HU220641B1 - Keratinocita növekedési faktor alkalmazása - Google Patents
Keratinocita növekedési faktor alkalmazása Download PDFInfo
- Publication number
- HU220641B1 HU220641B1 HU9502800A HU9502800A HU220641B1 HU 220641 B1 HU220641 B1 HU 220641B1 HU 9502800 A HU9502800 A HU 9502800A HU 9502800 A HU9502800 A HU 9502800A HU 220641 B1 HU220641 B1 HU 220641B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- kgf
- cells
- liver
- use according
- treatment
- Prior art date
Links
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 title claims abstract description 165
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 title claims description 159
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 60
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 46
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims abstract description 29
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims abstract description 27
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 20
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 5
- 210000004043 pneumocyte Anatomy 0.000 claims description 16
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 10
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 claims description 10
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims description 9
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 6
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 claims description 5
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 claims description 5
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 claims description 5
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 5
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 claims description 4
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 4
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 claims description 4
- 208000024963 hair loss Diseases 0.000 claims description 4
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 3
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 claims description 3
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 claims description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 claims description 3
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 claims description 3
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims description 2
- 208000007788 Acute Liver Failure Diseases 0.000 claims description 2
- 206010000804 Acute hepatic failure Diseases 0.000 claims description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 2
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 claims description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 claims description 2
- 208000000203 Hyaline Membrane Disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000032571 Infant acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010028974 Neonatal respiratory distress syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 claims description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 claims description 2
- 231100000836 acute liver failure Toxicity 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 2
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 claims description 2
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 2
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 claims description 2
- 201000002652 newborn respiratory distress syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 claims description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 claims description 2
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 claims description 2
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 claims 1
- 206010063655 Erosive oesophagitis Diseases 0.000 claims 1
- 208000007882 Gastritis Diseases 0.000 claims 1
- 206010017865 Gastritis erosive Diseases 0.000 claims 1
- 101001060261 Homo sapiens Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 claims 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 claims 1
- 208000021063 Respiratory fume inhalation disease Diseases 0.000 claims 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 claims 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 claims 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 claims 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 claims 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 claims 1
- 208000021302 gastroesophageal reflux disease Diseases 0.000 claims 1
- 102000057239 human FGF7 Human genes 0.000 claims 1
- 210000001533 respiratory mucosa Anatomy 0.000 claims 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 21
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 abstract description 16
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 abstract description 16
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 14
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 abstract description 9
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 8
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 abstract description 6
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 4
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 abstract 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 36
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 29
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 29
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 25
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 16
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 15
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 14
- 230000002390 hyperplastic effect Effects 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 210000002821 alveolar epithelial cell Anatomy 0.000 description 11
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 description 10
- 210000001732 sebaceous gland Anatomy 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 9
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 9
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 9
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 8
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 8
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 6
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 6
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 5
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 5
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000037309 reepithelialization Effects 0.000 description 5
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 5
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 4
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 4
- 230000001120 cytoprotective effect Effects 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 4
- 108010029560 keratinocyte growth factor receptor Proteins 0.000 description 4
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 4
- 230000003843 mucus production Effects 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N Oil red O Chemical compound Cc1ccc(C)c(c1)N=Nc1cc(C)c(cc1C)N=Nc1c(O)ccc2ccccc12 NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 3
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 3
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 206010072170 Skin wound Diseases 0.000 description 3
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 210000004378 sebocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000000106 sweat gland Anatomy 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 2
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 2
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000000424 bronchial epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 2
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 2
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 2
- 238000012735 histological processing Methods 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 2
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 238000012753 partial hepatectomy Methods 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxomolybdenum Chemical compound O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.OP(O)(O)=O DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000011555 rabbit model Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 210000004761 scalp Anatomy 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000013222 sprague-dawley male rat Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000008964 Chemical and Drug Induced Liver Injury Diseases 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010057573 Chronic hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 208000010334 End Stage Liver Disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 206010014989 Epidermolysis bullosa Diseases 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 208000004852 Lung Injury Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 206010040943 Skin Ulcer Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 206010069363 Traumatic lung injury Diseases 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical group [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 206010068168 androgenetic alopecia Diseases 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000069 breast epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229950005499 carbon tetrachloride Drugs 0.000 description 1
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000011444 chronic liver failure Diseases 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 description 1
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000002183 duodenal effect Effects 0.000 description 1
- 208000000718 duodenal ulcer Diseases 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 210000003890 endocrine cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000005081 epithelial layer Anatomy 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 230000007967 glucose restriction Effects 0.000 description 1
- 230000007773 growth pattern Effects 0.000 description 1
- BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N halothane Chemical compound FC(F)(F)C(Cl)Br BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003132 halothane Drugs 0.000 description 1
- 210000000514 hepatopancreas Anatomy 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 238000011694 lewis rat Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 231100000515 lung injury Toxicity 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229960005489 paracetamol Drugs 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000036573 scar formation Effects 0.000 description 1
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 1
- 210000002374 sebum Anatomy 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 230000008591 skin barrier function Effects 0.000 description 1
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 1
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 1
- 230000036560 skin regeneration Effects 0.000 description 1
- 231100000019 skin ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 210000000437 stratum spinosum Anatomy 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000012762 unpaired Student’s t-test Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 239000003357 wound healing promoting agent Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
A jelen találmány tárgya a keratinocitanövekedési faktor (KGF)alkalmazása a keratinocitáktól eltérő sejtek szaporodásának,növekedésének és differenciálódásának serkentésére, valamint a KGFalkalmazása olyan betegeknél, akiknél ezek a biológiai hatásokhasznosak a sérült vagy megbetegedett sejtek és szövetekregenerálásában. ŕ
Description
A jelen találmány tárgya a keratinocitanövekedési faktor (KGF) alkalmazása a keratinocitáktól eltérő sejtek szaporodásának, növekedésének és differenciálódásának serkentésére, valamint a KGF alkalmazása olyan betegeknél, akiknél ezek a biológiai hatások hasznosak a sérült vagy megbetegedett sejtek és szövetek regenerálásában.
Az utóbbi években a biotechnológia fejlődése rekombináns polipeptidek kifejlesztéséhez vezetett, beleértve az eritropoietint és a granulocitastimuláló faktort is és ennek számos beteg élvezte az előnyét. Azóta egyre nagyobb számú más polipeptidet fedeztek fel, amelyek in vitro biológiai aktivitást mutatnak. Azonban lényeges, hogy jellemezzük ezeknek a faktoroknak a célsejtjeit és a faktorok in vivő biológiai hatásait, hogy be tudjuk határolni a potenciális alkalmazási lehetőségeiket emberekben.
