HUT78069A

HUT78069A - Keratinocita növekedési faktor analógok

Info

Publication number: HUT78069A
Application number: HU9901325A
Authority: HU
Inventors: Tsutomu Arakawa; Bao-Lu Chen
Original assignee: Amgen Inc.
Priority date: 1994-10-13
Filing date: 1995-10-12
Publication date: 1999-08-30
Also published as: ATE237634T1; WO1996011951A2; WO1996011951A3; MX9702665A; JP2000511762A; EP0785950A2; ES2196088T3; CA2202390A1; DK0785950T3; DE69530404T2; SI0785950T1; NO971621L; EP0785950B1; JP2007020575A; NO971621D0; PT785950E; AU3893195A; JP4422210B2; DE69530404D1; CA2202390C

Description

A jelen találmány tárgyát rekombináns DNS technológia és protein engineering képezi. Pontosabban, rekombináns DNS technológiát alkalmazunk a keratinocita növekedési faktor (KGF), amely egy a nem-fibroblaszt epiteliális sejtnövekedésnek egy potens mitogénje, polipeptid analógjainak előállítására, amely analógok a kiindulási KGF-hez viszonyítva fokozott stabilitással rendelkeznek.

A szövetgenerálás és regenerálás komplex folyamatát számos fehérjefaktor befolyásolja, amelyeket lágyszövet növekedési faktoroknak neveznek. Ezeket a molekulákat általában egy sejttípus bocsátja ki, és úgy működnek, hogy befolyásolják más sejttípusok szaporodását [Rubin és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86, 802-806 (1989)] . Néhány lágyszövet növekedési faktort bizonyos sejttípusok bocsátanak ki, és befolyásolják a többsejtes szervezetek érésében szerepet játszó reagáló sejtek szaporodását, differenciálódását és/vagy érését [ Finch és mtsai: Science 245, 752-755 (1989)] . A fejlődő szervezetekben játszott szerepük mellett néhányan fontosak az érettebb rendszerek folyamatos egészségében és fenntartásában. Például az emlősökben számos olyan rendszer van, ahol a sejtekben gyors anyagcsere játszódik le. Ilyen rendszer például a bőr és az emésztőrendszer, amelyek mind epiteliális sejteket tartalmaznak. A lágyszövet növekedési faktoroknak ebbe a csoportjába tartozik a fibroblaszt növekedési faktorok (FGF-ek) egy fehérjecsaládja.

Jelenleg nyolc ismert tagja van az FGF családnak, amelyeknek a primer szerkezete rokonságot mutat: bázikus fíbroblaszt növekedési faktor, bFGF [Abraham és mtsai: EMBO J. 5_, 2523-2528 (1986)]; savas fibroblaszt növekedési faktor, aFGF [ Jaye és mtsai: Science 233, 541-545 (1986)] ; int-2 géntermék, ínt-2 [ Dickson és Peters: Natúré 326, 833 (1987)] ; hst/KGF [Delli-Bovi és mtsai: Cell 50, 729-737 (1987); Yoshida és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 84, 7305-7309 (1987)]; FGF-5 [Zhan és mtsai: Mól. Cell. Biology 8,

3487-3495 (1988)] ; FGF-β [ Marics és mtsai: Oncogene 4_, 335-340 (1989)]; keratinocita növekedési faktor [Finch és mtsai:

Science 24, 752-755 (1989)] ; és a hisactophilin [ Habazzettl és mtsai: Natúré 359, 855-858 (1992)] .

A fehérjék FGF családjában a keratinocita növekedési faktor (KGF) egy különleges effektora a mesenchyma szövetekből származó, nem-fibroblaszt epiteliális (különösen keratinocita) sejtszaporodásnak. A természetes KGF szakkifejezés jelentése egy természetes humán (hKGF) vagy rekombináns (rKGF) polipeptid (szignálszekvenciával vagy anélkül·), amit a 2. számú szekvencián bemutatott aminosav szekvencia jellemez, vagy annak egy alléi variánsa. (Hacsak külön nem jelezzük, akkor a leírásban ismertetett molekuláknál az aminosavak számozása megfelel a természetes molekula érett formájának (azaz mínusz a szignálszekvencia), amit a 2. számú szekvencián a 32-194-es aminosavakkal lehet leírni.

A természetes KGF-et természetes humán forrásokból lehet izolálni (hKGF), vagy rekombináns DNS technikákkal lehet előállítani (rKGF) [ Finch és mtsai: Science 245, 752-755 (1989);

Rubin és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 8 6, 802-806 (1989); Ron és mtsai: Journal of

Biological Chemistry 268 (4), 2984-2988 (1993); Yan és mtsai: In vitro Cell. Dev. Bioi. 27A, 437-438 (1991)] .

Az közismert, hogy a természetes KGF viszonylag instabil vizes közegben, és kémiai valamint fizikai lebomláson megy át, ami a biológiai aktivitás elvesztését eredményezi a processzálás és tárolás során [Chen és mtsai: Pharmaceutical

Research 11, 1582-1589 (1994) ] . A természetes KGF hajlamos az aggregációra magasabb hőmérsékleten, és inaktiválódik savas körülmények között [Rubin és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86, 802-806 (1989)] . A természetes KGF vizes oldatban való aggregálódása szintén inaktivált fehérjét eredményez. Ez azért előnytelen, mivel az aktivitás elvesztése gyakorlatilag értelmetlenné teszi a természetes KGF fehérjék vizes készítményeinek hosszú ideig való tárolását, vagy a fehérje hosszabb ideig tartó beadását. Emellett az különösen problematikus, ha gyógyászati készítményeket készítünk, mivel az aggregálódott fehérjékről ismertté vált, hogy immunogének [ Cleland és mtsai: Crit. Rév. Therapeutic Drug Carrier Systems 10, 307-377 (1993); Robbins és mtsai: Diabetes 36, 838-845 (1987); Pínckard és mtsai: Clin. Exp. Immunoi. 2, 331-340 (1967)] .

Rekombináns DNS technológiát alkalmaznak az FGF család különböző tagjai szekvenciájának módosítására. Az aFGF-et és a bFGF-et például úgy módosították, hogy helyettesítették vagy kivágták a pozitívan töltött csoportokat, amelyek lényegesek a heparinkötéshez, a heparínon levő semleges vagy negatívan töltött aminosavakhoz való kapcsolódás révén. Leírták, hogy a módosított molekulák csökkent heparinkötő aktivitást eredményeztek. Ezért azt a következtetést vonták le, hogy a heparin vagy heparin-szerű molekulák által a beteg szervezetéből kivont módosított molekulák mennyisége csökkenni fog, ezzel megnő a hatékonyságuk, mivel több FGF éri el a megcélzott receptorát (EP 0 298 723) .

»·· ···♦

Ahhoz, hogy megpróbáljuk a természetes KGF egy vagy több jellemzőjének a megjavítását vagy másképpen való megváltoztatását, protein engineeringet alkalmazunk. A rekombináns DNS technológiát alkalmaztuk a természetes KGF szekvenciáinak módosítására. Ron és munkatársai leírtak módosított KGF polipeptideket, amelyeknek az N-terminálisáról 3, 8, 27 vagy 49 aminosavat kivágtak [Ron és mtsai: Journal of Biological Chemistry 268 (4) , 2984-2988 (1993.)] . Azok a fehérjék, amelyekről 3, 8 vagy 27 aminosav hiányzott, megtartották a heparinkötő képességüket, a többiek nem. Emellett azokról a peptidekről, amelyekről 3 és 8 aminosav hiányzott, leírták, hogy teljesen aktívak maradtak, míg az a forma, amelyikről 27 csoport hiányzott, 10-20-szor volt kevésbé mitogén, és az a forma, amelyről 38 vagy 49 aminosav hiányzott, egyáltalán nem rendelkezett mitogén aktivitással. A módosított KGF polipeptid stabilitását nem tárgyalták, illetve más módon sem közölték.

A publikált 90/08771 számú PCT bejelentésben is leírták, hogy kiméra fehérje keletkezik, amikor a természetes KGF érett formája első 40 N-terminális aminosavát kombinálták az aFGF Cterminális részével (körülbelül 140 aminosav). A kiméráról leírták, hogy a KGF-hez hasonlóan a keratinocitákat célozza meg, de nincs meg a heparin-érzékenysége, ami jellemző az aFGFre, de nem jellemző a KGF-re. A kiméra stabilitását nem tárgyalták, illetve más módon sem közölték.

Tehát a szakirodalomban nem írtak le olyan módosított KGF molekulát, amelynek jelentősen fokozott stabilitása van a természetes KGF-hez viszonyítva. Emellett a szakirodalomban nem ,> * közöltek elegendő információt vagy bizonyítékot arra, hogy ésszerűen várható legyen olyan KGF molekulák generálása, amelyek ezekkel a kívánatos jellemzőkkel rendelkeznek.

Jelenleg nem lehetséges egy fehérje tulajdonságainak megjósolása, ha csak a primer szerkezetét ismerjük. Például az aFGF mitogén aktivitása jelentősen megnő heparin jelenlétében, de a bFGF mitogén aktivitása heparin jelenlétében csak minimális mennyiségben nő meg, annak ellenére, hogy a heparin erősen kötődik a bFGF-hez [ Burgess és Maciag: Annu. Rév. Biochem. 58, 575-606 (1989); Schreiber és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 82, 6138-6142 (1985); Gospodarowicz és Cheng: J. Cell Physiol. 128, 475-485 (1986); PCT 90/00418] . Ezzel szemben a BALB/MK sejtek timidin beépítése gátlódik, ha a KGF mellett heparint is teszünk a tenyésztő közegbe.

Általában bármilyen aminosav-cserének a fehérje biológiai aktivitására gyakorolt hatása számos faktortól függ, beleértve a fehérje háromdimenziós szerkezetét, valamint attól, hogy a módosítások a fehérje elsődleges szerkezetében a receptorkötésért felelős régióban játszódnak le. Mivel a természetes KGF-nek sem a háromdimenziós szerkezetét, sem a primer szerkezet receptorkötésért felelős régióját nem közölték, ezért a szakirodalomban található ismeret nem teszi lehetővé az aminosav-cseréknek a természetes KGF-re gyakorolt hatásának általánosítását, az aminosav-módosításoknak az általánosan jellemzett fehérjékre gyakorolt hatása alapján.

A jelen találmány tárgyát polipeptid molekuláknak olyan analógjai képezik, amelyek fokozott stabilitással rendelkeznek (azaz ha tipikus pH-η, hőmérsékleti és/vagy tárolási körülmények között tartják) a természetes KGF-hez viszonyítva.

A jelen találmány tárgyát a KGF új, biológiailag aktív analógjai képezik. A jelen találmány szempontjából a KGF szakkifejezés jelentése lehet a természetes KGF, valamint egy olyan peptid-szekvenciával rendelkező fehérje, amely lényegében megegyezik a természetes KGF peptid-szekvenciájával, amely megtartja a természetes KGF biológiai aktivitását, vagy annak egy részét, különösen a fibroblaszt epiteliális sejtszaporodást. Az egy olyan peptid-szekvenciával rendelkező fehérje, amely lényegében megegyezik a természetes KGF peptidszekvenciájával szakkifejezés alatt egy olyan peptid-szekvenciát értünk, amely megtartja a 2. számú szekvencia Arg⁴¹, Gin⁴³,

T 55 _T 95 _T 128 - 137 „, 138 _T „139 - „144 _T ,„147 „.152

Lys , Lys , Lys , Asn , Gin , Lys , Arg , Lys , Gin ,

Lys¹⁵³ és Thr¹⁵⁴ csoportjainak megfelelő csoportokat, és amit egy olyan DNS szekvencia kódol, amely képes az 1. számú szekvencia 201-684-es nukleotidjai között levő szekvenciával hibridizálódni, előnyösen szigorú hibridizálási körülmények között.

Két aminosav szekvencia között a megfelelő aminosav pozíciót úgy határozhatjuk meg, hogy a két szekvenciát úgy illesztjük egymáshoz, hogy maximalizáljuk az illeszkedéseket, beleértve az N-terminális és/vagy a C-terminális eltolását, ha szükséges, akkor lukak bevitelét és/vagy a jelölt molekulában inszertként jelenlevő csoportok kivágását. Adatbázis kutatások, szekvencia-elemzések és manipulációk végezhetők az egyik jól • · .; · • ·· ····· • ···· · · ···· ···

.........

► ismert szekvencia-homológia/azonosság pásztázó algoritmus programmal [ Pearson és Lipman: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 85, 2444-2448 (1988) ; Altschul és mtsai: J.Mol.Bíol. 215, 403-410 (1990); Lipman és Pearson:

Science 222, 1435 (1985); Devereux és mtsai: Nucleic Acids

Research 12, 387-395 (1984)] .

A hibridizáció összefüggésében a szigorú körülmények a sókoncentráció, a szerves oldószerek és egyéb paraméterek szigorú, kombinált körülményei, amiket általában a hibridizációs reakciókban szabályoznak. A szigorú hibridizációs körülményekre egy példa lehet a következő: hibridizáció 4 x SSC-ben 62-67 °C-on, ezt követi a mosás 0,1 x SSC-ben 62-67 °C-on, körülbelül egy óra hosszat. Egy másik változat a szigorú hibridizációs körülményekre a hibridizáció 45-55 % formamid, 4 x

SSC-ben 40-45 °C-on [Sambrook és mtsai: Molecular Cloning: A

Laboratory Manual, 387-389. old.; Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)] .

Tehát a fehérjék közé tartoznak az allél-variációk vagy aminosav deléció(k), helyettesítés(ek), vagy inszerciók, beleértve a természetes KGF fragmenseit, kiméra vagy hibrid molekulákat. A KGF-re példák lehetnek azok a fehérjék, amelyekben a 2. számú szekvencia Cys¹ és Cys¹⁵ csoportjait helyettesítettük vagy kivágtuk, és a kapott molekulának megnőtt a kiindulási molekulához viszonyított stabilitása (lásd az 1995. július 7-én benyújtott 08/487,825 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentést). A leírt molekulák a következők:

C (1,15)S, azaz egy olyan KGF, amelyben az 1-es és 15-ös pozí• · · • · · · · « cióban levő ciszteincsoportot szerinnel helyettesítjük; ΔΝ15ΔΝ24, azaz az olyan KGF-ek, amelyekből a természetes KGF Nterminálisának első 15-24 aminosavából valamelyik aminosavat kivágtuk; AN3/C(15)S, azaz egy olyan KGF, amelyből a természetes KGF N-terminálisának első 3 aminosavát kivágtuk, majd a 15ös pozícióban levő ciszteint szerinre cseréltük; ΔΝ3/Ο(15)-, azaz egy olyan KGF, amelyből a természetes KGF N-terminálisának első 3 aminosavát kivágtuk, és a 15-ös pozícióban levő ciszteint is kivágtuk; AN8/C(15)S, azaz egy olyan KGF, amelyből a természetes KGF N-terminálisának első 8 aminosavát kivágtuk, majd a 15-ös pozícióban levő ciszteint szerinre cseréltük; ΔΝ8/Ο(15)-, azaz egy olyan KGF, amelyből a természetes KGF Nterminálisának első 8 aminosavát kivágtuk, és a 15-ös pozícióban levő ciszteint is kivágtuk; C (1,15,40)S, azaz egy olyan KGF, amelyből a természetes KGF-nek az 1-es, 15-ös és 40-es pozícióban levő ciszteint szerinre cseréltük; C(1,15,102)S, azaz egy olyan KGF, amelyből a természetes KGF-nek az 1-es, 15ös és 102-es pozícióban levő ciszteint szerinre cseréltük;

C(1, 15,106)S, azaz egy olyan KGF, amelyből a természetes KGFnek az 1-es, 15-ös és 106-os pozícióban levő ciszteint szerinre cseréltük.

Egyéb KGF analógok lehetnek például azok a fehérjék, amelyeket úgy állítunk elő, hogy legalább egy, magasabb hurokképző képességgel rendelkező aminosavval helyettesítünk egy aminosavat a természetes KGF Asn¹¹⁵-His¹¹⁶-Tyr¹¹⁷-Asn¹¹⁸-Thr¹¹⁹hurokképző régiójában (lásd az 1994. október 13-án benyújtott, • · ► ’ 10

08/323,473 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentést), és feltétlenül ide tartozik a H(116)G, azaz egy olyan KGF analóg, amelyben a természetes KGF 116-os pozíciójában levő hisztidint glicinre cseréltük.

