JPH07504081A - ヘパリン結合タンパク質の阻害剤についてのスクリーニング方法 - Google Patents
ヘパリン結合タンパク質の阻害剤についてのスクリーニング方法Info
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- JPH07504081A JPH07504081A JP5504849A JP50484993A JPH07504081A JP H07504081 A JPH07504081 A JP H07504081A JP 5504849 A JP5504849 A JP 5504849A JP 50484993 A JP50484993 A JP 50484993A JP H07504081 A JPH07504081 A JP H07504081A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ヘパリン結合タンパク質の阻害剤についてのスクリーニング方法発明の分野
本発明は、ヘパリン結合タンパク質の阻害剤または拮抗剤である物質についての
スクリーニング方法、並びに該方法に使われる試験キットに関する。
発明の背景
ヒトおよびブタ起源の末梢好中球から単離された2つの密接に関連したタンパク
質の共有結合構造が最近決定された(H,Flodgaardら、Eur、J、
Biochem、197. 1991.535−547頁; J、 Pohlら
、FEBSLett、272.1990.200頁〜を参照のこと)。両タンパ
ク質は好中球エラスターゼに非常に類似しているが、活性セリン195とヒスチ
ジン57〔キモトリプシン番号性は法(B、S、 Hartley、 −Hom
ologiesin 5erfne Proteinases″、 Ph11.
Trans、 Rov、 Soc、 5eries 257゜1970、77
頁〜)〕の選択的変異のため、それらのタンパク質はプロテアーゼ活性を欠いて
いる。それらのタンパク質はヘパリンに対して高い親和性を持つため、それぞれ
ヒトヘパリン結合タンパク質(hHBP)およびブタヘパリン結合タンパク質(
pHBP)と命名された。5chaferら(W、M、 5chaferら、I
nfect、1mmun、53゜1986、651頁〜)は、該タンパク質をそ
の抗菌活性にちなんでカチオン性抗菌性タンパク質(CA P 37)と命名し
た。該タンパク質は1.3 XIO”’M〜10−″Mの範囲に渡り単球走化性
であることも示され、これはFlodgaardら(前掲)から明らかである結
果と一致する。
更に、HBPは、単層培養で増殖させた内皮細胞や繊維芽細胞に添加すると、そ
のような細胞の剥離と収縮を媒介することが示された。HBPは単球生存力とト
ロンポスボンジン分泌も刺激する(E。
@ e r g aa r dおよびH,Flodgaard、 J、 Leu
kocyte Bjol、51.1992゜316頁〜)。アズール好性顆粒か
ら、hHBPとCAP37のものと同じ最初の20個のN末端アミノ酸残基を有
するアズロシジンと呼ば265、1990.2038頁〜)、その抗菌性が報告
された(D、 Campanelliら、J、 Cl1n、Invest、85
. 1990. 904頁〜)。
好中球中のhHBPの存在および白血球がスタフィロコッカス・アウレウス(S
taph、 aureus)を食作用している時にCAP37(hHBPと同一
)の89%が放出されるという事実(H,A、Pereiraら、前掲)は、h
HBPはどうやら活性化された好中球から放出されるらしいことから、hHBP
の機能が免疫過程に関係し得ることを示している。Pareira (前掲)は
、CAP37が特異的に単球を誘引することのできる炎症部位にその機能が存在
し、よって炎症の第二波において単球の流入の原因となる因子の1つであること
を示唆したa jFstergaardおよびH,Flodgaard (前掲
)は、単球の漸増に重要であることに加えて、HBPが好中球と単球の溢出機構
に重要な役割を果たしているかもしれないと唱えた。
発明の要約
ヘパリン結合タンパク質が顕著な細胞収縮と細胞単層の崩壊を伴う繊維芽細胞や
内皮細胞の単層の形態学的変化を誘発し、並びに単球の走化性を誘発するという
観察結果は、ヘパリン結合タンパク質カー血管壁を通って炎症部位のほうへ多形
核白血球(PMN)が移動する上で重要な役割を果たすことを暗示している。従
って、例えば様々な型の過敏症、特に典型的な1. IIおよび■型過敏症にお
けるように、免疫応答が過大なまたは不適当な形で起こる場合、ヘパリン結合タ
ンパク質の阻害が望ましいかもしれない。それらの型の過敏症は抗体により媒介
されるので、補体活性化が起こり免疫複合体の沈着部位にPMNが誘引され、そ
れによって局部障害が生じる。
従ってヘパリン結合タンパク質の阻害は、免疫複合体が介在する状態、例えば血
管炎、腎炎、慢性関節リウマチ、喘息、急性肺困難症候群および肺組織の慢性過
敏におけるPMNの溢出を抑制し得る。
それらの炎症疾患の慢性状態では単核の食細胞が浸潤物の主要部分を構成するこ