A KGF egy ismert mitogén, amelyet korábban úgy azonosítottak, hogy az epiteliális sejtekre, főleg a keratinocitákra specifikus [Rubin és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86, 802-806 (1989); Finch és munkatársai: Science 245, 752-755 (1989); Marchese és munkatársai: J. Cell. Phys. 144, 326-332 (1990)]. A KGF hírvivő RNSének expresszióját kimutatták számos sztromális fibroblaszt sejtvonalban, amelyek embrionális, újszülött és felnőtt humánforrásból származnak, valamint normális felnőttvesékből és gasztrointesztinális traktusokból származó RNS-kivonatokban is. Ilyen RNS-t nem mutattak ki gliasejtekből, tüdőből, agyból, valamint számos különböző epiteliális sejtvonalból, amelyek közé tartoznak a pikkelysejt-karcinómák, emlő epiteliális sejtek, immortalizált hörgő epiteliális sejtek, immortalizált keratinociták és primer keratinocitatenyészetek [Finch és munkatársai: Science 245, 752-755 (1989)]. A KGF azonban mitogenikusan aktív a folytonos egérsejtvonalban, a BALB/MK sejtekben [Weissman és Aaronson: Cell 32, 599 (1983); Rubin és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86, 802-806 (1989); Finch és munkatársai: Science 245, 752-755 (1989)]. Ez a megfigyelés alátámasztja azokat a bizonyítékokat, amelyek a KGF-nek a bőrre gyakorolt parakrin hatását jelzik, azzal, hogy KGF termelődik a dermiszben (de nem termelődik az epidermiszben), és hatással van a keratinocitákra.
Emellett, a keratin- és filagringének expressziójának alkalmazásával kimutatták, hogy a KGF befolyásolja a keratinociták differenciálódását és érését [Marchese és munkatársai: J. Cell. Phys. 144, 326-332 (1990)].
Az előzőkben említett, a KGF biológiai aktivitására vonatkozó munkák legnagyobb részét rekombináns KGF-fel végezték, ami ennek a faktornak sokkal szélesebb körű tanulmányozását tette lehetővé. A publikált WO 90/08771 számú PCT szabadalmi bejelentésben leírják a KGF tisztítását humán embrionális fibroblaszt sejtvonal kondicionált tápközegéből, az izolált polipeptid aminosavszekvenciájának részleges meghatározását, a gén klónozását és bakteriális sejtekben (Escherichia coli) való expresszálását, biológiailag aktív rekombináns KGF előállítása céljából.
Miközben a KGF-nek a keratinociták in vitro stimuláló ágenseként játszott szerepét világosan tisztázták, sok minden maradt ismeretlen a KGF-nek mint növekedési faktornak a szerepét illetően, beleértve azokat a további sejttípusokat, amelyek megcélozhatok vele, és a KGF-nek az ilyen sejtekre gyakorolt in vivő hatását. Ez az információ létfontosságú a KGF mint terápiás ágens teljes potenciáljának megértéséhez.
A jelen találmány tárgyát képezik a KGF-nek a nem keratinocita epiteliális sejtekre gyakorolt serkentő hatásával kapcsolatos felfedezések. Még pontosabban, kiderült, hogy az in vivő használt KGF a normális függelékstruktúrákban, mint például a faggyúsejtekben, hajtüszősejtekben, májsejtekben, mint például hepatocitákban, és a légzőszervi nyálkás epitélium sejtjeiben, mint például a ΙΙ-es típusú pneumocitákban serkenti a szaporodást. Emellett arra is van bizonyíték, hogy a KGF serkenti a belső nyálka sejtjeinek szaporodását és növekedését, azaz például a mucintermelő falósejtekét a mirigyes gyomorban és vékonybélben, a vastagbél tüszősejtjeiben, valamint a bélrendszer egyéb epiteliális sejtjeiben.
Ezek a felfedezések, amelyek a jelen találmány alapját képezik, jelentős hatással vannak abból a szempontból, hogy lehetővé teszik a KGF alkalmazását olyan szövetekre, amelyeket ezeknek a sejttípusoknak a sérülése vagy hiányossága jellemez. Az alábbiakban azoknak a betegségeknek és orvosi állapotoknak a leírását adjuk meg, amelyeket a találmány szerint KGF-fel lehet kezelni.
A fuggelékstruktúrák, mint például a hajtüszők, izzadságmirigyek és faggyúmirigyek szaporodásának és differenciálódásának serkentése kritikus jelentőségű az epidermisz és dermisz regenerálódása szempontjából, olyan betegeknél, akik égési sérüléseket szenvedtek, valamint egyéb részleges vagy teljes mélységű sérüléseket. Jelenleg a felszíni sérülések heg képződésével és keratinocita felszínre kerülésével gyógyulnak; a bőr teljes regenerálása jelenleg nem lehetséges. A hajtüszők, izzadságmirigyek, faggyúmirigyek jelenleg nem képződnek újra teljes mélységű bőrsérülések, beleértve az égést is, esetében. A KGF alkalmazása lehetővé teheti ezt az újraképződést.
Az Epidermolysis bullosa egy olyan betegség, amely abban nyilvánul meg, hogy az epidermisz nem képes az alatta levő dermiszhez tapadni, ennek eredménye az, hogy gyakran nyitott, fájdalmas hólyagok keletkeznek, amelyek súlyos megbetegedéseket okozhatnak. Ezeknek a lézióknak a felgyorsított reepitelizáció, azaz például a KGF-fel való kezelés, a fertőzés kisebb kockázatát, csökkent fájdalmat eredményezhet, valamint kevesebbet kell a sebet kezelni.
Kemoterápiával indukált hajhullás akkor jön létre, ha betegeket rákos megbetegedések esetén kemoterápiás kezeléseknek vetnek alá. Jelenleg nincsenek olyan gyógyszerek, amelyek képesek megakadályozni a szőrtüszők pusztulását, ami az ideiglenes hajvesztést okozza. A KGF-fel ezt meg lehet akadályozni.
A férfias típusú kopaszodás elterjedt és lényegében kezelhetetlen. A férfiak és nők progresszív hajvesztése
HU 220 641 Β1 súlyos kozmetikai probléma. Ezt az állapotot KGF-fel lehet kezelni, akár szisztémásán, akár topikálisan alkalmazva, ha a gyógyszer alkalmazható és felszívódik a fejbőrön keresztül, vagy a fejbőrbe való permetinjekcióval, légpisztolyt vagy hasonló technológiát alkalmazva.
A gyomorfekélyek, jóllehet H2 antagonistákkal kezelhetők, jelentős számú megbetegedést okoznak, gyakran újra felbukkannak, és a gyógyulás során a nyálkahártyán var képződik. Az a képesség, hogy a mirigyes nyálka gyorsabban gyógyul, jelentős terápiás fejlődést jelent a gyomorfekélyek gyógyulásában.
A nyombélfekélyek, csakúgy mint a gyomorfekélyek, kezelhetők, de jelentős előrelépést jelentene egy olyan terápiás hatóanyag kifejlesztése, amely elősegíti a nyombél nyálkahártyájának teljesebb és gyorsabb regenerálódását. Emellett előnyös lenne egy olyan gyógyászati hatóanyag, amely regenerálva gyógyítja ezeket a fekélyeket és csökkenti előfordulásuk gyakoriságát. A KGF rendelkezik ezzel a potenciállal.