A találmány tárgyát képezik továbbá azok a fehérjék, amelyekben a természetes KGF 123-133-as régiójában (azaz a 2. számú szekvencia 154-164-es aminosavai) egy vagy több aminosavat helyettesítettünk, kivágtunk vagy beszúrtunk; ezeknek a fehérjéknek agonista vagy antagonista aktivitásuk lehet.

Meglepő felfedezésünk volt, hogy ha egy KGF molekulában (azaz a kiindulási molekulában) a semleges vagy negatív töltésű aminosavakat pozitívabban töltött csoportokra cseréljük (azaz a negatív töltésű csoportokat semleges vagy pozitív töltésű csoportra cseréljük, vagy a semleges csoportokat pozitív töltésű csoportokra cseréljük), akkor a kapott KGF analógnak megnő a kiindulási molekulához viszonyított stabilitása. Előnyösen, amellett, hogy megnőtt a stabilitásuk, a találmány tárgyát képezik azok az analógok, amelyek szintén teljes biológiai aktivitással rendelkeznek (azaz legalább lényegében hasonló receptorkötéssel vagy affinitással), a természetes KGF-fel összehasonlítva .

A találmány tárgyát képezik továbbá a KGF különböző biológiailag aktív polipeptid analógjait kódoló tisztított és izolált nukleinsav molekulák. Az egyik megvalósítási mód szerint ezek a nukleinsav molekulák biológiailag működőképes plazmid vagy virális vektorokba klónozott DNS molekulákat tartalmaznak. Egy másik megvalósítási mód szerint a nukleinsav • · · · · · ·· • ···» · · ·♦·· *·· ··»· · ·· ♦ · konstrukciókat arra használhatjuk, hogy stabilan transzformáljunk velük egy prokarióta vagy eukarióta gazdasejtet. Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás, amelyben egy nukleinsav molekulával stabilan transzformált prokarióta (előnyösen Escheríchia coli) vagy egy eukarióta gazdasejtet növesztünk megfelelő tápláló körülmények között, olyan módon, hogy az lehetővé tegye a KGF analóg expresszióját.

Az expresszió után a kapott rekombináns polipeptidet izolálhatjuk és tisztíthatjuk.

A találmány tárgyát képezik továbbá azok a gyógyászati készítmények, amelyek egy KGF analógból terápiásán hatékony mennyiséget valamint egy elfogadható gyógyászati hordozót tartalmaznak. Ezek a készítmények jól használhatók epiteliális betegségekben és sérülésekben szenvedő betegek kezelésére.

A találmány tárgyát képezik továbbá az epiteliális sejtnövekedést serkentő módszerek, amelyek során egy betegnek egy KGF analógból terápiásán hatékony mennyiséget adunk be. Az egyik megvalósítási mód szerint a nem-fibroblaszt epiteliális sejtek azok a sejtek, amelyeknek a szaporodását serkentjük. Ilyen epiteliális sejtek lehetnek a különböző adnexálís sejtek, hasnyálmirigy sejtek, májsejtek és a nyálkahártya epitélium a légző- és gasztrointesztinális rendszerben.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.

Az 1. ábrán a természetes KGF nukleotid (1. számú szekvencia) és aminosav (2. számú szekvencia) szekvenciája látható (a természetes KGF érett formáját kódoló nukleotidokat az 1. számú ·

·« · · ··*· b * · « · · β » ·»« » • · * szekvencia 201-684-es bázisai mutatják, és a KGF érett formáját a 2. számú szekvencia 32-192-es aminosav csoportjai mutatják).

A 2A., 2B. és 2C. ábrákon a pCFM1156, pCFMl656 és pCFM3102 plazmidok térképei láthatók.

A 3. ábrán az RSH-KGF konstrukció nukleotid (3. számú szekvencia) és aminosav (4. számú szekvencia) szekvenciáját láthatjuk.

A 4. ábrán a KGF plazmádban levő konstrukció nukleotid (5. számú szekvencia) és aminosav (6. számú szekvencia) szekvenciáját mutatja.

Az 5. ábrán a kémiai úton szintetizált oligonukleotidok láthatók (6. számú oligonukleotidtól a 11. számú oligonukleotidig, azaz a 12-17. számú szekvenciák), amiket arra lehet használni, hogy a KGF plazmidban levő konstrukció Kpnl és EcoRI hasítási helye között levő DNS szekvenciát (a 6. számú szekvencia 46-85-ös aminosav pozíciói között) helyettesítsük, ezzel előállítva a KGF (dsd) plazmidban levő konstrukciót.

A 6. ábrán a kémiai úton szintetizált oligonukleotidok láthatók (a 12. számú oligonukleotidtól a 24. számú oligonukleotidig; azaz 18-30. számú szekvenciák), amiket a KGF készítéséhez használunk (kodonokra optimalizálva).

A 7. ábrán az R(144)Q, egy olyan KGF analóg, amelyben a természetes KGF 144-es aminosav pozíciójában levő arginínt glutaminnal helyettesítjük, nukleotid (31. számú szekvencia) és aminosav (32. számú szekvencia) szekvenciája látható.

A 8. ábrán a C(1,15)S/R(144)E, azaz egy olyan KGF analóg, amelyben a természetes KGF 15-ös aminosav pozíciójában levő <* * «·· ciszteint szerinre cseréltük, a 144-es aminosav pozíciójában levő arginint glutaminsavval helyettesítettük nukleotid (33.

számú szekvencia) és aminosav (34. számú szekvencia) szekvenciáját mutatjuk be.

A 9. ábrán a C(1,15)S/R(144)Q, azaz egy olyan KGF analóg, amelyben a természetes KGF 15-ös aminosav pozíciójában levő ciszteint szerinre cseréltük, a 144-es aminosav pozíciójában levő arginint glutaminnal helyettesítettük nukleotid (35. számú szekvencia) és aminosav (36. számú szekvencia) szekvenciáját mutatjuk be.

A 10. ábrán a ÁN23/R(144)Q, azaz egy olyan KGF analóg, amelyből a természetes KGF N-terminálisa első 23 aminosavát kivágtuk, és a 144-es aminosav pozíciójában levő arginint glutamin cseréltük, nukleotid (37. számú szekvencia) és aminosav (38. számú szekvencia) szekvenciáját mutatjuk be.

A 11. ábrán a megmaradó oldódó fehérje mennyisége látható, méretkizárásos HPLC-vel meghatározva, a 37 °C-on végzett inkubálás idejének függvényében ábrázolva.

A 12. ábrán a becsült olvadáspont hőmérséklet (T_m) látható, a pH függvényében, a természetes KGF, a C(1,15)S/R(144)Q és a C(1,15)S/R(144)E esetében.

A 13. ábrán a R(144)Q mitogén aktivitásának tipikus profilját láthatjuk, amit úgy mérhetünk meg, hogy mérjük a [³H] -timidin beépülését a DNS szintézis során, a természetes KGF-fel kapott standard görbével összehasonlítva.

A 14. ábrán a AN23/R(144)Q mitogén aktivitásának tipikus profilját láthatjuk, amit úgy mérhetünk meg, hogy mérjük a ··«« 9

9999 9999 [³H]-timidin beépülését a DNS szintézis során, a természetes KGF-fel kapott standard görbével összehasonlítva.

A 15. ábrán a C(1,15)S/R(144)Q mitogén aktivitásának tipikus profilját láthatjuk, amit úgy mérhetünk meg, hogy mérjük a [ ³HJ -timidin beépülését a DNS szintézis során, a természetes KGF-fel kapott standard görbével összehasonlítva.

A 16. ábrán a C(1,15)S/R(144)E mitogén aktivitásának tipikus profilját láthatjuk, amit úgy mérhetünk meg, hogy mérjük a [³H] -timidin beépülését a DNS szintézis során, a természetes KGF-fel kapott standard görbével összehasonlítva.

A 17. ábrán a ΔΝ23/Ν(137)E, azaz egy olyan KGF analóg, amelyből az N-terminális első 23 aminosavát kivágtuk, és amelyben a természetes KGF 137-es pozíciójában levő aszparagint glutaminra cseréltük, nukleotid (41. számú szekvencia) és aminosav (42. számú szekvencia) szekvenciáit látjuk.

A 18. ábrán a ΔΝ23/Κ(139)E, azaz egy olyan KGF analóg, amelyből az N-terminális első 23 aminosavát kivágtuk, és amelyben a természetes KGF 139-es pozíciójában levő lizint glutaminsavra cseréljük, nukleotid (43. számú szekvencia) és aminosav (44. számú szekvencia) szekvenciáit látjuk.

A 19. ábrán a ΔΝ23/Κ(139)Q, azaz egy olyan KGF analóg, amelyből az N-terminális első 23 aminosavát kivágtuk, és amelyben a természetes KGF 139-es pozíciójában levő lizint glutaminra cseréljük, nukleotid (45. számú szekvencia) és aminosav (46. számú szekvencia) szekvenciáit látjuk.

A 20. ábrán a ΔΝ23/Ε(144)A, azaz egy olyan KGF analóg, amelyből az N-terminális első 23 aminosavát kivágjuk, és • · • · · · , 15 fe* amelyben a természetes KGF 144-es pozíciójában levő arginint alaninra cseréljük, nukleotid (47. számú szekvencia) és aminosav (48. számú szekvencia) szekvenciáit látjuk.

A 21. ábrán a AN23/R(144)L, azaz egy olyan KGF analóg, amelyből az N-terminális első 23 aminosavát kivágtuk, és amelyben a természetes KGF 144-es pozíciójában levő arginint leucinra cseréljük, nukleotid (49. számú szekvencia) és aminosav (50. számú szekvencia) szekvenciáit látjuk.

A 22. ábrán a ΔΝ23/Κ (147)E, azaz egy olyan KGF analóg, amelyből az N-terminális első 23 aminosavát kivágtuk, és amelyben a természetes KGF 147-es pozíciójában levő lizint glutaminsavra cseréljük, nukleotid (51. számú szekvencia) és aminosav (52. számú szekvencia) szekvenciáit látjuk.

A 23. ábrán a ΔΝ23/Κ(147)Q, azaz egy olyan KGF analóg, amelyből az N-terminális első 23 aminosavát kivágtuk, és amelyben a természetes KGF 147-es pozíciójában levő lizint glutaminra cseréljük, nukleotid (53. számú szekvencia) és aminosav (54. számú szekvencia) szekvenciáit látjuk.

A 24. ábrán a ΔΝ23/Κ(147)E, azaz egy olyan KGF analóg, amelyből az N-terminális első 23 aminosavát kivágtuk, és amelyben a természetes KGF 147-es pozíciójában levő lizint glutaminsavra cseréljük, nukleotid (55. számú szekvencia) és aminosav (56. számú szekvencia) szekvenciáit látjuk.

A 25. ábrán a ΔΝ23/Κ(153)Q, azaz egy olyan KGF analóg, amelyből az N-terminális első 23 aminosavát kivágtuk, és amelyben a természetes KGF 153-as pozíciójában levő lizint glu16

.... · · ··;· ··;·

......

taminra cseréljük, nukleotid (57. számú szekvencia) és aminosav (58. számú szekvencia) szekvenciáit látjuk.

A 26. ábrán a ΔΝ23/Κ(153)E, azaz egy olyan KGF analóg, amelyből az N-terminális első 23 aminosavát kivágtuk, és amelyben a természetes KGF 153-as pozíciójában levő lizint glutaminsavra cseréljük, nukleotid (59. számú szekvencia) és aminosav (60. számú szekvencia) szekvenciáit látjuk.

A jelen találmány tárgyát új KGF analógok képezik. A KGF analógokat úgy állítjuk elő, hogy egy vagy több specifikus, pozitívan töltött csoportot eltávolítunk a KGF-ből, vagy mással helyettesítünk.

A KGF analógok, egyéb tulajdonságaik mellett fokozott stabilitással rendelkeznek a számos különböző tisztítási és/vagy tárolási körülmény között legalább egynél. Például a KGF analógokat általában nagyobb kitermeléssel lehet tisztítani oldható, megfelelő térszerkezetű fehérje formájában. Emellett, ha az anyagot egyszer már tisztítottuk, akkor stabilabb lesz a pH, a hőmérséklet, stb. változásokra, a kiindulási molekulával összehasonlítva. Amint az alább következő Példák részben ismertetjük (a 144-es pozícióban levő arginint glutamínnal vagy glutaminsavval helyettesítve [R(144)Q és R(144)E] , néhány esetben az N-terminálison is módosítva), a természetes KGF-fel összehasonlítva (1) 35-37,2 nappal megnő a tárolási felezési idő 37 °C-on, (2) 7,5-9,5%-kal magasabb az olvadáspont a természetes térszerkezet hőmérsékletemelkedés hatására történő elvesztésénél, és (3) egy pH-tartományban megnő a T_m érték.

Jóllehet nem kötődünk elméletekhez, az R(144)Q és az R(144)E fokozott stabilitásának valószínűleg az az oka, hogy bázikus csoportok egy csoportjának csökken a töltéssűrűsége, ami heparin távollétében a szerkezetéből következően instabil, a töltéstaszítás miatt. Az alább ismertetett eredmények azt sugallják, hogy a 144-es pozícióban levő arginin egy bFGF-ben levő csoportnak felel meg, Röntgen-krisztallográfiás meghatározás alapján, amiről azt közölték, hogy bázikus csoportok között vagy közelében található, amelyek befolyásolják a heparin-kötődést [ Ago és mtsai: Journal of Biochemistry 110, 360-363 (1991); Eriksson és mtsai: Protein Science 2, 1274-1284 (1993)] .

A természetes KGF 46 töltött csoportot tartalmaz, amelyek közül 27-nek van pozitív töltése. A KGF analógokkal kapott eredmények fényében a természetes KGF primer szekvenciájának összehasonlítása a bFGF primer szekvenciájával azt sugallja, hogy a 27 pozitív töltésű csoport közül néhány egy ahhoz hasonló tömörülést alkot, mint ami a bFGF tercier struktúrájában található. Az ilyen csoportoknak a fehérje háromdimenziós szerkezetében való elhelyezkedésétől függően, ezeknek a tömörülő csoportoknak egy vagy több negatív töltésű vagy semleges aminosavval való helyettesítése megváltoztathatja a szomszédos csoportok elektrosztatikus kölcsönhatásait, és így jól használható lehet arra, hogy fokozott stabilitást érjünk el.

Tehát az alábbiakban ismertetett R(144)Q analóg mellett egyéb analógokat is megfontolás tárgyává teszünk a talál··· · · • · • · · mányban. A továbbiakban a KGF analóg vagy a KGP polipeptid analógja szakkifejezés töltésükben megváltoztatott polipeptideket jelent, amelyekből a 41-154-es aminosavakat (a 2. számú szekvencia 72-185-ös aminosavai), különösen beleértve a 123133-as aminosavakat (a 2. számú szekvencia 154-164-es aminosavait) kivágjuk vagy helyettesítjük egy semleges csoporttal vagy negatívan töltött csoporttal, amiket úgy választunk meg, hogy a fehérjének csökkentsük a pozitív töltését. A módo_zz 41 sításhoz előnyben részesített csoportok a következők: Arg , Gin , Lys , Lys , Lys , Asn , Gin , Lys , Arg , Lys , Gin¹⁵², Lys¹⁵³ és Thr¹⁵⁴, amelyek közül előnyben részesítjük a Gin¹³⁸, Lys¹³⁹, Arg¹⁴⁴, Lys¹⁴⁷, Gin¹⁵² vagy Lys¹⁵³-as csoportokat, és ezek közül az Arg¹⁴⁴-et részesítjük leginkább előnyben. A helyettesítéshez előnyben részesített csoportok közé tartozik a glutamínsav, az aszparaginsav, a glutamin, az aszparagin, a glicin, az alanin, a valin, a leucin, az izoleucin, a szerin és a treonín, amelyek közül leginkább a glutaminsavat, glutamint, aszparaginsavat, aszparagint és alanint részesítjük előnyben.

Minden módosításnak az a célja, hogy minimalizálja a töltéstaszítást a molekula tercier szerkezetében; legelőnyösebb, ha az analóg a kiindulási molekulához viszonyítva fokozott stabilitással rendelkezik. Nyilvánvaló, hogy a deléciók vagy helyettesítések száma nem lehet olyan nagy, illetve nem tehetjük meg egymáshoz szoros közelségben levő aminosavakkal, hogy töltéstaszítást generáljunk két negatívan töltött csoport között.

