LT3472B - Dna encoding a growth factor specific for epithelial cells - Google Patents

Dna encoding a growth factor specific for epithelial cells Download PDF

Info

Publication number
LT3472B
LT3472B LTIP667A LTIP667A LT3472B LT 3472 B LT3472 B LT 3472B LT IP667 A LTIP667 A LT IP667A LT IP667 A LTIP667 A LT IP667A LT 3472 B LT3472 B LT 3472B
Authority
LT
Lithuania
Prior art keywords
cells
protein
kgf
kaf
dna
Prior art date
Application number
LTIP667A
Other languages
English (en)
Inventor
Jeffrey S Rubin
Paul W Finch
Stuart A Aaronson
Original Assignee
Jeffrey S Rubin
Paul W Finch
Stuart A Aaronson
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23175833&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=LT3472(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Jeffrey S Rubin, Paul W Finch, Stuart A Aaronson filed Critical Jeffrey S Rubin
Publication of LTIP667A publication Critical patent/LTIP667A/xx
Publication of LT3472B publication Critical patent/LT3472B/lt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C07K14/501—Fibroblast growth factor [FGF] acidic FGF [aFGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

Šis išradimas skirtas augimo faktoriams, ypač polipeptidų augimo faktoriaus, analogiško faktorių šeimai, apimančiai žinomus filbroblastų augimo faktorius (FAF), išsiskyrimui. Šis išradimas taip pat skirtas komplementarių DNR (kDNR) segmentų sudarymui iš informacinės RNR (iRNR), koduojančios naują augimo faktorių. Be to, išradimas susijęs su tokių DNR segmentų produktų sinteze rekombinantinėmis ląstelėmis ir tam tikrų kitų produktų, gaunamų DNR, koduojančių šį augimo faktorių, identifikacija bei klonavimu, gamyba ir panaudojimu.
Sutrumpinimai, naudojami šiame aprašyme rFAF bFAF
EAF
HSAC kb kDa
KAF
NaDodSOų/PAGE
AF-ASSC
TAFa
- rūgštinių fibroblastų augimo faktorius
- bazinių fibroblastų augimo faktorius
- epiderminis augimo faktorius
- heparino-Sefarozės afininė chromatografija
- kilobazės
- kilodaltonai
- keratinocitų augimo faktorius
- Natrio dodesilsulfato (SDS)/poliakrilamido gelio elektroforezė
- atvirkščios fazės aukšto skiriamumo skystinė chromatografija
- transformuojantis augimo faktorius a
Išradimo prielaidos
Augimo faktoriai yra svarbūs tarpląstelinių ryšių mediatoriai .
Šios galingos molekulės paprastai yra išskiriamos vieno ląstelių tipo ir proliferaciją (žiūr. Bradshaw, R.A. (1984) įtakoja kitų tipų ląstelių nuorodą James (James, R. and
Ann. Rev. Biochem. 53, 259-292)
I Eksperimentiniame skyriuje žemiau). Susidomėjimas augimo faktoriais padidėjo, įrodžius jų potencialų dalyLT 3472 B vavimą neoplazijoje (Sporn, M.B. and Todaro, G.J. (1980) N. Eng. J. Med. 303, 878-880, II Eksperimentiniame skyriuje žemiau). V-asis beždžionių sarkomos viruso transformuojantis genas koduoja proteiną, homologišką augimo faktoriaus-trombocito darinio B grandinei (James, R. and Bradshaw, R.A. (1984) Ann. Rev. Biochem. 53, 259-292), (Doolittle, R.F., Hunkapiller, M.W., Hood, L.E. Devare, S.G., Roobbins, K.C., Aaronson, S.A. and Antoniades, M.N. (1983) Science 221, 275-277) . Be to, daug onkogenų yra genų, koduojančių augimo faktoriaus receptorius, homologai (James, R. and Bradshaw, R.A. (1984) Ann. Rev. Biochem. 53, 259-292). Tuo būdu, gilesnis augimo faktorių ir signalinės transdukcijos, tarpininkaujant jų receptoriams, kelių supratimas, kaip matyti, leidžia geriau suprasti tiek normalių, tiek piktybinių ląstelių augimo mechanizmus.
Viena žinoma augimo faktorių šeima, veikianti jungiamojo audinio ląsteles, apima rūgštinių fibroblastų augimo faktorių (rFAF), bazinių fibroblastų augimo faktorių (bFAF), giminingus hst ir int-2 onkogenų produktus . Be to, yra žinoma, kad kai kurie augimo faktoriai, iškaitant toliau minimus, pasižymi hepariną jungiančiomis savybėmis: rFAF (Maciag, T., Mehlman, T., Friesel, R. and Schreiber, A.B. (1984) Science 225, 932-935), (Conn, G. and Hatcher, V.B. (1984) Biochem. Biophys .Res .Comm. 124, 262-268); bFAF (Gospodarowicz, D.,
Cheng, J., Lui, G.-M., Baird, A. and Bohlen, P. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6963-6967), (Maciag, T., Mehlman, T., Friesel, R. and Schreiber, A.B. (1984) Science 225, 932-935); granuliocito/makrofago koloniją stimuliuojantis faktorius (James, R. and Bradshaw, R.A. (1984) Ann. Rev. Biochem. 53, 259-292); ir interleukinas 3 (James, R. and Bradshaw, R.A. (1984) Ann. Rev. Biochem. 53, 259-292). Kiekvienas iš šių polipeptidinių faktorių yra gaminamas stromos ląstelių (James, R. and Bradshaw, R.A. (1984) Ann. Rev. Biochem. 53, 259-292), (Doolittle, R.F., Hunkapiller, M.W., Hood, L.E. Devare, S.G., Robbins, K.C., Aaronson, S.A. and Antoniades, M.N. (1983) Science 221, 275-277), (Roberts, R., Gallagher, J., Spooncer, E., Allen, T.D., Bloomfield, F. Dexter, T.M. (1988) Nature 332, 376-378) . Tokie faktoriai, atrodo, išsidėstę neląsteiinėje matricoje arba ant proteoglikanų, dengiančių stromos lątelės paviršių (James, R. and Bradshaw, R.A. (1984) Ann. Rev. Biochem. 53, 259-292), (Roberts, R., Gallagher, J., Spooncer, E., Allen, T.D., Bloomfield, F. and Dexter, T.M. (1988) Nature 332, 376378) . Postuluota, kad jų saugojimas, išskyrimas ir kontaktai su konkrečiomis laptelėmis-taikiniais yra reguliuojami tokia sąveika (Roberts, R., Gallagher, J., Spooncer, E., Allen, T.D., Bloomfield, F. and Dexter, T.M. (1988) Nature 332, 376-378), (Vlodavsky, I., Folkmann, J., Sullivan, R., Fridman, R., Ishai-Michaeli, R., Sasse, J. and Wasgburn, M. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci USA 84, 2292-2296).
Tačiau plačiai pripažinta, kad labai daug piktybinių darinių žmoguje yra epitelinių audinių dariniai (Wright, N. and Allison, M. (1984) The Biology of Epithelial Cell Populations (Oxford University Press, New York) Vol. 1, pp. 3-5) . Buvo aprašyti epitelinių ląstelių iš mezenchimos audinių proliferacijos efektoriai (James, R. and Bradshaw, R.A. (1984) Ann. Rev. Biochem. 53, 259-292), (Doolittle, R.F., Hunkapiller, M.W., Hood, L.E. Devare, S.G., Robbins, K.C., Aaronson, S.A. and Antoniades, M.N. (1983) Science 221, 275-277), (Waterfield, M.D., Scrace, G.J., Whittle, N., Strooband, P., Johnson, A., Wasteton, A., Westermark, B., Heldin, C.-H., Huang, J.S. and Deul, T.F. (1983) Nature 304, 35-39), tačiau jų molekulinių identiškumas ir struktūra nebuvo nustatyta.
Trūkstant žinių apie tokius mezenchiminius augimo faktorius, veikiančius epitelines ląsteles, akivaizdu, kad reikalingi metodai, kompozicijos ir biologinė analizė, kurie pagilintų žinias bei epitelinių ląstelių proliferacijos reguliavimo mechanizmų analize ir, galų gale, reikalingos naujos diagnostinės bei terapinės priemonės, paremtos tokiais faktoriais.
Šis išradimas numato proteino išskyrimo metodų ir rekombinantinių DNR technologijų panaudojimą minėtų poreikių patenkinimui ir mezenchiminės prigimties proteino faktorių, kurie, atrodo, yra susiję su epitelinių ląstelių proliferacijos procesais ir kurie negali būti gauti kitaip, gamybos būdų išsivystymui.
Šis išradimas skirtas proteino išskyrimo ir rekombinantinių DNR technologijų išsivystymui, kuris apima naujų augimo faktoriaus proteinų, veikiančių epitelines ląsteles, neturinčias kitų peptidinių faktorių, gamybą, į išradimo sritį taip pat įeina nauji DNR segmentai ir biologinės analizės metodai.
Šis išradimas, atskiru atveju, skirtas naujam proteinui, turinčiam struktūrines ir/arba funkcionalines charakteristikas žinomos augimo faktorių šeimos, apimančios rūgštinių fibroblastų augimo faktorių (rFAF), bazinių fibroblastų augimo faktorių (bFAF) ir giminingus hst ir int-2 onkogenų produktus. Šis naujas FAF polipeptidų šeimos narys išlaiko FAF hepariną jungiančias savybes, bet dar pasižymi unikaliu specifiškumu ląstelės-taikinio atžvilgiu. Šis augimo faktorius, pasirodo, yra specifinis epitelinėms ląstelėms ir ypač aktyvus keratinocitų atžvilgiu. Todėl šis naujas faktorius buvo pavadintas keratinocitų augimo faktoriumi (KAF). Nepaisant to, kad jis nėra aktyvus fibroblastų atžvilgiu, kadangi tai šeštas žinomas FAF polipeptidinės šeimos narys, KAF gali būti pažymėtas FAF-6.
Todėl šis išradimas iš dalies skirtas išgrynintiems KAF arba panašiems į KAF proteinams bei jų gavimo būdams. Tokie išgryninti faktoriai gali būti gauti, kultivuojant žmogaus ląsteles, kurios išskiria tokius proteinus iš prigimties ir taikant išskyrimo metodus pagal praktinį šio išradimo aspektą. Tokie proteinai gali būti panaudoti biocheminiams ir biologiniams tyrimams, vedantiems prie, pvz., DNR segmentų, koduojančių KAF arba į KAF panašų polipeptidą, išskyrimo.
Šis išradimas taip pat skirtas tokiems DNR segmentams, kurie koduoja KAF arba į KAF panašius proteinus. Pagrindiniame įgyvendinime šis išradimas skirtas DNR segmentams, kurie koduoja KAF giminingus produktus, susidedančius iš: žmogaus kDNR klonų 32 arba 49, gautų iš poliadenilintos RNR, ekstrahuotos iš žmogaus embriono plaučių fibroblasto ląstelinės linijos M426; šių klonų rekombinantų ir mutantų; giminingų DNR segmentų, kurie gali būti nustatyti hibridizacija su bet kuriais aukščiau minėtais žmogaus DNR segmentais; ir tokie giminingi segmentai koduoja į KAF panašius proteinus arba jų dalis.
Praktiškai realizuojant vieną šio išradimo įgyvendinimą, šio išradimo DNR segmentai sugeba pasireikšti tinkamose šeimininko ląstelėse, tuo pagamindami KAF arba į KAF panašius proteinus. Išradimas taip pat skirtas iRNR, gautų šio išradimo DNR segmentų jutimo sijų transkripcija.
Kitame įgyvendinime šis išradimas skirtas rekombinantinės DNR molekulei, susidedančiai iš šio išradimo vektoriaus ir DNR. Šių rekombinantinių molekulių pavyzdžiai yra molekulės, sudarytos iš KAF kDNR ir bet kurios iš šių vektorinių DNR: vektoriaus, klonuojančio bakteriofagą γ (kaip pavyzdys gali būti ypCEV9); plazminio vektoriaus, nustatančio DNR seką (pvz., variantas pUC); bakterinio geno ekspresijos vektoriaus (pvz., pKK233-2); arba žinduolio geno ekspresijos vektoriaus (toks kaip pMMT).
Dar kitame įgyvendinime šis išradimas apima ląstelę, geriau žinduolio ląstelę, transformuotą šio išradimo DNR. Be to, išradimas apima ląsteles, įskaitant vabzdžių ląsteles, mielių ląsteles ir bakterines ląsteles, tokias kaip Escherichia coli ir B. subtilus, transformuotas šio išradimo DNR. Pagal kitą šio išradimo aspekto įgyvendinimą transformuojanti DNR sugeba būti išskirta ląstelėje, dėl ko padidėja KAF arba į KAF panašaus proteino, užkoduoto šia DNR, kiekis.
Pirminis KAF transcliacijos produktas, prognozuotas iš jo kDNR sekos, turi N-gaio hidrofobinę sritį, kuri, gal būt, yra kaip signalinė seka sekrecijai ir kurios nėra subrendusioje molekulėje. Šio išradimo genų ekspresijos aspekto tinkamiausiame įgyvendinime ląstelė, transformuota šio išradimo DNR, išskiria proteiną, užkoduotą šios DNR, tokio (nupjauto) pavidalo, koks yra išskiriamas žmogaus embrioninio plaučio fibroplasto ląstelių .
Dar toliau, šis išradimas numato KAF arba į KAF panašius proteinus, gautus šio išradimo DNR ekspresija arba šio išradimo RNR transliacija. Geriau, kai tokie proteinai yra išskirto pavidalo (t.y. nėra aiškios signalinės sekos). Šie proteininiai faktoriai gali būti panaudoti funkciniams tyrimams ir gali būti išgryninti papildomai struktūrinei ir funkcinei analizei, tokiai kaip kokybinė ir kiekybinė receptoriaus jungimo analizė.
Dar daugiau, sugebėjimas gaminti didelius šio naujo augimo faktoriaus kiekius rekombinantine technologija leis tikrinti jo klinikini pritaikomumą būsenose, kur
Ί specifinė epitelinių ląstelių augimo stimuliacija yra ypač svarbi.
Todėl i šį išradimą įeina farmaciniai mišiniai, susidedantys iš KAF arba į KAF panašių polipeptidinių, skirti vartoti ligos sąlygomis, pvz., nudegimo žaizdų gydymui arba transplantuoto ragenos audinio stimuliacijai .
Pagal šį išradimo įgyvendinimą nauji į KAF panašūs proteinai bus proteininiai šio išradimo nemodifikuotų DNR ir iRNR produktai arba bus modifikuoti ar gauti genų ekspresijos būdais proteininiai produktai. Kaip inžinerinių mutacijų DNR sekose rezultatas modifikuoti į KAF panašūs proteinai turės vieną ar daugiau skirtumų aminorūgščių sekoje nuo atitinkamų gamtinių laukinio tipo proteinų. Pagal vieną šio išradimo aspekto įgyvendinimą modifikuoti į KAF panašūs proteinai turės chimerines molekules, susidedančias iš KAF aminorūgščių sekų ir bent vieno kito FAF peptidinės šeimos nario.
Galiausiai, pateikti analogiškų sėkmingų tyrimų su kitais peptidiniais faktoriais, turinčiais tas pačias savybes, rezultatai, ir tokių chimerinių į KAF panašių polipeptidų išvystymas turėtų atvesti prie pagerintų į KAF- panašių antros kartos pavidalo peptidų, skirtų klinikiniams tikslams. Šie modifikuoti i KAF panašūs produktai gali būti mažesni, stabilesni, galingesni ir/arba, pvz., lengviau ar pigiau pagaminami.
Į ši išradimą dar įeina bionalizės metodai iRNR ekspresijos žmogaus ląstelėse ir proteinų, gautų iš giminingų išradimo DNR segmentų, nustatymui. Pagal vieną tokį įgyvendinimą šio išradimo DNR gali būti panaudojama kaip zondas stacionarios būsenos lygių arba giminingų iRNR indukcijos kinetikos nustatymui. KAF giminingų kDNR klonų buvimas įgalina nustatyti atvejus, kai klinikinėse būsenose, besiskiriančiose perteklišku epitelinių ląstelių augimu, įskaitant displaziją ir neoplaziją (pvz., psoriazė, piktybiniai arba gerybiniai augliai) , yra anomali tokio augimo faktoriaus ekspresija.
Šis išradimas taip pat numato naujus antikūnus paptidui, užkoduotam šio išradimo DNR segmentais. Šiame išradimo įgyvendinime antikūnai yra iš prigimties monokloniniai arba polikloniniai ir yra gaunami, panaudojant KAF giminingus polipeptidus iš natūralių, rekombinantinių arba sintetinių cheminių šaltinių.
Šio išradimo antikūnai specifiškai jungiasi prie KAF arba prie į KAF panašaus proteino, kuris apima tokio peptido seką, ir geriau, kai šis proteinas yra natyvios (biologiškai aktyvios) konformacijos. Tokie antikūnai gali būti naudojami KAF arba į KAF panašių proteininių faktorių nustatymui arba gryninimui. Geriausiame šio išradimo aspekto įgyvendinime antikūnai neutralizuos KAF stimuliacinį aktyvumą, tuo įgalindami mechanistinius tyrinėjimus ir, galų gale, klinikinių būklių, apimančių pertekliškus KAF lygius, gydymą.
Trumpas figūrų aprašymas
Fig. 1-1 pateikti kondicionuotos terpės iš M426 žmogaus embrioninių fibroblastų heparino-Sefarozės afininės chromatografijos rezultatai, rodantys, kad daugiau kaip 90% mitogeninio pelių keratinocitų (BALB/MK) aktyvumo išplaunama eliuentu 0.6 M NaCl.
Fig. 1-2 iliustruoja tolesnio mitogeno iš žmogaus fibroplastų gryninimo rezultatus, panaudojant ASSC (aukšto skiriamumo skystinę chromatografiją, HPLCangl.) su adsorbcine matrica. Nuotrauka (A) rodo atvirkščios fazės (C4) BALK/MK mitogeninio aktyvumo ASSC. Nuotraukoje (B) pateikti frakcijų, parinktų iš chromatografijos stadijos C4, parodytos nuotraukoje A, elektroforezinės (NaDodS04/PAGE) analizės duomenys, demonstruojantys faktą, kad ASSC pikų frakcijos turi vienintelę juostą sidabru apdažytame gelyje. Nuotrauka (C) yra DNR sintezės BALB/MK ląstelėse, veikiant frakcijoms, analizuotoms nuotraukoje B, grafikas, rodantis, kad santykinis mitogeninis aktyvumas gerai koreliuojasi su proteininės juostos aktyvumo profilyje intensyvumu.