A gyulladásos bélpanaszok, azaz például a Crohnféle betegség (amely elsődlegesen a vékonybelet érinti) és a fekélyes kolítisz (amely elsődlegesen a vastagbelet érinti), ismeretlen eredetű krónikus megbetegedések, amelyek a nyálkás felület roncsolódását, gyulladást, sebhely (var) és tapadás kialakulását eredményezik a helyreállítódás során, valamint gyakori megbetegedést okoz az érintett egyedeknek. Egy olyan hatóanyag, mint például a KGF, amely serkenti a nyálkás felület újrakialakulását, előnyös lehet a betegség előrehaladásának gátlásában.
A béltoxicitás az egyik fő korlátozó tényező a besugárzásos és kemoterápiás kezelések során. A KGF-fel való előkezelésnek lehet citoprotektív hatása a vékonybél nyálkahártyájára, ezáltal lehetővé teszi, hogy az ilyen terápiákból nagyobb dózisokat alkalmazzunk, miközben csökkentjük a béltoxicitás potenciális fatális hatásait.
A KGF kezelésnek megdöbbentő hatása a nyálka termelődésére az emésztőrendszerben. Ez a tulajdonság jól használható lehet arra, hogy megvédjük a bél nyálkáját a lenyelt ártalmas anyagoktól, vagy korlátozzuk a sérülés kiteijedését az olyan megbetegedésekben, mint például a gyulladásos bélmegbetegedések.
Az újszülöttek hialin membrán megbetegedése azt eredményezi, hogy tüdőből hiányzik a ΙΙ-es típusú pneumociták által termelt felületaktív anyag, és ennek az a következménye, hogy a léghólyagok összeesnek. Jóllehet a kortikoszteroidok nagymértékben képesek felgyorsítani a huszonnyolc hetes és annál idősebb magzatokban az érést és a szekréciót, jelenleg nem létezik kezelési mód a fiatalabb magzatokra, aminek jelentős számú megbetegedés és haláleset a következménye ebben a populációban. Egy terápiás ágens, mint például a KGF, amely indukálja a ΙΙ-es típusú pneumociták szaporodását és differenciálódását, komoly előrelépést jelentene ennek a betegségnek a kezelésében.
A füst belégzése jelentős oka a megbetegedésnek és a halálnak az égési sérülést követő héten, a hörgőkben és a léghólyagokban fellépő nekrózis következtében. Egy növekedési faktor, mint például a KGF, amely képes serkenteni ezeknek a struktúráknak a szaporodását és differenciálódását, indukálja a helyreállítódásukat és regenerálódásukat, előnyös lehet belégzéses megbetegedések gyógyításában.
Az emfizéma a léghólyagok progresszív elvesztéséből származik. Egy növekedési faktor, mint például a KGF, amely képes serkenteni az újranövést, illetve a megmaradt léghólyagokra citoprotektív hatással rendelkezik, terápiás előnyökkel rendelkezne. Jelenleg nem áll rendelkezésünkre hatékony kezelés.
A hepatikus cirrózis a virális hepatitis és krónikus alkoholfogyasztás után a legjelentősebb oka a megbetegedéseknek és a haláleseteknek. A hepatociták citoprotekciója, szaporodása és differenciálódása például a KGF hatására, ami a máj működését serkenti, előnyös lehet a cirrózis kifejlődésének lelassításában vagy megakadályozásában .
A heveny májelégtelenség egy életveszélyes állapot, amely végső állapotú cirrózisnál fordul elő. Egy hatóanyag, mint például a KGF, amely képes a megmaradt hepatociták szaporodását beindítani, használható lehet ennek a betegségnek a kezelésében, amit jelenleg egyébként csak májátültetéssel lehet kezelni.
Az akut virális hepatitis gyakran szubklinikus és önmagát korlátozó. Azonban a betegek kisebb részében a súlyos májkárosodás több hét alatt állhat be. Egy citoprotektív hatóanyag, mint például a KGF, jól használható lehet a hepatocelluláris degeneráció megelőzésében.
Az acetaminofen, halotán, szén-tetraklorid és más toxinok által a májnak okozott toxikus károsodások enyhíthetők egy növekedési faktorral (KGF), amelynek citoprotektív hatása van a hepatocitákra.
Ennek megfelelően a találmány tárgyát képezi a KGF alkalmazása (illetve ahol lehetséges, megelőző alkalmazása) az előzőkben említett állapotok kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítása, amelyek a KGF-et megfelelő, gyógyászatilag hatásos mennyiségben tartalmazzák.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.
Az 1. ábrán egy szintetikus oligonukleotid DNS-nukleotidszekvenciája látható, amelyet az alábbiakban ismertetett in vivő kísérletekben használt KGF készítésében alkalmazott expressziós rendszerben használtunk.
A 2. ábrán a nyúlful részleges vastagságú bőrsebmodell látható, amelyet úgy módosítottunk, hogy sebet hozzon létre a porcban, az új szövet növekedésének jobb mérhetősége érdekében.
3. A 3. ábrán a módosított nyúlful részleges vastagságú bőrsebmodellből származó, KGF-fel kezelt és kontrolisebek reepitelizációja látható. A bal oldalon a KGF kezelés utáni regenerálódó epitélium összterülete látható, a jobb oldalon a sebek reepitelizációjának százaléka látható.
A 4. ábrán a bazális és szuprabazális keratinociták szaporodása látható a sebek szélén, öt nappal a KGF kezelés után, a nyúlsebmodellt használva.
Az 5. ábrán a bróm-dezoxi-uridinnal (BrdU) kezelt hajtüszők hisztológiai elemzése látható, KGF-fel kezelt és kontrollsebekből, a módosított nyúlmodellben a sejtszaporodás bemutatására.
HU 220 641 Bl
A 6. ábrán ugyanebből a nyúlmodellből származó, KGF-fel kezelt és kontrolisebek faggyúmirigyeinek olajvörös-0 festési eredményei láthatók.
A 7. és 8. ábrán az alveoláris szeptális epiteliális sejtek mikropapilláris túlnövekedése látható egészséges 5 patkányok tüdejében, amelyeket intratracheálisan KGF-fel kezeltek.
A 9. és 10. ábrán az epiteliális sejtek kuboidális növekedése látható a tüdő nagy szegmentjei léghólyagjaiban, ugyanazon egészséges patkány intratracheális KGF kezelése után.
A 11. és 12. ábrán az látható, hogy a hiperplasztikus alveoláris epiteliális sejtek, amelyek az ilyen kezelt patkányok alveoláris szeptumait tartalmazzák, különböző méretű és alakú lamelláris inklúziókat tartalmaznak.