とも知られており、そして慢性関節リウマチにおける溝膜の研究によりマクロフ
ァージの増加は血中単球の流入の増加のためであることが示されている(N、
Hoggら、Immunology 56゜1985、673−681頁)。こ
の現象は炎症の病巣のほうへの走化性移動により起こると思われる。この過程は
、ヘパリン結合タンパク質が介在する単球走化性の阻害並びにヘパリン結合タン
パク質が介在する単球からマクロファージへの分化の阻害により妨害されるだろ
う。
ヘパリン結合タンパク質の阻害の有益な効果が得られるかもしれない他の適応症
は、超急性拒絶反応、虚血後心筋障害および熱傷である。それらの場合、好中球
による過度な浸潤が観察される損傷を引き起こす。
本発明はヘパリン結合タンパク質の阻害剤についてのスクリーニング方法に関す
る。
従って、l観点によれば、本発明は、ヘパリン結合タンパク質(HBP)の阻害
剤についてのスクリーニング方法であって、HBPまたはHBP産生細胞を、H
BP阻害剤であると思われる物質と共にインキュベートし、次いでHBPと相互
作用することのできる組織、細胞またはその成分と共にインキュベートし、そし
て前記組織、細胞またはその成分とHBPとの相互作用に対する前記物質の効果
を検出することを含んで成り、前記相互作用の減少が前記物質がHBP阻害剤で
あることを示す方法に関する。
別の観点によれば、本発明はHBP阻害剤についてのスクリーニング方法であっ
て、)IBPまたはHBP産生細胞を、HBPと相互作用することのできる組織
、細胞またはその成分と共にインキュベートし、次いでHBP阻害剤であると思
われる物質と共にインキュベートし、そして前記組織、細胞またはその成分とH
BPとの相互作用に対する前記物質の効果を検出することを含んで成り、前記相
互作用の減少が前記物質がHBP阻害剤であることを示す方法に関する。
更に別の観点では、本発明はHBP阻害剤についてのスクリーニング方法であっ
て、HBP阻害剤であると思われる物質を、HBPと相互作用することのできる
組織、細胞またはその成分と共にインキュベートし、次いでHBPまたはHBP
産生細胞と共にインキュベートし、そして前記組織、細胞またはその成分とHB
Pとの相互作用に対する前記物質の効果を検出することを含んで成り、前記相互
作用の減少が前記物質がHBP阻害剤であることを示す方法に関する。
本明細書中、「ヘパリン結合タンパク質(HBP)Jなる用語は、タンパク質分
解活性を持たない好中球エラスターゼの同族体を表すためものである。試験管内
データに基づくと、現在HBPは好中球の漏出に関わり、繊維芽細胞の収縮を誘
導することによってそれらの移動を助け、かくして障壁の細胞外基質タンパク質
のエラスターゼ介在消化を促進すると思われている。移動している好中球から連
続的に分泌されたHBPは、次いで炎症の「第二波Jにおいて損傷組織に末梢の
単球を誘引する接触走性勾配を形成する。HBPの構造はWO89108666
とH,Plodgaardら(前掲)から明らかである。
HBPは他にCA P 37 (No 91100907参照)やアズロシジン
(C,G。
Wi ldeら、J、 Biol、 Chem、265.1990.2038頁
参照)と命名されている。)(BPは哺乳類、特にヒト起源のものであるのが適
当であろう。該用語は機能的類似体、すなわち生来のタンパク質と同様な機能を
有するポリペプチドを包含する。そのような機能的類似体の例としては、生来の
タンパク質のC末端またはN末端の一方もしくは両方への1もしくは複数のアミ
ノ酸残基の付加、生来のタンパク質の一端もしくは両端での1もしくは複数のア
ミノ酸残基の置換、または生来のタンパク質の一端もしくは両端または該アミノ
酸配列中の1もしくは複数の部位におけるlもしくは複数のアミノ酸残基の欠失
、または生来のアミノ酸配列中の1もしくは複数の部位における1もしくは複数
のアミノ酸残基の挿入が挙げられる。該用語は特にHBPのペプチド断片、特に
生来のHBPと同じ走化性作用を存する断片を包含する。
炎症性損傷の過程において、HBPは損傷の近位の内皮に付着した好中球から分
泌されると思われる。付着した好中球と内皮細胞との間の微小環境中に存在する
放出されたHBPは、内皮細胞上にあるレセプター(これは現在インテグリンレ
セブターであると推測されている)に結合することが判っている。
細胞が細胞外基質に(幾つかのインテグリンについては別の細胞に)付着するこ
とにより主要レセプターとして広く知られているインテグリンは、内皮細胞を含
む様々な細胞上に発現される。インテグリンはαサブユニットとβサブユニット
から構成され、αサブユニットは主に負に荷電したアミノ酸の配列(Asp−x
−Asp−x−Asp−Gly−x−x−Asp等)を含み、該配列はαサブユ
ニットをCa’“、 Mn”+またはMn’+のような二価カチオンを結合でき
るようにすると考えられる(一般的なインテグリンに関する更なる情報はR,O
,Hynes、 Ce11価カチオンの存在は、それらのリガンド結合能に必須
である。例えばインテグリンα、、β、中に導入された突然変異は二価カチオン
結合の欠損を引き起こし、その結果としてリガンド結合能の損失を引き起こす(