Fig. 1-3 parodyta alternatyvi gryninimo AF-ASSC stadija, panaudojant molekulinių sietų chromatografiją kolonėlėje (TSK G3000SW GlasPac) su vandeniniu tirpalu, esant pH artimam fiziologinio tirpalo pH, dėl ko gaunamas pagrindinis mitogeninio aktyvumo pikas BALB/MK bioanalizėj e.
Fig. 1-4 iliustruoja DNR sintezės BALB/MK, veikiant TSK-išgrynintam mitogenui ir kitiems augimo faktoriams, palyginimą.
Fig. 1-5 rodo BALB/MK ląstelių augimo chemiškai apibrėžtoje terpėje, veikiant įvairioms augimo faktorių kombinacijoms, palyginimą.
1-1 lentelėje susumuoti įvairių gryninimo stadijų rezultatai, rodantys, kad molekulinių sietų chromatografija gaunamas žymiai geresnis aktyvumo regeneravimas, negu adsorbciniu AF-ASSC būdu.
1-2 lentelėje susumuoti įvairių augimo faktorių specifiškumo ląstelės-taikinio atžvilgiu duomenys, demonstruojantys, kad naujas išskirtas faktorius pasižymi stipriu mitogeniniu poveikiu keratinocitams (BALB-MK) ir, visiškai priešingai tam, neturi nustatomos Įtakos io fibroblastams arba žmogaus poodinės venos endotelinėms ląstelėms.
Fig. II-l pateikta nukleotidinė seka ir nustatyta KAF kDNR aminorūgščių seka, kaip ir RNR, transkribuotų iš KAF geno, identifikacija. Nuotraukoje (A) schematiškai parodyti žmogaus KAF kDNR klonai. Nuotraukoje (B) pavaizduotas KAF kDNR nukleotidas ir prognozuotos aminorūgščių sekos. (C) - KAF genų RNR matricų identifikacija Northern apdažymo (Northern blot) analize.
Fig. II-2 iliustruoja giminingų molekulių, įskaitant, FAF šeimos topologinį palyginimą, ypatingą dėmesį skiriant dviems proteinų duomenims, kurie turi aukštą homologiją, numatomas signalines peptidų sekas ir dvi užkonservuotas cisteino liekanas.
Fig. II-3 rodo giminingų KAF iRNR ekspresijos parinktose normaliose žmogaus ląstelės linijose ir audiniuose analizės duomenis, atskleidžiančius, kad vienintelė 2.4 kb matrica buvo RNR iš žmogaus embrioninio plaučio fibroplastų ir suaugusio odos fibroplastų, tuo tarpu (B5/589) epitelinėse arba (HA83) glialinėse ląstelės linijose, arba pirminėse žmogaus poodinės venos endotelinių ląstelių kultūrose matricos nebuvo rasta.
II-l lentelėje susumuotas heparino poveikio KAF mitogeniniam aktyvumui ir poveikio kitiems augimo faktoriams palyginimas, rodantis, kad timidino įvedimas į BALB/MK ląstelių pagalba, veikiant KAF, buvo inhibuojamas heparinu, priešingai tiek rFAF, tiek bFAF aktyvumui, kurie padidėjo, taip apdorojus.
Šis išradimas dalinai skirtas išgrynintiems KAF arba į KAF panašiems proteinams ir šių proteinų paruošimo būdams. Pagrindinis šio išradimo aspektas skirtas homogeniniam KAF, besiskiriančiam tariama 28 kDa molekuline mase, besiremiančia migracija NaDodS04/PAGE, judėjimu vieninteliu piku atvirkščiosios fazės aukšto veikimo skystinės chromatografijos analizėje, ir mažiausiai 34 χ 104 vienetų/miligramui, geriau mažiausiai 3.2 χ 105 vienetų/miligramui specifiniu aktyvumu, kur vienas aktyvumo vienetas yra apibrėžiamas kaip kiekis, kuris sukelia pusę maksimalios galimos DNR sintezės stimuliacijos tam tikrose epitelinėse (keratinocitų) ląstelėse standartinėse sąlygose, nurodytose žemiau.
and Aaronson, S.A. (1983) indikacinę ląstelę tokių
Tam, kad būtų identifikuoti nauji augimo faktoriai, specifiniai epitelinėms ląstelėms, naudojo kloninę BALB/c pelių keratinocitinę ląstelės liniją, pažymėtą kaip BALB/MK (Weissman, B.E
Cell 32, 599, 606), kaip faktorių aptikimui. Šios ląstelės priklauso nuo jų augimo ant epitelinės ląstelės mitogeno ekzogeninio šaltinio net terpėje, turinčioje serumo (Weissman, B.E. and Aaronson, S.A. (1983) Cell 32, 599, 606). Chemiškai apibrėžtos terpės šioms ląstelėms sukūrimas įgalina pademonstruoti faktą, kad BALB/MK proliferacijai reikia dviejų pagrindinių mitogeninių kelių. Vienas iš jų numato į insuliną panašaus I faktoriaus (arba didelės koncentracijos insulino) dalyvavimą, o kitam pakanka epiderminio augimo faktoriaus (EAF), transformuojančio augimo faktoriaus a (TGFa), rūgštinio fibroblastinio (rFAF) arba bazinio (bFAF) (Falco, J. P., augimo faktoriaus augimo faktoriaus DiFiore, P.P., Weissman, (1988) Oncogene 2, 573-578( fibroplastinio
Taylor, W.G., Aaronson, S. A.
B.E, and
Naudojant BALB/MK kaip prototipinę epitelinę ląstelinę liniją ir NIH/3T3 kaip jos fibroblastinę kontrdalį, kondicionuotas terpes iš įvairių žmogaus ląstelinių linijų analizavo dėl naujų specifinių mitogenų. Šie išradimo biologinės analizės metodai įgalina atlikti gryninimą iki vieno iš tokių naujų augimo faktorių, išskiriamo žmogaus embrioninio plaučio fibroplastinės linijos ir pažymėto kaip keratinocitų augimo faktorius (KAF) homogeniškumo.
Trumpai, į KAF panašaus aktyvumo bionalizė standartinėse sąlygose susideda iš tokių stadijų:
(i) Pelių keratinocitai (BALB/MK ląstelės) yra auginami kultūroje iki susiliejimo ir tada laikomi 24-72 valandas terpėje, neturinčioje serumo;
(ii) Įdėjus bandomuosius pavyzdžius, DNR sintezės sti 3 muliaciją nustato, ^vesdami H-timidino į rūgštimi nusodinamą DNR.
Tam, kad nustatytų mitogeninio augimo faktoriaus specifiškumą ląstelės-taikinio atžvilgiu, DNR sintezės stimuliacija, išreikšta kaip stimuliuotos sintezės ir foninio timidino Įvedimo santykis, nesant pridėtinio bandomojo pavyzdžio, gali būti palyginta su analogiška stimuliacija, stebima ląstelėse, besiskiriančiose nuo keratinocitų tokiose pačiose analizės sąlygose. Tokiais palyginimais buvo nustatyta, kad KAF mitogeninis aktyvumas pasižymi aiškiai išreikštu specifiškumu keratinocitų atžvilgiu, skirtingai negu fibroblastų atžvilgiu (mažiausiai apie 500-kar'tinis stimuliacijos padidėjimas), ir mažesniu, bet žymiai (mažiausiai apie 50 kartų) stipresniu aktyvumu keratinocitų atžvilgiu negu kitų epitelinių ląstelių tipų atžvilgiu (žiūr. 1-2 lentelę su tolesniais duomenimis ir I Eksperimentiniame skyriuje smulkesniam susipažinimui su standartinėmis bioanalizės sąlygomis).
Naudojant KAF gamybos būdą, apimanti ląstelių kultivavimą ir mitogeninio aktyvumo išskyrimą, kur toks būdas apima ultrafiltraciją, heparino-Sefarozės afininę chromatografiją (HSAC) ir adsorbcinę atvirkščios fazės aukšto skiriamumo skystinę chromatografiją (AF-ASSC) , arba, alternatyviai, molekulinių sietų ASSC (TSK-ASSC) pagal šį išradimą, buvo išskirtas preparato kiekis, pakankamas fiziniam ir biologiniam tokios molekulės smulkiam charakterizavimui.
Susumuojant, KAF gamybos iš produkuojančių ląstelių, tokių kaip M426 žmogaus embrioniniai fibroblastai (Aaronson, S.A. and Todaro, G.J. (1968) Virology 36, 254-261), būdas, pvz., susideda iš tokių stadijų:
(i) Kondicionuotos terpės paruošimas (pvz., 10 ltr), panaudojant monosluoksnes kultūras, gautas, cikliškai apdorojant nuo terpės, kurioje yra serumo, iki terpės, neturinčios serumo, ir saugant serumo neturintį derlių -70°C temperatūroje iki tolesnio naudojimo;
(ii) Koncentravimas ultrafiltravimu, panaudojant membranas su 10 kDa molekulinės masės pralaidumu keliose nuosekliose stadijose, atskleidžiant buferyje (kad būtų palengvintas mažo molekulinio svorio medžiagų pašalinimas) , paskui paprastai laikymas -70°C temperatūroje;
(iii) Afininė chromatografija heparine, sujungtame su polimeriniu pagrindu (pvz., Sefaroze), išplaunant eliuentu - didėjančios NaCl koncentracijos gradientu;
(iv) Koncentracija iki 10-20 kartinio tūrio sumažinimo smulkaus mastelio ultrafiltraciniais įrengimais su pralaidumu iki 10 kDa molekulinės masės (pvz., mikrokoncentratorius Centrikon-10 iš Amicon) ir laikymas -70°C temperatūroje;
Kita gryninimo proceso stadija susideda arba iš stadijos (v) arba, alternatyviai, stadijos (vi), t.y.:
(v) Aktyvių frakcijų (0.6 M NaCl) iš ankstesnės HSAC stadijos AF-ASSC organinių tirpiklių sistemose;
arba (vi) Molekulinių sietų ASSC (pvz., TSK-G3000SW Glas-Pac kolonėlė iš LKB) vandeniniame buferyje, kurio pH artimas fiziologiniam pH (pvz., Tris-HCl, pH 6.8/0.5 M NaCl), po to laikymas -70°C temperatūroje.
Preparatas, gautas TSK stadijoje (vi) buvo beveik toks pat grynas, kaip ir preparatas, gautas iš AF-ASSC, sprendžiant pagal NaDodS04/PAGE dažant sidabru analizę (duomenys nepateikti); bet TSK būdas davė žymiai geresnę aktyvumo regeneraciją (1-1 lentelė) . Be to, TSK-išgryninta medžiaga pasižymėjo žymiai didesniu specifiniu aktyvumu, negu medžiaga, gauta AF-ASSC. KAF, gautas aukščiau aprašytu būdu TSK, stimuliavo DNR sintezę epitelinėse ląstelėse subnanomolinėse koncentracijose, bet neindukavo jokio timidino įvedimo į fibroblastų arba endotelinių ląstelių DNR, esant palyginamoms arba aukštesnėms koncentracijoms (iki 5 mM) . Toks aktyvumas jautrus rūgštims, šilumai ir tirpikliams, naudojamiems AF-ASSC stadijoje (žiūr., I Eksperimentini skyrių, jautrumo duomenis ir kitas gamybos būdo detales).
Naudojant standartinę metodologiją, gerai žinomą šioje srityje, buvo nustatyta nedviprasmiška aminorūgščių seka padėtims 2-13 iš išgryninto KAF galo:
Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Thr-Asn-Val (žiūr. I Eksperimentinį skyrių).
Į š.į išradimą taip pat įeina DNR segmentai, koduojantys KAF ir į KAF panašius polipeptidus. Šio išradimo DNR pavyzdžiais gali būti tokios DNR: žmogaus kDNR klonai 32 ir 49, gauti iš poliadenilintų RNR, ekstrahuotų iš žmogaus embrioninio plaučio fibroblasto ląstelės linijos M426; šių klonų rekombinantai ir mutantai; giminingi DNR segmentai, kurie gali būti nustatyti šių DNR segmentų hibridizacija.
Kaip aprašyta II Eksperimentiniame skyriuje, kDNR klonų, atitinkančių KAF aminorūgščių sekos žinomą dalį, paieškai buvo sudaryti du oligonukleotidinių zondų pulai, remiantis visomis galimomis nukleotidinėmis sekomis, koduojančiomis devintą amino rūgščių seką, AsnAsp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala. kDNR biblioteka buvo konstruojama kDNR klonuojančiame vektoriuje, ypCEV9, panaudojant poliadenilintą RNR, ekstrahuotą iš žmogaus embrioninio plaučio fibroplastų ląstelinės linijos M426, kuri buvo pradinis augimo faktoriaus šaltinis.
Bibliotekos skriningas (9 x 10 trombocitų) su P-žymėtų oligonukleotidų identifikavo 88 trombocitus, kurie hibridizavo su abiem zondais.
Iš 10 išvalytų nuo trombocitų klonų, kurie buvo analizuojami, vienas, pažymėtas kaip 49 klonas, turėjo 3.5 kb kDNR intarpą, tuo tarpu kiti turėjo intarpus intervale
1.8 kb - 2.1 kb. Smulkesnių klonų analizė įgalino aptikti kelis bendrus restrikcinius saitus, o vieno iš smulkių klonų, pažymėto kaip 32 klonas, kartu su 49 klonu, aminorūgščių sekos nustatymas parodė, kad jie yra persidengiančios kDNR (II-1A brėž.). Dviejų tokių kDNR išnagrinėjimas leido nustatyti 3.85 kb tolydinę seką, turinčią pilną KAF koduojančią seką. Jautrios DNR sijos nukleotidinė seka ir užkoduota prognozuota pirmino proteino seka parodytos II-1B brėžinyje pilno ilgio sudėtiniai KAF kDNR sekai.
Šios DNR, kDNR 32 ir 49 klonai, kaip ir šių segmentų rekombinantinės formos, apimančios pilną KAF koduojančią seką, yra tinkamiausios šio išradimo DNR.
Iš sekos kDNR aiškiai seka, kad pradinio KAF ir hst transliacijos produktai turi hidrofobines N-galo sritis, kurios kaip matyti, yra signalinės sekos tokių 'sekų panašumo įvairiuose kituose proteinuose pagrindu. Todėl tokios N-galo srities nėra išgryninto subrendusio KAF molekulėje, kuri yra išskiriama žmogaus embrioninių fibroplastų.
Be to, KAF dalinasi su visais kitais FAF šeimos nariais dvi pagrindines homologijos sritis, apimdamas aminorūgštis 65-156 ir 162-189 prognozuotoje KAF sekoje, kurios yra atskirtos įvairaus ilgio aminorūgščių nehomologinėmis serijomis skirtinguose šeimos nariuose.
Išgryninto pavidalo KAF seka turi penkias cisteino liekanas, iš kurių dvi išlieka visoje FAF giminingų proteinų šeimoje. FAF sekoje sutinkamos penkios pagrindinių liekanų poros. Toks pat vaizdas stebimas kituose KAF šeimos nariuose.
Šios srities specialistui turėtų būti suprantama, kad panaudojant šio išradimo DNR ir RNR hibridizacijos metoduose (tokiuose kaip genominių žmogaus DNR Southern apdažymo analizė -Southern blot analysis-angl.), ypač tinkamiausias DNR, išvardintas čia aukščiau, be nepageidaujamo eksperimentavimo, galima ekranizuoti genomines arba kDNR bibliotekas kitų i KAF panašių DNR, kurios patenka į šio išradimo sritį, suradimui. Be to, taip panaudojant šio išradimo DNR, genetiniai markeriai, susieti su KAF genu, tokie kaip apriboto fragmentų ilgio polimorfizmai (RFLF), gali būti identifikuoti ir susieti su paveldėtomis klinikinėmis būklėmis, apimančiomis šį ir kitus artimus jam genus.
Šis išradimas taip pat apima modifikuotas KAF DNR formas. Pagal svarbiausią šio išradimo aspekto įgyvendinimą tokios modifikuotos DNR koduoja į KAF panašius proteinus, apimančius KAF aminorūgščių sekų segmentus ir bent vieną kitą FAF peptidinės šeimos narį. Taip, pvz., kadangi nėra žymios N-galo homologijos tarp KAF išskirtos formos ir analogiškų padėčių kituose KAF gimininguose proteinuose, polipeptidai su naujomis struktūrinėmis ir funkcionalinėmis savybėmis gali būti sukurti, įskiepijant DNR segmentus, koduojančius atskirus N-galo kito polipeptido segmentus FAF šeimoje į KAF DNR segmentą vietoje jo įprastos NH2galo sekos.
Polipeptidinės chimeros, pagamintos tokių modifikuotų DNR, yra naudingos, kad nustatytume, ar KAF NH2-galo sritis yra pakankama jos unikalaus specifiškumo ląstelės-taikinio atžvilgiu nustatymui. Tokių chimerų tyrinėjimas taip pat aprūpina informacija apie sričių prigimtį, nuskančią įvairią heparino įtaką biologiniam aktyvumui.
Iš tikrųjų, šio būdo naudingumas buvo- patvirtintas sėkminga inžinerija ir ekspresija molekulės, kurioje apie 40 aminorūgščių iš išskirtos KAF formos NH2-gaio (pradedant nuo subrendusio KAF amino terminalinės cys liekanos, brėž. II-l priskirtas numeris 32, ir baigiant KAF liekana 78, arg) yra sujungta su apie 140 rKAF apvalkalo C03-galo aminorūgščių (pradedant liekana 39, arg, ir tęsiant iki rFAF koduojančios sekos C-galo). Toks chimerinis produktas turi pirmenybę keratinocitams kaip KAF ląstelės-taikinio atžvilgiu, bet neturi jautrumo heparinui, dėl ko jis labiau panašus į rFAF negu KAF.
Toks naujas į KAF panašus augimo faktorius gali turėti pranašumų klinikiniuose taikymuose, kur reikia vartoti epiteliškai specifini, augimo faktorių, esant heparinui, visuotinai priimtam antikoaguliantui. Kitos šios chimerinės molekulės konstrukcijos detalės ir polipeptido savybės aprašytos II Eksperimentiniame skyriuje.
Kitos šio išradimo DNR apima tokias rekombinantiniu DNR molekules, susidedančias iš kDNR KAF ir bet kurios iš tokių vektorinių DNR: klonuojantis bakteriofago vektorius (ypCEV9); nustatančios aminorūgščių seką piazmidės DNR vektorius (pUC variantas) ; bakterinės ekspresijos vektorius (pKK233-2); arba žinduolių ekspresijos vektorius (pMMT/neo). Tokių rekombinantiniu DNR konstrukcijų pavyzdžiai smulkiai aprašyti Eksperimentiniuose skyriuose.
Labiausiai tinkamos rekombinantinės molekulės yra šios: molekulės, susidedančios iš koduojančios sekos KAF išskirtai formai ir bakterinio ekspresijos vektoriaus (pvz., pKK233-2) arba kDNR, koduojančios visą pirminės transliacijos produktą (įskaitant NH2-galo signalinį peptidą), taip pat žinduolių ekspresijos vektoriaus (pvz., pMMT), galinčio išskirti įterptą DNR žinduolių ląstelėse (pvz., NIH/3T3).