A 13a. ábrán A KGF kezelés hiperplasztikus hatásai láthatók a hörgőepitéliumban, egészséges patkányok intratracheális kezelése után.
A 13b. ábrán egy egészséges kontroll patkánycsoportból származó hörgő epitélium látható (csak hordozóanyagot kaptak), amely megfelel a 13a. ábra tesztcsoportjának.
A 14. ábrán a KGF receptor (KGFR) RNáz protekciós vizsgálatát láthatjuk felnőtt patkány tüdejében.
A 15. ábrán az emésztőrendszer és a máj dózisfug- 25 gő súlynövekedése látható, négynapos KGF kezelést követően.
A 16. ábrán patkánymájban zajló fehérjeszintézis dózisfüggő fokozódása látható négynapos KGF kezelést követően.
A 17. ábrán a hepatociták fokozott szaporodása látható olyan állatok májában, amelyeket egy-hét napig kezeltünk KGF-fel, a szaporodás mértékét BrdU jelzés alapján (A) vagy mitotikus számlálás alapján (B) megbecsülve.
A 18. és 19. ábrán a májtömeg helyreállítódása látszik KGF kezelést követően, részleges májirtáson átesett állatokban.
A 20. és 21. ábrán az emésztőmirigyek hosszának és a nyálkaképződés mennyiségének fokozódása látható egy-hét napig KGF-fel kezelt patkányok mirigygyomrában.
A 22. ábrán a patkóbél tüszőüreg-meghosszabbodása és a nyálkatermelés fokozódása látható egy-hét napig KGF-fel kezelt patkányok vékonybelében.
A 23. ábrán a hiperplasztikus tüszőüregek fokozódása látható egy-hét napig KGF-fel kezelt patkányok vas10 tagbelében.
A 24. ábrán a vastagbél tüszőüreg-mélységének növekedése látható egy-hét napig KGF-fel kezelt patkányok vastagbelében.
Ahhoz, hogy az epiteliális sejtek olyan speciális típu15 sait azonosítsuk, amelyekben a KGF szignifikáns biológiai hatást fejt ki, jelezve a potenciális terápiás értéket, kiteijedt vizsgálatokat végeztünk élő állatok és in vivő KGF beadás alkalmazásával, az eredményeket megfigyelve és elemezve. Rekombináns KGF-et használtunk 20 mindegyik alábbi kísérletben, amelyet az alábbiak szerint állítottunk elő:
A rekombináns KGF-gént humán előbőrfibroblaszt (AG1523) RNS-ből izoláltuk PCR módszerrel, majd a kapott DNS-t egy pCFM156 expressziós vektorba ligáltuk az Ndel és BamHI restrikciós hasítási helyek közé. A pCFM1156 plazmid a pCFM836 plazmidból származtatható, amelyet a 4,710,473 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetnek (a továbbiakban referenciának tekintjük ezt a leírást), 30 oly módon, hogy a két belső Ndel hasítási helyet elroncsoljuk T4 polimeráz enzimmel feltöltve a végeiket, majd tompavégligálást végzünk és az egyedi Clal és KpnI restrikciós hasítási helyek közötti kis DNS-szekvenciát az alábbi duplex oligonukleotiddal helyettesít35 jük, amely az 1. számú szekvenciát és a 2. számú szekvenciát tartalmazza:
Clal KpnI ’ CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC 3 ’ TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC
A pCFM1156KGF plazmidot azután FM5 gazdasejtekbe (ATCC#53911) klónozzuk, standard elektroporációs transzformációs eljárás alkalmazásával (BioRad Gene Pulser). A megfigyelt belső transzlációs iniciáció csökkentésére a KGF génben a KpnI és EcoRI hasítási helyek közötti DNS-szekvenciát egy olyan szintetikus oligonukleotid DNS-sel helyettesítjük, amelyet úgy terveztünk meg, hogy csökkentse egy belső riboszomális kötőhely felhasználását (1. ábra). Ligálást, valamint FM5 sejtekbe (ATCC#53911) való elektroporációt követően egy kiónt szelektáltunk, amely a pCFM1156KGFdsd-t tartalmazza. A KGF gént kódoló DNS-szekvenciáját szekvenálással igazoljuk. A sejteket azután 30 °Con tenyésztjük tízliteres fermentorokban, standard tápközegben, amely lehetővé teszi, hogy a sejtek exponenciálisan növekedjenek glükózkorlátozás mellett, hogy ezzel megelőzzük a toxikus melléktermékek felhalmozódását.
Az exponenciális fázis közepének megfelelő sejtsűrűségnél a hőmérsékletet rövid időre 42 °C-ra növeljük, hogy ezzel a KGF gén transzkripcióját indukáljuk, majd hozzávetőlegesen 37 °C-on tartjuk a fermentáció KGF indukciós fázisa hátralevő idejére. Kinyerjük a sejttömeget majd lefagyasztva tároljuk. A biológiailag aktív KGF-et mechanikus módszerrel lizált sejttömegből tisztítjuk standard kromatográfiás módszerekkel, amelyek a fehéqe magas izoelektromos pontját (S-Sepharose Fást Flow, Pharmacia) és méretét (Superdex 75, Pharmacia) használják ki. A tisztított rekombináns KGF-fehéqének megmérjük az endotoxin-tartalmát és biológiai aktivitását a Rubin és munkatársai által ismertetett mitogén vizsgálatban [Rubin és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86, 802-806 (1989)].
HU 220 641 Bl
1. példa
Függelékstruktúrák KGF-fel serkentett szaporodása és differenciálódása in vivő sebgyógyulási modellben
Ebben a példában egy módosított nyúlful részleges vastagságú bőrsebmodellt használunk. A Mustoe és munkatársai által ismertetett nyúl-bőrfekélymodellt [Mustoe és munkatársai: J. Clin. Invest. 87, 694-703 (1991)] úgy módosítottuk, hogy a porcon keresztül nyúló seb jöjjön létre a fül hátsó részének dermiszéig, egy 6 mm-es koponyafúrót használva. Ennek eredményeképpen a seb úgy gyógyul, hogy az epiteliális elemek a porc alá saq adnak, és az összehúzódás nem egy változó faktor a sebgyógyulás során, ezáltal lehetővé teszi az új szövetek mennyiségének meghatározását (lásd 2. ábra). Az előzőkben leírt módon előállított rekombináns KGF-et használtunk terápiás sebgyógyító hatóanyagként. Anyagok és módszerek
KGF-et vagy csak foszfáttal puffereit sóoldatot alkalmaztunk egyszer, az operáció napján, majd a sebeket (0,25 cm2) Tegaderm zárókötéssel láttuk el (gyártja a 3M Company, St. Paul, MN). Az állatok leölése előtt mindegyik állat 50 mg/testsúlykilogramm mennyiségben intravénás BrdU injekciót kapott (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI).A BrdU-t azért adtuk be, hogy jobban meg tudjuk állapítani a bazális keratinociták szaporodását, valamint a bazális sejtvándorlás kinetikáját a bőr tüskés rétege és zárórétege irányába. Az állatok leölése után mindegyik sebet kettévágjuk, az egyik felét egy optimális hűtési hőmérsékletű közegben lefagyasztjuk (OCT, Miles Inc., Elkhart, IN), majd a második részt Omnifixben fixáljuk (Al-Con, Genetics, Inc. Melville, NY), és rutin hisztológiai módszerekkel feldolgozzuk. Masson Trichrome, olajvörös-0 és immunhisztokémiai (IHC) festékeket alkalmazunk minden egyes seb 3 pm vastag szekcióira.
