JPH07504081A

JPH07504081A - ヘパリン結合タンパク質の阻害剤についてのスクリーニング方法

Info

Publication number: JPH07504081A
Application number: JP5504849A
Authority: JP
Inventors: フロズガールズ，ハンス
Original assignee: ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ
Priority date: 1991-09-12
Filing date: 1992-09-09
Publication date: 1995-05-11
Also published as: WO1993005396A1; AU2658092A; EP0645016A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヘパリン結合タンパク質の阻害剤についてのスクリーニング方法発明の分野本発明は、ヘパリン結合タンパク質の阻害剤または拮抗剤である物質についてのスクリーニング方法、並びに該方法に使われる試験キットに関する。

発明の背景ヒトおよびブタ起源の末梢好中球から単離された２つの密接に関連したタンパク質の共有結合構造が最近決定された（Ｈ，Ｆｌｏｄｇａａｒｄら、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９７．　１９９１．５３５−５４７頁；　Ｊ、　Ｐｏｈｌら、ＦＥＢＳＬｅｔｔ、２７２．１９９０．２００頁〜を参照のこと）。両タンパク質は好中球エラスターゼに非常に類似しているが、活性セリン１９５とヒスチジン５７〔キモトリプシン番号性は法（Ｂ、Ｓ、　Ｈａｒｔｌｅｙ、　−Ｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓｉｎ　５ｅｒｆｎｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ″、　Ｐｈ１１．　Ｔｒａｎｓ、　Ｒｏｖ、　Ｓｏｃ、　５ｅｒｉｅｓ　２５７゜１９７０、７７頁〜）〕の選択的変異のため、それらのタンパク質はプロテアーゼ活性を欠いている。それらのタンパク質はヘパリンに対して高い親和性を持つため、それぞれヒトヘパリン結合タンパク質（ｈＨＢＰ）およびブタヘパリン結合タンパク質（ｐＨＢＰ）と命名された。５ｃｈａｆｅｒら（Ｗ、Ｍ、　５ｃｈａｆｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ、１ｍｍｕｎ、５３゜１９８６、６５１頁〜）は、該タンパク質をその抗菌活性にちなんでカチオン性抗菌性タンパク質（ＣＡ　Ｐ　３７）と命名した。該タンパク質は１．３　ＸＩＯ”’Ｍ〜１０−″Ｍの範囲に渡り単球走化性であることも示され、これはＦｌｏｄｇａａｒｄら（前掲）から明らかである結果と一致する。

更に、ＨＢＰは、単層培養で増殖させた内皮細胞や繊維芽細胞に添加すると、そのような細胞の剥離と収縮を媒介することが示された。ＨＢＰは単球生存力とトロンポスボンジン分泌も刺激する（Ｅ。

＠　ｅ　ｒ　ｇ　ａａ　ｒ　ｄおよびＨ，Ｆｌｏｄｇａａｒｄ、　Ｊ、　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｂｊｏｌ、５１．１９９２゜３１６頁〜）。アズール好性顆粒から、ｈＨＢＰとＣＡＰ３７のものと同じ最初の２０個のＮ末端アミノ酸残基を有するアズロシジンと呼ば２６５、１９９０．２０３８頁〜）、その抗菌性が報告された（Ｄ、　Ｃａｍｐａｎｅｌｌｉら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、８５．　１９９０．　９０４頁〜）。

好中球中のｈＨＢＰの存在および白血球がスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈ、　ａｕｒｅｕｓ）を食作用している時にＣＡＰ３７（ｈＨＢＰと同一）の８９％が放出されるという事実（Ｈ，Ａ、Ｐｅｒｅｉｒａら、前掲）は、ｈＨＢＰはどうやら活性化された好中球から放出されるらしいことから、ｈＨＢＰの機能が免疫過程に関係し得ることを示している。Ｐａｒｅｉｒａ　（前掲）は、ＣＡＰ３７が特異的に単球を誘引することのできる炎症部位にその機能が存在し、よって炎症の第二波において単球の流入の原因となる因子の１つであることを示唆したａ　ｊＦｓｔｅｒｇａａｒｄおよびＨ，Ｆｌｏｄｇａａｒｄ　（前掲）は、単球の漸増に重要であることに加えて、ＨＢＰが好中球と単球の溢出機構に重要な役割を果たしているかもしれないと唱えた。

発明の要約ヘパリン結合タンパク質が顕著な細胞収縮と細胞単層の崩壊を伴う繊維芽細胞や内皮細胞の単層の形態学的変化を誘発し、並びに単球の走化性を誘発するという観察結果は、ヘパリン結合タンパク質カー血管壁を通って炎症部位のほうへ多形核白血球（ＰＭＮ）が移動する上で重要な役割を果たすことを暗示している。従って、例えば様々な型の過敏症、特に典型的な１．　ＩＩおよび■型過敏症におけるように、免疫応答が過大なまたは不適当な形で起こる場合、ヘパリン結合タンパク質の阻害が望ましいかもしれない。それらの型の過敏症は抗体により媒介されるので、補体活性化が起こり免疫複合体の沈着部位にＰＭＮが誘引され、それによって局部障害が生じる。

従ってヘパリン結合タンパク質の阻害は、免疫複合体が介在する状態、例えば血管炎、腎炎、慢性関節リウマチ、喘息、急性肺困難症候群および肺組織の慢性過敏におけるＰＭＮの溢出を抑制し得る。