Ha a KGF analógokat biológiai módszerekkel, azaz a termékek sejtben való expressziójával állítjuk elő, szemben a szilárd fázisú szintézissel, vagy a természetes termékek proteolitikus vagy enzimatikus emésztésével, stb., az ilyen polipeptideket kódoló polipeptidek egy vagy több nukleotidban különböznek a természetes KGF nukleinsav szekvenciájától. Az ilyen nukleotidok expresszálhatók, és a kapott polipeptidet a számos rekombináns technika közül bármelyikkel tisztíthatjuk, amelyek a szakterületen jártas szakember számára jól ismertek.

A KGF analógokat vagy azok egy részét kódoló DNS szekvenciák közé tartozhatnak egyebek között azok, amelyekbe beépítettük az expresszióhoz a kiválasztott gazdasejtek által előnyben részesített kodonokat (azaz például az Escherichia coli expressziós kodonokat); restrikciós enzimek hasítási helyeit, valamint további kezdő, lezáró vagy intermedier nukleotid szekvenciákat (azaz például egy indító metionin aminosav csoportot Escherichia coli sejtekben való expresszióhoz), hogy ezzel megkönnyítsük könnyen expresszálódó vektorok készítését.

A jelen találmány tárgyát képezik a polipeptidek expresszálásában alkalmazható rekombináns molekulák vagy vektorok.

Ezek a vektorok lehetnek DNS vagy RNS vektorok, és lehetnek cirkulárisak, lineárisak, egyszálúak vagy kétszálúak, lehetnek természetben előfordulóak vagy számos komponensből összeállítottak, amely komponensek lehetnek természetesek vagy szintetikusak.

··· » · , 20

Az ilyen expressziós vektorokra számos példa létezik. A vektorok komponenseit, azaz például a replikonokat, szelekciós géneket, fokozókat, promotereket és hasonlókat előállíthatjuk természetes forrásokból vagy ismert eljárásokkal szintetizálhatjuk. A jelen találmányban jól használható expressziós vektorok mindegyik esetben tartalmaznak legalább egy expressziós kontroll elemet, funkcionálisan hozzákapcsolva a KGF polipeptid analógot kódoló, beszúrt nukleinsav molekulához. Ez a kontroll elem felelős a polipeptid találmány szerinti nukleinsav molekulákról való expressziójának szabályozásáért. A jól használható kontroll elemek közé tartozik például a lac rendszer, a trp rendszer, a λ fágból származó operátorok és promoterek, egy glikolitikus élesztő' promoter, az élesztő savas foszfatáz génből származó promoter, egy élesztő a-mating faktor és az adenovírusból, Epstein-Barr vírusból, polióma vírusból és majomvírusból, valamint különböző retrovírusokból származó kontroll elemek. Azonban számos egyéb, a szakirodalomban jól ismert, prokarióta és eukarióta expresszióhoz használható vektor és kontroll elem használható a jelen találmány gyakorlatában.

Az alkalmas prokarióta klónozó vektorok közé tartoznak az Escherichía coli plazmidok (azaz például pBR322, colEl, pUC és az F-faktor), az előnyben részesített plazmid a pCFM1156 (ATCC 69702), a pCFMl656 (ATCC 69576) és a pCFM3102 (az alább következő Példák részben ismertetjük). Más, az emlős, rovar, élesztő, gomba és bakteriális expresszióban használható ismert vektor, amelyeknek számos típusa ismert, szintén jól hasz21 nálható erre a célra. Ezeknek a vektoroknak a megfelelő gazdagejtekbe való transzfekciója eredményezheti a KGF analóg polipeptid expresszióját.

A jelen találmányban jól használható mikroorganizmus lehet prokarióta vagy eukarióta. A megfelelő prokarióta gazdaszervezetek közé tartoznak a különböző Escheríchia coli (azaz például

FM5, HB101, DH5cc, DH10 és MC1016) , Pseudomonas, Bacíllus és

Streptomyces törzsek, amelyek közül az Escheríchia coli törzseket részesítjük előnyben. Az alkalmas eukarióta gazdasejtek közé tartoznak az élesztők és egyéb gombák, a rovarsejtek, növényi sejtek és állati sejtek, azaz például a COS (úgymint a COS-1 és COS-1) és CV-1 majomsejt vonalak, Swiss, Balb-c vagy NIH sejtekből származó 3T3 vonalak, HeLa és L-929 egérsejtek, valamint CHO, BHK vagy HaK hörcsögsejtek. Az alkalmazott gazdaszervezettől függően a jelen találmány szerint előállított rekombináns polipeptidek lehetnek emlős vagy egyéb eukarióta szénhidrátokkal glikozilezve, vagy lehetnek glikozilezetlenek.

A előnyben részesített előállítási módszer számos különböző faktortól és megfontolástól függően változik; egy adott helyzetben az optimális előállítási eljárás nyilvánvaló a szakterületen jártas szakember számára, minimális kísérleti munka elvégzése után. A kapott expressziós terméket azután közel homogenitásig tisztítjuk, a szakterületen ismert eljárások alkalmazásával. Egy prokarióta sejt termékének tipikus tisztítási eljárása magában foglalja a sejtfalak feltörését magas nyomással vagy egyéb eszközökkel, centrifugálás alkalmazását a , 22 sejttörmelék eltávolítására, majd ioncserélő kromatográfia alkalmazását a felülúszóra vagy szűrletre, és végezetül hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia alkalmazását. Ha az analógot oldhatatlan formában expresszáljuk, akkor egy másik tisztítási technika magában foglalja azt a lépést, hogy először oldatba visszük az analógokat tartalmazó zárványtesteket, majd helyreállítjuk a fehérje térszerkezetét, és végezetül hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiát alkalmazunk. A tisztítási technikákat ismertetik az 1994. október 13-án benyújtott 08/323,339 számú Amerikai Egyesült Államok-beli bejelentésben. A 08/323,339 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentésben leírnak egy eljárást egy keratinocita növekedési faktor tisztítására, ami a következő lépésekből áll: (a) KGF-et tartalmazó oldatot állítunk elő; (b) az (a) pontban kapott oldatból a KGF-et egy kationcserélő gyantára kötjük ki; (c) a KGF-et eluáló oldattal eluáljuk a kationcserélő gyantáról; (d) a (c) pontból származó eluátumot vagy átbocsátjuk egy megfelelő molekulasúly kizárásos hordozón, vagy hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiát végzünk a (c) pontban kapott eluátum oldattal; és (e) kinyerjük a molekulasúly kizárásos hordozón vagy hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiával kapott

KGF-et.

Az analógokat természetesen gyorsan átvizsgálhatjuk, hogy megbecsüljük a fizikai tulajdonságaikat. A Példák részben számos jól ismert stabilitás esszét mutatunk be, jóllehet az analóg vizsgálatára használt specifikus esszé természete nem kritikus. Emellett a biológiai aktivitás szintje (azaz a recep23 torkötés és/vagy affinitás, mitogén, sejtszaporodási és/vagy in vivő aktivitás) is vizsgálható, számos különböző teszt alkalmazásával, amelyek közül néhányat a Példák részben mutatunk be. Számos vizsgálat jól ismert, és arra használhatjuk, hogy gyorsan megvizsgáljuk, rendelkeznek-e elfogadható biológiai aktivitással vagy sem. Egy ilyen vizsgálatban specifikusan vizsgáljuk a KGF analógoknak azt a képességét, hogy mennyire képesek kötődni a KGF receptorhoz (KGFR) , a ¹²⁵I-KGF-fel versengve [ Bottaro és mtsai: Journal of Biological Chemistry 265, 12767-12770 (1990); Ron és mtsai: Journal of Biological Chemistry 268, 2984-2988 (1993)] . Egy másik módszer a KGFR/KGF analóg kölcsönhatások vizsgálatára magában foglalja különböző technikák alkalmazását, azaz például a valós idejű biospecifikus kölcsönhatás elemzést (BIA) [Felder és mtsai: Molecular & Cellular Biology 13, 1449-1455 (1993)] . Emellett egy mitogén vizsgálat is használható arra, hogy vizsgáljuk a KGF analógoknak azt a tulajdonságát, hogy mennyire képesek serkenteni a DNS szintézisét [Rubin és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86, 802-806 (1989)] . Végezetül sejtszaporodási esszék is használhatók arra, hogy vizsgáljuk a KGF analógoknak azt a képességét, mennyire képesek serkenteni a sejtszaporodást [ Falco és mtsai: Oncogene 2_, 573578 (1988)] . Az előzőkben említett esszé-rendszerek bármelyikét alkalmazva a KGF analógok biológiai aktivitása gyorsan átvizsgálható.

A KGF analógok tovább módosíthatók, hogy olyan további kémiai egységeket tartalmazzanak, amelyek általában nem képezik

részét a pepiidnek. Az ilyen derivatizált egységek fokozhatják a KGF analóg oldékonyságát, abszorpcióját, biológiai felezési idejét és hasonlókat. Az egységek emellett eliminálhatják vagy gyengíthetik a fehérje nemkívánt mellékhatását és egyéb hasonló hatásuk is lehet. Az ilyen hatások kiváltására alkalmas egységeket leírnak a szakirodalomban [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. kiadás, Mack Publishíng Co.,

Easton, PA (1990)] . Kovalens módosításokat vihetünk be a molekulába, a peptid megcélzott aminosav csoportjait egy szerves származékképző ágenssel reagáltatjuk, amely képes reagálni a kiválasztott oldalláncokkal vagy terminális csoportokkal [T.E. Creighton: Proteins: Structure and Molecule Propertíes; W.H. Freeman & Co., San Francisco, 79-86. old. (1983)] . A polietilénglikol (PEG) egy ilyen kémiai egység, amit a terápiás fehérjetermékek készítésére lehet használni. Néhány fehérje esetében a polietilénglikol kapcsolásáról kimutatták, hogy megvéd a proteolízissel szemben [ Sada és mtsai: J. Fermentation Bioengineering 71, 137-139 (1991)] , és bizonyos polietilénglikol egységek kapcsolási módszerei is ismertek [Davis és mtsai: Non-Immunogenic Polypeptides, 4,179,337 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés, kibocsátva 1979. december 18-án; Royer: Modifying Enzimes with Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby, 4,002,531 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés, kibocsátva 1977. január 11-én] . A kérdésről összefoglaló is jelent meg a szakirodalomban [ Abuchowski és mtsai: Enzymes and Drugs, 367-382. old. ín: Enzymes as Drugs, szerk.; Holcerberg és Roberts • *··· (1981)] . A polietilénglikol esetében számos különböző eszközt használnak a polietilénglikolnak a fehérjéhez való kapcsolására. Általában a polietilénglikol molekulákat a fehérjéhez egy, a fehérjén levő reaktív csoporton keresztül kapcsolják a fehérjéhez. Az ilyen kapcsoláshoz jól használhatók a lizincsoportokon vagy az N-terminálison található aminocsoportok. Például Royer azt állítja, hogy reduktív alkilezés használható polietilénglikol molekuláknak egy enzimhez való kapcsolására [Royer: Modifying Enzimes with Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby, 4,002,531 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés, kibocsátva 1977. január 11-én] . Wright azt állítja, hogy a szabad aminocsoportokkal rendelkező peptideket és szerves vegyületeket a PEG vagy rokon vízoldékony szerves polimerek imidát származékával lehet módosítani [Wright: PEG Imidates and Protein Derivatives Thereof, EP 0 539 167, publikálva 1993. április 28-án] . Shaw szabadalmi bejelentésében azt írja le, hogy a fehérjékben levő lizincsoportok módosíthatók a polietilénglikol molekuláknak a kapcsolása céljából, a reaktív aminocsoportokon keresztül [Shaw, 4,904,584 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés, kibocsátva 1990. február 27-én] .

Egy megvalósítási mód szerint a jelen találmány tárgya egy gyógyászati készítmény egydózisos beadási egysége, amit biztonságosan be lehet adni parenterálisan vagy orálisan, a betegségnek egy melegvérű állatban (azaz például emberben) való kezelésére. Az ilyen gyógyászati készítmény lehet líofílezett • · ·«· · · vagy egyéb módon dehidratált terápiás vagy diagnosztikai készítmény, amit fiziológiásán elfogadható oldószer hozzáadásával helyre lehet állítani. Az oldószer lehet bármilyen közeg, azaz például steril víz, fizológiás sóoldat, glükózoldat vagy egyéb vizes szénhidrát (azaz például poliolok, úgymint mannát, xilit vagy glicerin), amely képes feloldani a szárított készítményt, amely kompatibilis a kiválasztott beadási úttal, és ami nem zavarja a hatóanyagot és a használt helyreállító stabilizálószert. Egy specifikus megvalósítási mód szerint a találmány tárgyát egy egydózisos beadási egység előállítására alkalmas kit képezi. A kit tartalmaz egy első tartóedényt, amelyben a szárított fehérje van, valamint egy második tartóedényt, amelyben egy vizes készítmény van, amely egy helyreállítási stabilizálószert tartalmaz. Az oldatban levő fehérje koncentrációja, az egyes tartóedényekbe töltött oldat térfogata, valamint a tartóedények kapacitása (egymással kapcsolatban levő paraméterek, amelyek megfelelően módosíthatók, a végső kiszerelésben levő hatóanyag kívánt koncentrációjától függően), amik a szakterületen jártas szakember számára ismert széles tartományon belül változhatnak.

A találmány szerinti KGF analógok jól használhatók terápiás és diagnosztikai ágensekként, valamint kutatási ágensekként. Tehát a KGF analógok használhatók in vitro és/vagy in vivő diagnosztikai vizsgálatokban, amelyekben egy szövetvagy szervmintában határozzuk meg a KGF mennyiségét, illetve használhatók KGFR-t expresszáló sejtek meghatározására és/vagy izolálására [ Bottaro és mtsai: Journal of Biological Chemistry • · ···· ·

·.·· >···· , ···· · · ···· ♦·;· .··· ♦ ·· λ 27 *

265, 12767-12770 (1990); Ron és mtsai: Journal of Biological

Chemistry 268, 2984-2988 (1993)] . A szövetek vagy szervek vizsgálatakor I-KGF analóg eseteben kevesebb KGFR-hez kötődő 125 radioaktivitás lesz, ha a I-KGF analóggal kapott standardizált kötési görbével hasonlítjuk össze, a jelzetlen természetes KGF-nek a KGFR-hez való kötődése következtében.

125

Hasonlóképpen, a I-KGF analóg arra is használható, hogy kimutassuk a KGFR jelenlétét különböző sejttípusokban.

A találmány tárgyát képezi a KGF analógok alkalmazása a peptid elleni ellenanyagok előállításában, amely ellenanyagok kötődnek a természetes KGF-hez. Ebben a megvalósítási módban az ellenanyagok monoklonális vagy poliklonális eredetűek, és egy KGF analóg felhasználásával állítjuk elő. A kapott ellenanyagok főleg a természetes KGF-hez kötődnek, előnyösen akkor, ha a fehérje természetes (biológiailag aktív konformációjában) van. Ezek az ellenanyagok használhatók a természetes KGF kimutatására vagy tisztítására.

A találmány tárgyát képezi emellett a KGF analógok alkalmazása terápiás alkalmazhatósággal rendelkező, nagy affinitású vagy kis affinitású KGF-kötő molekulák felfedezésében, amiket például a KGF hatékony bejuttatására, vagy a KGF aktivitás hatékony inhibitoraként lehet használni. A KGF analógok hőstabilitása fontos az ilyen kötő molekulák fiziológiás körülmények között (azaz 37 °C-on) való azonosításában, mivel a KGFhez való affinitásuk erősen hőmérsékletfüggő, és nem jósolható meg a 4 °C-on megfigyelt affinitásukból.

• •·· · • · *··» , 28 < * «

Az in vivő alkalmazások során a KGF analógokat adalékanyagokkal formulázhatjuk. Az ilyen adalékanyagok közé tartoznak a pufferek, hordozók, stabilizálószerek, töltőanyagok, konzerválószerek, tonicitást beállító szerek, antioxidánsok és hasonlók (azaz például a viszkozitást beállító szerek vagy töltőanyagok). A specifikus adalékanyagok kiválasztása függ a tárolási formától (azaz attól, hogy folyékony vagy liofilezett formában tároljuk), valamint a KGF analóg beadási módjától. A megfelelő kiszerelési módok, amelyek ismertek a szakterületen, megtalálhatók a szakirodalomban [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. kiadás, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)] .