A reepitelizáciö mérése
A teljes seblyukat és az epiteliális lyukat minden egyes sebnél megmértük, kalibrált mikrométert alkalmazva. Az egyes sebeknél a reepitelizáciö százalékát úgy számítjuk ki, hogy vesszük a különbséget a teljes lyuk és az epiteliális lyuk között, majd elosztjuk minden egyes sebnél a teljes lyuk méretével. A sebek két szekciójából származó adatokat átlagoljuk. Az epiteliális lyukmérések és a százalékos reepitelizáciö közötti különbségeket egyfarkú, páratlan Student-féle t-teszttel vizsgáljuk.
A kezelt és kezeletlen sebek epitéliuma közötti különbségeket minden egyes dóziscsoportnál kiszámoljuk. Egy egyutas ANOVA és Dunnett-féle t-tesztet futtatunk minden egyes dózisra a kontrollcsoporttal szemben.
Az epiteliális sejtek szaporodásának és differenciálódásának mérése
Paraffinba ágyazott 3 pm-es szövetszekciókat festünk anti-BrdU-val (Dako Corp. Carpinteria, CA), Avidin-Biotin-komplexszel (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA), valamint diamino-benzidin-szubsztráttal (DAB, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). A szekciókat 0,1%-os proteázoldattal emésztjük, majd 1 mol/1 koncentrációjú sósavval kezeljük. Az endogén peroxidázt 3%-os hidrogén-peroxid-oldattal érintkeztetve kioltjuk. A lemezeket normál lószérum foszfáttal puffereit sóoldatban (PBS) készített 10%-os oldatával blokkoljuk, majd anti-BrdU-val inkubáljuk, amit 1:400 arányban hígítottunk 1%-os szarvasmarha-szérumalbuminban. A mosást követően a szekciókat 20 percig inkubáljuk peroxidázhoz kapcsolt Avidin-Biotin-komplexszel, amit 1%-os BSA-ban 1:100 arányban hígítottunk. A lemezeket azután DAB szubsztráttal (10 mg DAB, 20 ml PBS, 20 pl 30%-os hidrogén-peroxid) hozzuk érintkezésbe 10 percre. A szekciókat hematoxilinnel ellenfestjük. BrdU-val kezelt szőrtüszők hisztológiai elemzése
A BrdU beépülését és az IHC festést követően a sebágyankénti tüszők össz-számát meghatározzuk és a Kruskall-Wallis-féle többszörös összehasonlítási tesztben vizsgáljuk. A további elemzés magában foglal egy Chi-négyzet-tesztet a sebek azon százalékára, amelyek minden egyes kezelési csoportban tíz vagy több szaporodó sejtet tartalmazó tüszőkkel rendelkeznek. Emellett minden egyes olyan tüszőben meghatározzuk a BrdU pozitívan festődő sejteket, amelyekben ötnél több szaporodó sejt található.
Olajvörös-O-val festődő faggyúmirigyek
Az olajvörös-O-t, egy semleges lipidekre specifikus festéket használtunk a szebociták és a faggyúmirigyek azonosítására. Az eljárást lefagyasztott metszeteken végezzük, az F. L. Garson által ismertetett eljárást használva [Histotechnology: A Self-Instructional Text; ASCP Press, Chicago (1990)]. Röviden, 7 pm-es lefagyasztott metszeteket levegőn megszárítunk, majd tíz percre cink-formaimban fixáljuk. A lemezeket 0,3 tömeg/térfogat%-os olajvörös-O-ba merítjük (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), majd szobahőmérsékleten 30 percig 60%-os izopropanolban tartjuk, utána 60%os izopropanollal színtelenítjük, és Leamer-féle hematoxilinnel ellenfestjük. Megbecsüljük a faggyúmirigyek méretét és a mirigyenkénti sejtek számát. Eredmények és megbeszélés
A 4-40 pg/cm2 KGF-fel kezelt sebeknél felgyorsult reepitelizáciö és fokozott vastagodás volt megfigyelhető. A kezelés utáni ötödik napon a sebek jelentősen megnövekedett reepitelizációt mutattak, a kontrolihoz viszonyítva (76,7% 52,5%-kal szemben, 1 pg KGF).Az új epitélium vastagsága dózisfüggő módon nő a kezelés utáni ötödik és hetedik napon, a kontroliseb epitéliuma területének közel kétszeresére, 10 pg KGF per seb dózisban (3. ábra).A hisztológiai elemzés azt sugallja, hogy az epiteliális regeneráció főleg úgy jön létre, hogy a dermiszen belüli függelékes elemekből, azaz például a faggyúmirigyekből, izzadságmirigyekből és hajtüszőkből sarjad ki.
A bazáliskeratinocita-szaporodás és a bazális sejtek vándorlásának elemzésével növekvő számú szaporodó bazális keratinocita figyelhető meg a sebek szélénél, a KGF-kezelés első napja után (4. ábra). A KGF-kezelés második napján az epidermisz szuprabazális rétegében levő növekvő számú szaporodó keratinocita azt sugallja, hogy a szaporodó sejtek tranzitideje felgyorsul a stratum spinosum felé. A kezelés ötödik napján a sebek kisebb mértékű szaporodást mutatnak a bazális rétegben, jelezve az epiteliális repair és differenciálódás önkorlátozó felgyorsulását (4. ábra). A keratinociták látha5
HU 220 641 Bl tóan normál érési folyamaton esnek át, amint felfelé vándorolnak, a bőr záróréteg létrehozására.
Váratlanul fokozódó szebocitaszaporodás és differenciálódás, valamint fokozódó szőrtüsző-szaporodás is megfigyelhető. Mind a szőrtüszők mind a faggyúmirigyek nagyobbaknak és számosabbnak tűnnek a KGFfel kezelt sebekben, a kontrolisebekkel összehasonlítva (5. és 6. ábra). Azok a hisztológiai metszetek, amelyeket olajvörös-O-val festettünk, hogy szelektíven azonosítani tudjuk a faggyúmirigyeket, jelentősen megnőtt számú ilyen mirigyet mutatnak, amelyek emellett még jelentősen megnőttek, jelezve a szebociták fokozott szaporodását és differenciálódását faggyútermelő sejtekké. Emellett a szaporodó sejtek számának dózisfuggő növekedése is megfigyelhető KGF-fel kezelt sebekben.