それらの炎症疾患の慢性状態では単核の食細胞が浸潤物の主要部分を構成することも知られており、そして慢性関節リウマチにおける溝膜の研究によりマクロファージの増加は血中単球の流入の増加のためであることが示されている（Ｎ、　Ｈｏｇｇら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　５６゜１９８５、６７３−６８１頁）。この現象は炎症の病巣のほうへの走化性移動により起こると思われる。この過程は、ヘパリン結合タンパク質が介在する単球走化性の阻害並びにヘパリン結合タンパク質が介在する単球からマクロファージへの分化の阻害により妨害されるだろう。

ヘパリン結合タンパク質の阻害の有益な効果が得られるかもしれない他の適応症は、超急性拒絶反応、虚血後心筋障害および熱傷である。それらの場合、好中球による過度な浸潤が観察される損傷を引き起こす。

本発明はヘパリン結合タンパク質の阻害剤についてのスクリーニング方法に関する。

従って、ｌ観点によれば、本発明は、ヘパリン結合タンパク質（ＨＢＰ）の阻害剤についてのスクリーニング方法であって、ＨＢＰまたはＨＢＰ産生細胞を、ＨＢＰ阻害剤であると思われる物質と共にインキュベートし、次いでＨＢＰと相互作用することのできる組織、細胞またはその成分と共にインキュベートし、そして前記組織、細胞またはその成分とＨＢＰとの相互作用に対する前記物質の効果を検出することを含んで成り、前記相互作用の減少が前記物質がＨＢＰ阻害剤であることを示す方法に関する。

別の観点によれば、本発明はＨＢＰ阻害剤についてのスクリーニング方法であって、）ＩＢＰまたはＨＢＰ産生細胞を、ＨＢＰと相互作用することのできる組織、細胞またはその成分と共にインキュベートし、次いでＨＢＰ阻害剤であると思われる物質と共にインキュベートし、そして前記組織、細胞またはその成分とＨＢＰとの相互作用に対する前記物質の効果を検出することを含んで成り、前記相互作用の減少が前記物質がＨＢＰ阻害剤であることを示す方法に関する。

更に別の観点では、本発明はＨＢＰ阻害剤についてのスクリーニング方法であって、ＨＢＰ阻害剤であると思われる物質を、ＨＢＰと相互作用することのできる組織、細胞またはその成分と共にインキュベートし、次いでＨＢＰまたはＨＢＰ産生細胞と共にインキュベートし、そして前記組織、細胞またはその成分とＨＢＰとの相互作用に対する前記物質の効果を検出することを含んで成り、前記相互作用の減少が前記物質がＨＢＰ阻害剤であることを示す方法に関する。

本明細書中、「ヘパリン結合タンパク質（ＨＢＰ）Ｊなる用語は、タンパク質分解活性を持たない好中球エラスターゼの同族体を表すためものである。試験管内データに基づくと、現在ＨＢＰは好中球の漏出に関わり、繊維芽細胞の収縮を誘導することによってそれらの移動を助け、かくして障壁の細胞外基質タンパク質のエラスターゼ介在消化を促進すると思われている。移動している好中球から連続的に分泌されたＨＢＰは、次いで炎症の「第二波Ｊにおいて損傷組織に末梢の単球を誘引する接触走性勾配を形成する。ＨＢＰの構造はＷＯ８９１０８６６６とＨ，Ｐｌｏｄｇａａｒｄら（前掲）から明らかである。

ＨＢＰは他にＣＡ　Ｐ　３７　（Ｎｏ　９１１００９０７参照）やアズロシジン（Ｃ，Ｇ。

Ｗｉ　ｌｄｅら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２６５．１９９０．２０３８頁参照）と命名されている。）（ＢＰは哺乳類、特にヒト起源のものであるのが適当であろう。該用語は機能的類似体、すなわち生来のタンパク質と同様な機能を有するポリペプチドを包含する。そのような機能的類似体の例としては、生来のタンパク質のＣ末端またはＮ末端の一方もしくは両方への１もしくは複数のアミノ酸残基の付加、生来のタンパク質の一端もしくは両端での１もしくは複数のアミノ酸残基の置換、または生来のタンパク質の一端もしくは両端または該アミノ酸配列中の１もしくは複数の部位におけるｌもしくは複数のアミノ酸残基の欠失、または生来のアミノ酸配列中の１もしくは複数の部位における１もしくは複数のアミノ酸残基の挿入が挙げられる。該用語は特にＨＢＰのペプチド断片、特に生来のＨＢＰと同じ走化性作用を存する断片を包含する。

炎症性損傷の過程において、ＨＢＰは損傷の近位の内皮に付着した好中球から分泌されると思われる。付着した好中球と内皮細胞との間の微小環境中に存在する放出されたＨＢＰは、内皮細胞上にあるレセプター（これは現在インテグリンレセブターであると推測されている）に結合することが判っている。