A KGF analógok terápiásán hatékony mennyiségben alkalmazhatók olyan szövetekre, amelyeket specifikusan az jellemez, hogy sérült, vagy klínikailag elégtelen számú nem-fibroblaszt epitélium sejtekkel rendelkezik. Mivel a KGF kötődik a heparinhoz, ezért valószínű, hogy a heparin, a heparin-szulfát, a heparin-szerű glikozaminoglikánok, amelyek az extracelluláris környezetben találhatók, in vivő köthetik a KGF-et. Ebből következik, hogy a csökkent heparinkötő aktivitással rendelkező KGF analógoknak megnő az aktivitásuk, mivel több KGF éri el a célpontját, és a heparin vagy heparin-szerű vegyületek nem szűrik ki az extracelluláris környezetből. Ezek az analógok jobban használhatók terápiásán, mivel egy adott KGF kisebb dózisaira van szükség egy kezelésben.

A KGF analógok terápiásán hatékony mennyiségben alkalmazhatók olyan szövetekre, amelyeket specifikusan az jellemez, • Σ * Λ · · · · ,· *.ϊ· · · ···· ··;

hogy sérült, vagy klinikailag elégtelen számú nem-fibroblaszt epitélium sejtekkel rendelkeznek. Azok a területek, amelyekre a KGF analógok sikeresen alkalmazhatók, a következők, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat: az adnexális struktúrák, azaz például a hajhagymák, izzadságmirigyek és faggyúmirigyek serkentése, szaporítása és differenciálódása égési sérülésekben, vagy egyéb, teljes mélységű sérülésekben szenvedő betegek kezelésében; az epidermolysis bullosa (az epidermisznek az alatta levő dermiszhez való tapadásának hibája, ami gyakran súlyos betegségeket okozó nyílt, fájdalmas hólyagok megjelenését eredményezi) által okozott léziók felgyorsult reepítelizációja; a kemoterápia által indukált szőrhullás megelőzése és férfias típusú kopaszság kezelése, vagy a haj progresszív elvesztése férfiakban és nőkben; gyomor- és nyombélfekélyek kezelése; gyulladásos bélbetegségek, azaz például a Crohn féle betegség (ami elsődlegesen a vékonybelet érinti) és a fekélyes kolítisz (ami elsődlegesen a vastagbelet érinti) kezelése; a béltoxicitás megakadályozása vagy csökkentése sugárzásos vagy kemoterápiás kezelések során (azaz például előkezelés és/vagy utókezelés), amely kezeléseket vagy citoprotektív hatás vagy regeneráció, vagy mindkettő kiváltására használnak; nyálka termelésének indukálása az emésztőrendszerben; a ΙΙ-es típusú pneumociták szaporodásának és differenciálódásának indukálása, ami segíthet betegségek kezelésében vagy megelőzésében, mint például a fiatal gyermekek hyalin membrán megbetegedésében (azaz például gyermek légzési nehézség tünetek és bronchopulmonáris fejlődési bronchopulmonáris és tünetek * · rf « · • · · · ···· ···<

• · rendellenesség); a bronchioláris és/vagy alveoláris epitélium szaporodásának és differenciálódásának serkentése belégzési sérülések (beleértve a magas oxigénkoncentrációt) miatt fellépő akut vagy krónikus tüdőkárosodás vagy tüdőelégtelenség esetében, emfizéma, tüdőkárosító kemoterápiás szerek alkalmazása, ventilátor sérülés vagy egyéb tüdőkárosító körülmények között; a máj működésének fokozására, máj zsugorodás, akut virális hepatitisz és/vagy a májnak okozott mérgezés által okozott heveny májkárosodás esetében; szaruhártya sejtek regenerálódásának indukálása, például a szaruhártya horzsolódása esetében; az epiteliális sejtregenerálódás indukciója progresszív gumi betegség kezelésére; dobhártya epiteliális sejtek regenerálódásának indukciója a dobhártya károsodásának kezelésére és a cukorbetegség fellépésének megakadályozására vagy kezelésére, vagy a hasnyálmirigy szigetsejtek transzplantációjának beállításánál adalékanyagként.

A nem-fibroblaszt epiteliális sejtek szaporodását igénylő betegnek egy KGF analógból hatékony mennyiséget adunk be. A hatékony mennyiség jelentése a KGF analógnak az a mennyisége, ami ahhoz szükséges, hogy kiváltsuk a kívánt választ a kezelt betegben, és ezért általában a kezelőorvos határozza meg. A beadott KGF analóg mennyiségét befolyásoló faktorok közé tartozik a beteg kora és általános kondíciója, a kezelendő betegség, stb. A tipikus dózisok 0,001 mg/testsúlykilogramm és 500 mg/testsúlykilogramm között változnak.

A KGF analógot melegvérű állatoknak (azaz például embereknek) biztonságosan beadhatjuk parenterálisan (azaz IV,

ΙΤ, ΙΜ, SC vagy IP utakon), orálisan vagy topikálisan. A KGF analógot használhatjuk egyszeri beadással, vagy ismételten is beadhatjuk, a betegségtől és a beteg állapotától függően. Néhány esetben a KGF analógot más terápiát kísérő anyagként is beadhatjuk, illetve beadhatjuk egyéb gyógyászati készítményekkel együtt.

Az alábbi példákat a jelen találmány teljes illusztrálása céljából adjuk meg. Az nyilvánvaló, hogy az ismertetett eljárások módosíthatók, anélkül, hogy eltérnénk a találmány szellemétől.

PÉLDÁK

Az alábbi példákban ismertetett eljárásokban szereplő standard módszereket vagy megfelelő alternatív módszereket megtalálhatjuk a molekuláris biológia széles körben ismert kézikönyveiben [ Sambrook és mtsai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Press, Cold Spríng Harbor, N.Y. (1989); Current Protocols in Molecular Piology, szerk.: Ausubel és mtsai, Greene Publíshing és WileyInterscience: New York (1990)] .

1. Példa

A KGF-et és KGF analógokat kódoló DNS készítése

A teljes hosszúságú humán KGF gén (ami a természetes KGF szekvenciájával rendelkező polipeptidet kódol) klónozását elvégeztük egy állati sejtből származó RNS-en végzett polimeráz láncreakcióval (PCR), illetve kémiailag szintetizált *

(Escherichía coli-ra optimalizált kodon) oligonukleotidokon végzett PCR reakcióval. Mindegyik eljárást ismertetjük az alábbiakban.

Azokból a sejtekből, amelyekről ismert, hogy előállítják a polipeptidet, RNS-t izolálunk, majd ezen PCR amplifikálást végzünk. Először az AG1523A humán fibroblaszt sejtvonalból származó sejteket (amikhez a Humán Genetic Mutant Cell Culture Repository Institute Fór Medicel Research, Camden, New Jersey, jóvoltából jutottunk hozzá) guanidium-izotiocianáttal elroncsoljuk, majd extraháljuk [Chomyzinski és mtsai: Anal. Biochem. 172, 156 (1987)] . Standard reverz transzkriptáz protokollt használva az össz-RNS-re, előállítjuk a KGF cDNS-t. A KGF gén PCR (PCR#1) amplifikálását a KGF cDNS-t templátként alkalmazva végezzük el, primerként az 1. számú és 2. számú oligonukleotidot használva, amelyek a KGF gén közvetlen 3' és 5' szomszédságában levő DNS szekvenciákat kódolják [ Model 9600 thermocycler (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT) ,· 28 ciklus, mindegyik ciklus a következő lépésekből áll: egy perc 94 °C-on a denaturáláshoz, két perc 60 °C-on az illeszkedéshez, majd három perc 72 °C-on a hosszabbításhoz] . A PCR#1 terméknek egy kis alikvot részét használjuk azután templátként egy második KGF PCR (PCR#2) amplifikáláshoz, amiben az előzőkkel azonos ciklusokat alkalmazunk, azzal az eltéréssel, hogy illeszkedési hőmérsékletként 50 °C-t használunk. A KGF gén expressziós klónozásához hálós PCR primereket használunk arra, hogy kényelmesen használható restrikciós hasítási helyeket hozzunk létre a KGF gén végein. A 3. számú és 4. számú oligonukleotidot hasz»··« · • · „ .· :.:. . » ···» ···· náljuk a PCR#2-ből származó KGF DNS termék módosítására, hogy Miül és BamHI restrikciós hasítási helyeket vigyünk be a gén 3' és 5' végére (PCR#3; 30 ciklus; az egyes ciklusokban alkalmazott lépések: egy perc 94 °C-on a denaturáláshoz, két perc 60 °C-on az illeszkedéshez, és három perc 72 °C-on a meghosszabbodáshoz) . Ezt a DNS-t azután Miül és BamHI restrikciós endonukleázokkal hasítjuk, fenollal extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk. Azután szuszpendáljuk, majd T4 ligázzal egy pCFMH56 plazmidba (2A. ábra) ligáljuk, amely tartalmaz egy RSH szignálszekvenciát, ezzel előállítva az RSH-KGF konstrukciót (3. ábra) .

A ligálás termékét Escherichia coli FM5 törzsbe (ATCC: 53911) transzformáljuk [ Hanahan: J.Mól.Bioi. 166, 557 (1983)] , majd LB+kanamicín lemezre szélesztjük 28 °C-on. Számos transzformánst választunk ki, majd kis folyadéktenyészetekben szaporítjuk, amelyek 20 pg/ml kanamicint tartalmaznak. Az RSH-KGF plazmidot izoláljuk az egyes tenyészetek sejtjeiből, majd a DNS-t megszekvenáljuk. Mivel a KGF gén belsejében van egy Ndel hasítási hely, ezért nem lehet a természetes génszekvenciát közvetlenül a kívánt expressziós vektorba klónozni, amely a zárójelbe tett Ndel és BamHI hasítási helyeket tartalmazza. Ezt háromutas ligálással érjük el. Az RSH-KGF plazmidot a BsmI és SstI egyedi restrikciós hasítási helyeken elvágjuk, majd egy 1%-os agaróz gélen végzett elektroforézis után izolálunk egy körülbelül 3 kilobázispár méretű DNS fragmenst (amely a KGF gén

3' végét tartalmazza). PCR-t végzünk (PCR#4) a PCR#3-ra leírt körülmények között, azzal az eltéréssel, hogy a 3. számú oligo·· · ··*· ί · t · · * · • » ···· ···· nukleotid helyett az 5. számú oligonukleotidot használjuk. A PCR-rel kapott DNS terméket azután Ndel és BsmI restrikciós endonukleázzal hasítjuk, majd 4%-os agaróz gélen végzett gélelektroforézis után egy 311 bázispár méretű DNS fragmenst izolálunk. A ligálás harmadik darabja a pCFM1156 plazmádnak egy

I, 8 kilobázispár méretű darabja, amit Ndel és SstI restrikciós enzimekkel vágtunk ki, ezt egy 1%-os agaróz gélen végzett gélelektroforézis után izoláltuk. Az előzőkben ismertetett ligálást (T4 ligázzal), transzformálást, kanamicin szelekciót és DNS szekvenálást követően kiválasztunk egy olyan kiónt, amely tartalmazza a 4. ábrán látható konstrukciót és a KGF jelű plazmidot. Egy belső riboszómális kötőhely miatt, amely csonkított termékeket eredményez, az egyedi KpnI és EcoRI hasítási helyek közötti KGF DNS szekvenciát kémiai úton szintetizált oligonukleotidokkal (6. számú oligonukleotidtól a

II. számú oligonukleotidig) helyettesítjük, hogy minimalizáljuk a belső starthely használatát (5. ábra).

1. számú oligonukleotid (7. számú szekvencia):

5' -CAATGACCTAGGAGTAACAATCAAC-3'

2. számú oligonukleotid (8. számú szekvencia):

5' -AAAACAAACATAAATGCACAAGTCCA-3'’

3. számú oligonukleotid (9. számú szekvencia):

5' - AC AACGCGTGCAATGACATGACTCCA- 3'

4. számú oligonukleotid (10. számú szekvencia):

5' -ACAGGATCCTATTAAGTTATTGCCATAGGAA-3'

5. számú oligonukleotid (11. számú szekvencia):

5' -ACACATATGTGCAATGACATGACTCCA-3'

6. számú oligonukleotid (12. számú szekvencia):

5' -CTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCC-3'

7. számú oligonukleotid (13. számú szekvencia):

5' -AAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTT-3'

8. számú oligonukleotid (14. számú szekvencia):

5' -GCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTG-3'

9. számú oligonukleotid (15. számú szekvencia):

TCTTGGGTGCCCTTGACTTTGCCGCGTTTGTCGATACGCAGGTAC-3'·

10. számú oligonukleotid (16. számú szekvencia):

5' -ACAGCAACAGTACGGATTTCCATAATATTGTAGTTGTTTTTCATC-3'

11. számú oligonukleotid (17. számú szekvencia):

5' -AATTCAGATTCAACACCTTTGATTGCAACGATACCA-3'

Az oligonukleotidokat T4 polinukleotid kinázzal foszforilezzük, majd hővel denaturáljuk. Azután hagyjuk, hogy az egyszálú (ss) olígonukleotidokkétszálú DNS fragmenseket képezzenek, oly módon, hogy hagyjuk hogy a hőmérséklet lassan szobahőmérsékletre csökkenjen. Ezután T4 ligázt használunk arra, hogy mind a belső oligonukleotid tapadó végeit mind a teljes kétszálú oligonukleotid fragmenst kovalens kötéssel a KpnI és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztett KGF plazmádhoz kössük. Az új plazmid jelzése KGF(dsd).

Egy olyan KGF gént készítünk PCR amplifikálással, a kémiailag szintetizált 12-24. számú oligonukleotidok felhasználásával, amelynek a kodonjai teljesen Escherichia coli-ra vannak optimalizálva.

12. számú oligonukleotid (18. számú szekvencia):

5' -AGTTTTGATCTAGAAGGAGG-3'

13. számú oligonukleotid (19. számú szekvencia):

5' -TCAAAACTGGATCCTATTAA-3'

14. számú oligonukleotid (20. számú szekvencia):

5' -AGTTTTGATCTAGAAGGAGGAATAACATATGTGCAACGACATG

ACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGTTAACTGCTCCAGCCCGGAACGT-3'

15. számú oligonukleotid (21. számú szekvencia):

5' -CACACCCGTAGCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGT

GTTCGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAA-3'

16. számú oligonukleotid (22. számú szekvencia):

5' -CGTGGTAAAGTTAAAGGTACCCAGGAAATGAAAAACAACTACAACATC

ATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAA-3'

17. számú oligonukleotid (23. számú szekvencia):

5' -GGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACT

GTACGCAAAAAAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAA-3'

18. számú oligonukleotid (24. számú szekvencia):

5' -CTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGAC

CCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGT-3'

19. számú oligonukleotid (25. számú szekvencia):

5' -ATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTC

ACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAATAGGATCCAGTTTTGA-3'

20. számú oligonukleotid (26. számú szekvencia):

5' -TACGGGTGTGACGTTCCGGG-3'

21. számú oligonukleotid (27. számú szekvencia):

5' -CTTTACCACGTTTGTCGATA-3'

22. számú oligonukleotid (28. számú szekvencia):

5' -ATTCAACACCTTTGATTGCA-3'

23. számú oligonukleotid (29. számú szekvencia):

5' -CCAGGATCAGTTCTTTGAAG-3'

24. számú oligonukleotid (30. számú szekvencia):

5' -GAACCGGGATACCTTTCTGG-3'

A 12-24. számú oligonukleotidokat úgy terveztük meg, hogy a természetes KGF-et kódoló teljes DNS szekvenciát oligonukleotidok képezik, vagy a Watson vagy a Crick szálról, és PCR amplifikálással a kívánt kétszálú DNS szekvenciát kapjuk (6. ábra) [ PCR#5, Model 9600 thermocycler, Perkin-Elmer Cetus; 21 ciklus, mindegyik ciklus a következő lépésekből áll: 31 másodperc 94 °C-on denaturáláshoz, 31 másodperc 50 °C-on illesztéshez, és 31 másodperc 73 °C-on a meghosszabbodáshoz; a 21 ciklust követően a PCR-t egy végső, hét percig tartó hosszabbítási lépéssel zárjuk le] . PCR amplifikálás után a DNS fragmenst Xbal és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük, majd az 521 bázispár méretű fragmenst a pCFM1156 expressziós plazmádba ligáljuk, amit előzőleg ugyanazokkal az enzimekkel hasítottunk. A PCR#5-ben külső printerekként (100 pmol/100 μΐ rxn) a 12. számú és 13. számú oligonukleotidot, valamint 1 μ1/100 μΐ rxn KGF templátot használjuk, ami a 14-19. számú oligonukleotidokkal végzett ligálásból származik (T4 ligázzal) (a 15-19. számú oligonukleotidokat foszforilezzük T4 polinukleotid kinázzal), a 20-24. számú oligonukleotidokat használva sávsegítő oligonukleotidokként [ Jayaraman és mtsai: Biotechniques 12, 392 (1992)] a ligáláshoz. A végső konstrukció jelzése KGF(optimalizált kodonok).