J、C,Loftus ら、5cience 249. 1990.915−9
18頁)。
HBPは正に荷電した配列(例えばヒトHBPの74〜80位のArg−Arg
−Arg−Glu−Arg−Glu−3er−Arg )によってインテグリン
レセブターの負に荷電した配列に結合し、かくして該レセプターへの二価カチオ
ンの結合を目当てに競争し、結果としてインテグリンが「オフ」コンホメーショ
ンに変化する。この過程は、基底膜からの剥離の制限に次いで細胞収縮の制限を
もたらすと思われる。この一連の現象は、近位の内皮細胞間の好中球漏出、ひい
ては基底膜からの漏出を促進し得る。炎症シグナルによってチャレンジした時好
中球が通過するにちがいない全ての型の遮断細胞層を通過する好中球の移動にも
同じ機構か関係していると思われる。そのような層は、例えば、繊維芽細胞、平
滑筋細胞、中皮細胞、肺胞上皮細胞、腸上皮細胞、漿膜細胞から成ることができ
る。
本明細書中、「阻害剤」なる用語は、内皮細胞、繊維芽細胞、平滑筋細胞および
単球のような細胞上にあるレセプターへの結合を目当てにHBPと競争すること
により、そのような細胞へのHBPの結合を阻害する物質を表すのに使われる。
この物質は、好ましくは、HBP自体の親和性と少なくとも同じ位高い親和性で
該レセプターに結合でき、そしてHBPとは異なり該レセプターからのいずれの
シグナルも伝えることができない物質であるべきである。もし該レセプターが本
当に上述したようなインテグリンであるならば、この阻害剤は、好ましくは、)
(BPのレセプター結合部位に結合し、それによってHBPがそのレセプターに
結合するのを防ぐことができるか、またはレセプターへのHBP結合が立体的に
妨害されるようにHBPがレセプター結合部位を被覆する部位でHBPに結合す
ることができる物質であろう。
更に別の観点によれば、本発明はHBP阻害剤スクリーニング用の試験キットに
関し、該キットは、別個の容器の中に、(a)HBPまたはHBP産生細胞、お
よび(b)HBPと相互作用することのできる組織、細胞またはその成分を含ん
で成る。
発明の詳細な説明
本発明によれば、HBPと相互作用することのできる組織、細胞またはその成分
は、(a)内皮細胞、繊維芽細胞もしくは平滑筋細胞またはその成分、(b)結
合組織またはその成分、および(C)単球またはその成分から成る群から選択す
ることができる。そのような細胞とHBPとの相互作用は、下記に更に詳細に記
載するようなHBPの存在下でのそれらの収縮(繊維芽細胞と内皮細胞)または
凝集(単球)により証明される。
本発明の方法の一態様では、HBPまたはHBP産生細胞を、固体支持体上の集
密層に存在する繊維芽細胞、内皮細胞もしくは平滑筋細胞と共に、または懸濁液
中の単球と共にインキュベートする。
HBP阻害剤であると疑われる物質を添加することによる細胞収縮もしくは凝集
の程度の減少または細胞の集密層の回復は、HBP阻害剤の存在を示す。逆に、
HBPまたはI(BP産生細胞を添加した後で、HBP阻害剤または拮抗剤と疑
われる物質を固体支持体上の集密層に存在する繊維芽細胞、内皮細胞もしくは平
滑筋細胞と共に、または懸濁液中の単球と共にインキュベートしてもよい。細胞
収縮や凝集の減少または防止がHBP阻害剤の存在を示す。
細胞が集密まで増殖される固体支持体は、この目的で通常側われる任意の常用材
料、例えばプラスチック、例えばラテックス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、
ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ナイロン、ポリ酢
酸ビニルもしくはそれらの適当なコポリマーであることができ、またはコラーゲ
ン、ゼラチンもしくはフィブロネクチンのような結合組織のポリマー成分である
ことができる。固体支持体の便利な形状は培養皿である。あるいは、HBPまた
はHBP阻害剤と思われるものと共にインキュベートする細胞が単球である時、
HBPを固体支持体上に固定化してもよい。
HBPもしくはHBP産生細胞、またはHBP阻害剤と思われる物質を内皮細胞
、繊維芽細胞または平滑筋細胞の成分と共にインキュベートする時、前記成分は
好ましくは表面膜分画または分子、例えばHBPレセプターを含んで成る。この
アッセイ態様では、HBPを固体支持体上に固定化してもよい。あるいはHBP
に適当な標識を提供することができる。
本発明のスクリーニング方法において使われる固体支持体は好ましくはポリマー
を含んで成る。該支持体はポリマーそれ自体から成るか、またはポリマーでコー
ティングされた母材から成ることができる。母材はガラス、紙またはプラスチッ
クなどの任意の適当な材料であることができる。ポリマーは、プラスチック(例
えばラテックス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリアクリル
アミド、ポリビニルアルコール、ナイロン、ポリ酢酸ビニルおよびそれらの適当
なコポリマー)、セルロース(例えば様々な型の紙、例えばニトロセルロース紙