細胞が細胞外基質に（幾つかのインテグリンについては別の細胞に）付着することにより主要レセプターとして広く知られているインテグリンは、内皮細胞を含む様々な細胞上に発現される。インテグリンはαサブユニットとβサブユニットから構成され、αサブユニットは主に負に荷電したアミノ酸の配列（Ａｓｐ−ｘ −Ａｓｐ−ｘ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−ｘ−ｘ−Ａｓｐ等）を含み、該配列はαサブユニットをＣａ’“、　Ｍｎ”＋またはＭｎ’＋のような二価カチオンを結合できるようにすると考えられる（一般的なインテグリンに関する更なる情報はＲ，Ｏ，Ｈｙｎｅｓ、　Ｃｅ１１価カチオンの存在は、それらのリガンド結合能に必須である。例えばインテグリンα、、β、中に導入された突然変異は二価カチオン結合の欠損を引き起こし、その結果としてリガンド結合能の損失を引き起こす（Ｊ、Ｃ，Ｌｏｆｔｕｓ　ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４９．　１９９０．９１５−９１８頁）。

ＨＢＰは正に荷電した配列（例えばヒトＨＢＰの７４〜８０位のＡｒｇ−Ａｒｇ −Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ａｒｇ　）によってインテグリンレセブターの負に荷電した配列に結合し、かくして該レセプターへの二価カチオンの結合を目当てに競争し、結果としてインテグリンが「オフ」コンホメーションに変化する。この過程は、基底膜からの剥離の制限に次いで細胞収縮の制限をもたらすと思われる。この一連の現象は、近位の内皮細胞間の好中球漏出、ひいては基底膜からの漏出を促進し得る。炎症シグナルによってチャレンジした時好中球が通過するにちがいない全ての型の遮断細胞層を通過する好中球の移動にも同じ機構か関係していると思われる。そのような層は、例えば、繊維芽細胞、平滑筋細胞、中皮細胞、肺胞上皮細胞、腸上皮細胞、漿膜細胞から成ることができる。

本明細書中、「阻害剤」なる用語は、内皮細胞、繊維芽細胞、平滑筋細胞および単球のような細胞上にあるレセプターへの結合を目当てにＨＢＰと競争することにより、そのような細胞へのＨＢＰの結合を阻害する物質を表すのに使われる。

この物質は、好ましくは、ＨＢＰ自体の親和性と少なくとも同じ位高い親和性で該レセプターに結合でき、そしてＨＢＰとは異なり該レセプターからのいずれのシグナルも伝えることができない物質であるべきである。もし該レセプターが本当に上述したようなインテグリンであるならば、この阻害剤は、好ましくは、）（ＢＰのレセプター結合部位に結合し、それによってＨＢＰがそのレセプターに結合するのを防ぐことができるか、またはレセプターへのＨＢＰ結合が立体的に妨害されるようにＨＢＰがレセプター結合部位を被覆する部位でＨＢＰに結合することができる物質であろう。

更に別の観点によれば、本発明はＨＢＰ阻害剤スクリーニング用の試験キットに関し、該キットは、別個の容器の中に、（ａ）ＨＢＰまたはＨＢＰ産生細胞、および（ｂ）ＨＢＰと相互作用することのできる組織、細胞またはその成分を含んで成る。

発明の詳細な説明本発明によれば、ＨＢＰと相互作用することのできる組織、細胞またはその成分は、（ａ）内皮細胞、繊維芽細胞もしくは平滑筋細胞またはその成分、（ｂ）結合組織またはその成分、および（Ｃ）単球またはその成分から成る群から選択することができる。そのような細胞とＨＢＰとの相互作用は、下記に更に詳細に記載するようなＨＢＰの存在下でのそれらの収縮（繊維芽細胞と内皮細胞）または凝集（単球）により証明される。

本発明の方法の一態様では、ＨＢＰまたはＨＢＰ産生細胞を、固体支持体上の集密層に存在する繊維芽細胞、内皮細胞もしくは平滑筋細胞と共に、または懸濁液中の単球と共にインキュベートする。

ＨＢＰ阻害剤であると疑われる物質を添加することによる細胞収縮もしくは凝集の程度の減少または細胞の集密層の回復は、ＨＢＰ阻害剤の存在を示す。逆に、ＨＢＰまたはＩ（ＢＰ産生細胞を添加した後で、ＨＢＰ阻害剤または拮抗剤と疑われる物質を固体支持体上の集密層に存在する繊維芽細胞、内皮細胞もしくは平滑筋細胞と共に、または懸濁液中の単球と共にインキュベートしてもよい。細胞収縮や凝集の減少または防止がＨＢＰ阻害剤の存在を示す。

細胞が集密まで増殖される固体支持体は、この目的で通常側われる任意の常用材料、例えばプラスチック、例えばラテックス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ナイロン、ポリ酢酸ビニルもしくはそれらの適当なコポリマーであることができ、またはコラーゲン、ゼラチンもしくはフィブロネクチンのような結合組織のポリマー成分であることができる。固体支持体の便利な形状は培養皿である。あるいは、ＨＢＰまたはＨＢＰ阻害剤と思われるものと共にインキュベートする細胞が単球である時、ＨＢＰを固体支持体上に固定化してもよい。

ＨＢＰもしくはＨＢＰ産生細胞、またはＨＢＰ阻害剤と思われる物質を内皮細胞、繊維芽細胞または平滑筋細胞の成分と共にインキュベートする時、前記成分は好ましくは表面膜分画または分子、例えばＨＢＰレセプターを含んで成る。このアッセイ態様では、ＨＢＰを固体支持体上に固定化してもよい。あるいはＨＢＰに適当な標識を提供することができる。