Rekombinantiniu DNR, turinčių KAF DNR ir bakterinės ekspresijos vektorių, konstrukcija yra aprašyta II Eksperimentiniame skyriuje. Trumpai, KAF kDNR buvo išskirta, kad pagamintų polipeptidą E. coli, patalpinant jo koduojančią seką, kontroliuojant hibridiniam trk promoto.riui, plazmidiniame ekspresijos vektoriuje pKK233-2) (Amman, E. and Brosius, J. (1985) Gene 40, 183).
Rekombinantiniu DNR, turinčių KAF DNR ir žinduolių vektorių, galintį išskirti įterptą DNR kultivuotose žmogaus arba gyvulio ląstelėse, sudarymas gali būti atliktas pagal standartinę genų ekspresijos technologiją, panaudojant metodus, gerai žinomus šioje srityje tokio palyginus paprasto polipeptido ekspresijai. Vienas specifinis šio išradimo aspekto rekombinantinės DNR įgyvendinimas, įjungiantis žinduolių vektorių pMMT, yra aprašytas žemiau šioje sekcijoje, skirtoje šio išradimo rekombinantinėms ląstelėms.
Šio išradimo DNR ir RNR su jautriomis sijomis gali būti panaudotos kartu su šio išradimo proteino gamybos būdais, kad būtų pagaminti dideli kiekiai iš esmės grynų KAF arba į KAF panašių proteinų. Taip pagamintas iš esmės grynas KAF proteinas gali būti panaudotas, naudojant gerai žinomus būdus diagnostinėje analizėje nustatyti receptorių tokiam proteinui buvimą įvairiuose organizmo skysčiuose ir pavyzdžiuose.
Todėl šis išradimas taip pat apima ląstelę, geriau bakterinę arba žinduolių ląstelę, transformuotą su šio išradimo DNR, kur transformuojanti DNR gali būti išskirta. Tinkamesniame šio išradimo įgyvendinime ląstelė, transformuota šio išradimo DNR, gamina KAF proteiną visiškai mitogenine forma. Geriausia, kai šie proteinai bus išskirtos formos (pvz., neturintys akivaizdžios signalinės sekos). Šie proteino faktoriai gali būti panaudoti funkciniams tyrimams ir gali būti išgryninti papildomai biocheminei ir funkcinei analizei, tokiai kaip kokybinė ir kiekybinė receptoriaus jungimo analizė.
Rekombinantinės E coli ląstelės buvo sudarytos bakteriniame ekspresijos vektoriuje, pKK233-2, KAF gamybai, kaip smulkiai aprašyta II Eksperimentiniame skyriuje. Susumuojant, keli rekombinantiniai bakteriniai klonai buvo išskirti dėl proteino gamybos įprastais smulkiamasteliniais metodais. Visi tirti rekombinantai sintezavo proteiną, apie ką liudijo antikūnai, atsirandantys amino-terminaliniam KAF peptidui. Vienas rekombinantas buvo auginamas viename litre kultūros, kuri augino rekombinantinį KAF, kuris efektyviai stimuliavo timidino įvedimą į BALB/MK keratinocito ląstelių DNR, bet buvo tik nežymiai aktyvus NIH/3T3 fibroblastų atžvilgiu. Pusė maksimalios BALB/MK ląstelių stimuliacijos standartinėje keratinocito bioanalizėje buvo pasiekta, esant koncentracijai tarp 2 ir 5 ng/ml, palyginus su 10-15 ng/ml koncentracija KAF, išvalytam nuo M426 ląstelių.
Iš vieno bakterinių ląstelių litro buvo gauta apytikriai 50 mg Mono-S išgryninto rekombinantinio KAF. Genų ekspresijos srities specialistui bus akivaizdu, kad ši pradinė išeiga gali būti pagerinta iš esmės be nepageidaujamo eksperimentavimo, taikant įvairias žinomas rekombinantinės DNR technologijas.
Rekombinantinės žinduolių (NIH/3T3 pelė) ląstelės taip pat buvo sudarytos, panaudojant KAF kDNR koduojančią seką (įskaitant NH2-galo signalinį peptidą) ir vektorių pMM/neo, kuris neša pelės metalotionino (MMT) promotorių ir selektyvų žymėtą geną neomicino stabilumui. Buvo įvertintas šios ląstelės dalyvavimas KAF gamyboje, ypač įtaka subrendusios formos (nesant signalinio peptido) , gaminamos žmogaus fibroblastų sekrecijai, panaudojant šio išradimo bioanalizę. Tokio pat vektoriaus ir ląstelės-šeimininko kombinacija buvo sėkmingai panaudota išskirti kelis kitus panašius rekombinantinius polipeptidus, iškaitant aukštus augimo faktorių A ir B, išvestų iš trombocitų (TIAF), grandinių lygis (MSakai, R.K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K.B., Norn, G.T., Erlich, H.A. and Arnheim. N. (1985) Science 230, 13501354) . Todėl šios srities specialistui bus aišku, kad didelės rekombinanto KAF išeigos gali būti pasiektos šiuo būdu, naudojant aukščiau minėtas rekombinantinės DNR ir transformuotas šio išradimo ląsteles.
Galiausiai, gali būti panaudota stambiamolekulinė gamyba, kad įgalintų klinikini tyrimą būklėse, reikalaujančiose specifinės epitelinių ląstelių augimo stimuliacijos. Medžiagos ir metodai farmacinių mišinių paruošimui, kad galima būtų vartoti polipeptidus lokaliai (odai arba, pvz., akies ragenai) ar sistemingai yra gerai žinomi šioje srityje ir gali būti greitai pritaikomi, vartojant KAF ir į KAF panašius peptidus be nepageidaujamo eksperimentavimo.
į šį išradimą taip pat įeina nauji antikūnai prieš peptidą, užkoduotą šio išradimo DNR segmento. Šio išradimo aspekto įgyvendinimas pateiktas keliais antikūnų, atpažįstančių KAF, pavyzdžiais. Jie buvo paruošti, naudojant standartinę metodologiją, gerai žinomą eksperimentinės imunologijos srityje, kaip nurodyta II Eksperimentiniame skyriuje. Šie antikūnai apima: monokloninius antikūnus, atsirandančius pelėse prieš nepažeistą išgrynintą proteiną iš žmogaus fibroplastų; polikloninius antikūnus, atsirandančius triušiuose prieš sintetinius peptidus su sekomis aminorūgščių sekų pagrindu, prognozuotų iš KAF kDNR sekos [ pavyzdžiu gali būti peptidas su KAF liekanų 32-45 seka, būtent, NDMTPEQMATNVR (panaudojant standartinį vienos raidės kodą aminorūgščių sekoms; žiūr. II-l brėž.)]; polikloninius antikūnus, atsirandančius triušiuose tiek prieš iš žmogaus fibroplastų natūraliai išskirtą KAF, tiek prieš rekombinantinį KAF, pagamintą E. coli (žiūr. aukščiau).
Visi tirti antikūnai atpažįsta rekombinantinį, kaip ir natūraliai atsirandantį KAF, arba kietos fazės analizėje (ELISA) ir arba Western blot analizėje. Kai kurie antikūnų pavyzdžiai, kuriems teiktina pirmenybė pagal šį išradimą, skirti neutralizuoti mitogeninį KAF aktyvumą BALB/MK bioanalizėj e.
Šio išradimo antikūnų fragmentai, tokie kaip Fab arba (9ab)' fragmentai, kurie išlaiko antigeną jungianti aktyvumą ir gali būti paruošti metodais, gerai žinomais šioje srityje, taip pat įeina į šio išradimo sritį. Be to, į šį išradimą įeina šio išradimo antikūnų ar jų aktyvių fragmentų farmacinės kompozicijos, kurios gali būti paruoštos, naudojant medžiagas ir metodus farmacinių kompozicijų su polipeptidais paruošimui, kurie yra gerai žinomi šioje srityje ir gali būti greitai pritaikomi KAF arba į KAF panašių peptidų vartojimui be nepageidaujamo eksperimentavimo.
Šie antikūnai, jų aktyvūs fragmentai gali būti panaudoti, pvz., KAF aptikimui bioanalizėje arba proteininių faktorių gryninimui. Jie taip pat gali būti panaudoti būduose, gerai žinomuose šioje srityje KAF receptorių išskyrimui, kurie, kaip aprašyta II Eksperimentiniame skyriuje, atrodo, skiriasi nuo visų kitų žinomų augimo faktorių receptorių.
Šie tinkamesni antikūnai, jų fragmentai ir farmacinės kompozicijos, kurie neutralizuoja KAF mitogeninį aktyvumą epitelinį ląstelių atžvilgiu, kaip nustatyta BALB/MK analize, pvz., gali būti ’ panaudoti klinikinių būklių, besiskiriančių pertekliškumu epitelinių ląstelių augimu, įskaitant displaziją ir neoplaziją (pvz., psoriazę arba gerybinius ar piktybinius auglius), gydymui.
Į šį išradimą dar Įeina nauji bioanalizės metodai genų, giminingų šio išradimo DNR, ekspresijos nustatymui. Kai kuriuose šio išradimo įgyvendinimuose šio išradimo DNR buvo panaudotos kaip zondai nustatyti giminingų iRNR pastovios būsenos lygius. Šie išradimo bioanalizės būdai, panaudojant KAF DNR ir standartinius Nothernblot būdus, yra smulkiai aprašyti II Eksperimentiniame skyriuje.
Įgudusiam šioje srityje bus aišku be nepageidaujamo eksperimentavimo, kad tokie metodai gali būti greitai pritaikomi genų ekspresijos i KAF panašiems proteinams analizei arba atskirose ląstelėse, arba Įvairiuose audiniuose. Tokia bioanalizė gali būti naudinga, pvz., auglio ląstelių Įvairių klasių arba genetinių defektų epiteliniuose augimo procesuose identifikavimui.
Be tolesnių tikslinimų tikimasi, kad vidutinis spe10 cialistas šioje srityje, panaudodamas aukščiau pateiktą aprašymą ir taikydamas būdus, aprašytus Eksperimentiniuose skyriuose, galės pritaikyti ši išradimą jo išsamesniam kontekste. Medžiaga, pateikta eksperimentiniuose skyriuose, jei nepažymėta kitaip, pateikta kaip iliustracijos ir jokiu būdu neapriboja pridedamos išradimo apibrėžties.
II EKSPERIMENTINIS SKYRIUS
Naujo specifinio epitelinėms ląstelėms augimo faktoriaus identifikacija ir charakterižavimas
Šiame skyriuje aprašomas eksperimentinis darbas, vedantis į augimo faktoriaus, specifinio epitelinių ląstelių atžvilgiu, identifikaciją. Faktorius, sąlyginai pavadintas keratinocito augimo faktoriumi (KAF) dėl jo dominuojančio aktyvumo tokio tipo ląstelių atžvilgiu, buvo gryninamas iki homogeniškumo ultrafiltracijos, heparino-Sefarozės afininės chromatogtafijos ir hidrofobinės chromatografijos C4 atvirkščios fazės ASSC kolonėlėje kombinacija pagal šio išradimo būdus. Buvo rasta, kad KAF yra labilus tiek rūgščių, tiek šilumos veikimo atžvilgiu ir sudarytas iš vienos polipeptidinės grandinės su tariama maždaug 2800 Daltonų molekuline mase. Išgrynintas KAF buvo galingas mitogenas epitelinių ląstelių atžvilgiu, galintis stimuliuoti DNR sintezę BALB/MK epiderminiuose keratinocituose ramybės būklėje, padidinant aktyvumą daugiau kaip 500 kartų, esant 0.1 nM, ir pasiekiant maksimumą, esant 1.0 nM. Mitogeninio aktyvumo nebuvimas tiek fibroplastų, tiek endotelinių ląstelių atžvilgiu parodė, kad KAF pasižymi specifiškumu ląstelei-taikiniui, kuris skiriasi nuo bet kurio aukščiau charakterizuoto augimo faktoriaus. Aminorūgščių sekos nustatymas mikrometodais leido nustatyti amino-terminalinę seką, neturinčią žymios homologijos su bet kuriuo žinomu proteinu. Tokio naujo augimo faktoriaus išskyrimas žmogaus embrioniniais fibroplastais rodo tai, kad KAF vaidina tam tikrą vaidmenį mezenchiminėje normalios epitelinės ląstelės proliferacijos stimuliacijoje.
BŪDAI IR MEDŽIAGOS
Kondicionuotas terpės paruošimas
Ankstyvas M426 žmogaus embrioninių fibroplastų ((Aaronson, S.A. and Todaro, G.J. (1968) Virology 36, 254-261) perkėlimas buvo išdėstytas 175 cm2 T-formos kolbose ir auginamas 10-14 dienų Dulbecco modifikuotoje Eagle terpėje (DMEM; GIBCO), papildytoje 10% jaučio serumu (GIBCO). Užbaigus šią operaciją, monosluoksniai savaitę buvo cikliškai apdorojami terpių diapazonu nuo tokios, kurioje buvo serumo, iki tokios, kurioje jo nebuvo, pastarajai susidedant vien iš DMEM. Ląstelės buvo dukart perplautos 5 ml fosfatinio buferinio tirpalo, prieš pridedant 20 ml DMEM. Po 72 valandų kultivuotus skysčius surinkdavo ir pakeisdavo 35 ml serumo turinčios terpės. Kondicionuota terpė buvo laikoma -70°C temperatūroje iki tolesnio naudojimo.
Ultrafiltracija
Maždaug 10 ltr kondicionuotos terpės buvo atitirpinta, iš anksto filtruota per 0.50 mikronų filtrą (Millipore HAWP 142 50) ir koncentruota iki 200 ml tūrio, panaudojant Pellicon kasetinę sistemą (Millipore ΧΧ42 00K 60) ir kasetę, turinčią 10 kDa molekulinės masės pralaidumą (Millipore PTGC 000 05) . Po koncentravimo bandinys buvo iš eilės atskiestas vienu litru 20 mM TrisHCl, pH 7.5/0.3 M NaCl, ir po kiekvieno tokio atskiedimo stadijos buvo atliekama ultrafiltracij a su Pellicon sistema. Regeneruotas retentate aktyvumas iš karto buvo taikomas heparino-Sefarozės dervai arba laikomas -70°C temperatūroje.
Heparino-Sefarozės afininė chromatografija (HSAC)
Retentatas iš ultrafiltracijos stadijos buvo pakrautas ant heparino-Sefarozės dervos (Pharmacia), kuri nulygsvarinta 20 mM Tris-HCl, pH 7.5/0.3 M NaCI. Derva buvo intensyviai plaunama tol, kol optinis tankis sugrįžo prie foninės reikšmės, ir tada paveikiama didėjančios NaCI koncentracijos tiesiniu gradientu. Pašalinus alikvotas iš frakcijų timidino įvedimo bioanalizei, surinktos frakcijos sukoncentruojamos 10-20 kartų Centricon-10 mikrokoncentratoriumi (Amicon) ir laikomas -70°C temperatūroje.
Atvirkščios fazės ASSC (AF-ASSC)
Aktyvios frakcijos (0.6 M NaCI) iš HSAC buvo atitirpintos, supiltos ir papildomai koncentruotos su Centricon-10 iki galutinio tūrio <200 μΐ. bandinys buvo pakrautas į Vydac C4 ASSC kolonėlę (The Separation Group, Hesperia, CA) , kuri buvo ekvilibruojama 0.1% trifluoro acto rūgštyje (TFA, Fluka)/20% acetonitrile (Baker, HPLC grade-angl.) ir išplauta eliuentedidėjančio acetonitrilo tiesiniame gradiente. Alikvotos bioanalizei buvo nedelsiant atskiestos 50 pg/ml BSA (Fraction V, Sigma)/20 mM Tris-HCl, pH 7.5 10-kartiniu pertekliumi. Likusi bandinio dalis buvo išdžiovinta Speed-Vac (Savant) struktūrinei analizei.
Molekulinių sietų ASSC
Maždaug 50 μΐ dukart koncentruotų heparino-Sefarozės frakcijų buvo pakrauta į TSK-G3000SW Glas-Pac kolonėlę, kuri buvo nulygsvarinta 20 mM Tris-HCl, pH 6.8/0.5 NaCI. Bandinys buvo išplautas eliuente - šiame buferyje su 0.4 ml/min. srauto greičiu. Atskyrus alikvotas bioanalizei, frakcijos buvo laikomos -70°C temperatūroje.
NaDodS04-poliakrilamido gelių elektroforezė (NaDodSO4/PAGE)
Poliakrilamido geliai buvo paruošti su NaDodS04 pagal Laemmli (Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, 680-685) procedūrą. Bandiniai buvo verdami 3 minutes, esant 2.5% 2merkaptoetanoliui (tūr./tūr.). Geliai buvo fiksuoti ir padengti sidabru (Merril, C.R., Goldman, D., Sedman, S.A. and Ebert, M.H. (1981) Science 211, 1437-1438), panaudojant reagentus ir metodiką iš BioRad. Molekulinės masės markeriai buvo gauti iš Pharmacia firmos.
DNR sintezės stimuliacija duobučių mikrotitruotos plokštelės (Falcom No. 3596) buvo padengtos žmogaus fibronektiniu (Collaborative Research) 1 ųg. cm2 tankiu, prieš užsėjant BALB/MK ląstelėmis. Po to ląstelės buvo laikomos 24-72 valandas terpėje be serumo, turinčioje 5 ųg/ml transferino (Collaborative Research) ir 30 nM Na2SeO3 (Baker).
3H-timidino (5ųCi/ml galutinė koncentracija, NEN) įvedimas į DNR buvo matuojamas 6 valandas, pradedant 16 valandų po pavyzdžių pridėjimo. Analizė buvo baigta, perplaunant ląsteles kartą su atšaldytu ledu fosfatinių buferiu ir dukart 5% trichloracto rūgštimi. Nuosėdos buvo vėl ištirpintos 0.25 M NaOH, perneštos į scintiliacinį skystį (Biofluor, NEN) ir buvo atlikti skaičiavimai .
(Caputo, J.L., Hay, Vitro 15, 222-223)
DNR sintezės stimuliacija buvo reguliuojama, kaip aprašyta BALB/MK ląstelėms, naudojant didelį kiekį kitų ląstelinių linijų. NIH/3T3 fibroblastai (Jainchill, J.L., Aaronson, S.A. and Todaro, G.J. (1969) J.Virol. 4, 549553) buvo gauti iš National Institutes of Health, tuo tarpu beždžionių bronchinės epitelinės ląstelės R.J. and Williams, C.D. (979) in buvo gautos iš Amerikos Tipinių kultūrų kolekcijos (American Type Culture Collection). Žmogaus pieno liaukos epitelinė ląstelinė linija, paruošta kaip aprašyta Stampfer (Stampfer, M.R. and Bartley, J.C. (1985) Proc. Natl. Acad Sci. USA 82, 2394-2398) buvo gauta iš Martha Stampher (University of California, Berkeley). Pieno liaukos ląstelės buvo auginamos RPMI 1640 papildytoje 10% jaučio vaisiaus serumu ir 4 ng/ml EGF. Laikant sąlygose be serumo, pagrindinė aplinka buvo DMEM. Žmogaus poodinės venos endotelinių ląstelių pirminės kultūros buvo paruoštos ir laikomos, kaip aprašyta nuorodoje (Sharefkin, J.B., Fairchild, K.D., Albus, R.A., Cruess, D.F. and Rich, N.M. (1986) J. Surgical Res. 41, 462-472). Epiderminis augimo faktorius ir insulinas buvo gauti iš Collaborative Research. Rūgštinis FAF ir bFAF buvo gauti iš Kalifornia Biotechnology, Inc. Rekombinantinis TGFa buvo gautas iš Genetch, Inc. Terpė ir serumas buvo arba iš GIBCO, Biofluids, Ine., arba tai buvo terpė NIH.