等)、シリコンポリマー(例えばシロキサン)、多糖(例えばアガロースまたは
デキストラン)、イオン交換樹脂(例えば常用のアニオンまたはカチオン交換樹
脂)、ポリリジンのようなポリペプチド、およびガラスなどのセラミック材料(
例えば細孔調整ガラス)から成る群から選択することができる。
固体支持体の物理的形態は重要ではないが、当該目的にはある形態がその他の形
態よりも一層好都合であることがある。例えば、固体支持体は平板、例えば薄層
もしくはマイクロタイタープレート、またはフィルム、ストリップ、膜(例えば
ナイロン膜またはセルロースフィルター)もしくは固体粒子(例えばラテックス
ビーズ、デキストランビーズまたはアガロースビーズ)の形であることができる
。
HBPを標識することのできる標識物質は、好ましくは酵素、着色または蛍光物
質、放射性同位体および複合体生成剤から成る群から選択される。
標識物質として作用な酵素の例は、ペルオキシダーゼ(例えば西洋ワサビペルオ
キシダーゼ)、ホスファターゼ(例えば酸またはアルカリホスファターゼ)、β
−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、カルボニックアン
ヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、リ
ンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、β−グル
コシダーゼ、プロテアーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、エステラーゼ、ル
シフェラーゼ等である。
酵素は単独では検出可能でなく、最終産物か検出可能である反応を触媒する基質
と組み合わせなければならない。本発明の方法に使用することができる基質の例
としては、過酸化水素/テトラメチルベンジジンもしくはクロロナフトールもし
くは0−フェニレンジアミンもしくは3−(p−ヒドロキシフェニル)プロピオ
ン酸もしくはルミノール、インドキシルホスフェート、p−ニトロフェニルホス
フェート、ニトロフェニルガラクトース、4−メチルウンベリフェリル−D−ガ
ラクトピラノシド、またはルシフェリンが羊げられる。
あるいは、標識物質が着色または蛍光物質、例えば金粒子、着色または蛍光ラテ
ックス粒子、色素粒子、フルオレセイン、フィコエリスリンまたはフィコシアニ
ンを含んで成ることができる。
この目的に使うことができる放射性同位体は、l−125、l−131゜In−
111、H−3、P−32、C−14または5−35から選択することができる
。それらの同位体により放出される放射能は、それ自体既知の方法でガンマカウ
ンターやシンチレーションカウンター中で測定することができる。
この目的に使うことができる複合体生成剤は、ビオチン(アビジンまたはストレ
プトアビジンと複合体生成する)、アビジン(ビオチンと複合体生成する)、プ
ロティンA(免疫グロブリンと複合体生成する)およびレクチン(炭化水素レセ
プターと複合体生成する)から選択することができる。複合体が直接的に検出可
能でない時、複合体生成剤と複合体を形成する物質を標識することが必要である
。
この標識は、酵素の標識について上述した標識物質のいずれが1つを使って行う
ことができる。
本発明のスクリーニング方法に使うことができるHBPレセプターは単離された
形で使用することができ、そしてそれぞれ上述したように、標識を提供してもよ
くまたは固体支持体上に固定化されてもよい。しかしながら、該レセプターは膜
に結合した形で使うこともでき、即ち完全な細胞にまたは膜調製物の一成分とし
て結合させることもできる。該レセプターが完全な細胞に結合される場合(細胞
の表面上に発現される場合)、HBPへの該レセプターの結合は、細胞を視覚的
にカウントするか、または天然の細胞内酵素活性(例えばカテプシンB活性)を
測定するか、または組換えDNA技術によって細胞内に導入された酵素活性を測
定することにより、測定することができる。
より詳しくは、HBP阻害剤についてのアッセイは、固体支持体上に固定化され
たHBPレセプターまたはHBPレセプターを発現する細胞もしくはその表面膜
分画を、固体支持体上に固定化されたものと同様に、標識したHBPおよびHB
P阻害剤と思われる物質と共にインキュベートし、そして該レセプターに結合し
たHBPの量を測定することによって達成される。HBPの結合の減少(阻害剤
と思われるものと共にインキュベートしなかった対照に比較して)は、問題の試
験物質の阻害効果を指摘する。
(未標識の’)HBPまたはHBP産生細胞、HBP阻害剤であると思われる物
質、およびHBPと相互作用することのできる組織、細胞またはその成分のイン
キュベーション後に、HBP反応性である抗体を添加するということも考えられ
る。この場合、該抗体に上述したような標識を付けるか、または抗HBP抗体の
添加後に抗HBP抗体反応性である標識したた第二抗体を添加することができる
。
上述したようなインテグリンレセブターへのHBP結合の現在の知見を基にする
と、可能なHBP結合阻害剤は、全体に負の正味電荷を有する物質であると予想