本発明のスクリーニング方法において使われる固体支持体は好ましくはポリマーを含んで成る。該支持体はポリマーそれ自体から成るか、またはポリマーでコーティングされた母材から成ることができる。母材はガラス、紙またはプラスチックなどの任意の適当な材料であることができる。ポリマーは、プラスチック（例えばラテックス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ナイロン、ポリ酢酸ビニルおよびそれらの適当なコポリマー）、セルロース（例えば様々な型の紙、例えばニトロセルロース紙等）、シリコンポリマー（例えばシロキサン）、多糖（例えばアガロースまたはデキストラン）、イオン交換樹脂（例えば常用のアニオンまたはカチオン交換樹脂）、ポリリジンのようなポリペプチド、およびガラスなどのセラミック材料（例えば細孔調整ガラス）から成る群から選択することができる。

固体支持体の物理的形態は重要ではないが、当該目的にはある形態がその他の形態よりも一層好都合であることがある。例えば、固体支持体は平板、例えば薄層もしくはマイクロタイタープレート、またはフィルム、ストリップ、膜（例えばナイロン膜またはセルロースフィルター）もしくは固体粒子（例えばラテックスビーズ、デキストランビーズまたはアガロースビーズ）の形であることができる。

ＨＢＰを標識することのできる標識物質は、好ましくは酵素、着色または蛍光物質、放射性同位体および複合体生成剤から成る群から選択される。

標識物質として作用な酵素の例は、ペルオキシダーゼ（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）、ホスファターゼ（例えば酸またはアルカリホスファターゼ）、β −ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、β−グルコシダーゼ、プロテアーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、エステラーゼ、ルシフェラーゼ等である。

酵素は単独では検出可能でなく、最終産物か検出可能である反応を触媒する基質と組み合わせなければならない。本発明の方法に使用することができる基質の例としては、過酸化水素／テトラメチルベンジジンもしくはクロロナフトールもしくは０−フェニレンジアミンもしくは３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸もしくはルミノール、インドキシルホスフェート、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、ニトロフェニルガラクトース、４−メチルウンベリフェリル−Ｄ−ガラクトピラノシド、またはルシフェリンが羊げられる。

あるいは、標識物質が着色または蛍光物質、例えば金粒子、着色または蛍光ラテックス粒子、色素粒子、フルオレセイン、フィコエリスリンまたはフィコシアニンを含んで成ることができる。

この目的に使うことができる放射性同位体は、ｌ−１２５、ｌ−１３１゜Ｉｎ− １１１、Ｈ−３、Ｐ−３２、Ｃ−１４または５−３５から選択することができる。それらの同位体により放出される放射能は、それ自体既知の方法でガンマカウンターやシンチレーションカウンター中で測定することができる。

この目的に使うことができる複合体生成剤は、ビオチン（アビジンまたはストレプトアビジンと複合体生成する）、アビジン（ビオチンと複合体生成する）、プロティンＡ（免疫グロブリンと複合体生成する）およびレクチン（炭化水素レセプターと複合体生成する）から選択することができる。複合体が直接的に検出可能でない時、複合体生成剤と複合体を形成する物質を標識することが必要である。

この標識は、酵素の標識について上述した標識物質のいずれが１つを使って行うことができる。

本発明のスクリーニング方法に使うことができるＨＢＰレセプターは単離された形で使用することができ、そしてそれぞれ上述したように、標識を提供してもよくまたは固体支持体上に固定化されてもよい。しかしながら、該レセプターは膜に結合した形で使うこともでき、即ち完全な細胞にまたは膜調製物の一成分として結合させることもできる。該レセプターが完全な細胞に結合される場合（細胞の表面上に発現される場合）、ＨＢＰへの該レセプターの結合は、細胞を視覚的にカウントするか、または天然の細胞内酵素活性（例えばカテプシンＢ活性）を測定するか、または組換えＤＮＡ技術によって細胞内に導入された酵素活性を測定することにより、測定することができる。

より詳しくは、ＨＢＰ阻害剤についてのアッセイは、固体支持体上に固定化されたＨＢＰレセプターまたはＨＢＰレセプターを発現する細胞もしくはその表面膜分画を、固体支持体上に固定化されたものと同様に、標識したＨＢＰおよびＨＢＰ阻害剤と思われる物質と共にインキュベートし、そして該レセプターに結合したＨＢＰの量を測定することによって達成される。ＨＢＰの結合の減少（阻害剤と思われるものと共にインキュベートしなかった対照に比較して）は、問題の試験物質の阻害効果を指摘する。

（未標識の’）ＨＢＰまたはＨＢＰ産生細胞、ＨＢＰ阻害剤であると思われる物質、およびＨＢＰと相互作用することのできる組織、細胞またはその成分のインキュベーション後に、ＨＢＰ反応性である抗体を添加するということも考えられる。この場合、該抗体に上述したような標識を付けるか、または抗ＨＢＰ抗体の添加後に抗ＨＢＰ抗体反応性である標識したた第二抗体を添加することができる。

上述したようなインテグリンレセブターへのＨＢＰ結合の現在の知見を基にすると、可能なＨＢＰ結合阻害剤は、全体に負の正味電荷を有する物質であると予想される。そのような物質の例は、ｌもしくは複数のＡｓｐおよび／またはＧｌｕ残基を含むペプチド、または硫酸デキストラン、硫酸ヘパリンもしくはスクラルファートのような硫酸化炭化水素である。