Az alábbiakban ismertetett összes KGF kodon részben a

KGF(dsd)-ben, részben a KGF(optimalizált kodonok)-bán található DNS szekvenciákból, vagy a kettő kombinációjából áll. A szekvenciákat a továbbiakban tovább módosítjuk a DNS szekvenciákban található megfelelő restrikciós hasítási helyekbe olyan szekvenciák beépítésével, amelyek az adott KGF analóg aminosavait kódolják, és amelyeket úgy állítottunk elő, hogy egy vagy több, a DNS fragmensek szintézisére használt technikák közül egyet vagy többet használunk. Bármelyik analóg teljes mértékben előállítható az előzőkben ismertetett technikák alkalmazásával.

Ahol ez alkalmazható volt, ott az Escherichia coli kodonokra optimalizált oligonukleotidokat használtuk, jóllehet az Escherichia coli-za optimalizált kodonok részben vagy teljes egészben való jelenléte bármelyik vizsgált génben nem növelte szignifikánsan a tenyésztett bakteriális sejtekben előállított fehérje mennyiségét. A 7-10. és 17-26. ábrákon KGF analóg nukleotid- és aminosav szekvencia konstrukciókat mutatunk be:

R(144)Q (7. ábra); C(1,15)S/R(144)E (8. ábra); C(1,15)S/R(144)Q (9. ábra); AN23R(144)Q (10. ábra); ΔΝ23/Ν(137)Ε (17. ábra);

ΔΝ23/Κ(139)Ε (18. ábra); AN23/K(139)Q (19. ábra); AN23/R(144)A (20. ábra); AN23/R(144)L (21. ábra); ΔΝ23/Κ(147)Ε (22. ábra);

ΔΝ23/Κ(147)ζ) (23. ábra); ΔΝ23/Κ(153)Ε (24. ábra); AN23/K(153)Q (25. ábra) és ΔΝ23/<2 (152 ) E/K (153) E (26. ábra). Mindegyik ismertetett KGF analógnak igazoltuk a DNS szekvenciáját.

• * · · ·

2. Példa

Előállítás Escherichia colí-ban

Három különböző expressziós plazmidot használunk a KGF analóg gének klónozásában. Ezek a következők: pCFMH56 (ATCC# 69702), pCFM1656 (ATCC# 69576), és pCFM3102 (2A., 2B. és 2C.

ábrák). A p3102 plazmid a pCFM1656 plazmádból származik, egy sorozat helyspecifikus báziscserét hajtva végre PCR átfedő oligonukleotid mutagenezissel. A BglII hasítási hellyel (pCFM1656 plazmid 180# bázispár) kezdve közvetlenül a plazmid replikációs promoterétől (P_copB) 5' irányban, az elvégzett báziscserék a következők:

PCFM1656 bp# bp a pCFM!656-ban

# 204		T/A
# 428		A/T
# 509		G/C
# 617		- -
# 637		G/C
# 978		T/A
# 992		G/C
#1002		A/T
#1005		C/G
#1026		A/T
#1045		C/G
#1176		G/C
#1464		G/C
#2026		G/C
#2186		C/G
#2479		A/T
#2498-2501		AGTC TCAC
#2641-2647		TCCGAGC AGGCTC
#3441		G/C
#3452		G/C
#3649		A/T
#4556		- -
	(39 .	számú szekvencia)
	(40 .	számú szekvencia)

Megváltoztatott bázispárok a pCFM3102-ben C/G G/C A/T két G/C bp beszúrása T/A C/G A/T C/G T/A T/A T/A T/A T/A bp deléció T/A T/A GTCA CAGT bp deléció

A/T

T/A bázispárok beszúrása 5' -GAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAG-3'

3' -CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC-5'

Amint az az előzőkből látható, a pCFM1156, pCFM1656 és pCFM3102 plazmidok nagyon hasonlítanak egymásra, és számos azonos restrikciós hasítási helyet tartalmaznak, A plazmidot egyszerűség! szempontok alapján választottuk ki, és a vektor ···· » · ····»*·· ♦· • ·· ···· ···

DNS komponensei könnyen megváltoztathatók az új konstrukcióknak megfelelően. Az összes klónozáshoz az Escherichia coli FM5 törzset használjuk (ATCC: 53911), és a transzformációkat vagy Hanahan módszerével, [ Hanahan: J.Mól.Bioi. 166, 557 (1983)] , vagy elektroelúcióval végezzük, egy Gene Pulser transzfekciós berendezést használva erre a célra (BioRad Laboratories, Inc.,

Hercules, CA) , a gyártó előírásai szerint.

Először kismennyiségű frissen tenyésztett inokulummal kezdünk, amit a három pCFM vektor közül az egyikben levő kívánt konstrukciót hordozó rekombináns Escherichia coli klónból készítünk. Az inokulumot úgy állítjuk elő, hogy a megfelelő törzs mélyhűtött glicerines tenyészetéből 0,1 ml-t viszünk át egy kétliteres lombikba, ami 500 ml Luria táptalajt tartalmaz. A tenyészetet 16 óra hosszat rázatjuk 30 °C-on, majd a tenyészetet egy 15 literes fermentorba visszük át, ami 8 liter steril táptalajt tartalmaz [ Tsai és mtsai: J. Industrial Microbiol. 2, 181-187 (198)] .

A rátáplálásos fermentáció az 1. számú táptalaj beadásával indul [Tsai és mtsai: J. Industrial Microbiol. 2, 181-187 (1987)] . Amikor az OD₆₀₀ eléri a 35-ös értéket, akkor a kívánt KGF analóg expresszióját azzal indukáljuk, hogy a tenyészet hőmérsékletét gyorsan megemeljük 37 °C-ra, két óra hosszat itt tartjuk, majd 42 °C-ra emeljük, hogy denaturáljuk a Cl represszort. Az 1. számú táptalaj adagolását leállítjuk és megkezdjük 300 ml/óra sebességgel a 2. számú táptalaj adagolását. A 2. számú táptalaj összetétele: 175 g/l triptikáz/pepton, 87,5 g/l élesztőkivonat és 260 g/l glükóz.

*?· ··..

Egy óra hosszat 42 °C-on tartjuk, majd. a tenyészet hőmérsékletét 36 °C-ra csökkentjük, és ezt a hőmérsékletet tartjuk további 6 óra hosszat.

A fermentációt leállítjuk, majd a sejteket centrifugálással 1 literes centrifugapalackokba tett műanyag zacskókba gyűjtjük. A sejteket centrifugálással ülepítjük (400/perc, 60 perc), majd a felülúszókat eltávolítjuk, és a sejttömeget -90 °C-ra hűtjük.

A különböző KGF analógok Escherichia coli-ban való expresszióját követően a természetes KGF, C(1,15)S/R(144)E, C(1,15)S/R(144)Q és ÁN23/R(144)Q fehérjéket az alábbi eljárással tisztítjuk. A nagy sejtsűrűségű fermentációból származó sejttömeget 4 °C-on szuszpendáljuk 0,2 mol/1 nátrium-klorid, 20 mmol/1 nátriumfoszfát (pH=7,5) összetételű oldatban, 10-20 (tömeg/térfogat)%-os oldat formájában, megfelelő keverő alkalmazásával. A szuszpendált sejteket azután feltárjuk, az oldatot háromszor átbocsátva egy homogenizálón (APV Gaulin, Inc., Everett, MA) . A kifolyó homogenizátumot 4-8 °C-ra hűtjük, megfelelő hőcserélővel. A törmeléket azután eltávolítjuk, oly módon, hogy, hogy a lizátumot egy J-6B centrifugában (Beckman Instruments, Inc., Brea, CA) , egy JS 4.2 rotorral 4200/perc fordulatszámmal, 30-60 percig 4°C-on centrifugáljuk. A felülúszókat azután óvatosan dekantáljuk, majd egy korábban elkészített 450 ml-es (5x23 cm) oszlopba töltött Sepharose Fást Flow gyantára (Pharmacia, Piscataway, NJ) töltjük, amit 0,2 mol/1 nátrium-klorid, 20 mmol/1 nátriumfoszfát (pH=7,5) össze• ♦·*· · · · · · · ···· ♦ ..· ···· ··*· • · tételű oldattal hoztunk egyensúlyba 4 °C-on. Ezután az oszlopot öt oszloptérfogatnyi (2250 ml) oldattal (0,4 mol/1 nátrium-

klorid,	20 mmol/1	nátriumfoszfát, pH=7,5;	ι mossuk	4 °C-on. A
kapott	fehérjét	eluáljuk,	az oszlopot	5 liter	0,5 mol/1
nátrium-	klorid,	20	mmol/1	nátriumfoszfát	(pH=7,5)	összetételű
oldattal	mosva.	50	ml-es	frakciókat szedünk, és	az elfolyó

oldat A₂₈₀ értékét folyamatosan ellenőrizzük. Azután 14%-os gélen SDS-PAGE-val elemezzük azokat a frakciókat, amelyekről az A₂₈₀ érték alapján kiderült, hogy eluált anyagot tartalmaznak, ezzel igazolva, hogy a keresett polipeptid jelen van.

Ezután a számunkra érdekes fehérjéket tartalmazó frakciókat egyesítjük, majd azonos térfogatú desztillált vizet adunk hozzá. A hígított mintát azután egy korábban elkészített 450 ml térfogatú (5 x 23 cm) Sepharose Fast-Flow oszlopra visszük, amit előzőleg 0,4 mol/1 nátrium-klorid, 20 mmol/1 nátriumfoszfát (pH=6,8) oldattal hoztunk egyensúlyba 4 °C-on. Az oszlopot azután 2250 ml térfogatú, 0,4 mol/1 nátrium-klorid, 20 mmol/1 nátriumfoszfát (pH=6,8) összetételű oldattal mossuk, majd a fehérjét 20 oszloptérfogatnyi lineáris gradienssel eluáljuk (a gradiens összetétele 0,4 mol/1 nátrium-klorid, 20 mmol/1 nátriumfoszfát (pH=6,8)-tól 0,6 mol/1 nátrium-klorid, 20 mmol/1 nátriumfoszfát (pH=6,8) között változik). Ismét 50 ml-es frakciókat szedünk, az elfolyó oldatot folyamatosan ellenőrizve az A₂₈₀ alapján. Azután a fehérjéket tartalmazó frakciókat (14%-os SDS-PAGE-val meghatározva) egyesítjük, majd egy YM-10 membránon (10000-es vágási érték) keresztül 30-40 ml-re kon44 centráljuk 350 ml-es kevertetett cellában (Amicon, Inc., Mayberry, MA).

A koncentrátumot azután egy korábban elkészített, 1300 ml (4,4 x 85 cm) térfogatú oszlopba töltött Superdex-75 gyantára (Pharmacia) töltjük, amit oszloppufferrel hoztunk egyensúlyba. Az oszloppuffer összetétele: lxPBS (Dulbecco féle foszfáttal puffereit sóoldat, D-PBS, kalcium- és magnézium-mentes), vagy 0,15 mo/1 nátrium-klorid, 20 mmol/1 nátriumfoszfát (pH=7,0). Miután hagytuk a mintát az oszlopon futni, a fehérjét eluáljuk a gélszűrő anyagról, az oszloppuffért használva erre a célra. Ezután 10 ml-es frakciókat szedünk, majd az analógot tartalmazó frakciókat (14%-os SDS-PAGE alapján meghatározva) egyesítjük. Tipikus esetben a fehérje-koncentráció körülbelül 5-10 mg a kapott egyesített oldatban. Az összes előzőleg említett eljárást 4-8 °C-on hajtjuk végre, hacsak külön nem említjük.

Elemzés

Az elemzést Escherichia coli-ból származó, természetes KGF; R(144)Q; C(1,15)S/R(144)E; C(1,15)S/R(144)Q és

ÁN23/R(144)Q mintákkal végezzük.

Konformációs stabilitás

A polipeptideket a tárolási stabilitásuk, a hőmérsékletváltozás hatására lejátszódó térszerkezet-változás hőmérséklete (T_ro) , és a széles pH-tartományban mérhető stabilitásuk alapján hasolítjuk össze.

.:7. ί·:· í s.:.:

A természetes KGF, az R(144)Q, a C(1,15)S/R(144)Q, a

C(1,15)S/R(144)e és a AN23/R(144)Q analógoknak azt a képességét is vizsgáljuk, hogy megakadályozzák a magas hőmérsékleten való aggregációt. 0,5 mg/ml fehérjét tartalmazó mintákat készítünk D-PBS-ben. Az egyes mintákból 0,5 ml-t osztunk szét alikvot részekre 3 ml-es, 1-es típusú üvegküvettában. A küvettákat gumidugókkal zárjuk le, majd 13 mm-es lepattanó alumínium pecséteket préselünk rájuk. Ezeket a küvettákat azután egy 37 °C-os inkubátorba tesszük. A küvettákat előre meghatározott időpontokban kivesszük, és vizsgáljuk, hogy mennyi az oldható fehérje veszteség bennük. A látható csapadékot az egyes minták 250 μΙ-es alikvot részének egy 0,22 μιη-es Spin-X™ szűrőegységen (Costar, Cambridge, MA) át való centrifugálásával távolítjuk el. A megszűrt oldatban levő oldható fehérjét azután méretkizárásos HPLC-vel elemezzük. Az oldható fehérje mennyiségét a HPLC csúcs területének integrálásával határozzuk meg, majd az eredményeket a 37 °C-on való inkubálás idejének függvényében ábrázoljuk. Az eredményeket a

11. ábrán mutatjuk be.

Azután megbecsüljük az oldható, monomer fehérje veszteségének felezési idejét. Az 1. táblázatban a megmaradt oldható KGF felezési idejét láthatjuk, ezeknek a fehérjéknek 37

C-on való tárolása után.

1. Táblázat

Az oldható, monomer fehérjék vesztségének felezési ideje

Fehérj e	t_1/2 (nap)
természetes KGF	0, 6
R(144)Q	4,1
.C(1,15)S/R(144)Q	13,3
ÁN23/R(144)Q	22,3
C(1,15)S/R(144)E	38,0

Amint az a fenti 1. táblázatból és a 11. ábráról látható, a természetes KGF aggregálódik leggyorsabban, az oldhatóság felezési ideje 0,6 nap. Az R(144)Q felezési ideje 4,1 napra emelkedett. A C(1,15)S/R(144)Q, a ÁN23/R(144)Q és a C(1,15)S/R(144)E analógok lényegesen nagyobb felezési idővel rendelkeznek, azaz 13,3, 22,3 és 38 nappal.

A természetes térszerkezet elvesztése a hőmérsékletemelés hatására

A természetes térszerkezet hőmérsékletemelkedés hatására való elvesztését cirkuláris dikroizmussal (CD) vizsgáljuk 230 nm-en, egy J-720™ spektropolarimétert használva (Jasco, Inc., Easton, MD), amit egy PTC-343 Peltier-típusú hőmérséklet-szabályozó rendszerrel szereltünk fel. A CD elemzéshez 0,1 mg/ml elemzendő polipeptidet tartalmazó mintákat készítünk D-PBS-ben (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY). Mindegyik mintából körülbelül 2,5 ml-t teszünk egy 10 mm-es úthosszú Suprasil™ kvarc (Heraeus Quarzschmelze, GmbH, Hanau, Németország) fluoreszcencia cellába (Hellma Cells, Inc., Jamaica, NY). A cellákat azután a spektropolariméterben levő Peltier-típusú hőmérséklet-szabályozó rendszerbe tesszük. A természetes térszerkezet hőmérsékletemelkedés hatására való elvesztését 50 °C/óra sebességgel vizsgáljuk. A térszerkezet elvesztésének jelzésére az ellipticitás változását követjük 230 nm-en. Az egyes minta T_ra értékét úgy becsüljük meg, hogy azonosítjuk azt a hőmérsékletet, amelynél az oldatban levő fehérjék 50%-a elvesztette a természetes térszerkezetét [ Biophysical Chemistry; szerk.: Cantor és Schímmel; W.H. Freeman and Co., San Francisco (1980)] . A három fehérje becsült T_m értékét a 2. táblázatban mutatjuk be.