Korábban az epidermális növekedési faktort (EGF) és a bázikusfihroblaszt-növekedési faktort (FGF) is vizsgálták a nyúlfulmodellen [Mustoe és munkatársai: J. Clin. Invest. 87, 694-703 (1991); Pierce és munkatársai: Amer. J. Pathol. 140, 1375-1388 (1992)]. Jóllehet mindkét említett növekedési faktorról ismert, hogy serkenti a reepitelizációt, sem az EGF sem a bázikus FGF nem befolyásolja a fuggelékes struktúrák, azaz a faggyúmirigyek és szőrtüszők szaporodását vagy differenciálódását. A KGF-nek az a képessége, hogy serkenti több különböző epiteliális sejttípus szaporodását és differenciálódását a bőrben, azzal együtt, hogy eredetileg fibroblasztból izolálták, azt sugallja, hogy a KGF egy potens parakrin serkentője a bőr regenerációs folyamatának.
2. példa
In vivő ΙΙ-es típusú pneumociták KGF-fel serkentett szaporodása és differenciálódása
Ezt a példát azért mutatjuk be, hogy értékeljük a KGF-adagolás hatását egészséges patkányok légzőrendszerének epiteliális sejtjeire.
Anyagok és módszerek
200-250 g-os hím Lewis-patkányok egy, különböző dózisú KGF-injekciót kapnak intratekálisan, sóoldatban vagy foszfáttal puffereit sóoldatban, az Ulrich és munkatársai által ismertetett leírás szerint [Amer. J. Pathol. 138, 1485-1496 (1991)]. A KGF-et 0,1,1,0, 5,0 és 10,0 mg/kg dózisban injekciózzuk. A kontrollpatkányok a hordozóból kapnak intratekális injekciót. A KGF-injekció után hat órával, illetve egy, kettő, három, négy, öt és hat nappal a patkányokat levágjuk, a tüdőket feltöltjük Boiun-féle fixatívval egy intratekális katéterrel, a tüdő szagittális metszeteit paraffinba ágyazzuk, majd a hisztológiai szekciókat hematoxilinnel és eozinnal festjük. Eredmények és megbeszélés
0,1 mg/kg dózisú KGF nem okozott hisztológiailag megfigyelhető alveoláris epiteliális sejthiperpláziát. 1,0 mg/kg dózisú KGF gyenge, de meghatározott növekedést okozott az alveoláris epiteliális sejtekben. Fokozódó alveoláris epiteliális sejthiperplázia volt megfigyelhető 5,0 és 10,0 mg/kg dózisban. A KGF nem okozott hisztológiailag megfigyelhető növekedést az alveoláris epiteliális sejtekben hat órával vagy egy nappal az intratekális injekció után. Két nap után az alveoláris szeptális epiteliális sejtek dudoros mikropapilláris túlnövekedése figyelhető meg KGF-fel kezelt patkányok tüdejében (7, és 8, ábra). Három nap elteltével az alveoláris epiteliális sejtek alacsony köbös vagy köbös növekedése figyelhető meg, amely teljes leghólyagokat beborít a tüdő nagy szegmentjeiben (9. és 10. ábra). A tüdő bizonyos területei azonban megtartják a normális hisztológiájukat. A hiperplasztikus alveoláris epitélium hisztológiai megjelenése a patkányban három nap elteltével lényegében ugyanaz, mint a reaktív ΙΙ-es típusú pneumocita hiperplázia megjelenése humán tüdőkben. A hiperplasztikus alveoláris epitélium felismerhető volt, csökkenő mennyiségben, a KGF-fel kezelt patkányok tüdejében az intratekális injekció utáni negyedik és ötödik napon. A hatodik napon a KGF-fel kezelt és kontrollpatkányok tüdeje nem különböztethető meg.
A KGF-fel kezelt patkány tüdejét ultrastrukturálisan vizsgáljuk három nappal az intratekális injekció után. Az alveoláris szeptumokat borító hiperplasztikus alveoláris sejtek majdnem mind tartalmaznak egy vagy több, különböző méretű és formájú lamelláris inklúziót (11. és 12. ábra). A KGF-fel kezelt patkányok hörgőepitéliuma hiperplasztikus volt a harmadik napon, de a hiperplázia nem volt azonnal olyan szembeötlő mint az alveoláris sejthiperplázia. A hiperpláziát úgy lehet felfogni, mint a kisebb disztális hörgők epiteliális borításának pszeudorétegződését, amelyeket normális körülmények között egyetlen epitéliumréteg borít, a hörgőepitélium csomósodásával vagy mikropapilláris növekedésével, és a mitotikus figurák növekedésével a hörgőepitéliumon belül (13a. és 13b. ábrák).
Az intratekálisan adagolt KGF az alveoláris epiteliális sejtek szembeszökő hiperpláziáját okozza. A lamelláris citoplazmatikus inklúziók jelenléte a sejtekben ultrastrukturális szinten konzisztens azzal a feltételezéssel, hogy a hiperplasztikus sejtek ΙΙ-es típusú pneumociták. A lamelláris inklúziók nem tűnnek olyan számosnak vagy olyan ozmofilnek mint azok, amelyeket néhány esetben bemutatnak a ΙΙ-es típusú pneumociták kísérleti hiperpláziája esetében, de nagyon hasonlóak a normál patkánytüdőben bemutatott lamelláris inklúziókhoz. Amellett, hogy alveoláris sejthiperpláziát okoz, a KGF hörgő epiteliális sejthiperpláziát is okoz. Lehetséges, hogy a hiperplasztikus alveoláris epitélium a hörgőepitéliumnak a terminális kishörgőkből való lenövését jelenti a léghólyag parenchymájába. Az azonban valószínűbbnek tűnik, hogy a KGF közvetlenül a ΙΙ-es típusú pneumocitákra hat, a pneumocitáknak az alveoláris szeptumokon mutatott multifokális mikropapilláris saqadzó növekedési mintázata miatt, két nappal a KGF injekció után, ami egy olyan növekedési mintázat, amely megelőzi a léghólyagok köbös sejtekkel való egybefüggő benövését a harmadik napon. Emellett, a ΙΙ-es típusú pneumocitákról azt gondolják, hogy egy mitotikusan reagálni képes alveoláris epiteliális sejtpopuláció, és várható, hogy az az alveoláris sejttípus, amely reagál az alveoláris sejtnövekedés egy potenciális endogén mediátorára, mint például a KGF-re. Végezetül, a lemezes inklúziók azonosítása a hiperplasztikus sejtekben nemcsak azt sugallja, hogy differenciálódnak ΙΙ-es típusú pneumocitákká, hanem azt is, hogy ΙΙ-es típusú pneumocitákból származnak.