Proliferacijos analizė mm kultivavimo lėkštelės buvo iš anksto padengtos nuosekliai poli-D-lizinu (20ųg/cm2) (Sigma) ir žmogaus fibronektinu, tada apsėti su maždaug 2.5 χ 104 BALB/MK ląstelių. Pagrindinė terpė buvo mišinys santykiu 1:1 Eagle mažo turinio Ca2+ minimalios esminės terpės ir Ham F-12 terpės, papildytos 5 ųg/ml transferino, 30 nM Na2SeO3 ir 0.2 mM etanolamino (Sigma). Terpė buvo keičiama kas 2 arba 3 dienos. Po 10 dienų ląstelės buvo fiksuojamos formaline (Ficher Scientific Co. ) ir apdažytos Giemsa (Fisher Scientific Co.).
Proteino sekos mikronustatymas
Maždaug 4 ųg (.150 pmol) proteino iš aktyvių C4 kolonėlės frakcijų buvo vėl ištirpinta 50% TFA ir pakrauta i dujinės fazės proteino sekvensorių (Applied BioLT 3472 B systems). Buvo atlikta 20 degradacijos ir aminorūgščių darinių identifikacija ASSC (Modelis 120A Applied Biosystems).
pagal Edman cilų su automatozuota
REZULTATAI
Augimo faktoriaus nustatymas ir išskyrimas
Preliminarus kondicionuotos terpės iš Įvairių ląstelės linijų skriningas parodė, kad terpė iš kai kurių fibroblasto linijų pasižymėjo mitogeniniu aktyvumu, nustatomu tiek BALB/MK, tiek NIH/3T3 ląstelėse. Tuo tarpu, kai virimas suardo BALB/MK aktyvumą, mitogeninis NIH/3T3 aktyvumas lieka nepaliestas. Remiantis žinomais duomenimis apie tai, kad EAF (Cohen, S. (1962) J. Biol. Chem. 237, 1555-1562) ir TAFa (DeLarco, J.E. and Todaro, G.J. (1978) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 75, 40014005) yra termiškai stabilios medžiagos, natūralu daryti prielaidą, kad BALB/MK mitogeninis aktyvumas susijęs su agento,. besiskiriančio nuo šių žinomų epitelinių augimo faktorių, buvimu.
M426 žmogaus embrioninio fibroplasto linija buvo parinkta kaip produktyviausias tokio aktyvumo šaltinis augimo faktoriaus išgryninimui. Ultrafiltracij a Pellicon sistema suteikė patogų kelią bandinio tūriui sumažinti iki tinkamo lygio tolesnei chromatografijai. Buvo išbandytos įvairios sietų jonų mainų ir izoelektrinio fokusavimo chromatografijų kombinacijos, bet visos davė nepriimtinai mažas išeigas. Iš kitos pusės heparino-Sefarozės afininė chromatografija (HSAC), kuri buvo panaudota kitų augimo faktorių gryninime (Rainės, E.W. and Ross, R. (1982) J.Biol.Chem. 257, 5154-5160; Shing, Y. Folkman, J. Sullivan, R., Butterfield, C., Murray, J. and Klagsburn, M. (1984) Science 223, 12961299; Gospodarowicz, D., Cheng, J., Lui G.-M., Baird, A. and Bohlen, P. (1984) proc.Natl.Acad.Sci. USA 81, 69636967; Maciag, T., Mehlman, T., Friesel, R. and Schreiber, A.B. (1984) Science 225, 932-935; Conn.G. and Hatcher, V.B. (1984) Biochem.Biophys.Res.Comm. 124, 262-268; Lobb, R.R. and Fett, J.W. (1984) Biochemistry
23, 6295-6299), pasirodė esanti naudinga kaip ankstyvoji šio išradimo gryninimo stadija. Nors regeneruoto specifinio aktyvumo įverčiai buvo nežinomi šioje stadijoje dėl galimo kitų faktorių buvimo, tariama aktyvumo išeiga buvo 50-70% su atitinkamu 1000 kartų praturtinimu.
Kaip parodyta Fig. 1-1, daugiau negu 90% BALB/MK mitogeninio aktyvumo išsiplauna iš HSAC kolonėlės su 0.6 M NaCl. Toks aktyvumo pikas nesusijęs su kokiu nors aktyvumu NIH/3T3 ląstelių atžvilgiu (duomenys neparodyti). Žymiai mažesnis BALB/MK mitogeninio aktyvumo pikas išryškėja, esant 0.8-1.2 M NaCl.
Dėl HSAC bandinio atstatomumo aktyvios frakcijos galėjo būti identifikuotos profilio gradiento ir optinio aktyvumo pagrindu. 10-20-kartinis koncentravimas su Centricon-10 pasirodė esąs esminis stabilumui, kuris galėjo būti palaikomas -70°C temperatūroje kelis mėnesius.
Tolesnis gryninimas buvo atliekamas AF-ASSC su C4 Vydac kolonėle, ir tai buvo paruošiamasis būdas, tinkantis aminorūgščių sekos analizei. Nors aktyvumo išeiga iš stadijos C4 buvo paprastai tik keli procentai, šis praradimas gali būti priskirtas naudojamiems tirpikliams. Kituose eksperimentuose vienos valandos eksponavimas sistema 0.1% TFA/50% acetonitrilo kambario temperatūroje sumažino preparato mitogeninį aktyvumą 98%. Vis dėlto, kaip parodyta (Fig. 1-2) buvo gautas vienintelis BALB/MK stimuliacinio aktyvumo pikas, kas suderinama su aiškiu piku optinio tankio profilyje. Piko frakcijos duoda vienintelę juostą NaDodS04/PAGE ir gelio apdažyme sidabru (Fig. I-2B), o santykinis momentinis kiekvienos išbandytos frakcijos aktyvumas (Fig. I-2C) gerai koreliuojasi su juostos intensyvumu aktyvumo profilyje.
Alternatyvi gryninimo stadija aukščiau aprašytam ASSC būdui, panaudojant tinklelinę chromatografiją su TSK 63 000 SW Glas Pac kolonėle vandens tirpale su pH, artimu fiziologinio tirpalo pH, davė BALB/MK bioanalizėje pagrindinį aktyvumo piką (Fig. 1-3).
Toks preparatas buvo beveik toks pat grynas, kaip tas, kuris buvo gautas iš AF-ASSC stadijos pagal apdažymo sidabru NaDodS04/PAGE duomenis (duomenys neparodyti), bet davė žymiai didesnį regeneravimo aktyvumą (1-1 lentelėje), TSK - išvalyta medžiaga buvo naudojama įprastais būdais biologiniams tyrinėjimams, kadangi ji pasižymėjo didesniu specifiniu aktyvumu.
Abiems išgrynintų preparatų tipams (t.y. išgrynintam ASSC arba su molekuliniais sietais) mitogeninio aktyvumo profilis buvo susijęs su aiškia juosta NaDodS04/PAGE, kuri neatskiriama abiems preparatams.
Augimo faktoriaus fizikinis ir biologinis apibūdinimas
Išgryninto faktoriaus įvertinta molekulinė masė buvo apie 28 kDa pagal NaDodS04/PAGE duomenis regeneravimo Fig. 1-2 ir neregeneravimo sąlygomis (duomenys nepateikti) . Ši reikšmė derinasi su eliucijos padėtimi dviejose skirtingų matavimų kolonėlėse tuose tirpikliuose, kurie, kaip tikimasi išlaiko natyvią konformaciją (TSK-C3000-SW, Fig. 1-3, superozė-12, duomenys neparodyti). Iš šių duomenų seka, kad mitogenas, matyt, sudarytas iš vienos polipeptidinės grandinės su 25-30 kDa molekuline mase.
Terminis ir rūgštinis mitogeninio aktyvumo labilumas buvo pademonstruoti, panaudojant BALB/MK mitogenezės bioanalizę. Nors aktyvumas nesikeitė per 10 minučių inkubavimo 50°C temperatūroje, jis sumažėjo 68% po 10 min. 60°C temperatūroje ir buvo nenustatomas po 3 min.
100°C temperatūroje. Paveikus 0.5 M acto rūgštimi 60 minučių kambario temperatūroje, aktyvumas sumažėjo iki 14% kontrolinės reikšmės. Palyginimui reikia pasakyti, kad žinomo augimo faktoriaus EAG aktyvumas nesumažėjo nė po vieno tokio apdorojimo. Kreivė dozė-atsakas išgrynintam augimo faktoriui, pateikta Fig. 1-4, iliustruoja faktą, kad tik 0.1 nM sukelia nustatomą sintezės DNR stimuliaciją. Tuo būdu, aktyvumo intervalas palyginamas su intervalu kitiems dviems augimo faktoriams, išanalizuotiems iki dabar. Koncentracijos intervale 0.1-1.0 nM stebima tiesinė priklausomybė, ir maksimali 6000-kartinė stimuliacija buvo stebima, esant 1.0 nM koncentracijai. Naujas faktorius atitinkamai indukavo aukštesnį maksimalaus timidino įvedimo lygį, negu EAF, rFAF arba bFAF BALB/MK keratinocituose (Fig. 1-4).
Būdingas tokio faktoriaus specifiškumas ląstelės-taikinio atžvilgiu demonstruojamas jo aktyvumo dideliam ląstelių tipų skaičiui palyginimu su aktyvumu kitų augimo faktorių, kurie kaip žinoma, pasižymi mitogeniniu aktyvumu epitelinių ląstelių atžvilgiu.
Kaip parodyta 1-2 lentelėje, naujas išskirtas faktorius parodė stiprų mitogeninį poveikį BALB/MK, bet taip pat indukavo įrodomą timidino įvedimą į kitų tirtų epitelinių ląstelių DNR. Priešingai tam, šis faktorius nedarė nustatomo poveikio pelės (arba žmogaus, duomenys neparodyti) fibroplastams arba žmogaus poodinės venos endotelinėms ląstelėms.
Palyginimui pasakysime, kad nė vienas kitas žinomas augimo faktorius tinkamai nestimuliuoja keratinocito. TAFa ir EAF pasižymi stipriu fibroplastų atžvilgiu, tuo tarpu FAF buvo mitogeniniai tiek endotelinių ląstelių, tiek ir fibroplastų atžvilgiu (1-2 lentelė) . Dėl jo specifiškumo epitelinių ląstelių atžvilgiu ir ypač jautLT 3472 B rūmo keratinocitų atžvilgiu naujasis mitogenas buvo sąlyginai pavadintas keratinocito augimo faktoriumi (KAF).
Tam, kad būtų nustatytas faktas, jog KAF sugeba ne tik stimuliuoti DNR sintezę, bet ir palaikyti ilgalaikį ląstelių augimą, buvo tirtas BALB/MK ląstelių sugebėjimas augti visiškai apibrėžtoje, serumo neturinčioje terpėje, papildytoje augimo faktoriumi. Kaip parodyta Fig. 1-5, KAF yra geras EAF, bet ne insulino (arba į insuliną panašaus faktoriaus) pakaitalas tokioje chemiškai apibrėžtoje terpėje. Tuo būdu, KAF, kaip matyti, veikia pagrindiniu signaliniu maršrutu konkuruodamas su EAF, rFAF ir bFAF dėl BALB/MK ląstelių poliferacijos.
Aminorūgščių sekos mikronustatymas atskleidžia unikalią N-terminalinę KAF aminorūgščių seką
Tolesniam augimo faktoriaus charakterizavimui maždaug 150 pmol C4-išgrynintos medžiagos buvo analizuojama aminorūgščių sekos nustatymui. Buvo nustatyta vienintelė seka su neabejotinu 2-13 ciklų priskyrimu: X-AsnAsp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Thr-Asn-Val. Didelis foninis triukšmas trukdė priskirti pirmajai pozicijai, kuri yra, tuo būdu, pažymėta X.
Kompiuterinė paieška, panaudojant FASTP programą (Lipman, D.J. and Pearson,. R.W. (1985) Science 227, 14351441), nustatė, kad KAF N-terminalinė aminorūgščių seka neparodė žymesnės homologijos su bet kuriuo iš proteinų iš National Biomedical Research Foundation duomenų banko, tuo patvirtindama tokio epitelinio augimo faktoriaus naujumą.
DISKUSIJA
Tyrimai, aprašyti šiame Eksperimentiniame skyriuje, nustatė žmogaus augimo faktorių, kuris pasižymi unikaliu specifiškumu epitelinių ląstelių atžvilgiu. Panaudojus ultrafiltraciją, HSAC ir AF-ASSC arba TSK sietų chromatografiją pagal šį išradimą, buvo išskirtas pakankamas preparato kiekis, kurio pakako smulkiai charakterizuoti šios molekulės fizikines ir biologines savybes.
Vienintelė sidabru apdažyta juosta, atitinkanti maždaug 28000 daltonų molekulinę masę, buvo nustatyta aktyviose frakcijose iš AF-ASSC, ir juostos intensyvumas buvo proporcingas šių faktorių mitogeniniam aktyvumui. Juosta, neatskiriama nuo tos, kuri gauta AF-ASSC, buvo numatoma aktyviose frakcijose iš TSK chromatografijos išgrynintas proteinas stimuliavo DNR sintezę epitelinėse ląstelėse, esant subnanomolinėms koncentracijoms, bet nesugebėjo indukuoti timidino įvedimo į fibroplastus arba endotelines ląsteles palyginamose arba aukštesnėse koncentracijose (iki 5 nM) . Šis bū- . dingas specifiškumas ląstelės-taikinio atžvilgiu kartu su vienintele nauja N-terminaline aminorūgščių seka, nustatyta iš išgrynintos molekulės, leidžia daryti išvadą, kad KAF yra naujas augimo faktorius.
Chemiškai apibrėžtoje terpėje išgrynintas faktorius galėjo papildyti į insuliną panašų augimo faktorių I/BALB/MK ląstelių insulino poreikį ir todėl turėjo veikti signalinės transdukcijos keliu, konkuruodamas su EAF, TAF ir FAF. Dar daugiau, naujas faktorius buvo galingesnis negu bet kuris iš žinomų epitelinių ląstelių mitogenų, stimuliuojant timidino įvedimą į BALB/MK ląsteles. Pradiniai duomenys rodo tai, kad šis faktorius sugeba palaikyti žmogaus keratinocitų antrinių kultūrų proliferaciją (duomenys nepateikti).
Gryninimo metu KAF manipuliacijos ir laikymas buvo problematiški. Be jo labilumo šilumos ir rūgščių šis faktorius buvo nepastovus liofilizacijos arba dializės atžvilgiu. Po HSAC praėjus 24 valandoms,· aktyvumas visiškai prarandamas, nepaisant proteinų-nešėjų, heparino, proteazės inhibitorių, silikoninių mėgintuvėlių panaudojimo arba laikymo 4° arba -20°C temperatūroje. Tik bandinio koncentravimas šioje stadijoje gali išsaugoti jo aktyvumą.
Be to, kad išdžiovintas ir išgrynintas faktorius būtų perneštas, būtina panaudoti stiprią rūgštį arba detergentą, atitinkančius adsorbcines tendencijas arba netirpumą .
Tuo būdu, aktyvumo išsaugojimui išgrynintas faktorius buvo laikomas tirpale, esant didelėms koncentracijoms, -70°C temperatūroje, kur jis išlieka stabilus kelis mėnesius.
KAF sugebėjimas surišti hepariną gali būti fundamentali tokio faktoriaus savybė, kuri pernešama į jo funkciją organizme. Augimo faktoriai su hepariną jungiančiomis savybėmis apima FAF (Maciag, T., Mehlman, T., Friesel, R. and Schreiber, A.B. (1984) Science 225, 932-935; Conn, G. and Hatcher, V.B. (1984) Biochem. Biophys. Res. Comm. 124, 262-268; Lobb, R.R. and Fett, J.W. (1984) Biochemistry 23, 6295-6299), bFAF (Gospodarowicz, D. Cheng, J., Lui, G.-M., Baird, A. and Bohlen, P. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6963-6967; Lobb, R.R. and Fett, J.W. (1984) Biochemistry 23, 6295-6299), granuliocito/makrofago koloniją stimuliuojantį faktorių ir interleukiną 3 (Roberts, R., Gallagher, J., Spooncer, E., Allen, T.D., Bloomfield, F. and Dexter, T.M. (1988) Nature 332, 376-378). Tokie faktoriai, kaip matyti, nusėda tarpląstelinėje matricoje arba ant proteoglikanų, dengiančių stromos ląstelės paviršių (Roberts, R., Gallagher, J., Spooncer, E., Allen, T.D., Bloomfield, F. and Dexter, T.M. (1988) Nature 332, 376378; Vlodavsky, I., Folkman, J., Sullivan, R., Fridman, R., Ishai-Michaeli, R., Sasse, J. and Wagsburn, M. 1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2292-2296). Buvo postuluota, kad jų laikymas, išskyrimas ir kontaktai su specifinėmis ląstelėmis-taikiniais yra reguliuojami tokia sąveika (Roberts, R., Gallagher, J., Spooncer, E., Allen, T.D., Bloomfield, F. and Dexter, T.M. (1988) Nature 332, 376-378; Vlodavsky, I., Folkman, J., Sullivan, R., Fridman, R., Ishai-Michaeli, R. Sasse, J. and Wagsburn, M. 1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2292-2296). Nors epitelinių ląstelių proliferacijos mezenchiminės prigimties efektoriai taip pat buvo aprašyti (Gilchrest, B.A., Karassik, R.L., Wilkins, L.M., Vrabel, M.A. and Maciag, T. (1983) J. Cell Physiol. 117, 2325-240; Chan, K.Y. and Hasche, R.H. (1983) Exp. Eye Res. 36, 231-246; Stiles, A.D., Smith, B.T. and Post, M. (1986) Exp. Lung. Res. 11, 165-177), jų identiškumas nenustatytas. Hepariną-jungiančios savybės išskyrimas žmogaus embrioninių fibroblastų epitelinėmis ląstelėmis, ir epitelinių ląstelių tropizmas suteikia KAF visas savybes, kurių tikimasi iš tokio normalios epitelinės ląstelės augimo parakrino mediatoriaus.
Dalinė aminorūgščių seka, nustatyta šiam naujam augimo faktoriui, įgalino jį koduojančios sekos molekulinį klonavimą ir jos struktūrinės priklausomybės žinomoms augimo faktorių šeimoms nustatymą, kaip aprašyta II Eksperimentiniame skyriuje žemiau.
II EKSPERIMENTINIS SKYRIUS
Naujo epitelinių ląstelių specifinio augimo faktoriaus kDNR seka apibūdina naują FAF šeimos narį
Darbas, aprašytas priešeinančiame I Eksperimentiniame skyriuje, identifikavo ir išgrynino naują hepariną jungiantį augimo faktorių, pažymėtą keratinocito augimo faktoriumi (KAF), kuris yra ypač aktyvus keratinocitų atžvilgiu ir, kaip matyti, yra specifinis epitelinėms ląstelėms. Šis antras Eksperimentinis skyrius aprašo kDNR klonų, koduojančių KAF, išskyrimą ir apibūdinimą, panaudojant oligonukleotidus, remiantis eksperimentiškai nustatyta NH2-galo aminorūgščių seka kaip hibridizacijos zondu. Nukleotido sekos analizė nustatė 582-bp atvirą skaitymo karkasą, kuris gali koduoti polipeptidą iš 194 aminorūgščių, t.y. tarp 41% ir 33% identiškas hepariną jungiantiems rūgštinių ir bazinių fibroplastų augimo faktoriams (FAF) ir giminingiems hst ir int-2 onkogenams. KAF geno RNR matricos yra išskiriamos normaliuose tiek embrioninės prigimties, tiek suaugusio fibroblastuose, bet ne epitelinėse, endotelinėse ir glialinėse ląstelėse. Tuo būdu, KAF pasirodo esąs normaliai išskiriamas mezenchimos, tuo parodydamas savo vaidmenį epitelinių ląstelių proliferacijos reguliavime.