. Táblázat

Becsült olvadási hőmérsékletek

Fehérje	T_m (°C)
természetes KGF	54,0
R(144)Q	61,5
C(l, 15) S/R(144)Q	62,5
ÁN23/R(144)Q	63,0
C(1,15)S/R(144)E	63,5

Amint ezek az eredmények mutatják, az R(144)Q-nak 7 °Cszal magasabb a T_m értéke a természetes KGF-hez viszonyítva. Az R(144)Q-t C(1,15)S/R(144)Q-ra vagy ÁN23-ra cserélve további egy fokkal nőtt a T_m értéke, és több mint 8 °C-szal magasabb • · · · mint a természetes KGF-é. Emellett a C(1,15)S/R(144)E T_m értéke több mint 9 °C-szal magasabb mint a természetes KGF-é. Tehát ha egy pozitívan töltött csoportot (Arg) a 144-es pozícióban egy semleges vagy negatívan töltött aminosavra cserélünk, akkor ez lényegesen stabilizálja a polipeptidet.

A C(1, 15)S/R(144)Q és a C(1,15)S/R(144)E savstabilitását is összehasonlítjuk a természetes KGF savstabilitásával, a DPBS ρΗ-ját különböző értékekre állítva be, tömény sósavat vagy nátríum-hidroxidot adva hozzá. Körülbelül 2,35 ml, különböző pH-jú D-PBS-t keverünk össze 100 μΐ, 2,45 mg/ml KGF fehérjével egy kvarc cellában. Ezekben a mintákban a fehérje természetes térszerkezetét a hőmérséklet emelésével megbontjuk, 50 °C/óra sebességgel, majd CD-vel követjük 230 nm-en. A 12. ábrán a T_met a természetes KGF, a C (1,15)S/R(144)Q és a C(1,15)S/R(144)E pH-jának függvényében mutatjuk be. A vizsgált pH-tartományban a C (1,15)S/R(144)Q-nak és a C (1,15)S/R(144)E-nek mindig magasabb a T_m értéke mint a természetes KGF-nek.

In vitro biológiai aktivitás

Az R(144)Q, a ÁN23/R(144)Q, a C(1,15)S/R(144)Q és a

C(1,15)S/R(144)E in vitro mitogén aktivitását is meghatározzuk a fehérje-koncentráció függvényében, valamint meghatározuk a maximális koncentráció felét, a Balb/MK sejtek [ ³H] -timidinfelvétele alapján [Rubin és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86, 802-806 (1989)] .

·»· ·

Az egyes KGF analógok koncentrációját általában az ismert standard természetes KGF-hez viszonyítva határozzuk meg, egy in vitro biológiai esszét használva. Azután mindegyik KGF analógot meghigítjuk és vizsgáljuk a biológiai aktivitását, egy Balb/MK mitogén esszét használva. A mintákat először egy biológiai vizsgáló közegben hígítjuk, ami 50%, a felhasználó által készített Eagle féle MEM-et, 50%, a felhasználó által készített F12-t, 5 μρ/ιηΐ transzferrint, 5 ng/ml nátrium-szelenitet,

0,0005% HSA-t és 0,005% Tween 20-at tartalmaz. A KGF mintákat azután Falcon primeria 96-lukas lemezekre visszük, amiket Balb/MK sejtekkel oltunk be. Mérjük a [ ³H] -beépülését a DNS szintézise során, majd bevitt természetes KGF koncentrációvá alakítjuk, természetes KGF standard görbével összehasonlítva. Az eredményeket a 13-16. ábrán mutatjuk be. Amint az a 13-16. ábrákról látható, mindegyik KGF analógnak van mitogén aktivitása .

Az alábbiakban ismertetjük a leírásban szereplő szekvenciák listáját.

A SZEKVENCIÁK JEGYZÉKE (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ:

(i) BENYÚJTÓ: Amgen Inc.

(ii) A TALÁLMÁNY CÍME: Keratinocita növekedési faktor analógok (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 60 (iv) LEVELEZÉSI CÍM:

(A) CÍMZETT: Amgen Inc.

(B) UTCA: 1840 DeHavilland Drive (C) VÁROS: Thousand Oaks (D) ÁLLAM: Kalifornia (E) ORSZÁG: USA (v) SZÁMÍTÓGÉPES FORMA:

(A)	A HORDOZÓ	TÍPUSA:	FLOPPY LEMEZ
(B)	SZÁMÍTÓGÉP: IBM PC	KOMPATIBILIS
(C)	OPERÁCIÓS	RENDSZER	: PC-DOS/MS-DOS
(D)	PROGRAM:	PATENTIN	RELEASE #1.0, VERSION #1.30

(vi) A JELENLEGI BENYÚJTÁS ADATAI:

(A) A BENYÚJTÁS SORSZÁMA: PCT/US95/13075 (B) A BENYÚJTÁS IDŐPONTJA: 1995. október 12.

(C) OSZTÁLYOZÁS:

(vii) A KORÁBBI BENYÚJTÁS ADATAI:

(A) A BENYÚJTÁS SORSZÁMA: US 08/487,825 (B) A BENYÚJTÁS IDŐPONTJA: 1995. június 7. (vii) A KORÁBBI BENYÚJTÁS ADATAI:

(A) A BENYÚJTÁS SORSZÁMA: US 08/323,337 (B) A BENYÚJTÁS IDŐPONTJA: 1994. október 13.

« · • ·*·· *··· (viii) ÜGYVIVŐ/ÜGYNÖK INFORMÁCIÓ:

(A)

NÉV: Zindrick, Thomas D.

(B) (C)

REGISZTRÁCIÓS SZÁM: 32,185

REFERENCIA/LAJSTROMSZÁM: A-316B

1. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 862 bázispár (B) Típus:nukleinsav (C) Száltípus:ismeretlen (D) Topológia:ismeretlen (ii) A molekula típusa:cDNS (xi) A szekvencia leírása: 1. számú szekvencia

CAATCTACAA TTCACAGATA GGAAGAGGTC AATGACCTAG GAGTAACAAT CAACTCAAGA 60

TTCATTTTCA TTATGTTATT CATGAACACC CGGAGCACTA CACTATAATG CACAAATGGA 120

TACTGACATG GATCCTGCCA ACTTTGCTCT ACAGATCATG CTTTCACATT ATCTGTCTAG 180

TGGGTACTAT ATCTTTAGCT TGCAATGACA TGACTCCAGA GCAAATGGCT ACAAATGTGA 240

ACTGTTCCAG CCCTGAGCGA CACACAAGAA GTTATGATTA CATGGAAGGA GGGGATATAA 300

GAGTGAGAAG ACTCTTCTGT CGAACACAGT GGTACCTGAG GATCGATAAA AGAGGCAAAG 360

TAAAAGGGAC CCAAGAGATG AAGAATAATT ACAATATCAT GGAAATCAGG ACAGTGGCAG 420

TTGGAATTGT GGCAATCAAA GGGGTGGAAA GTGAATTCTA TCTTGCAATG AACAAGGAAG 480

GAAAACTCTA TGCAAAGAAA GAATGCAATG AAGATTGTAA CTTCAAAGAA CTAATTCTGG 540

AAAACCATTA CAACACATAT GCATCAGCTA AATGGACACA CAACGGAGGG GAAATGTTTG 600

TTGCCTTAAA TCAAAAGGGG ATTCCTGTAA GAGGAAAAAA AACGAAGAAA GAACAAAAAA 660

CAGCCCACTT TCTTCCTATG GCAATAACTT AATTGCATAT GGTATATAAA GAACCCAGTT 720

CCAGCAGGGA GATTTCTTTA AGTGGACTGT TTTCTTTCTT CTCAAAATTT TCTTTCCTTT 780

TATTTTTTAG TAATCAAGAA AGGCTGGAAA AACTACTGAA AAACTGATCA AGCTGGACTT 840

GTGCATTTAT GTTTGTTTTA AG

862 ·**» ·*»# * ·

2. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 194 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 2. számú szekvencia

Met His Lys Trp Ile Leu Thr Trp Ile Leu Pro Thr Leu Leu Tyr Arg

10 15

Ser Cys Phe His Ile Ile Cys Leu Val Gly Thr Ile Ser Leu Ala Cys

25 30

Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Val Asn Cys Ser Ser

40 45

Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile

55 60

Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp 65 70 75 80

Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn 85 90 95

Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly

100 105 110

Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr

115

120

125

Alá

Lys 130

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu 135

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys 140

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Alá

Ser

Alá

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

145

150

155

160

Gly

Glu

Met

Phe

Val

Alá

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly

165

170

175

Lys

Thr

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Alá

His

Phe

Leu

Pro

Met

Alá

180

185

190

Ile

Thr

3

. számú sz

ekvenciavázlat

(i) A szekvencia jellemzői:

(A)	Hossz: 595	bázispár
(B)	Típus: nukleinsav
(C)	Száltípus:	ismeretlen
(D)	Topológia:	ismeretlen

(ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 3. számú szekvencia

ATCGATTTGA	TTCTAGAAGG	AGGAATAACA	TATGAAAAAG	CGCGCACGTG	CTATCGCCAT	60
TGCTGTGGCT	CTGGCAGGTT	TCGCAACTAG	TGCACACGCG	TGCAATGACA	TGACTCCAGA	120
GCAAATGGCT	ACAAATGTGA	ACTGTTCCAG	CCCTGAGCGA	CACACAAGAA	GTTATGATTA	180
CATGGAAGGA	GGGGATATAA	GAGTGAGAAG	ACTCTTCTGT	CGAACACAGT	GGTACCTGAG	240
GATCGATAAA	AGAGGCAAAG	TAAAAGGGAC	CCAAGAGATG	AAGAATAATT	ACAATATCAT	300
GGAAATCAGG	ACAGTGGCAG	TTGGAATTGT	GGCAATCAAA	GGGGTGGAAA	GTGAATTCTA	360
TCTTGCAATG	AACAAGGAAG	GAAAACTCTA	TGCAAAGAAA	GAATGCAATG	AAGATTGTAA	420
CTTCAAAGAA	CTAATTCTGG	AAAACCATTA	CAACACATAT	GCATCAGCTA	AATGGACACA	480
CAACGGAGGG	GAAATGTTTG	TTGCCTTAAA	TCAAAAGGGG	ATTCCTGTAA	GAGGAAAAAA	540

AACGAAGAAA GAACAAAAAA CAGCCCACTT TCTTCCTATG GCAATAACTT AATAG

595 i

í

4. számú szekvenciavázlat j

I (i) A szekvencia jellemzői: | í

(A) Hossz: 186 aminosav | i

(B) Típus: aminosav ' (C) Száltípus: ismeretien [ (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 4. számú szekvencia

Met Lys Lys Arg Alá Arg Alá Ile Alá Ile Alá Val Alá Leu Alá Gly

10 15

Phe Alá Thr Ser Alá His Alá Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met

25 30

Alá Thr Asn Val Asn Cys Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr

40 45

Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg

55 60

Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr 65 70 75 80

Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Alá

90 95

Val Gly Ile Val Alá Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Alá

100 105 110

Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Alá Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp

115 120 125 «·ί.

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile Leu

Glu

Asn

His Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

130

135

140

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn Gly

Gly

Glu

Met Phe

Val

Ala

Leu

Asn

145

150

155

160

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg Gly

Lys

Thr Lys

Lys

Glu

Gin

Lys

165

170

175

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met Ala

Ile

Thr

180

185

5

. számú sz

ekvenciavázlat

(i) A szekvencia jellemzői:

(A)	Hossz: 499	bázispár
(B)	Típus: nukleinsav
(C)	Száltípus:	ismeretlen
(D)	Topológia:	ismeretlen

(ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 5. számú szekvencia

TATGTGCAAT	GACATGACTC	CAGAGCAAAT	GGCTACAAAT	GTGAACTGTT	CCAGCCCTGA	60
GCGACACACA	AGAAGTTATG	ATTACATGGA	AGGAGGGGAT	ATAAGAGTGA	GAAGACTCTT	120
CTGTCGAACA	CAGTGGTACC	TGAGGATCGA	TAAAAGAGGC	AAAGTAAAAG	GGACCCAAGA	180
GATGAAGAAT	AATTACAATA	TCATGGAAAT	CAGGACAGTG	GCAGTTGGAA	TTGTGGCAAT	240
CAAAGGGGTG	GAAAGTGAAT	TCTATCTTGC	AATGAACAAG	GAAGGAAAAC	TCTATGCAAA	300
GAAAGAATGC	AATGAAGATT	GTAACTTCAA	AGAACTAATT	CTGGAAAACC	ATTACAACAC	360
ATATGCATCA	GCTAAATGGA	CACACAACGG	AGGGGAAATG	TTTGTTGCCT	TAAATCAAAA	420
GGGGATTCCT	GTAAGAGGAA	AAAAAACGAA	GAAAGAACAA	AAAACAGCCC	ACTTTCTTCC	480

TATGGCAATA ACTTAATAG

499 • » • ••fc ·*»·-

	56
6. számú szekvenciavázlat
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 164 aminosav
(B) Típus: aminosav
(C) Száltípus: ismeretlen
(D) Topológia: ismeretlen
(ii) A molekula típusa: fehérje
(xi) A szekvencia leírása: 6. számú szekvencia
Met Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin	Met Ala Thr Asn Val Asn Cys
1 5	10 15
Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser	Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly
20 25	30
Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys	Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg
35 40	45
Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly	Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn
50 55	60
Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val	Ala Val Gly Ile Val Ala Ile
65 70	75 80
Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu	Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys
85	90 95
Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu	Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu
100 105	110
Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr	Ala Ser Ala Lys Trp Thr His

115

120

125 ⁵⁷ I

Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Alá Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val f $

130 135 140 | i

<

i i

Arg Gly Lya Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Alá His Phe Leu Pro

145 150 155 160 j

Met Alá Ile Thr

7. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 25 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 7. számú szekvencia

CAATGACCTA GGAGTAACAA TCAAC 25

8. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 26 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 8. számú szekvencia

AAAACAAACA TAAATGCACA AGTCCA

• ·

9. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 26 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 9. számú szekvencia

ACAACGCGTG CAATGACATG ACTCCA 26

10. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 31 bázíspár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 10. számú szekvencia

ACAGGATCCT ATTAAGTTAT TGCCATAGGA A 31

11. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 27 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 11. számú szekvencia I i

ACACATATGT GCAATGACAT GACTCCA 27 <

i f

í

j.

12. számú szekvenciavázlat í (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 37 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 12. számú szekvencia

CTGCGTATCG ACAAACGCGG CAAAGTCAAG GGCACCC 37

13. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 44 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 13. számú szekvencia

AAGAGATGAA AAACAACTAC AATATTATGG AAATCCGTAC TGTT

14. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 37 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 14. számú szekvencia

GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT GAATCTG 37

15. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 45 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 15. számú szekvencia

TCTTGGGTGC CCTTGACTTT GCCGCGTTTG TCGATACGCA GGTAC 45 í

I ι

i i

16. számú szekvenciaváziat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 45 bázíspár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS a

f (xi) A szekvencia leírása: 16. számú szekvencia

ACAGCAACAG TACGGATTTC CATAATATTG TAGTTGTTTT TCATC 45 (i) (Ü) (xi)

AATTCAGATT

17. számú szekvenciavázlat

A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 36 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen A molekula típusa: cDNS

A szekvencia leírása: 17. számú szekvenc

CAACACCTTT GATTGCAACG ATACCA ia

18. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 20 bázíspár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 18. számú szekvencia

AGTTTTGATC TAGAAGGAGG • · ^: **·: :

• · · *·· · • ···· « · · ·

19. számú szekvenciavázlat ?

i (i) A szekvencia jellemzői: ) (

(A) Hossz: 20 bázispár j (

(B) Típus: nukleinsav ι (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 19. számú szekvencia

TCAAAACTGG ATCCTATTAA 20

20. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 91 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS· (xi) A szekvencia leírása: 20. számú szekvencia

AGTTTTGATC TAGAAGGAGG AATAACATAT GTGCAACGAC ATGACTCCGG AACAGATGGC 60

TACCAACGTT AACTGCTCCA GCCCGGAACG T 91

21. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 90 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS • · ···· »·· · ···· (xi) A szekvencia leírása: 21. számú szekvencia ( i

CACACCCGTA GCTACGACTA CATGGAAGGT GGTGACATCC GTGTTCGTCG TCTGTTCTGC 60 f i

CGTACCCAGT GGTACCTGCG TATCGACAAA 90 ?