される。そのような物質の例は、lもしくは複数のAspおよび/またはGlu
残基を含むペプチド、または硫酸デキストラン、硫酸ヘパリンもしくはスクラル
ファートのような硫酸化炭化水素である。
本発明のスクリーニング方法で使われるHBPは、該アッセイ中に存在する他の
物質からの起こり得る妨害を避けるために、好ましくは実質的に純粋な形である
。従って最も好都合には、HBPは例えば下記のような組換えDNA技術により
調製される。
HBPをコードするDNA配列は、確立された標準法、例えばS。
L、 BeaucageおよびM、)1. Caruhters、 Tetra
hedron Letters 22゜1981、1859−1869頁により
記載されたホスホアミダイト法、またはMattheSら、EMBOJourn
al 3.1984.801−805頁により記載された方法、によって合成的
に調製することができる。ホスホアミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドを
例えば自動DNA合成装置中で合成し、精製し、アニーリングせしめ、適当なベ
クターに連結してクローニングする。
DNA配列はゲノム由来でもcDNA由来でもよく、例えば標準技術(Samb
rookら、Mo1ecular Cloning:^Laboratory
ManuaL第2版、Co1d Spring Harbor、 1989)に
従って、ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーを調製しそして合成オ
リゴヌクレオチドプローブを使ったハイブリダイゼーションによりHBPの全部
または一部をコードするDNA配列についてスクリーニングすることにより得ら
れる。該DNA配列は、例えばLIS 4,683.202またはR,K。
5aiki ら、5cience 239.1988.487−491頁に記載
されたように、特異的プライマーを使ったポリメラーゼ連鎖反応によって調製す
ることもできる。
次いで該DNA配列は組換え発現ベクター中に挿入される。この発現ベクターは
、便利には組換えDNA操作にかけることができる任意のベクターであることが
できる。ベクターの選択は、しばしばベクターを導入しようとする宿主細胞に依
存するだろう。例えば、ベクターは、自己複製ベクター、すなわち染色体外存在
物、例えばプラスミドとして存在し、その複製が染色体の複製とは無関係である
ベクターであることができる。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入すると宿
主ゲノム中に組み込まれ、組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであるこ
とができる。
ベクター中、HBPをコードするDNA配列は、適当なプロモーター配列に作用
可能に連結されるだろう。プロモーターは、選択した宿主細胞中で転写活性を示
す任意のDNA配列であることができ、そして宿主細胞に対して同種または異種
であるタンパク質をコードする遺伝子から誘導することができる。哺乳動物細胞
中でHBPをコードするDNAの転写を指令するための適当なプロモーターの例
としては、SV 40プロモーター(Subramani ら、Mo1. Ce
1l Biol。
デフウィルス2主要後期プロモーターである。酵母宿主細胞中での使用に適する
プロモーターとしては、酵母解糖系遺伝子(HitzemanもしくはADt(
2−4c (Russell ら、Nature 304.1983.652−
654頁)プロモーターが挙げられる。糸状菌宿主細胞中での使用に適するブH
BPをコードするDNA配列は、適当なターミネータ−1例えもできる。ベクタ
ーは、更にポリアデニル化シグナル(例えばSV 40またはアデノウィルス5
Elb領域由来)、転写エンハンサ−配列(例えばSV 40エンハンサ−)
および翻訳エンハンサ−配列(例えばアデノウィルスVA RNAをコードする
もの)といった要素を含んでもよい。
組換え発現ベクターは、該ベクターを問題の宿主細胞中で複製できるようにする
DNA配列を更に含んでもよい。そのような配列の一例は(宿主細胞が哺乳動物
細胞である時)SV 40複製開始点である。該ベクターはまた、選択可能マー
カー、例えば、その産物が宿主細胞中の欠損を補完するような遺伝子、例えばジ
ヒドロ葉酸レダクターゼ(DHPR)をコードする遺伝子または薬剤(例えばネ
オマイシン、ヒグロマイシンもしくはメトトレキセート)に対する耐性を付与す
る遺伝子を更に含んで成ってもよい。
HBPをコードするDNA配列、プロモーターおよびターミネータ−をそれぞれ
連結せしめ、そしてそれらを複製に必要な情報を含む適当なベクター中に挿入す
るのに使われる方法は、当業者に公知である(例えばSambrookら、前掲
、を参照のこと)。
発現ベクターか導入される宿主細胞は、HBPを生産することのできるいずれの
細胞でもよいが、好ましくは真核細胞、特に哺乳動物細胞である。適当な哺乳動
物細胞系の例は、COS (ATCCCRL1650) 、BHK (ATCC