MEDŽIAGOS IR METODAI kDNR klonų išskyrimas
KAF išgryninimas ir N-galo aminorūgščių sekos nustatymas buvo aprašyti aukščiau (žiūr. I Eksperimentinį skyrių ir Rubin, J.S., Osada, H., Finch, P.W., Taylor, W.G., Rudikoff, S. and Aaronson, S.A. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA (in press)). Deoksioligonukleotidų pulai (50 pmolių), aprašyti Rezultatuose, buvo 5' gale pažyLT 3472 B mėti, panaudojant τ-32ρ -ATP (3000 Cl/mmole, Amersham) ir 10 vienetų T4 poiinukleotidinės kinazės. Rekombinantinis fagas, nešantis kDNR klonus, buvo replika, išsėta ant nitroceliuliozinių filtrų ir hibridizuota su 32P-žymėtais deoksioligonukleotidais 20% formamide, 10% dekstrano sulfate, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 8 x SSC, 5 x Denhardt's ir 50 ųg/ml denatūruotoje per naktį 42°C temperatūroje briedžio spermoje. Filtrai buvo perplauti 0.5 x SSC, 0.1% SDS 50°C temperatūroje ir eksponuoti ant Kodak X-omat AR juostelės.
DNR sekos nustatymas
KAF kDNR nukleotidinė seka buvo nustatyta dideoksi persidengiančių ribojančių fragmentų, subklonuotų į pUC vektorius, grandinės nutraukimo būdu (Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J. (1985) Gene 33, 103-119).
Bakterinės ekspresijos vektoriaus KAF kDNR konstravimas
KAF kDNR, koduojanti subrendusią, išskirtą polipeptido formą, buvo patalpinta hibridinio trk promotoriaus kontrolei, į plazmidės ekspresijos vektorių pKK233-2 (Amman, E. and Brosius, J. (1985) Gene 40, 183), kaip aprašyta toliau. Kad tai būtų atlikta, konkretus KAF kDNR ilgis, kuris turėjo informaciją užkoduoti subrendusią KAF molekulę (pvz., be jo signalinio peptido) buvo sustiprintas, panaudojant polimerazės reakcijos (PGR) būdą (Sakai, R.K., Schart, S., Faloona, F., Mullis, K.B., Norn, G.T., Erlich, H.A. and Arnheim, N. (1985) Science 230, 1350-1354). Fragmentą kryptingai įterpė tarp dviejų saitų vektoriuje, būtent, saito Ncol su bukais galais po SI nukleazės suskaldymo ir saito HindlII, panaudojant rekombinantines DNR technologiją. KAF kDNR, gauto PCR būdu, galai buvo tokie: 5' galas buvo bukas ir prasidėjo ATG kodonu, po to ėjo kodonas TGC cys liekanai, numeris 33, kuris yra KAF subrenLT 3472 B dusios formos amino-terminalinė liekana (žiūr. Fig. II-l), ir tada visą KAF koduojančią seką. Stop-kodonas, TAA, ir keturios fazės po jų, TTGC, t.p. buvo įjungti į kDNR 3' galą. Pradmuo naudojamas PCR būde nukreipti DNR sintezę į reikalingą padėtį kDNR 3' gale, apėmė HindlII saitą sustiprintos kDNR Įterpimui į vektorinę DNR.
Antikūnų prieš KAF ir KAF giminingus peptidus gamyba
Monokloniniai antikūnai buvo gaminami pelėse prieš nepažeistą išgrynintą proteiną iš žmogaus fibroblastų, panaudojant 5 arba daugiau poodinių injekcijų. Naudojami kraujo pavyzdžiai buvo rūšiuojami kietos fazės analize (ELISA), naudojant labai išgrynintą KAF iš žmogaus epitelinių ląstelių kaip antigeną. Hibridomos buvo paruoštos įprastais būdais ir supernatantai buvo rūšiuojami ELISA analize, kad būtų aptikti KAF-reaktyvūs antigenai. Teigiami klonai serijomis buvo subklonuojami įprastais būdais, ir atrinkti subklonai buvo auginami kaip acitiniai augliai pelėms, kad būtų pagaminti dideli antikūnų kiekiai. Antikūnai buvo gryninami iš ascitinių skysčių, panaudojant standartinius būdus (pvz., panaudojant hidroksiapatitą arba imunoafinines dervas).
Poiikloniniai antikūnai prieš sintetinius peptidus buvo auginami triušiuose standartiniais būdais, kaip aprašyta toliau. Peptidai buvo gauti kietos fazės technologija ir sujungiami su tiroglobulinu reakcija su gliutaraldehidu. Buvo daromos poodinės injekcijos serijomis, ir kraujo pavyzdžiai rūšiuojami ELISA analize, taip pat kitais metodais, įskaitant Western-biott ir mitogenezės bioanalizę. IgC imunoglobulinai buvo išskirti afinine chromatografija, panaudojant imobilizuotą proteiną G.
Polikloniniai antikūnai buvo auginami triušiuose tiek prieš natūraliai išskirtą KAF iš žmogaus fibroplastų, tiek prieš rekombinantinį KAF, pagamintą E.coli (žiūr. kitą skyrių), panaudojant tokias operacijas:
I) Pradinę injekciją ir pirmą imunizaciją atliko kirkšnies limfiniuose mazguose;
ii) kitas imunizacijas atliko į raumenis.
10
Tiriamų pavyzdžių skriningą atliko, naudodami ELISA analizę ir Western-blott bei mitogenezės bioanalizę. IgG gryninimas kaip antikūnai prieš sintetinius peptidus, kaip aprašyta aukščiau.
REZULTATAI kDNR klonų, koduojančių naują augimo faktorių, išskyrimas kDNR klonų, atitinkančių KAF koduojančią seką, paieškai du oligonukleotidų 26 bazių ilgio pulai buvo generuojami, remiantis devynių aminorūgščių seka Asn-AspMet-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala, kaip nustatyta išgryninto KAF aminorūgščių sekos mikronustatymu (žiūr. I Eksperimentinį skyrių aukščiau ir Rubin (Rubin, J.S., Osada, H., Finch, P.W., Taylor, W.G., Rudikoff, S. and Aaronson, S.A. (1989) Proc. Natl.Acad.Sci. USA (in press)). Vienas oligonukleotidinis pulas turėjo visų 256 galimų koduojančių sekų mišinį devynioms aminorūgštims, tuo tarpu kitas turėjo inozino liekanas degeneruotoje trečioje kodonu pozicijoje Thr ir Pro.
Ši pastaroji konstrukcija sumažino galimų koduojančių sekų pule skaičių iki 16. Inozinas tRNR antikodone gali sudaryti vandenilines jungtis su A, C arba U (Crick, F.H.C. (1966) J. Mol. Biol. 19, 548-555), ir oligonukleotidai, kurie turi deoksiinozino, kaip buvo parodyta, gali efektyviai hibridizuotis su atitinkama kDNR (Ohtsuka, R., Matsuki, S., Ikehara, M., Takashi, Y. and Matsubara, K. (1985) J. Biol.Chem. 260, 2605-2608).
kDNR biblioteka buvo sudaryta kDNR klonuojančiame vektoriuje pCEVP (Miki, T., Matsui , T., Heidaran, M.
and Aaronson, S.A. (1989) Proc.Natl.Acad.Sci (inpress)), panaudojant poliadenilintą RNR, ekstrahuotą iš žmogaus embrioninio plaučio fibroblasto ląstelinės linijos M426 (Aaronson, S.A. and Todaro, G.J. (1968) Virology 36, 254-261), pradinio augimo faktoriaus ląstelės. Po bibliotekos atrinkimo (skriningo) (9 χ 105 trombocitų) su 32
P-žymėti 26-mer oligonukleotidai identifikavo 88 tromLT 3472 B bocitus, kurie hibridizavosi su abiem oligonukleotidinių zondų pulais.
Parinktų kDNR klonų charakterizavimas ir aminorūgščių nustatymas
Iš 10 išvalytų nuo trombocitų klonų, kurie buvo analizuojami, vienas, pažymėtas klonu 49, turėjo kDNR 3.5 kb intarpą, tuo tarpu likusieji turėjo 1.8 kb - 2.1 kb intarpus.
Mažesnių klonų analizė atskleidė kelis bendrus restrikcinius saitus. Būdingų mažesnių klonų, pažymėtų 32 klonu, kartu su 49 klonu, sekų nustatymas parodė, kad jie buvo persidengiantys kDNR (Fig. II-1A). Tuo tarpu kai 49 kloną veikė pradmuo iš poli (A) galo informacijos, 32 klonas iškilo, konstruojant biblioteką oilgo(dT), sukėlėjo hibridizacija su A-praturtinta seka 3’ nekoduojančioje KAF iRNR srityje.
Sekos, koduojančios KAF polipeptidą, aprašymas
Dviejų šių kDNR (32 ir 49) tyrimas leido nustatyti tolydinę 3.5 kb seką, turinčią visą KAF koduojančią seką (Fig. II-1B). ATG, matyt, esantis iniciacijos kodonu, buvo 446 nukleotido pozicijoje, sudarydamas 582azotinių bazių porų atviro skaitymo rėmelį, kuris baigėsi TAA terminacinio kodono pozicijoje 1030. Šis atviras skaitymo rėmelis gali koduoti polipeptidą iš 194 aminorūgščių su paskaičiuota 22512 daltonų molekuline mase.
Šoninė ATG kodono seka neprisitaiko prie pasiūlyto GCC(G/A) CCATGG suderinamumo optiniam iniciavimui eukariotinėmis ribosomomis (Kozak, M. (1987) Nucl.Asids Res. 13, 8125-8148), tačiau aukštyn nuo ATC kodono yra A trys nukleotidai. Toje padėtyje A yra labiausiai išsaugotos tokio suderinamumo nukleotidas. Toks ATG kodonas eina prieš 85 nukleotidus, išdėstytus aukštyn nuo TGA stop-kodono tame pačiame skaitymo rėmelyje.
Aminorūgščių seka 19, kuri yra homologiška eksperimentiškai apibrėžtam išgryninto KAF NH2-galui, prasideda nuo 32 aminorūgščių, išdėstytų žemyn nuo pasiūlyto iniciacijos kodono. Buvo visiškas atitikimas tarp prognozuotos ir eksperimetiškai nustatytos aminorūgščių sekos, todėl galėjo būti atliktas nedviprasminis priskyrimas .
Homologijos tarp KAF ir bet kurio žinomo proteino ieškojimas buvo atliekamas kompiuterine paieška National Biomedical Research Foundation duomenų bazėje, naudojant FASTP Lipman and Pearson programą (Lipman, D.J. and Pearson, R.W. (1985) Science 227, 1435-1441) . Pagal šį būdą buvo išryškintas puikus giminingumas tarp prognozuotos KAF struktūros ir rūgštinio ir bazinio FAF struktūros, kaip ir giminingų hst ir int-2-užkoduotų proteinų.
KAF geno mRNR matricų ekspresija žmogaus ląstelėse
Parengiamuosiuose bandymuose ištirti KAF iRNR žmogaus ląstelėse zondas, apimantis didesnę KAF koduojančios sekos dalį (zondas A, Fig. II-1A), nustatė vienintelę
2.4 kb matricą Northern-blott analizės būdu iš visos M426 RNR (Fig. II-1C). Šis dydis žymiai mažesnis, negu sudėtinės kDNR ilgis, 3.85 kb.
Tačiau, ekranuojant poli(A)-parinktą M426 RNR, buvo nustatyta papildoma apytikriai 5 kb matrica. Be to, zondas išvestas iš netransliuotos 49 klono srities 3' iki 32 klono galo (zondas B, Fig. II-1A), hibridizavosi tik su didesne infromacijos dalimi (Fig. II-1C). Tuo būdu, matyti, kad KAF genas yra transkribuojamas tik tose dalyse, kurios susijusios su alternatyviom RNR. Du kiti FAF genų šeimos nariai, bFAF (Abrahams J.A., Mergia, A., Whang, J.L., Tumolo, A., Friedman, J., Hjerrild, K.A., Gospodarowicz, D. and Fiddes, J.C. (1986) Science 233, 545-548) ir int-2 (Mansour, S.L. and Martin, G.R. (1988) EMBO J. 1, 2035-2041), taip pat išskiria sudėtinių RNR, kurių svarbumą lieka papildomai išaiškinti.
Normalaus KAF funkcionalinio vaidmens ištyrimui buvo nagrinėjama jo matricos ekspresija įvairiose žmogaus ląstelinėse linijose ir audiniuose. Kaip parodyta Fig. II-3, dominuojanti 2.4 kb KAF matrica buvo nustatyta kiekvienoje iš stromalinių fibroplastinių linijų, kurios yra epitelinių audinių dariniai iš embrioninių, naujagimių ir suaugusių šaltinių, bet ne iš normalios prigimties epitelinių ląstelių linijų. Tokia matrica taip pat buvo nustatyta RNR, ekstrahuotoje iš normalių suaugusio žmogaus inkstų ir skrandžio virškinamojo trakto organų, bet ne plaučių ar smegenų. Puikus KAF RNR ekspresijos specefiškurnąs stromos ląstelėse parodė tai, kad šis faktorius vaidina normalų vaidmenį epitelinių ląstelių augimo mezemchiminiame stimuliavime.
Kitų augimo faktorių, pasižyminčių žinomu aktyvumu epitelinių ląstelių atžvilgiu, palyginimui iRNR buvo analizuotos taip pat tuose pačiuose audiniuose, minėtuose aukščiau. Tarp išanalizuotų epitelinių ir stromos ląstelių linijų nebuvo rasta rFAF arba bFAF matricų ekspresijos dėsningumo (Fig. II-3). EAF matrica nebuvo išskirta tose pačiose linijose ir buvo pastebėta tarp įvairių audinių tik insktuose. Galiausiai, TAFa nebuvo aptiktas jokioje stromos fibroplastų linijoje ir buvo išskirtas įvairiuose lygiuose iš epitelinių ląstelių linijų. Jis taip pat buvo aptiktas mažais kiekiais inkstuose tarp tirtų audinių (Fig. II-3) .
KAF mitogeninio aktyvumo inhibicija heparinu
Buvo parodyta, kad heparinas žymiai padidina tFAF mitogeninį aktyvumą dideliam skaičiui ląstelių-taikinių kultūroje ir stabilizuoja jį terminės dezaktyvacijos atžvilgiu. Nepaisant tvirto prijungimo prie bFAF, heparinas darė minimalų poveikį jo mitogeniniam aktyvumui (Gospodarowicz, O. and Cheng, J., Cell Physiol. 128, 475-485). Heparino poveikis KAF mitogeniniam aktyvumui buvo ištirtas KAF ir FAF giminingumo požiūriu. Kaip parodyta II-l lentelėje, timidino įvedimas BALB/MK ląstelėmis, veikiant KAF, buvo 16 kartų inhibuoj amas, įvedus hepariną į kultūrinę terpę. Priešingai, taip paveikus, padidėjo ir rFAF bei bFAF aktyvumai.
Anti-KAF antikūnų gamyba
Kelios antikūnų, kurie atpažįsta KAF arba į KAF panašius polipeptidus, rūšys buvo paruoštos, naudojant standartines metodologijas, gerai žinomas eksperimentinės imunologijos srityje ir trumpai aprašytas Metodų skyriuje aukščiau. Į jas įeina: monokloniniai antikūnai, išauginti pelėse prieš nepažeistą, išgrynintą proteiną iš žmogaus fibroplastų; polikloniniai antikūnai, išauginti triušiuose prieš sintetinius peptidus su sekomis aminorūgščių sekų, prognozuotų KAF kDNR sekos, pagrindu; polikloniniai antikūnai, išauginti triušiuose tiek prieš natūraliai išskirtą KAF iš žmogaus fibroplastų, tiek prieš rekombinantinį KAF, pagamintą E. coli (žiūr. kitą skyrių).
Buvo išgryninti monokloniniai antikūnai iš trijų skirtingų hibridomų. Visi trys atpažino rekombinantą, kaip ir natūraliai pasirodantį KAF kietos fazės (ELISA) bandyme. Nė vienas iš jų nedalyvauja kryžminėse reakcijose su KAF denatūracijos sąlygose (pagal WesternLT 3472 B blott analize), ir nė vienas neneutralizuoja KAF mitogeninio aktyvumo BALB/MK bioanalizėje.
Polikloniniai antikūnai buvo gaunami, naudojant sintetinį peptidą su aminorūgščių seka NDMTPEQMATNVR, atitinkančia liekanas 32-44 KAF (žiūr. Fig. II-1), plius R(arg) liekana vietoj tikrosios asp liekanos, užkoduotos kRNR pozicijoje 45. Asp liekana yra, galbūt, glikozilintą natūraliame KAF polipeptide ir todėl yra arg aminorūgščių sekos duomenyse, gautuose betarpiškai dėl tokio polipeptido (žiūr. Diskusijų žemiau). Polikloniniai antikūnai, generuoti su sintetiniu peptidu, atpažįsta tiek natūralų, tiek rekombinantinį KAF ELISA ir Western-blott analizės, esant jautrumo lygiui ne mažesniam kaip 10 ng proteino. Tačiau tokie antikūnai ne neutralizuoja KAF mitogeninio aktyvumo BALB/MK bioanalizė je .
Polikloninis antiserumas prieš nepažeistą natūralų KAF proteiną atpažįsta KAF tiek ELISA, tiek Western-blott analizėse. Tokie antikūnai taip pat inhibuoja KAF mitogeninį aktyvumą BALB/MK bioanalizėj e .
KAF kDNR ekspresija E. coli
Buvo atlikta KAF kDNR ekspresija, kad būtų pagamintas polipeptidas E.coli, patalpinant jo koduojančią seką hibridinio trk promotoriaus (turinčio trp ir lac promotorių elementus) kontrolei plazmidėje pKK233-2 (Amman, E. and Brosius, J. (1985) Gene 40, 183) . Kad tai būtų atlikta, konkretus FAF kDNR ilgis, kuris turėjo informaciją subrendusios KAF molekulės užkodavimui (t.y. be jo signalinės sekos), buvo sustiprintas, panaudojant polimerazinės grandinės reakcijos metodą (Sakai, R.K., Schart, S., Faloona, F., Mullis, K.B., Norn, G.T., Erlich, H.A. and Arnheim, N. (1985) Science 230, 13501354). Fragmentas buvo kryptingai įterpiamas tarp dviejų saitų vektoriuje, būtent, Ncol saito, padaryto bukais galais SI nukleazės įsisavinimu, ir HindlII saito, panaudojant standartinę rekombinantinės DNR metodologiją. Parinktuose rekombinantuose atliko aminorūgščių sekos nustatymą jų kDNR 5' galuose, kad būtų užtikrintas teisingas ATC iniciacijos kodono sureguliavimas su reguliaciniais trk promotoriaus elementais .