22. számú szekvenciavázlat (i) (ü) (xi)

CGTGGTAAAG

ACTGTTGCTG

A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 90 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen A molekula típusa: cDNS

A szekvencia leírása: 22. számú szekvencia

TTAAAGGTAC CCAGGAAATG AAAAACAACT ACAACATCAT GGAAATCCGT

TTGGTATCGT TGCAATCAAA

23. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(ii) (xi)

GGTGTTGAAT

GAATGCAACG (A) Hossz: 90 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen A molekula típusa: cDNS

A szekvencia leírása: 23. számú szekvencia

CTGAATTCTA CCTGGCAATG AACAAAGAAG GTAAACTGTA CGCAAAAAAA

AAGACTGCAA CTTCAAAGAA

24. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 90 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 24. számú szekvencia

CTGATCCGGG AAAACCACTA CAACACCTAC GCATCTGCTA AATGGACCCA CAACGGTGGT 60

GAAATGTTCG TTGCTCTGAA CCAGAAAGGT 90

25. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 88 bázíspár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 25. számú szekvencia

ATCCCGGTTC GTGGTAAAAA AACCAAAAAA GAACAGAAAA CCGCTCACTT CCTGCCGATG 60

GCAATCACTT AATAGGATCC AGTTTTGA 99

26. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen ···· « •··· ···* számú szekvencia (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 26.

TACGGGTGTG ACGTTCCGGG

27. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 27. számú szekvencia

CTTTACCACG TTTGTCGATA 20

28. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(Ά) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 28. számú szekvencia

ATTCAACACC TTTGATTC-CA

0 * » · · · • 66

29. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 29. számú szekvencia

CCAGGATCAG TTCTTTGAAG 20

30. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) Ά szekvencia leírása: 30. számú szekvencia

GAACCGGGAT ACCTTTCTGG 20

31. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 495 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS ·· · ·

(xi) A szekvencia leírása: 31. számú szekvencia

ATGTGCAATG	ATATGACTCC	TGAACAAATG	GCTACCAATG	TCAACTGTTC	CTCTCCGGAG	60
CGCCACACCC	GGAGTTACGA	TTACATGGAA	GGTGGGGATA	TTCGCGTACG	TCGTCTGTTC	120
TGCCGTACCC	AGTGGTACCT	GCGTATCGAC	AAACGCGGCA	AAGTCAAGGG	CACCCAAGAG	180
ATGAAAAACA	ACTACAATAT	TATGGAAATC	CGTACTGTTG	CTGTTGGTAT	CGTTGCAATC	240
AAAGGTGTTG	AATCTGAATT	CTATCTTGCA	ATGAACAAGG	AAGGAAAACT	CTATGCAAAG	300
AAAGAATGCA	ATGAAGATTG	TAACTTCAAA	GAACTAATTC	TGGAAAACCA	TTACAACACA	360
TATGCATCTG	CTAAATGGAC	CCACAACGGT	GGTGAAATGT	TCGTTGCTCT	GAACCAGAAA	420
GGTATCCCTG	TTCAAGGTAA	GAAAACCAAG	AAAGAACAGA	AAACCGCTCA	CTTCCTGCCG	480
ATGGCAATCA	CTTAA					495

32. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A)	Hossz: 164	aminosav
(B)	Típus : aminosav
(C)	Száltípus:	ismeretlen
(D)	Topológia:	ismeretlen

(ii) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 32. számú szekvencia

Met Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Alá Thr Asn Val Asn Cys

10 15

Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly

25 30

Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg

40 45

Ile Asp Lyz Arg Gly Lys Val..Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn

55 60

Tyr Aan Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Alá Val Gly Ile Val Alá Ile

70 75 80

Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Alá Met Asn Lys Glu Gly Lys

90 95

Leu Tyr Alá Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu

100 105 110

Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Alá Ser Alá Lys Trp Thr His

115 120 125

Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Alá Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val

130 135 140

Gin Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Alá His Phe Leu Pro

145 150 155 160

Met Alá Ile Thr

33. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 495 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 33. számú szekvencia

ATGTCTAATG ATATGACTCC GGAACAGATG GCTACCAACG TTAACTCCTC CTCCCCC-GAA 60

CGTCACACGC GTTCCTACGA CTACATGGAA GGTGGTGACA TCCGCGTACG TCGTCTGTTC 120

TGCCGTACCC AGTC-GTACCT GCGTATCGAC AAACGCGGCA AAGTCAAGGG CACCCAAGAG 180 • 3

ATGAAAAACA	ACTACAATAT	TATGGAAATC	CGTACTGTTG	CTGTTGGTAT
AAAGGTGTTG	AATCTGAATT	CTATCTTGCA	ATGAACAAGG	AAGGAAAACT
AAAGAATGCA	ATGAAGATTG	TAACTTCAAA	GAACTAATTC	TGGAAAACCA
TATGCATCTG	CTAAATGGAC	CCACAACGGT	GGTGAAATGT	TCGTTGCTCT
GGTATCCCTG	TTGAAGGTAA	GAAAACCAAG	AAAGAACAGA	AAACCGCTGA
ATGGCAATCA	CTTAA

CGTTGCAATC	2	40
CTATGCAAAG	3	00
TTACAACACA	3	60
GAACCAGAAA	4	20
C1 TCCTGCcij	4	80
	4	95

34. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A)	Hossz: 164	aminosav
(B)	Típus: aminosav
(C)	S záltípus:	ismeretlen
(D)	Topológia:	ismeretlen

(ii) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 34. számú szekvencia

Met Ser Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Alá Thr Asn Val Asn Ser

10 15

Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly

25 30

Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg

40 45

Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn

55 60

Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Alá Val Gly Ile Val Alá Ile

70 75 80

....... · • · · · · • · · *. i , ····· ·· ···· · ·«

Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys

90 95

Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu

100 105 110

Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His

115 120 125

Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val

130 135 140

Glu Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro

145 150 155 160

Met Ala Ile The

35. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A)	Hossz: 495	bázispár
(B)	Típus: nukleinsav
(C)	Száltípus:	ismeretlen
(D)	Topológia:	ismeretlen

(ü) (xi)

ATGTCTAATG

CGTCACACGC

TGCCGTACCC

ATGAAAAACA

AAAGGTGTTG

A molekula

A szekvencia

ATATGACTCC

GTTCCTACGA

AGTGGTACCT

ACTACAATAT

AATCTGAATT típusa:

cDNS leírása: 35.

GGAACAGATG

CTACATGGAA

GCGTATCGAC

TATGGAAATC

CTATCTTGCA számú szekvencia

GCTACCAACG

GGTGGTGACA

AAACGCGGCA

CGTACTGTTG

ATGAACAAGG

TTAACTCCTC

TCCGCGTACG

AAGTCAAGGG

CTGTTGGTAT

AAGGAAAACT

CT.CCCCGGAA

TCGTCTGTTC

CACCCAAGAG

CGTTGCAATC

CTATGCAAAG

AAAGAATGCA ATGAAGATTG TAACTTCAAA GAACTAATTC TGGAAAACCA TTACAACACA 360

·· · ·

TATGCATCTG CTAAATGGAC CCACAACGGT GGTGAAATGT TCGTTGCTCT GAACCAGAAA 420

GGTATCCCTG TTCAAGGTAA GAAAACCAAG AAAGAACAGA AAACCGCTCA CTTCCTGCCG 480

ATGGCAATCA CTTAA 495

36. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 164 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltipus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (íi) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 36. számú szekvencia

Met Ser Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Alá Thr Asn Val Asn Ser

5 10 15

Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly

25 30

Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg

40 45

Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn

55 60

Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Alá Val Gly Ile Val Alá Ile

70 75 80

Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Alá Met Asn Lys Glu Gly Lys 85 90 95

• · ·· • · · · • ·*·· ····

Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu

100 105 110

Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His

115 120 125

Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val

130 135 140

Gin Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro

145 150 155 160

Met Ala Ile Thr

37. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 426 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 37. számú szekvencia

ATGTCCTACG	ACTACATGGA	AGGTGGTGAC	ATCCGCGTAC	GTCGTCTGTT	CTGCCGTACC	60
CAGTGGTACC	TGCGTATCGA	CAAACC-CGGC	AAAGTCAAGG	GCACCCAAGA	GATGAAAAAC	120
AACTACAATA	TTATGGAAAT	CCGTACTGTT	GCTGTTGGTA	TCGTTGCAAT	CAAAGGTGTT	180
GAATCTGAAT	TCTATCTTGC	AATGAACAAG	GAAGGAAAAC	TCTATGCAAA	GAAAGAATGC	240
AATGAAGATT	GTAACTTCAA	AGAACTAATT	CTGGAAAACC	ATTACAACAC	ATATGGATCT	300
GCTAAATGGA	CCCACAACGG	TGGTGAAATG	TTCGTTGCTC	TGAACCAGAA	AGGTATCCCT	360
GTTCAAGGTA	AGAAAACCAA	GAAAGAACAG	AAAACCGCTC	ACTTCCTGCC	GATGGCAATC	420

ACTTAA ··· · · • ·

38. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 141 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 38. számú szekvencia

Met 1

Ser

Tyr

Asp

Tyr 5

Met

Glu

Gly

Asp 10

Ile

Arg

Val

Arg

Arg 15

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Me t

Lys

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

T 1 _Q

Arg

35

40

45

Thr

Val

Alá

Val

Gly

Ile

Val

Alá

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55-

60

Tyr

Leu

Alá

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Alá

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Alá

Ser

Alá

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Glu

Met

Phe

Val

100 105 110 ·· · · « • ·

Als

Leu

Asn 115

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro 120

Val

Gin

Gly

Lys

Lys 125

Glu

Gin

Lys

Thr

Alá

His

Phe

Leu

Pro

Met

Alá

Ile

Thr

130

135

140

39. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 24 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 39. számú szekvencia

GAGCTCACTA GTGTCGACCT GCAG 24

40. számú szekvenciavázlat (í) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 24 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 40. számú szekvencia

CTGCAGGTCG ACACTAGTGA GCTC

41. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 426 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 41. számú szekvencia

ATGTCCTACG	ACTACATGGA	AGGTGGTGAC	ATCCC-CGTAC	GTCGTCTGTT	CTGCCGTACC	60
CAGTGGTACC	TGCGTATCGA	CAAACGCGGC	AAAGTCAAGG	GCACCCAAGA	GATGAAAAAC	120
AACTACAATA	TTATGGAAAT	CCGTACTGTT	GCTGTTGGTA	TCGTTGCAAT	CAAAGGTGTT	180
GAATCTGAAT	TCTACCTGGC	AATGAACAAA	GAAGGTAAAC	TGTACGCAAA	AAAAGAATGC	240
AACGAAGACT	GCAACTTCAxA	AGAACTGATC	CTGGAAAACC	ACTACAACAC	CTACGCATCT	300
GCTAAATGGA	CCCACAACGG	TGGTGAAATG	TTCGTTGCTC	TGGAACAGAA	AGGTATCCCT	360
GTTCGTGGTA	AGAAAACCAA	GAAAGAACAG	AAAACCGCTC	AGTTCüfGCC	GATGGCAATC	42 0

ACTTAA ' 426

42. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 141 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 42. számú szekvencia

Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu

5 10 15

Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val

Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu He Arg

40 45

Thr Val Alá Val Gly Ile Val Alá Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe

55 60

Tyr Leu Alá Met Asn Lys Giu Gly Lys Leu Tyr Alá Lys Lys Glu Cys

70 75 80

Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn

90 95

Thr Tyr Alá Ser Alá Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val

100 105 110

Alá Leu Giu Gin Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys

115 120 125

Glu Gin Lys Thr Alá His Phe Leu Pro Met Alá Ile Thr

130 135 140

43. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 426 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 43. számú szekvencia

ATGTCCTACG	ACTACATGGA	AGGTGGTGAC	ATCCGCGTAC	GTCGTCTGTT	CTGCCGTACC	60
CAGTGGTACC	TGCGTATCGA	CAAACGCGGC	AAAGTCAAGG	GCACCCAAGA	GATGAAAAAC	120
AACTACAATA	TTATGGAAAT	CCGTACTGTT	GCTGTTGGTA	TCGTTGCAAT	CAAAGGTGTT	180
GAATCTGAAT	TCTACCTGGC	AATGAACAAA	GAAGGTAAAC	TGTACGCAAA	AAAAGAATGC	240
AACGAAGACT	GCAACTTCAA	AGAACTGATC	CTGGAAAACC	ACTACAACAC	CTACGCATCT	300
GCTAAATGGA	CCCACAACGG	TGGTGAAATG	TTCGTTGCTC	TGAACCAGGA	AGGTATCCCT	3 60
GTTCGTGGTA	AGAAAACCAA	GAAAGAACAG	AAAACCGCTC	ACTTCCTGCC	GATGGCAATC	420
ACTTAA						426

44. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 141 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: fehérj .(xi) A szekvencia leírása: 44. számú szekvencia

Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu

10 15

Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val

25 30

Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg

40 45 Thr Val Alá Val Gly Ile Val Alá Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe

Tyr Leu Alá Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Alá Lys Lys Glu Cys

70 75 80

Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn

90 95

Thr Tyr Alá Ser Alá Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val

100 105 110

Alá Leu Asn Gin Glu Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys

115 120 125

Glu Gin Lys Thr Alá His Phe Leu Pro Met Alá Ile Thr

130 135 140

45. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A)	Hossz: 426	bázispár
(B)	Típus: nukleinsav
(C)	Száltípus:	ismeretlen
(D)	Topológia:	ismeretlen

(ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 45. számú szekvencia

ATGTCCTACG	ACTACATGGA	AGGTGGTGAC	ATCCGCGTAC	GTCGTCTGTT	CTGCCGTACC	60
CAGTGGTACC	TGCGTATCGA	CAAACGCGGC	AAAGTCAAGG	GCACCCAAGA	GATGAAAAAC	120
AACTACAATA	TTATGGAAAT	CCGTACTGTT	GCTGTTGGTA	TCGTTGCAAT	CAAAGGTGTT	180
GAATCTGAAT	TCTACCTGGC	AATGAACAAA	GAAGGTAAAC	TGTACGCAAA	AAAAGAATGC	240
AACGAAGACT	GCAACTTCAA	AGAACTGATC	CTGGAAAACC	ACTACAACAC	CTACGCATCT	300
GCTAAATGGA	CCCACAACGG	TGGTGAAATG	TTCGTTGCTC	TGAACCAGCA	AGGTATCCCT	360
GTTCGTGGTA	AGAAAACCAA	GAAAGAACAG	AAAACCGCTC	ACTTCCTGCC	GATGGCAATC	420

ACTTAA

426 tt»·

46. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 141 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 46. számú szekvencia

Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly

5

Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu

Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn

5 4 0

Thr Val Alá Val Gly Ile Val Alá

55

Tyr Leu Alá Met Asn Lys Glu Gly

70

Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu

Thr Tyr Alá Ser Alá Lys Trp Thr

Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu

15

Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val

30

Asn Tyr Asn Ile Met Glu He Arg

Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe

Lys Leu Tyr Alá Lys Lys Glu Cys

80

Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn

95

His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val

100

105

110 • ·»· »··· ··«·

Alá

Leu

Asn 115

Gin

Gly

He

Pro 120

Val

Arg

Gly

Lys

Lys Thr Lys Lys 125

Glu

Gin

Lys

Thr

Alá

His

Phe

Leu

Pro

Met

Alá

Ile

Thr

130

135

140

47. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 426 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 47. számú szekvencia

ATGTCCTACG	ACTACATGGA	AGGTGGTGAC	ATCCGCGTAC	GTCGTCTGTT	CTGCCGTACC	60
CAGTGGTACC	TGGGTATCGA	CAAALGCoGC	AAAGTCAAGG	GCACCCAAGA	GATGAAAAAC	120
AACTACAATA	TTATGGAAAT	CCGTACTGTT	GCTGTTGGTA	TCGTTGCAAT	CAAAGGTGTT	180
GAATCTGAAT	TCTACCTGGC	AATGAACAAA	GAAGGTAAAC	TGTACGCAAA	AAAAGAATGC	240
AACGAAGACT	GCAACTTCAA	AGAACTGATC	CTGGAAAACC	ACTACAACAC	CTACGCATCT	300
GCTAAATGGA	CCCACAACC-G	TGGTGAAATG	TTCGTTGCTC	TGAACCAGAA	AGGTATCCCT	360
GTTGCTGGTA	AGAAAACCAA	GAAAGAACAG	AAAACCGCTC	ACTTCCTGCC	GATGGCAATC	420