CRL 1632. ATCCCCL 10)またはCHO(ATCCCCL
61 ’)細胞系である。哺乳動物細胞をトランスフェクトせしめ、該細胞中に
導入されたDNA配列を発現せしめる方法は、あるいは、真菌細胞(酵母細胞を
含む)を宿主細胞として使うこともできる。適当な酵母細胞の例としては、サツ
カロミセス(Saccharomyces )の種またはシゾサツカロミセス(
銃吐軸匣匹匝朋−スベルギルヌ(Aspergillus )の種またはニュー
ロスポラ(NeUrO9pO−■)の種の細胞、特にアスペルギルス・オリザエ
(Aspergi flusoryzae)またはアスペルギルス・ニガー(A
spergillus niger )の株である。タンパク質発現のためのア
スペルギルス種の使用は、例えばEP 238023に記載されている。
細胞を培養するのに使用する培地は、哺乳動物細胞を増殖させるのに適当な任意
の常用培地、例えば適当な補足物を含有する血清含有培地または無血清培地であ
ることができる。適当な培地は商業的供給業者から入手することができるか、ま
たは発表された配合表〔例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
(ATCC)のカタログ中のもの〕に従って調製することができる。
細胞によって生産されたHBPは、次いで遠心または濾過によって培地から宿主
細胞を分離し、上溝または濾液のタンパク質様成分を塩、例えば硫酸アンモニウ
ムで沈澱させ、様々なりロフトグラフィー法、例えばイオン交換クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィー等によって精製することを含む常用手
段により、培地から回収することができる。
本発明を下記の実施例により一層詳細に説明する。下記実施例は本発明の請求の
範囲を何ら制限するものではない。
実施例
組織培養皿はNunc社から購入し、血液銀行から新鮮な「パフイコート」を得
た。フィコール−パック、パーコールおよびプロティンA−セファロースCL−
48はPharmacia社から入手した。MRC−5胎芽肺繊維芽細胞とウシ
胎児心臓内皮(FBHE)細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョンから入手した。骨髄性白血病細胞系0937 (C,Sundstr6mお
よびに、 Ni1sson、Tnt、 J、 Cancer 17゜1.976
、565−577頁を参照のこと)はA、 Fattorsi、 Re5ear
ch Labo−ratories of Aeronautica Mili
tare、 Rome、 Italyから得た。ヒトHBP (hHBP)(ポ
リアクリルアミドゲル分析により評価した時95%以上の純度)は、H,Flo
dgaardら(前掲)に記載の通りに好中球から精製した。ホルボール12ミ
リステート13A (PMA)はSigma社から入手した。Na−ショ糖−オ
クタキス(硫酸水素)アルミニウム複合体(スクラルファート)はBukh M
editec A/S、 Farum。
Denmarkから入手した。
77頁〕により記載された方法に従って、健康な提供者から単核細胞を単離した
。簡単に言えば、「バフィコート」を1容の冷ダルベツコ改良イーグル培地(D
ME)で希釈し、モして50−ファルコン試験管に入った15WLlのフィコー
ル−パックの上に重層した。スイングアウトローター中で400Xgで30分間
遠心した後、フィコール−パックとDME−血漿の間の層(単核細胞と血小板を
含む)を収集し、次いで細胞をDME中で繰り返し洗浄することにより血小板を
除去した。パーコール勾配(1,070g/rd!の平均密度を有する等張のパ
ーコールを固定角ローター中で3,200 Xgにて遠心することによって生成
された(J、C,Giddingsら、Cl1n、 Lab、 Haemat、
2.1980゜121頁)〕上での遠心によって単核細胞を更に分画した。この
勾配の上に単核細胞を重層し、スイングアウトローター中で2.700 x g
で20分間遠心した。非特異的エステラーゼ染色により勾配の最上部にある単球
が90%を越える純度であることが決定された。単球をhHBPと共にインキュ
ベートする時、hHBPの添加よりも前にまず該細胞を10 mg/−のBSA
が補足されたDME中で平板培養した。ペニシリンとストレプトマイシンが補足
されたDME (培地l−あたり259g未満の内毒素を含む)中で単球をイン
キュベートした。16時間のインキュベーション後、Olympus CK−2
倒立顕微鏡に合わせたOlympus 0M−4カメラで培養物を撮影した。
20〜35継代のMRC−5細胞を使い、1%L−グルタミン、1.1%NaH
COs、1%非必須アミノ酸、ペニシリン/ストレプトマイシンおよびlO%F
C3を含む最少必須培地(MEM)中で培養した。FBI(E細胞は10%新生
ウシ血清(NC3)と10〜20 ng/m1の組換えヒト塩基性繊維芽細胞増
殖因子を含むDME中で培養した。両細胞型とも24ウエルのマクロウェル皿中