本発明のスクリーニング方法で使われるＨＢＰは、該アッセイ中に存在する他の物質からの起こり得る妨害を避けるために、好ましくは実質的に純粋な形である。従って最も好都合には、ＨＢＰは例えば下記のような組換えＤＮＡ技術により調製される。

ＨＢＰをコードするＤＮＡ配列は、確立された標準法、例えばＳ。

Ｌ、　ＢｅａｕｃａｇｅおよびＭ、）１．　Ｃａｒｕｈｔｅｒｓ、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２゜１９８１、１８５９−１８６９頁により記載されたホスホアミダイト法、またはＭａｔｔｈｅＳら、ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　３．１９８４．８０１−８０５頁により記載された方法、によって合成的に調製することができる。ホスホアミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドを例えば自動ＤＮＡ合成装置中で合成し、精製し、アニーリングせしめ、適当なベクターに連結してクローニングする。

ＤＮＡ配列はゲノム由来でもｃＤＮＡ由来でもよく、例えば標準技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ＭａｎｕａＬ第２版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　１９８９）に従って、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを調製しそして合成オリゴヌクレオチドプローブを使ったハイブリダイゼーションによりＨＢＰの全部または一部をコードするＤＮＡ配列についてスクリーニングすることにより得られる。該ＤＮＡ配列は、例えばＬＩＳ　４，６８３．２０２またはＲ，Ｋ。

５ａｉｋｉ　ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３９．１９８８．４８７−４９１頁に記載されたように、特異的プライマーを使ったポリメラーゼ連鎖反応によって調製することもできる。

次いで該ＤＮＡ配列は組換え発現ベクター中に挿入される。この発現ベクターは、便利には組換えＤＮＡ操作にかけることができる任意のベクターであることができる。ベクターの選択は、しばしばベクターを導入しようとする宿主細胞に依存するだろう。例えば、ベクターは、自己複製ベクター、すなわち染色体外存在物、例えばプラスミドとして存在し、その複製が染色体の複製とは無関係であるベクターであることができる。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入すると宿主ゲノム中に組み込まれ、組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであることができる。

ベクター中、ＨＢＰをコードするＤＮＡ配列は、適当なプロモーター配列に作用可能に連結されるだろう。プロモーターは、選択した宿主細胞中で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であることができ、そして宿主細胞に対して同種または異種であるタンパク質をコードする遺伝子から誘導することができる。哺乳動物細胞中でＨＢＰをコードするＤＮＡの転写を指令するための適当なプロモーターの例としては、ＳＶ　４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ　ら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ。

デフウィルス２主要後期プロモーターである。酵母宿主細胞中での使用に適するプロモーターとしては、酵母解糖系遺伝子（ＨｉｔｚｅｍａｎもしくはＡＤｔ（２−４ｃ　（Ｒｕｓｓｅｌｌ　ら、Ｎａｔｕｒｅ　３０４．１９８３．６５２− ６５４頁）プロモーターが挙げられる。糸状菌宿主細胞中での使用に適するブＨＢＰをコードするＤＮＡ配列は、適当なターミネータ−１例えもできる。ベクターは、更にポリアデニル化シグナル（例えばＳＶ　４０またはアデノウィルス５　Ｅｌｂ領域由来）、転写エンハンサ−配列（例えばＳＶ　４０エンハンサ−）および翻訳エンハンサ−配列（例えばアデノウィルスＶＡ　ＲＮＡをコードするもの）といった要素を含んでもよい。

組換え発現ベクターは、該ベクターを問題の宿主細胞中で複製できるようにするＤＮＡ配列を更に含んでもよい。そのような配列の一例は（宿主細胞が哺乳動物細胞である時）ＳＶ　４０複製開始点である。該ベクターはまた、選択可能マーカー、例えば、その産物が宿主細胞中の欠損を補完するような遺伝子、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＰＲ）をコードする遺伝子または薬剤（例えばネオマイシン、ヒグロマイシンもしくはメトトレキセート）に対する耐性を付与する遺伝子を更に含んで成ってもよい。

ＨＢＰをコードするＤＮＡ配列、プロモーターおよびターミネータ−をそれぞれ連結せしめ、そしてそれらを複製に必要な情報を含む適当なベクター中に挿入するのに使われる方法は、当業者に公知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、前掲、を参照のこと）。

発現ベクターか導入される宿主細胞は、ＨＢＰを生産することのできるいずれの細胞でもよいが、好ましくは真核細胞、特に哺乳動物細胞である。適当な哺乳動物細胞系の例は、ＣＯＳ　（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０）　、ＢＨＫ　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６３２．　ＡＴＣＣＣＣＬ　１０）またはＣＨＯ（ＡＴＣＣＣＣＬ　６１　’）細胞系である。哺乳動物細胞をトランスフェクトせしめ、該細胞中に導入されたＤＮＡ配列を発現せしめる方法は、あるいは、真菌細胞（酵母細胞を含む）を宿主細胞として使うこともできる。適当な酵母細胞の例としては、サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　）の種またはシゾサツカロミセス（銃吐軸匣匹匝朋−スベルギルヌ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　）の種またはニューロスポラ（ＮｅＵｒＯ９ｐＯ−■）の種の細胞、特にアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉ　ｆｌｕｓｏｒｙｚａｅ）またはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　）の株である。タンパク質発現のためのアスペルギルス種の使用は、例えばＥＰ　２３８０２３に記載されている。