ACTTAA 426

48. számú szekvencíaváziat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 141 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: fehérje ··· · · •' · · · · * • ·· »···· » ···· · · ···· ···· ···· · ·· ’ 81 (xi) A szekvencia leírása: 48. számú szekvencia

Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu

10 15

Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val

25 30

Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg

40 45

Thr Val Alá Val Gly Ile Val Alá ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe

55 60

Tyr Leu Alá Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Alá Lys Lys Glu Cys

70 75 80

Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn

90 95

Thr Tyr Alá Ser Alá Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val

100 105 110

Alá Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val Alá Gly Lys Lys Thr Lys Lys

115 120 125

Glu Gin Lys Thr Alá His Phe Leu Pro Met Alá Ile Thr

130

135

140

49. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 426 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 49. számú szekvencia

ATGTCCTACG	ACTACATGC-A	AGGTGGTGAC	ATCCGCGTAC	GTCGTCTGTT	CTGCCGTACC	60
CAGTGGTACC	TGCGTATCGA	CAAACGCGGC	AAAGTCAAGG	GCACCCAAGA	GATGAAAAAc	120
AACTACAATA	TTATGGAAAT	CCGTACTGTT	GCTGTTGGTA	TCGTTGCAAT	CAAAGGTGTT	18 0
GAATCTGAAT	TCTACCTGGC	AATGAACAAA	GAAGGTAAAC	TGTACGCAAA	AAAAGAATGC	2 4 0
AACGAAGACT	GCAACTTCAA	AGAACTGATC	CTGGAAAACC	ACTACAACAC	CTACGCATCT	30 0
GCTAAATGGA	CCCACAACGG	TGGTGAAATG	TTCGTTGCTC	TGAACCAGAA	AGGTATCCCT	3 60
GTTCTGGGTA	AGAAAACCAA	GAAAGAACAG	AAAACCGCTC	ACTTCCTGCC	GATGGCAATC	4 2 0

ACTTAA 426

50. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 141 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 50. számú szekvencia

Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu

10 15

Phe Cys Arg Thr

Gin Trp Tyr

Leu Arg

Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val ·« · ·· · · ····

Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg

40 45

Thr Val Alá Val Gly Ile Val Alá Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe

55 60

Tyr Leu Alá Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Alá Lys Lys Glu Cys

70 75 80

Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn

90 95

Thr Tyr Alá Ser Alá Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val 100 105 110

Alá Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val Leu Gly Lys Lys Thr Lys Lys

115 120 125

Glu Gin Lys Thr Alá His Phe Leu Pro Met Alá Ile Thr

130 135 140

51. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A)	Hossz:	425 bázispár
(B)	Típus:	nukleinsav
(C)	Száltípus:	ismeretlen
(D)	Topológia:	ismeretlen

(ii) A molekula típusa: cDNS ·»· ·

Λ. · * k · · · · · !· · . »··· ·*·· (xi) A szekvencia leírása: 51. számú szekvencia

ATGTCCTACG	ACTACATGGA	AGGTGGTGAC	ATCCGCGTAC	C-TCGTCTGTT	CTGCCGTACC	60
CAGTGGTACC	TGCGTATCGA	CAAACGCGGC	AAAGTCAAGG	C-CACCCAAGA	GATGAAAAAC	120
AACTACAATA	TTATGGAAAT	CCGTACTGTT	GCTGTTGGTA	TCGTTGCAAT	CAAAGGTGTT	180
GAATCTGAAT	TCTACCTGGC	AATGAACAAA	GAAGGTAAAC	TGTACGCAAA	AAAAGAATGC	240
AACGAAGACT	GCAACTTCAA	AGAACTGATC	CTGGAAAACC	ACTACAACAC	CTACGCATCT	300
GCTAAATGGA	CCCACAACGG	TGGTGAAATG	TTCGTTGCTC	TGAACCAGAA	AGGTATTCCT	360
GTTCGTGGTA	AGGAAACCAA	GAAAGAACAG	AAAACCGCTC	ACTTCCTGCC	GATGGCAATC	420
ACTTAA						426

52. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 141 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 52. számú szekvencia

Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu

Phe Cys Arg Thr Glr. Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val

25 30

Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg

40 45

Thr Val Alá Val Gly Ile Val Alá Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe

Tyr

Leu

Alá

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Alá

Lys

Glu

Cys

65

70

7 5

80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Alá

Ser

Alá

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Glu

Met

Phe

Val

100

105

110

Alá

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

I le

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Glu

Thr

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Lys

Thr

Alá

His

Phe

Leu

Pro

Met

Alá

Ile

Thr

130

1 3 5

140

LT,

3. s

z ámú s

zekvenciavázlat

(i) A szekvencia jellemzői:

(A)	Hossz: 426	bázispár
(B)	Típus : nukleinsav
(C)	Száltípus:	ismeretlen
(D)	Topológia:	ismeretlen

(ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 53. számú szekvencia

ATGTCCTACG	ACTACATGGA	AGGTGGTGAC	ATCCGCGTAC	GTCGTCTGTT	CTGCCGTACC	60
CAGTGGTACC	TGCGTATCGA	CAAACGCGGC	AAAGTCAAGG	GCACCCAAGA	GATGAAAAAC	120
AACTACAATA	TTATGGAAAT	CCGTACTGTT	GCTGTTGGTA	TCGTTGCAAT	CAAAGGTGTT	180
GAATCTGAAT	TCTACCTGGC	AATGAACAAA	GAAGGTAAAC	TGTACGCAAA	AAAAGAATGC	240
AACGAAGACT	GCAACTTCAA	AGAACTGATC	CTGGAAAACC	ACTACAACAC	CTACGCATCT	300
GCTAAATGGA	CCCACAACGG	TGGTGAAATG	TTCGTTGCTC	TGAACCAGAA	AGGTATCCCT	360
GTTCGTGGTA	AGCAAACCAA	GAAAGAACAG	AAAACCGCTC	ACTTCCTGCC	GATGGCAATC	420

ACTTAA

426 ···» » · • · * ♦ · * · «··« ···· ··<« · ** * * ‘ 86

54. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 141 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 54. számú szekvencia

Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu

5 10 15

Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val

25 30

Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg

40 45

Thr Val Alá Val Gly Ile Val Alá Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe

55 60

Tyr Leu Alá Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Alá Lys Lys Glu Cys

70 75 80

Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn

90 95

Thr Tyr Alá Ser Alá Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val

100 105 110

Alá Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Gin Thr Lys Lys

115

120

125 . · ···« ««··

Glu Gin Lys Thr Alá His Phe Leu Pro Met Alá Ile Thr

130 135 140

55. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(Ά) Hossz: 426 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 55. számú sze :kvencia

ATGTCCTACG	ACTACATGGA	AGGTGGTGAC	ATCCGCGTAC	GTCGTCTGTT	CTGCCGTACC	60
CAGTGGTACC	TGCGTATCGA	CAAACGCGGC	AAAGTCAAGG	GCACCCAAGA	GATGAAAAAC	12 0
AACTACAATA	TTATGGAAAT	CCGTACTGTT	GCTGTTGGTA	TCGTTGCAAT	CAAAGGTGTT	180
GAATCTGAAT	TCTACCTGGC	AATGAACAAA	GAAGGTAAAC	TGTACGCAAA	AAAAGAATGC	240
AACGAAGACT	GCAACTTCAA	AGAACTGATC	CTGGAAAACC	ACTACAACAC	CTACGCATCT	30 0
GCTAAATGGA	CCCACAACGG	TGGTGAAATG	TTCGTTGCTC	TGAACCAGAA	AGGTATCCCT	360
GTTCGTGGTA	AGAAAACCAA	GAAAGAACAG	GAAACCGCTC	ACTTCCTGCC	GATGGCAATC	420

ACTTAA 426

56. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A)	Hossz: 141	aminosav
(B)	Típus: aminosav
(C)	Száltípus:	ismeretlen
(D)	Topológia:	ismeretlen

(ii) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 55. számú szekvencia

Met 1 Phe

Ser Cys

Tyr Arg

Asp Thr 20

Tyr 5 Gin

Met Trp

Glu Tyr

Gly Leu

Gly Arg 25

Asp 10 Ile

Ile Asp

Arg Lys

Val Arg

Arg Gly 30

Arg 15 Lys

Leu Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Me t

Lys

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

35

40

45

Thr

Val

Alá

Val

Gly

Ile

Val

Alá

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Alá

Me t

Asn

Lys

G1 u

G1 y

Lys

Leu

Tyr

Alá

Lys

Glu

Cys

6 5

70

75

8 0

Asn

Glu

Asp

C y s

Asn

Phe

Lj y s

G1 u

Leu

I le

L 3 ii

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

8 5

90

95

Thr

Tyr

Alá

Ser

Alá

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Glu

Met

Phe

Val

100

105

110

Alá

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Thr

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Glu

Thr

Alá

His

Phe

Leu

Pro

Met

Alá

Ile

Thr

130

135

140

57. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 426 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 57. számú szekvencia

ATGTCCTACG	ACTACATGGA	AGGTGGTGAC	ATCCGCGTAC	GTCGTCTGTT	CTGCCGTACC	60
CAGTGGTACC	TGCGTATCGA	CAAACGCGGC	AAAGTCAAGG	GCACCCAAGA	GATGAAAAAC	12 0
AACTACAATA	TTATGGAAAT	CCGTACTGTT	GCTGTTGGTA	TCGTTGCAAT	CAAAGGTGTT	180
GAATCTGAAT	TCTACCTGGC	AATGAACAAA	GAAGGTAAAC	TGTACGCAAA	AAAAGAATGC	240
AACGAAGACT	GCAACTTCAA	AGAACTGATC	CTGGAAAACC	ACTACAACAC	CTACGCATCT	300
GCTAAATGGA	CCCACAACGG	TGGTGAAATG	TTCGTTGCTC	TGAACCAGAA	AGGTATCCCT	360
G í i. CG i G G i A	AGAAAACCAA	GAAAGAACAG	CAAACCGCTC	ACTTCCTGCC	GATGGCAATC	420

ACTTAA 426

58. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 141 aminosav (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 58. számú szekvencia

Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu

5 10 15

Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val

Lys

Gly

Thr 35

Gin

Glu

Met

Lys

Asn 40

Asn

Tyr

As n

Ile

Met 45

Glu

Ile

Arg

Thr

Val

Alá

Val

Gly

Ile

Val

Alá

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Alá

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Alá

Lys

Glu

Cys

65

70

75

8 0

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Alá

Ser

Alá

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Glu

Met

Phe

Val

1 0 0

105

110

Alá

Leu

A s n

Gin

Lys

Gly

Γ ] g

Pro

Val

Arg

G -1 y

Lys

Thr

Lys

115

120

125

G1 u

Gin

Thr

Alá

His

Phe

Leu

Pro

Met

Alá

Ile

Thr

130 135 140

59. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 426 bázispár
(B)	Típus: nukleinsav
(C)	S záltípus:	ismeretlen
(D)	Topológia:	ismeretlen

(ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 59. számú szekvencia

ATGTCCTACG	ACTACATGGA	AGGTGGTGAC	ATCCGCGTAC	GTCGTCTGTT	CTGCCC-TACC	60
CAGTGGTACC	TGCGTATCGA	CAAACGCGGC	AAAGTCAAGG	GCACCCAAGA	GATGAAAAAC	120
AACTACAATA	TTATGGAAAT	CCGTACTGTT	GCTGTTGGTA	TCGTTGCAAT	CAAAGGTGTT	180
GAATCTGAAT	TCTACCTGGC	AATGAACAAA	GAAGGTAAAC	TGTACGCAAA	AAAAGAATGC	240
AACGAAGACT	GCAACTTCAA	AGAACTGATC	CTGGAAAACC	ACTACAACAC	CTACGCATCT	30C
GCTAAATGGA	CCCACAACGG	TGGTGAAATG	TTCGTTGCTC	TGAACCAGAA	AGGTATCCCT	3 60
GTTCGTGGTA	AGAAAACCAA	GAAAGAAGAG	GAAACCGCTC	ACTTCCTGCC	GATGGCAATC	42 0
ACTTAA						4 2 6

60. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A)	Hossz: 141	aminosav
(B)	Típus: aminosav
(C)	S záltípus:	ismeretlen
(D)	Topológia:	ismeretlen

(ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 60. számú szekvencia

Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu

10 15

Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val

25 30

Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn He Met Glu ile Arg

40 45

Thr Val Alá Val Gly Ile Val Alá Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe • « ···· ···· * ···· ···· ’ 92

Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys

70 75 80

Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn

90 95

Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val

100 105 110

Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys

115 120 125

Glu Glu Glu Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr

Claims

1. A természetes KGF-nek egy polipeptid analógja, amelyben töltésváltozást hozunk létre, azáltal, hogy a 2. ábrán látható 41-154-es aminosavai közül (a 2. számú szekvencia

72-185-ös aminosavai) egyet vagy többet kicserélünk

2. Az 1. igénypont szerinti polipeptid analóg, amelyben a kivágott vagy helyettesített aminosavakat a következő csoportból választjuk: Arg , Gin , Lys , Lys , Lys , Asn ,

Gin , Lys , Arg , Lys , Gin , Lys es Thr

3. Az 1 . igénypont szerinti polipeptid analóg, amit a következő csoportból választhatunk: R(144)Q, C(1,15)S/R(144)Ε, C(í,15)S/R(144)Q és AN23/R(144)Q.

4. Gyógyászati készítmény, amely terápiásán hatásos mennyiséget tartalmaz az 1. igénypont szerinti polipeptid analógból, valamint tartalmaz egy gyógyászatilag elfogadható hordozót.

5. Gyógyászati készítmény, amely terápiásán hatásos mennyiséget tartalmaz az 1. igénypont szerinti liofilezett polipeptid analógból.

6. A 4. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amely tartalmaz még egy gyógyászatilag elfogadható hordozót is.

7. Egy nukleinsav molekula, ami lehet DNS és RNS is, amely nukleinsav molekula a természetes KGF-nek egy olyan polipeptíd analógját kódolja, amelyben töltésváltozás történik, azáltal, hogy a 2. ábrán látható 41-154-es aminosav csoportok ·*· (72-185-ös aminosavak a 2. számú szekvencián) közül egyet vagy többet kivágunk vagy helyettesítünk.

8. A 7. igénypont szerinti nukleinsav molekula, amelynél a kivágott vagy helyettesített aminosavat a következő csoportból választjuk: Arg , Gin , Lys , Lys , Lys , Asn , Gin ,

Lys¹³⁹, Arg¹⁴⁴, Lys¹⁴⁷, Gln^lji, Lys¹⁵³ és Thr¹⁵⁴.

9. A 7. igénypont szerinti nukleinsav molekula, amelynél a polipeptid analógot az alábbi csoportból választjuk: R(144)Q,

C(1,15)S/R(144)Q, C(1,15)S/R(144)E és ΔΝ23/R(144)Q.

10. Egy biológiailag működőképes plazmid vagy virális vektor, amely a 7. igénypont szerinti nukleinsav molekulát tartalmaz .

11. Egy prokarióta vagy eukarióta gazdasejt, amely stabilan transzformálva vagy transzfektálva van egy, a 8. igénypont szerinti, biológiailag működőképes vektorral.

12. A 11. igénypont szerinti prokarióta gazdasejt, ami

Escherichía coli.

13. A 11. igénypont szerinti eukarióta gazdasejt, ami egy emlős sejt.

14. A 12. igénypont szerinti eukarióta gazdasejt, ami egy aranyhörcsög petefészeksejt.

15. Eljárás egy KGF polipeptid analógjának előállítására azzal jellemezve, hogy egy, a 7. igénypont szerinti nukleinsav molekulával stabilan transzformált eukarióta vagy prokarióta gazdasejtet megfelelő körülmények között szaporítunk, oly módon, hogy a kódolt polipeptid analóg expresszálódjon, majd izoláljuk az így előállított polipeptid analógot.

• ·

16. Eljárás nem-fibroblaszt epiteliális sejtek termelődésének serkentésére, azzal jellemezve, hogy ezeket a sejteket érintkezésbe hozzuk egy 1. igénypont szerinti KGF polipeptid analóg hatásos mennyiségével.