Buvo tikrinamas kelių rekombinantų sugebėjimas gaminti proteiną įprastais mikrometodais. Trumpai sakant, klonai buvo auginami iki mikrosponentinės fazės (OD595- 0.5), paveikti 1 mM izopropilo β-D-tiogalaktopiranozidu 90 minučių, ir ląstelės ekstraktai buvo užnešti ant SDSpoliakrilamidinių gelių Western-blott apdažymo analizei. Visi tirti rekombinantai sintezavo proteiną, kuris buvo atpažįstamas antikūnais prieš amino-terminalinį KAF peptidą. Buvo parinktas vienas rekombinantas, kuris parodė didžiausią indukciją iš IPTG tolesnei proteino analizei.
ltr bakterijų buvo auginamas NZY buljone, turinčiame 50 ųg/ml ampicilino ir 12 ųg/ml tetraciklino, iki OD595-0.5 ir 90 min. paveikta IPTG. Ląstelės buvo surinktos centrifugavimu, resuspenduotos 50 mM natrio fosfato (pH 7.3), 0.2 M NaCl, ir lizuotos ultragarsu. Ląstelės liekanos buvo atskirtos centrifugavimu, ir lizatas betarpiškai buvo naudojamas heparino-Serafozės afininėje kolonėlėje.
Kaip nustatyta Western-blott analize ir mitogeninių aktyvumu keratinocituose, rekombinantinis KAF buvo išplautas eliuentu 0.5-0.6 M NaCl. Tolesnis HSAC medžiagos gryninimas su Mono-S (FPLC) kolonėle (Pharmacia) davė KAF preparatą, kurio įvertintas grynumas) 90%, kaip įvertinta elektroferazės abalize, panaudojant SDS-poliakrilamidinius gelius ir apdažymą sidabru.
Rekombinantinis KAF efektyviai stimuliavo timidino įvedimą į BALB/MK keratonicito ląsteles, bet tik nežymiai aktyvus NIH/3T3 fibroplastų atžvilgiu. Pusė maksimalios BALB/MK ląstelių stimuliacijos standartinėje keratinocito bioanalizėje buvo atlikta, esant koncentracijai nuo 2 iki 5 ng/ml, lyginant su koncentracija nuo 10 iki 15 ng/ml išgrynintam KAF iš M426 ląstelių. Vienas bakterinių ląstelių davė maždaug 50 ųg Mono-S išgryninto rekombinantinio KAF.
Chimeros, turinčio KAF ir rFAF sekas, konstravimas
Aukščiau aprašyti tyrimai parodė, kad KAF pasižymėjo dviem atskiromis charakteristikomis, kurios galėjo būti užkoduotos atskiromis polipeptidinės sekos dalimis arba sritimis, kaip yra gerai žinoma iš kitų multifunkcionalinių polipeptidų, koduojančių sekų. Šios galimybės patikrinimui chimerinės DNR segmentas, koduojantis NH2-galo KAF seką, įskiepytas į rFAF C-galo šerdį, buvo sukonstruotas taip. Sau3AI restrikcinis fermento saitas (GATS) kDNR 5' gale, kodonu liekanomis 78 ir 79 (atitinkamai arg ir ile, žiūr. Fig. II-l) viduje buvo išpjautas ir įjungtas į homologinį saitą rFAF kDNR aminorūgščių 39 (arg) ir 40 viduje. Šios chimerinės DNR galai 3' ir 5' buvo prijungti prie plazmidės pKK233-2 vektorinės DNR tuo pačiu būdu, naudojamu KAF kDNR, koduojančios polipeptido sekrecinę formą, įterpimui (žiūr. Metodus aukščiau).
Kada rekombinantinės E. coli ląstelės buvo sukonstruotos, panaudojant vektorių, nešantį chimerą, ekspresijos testai buvo atliekami, kaip aprašyta aukščiau subrendusiam KAF, buvo pagamintas naujas produktas, turintis tiek KAF, tiek rFAF savybes. Peptidas buvo praturtintas heparino-Sefarozės chromatografija ir buvo rasta, kad jis turi ląstelės-taikinio pranašumų keratinocitams, kaip KAF, su minimaliu aktyvumu fibroplastams (NIH/3T3). Tačiau šio chimerinio polipeptido mitogeninis aktyvumas neturi jautrumo inhibicijai heparinu, charakteristikos, kuri būdinga labiau rFAF negu KAF. Faktiškai mitogeninis aktyvumas kerati5 nocitams yra padidinamas, kaip rFAF atveju. Todėl peptido sritys, atsakingos už ląstelės-taikinio specifiškumą ir jautrumą heparinui, yra aiškiai atskiros ir greitai atskiriamos FAF pagal šio išradimo panaudojimą.
DISKUSIJA
Eksperimentai, aprašyti šiame skyriuje, iliustruoja kelių principinių šio išradimo įgyvendinimų praktiką. Jie apima kDNR, koduojančių KAF, išskyrimą; tokių kDNR ekspresiją rekombinantinėse ląstelėse; įvairių antikūnų su KAF, gamybą; ir chimerinės kDNR, koduojančios naują augimo faktorių tiek su KAF, tiek su rFAF aminorūgščių sekomis ir giminingais funkcionališkumais. Geresniam šio išradimo supratimui galima paminėti tokius aspektus; susijusius su šiais įgyvendinimais.
Seka, prognozuota iš KAF kDNR, atitiko aminorūgščių seką, nustatytą iš grynos KAF formos, išskirtos žmogaus fibroplastų. Be to, ši seka leido potencialiai paaiškinti pozicijas, kur galutinai aminorūgščių priskyrimui gali būti atlikti tiesioginiu aminorūgščių nustatymu. Liekanos 32 ir 46 prognozuojamos iš kDNR sekos, kad būtų cisteinai, ir hidrolizuoti nemodifikuoto cisteino liekanų dariniai yra nenustatomi pagal Edman degredaciją. Prognozuota KAF aminorūgščių seka taip pat turėjo vieną potencialų N-sujungtą glikozilacijos saitą (Asn-X-Ser/Thr) iš liekanų 45-47. Jei Asn 45 buvo glikozilinti, jis nebūtų buvęs nustatytas aminorūgščių sekų nustatymo metodu, naudojamu čia. Iš tikrųjų, KAF migruoja kaip plati juosta NaDodS04/PAGE, esant didesnei molekulinei masei negu prognozuota grynam proteinui. Tai gali būti priskirta glikozilinimui.
FAF yra hepariną surišantys mitogenai' su aiškiais ląstelės-taikinio specifiškumais (Thomas, K. (1987) FASEB J. 1, 434-440) . hst genas buvo identifikuotas kaip transformuojantis genas iš žmogaus skrandžio auglio (Taira,
M., Yoshida, T., Miyagawa, K., Sakamoto, H., Terada, M. and Sugimara, T. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci USA 84, 2980-2984), gretimo normalaus skrandžio audinio (Yoshida, T., Miyagawa, K., Odagiri, H., Sakamoto, H.,
Little, P.F.R., Terada, M. and Sugimara, T. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7305-7309) ir iš Kaposi's sarkomos (DelliBovi, P. and Basilico, C. (1987) Proc. Natl Acad Sci. USA 84, 5660-5664) standartine NIH/3T3 transfekcijos analize, int-2 geno produktas yra išskiriamas normaliai pelės embriogenezės metu (Jakobovits, A., Shackleford, M., Varmus, H.E. and Martin, G. R. (1986) Proc. Natl. Acad Sci. USA 83, 7806-7810) ir pažeidimo atveju - po provirusinės pelės liaukos auglio viruso integracija (Peters, G. Brookes, S. and Dickson, S. (1983) 33,364-377).
KAF yra šeštas identifikuojamos fibroplastų augimo faktorių šeimos narys. Nors pavadinimas FGF-6 neatrodo tinkamas dėl to, kad KAF nėra aktyvus fibroplastų atžvilgiu, tokia terminologija gali būti panaudota šiam augimo faktoriui, pažymint struktūrinius ryšius su FAF šeima. Kadangi visi anksčiau apibūdinti augimo faktoriai arba išskiria epitelines ląsteles kaip taikinius, arba įjungia jas tarp eilės jautrių ląsteliųtaikinių, labai specifinė KAF mitogeninio aktyvumo epitelinių ląstelių atžvilgiu prigimtis ir ypač jautrumas keratinocitų atžvilgiu daro jį unikalų.
Tyrinėjimuose ligi šiol KAF matricos ekspresija pasirodė specifinė stromos ląstelių, išvestų iš epitelinių audinių, atžvilgiu, rodydama jos funkciją normalios epitelinės ląstelės proliferacijoje. KAF kDNR klono buvimas įgalina nustatyti, ar normali šio augimo faktoriaus ekspresija gali būti įtraukta į klinikines būkles, apibūdinamas epitelinės ląstelės displazija ir/arba neoplazija. Be to, galimybė pagaminti didelius šio naujo augimo faktoriaus kiekius rekombinantiniais būdais turėtų leisti patikrinti jo klinikinį pritaikomumą situacijose, kur specifinis epitelinis ląstelių augimas ypač svarbus.
KAF sekos palyginimas su penkiais kitais FAF šeimos proteinais atskleidė dvi pagrindines homologijos sritis, apimančias aminorūgštis 65-156 ir 162-189 prognozuotoje KAF sekoje, kurios buvo atskirtos trumpa nehomologiška aminorūgščių serija su besikeičiančiu ilgiu skirtinguose šeimos nariuose (Fig. II-2) int-2 atveju šios sekos ilgis turėjo 17 liekanų, tuo tarpu hst dvi homologinės sritys buvo gretimos. KAF Įsiterpianti seka susidėjo iš penkių aminorūgščių.
Sulygintose srityse KAF aminorūgščių seka buvo apie 44% identiška int-2 (pelės), 39% identiška bFAF (žmogaus) ir 33% identiška hst (žmogaus). Toje pačioje srityje visi šeši proteinai buvo identiški 19% liekanų, ir, panaudojus saugomus pakaitalus, jie aprodė 28% homologiją.
Kaip parodyta Fig. II-2, tokių giminingų proteinų aminogalai buvo nehomologiški ir turėjo skirtingą ilgĮ. Pirminiai KAF ir hst transliacijos produktai turi hidrofobines N-gali sritis, kurios, kaip matyti, yra kaip signalinės sekos (von Heijne, G. (1986) Nucl. Acids Res. 4683-4690). Faktas, kad šios N-galo srities nėra subrendusioje KAF molekulėje (Fig. II-1B), patvirtina šią išvadą. Priešingai, FAF yra sintezuojami aiškiai be signalinių peptidų (Thomas, K. (1987) FASEB, J. 1, 434440). int-2 proteinas turi netipiškai trumpą N-galinių hidrofobinių liekanų sritį (Moore, R. Casey, G., Brookes, S., Dixon, M., Peters, G., and Dickon, C. (1986) EMBO J. 5, 919-924), bet ji nėra žinoma, jei proteinas išskirtas. Dar daugiau, int-2 proteinas turi didelĮ C-galo pailginimą, palyginus su kitais šeimos nariais.
Išgrynintas KAF turi penkias cisteino liekanas, iš kurių dvi išsilaiko visoje FAF giminingų proteinų šeimoje (Fig. II-2). Reikėtų taip pat paminėti penkias bazių liekanų poras KAF sekoje. Tas pats vaizdas buvo stebimas kituose FAF šeimos nariuose ir į tai galima atsižvelgti jų sąveikoje su heparinu (Scwarzbauer, J.E., Tamkum, J.M., Lemischka, I.R. and Hynes, R.O. (1983) Cell 35, 421-431) . Dviejų bazių saitai taip pat yra įprasti taikiniai proteolitiniam apdorojimui ir toks apdorojimas gali būti mikroheterogeniškumo, stebimo kai kuriuose KAF preparatuose, priežastimi (nepublikuoti duomenys).
KAF kDNR seka buvo praturtinta AT per visą ilgį, bet ypač 3' netransliuotoje srityje, kur AT turintys buvo 70%, palyginus su 60% numatomoje koduojančioje sekoje ir 63% 5' netransliuotoje srityje. 3' netransliuota sritis turėjo didelį skaičių AT TTA sekų, kurios, kaip manome, dalyvauja selektyvioje laikinai išskirtos, nestabilios RNR degradacijoje (Shaw, G. and Kamen, R. (1986) Cell 46, 659-667) . Klasikinio AATAAA poliadenilinimo signalo nėra, bet nustatomos dvi skirtingos sekos AATTAA ir AATACA (Birnsteil, M.L., Busslinger, M. and Strub, K. (1985) Cell 41, 349-359), atitinkamai 24 ir 19 nukleotidų, į viršų nuo poli (A) sekos kDNR 3j gale.
Buvo padaryta prielaida, kad heparino poveikis rūgštiniam FAF yra arba dėl aktyvios augimo faktoriaus konformacijos, arb dėl trigubo komplekso su rūgštiniu FAF ir jo receptoriumi susidarymo (Schrieber, A.B., Kenny, J., Kowalski, W., Friesel, J., Mehlman, T. and Maciag, T. (1985) Proc. Natl. Acad Sci. USA 82, 61386142; Gospodarowi cz, O. and Cheng, J. (1986) J. Cell Physiol. 128, 475-485). 'Jei taip, heparinas gali stabilizuoti KAF konformaci ją, kuri ne tokia' aktyvi, kaip laisva molekulė, arba sudaryti stabilų kompleksą, kuris negali efektyviai sąveikauti su jo receptoriumi.
Nors jo sugebėjimas jungti hepariną atspindi struktūrinius KAF panašumus su FAF, specifiškumų ląsteiiųtaikinių atžvilgiu skirtumai tarp šių giminingų mitogenų yra žymūs. FAF indukuoja daugelio neterminaliai diferencijuotų tiek embrioninės mezodermalinės, tiek neuroektoderminaiinės prigimties ląstelių dalijimąsi. Be fibroplastų ir kraujagyslių endotelinių audinių, mezodermalinės prigimties taikiniai kultūroje apima mioblastus, chondrocitus ir osteoblastus (Thomas,
K.A. and Giminez-Gallego, G. (1986) Trends Biochem, Soc. 11, 81-84) . FAF yra taip pat mitogeniniai glialinių astrocitų ir neuroblastų atžvilgiu (Gensburger, C., Labourdette, J. and Sensembrenner, M. (1987) FEBS Lett. 217, 1-5) . Onkogeno produktas, išskirtas iš Kaposis sarkomos, kuris yra identiškas hst, taip pat stimuliuoja NIH/3T3 ir kapiliarinių endotelinių ląstelių proliferaciją. Iki šiol KAF indukuota mitogenezė buvo stebima tik epitelinėse ląstelėse, ir jokio nustatomo aktyvumo fibroplastų arba endotelinių ląstelių atžvilgiu nebuvimas buvo pademonstruotas taip pat (žiūr. I Eksperimentinį skyrių aukščiau ir Rubin (Rubin, J. S., Osada, H., Finch, P.W., Taylor, W.G., Rudikoff, S. and_ Aaronson, S.A. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA (in press)). Nėra žymios N-galo homologijos tarp KAF ir kitų FAF giminingų proteinų. Tuo būdu, chimerinių molekulių struktūra tarp KAF ir prototipinio FAF buvo tiriama nustatyti, ar KAF N-galo sritis yra pakankama užtikrinti jo unikalų ląstelės-taikinio specifiškumą. Pirmos tokios rekombinantinės polipeptidinės sekos tyrimo rezultatai parodė, kad N-galo KAF seka iš esmės koduoja ląstelės pirmenybę keratinocitų atžvilgiu, tuo tarpu KAF jautrumas heparinui yra užkoduotas kažkur Cgali šerdies srityje, kuri buvo pakeista rFAF sekomis. Šis naujas i KAF panašus augimo faktorius gali turėti pranašumų klinikiniuose taikymuose, kur specifinis epitelinių ląstelių atžvilgiu augimo faktorius yra reikalingas, esant heparinui, visuotinai naudojamam antiLT 3472 B koaguliantui. Papildomi chimerų tyrimai turėtų taip pat padėti suprasti, kurios specifinės sritys C-galo šerdyje įneša skirtingus heparino poveikius jų biologiniams aktyvumams.
Aukščiau aprašytas išradimas pateiktas čia su kai kuriomis smulkmenomis, kad būtų galima aiškiau ir geriau ji suprasti. Akivaizdu, kad gali būti atliktos įvairios formų ir detalių kombinacijos, nukrypstančios nuo išradimo srities.
1-1 lentelė. Augimo faktoriaus gryninimas
Gryninimo žingsnis Proteinas (mg) Bendras aktyvumas (vienetai)* Specifinis aktyvumas (vienetai/mg)
Kondicionuota 1.4xl03a 2.5xl04 Ι.δχΙΟ1
terpė (10 ltr)
Ultrafiltracija 1.3xl03a 3.2xl04 2.5Χ101
(retentatas)
HSAC 0.6 MM NaCl 0.73b 1.6xl04 2.2xl04
nupylimas
TSK-G3000SW 8.4xl0’3b 2.7xl03 3.2xl05
c4-assc 6.1xl0'3b 2.1xl02 3.4xl04
Regeneracijos paskaičiuotos su prielaida, id visas 5 mitogeninis aktyvumas pradinėje medžiagoje buvo izoliuoto faktoriaus dėka.
* Vienas aktyvumo vienetas yra apibrėžiamas kaip pusė maksimalios timidino įvedimo stimuliacijos, indukuotos
TSK-išgrynintu faktoriumi BALB/MK bioanalizėje, kurioje maždaug 3 ng TSK/išgryninto faktoriaus stimuliavo 1 aktyvumo vienetą.
aProteinas buvo įvertintas, naudojant Bradford reagentą iš BioRad (Bradfor, M. (1976) Anai. Biochem. 72, 248-254).
b i %
Proteinas buvo įvertintas, naudojant A 214=140.
1-2 lentelė. Augimo faktoriaus specifiškumas ląsteleitaikiniui.
Augimo faktorius Epitelinės Fibroplastų MIN/3T3S Endotelinės žmogaus poodinė vena
BALB/MK BS/589 CCL208
KAF 500-1000 2-3 5-10 <1 <1
EAF 100-200 20-40 10-30 10-20 n. n.
TAF* 150-300 n. n. n. n. 10-20 n. n.
rFAF* 300-500 . 2-3 5-10 50-70 5
bFAF 100-200 2-3 2-5 50-70 5
Maksimalus timidino įvedimo, stimuliuoto KAF ir kitų augimo faktorių lyginimas Įvairiose ląstelėse yra išreikštas kaip kartoninis stimuliacijos padidėjimas, lyginant su fonine reikšme.
Šie duomenys yra keturių skirtingų eksperimentų rezultatas .
*Maksimali stimuliacija rFAF reikalavo heparino (sigma) buvimo, 20 mg/ml.
n.n.=nenustatyta.
II-l lentelė. Heparino poveikis KAF mitogeniniam aktyvumui.
Augimo faktorius BALB/MK □ MIN/3T3 + □ +
KAF 150 9.5 <1 <1_
rFAF 106 259 10.4 68
bFAF 30 124 45.7 70
W.G. ,
Natl.
Ląstelės buvo išdėstytos mikrotitravimo lėkštelėse, kultivuotos iki susiliejimo terpėje su serumu ir tada, prieš įdedant pavyzdį, patalpintos į terpe be serumo 24-72 valandoms. Mitogenezė buvo atliekama kaip aprašyta (žiūr. I Eksperimentinį skyrių aukščiau ir Rubin (Rubin, J.S., Osada, H., Finch, P.W., Taylor, Rudikoff, S. and Aaronson, S.A. (1989) Proc.
Acad. Sci. USA (in press)). Kur nurodyta, heparinas buvo įvedamas į kultūrinę terpę galutinės 20 ųg/ml koncentracijos. Visų augimo faktorių koncentracija buvo 50 ng/ml. Rezultatai yra kartoninė H-timidino įvedimo 1 nurodytą analizės ląstelę stimuliacija, esant (+) arba nesant (-) heparino. Kiekviena reikšmė yra vidutinė reikšmė pagal du nepriklausomus eksperimentus, kuriuose kiekvienas taškas savo ruožtu reiškia dvigubos analizės vidutinę reikšmę.