細胞を培養するのに使用する培地は、哺乳動物細胞を増殖させるのに適当な任意の常用培地、例えば適当な補足物を含有する血清含有培地または無血清培地であることができる。適当な培地は商業的供給業者から入手することができるか、または発表された配合表〔例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）のカタログ中のもの〕に従って調製することができる。

細胞によって生産されたＨＢＰは、次いで遠心または濾過によって培地から宿主細胞を分離し、上溝または濾液のタンパク質様成分を塩、例えば硫酸アンモニウムで沈澱させ、様々なりロフトグラフィー法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等によって精製することを含む常用手段により、培地から回収することができる。

本発明を下記の実施例により一層詳細に説明する。下記実施例は本発明の請求の範囲を何ら制限するものではない。

実施例組織培養皿はＮｕｎｃ社から購入し、血液銀行から新鮮な「パフイコート」を得た。フィコール−パック、パーコールおよびプロティンＡ−セファロースＣＬ− ４８はＰｈａｒｍａｃｉａ社から入手した。ＭＲＣ−５胎芽肺繊維芽細胞とウシ胎児心臓内皮（ＦＢＨＥ）細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手した。骨髄性白血病細胞系０９３７　（Ｃ，Ｓｕｎｄｓｔｒ６ｍおよびに、　Ｎｉ１ｓｓｏｎ、Ｔｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　１７゜１．９７６、５６５−５７７頁を参照のこと）はＡ、　Ｆａｔｔｏｒｓｉ、　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ　ｏｆ　Ａｅｒｏｎａｕｔｉｃａ　Ｍｉｌｉｔａｒｅ、　Ｒｏｍｅ、　Ｉｔａｌｙから得た。ヒトＨＢＰ　（ｈＨＢＰ）（ポリアクリルアミドゲル分析により評価した時９５％以上の純度）は、Ｈ，Ｆｌｏｄｇａａｒｄら（前掲）に記載の通りに好中球から精製した。ホルボール１２ミリステート１３Ａ　（ＰＭＡ）はＳｉｇｍａ社から入手した。Ｎａ−ショ糖−オクタキス（硫酸水素）アルミニウム複合体（スクラルファート）はＢｕｋｈ　Ｍｅｄｉｔｅｃ　Ａ／Ｓ、　Ｆａｒｕｍ。

Ｄｅｎｍａｒｋから入手した。

７７頁〕により記載された方法に従って、健康な提供者から単核細胞を単離した。簡単に言えば、「バフィコート」を１容の冷ダルベツコ改良イーグル培地（ＤＭＥ）で希釈し、モして５０−ファルコン試験管に入った１５ＷＬｌのフィコール−パックの上に重層した。スイングアウトローター中で４００Ｘｇで３０分間遠心した後、フィコール−パックとＤＭＥ−血漿の間の層（単核細胞と血小板を含む）を収集し、次いで細胞をＤＭＥ中で繰り返し洗浄することにより血小板を除去した。パーコール勾配（１，０７０ｇ／ｒｄ！の平均密度を有する等張のパーコールを固定角ローター中で３，２００　Ｘｇにて遠心することによって生成された（Ｊ、Ｃ，Ｇｉｄｄｉｎｇｓら、Ｃｌ１ｎ、　Ｌａｂ、　Ｈａｅｍａｔ、２．１９８０゜１２１頁）〕上での遠心によって単核細胞を更に分画した。この勾配の上に単核細胞を重層し、スイングアウトローター中で２．７００　ｘ　ｇで２０分間遠心した。非特異的エステラーゼ染色により勾配の最上部にある単球が９０％を越える純度であることが決定された。単球をｈＨＢＰと共にインキュベートする時、ｈＨＢＰの添加よりも前にまず該細胞を１０　ｍｇ／−のＢＳＡが補足されたＤＭＥ中で平板培養した。ペニシリンとストレプトマイシンが補足されたＤＭＥ　（培地ｌ−あたり２５９ｇ未満の内毒素を含む）中で単球をインキュベートした。１６時間のインキュベーション後、Ｏｌｙｍｐｕｓ　ＣＫ−２倒立顕微鏡に合わせたＯｌｙｍｐｕｓ　０Ｍ−４カメラで培養物を撮影した。

２０〜３５継代のＭＲＣ−５細胞を使い、１％Ｌ−グルタミン、１．１％ＮａＨＣＯｓ、１％非必須アミノ酸、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびｌＯ％ＦＣ３を含む最少必須培地（ＭＥＭ）中で培養した。ＦＢＩ（Ｅ細胞は１０％新生ウシ血清（ＮＣ３）と１０〜２０　ｎｇ／ｍ１の組換えヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子を含むＤＭＥ中で培養した。両細胞型とも２４ウエルのマクロウェル皿中で集密まで増殖させ、次いでｈＨＢＰでの処理前にＤＭＥ中で１回洗浄した。５％ＣＯ７を含む湿潤大気中でペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥの中で該細胞を３７°Ｃにて１６時間インキュベートした。次いでそれらを写真撮影した。