HU 220 641 Β1 a kísérletben a KGF receptor hírvivő RNS-szinteket módosított Ambion RNáz protekciós vizsgálattal mutatjuk ki (RPA II, No. 1410).
Az ebben a vizsgálatban használt „antiszensz” RNSpróba szekvenciája az alábbi (3. számú szekvencia):
A KGF-nek a Π-es típusú pneumocitákra gyakorolt serkentő hatása összhangban van azzal a megfigyeléssel, hogy a KGF receptor hírvivő RNS mennyisége a tüdőben, össz-RNS ekvivalens mintájára számítva, kétszerese vagy háromszorosa annak a szintnek, amit fia- 5 tál felnőtt patkányok egyéb szerveiben találtunk. Ebben ’ GAAUACGAAUUCCUUGCUGUUUGGGCAGGACAGUGA GCCAGGCAGACUGGUUGGCCUGCCCUAUAUAAUUGG AGACCUUACAUAUAUAUUCCCCAGCAUCCAUCUCCG UCACAUUGAACAGAGCCAGCACUUCUGCAUUGGAGC
UAUUUAUCCCCGAGUGGAUC
Az antiszensz próbát egy Promega Riboprobe Gemini II kittel (#P2020) készítjük egy linearizált templát DNS-ről, amely az alábbiakban ismertetett, megfelelő 15 DNS-szekvenciát kódolja. Az RNS-próbát egy karbamid-poliakrilamid-gélből tisztítjuk, a megfelelő méretű ’
sávot kivágva és az RNS-próbát Ambion F oldattal eluáljuk.
Az „értelmes” RNS-standard, amely az „antiszensz” próba RNS-szekvenciáját kódolja, az alábbi szekvenciájával rendelkezik (4. számú szekvencia):
’ GGGAGACAAGCUUGCAUGCCUGCAGGUCGACUCUAG AGGAUCCACUCGGGGAUAAAUAGCUCCAAUGCAGAA GUGCUGGCUCUGUUCAAUGUGACGGAGAUGGAUGCU GGGGAAUAUAUAUGUAAGGUCUCCAAUUAUAUAGGG CAGGCCAACCAGUCUGCCUGGCUCACUGUCCUGCCCA AAC AGC AAGG 3’
Az értelmes standardot hidegen készítjük el (radioaktív jelzés nélkül), a Promega Riboprobe Gemini II kitet használva (#P2020), majd G50 Sephadex Quick spin oszlopon tisztítjuk.
A standard Ambion (RPA II #1410) protokollt követve, 50 pg össz-RNS-t inkubálunk 105 cpm próbával, először négy percig 95 °C-on, majd 12-18 óráig 45 °Con. RNázt (1:500 Ambion R oldat) inkubálunk a hibridizációs oldattal 37 °C-on negyven percig, majd inakti váló/kicsapó reagenst adunk hozzá (Dx oldat).
Az RNáz-tól védett fragmenseket azután méret alapján elválasztjuk, karbamid-poliakrilamid gélelektroforézissel, majd a teljes gélt phosphorimager erősítőfóliára visszük. A sávok mennyiségét azután egy Molecular Dynamics Phosphorimager-rel határozzuk meg. Az eredményeket a 14. ábrán mutatjuk be.
A KGF-nek mint a ΙΙ-es típusú pneumociták növekedési faktorának az azonosítása felveti annak a lehetőségét, hogy a KGF terápiás potenciálja hasonló lesz a glükokortikoidokéhoz, a magzati tüdőérés stimulátoraként. A KGF klinikailag hasznos lehet a bronchoalveoláris repair serkentésében, felnőttek tüdősérülése után. A KGF-nek a ΙΙ-es típusú pneumocitákra gyakorolt szaporodási hatása azt sugallja, hogy a KGF fontos szerepet játszhat a felületaktív anyagok szintézisének és szekréciójának szabályozásában.
3. példa
Hepatociták KGF-fel serkentett szaporodása és differenciálódása
A szisztémásán adott KGF-nek a máj epiteliális szöveteire gyakorolt hatását értékeljük.
Anyagok és módszerek
Hím patkányok igény szerint kaptak vizet és élelmet. Mindegyik állat vagy KGF-et vagy PBS-t kapott intraperitonális injekció formájában, naponta, egy, négy vagy hét napig. Mindegyik kísérletben csoportonként legalább öt állatot vizsgálunk.
Mindegyik állatot CO2-vel altatunk el, majd közvetlenül a halál beállta után szívpunkcióval vért veszünk vérkémiai vizsgálatokhoz, és a vizsgálatig lefagyasztva tároljuk. A szérumot standard szérumkémia szerint és az elektrolitok szerint elemezzük. A májat blindelve mérjük, majd a súlyokat 100 gramm testsúlyra számítva adjuk meg grammban (százalékos testsúly). A szövetmintákat 10%-os puffereit formaiinba tesszük, rutin hisztológiai feldolgozás céljából.
A májmetszeteket hematoxilinnel és eozinnal festjük (H és E). A levágás előtt egy órával a patkányok 50 mg/kg BrdU-t kapnak intraperitoneális injekció formájában. Az anti-BrdU immunhisztokémiát úgy hajtjuk végre, hogy láthatóvá tegyük a BrdU beépülését a replikálódó sejtek DNS-ébe.
A máj jelzési indexét (LI) kalibrált objektív rács alkalmazásával határozzuk meg. Állatonként átlagosan tíz mezőt határoztunk meg és átlagoltunk. Megszámoltuk az egységnyi területre jutó összes sejtmagot és jelzett sejtmagot. Azért, hogy standardizáljuk a megszámlált mezőket, mint amelyek a hepatikus parenchyma hasonló területeit képviselik, mindegyik megszámlált mező szomszédos a portális triáddal.
Minden adatot páratlan kétfarkú Student féle Tteszttel vagy egyutas Anova-val vizsgálunk a többszörös csoport-összehasonlításhoz.
Eredmények és megbeszélés
Dózis-hatás vizsgálatot végeztünk a KGF hatékony dózisának azonosítására. A KGF-et naponta injekcióztuk, négy napig, majd a szerveket begyűjtöttük. A máj, a testsúly százalékában kifejezve, csak a legmagasabb dózisban (5 mg/kg) tért el lényegesen a kontrolitól, az
HU 220 641 Bl
ANOVA-val összehasonlítva (15. ábra). Meg kell jegyeznünk, hogy a szérumfehéijék, a koleszterol és a trigliceridek, a máj által szintetizált vegyület mennyisége lényegesen magasabb volt, ha a kontrollal hasonlítjuk össze, mind az 1 mind az 5 mg/kg KGF dózisnál (16. ábra).
Az állatokat egy-, négy- vagy hétnapos, napi 5 mg/kg KGF kezelés után elemezzük. Teljes boncolási vizsgálatoknál a máj lényegesen nagyobb volt a hétnapos időpontban. A máj súlya minden vizsgálati időpontban lényegesen nagyobb volt a KGF-fel kezelt patkányok esetében (hetedik nap, KGF 4,08 ±0,08%, a kontroll pedig 3,49±0,06%, p=0,0003).