Claims (46)

1. Iš esmės grynas žmogaus keratinocitų augimo faktoriaus (KAF) proteinas arba į KAF panašus proteinas, kurio molekulinė masė, nustatyta migracija NaDodSO4/PAGE, yra tarp 16 ir 30 kDa ir specifinis aktyvumas yra mažiausiai apie 3.4 χ 104 vienetų proteino miligramui, kur vienas aktyvumo vienetas yra apibrėžiamas kaip tas kiekis, kuris sukelia pusę maksimalios galimos DNR sintezės stimuliacijos BALB/MK keratinocitų ląstelėse, esant standartinėms analizės sąlygoms, besiskiriantis tuo, kad minėto augimo faktoriaus mitogeninis aktyvumas stimuliuoja epitelinės prigimties ląsteles, bet ne fibroblastines ląsteles.
2. Proteinas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra glikozilintas.
3. Proteinas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis turi visą arba dalį aminorūgščių sekos, parodytos Fig.II-lB, o Fig.II-lB yra šios apibrėžties dalis.
4. Proteinas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis neturi signalinės peptidinės sekos, kaip parodyta Fig.II-lB.
5. Proteinas pagal 3 arba 4 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis nėra glikozilintas.
6. Chimerinis i KAF panašus proteinas, besiskiriantis tuo, kad jis turi vienoje polipeptidinėje molekulėje žmogaus KAF funkcines sritis ir bent vieną kitą fibroblastų augimo faktorių šeimos polipeptidą.
7. Chimerinis į KAF panašus proteinas pagal 6 punktą, besiskiriantis tuo, kad fibroblastų augimo faktoriaus polipeptidas yra rūgštinis fibroblastų augimo faktorius (rFAF).
8. Chimerinis i KAF panašus proteinas pagal 7 punktą, besiskiriantis tuo, kad KAF funkcinė sritis yra apibrėžiama aminorūgščių liekanomis, atsakingomis už pirmenybinį KAF mitogeninį aktyvumą epitelinių ląstelių atžvilgiu ir rFAF funkcinė sritis yra apibrėžiama aminorūgščių liekanomis tos rFAF srities, kuri yra homologiška KAF sekai, atsakingai uš KAF jautrumą heparinui.
9. Chimerinis į KAF panašus proteinas pagal 8 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta funkcinė KAF sritis yra apibrėžiama aminorūgščių liekanomis, turinčiomis 39 - 78 numerius Fig.II-lB, ir minėta rFAF funkcinė sritis yra apibrėžiama maždaug 140 aminorūgščių liekanomis, apimančiomis rFAF karboksilinį galą, pradedant 39 numerio liekana.
10. Farmacinė kompozicija, besiskirianti tuo, kad ji susideda iš chimerinio į KAF panašaus proteino pagal bet kuri, iš 6 - 9 punktų ir priimtino farmacinio nešiklio.
11. Farmacinė kompozicija pagal 10 punktą, skirta būklių, reikalaujančių specifinės epitelinių ląstelių stimuliacijos, esant heparinui, gydymui.
12. Antikūnas, nukreiptas prieš visą arba dalį KAF arba į KAF panašaus proteino pagal 3 punktą.
13. Antikūnas pagal 12 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis neutralizuoja mitogeninį žmogaus KAF aktyvumą.
14. Antikūnas pagal t i s tuo, kad jis 15. t i Antikūnas pagal s tuo, kad jis 16. DNR segmentas,
12 punktą, bes yra polikloninis.
12 punktą, bes yra monokloninis koduojantis iskirianantikūnas žmogaus keratinocitų augimo faktoriaus (KAF) proteiną arba į KAF panašų proteiną, arba minėto DNR segmento komplementari grandinė minėto proteino molekulinei masei esant tarp 16 ir 30 kDa, kaip apibrėžta migracija NaDodS04/PAGE, ir jo specifiškumui esant mažiausiai apie 3.4 χ 104 vienetų proteino miligramui, kur vienas aktyvumo vienetas yra apibrėžiamas kaip kiekis, kuris sukelia pusę maksimalios galimos DNR sintezės stimuliacijos BALB/MK keratinocito ląstelėse, esant standartinėms analizės sąlygoms, besiskiriantis tuo, kad minėto augimo faktoriaus mitogeninis aktyvumas stimuliuoja epitelinės prigimties ląsteles, bet ne fibroblastines ląsteles.
17. DNR segmentas pagal 16 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis koduoja visą arba dali aminorūgščių sekos, apibrėžtos Fig.II-lB, arba Komplementari minėtam DNR segmentui grandinė.
18. DNR segmentas pagal 17 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis neturi nukleotidinės sekos, koduojančios signalinę peptido seką, parodytą Fig.II-lB arba komplementari minėtam DNR segmentui grandinė.
19. DNR segmentas, besiskiriantis tuo, kad jis apima visą arba dalį nukleotidinės sekos, nurodytos Fig.II-lB, arba komplementari minėtam DNR segmentui grandinė.
20. DNR segmentas, besiskiriantis tuo, kad jis koduoja chimerinį į KAF panašų proteiną, kuris vienoje polipeptido molekulėje turi žmogaus KAF funkcines sritis ir bent vieną kitą fibroblastų augimo faktorių šeimos polipeptidą, arba komplementari minėtam DNR segmentui grandine.
21. DNR segmentas pagal 20 punktą, besiskiriantis tuo, kad fibroblastų augimo faktoriaus polipeptidas yra rūgštinis fibroblastų augimo faktorius, arba komplementari minėtam DNR segmentui grandinė .
22. DNR segmentas pagal 21 punktą, besiskiriantis tuo, kad funkcinė KAF sritis yra apibrėžiama aminorūgščių liekanomis, atsakingomis už pirmenybinį KAF mitogeninį aktyvumą epitelinių ląstelių atžvilgiu, ir funkcinė rFAF sritis yra apibrėžiama aminorūgščių liekanomis tos rFAF srities, kuri yra homologiška KAF sekai, atsakingai už KAF jautrumą heparinui, arba komplementari minėtam DNR segmentui grandinė.
23. DNR segmentas pagal 21 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta KAF funkcinė sritis yra apibrėžiama aminorūgščių liekanomis, turinčiomis 39 78 numerius Fig.II-lB, ir minėta rFAF funkcinė sritis yra apibrėžiama maždaug 140 aminorūgščių liekanomis, apimančiomis rFAF karboksilinį galą, pradedant 39 numerio liekana, arba komplementari minėtam DNR segmentui grandinė.
24. Rekombinantinė DNR molekulė, besiskiriant i tuo, kad susideda iš DNR segmento pagal bet kurį iš 16 - 23 punktų ir vektoriaus.
25. Rekombinantinė DNR molekulė pagal 24 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtas vektorius yra plazmidė, bakteriofago klonuojantis vektorius, plazmidinis DNR sekos nustatymo vektorius, bakterinių genų ekspresijos vektorius arba žinduolio geno ekspresijos vektorius.
26. Ląstelių kultūra, besiskirianti tuo, kad ji transformuota minėtos rekombinantinės DNR molekulės pagal bet kurį iš 16 - 23 punktų.
27. Ląstelių kultūra pagal 26 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtos ląstelės yra prokariotinės ląstelės arba eukariotinės ląstelės.
28. į KAF panašaus proteino analizės tiriamajame pavyzdyje būdas, besiskiriantis tuo, kad jis susideda iš tokių stadijų:
I) keratinocitų auginimas kultūroje iki susiliejimo ir susiliejusios kultūros palaikymas terpėje be serumo;
ii) tiriamo pavyzdžio pridėjimas prie nurodytos susinėjusios keratinocitų kultūros;
iii) DNR sintezės stimuliacijos nustatymas minėtuose keratinocituose.
29. Būdas pagal 28 punktą, besiskiriantis tuo, kad stadija iii atliekama, esant ir nesant KAF neutralizuojančio antiserumo.
30. Viso arba dalies žmogaus KAF proteino arba į KAF panašaus proteino gamybos būdas, besiskiriantis tuo, kad jis susideda iš ląstelių pagal 27 punktą auginimo kultūrinėje terpėje tokiose sąlygose, kad minėtas proteinas gaunamas ir išskiriamas iš minėtų ląstelių.
31. KAF arba į KAF panašaus proteino pagal bet kurį iš 1-9, 43 arba 44 punktų gavimo iš kultivuojamų ląstelių būdas, besiskiriantis tuo, kad jis susideda iš tokių stadijų:
I) KAF produkuojančių ląstelių auginimas kultūrinėje terpėje tokiose sąlygose, kuriose KAF susidaro;
ii) minėtų ląstelių ūžavimas, jei būtina, kad intraląstelinis KAF būtų išskirtas į aplinkinę kultūrinę terpę;
iii) paprastai minėtos kultūrinės terpės toks koncentravimas, kad susidarytų pirmas koncentratas;
iv) minėto koncentrato sąlytis su heparinu tokiose sąlygose, kad KAF, esantis nurodytame pirmame koncentrate, sujungiamas su heparinu, po ko susidaro heparino-KAF kompleksas;
v) minėto heparino-KAF komplekso atskyrimas nuo minėto koncentrato;
vi) minėto heparino-KAF komplekso apdorojimas tokiose sąlygose, kad minėtas KAF atskiria nuo heparino, taip kad susidaro laisvo KAF tirpalas;
vii) toks minėto tirpalo koncentravimas kad susidaro antras koncentratas; ir viii) toks nurodyto antrojo koncentrato frakcionavimas, kad KAF yra atskiriamas nuo likusių komponentų.
32. KAF arba i KAF panašaus proteino gavimo iš kultivuotų ląstelių būdas pagal 30 arba 31 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtą KAF gaminančios ląstelės yra prokariotinės ląstelės arba eukariotinės ląstelės.
33. Būdas pagal 32 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtos ląstelės yra E.coli ląstelės.
34. KAF RNR matricos lygio nustatymo būdas, besiskiriantis tuo, kad jis susideda iš tokių stadijų:
I) iRNR išskyrimas iš audinių arba ląstelių;
ii) minėtos RNR renatūracija DNR zondu, koduojančiu žmogaus KAF; ir iii) DNR:RNR hibrido, turinčio minėtą DNR zondą, kiekio nustatymas.
35. KAF proteino ekspresijos lygio nustatymo būdas,, besiskiriant is tuo, kad polipeptidai iš kūno skysčių arba audinių pavyzdžių paveikiami specifiniu peptidui, turinčiam žmogaus KAF arba į KAF panašų proteiną, antikūnu pagal 12 punktą ir nustatomas proteino- antikūno sujungimo kiekis.
36. Reagentas tyrimams, besiskiriantis tuo, kad jis susideda iš viso arba dalies KAF proteino pagal bet kurį iš 1-9, 43 arba 44 punktų, ir paprastai fiziologiškai priimtino kultūros skysčio.
37. Epitelinių ląstelių augimo in vitro stimuliavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad jis apima reagento pagal bet kurį iš 30-33 punktų kiekio, pakankamo stimuliuoti epitelinių ląstelių augimą, pridėjimą.
38. Būdas pagal 37 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtos ląstelės yra keratinocitai.
39. Šeimininko ląstelės, transformuotos rekombinantiniu vektoriumi pagal 24 arba 25 punktą.
40. Ląstelės pagal 39 punktą, besiskiriančios tuo, kad minėtos ląstelės yra prokariotinės ląstelės arba eukariotinės ląstelės.
41. Ląstelės pagal 40 punktą, besiskiriančios tuo, kad jos yra E.coli ląstelės, transformuotos bakterinės ekspresijos vektoriumi.
42. Antikūnas pagal 12 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis veikia prieš peptidą NDMTPEQMATNVR.
43. Žmogaus KAF proteinas pagal Fig.II-lB, besiskiriantis tuo, kad N-galas yra prie arba apie cisterną 32 ir C-galas yra prie arba apie treoniną 194.
44. Neglikozilintas žmogaus KAF proteinas arba jo dalis pagal 1 punktą, kurio molekulinė masė yra tarp 16 ir 22 kDa, kaip nustatyta migracija NaDodS04/PAGE ir kurio specifinis aktyvumas yra mažiausiai apie 3.4 x 10 vienetų proteino miligramui, kur vienas aktyvumo vienetas yra apibrėžiamas kaip toks kiekis, kuris sukelia pusę maksimalios galimos DNR sintezės stimuliacijos BALB/MK keratinocitų ląstelėse, esant standartinėms analizės sąlygoms, besiskiriantis tuo, kad minėto augimo faktoriaus mitogeninis aktyvumas stimuliuoja epitelinės prigimties ląsteles, bet ne fibroblastines ląsteles.
45. Farmacinė kompozicija, besiskirianti tuo, kad ji sudaryta iš bent vieno antikūno pagal 12 punktą ir farmaciškai priimtino nešiklio.
5
46. Farmacinė kompozicija, besiskirianti tuo, kad ji susideda iš bent vieno proteino arba peptido pagal bet kuri iš 1-9, 43 ir 44 punktų ir farmaciškai priimtino nešiklio.
10
47. Farmacinė kompozicija pagal 46 punktą, skirta būklių, reikalaujančių specifinės epitelinių ląstelių stimuliacijos, gydymui.
48. Kompozicija pagal 47 punktą, besiskirian15 t i tuo, kad minėtų būklių gydymas apima žaizdų gydymą, įskaitant epiderminį pagreitinimą arba pagerinimą .
49. Farmacinė kompozicija pagal 45 punktą, skirta
20 būklių, reikalaujančių specifinės epitelinių ląstelių stimuliacijos KAF inhibicijos, gydymui.
LTIP667A 1989-01-31 1993-06-21 Dna encoding a growth factor specific for epithelial cells LT3472B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30428189A 1989-01-31 1989-01-31