ｈＨＢＰとのインキュベーション後の細胞形態学の変化集密のＭＲＣ−５またはＦＢＨＥ細胞を、培地に添加された１０μｇ／−のｈＨＢＰと共にインキュベートした時、１６時間のインキュベーション後に細胞収縮を観察することができた。細胞間の広い間隙は残っていた。対照の繊維芽細胞は、血清の欠失のため集密で細長いスピンドル形であり、対照の内皮細胞は典型的な偏平な丸石様細胞であった。１０μｇ／−のｈＨＢＰと共に１６時間インキュベートした単球は大きな多細胞の塊に凝集し、一方対照の単球はウェル表面に薄く付着した。細胞がより丸くなった形態学を示すというような単球の形態学的変化が２時間以内には観察されたが、数時間後には細胞凝集のみが表れた。ＩＯμｇ／ｍＪ！の濃度のｈＨＢＰの存在下で血清無添加のＤＭＥ中に細胞を接種した場合にも、ＭＲＣ−５繊維芽細胞とＦＢＨＥ細胞の塊形成が観察された。より高濃度のｈＨＢＰ（３０μ ｇ／ｍｌ＞では、ＭＲＣ−５とＦＢＨＥの単層はウェル表面から剥離して凝集物を形成した。

１０μｇ／ｍＪまでのｈＨＢＰａ度を使った時、ＭＲＣ−５繊維芽細胞とＦＢＨＥ細胞の収縮は可逆的であり、１０％へのウシ胎児血清の添加が２４時間後に集密単層を完全に回復させた。より高いｈＨＢＰ濃度では、細胞が凝集物中に閉じ込められ、従ってウシ胎児血清の添加後に該基質の方に移動することはできなかった。

Ｕ９３７細胞の同型凝集該細胞をｌθ％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）が補足されたダルベツコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。ＦＣ３不含有ＤＭＥＭ中で細胞を２回洗浄し、２４ウエルのマクロウェル皿の中の１５０　ｎＭＰＭＡ／ＤＭＥＭに０．５Ｘ１０’細胞／１ｄ！の密度で接種した。試験ウェルには１０μｇのＨＢＰを添加し、対照ウェルにはＰＢＳを添加し、次いで５％ＣＯ，を含む湿潤大気中でインキュベートした。培養物を時折検査し、そして１６時間のインキュベーション後に撮影した。

２時間後に同型凝集を観察することができ、１２〜１６時間後に最高潮に達した。対照では、細胞はウェルの底に付着し、十分に拡散していた。

それらの未刺激の条件においては、Ｕ９３７細胞は固定源とは無関係に懸濁状態で増殖する。しかしながら、ＰＭＡで刺激すると、この細胞系はβ、インテグリンＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８およびＣＤｌＩＣ／ＣＤ１８の細胞表面発現の変化を示す。それらのインテグリンの発現の有意な増加とＣＤ７１の減少は、Ｕ９３７細胞からマクロファージ様細胞への分化を特徴付ける（Ｃ，Ｃａｂａｎａｓら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　７．　１９８８．１６７−１７６頁）。

ＰＭＡ刺激されたＵ９３７細胞へのＨＢＰの添加により観察される強い同型凝集は、ＨＢＰがインテグリンに作用しくおそらく二価イオン結合部位に）、そしてこのエピトープと反応するモノクローナル抗体について報告されたのと同じ形で（Ｄ、Ｃ，Ａｌｔｉｅｒｉ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

を媒介することを示す。

この実験構成は、ＨＢＰ阻害剤であると思われる物質をＨＢＰの添加の前または後に添加し、そして上述したような繊維芽細胞もしくは内皮細胞の収縮に対するまたは単球の凝集に対する試験物質の効果を測定することにより、ＨＢＰ阻害剤についてスクリーニングするのに利用することができる。

よって、同様な構成において、Ｎａ−ショ糖−オクタキス（硫酸水素）アルミニウム複合体（スクラルファート）の効果を試験した。

全＜ＨＢＰを含まない対照ウェルへの１００μｇ／ｒｎｌ培地の濃度のスクラルファートの添加は、ＰＭＡ刺激された細胞付着および拡散に影響を与えなかった。しかしながら、該ウェルに１０１１ｇ／−培地の濃度のＨＢＰを添加した時、同濃度のスクラルファートが上記細胞の同型凝集を強力に抑制した。ＨＢＰの阻害の背後にある機構は、強く負に荷電したスクラルファート分子によるＨＢＰの７４〜８０位のＡｒｇ〜Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇ　ｌｕ−Ａｒｇ−Ｇ　ｌｕ−３ｅｒ −Ａｒｇモチーフの静電中和によって引き起こされるものと思われる。