で集密まで増殖させ、次いでhHBPでの処理前にDME中で1回洗浄した。5
%CO7を含む湿潤大気中でペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEの中
で該細胞を37°Cにて16時間インキュベートした。次いでそれらを写真撮影
した。
hHBPとのインキュベーション後の細胞形態学の変化集密のMRC−5または
FBHE細胞を、培地に添加された10μg/−のhHBPと共にインキュベー
トした時、16時間のインキュベーション後に細胞収縮を観察することができた
。細胞間の広い間隙は残っていた。対照の繊維芽細胞は、血清の欠失のため集密
で細長いスピンドル形であり、対照の内皮細胞は典型的な偏平な丸石様細胞であ
った。10μg/−のhHBPと共に16時間インキュベートした単球は大きな
多細胞の塊に凝集し、一方対照の単球はウェル表面に薄く付着した。細胞がより
丸くなった形態学を示すというような単球の形態学的変化が2時間以内には観察
されたが、数時間後には細胞凝集のみが表れた。IOμg/mJ!の濃度のhH
BPの存在下で血清無添加のDME中に細胞を接種した場合にも、MRC−5繊
維芽細胞とFBHE細胞の塊形成が観察された。より高濃度のhHBP(30μ
g/ml>では、MRC−5とFBHEの単層はウェル表面から剥離して凝集物
を形成した。
10μg/mJまでのhHBPa度を使った時、MRC−5繊維芽細胞とFBH
E細胞の収縮は可逆的であり、10%へのウシ胎児血清の添加が24時間後に集
密単層を完全に回復させた。より高いhHBP濃度では、細胞が凝集物中に閉じ
込められ、従ってウシ胎児血清の添加後に該基質の方に移動することはできなか
った。
U937細胞の同型凝集
該細胞をlθ%ウシ胎児血清(FCS)が補足されたダルベツコ改良イーグル培
地(DMEM)中で増殖させた。FC3不含有DMEM中で細胞を2回洗浄し、
24ウエルのマクロウェル皿の中の150 nMPMA/DMEMに0.5X1
0’細胞/1d!の密度で接種した。試験ウェルには10μgのHBPを添加し
、対照ウェルにはPBSを添加し、次いで5%CO,を含む湿潤大気中でインキ
ュベートした。培養物を時折検査し、そして16時間のインキュベーション後に
撮影した。
2時間後に同型凝集を観察することができ、12〜16時間後に最高潮に達した
。対照では、細胞はウェルの底に付着し、十分に拡散していた。
それらの未刺激の条件においては、U937細胞は固定源とは無関係に懸濁状態
で増殖する。しかしながら、PMAで刺激すると、この細胞系はβ、インテグリ
ンCD11b/CD18およびCDlIC/CD18の細胞表面発現の変化を示
す。それらのインテグリンの発現の有意な増加とCD71の減少は、U937細
胞からマクロファージ様細胞への分化を特徴付ける(C,Cabanasら、H
ybridoma 7. 1988.167−176頁)。
PMA刺激されたU937細胞へのHBPの添加により観察される強い同型凝集
は、HBPがインテグリンに作用しくおそらく二価イオン結合部位に)、そして
このエピトープと反応するモノクローナル抗体について報告されたのと同じ形で
(D、C,Altieri、 J、 Biol。
を媒介することを示す。
この実験構成は、HBP阻害剤であると思われる物質をHBPの添加の前または
後に添加し、そして上述したような繊維芽細胞もしくは内皮細胞の収縮に対する
または単球の凝集に対する試験物質の効果を測定することにより、HBP阻害剤
についてスクリーニングするのに利用することができる。
よって、同様な構成において、Na−ショ糖−オクタキス(硫酸水素)アルミニ
ウム複合体(スクラルファート)の効果を試験した。
全<HBPを含まない対照ウェルへの100μg/rnl培地の濃度のスクラル
ファートの添加は、PMA刺激された細胞付着および拡散に影響を与えなかった
。しかしながら、該ウェルに1011g/−培地の濃度のHBPを添加した時、
同濃度のスクラルファートが上記細胞の同型凝集を強力に抑制した。HBPの阻
害の背後にある機構は、強く負に荷電したスクラルファート分子によるHBPの
74〜80位のArg〜Arg−Arg−G lu−Arg−G lu−3er
−Argモチーフの静電中和によって引き起こされるものと思われる。
国際調査報告
を−一一−m、、+−w−PCT/I)+ 9210027G
Claims (25)
- 1.ヘパリン結合タンパク質(HBP)の阻害剤についてのスクリーニング方法 であって、HBPまたはHBP産生細胞を、HBP阻害剤であると思われる物質 と共にインキュベートし、次いでHBPと相互作用することのできる組織、細胞 またはその成分と共にインキュベートし、そして前記組織、細胞またはその成分 とHBPとの相互作用に対する前記物質の効果を検出することを含んで成り、前 記相互作用の減少が前記物質がHBP阻害剤であることを示す方法。
- 2.ヘパリン結合タンパク質(HBP)の阻害剤についてのスクリーニング方法 であって、HBPまたはHBP産生細胞を、HBPと相互作用することのできる 組織、細胞またはその成分と共にインキュベートし、次いでHBP阻害剤である と思われる物質と共にインキュベートし、そして前記組織、細胞またはその成分 とHBPとの相互作用に対する前記物質の効果を検出することを含んで成り、前 記相互作用の減少が前記物質がHBP阻害剤であることを示す方法。