Publications (2)

Publication Number Publication Date
LTIP667A LTIP667A (en) 1995-01-31
LT3472B true LT3472B (en) 1995-10-25

Family

ID=23175833

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
LTIP667A LT3472B (en) 1989-01-31 1993-06-21 Dna encoding a growth factor specific for epithelial cells

Country Status (22)

Country Link
US (8) US5741642A (lt)
EP (2) EP1016716A3 (lt)
JP (6) JP3298874B2 (lt)
KR (1) KR950012805B1 (lt)
AT (1) ATE197800T1 (lt)
AU (2) AU647732B2 (lt)
CA (2) CA2038398C (lt)
DE (2) DE69033668T2 (lt)
DK (1) DK0555205T3 (lt)
ES (1) ES2153816T3 (lt)
FI (1) FI114711B (lt)
GE (1) GEP20022681B (lt)
HU (1) HU218090B (lt)
IE (1) IE20020188A1 (lt)
LT (1) LT3472B (lt)
LU (1) LU91237I2 (lt)
LV (1) LV10284B (lt)
NL (1) NL300230I2 (lt)
NO (2) NO308312B1 (lt)
RU (1) RU2250213C2 (lt)
SG (1) SG46699A1 (lt)
WO (1) WO1990008771A1 (lt)

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69033668T2 (de) 1989-01-31 2001-04-12 Jeffrey S Rubin Dns kodierend für einen für epithelzellen spezifischen wachstumsfaktor
GB9203533D0 (en) * 1992-02-19 1992-04-08 Erba Carlo Spa Use of the conjugate between a fibroblast growth factor and a saporin in treating ocular pathologies
US5814605A (en) * 1993-03-26 1998-09-29 Amgen Inc. Therapeutic uses of keratinocyte growth factor
HU220641B1 (hu) * 1993-03-26 2002-03-28 Amgen Inc. Keratinocita növekedési faktor alkalmazása
AU681405B2 (en) * 1993-06-29 1997-08-28 Chiron Corporation A truncated keratinocyte growth factor (KGF) having increased biological activity
US7084119B2 (en) 1993-06-29 2006-08-01 Chiron Corporation Truncated keratinocyte growth factor (KGF) having increased biological activity
US6268212B1 (en) 1993-10-18 2001-07-31 Amgen Inc. Tissue specific transgene expression
HUT78069A (hu) * 1994-10-13 1999-08-30 Amgen Inc. Keratinocita növekedési faktor analógok
EP1334981B1 (en) * 1994-10-13 2011-01-26 Swedish Orphan Biovitrum AB (publ) Method for purifying keratinocyte growth factors
KR100278597B1 (ko) * 1994-10-13 2001-01-15 스티븐 엠. 오드리 케라티노사이트 성장 인자의 유사체, 이 유사체를 암호하는 핵산 및 그것의 제조방법
US6008328A (en) * 1994-10-13 1999-12-28 Amgen Inc. Method for purifying keratinocyte growth factors
US6818439B1 (en) 1994-12-30 2004-11-16 Chiron Corporation Methods for administration of recombinant gene delivery vehicles for treatment of hemophilia and other disorders
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6077692A (en) 1995-02-14 2000-06-20 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2
US6693077B1 (en) 1995-02-14 2004-02-17 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2
US7232667B2 (en) 1995-02-14 2007-06-19 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2 polynucleotides
EP1486565B1 (en) 1995-10-11 2007-11-21 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Combination of PDGF, KGF, IGF, and IGFBP for wound healing
US6692961B1 (en) 1996-10-11 2004-02-17 Invitrogen Corporation Defined systems for epithelial cell culture and use thereof
US6743422B1 (en) 1996-10-15 2004-06-01 Amgen, Inc. Keratinocyte growth factor-2 products
US20030144202A1 (en) * 1996-10-15 2003-07-31 Amgen Inc. Uses of keratinocyte growth factor-2
DE19716098A1 (de) * 1997-04-17 1998-10-22 Univ Ludwigs Albert Fibroblasten mit einem Fremdgen enthaltende Zusammensetzung zur Behandlung von Wunden
US6228839B1 (en) 1997-12-19 2001-05-08 Emory University Use of keratinocyte growth factor to improve oxidative status
US6869927B1 (en) 1997-12-22 2005-03-22 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2 formulations
NZ505324A (en) * 1997-12-22 2002-11-26 Human Genome Sciences Inc Liquid and lyophilised KGF-2 polypeptide formulations used to accelerate soft tissue growth or regeneration
AU762519B2 (en) * 1998-02-13 2003-06-26 Human Genome Sciences, Inc. Therapeutic uses of keratinocyte growth factor-2
US6335317B1 (en) 1998-04-10 2002-01-01 Emory University Use of gut-trophic growth factors to improve oxidative status
US7022683B1 (en) 1998-05-13 2006-04-04 Carrington Laboratories, Inc. Pharmacological compositions comprising pectins having high molecular weights and low degrees of methoxylation
US5929051A (en) * 1998-05-13 1999-07-27 Carrington Laboratories, Inc. Aloe pectins
US6313103B1 (en) 1998-05-13 2001-11-06 Carrington Laboratories, Inc. Pectic substance as a growth factor stabilizer
US6372494B1 (en) * 1999-05-14 2002-04-16 Advanced Tissue Sciences, Inc. Methods of making conditioned cell culture medium compositions
US6783546B2 (en) 1999-09-13 2004-08-31 Keraplast Technologies, Ltd. Implantable prosthetic or tissue expanding device
US6371984B1 (en) * 1999-09-13 2002-04-16 Keraplast Technologies, Ltd. Implantable prosthetic or tissue expanding device
US6376112B1 (en) 2000-02-11 2002-04-23 General Motors Corporation Controlled shutdown of a fuel cell
US6395414B1 (en) 2000-02-11 2002-05-28 General Motors Corporation Staged venting of fuel cell system during rapid shutdown
US6413662B1 (en) 2000-02-22 2002-07-02 General Motors Corporation Fuel cell system shutdown with anode pressure control
JP2001302691A (ja) * 2000-04-17 2001-10-31 Nichirei Corp ヒトｋｇｆに対する抗体
EP1357931A2 (en) * 2001-01-08 2003-11-05 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2
CA2438652A1 (en) 2001-02-19 2002-09-06 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Method for identification of t-cell epitopes and use for preparing molecules with reeduced immunogenicity
US7494669B2 (en) 2001-02-28 2009-02-24 Carrington Laboratories, Inc. Delivery of physiological agents with in-situ gels comprising anionic polysaccharides
WO2003016505A2 (en) * 2001-08-21 2003-02-27 Chiron Corporation Kgf polypeptide compositions
US7202066B2 (en) * 2002-01-29 2007-04-10 Carrington Laboratories, Inc. Combination of a growth factor and a protease enzyme
GB0206309D0 (en) * 2002-03-16 2002-05-01 Axordia Ltd Isolated cells
US20050074773A1 (en) * 2002-08-20 2005-04-07 Shimkets Richard A. Methods for diagnosing and treatment of conditions that alter phosphate transport in mammals
DK1827483T3 (da) 2004-12-15 2014-10-06 Swedish Orphan Biovitrum Ab Publ Terapeutiske formuleringer af keratinocyt-vækstfaktor
WO2008005533A2 (en) * 2006-07-06 2008-01-10 Aaron Thomas Tabor Compositions and methods for genetic modification of cells having cosmetic function to enhance cosmetic appearance
EP2125878B1 (en) * 2007-01-05 2013-02-20 Helix Biomedix, Inc. Short bio-active peptides for cellular and immunological modulation
CN102471769A (zh) 2009-07-17 2012-05-23 亚伦·T.·塔波尔 用于具有美容功能的细胞的遗传修饰以提高美容外观的方法和组合物
WO2013149258A2 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Charles Drew University of Medicine and Science Compositions and methods for treating or preventing metabolic syndrome disorders
KR102277147B1 (ko) * 2017-12-13 2021-07-13 건국대학교 산학협력단 섬유아 성장인자 유래 펩타이드의 골 또는 연골 분화 촉진 용도

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5096825A (en) * 1983-01-12 1992-03-17 Chiron Corporation Gene for human epidermal growth factor and synthesis and expression thereof
US4444760A (en) * 1983-06-17 1984-04-24 Merck & Co., Inc. Purification and characterization of a protein fibroblast growth factor
US4473679A (en) 1983-12-12 1984-09-25 Borg-Warner Chemicals, Inc. Thermoplastic acrylic elastomers
US4743679A (en) * 1986-02-24 1988-05-10 Creative Biomolecules, Inc. Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof
US4868113A (en) 1986-03-03 1989-09-19 Rorer Biotechnology, Inc. Recombinant DNA vector encoding human endothelial cell growth factor
US4983679A (en) 1986-05-29 1991-01-08 E. I. Dupont De Nemours And Company β-(keto or sulfonyl)esters from reaction of silylketene acetal and acyl or sulfonyl compound
AU617795B2 (en) 1988-03-17 1991-12-05 Leukotech A/S Heparin-binding proteins, dna coding for them, processes for producing them as well as therapeutic preparations containing them
DE69033668T2 (de) 1989-01-31 2001-04-12 Jeffrey S Rubin Dns kodierend für einen für epithelzellen spezifischen wachstumsfaktor
AU681405B2 (en) * 1993-06-29 1997-08-28 Chiron Corporation A truncated keratinocyte growth factor (KGF) having increased biological activity
KR100278597B1 (ko) 1994-10-13 2001-01-15 스티븐 엠. 오드리 케라티노사이트 성장 인자의 유사체, 이 유사체를 암호하는 핵산 및 그것의 제조방법

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MACIAG T. ET AL.: "Heparin binds endothelial cell growth factor, the principal endothelial cell mitogen in bovine brain", PROC NATL ACAD SCI U S A., 1984, pages 932 - 935
MACIAG T. ET AL.: "Heparin binds endothelial cell growth factor, the principal endothelial cell mitogen in bovine brain", SCIENCE, 1984, pages 932 - 935
RAINES EW, ROSS R.: "Platelet-derived growth factor. I. High yield purification and evidence for multiple forms.", J BIOL CHEM., 1982
U. K. LAEMMLI: "Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4", NATURE, 1970, pages 680 - 685, XP055108426, DOI: doi:10.1038/227680a0
WRIGHT N. AND ALLISON M.: "The Biology of Epitelial Cell Populations", pages: 3 - 5

Also Published As

Publication number Publication date
JPH08277227A (ja) 1996-10-22
IE20020188A1 (en) 2002-06-26
FI114711B (fi) 2004-12-15
JP3802292B2 (ja) 2006-07-26
US6709842B1 (en) 2004-03-23
AU647732B2 (en) 1994-03-31
JP2716416B2 (ja) 1998-02-18
JPH10243800A (ja) 1998-09-14
LU91237I2 (fr) 2007-02-22
EP1016716A2 (en) 2000-07-05
AU6598694A (en) 1994-09-08
JP3802329B2 (ja) 2006-07-26
LV10284A (lv) 1994-10-20
FI913637A0 (fi) 1991-07-30
DE69033668T2 (de) 2001-04-12
HUT58759A (en) 1992-03-30
RU2250213C2 (ru) 2005-04-20
DK0555205T3 (da) 2001-03-05
US5741642A (en) 1998-04-21
DE69033668D1 (de) 2001-01-04
US5654405A (en) 1997-08-05
AU684278B2 (en) 1997-12-11
DE122006000021I1 (de) 2006-07-13
KR950012805B1 (en) 1995-10-21
ES2153816T3 (es) 2001-03-16
EP0555205A1 (en) 1993-08-18
EP0555205A4 (en) 1992-06-02
KR910700257A (ko) 1991-03-14
JPH04504415A (ja) 1992-08-06
NL300230I2 (nl) 2006-09-01
LTIP667A (en) 1995-01-31
SG46699A1 (en) 1998-02-20
ATE197800T1 (de) 2000-12-15
NO972259D0 (no) 1997-05-16
JP3088983B2 (ja) 2000-09-18
US6420531B1 (en) 2002-07-16
WO1990008771A1 (en) 1990-08-09
NO308312B1 (no) 2000-08-28
US5665870A (en) 1997-09-09
LV10284B (en) 1995-04-20
US5731170A (en) 1998-03-24
US5707805A (en) 1998-01-13
GEP20022681B (en) 2002-04-25
JP2006149407A (ja) 2006-06-15
JP3298874B2 (ja) 2002-07-08
EP0555205B1 (en) 2000-11-29
AU5049690A (en) 1990-08-24
NO972617L (no) 1997-06-06
CA2349875A1 (en) 1992-09-16
CA2349875C (en) 2010-02-09
US6833132B1 (en) 2004-12-21
HU218090B (hu) 2000-05-28
EP1016716A3 (en) 2000-07-12
NO972617D0 (no) 1997-06-06
CA2038398A1 (en) 1992-09-16
NL300230I1 (nl) 2006-07-03
CA2038398C (en) 2002-01-22
NO308310B1 (no) 2000-08-28
JP2000102396A (ja) 2000-04-11
NO972259L (no) 1997-05-16
JP2001157594A (ja) 2001-06-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
LT3472B (en) Dna encoding a growth factor specific for epithelial cells
CA2263890C (en) Recombinant vascular endothelial cell growth factor d (vegf-d)
AU623109B2 (en) Amphiregulin: a novel bifunctional growth modulating glycoprotein
US7026291B1 (en) Epithelial cell specific growth factor, keratinocyte growth factor (KGF)
IE83398B1 (en) DNA encoding a growth factor specific for epithelial cells
NO308309B1 (no) FremgangsmÕte for fremstilling av et hovedsaklig rent keratinocyttvekstfaktor (KGF) protein

Legal Events

Date Code Title Description
MK9A Expiry of a patent

Effective date: 20130621