国際調査報告を−一一−ｍ、、＋−ｗ−ＰＣＴ／Ｉ）＋　９２１００２７Ｇ

Claims

【特許請求の範囲】

１．ヘパリン結合タンパク質（ＨＢＰ）の阻害剤についてのスクリーニング方法であって、ＨＢＰまたはＨＢＰ産生細胞を、ＨＢＰ阻害剤であると思われる物質と共にインキュベートし、次いでＨＢＰと相互作用することのできる組織、細胞またはその成分と共にインキュベートし、そして前記組織、細胞またはその成分とＨＢＰとの相互作用に対する前記物質の効果を検出することを含んで成り、前記相互作用の減少が前記物質がＨＢＰ阻害剤であることを示す方法。
２．ヘパリン結合タンパク質（ＨＢＰ）の阻害剤についてのスクリーニング方法であって、ＨＢＰまたはＨＢＰ産生細胞を、ＨＢＰと相互作用することのできる組織、細胞またはその成分と共にインキュベートし、次いでＨＢＰ阻害剤であると思われる物質と共にインキュベートし、そして前記組織、細胞またはその成分とＨＢＰとの相互作用に対する前記物質の効果を検出することを含んで成り、前記相互作用の減少が前記物質がＨＢＰ阻害剤であることを示す方法。
３．ヘパリン結合タンパク質（ＨＢＰ）の阻害剤についてのスクリーニング方法であって、ＨＢＰ阻害剤であると思われる物質を、ＨＢＰと相互作用することのできる組織、細胞またはその成分と共にインキュベートし、次いでＨＢＰまたはＨＢＰ産生細胞と共にインキュベートし、そして前記組織、細胞またはその成分とＨＢＰとの相互作用に対する前記物質の効果を検出することを含んで成り、前記相互作用の減少が前記物質がＨＢＰ阻害剤であることを示す方法。
４．前記ＨＢＰと相互作用することのできる組織、細胞またはその成分が、（ａ）内皮細胞、繊維芽細胞もしくは平滑筋細胞またはその成分、（ｂ）結合組織またはその成分、および（ｃ）単球またはその成分から成る群より選択される、請求項１，２または３に記載の方法。
５．前記ＨＢＰもしくはＨＢＰ産生細胞、またはＨＢＰ阻害剤であると思われる物質が内皮細胞、繊維芽細胞または平滑筋細胞と共にインキュベートされる時、前記内皮細胞、繊維芽細胞または平滑筋細胞が固体支持体上の集密層に存在する、請求項４に記載の方法。
６．前記固体支持体が、ポリマー、例えばコラーゲン、ゼラチンもしくはフィブロネクチン、またはプラスチック、例えばラテックス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ナイロン、ポリ酢酸ビニル、またはそれらの適当なコポリマーを含んで成る、請求項５に記載の方法。
７．前記ＨＢＰもしくはＨＢＰ産生細胞、またはＨＢＰ阻害剤であると思われる物質が内皮細胞、繊維芽細胞または平滑筋細胞の成分と共にインキュベートされる時、前記成分が表面膜分画または分子である、請求項４に記載の方法。
８．前記表面膜分子がＨＢＰレセプターである、請求項７に記載の方法。
９．前記ＨＢＰが単球とインキュベートされる時、前記ＨＢＰが固体支持体上に固定化されている、請求項４に記載の方法。
１０．前記ＨＢＰが組換えＨＢＰである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
１１．前記ＨＢＰに標識が提供される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
１２．前記ＨＢＰまたはＨＢＰ産生細胞、ＨＢＰ阻害剤であると思われる物質、およびＨＢＰと相互作用することのできる組織、細胞またはその成分のインキュべーション後に、ＨＢＰ反応性である抗体が添加される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
１３．前記抗体に標識が提供される、請求項１２に記載の方法。
１４．前記抗ＨＢＰ抗体の添加後に、前記抗ＨＢＰ抗体反応性である標識した第二抗体が添加される、請求項１２に記載の方法。
１５．ＨＢＰ阻害剤または拮抗剤についてのスクリーニング用の試験キットであって、別個の容器の中に、（ａ）ＨＢＰまたはＨＢＰ産生細胞、および（ｂ）ＨＢＰと相互作用することのできる組織、細胞またはその成分を含んで成る試験キット。
１６．前記ＨＢＰと相互作用することのできる組織、細胞またはその成分が、（ｉ）内皮細胞、繊維芽細胞もしくは平滑筋細胞またはその成分、（ｉｉ）結合組織またはその成分、および（ｉｉｉ）単球またはその成分から成る群より選択される、請求項１５に記載の試験キット。
１７．前記内皮細胞、繊維芽細胞もしくは平滑筋細胞またはその成分が固体支持体上に固定化されている、請求項１６に記載の試験キット。
１８．前記内皮細胞が固体支持体上の集密層に存在する、請求項１７に記載の試験キット。
１９．前記固体支持体が、ポリマー、例えばコラーゲン、ゼラチンもしくはフィブロネクチン、またはプラスチック、例えばラテックス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ナイロン、ポリ酢酸ビニル、またはそれらの適当なコポリマーを含んで成る、請求項１７または１８に記載の試験キット。
２０．前記内皮細胞の成分が表面膜分画または分子である、請求項１６に記載の試験キット。
２１．前記表面膜分子がＨＢＰレセプターである、請求項２０に記載の試験キット。
２２．前記ＨＢＰまたはＨＢＰ産生細胞が固体支持体上に固定化されている、請求項１５に記載の試験キット。
２３．前記ＨＢＰに標識が提供される、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の試験キット。
２４．別個の容器の中に、ＨＢＰ反応性である標識した抗体を更に含んで成る、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の試験キット。
２５．それぞれ別個の容器の中に、ＨＢＰ反応性である第一抗体、および前記第一抗体反応性である標識した第二抗体を更に含んで成る、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の試験キット。