- 3.ヘパリン結合タンパク質(HBP)の阻害剤についてのスクリーニング方法 であって、HBP阻害剤であると思われる物質を、HBPと相互作用することの できる組織、細胞またはその成分と共にインキュベートし、次いでHBPまたは HBP産生細胞と共にインキュベートし、そして前記組織、細胞またはその成分 とHBPとの相互作用に対する前記物質の効果を検出することを含んで成り、前 記相互作用の減少が前記物質がHBP阻害剤であることを示す方法。
- 4.前記HBPと相互作用することのできる組織、細胞またはその成分が、(a )内皮細胞、繊維芽細胞もしくは平滑筋細胞またはその成分、(b)結合組織ま たはその成分、および(c)単球またはその成分から成る群より選択される、請 求項1,2または3に記載の方法。
- 5.前記HBPもしくはHBP産生細胞、またはHBP阻害剤であると思われる 物質が内皮細胞、繊維芽細胞または平滑筋細胞と共にインキュベートされる時、 前記内皮細胞、繊維芽細胞または平滑筋細胞が固体支持体上の集密層に存在する 、請求項4に記載の方法。
- 6.前記固体支持体が、ポリマー、例えばコラーゲン、ゼラチンもしくはフィブ ロネクチン、またはプラスチック、例えばラテックス、ポリスチレン、ポリ塩化 ビニル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ナイロン 、ポリ酢酸ビニル、またはそれらの適当なコポリマーを含んで成る、請求項5に 記載の方法。
- 7.前記HBPもしくはHBP産生細胞、またはHBP阻害剤であると思われる 物質が内皮細胞、繊維芽細胞または平滑筋細胞の成分と共にインキュベートされ る時、前記成分が表面膜分画または分子である、請求項4に記載の方法。
- 8.前記表面膜分子がHBPレセプターである、請求項7に記載の方法。
- 9.前記HBPが単球とインキュベートされる時、前記HBPが固体支持体上に 固定化されている、請求項4に記載の方法。
- 10.前記HBPが組換えHBPである、請求項1〜9のいずれか一項に記載の 方法。
- 11.前記HBPに標識が提供される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の 方法。
- 12.前記HBPまたはHBP産生細胞、HBP阻害剤であると思われる物質、 およびHBPと相互作用することのできる組織、細胞またはその成分のインキュ べーション後に、HBP反応性である抗体が添加される、請求項1〜11のいず れか一項に記載の方法。
- 13.前記抗体に標識が提供される、請求項12に記載の方法。
- 14.前記抗HBP抗体の添加後に、前記抗HBP抗体反応性である標識した第 二抗体が添加される、請求項12に記載の方法。
- 15.HBP阻害剤または拮抗剤についてのスクリーニング用の試験キットであ って、別個の容器の中に、(a)HBPまたはHBP産生細胞、および(b)H BPと相互作用することのできる組織、細胞またはその成分を含んで成る試験キ ット。
- 16.前記HBPと相互作用することのできる組織、細胞またはその成分が、( i)内皮細胞、繊維芽細胞もしくは平滑筋細胞またはその成分、(ii)結合組 織またはその成分、および(iii)単球またはその成分から成る群より選択さ れる、請求項15に記載の試験キット。
- 17.前記内皮細胞、繊維芽細胞もしくは平滑筋細胞またはその成分が固体支持 体上に固定化されている、請求項16に記載の試験キット。
- 18.前記内皮細胞が固体支持体上の集密層に存在する、請求項17に記載の試 験キット。
- 19.前記固体支持体が、ポリマー、例えばコラーゲン、ゼラチンもしくはフィ ブロネクチン、またはプラスチック、例えばラテックス、ポリスチレン、ポリ塩 化ビニル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ナイロ ン、ポリ酢酸ビニル、またはそれらの適当なコポリマーを含んで成る、請求項1 7または18に記載の試験キット。
- 20.前記内皮細胞の成分が表面膜分画または分子である、請求項16に記載の 試験キット。
- 21.前記表面膜分子がHBPレセプターである、請求項20に記載の試験キッ ト。
- 22.前記HBPまたはHBP産生細胞が固体支持体上に固定化されている、請 求項15に記載の試験キット。
- 23.前記HBPに標識が提供される、請求項15〜22のいずれか一項に記載 の試験キット。
- 24.別個の容器の中に、HBP反応性である標識した抗体を更に含んで成る、 請求項15〜22のいずれか一項に記載の試験キット。
- 25.それぞれ別個の容器の中に、HBP反応性である第一抗体、および前記第 一抗体反応性である標識した第二抗体を更に含んで成る、請求項15〜22のい ずれか一項に記載の試験キット。
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