A BrdU-pozitív magok mennyiségi vizsgálata három-négyszeres növekedést mutatott a KGF-fel kezelt patkányoknál egynapos kezelésnél, a kontrollokhoz viszonyítva (17. ábra). A mitotikus index, amit a mitotikus figurák per nagy nagyítású mező formájában fejeztünk ki, lényegesen nagyobb volt mint a kontrolloknál egynapos kezelés után, ami összhangban van a BrdU számokkal.
Ezek az eredmények azt igazolják, hogy a KGF-nek erős mitogén és differenciálódási hatása van a májra. A májsúly gyors növekedése egynapos KGF-kezelés után, ami kapcsolódik egy nagyobb mitotikus indexhez és BrdU-pozitív frakcióhoz, igazolja a KGF gyors és erős hatását erre a főleg epiteliális szövetre. Jóllehet a KGF mitotikus hatásai gyorsan eltűnnek, a testsúly százalékában kifejezett májsúly tovább fokozódott a vizsgálat során. A megnövekedett súly főleg a sejtek növekedésének következménye, ami hisztológiailag már az első napon megfigyelhető volt, és megmaradt a kezelés negyedik és hetedik napján is. Mivel a máj tömege a máj regenerálódása során két hétnél rövidebb idő alatt képes több mint a kétszeresére nőni, ezért nem meglepő, hogy jelentős különbség figyelhető meg egynapos kezelés után.
Az albumin megnövekedett szintje nem kapcsolódik semmi egyéb ismert betegséghez, csak a dehidrációhoz. A KGF valószínűleg az albumin (és más fehérjék) nagyobb szérumszintjét okozza, a jelen levő hepatociták nagyobb száma miatt. A KGF által indukált fokozott fehérjeszintézisnek rendkívül előnyös, életmentő hatása lehet olyan betegeknél, akik végállapotú májbetegségben vagy cirrózisban szenvednek.
4. példa
A májsejtek KGF-fel serkentett szaporodása és regenerálódása in vivő, részleges hepatektómiát követően
Ebben a kísérletben hím Sprague-Dawley-patkányokat használunk (300-340 gramm tömegűek) vizsgálati alanyként.
Anyagok és módszerek
Mindegyik patkányt kétharmados, részleges hepatektómiának vetjük alá, Higgins és Anderson módszerét alkalmazva [Higgins és Anderson: Archives of Pathology 12, 186 (1931)]. Az operáció után nyolc órával kezdve, majd utána naponta egyszer a patkányokat szubkután injekciózzuk vagy PBS-sel (kontrollcsoport) vagy KGF-fel 1 mg/kg dózisban. Az operáció után négy, hét, tíz vagy tizennégy nappal a kontroll- és KGF-fel kezelt patkányok súlyát megmérjük, és a patkányokat leöljük.
A megmaradt májakat eltávolítjuk és lemérjük.
Eredmények és megbeszélés
Kiderítettük, hogy a részlegesen hepatektomizált patkányok KGF-fel való kezelése a májtömeg regenerálódásának jelentős felgyorsulását eredményezi, mind abszolút, mind relatív alapon, amint az a 18. és 19. ábrán látható. A KGF-fel kezelt csoport májsúlya hét napon belül visszatért az operáció előtti értékre. Ezzel szemben a kontroll- (KGF-fel nem kezelt) csoportnak sem abszolút sem relatív mértékkel mérve nem regenerálódott a májtömege még tizennégy nap elteltével sem.
5. példa
A KGF enyhítő hatása kémiailag indukált májtoxicitásra
300-340 grammos hím Sprague-Dawley-patkányokat vizsgáltunk azzal a céllal, hogy kiértékeljük a KGF terápiás hatását a májra, egy kémiai toxin bejuttatása után.
Beadás
Tizenkét hím Sprague-Dawley-patkányból álló csoportoknak vagy 1 ml/kg vagy 2 ml/kg szén-tetrakloridot (CC14) adunk kukoricaolaj-hordozóban a nulladik napon. Mindegyik dóziscsoportot két, hat-hat patkányból álló alcsoportra osztjuk. A CC14 beadás után három órával, majd utána folyamatosan naponta, mindegyik alcsoportnak szubkután vagy PBS-t vagy 1 mg/kg/nap KGF-et adunk be. A CC14 beadás után 22, 72, valamint 124 óra elteltével mindegyik patkányból vérmintát veszünk, és a szérum glutamát-oxál-acetát-transzamináz (SGOT) szintjét meghatározzuk.
Eredmények és megbeszélés
Amint az a 20. ábrán látható, a CC14 orális beadása után a KGF szubkután injekciózása jelentősen csökkenti az SGOT enzim vérszérumszintjét, ami a májkárosodás ismert indikátora. A hatás kifejezetten erős 2 ml/kg esetében, a beadás utáni első napon.
6. példa
A bélnyálka epiteliális sejtjeinek KGF-fel serkentett szaporodása és differenciálódása
Ebben a példában a KGF-nek egészséges patkányok bélnyálkájára gyakorolt hatását vizsgáljuk.
Anyagok és módszerek
A hím patkányok tetszés szerinti mennyiségben fogyasztanak vizet és élelmiszert. Mindegyik állat vagy KGF vagy PBS intraperitoneális injekciót kap az első, negyedik vagy hetedik napon. Mindegyik kísérletben legalább öt állatot vizsgálunk csoportonként.
Mindegyik állatot kíméletesen leöljük, CO2 atmoszférában. A fő szerveket leméijük (blindelve) és a súlyokat grammban adjuk meg, 100 gramm testsúlyra számítva (testsúlyszázalék). A belet felosztjuk mirigy nélküli előgyomorra, mirigygyomorra, vékonybélre és vastagbélre. A szövetmintákat 10%-os puffereit formaiinba tesszük a rutin hisztológiai feldolgozáshoz.
Az összes begyűjtött szervből metszetet készítünk, majd hematoxilinnel és eozinnal (H és E) festjük. A le8
HU 220 641 Bl ölés előtt egy órával a patkányoknak 50 mg/kg BrdU-t adunk be intraperitoneális injekció formájában. Az anti-BrdU immunhisztokémiát standard módszerekkel végezzük, hogy láthatóvá tegyük a BrdU beépülését a replikálódó sejtek DNS-ébe. A kiválasztott szöveteket perjód-sav-schiff-el (PÁS), Alcian-kékkel (pH=2,5) és Masson-Trichrome-mal festjük.
Kalibrált mikroszkópszemlencsét használunk a gyomomyálka vastagságának és a gyomomyálka PÁS festődése mélységének mérésére. Hasonlóképpen megméijük a bolyhok hosszát, a béltüszőüregek mélységét a patkóbélben, és a vastagbél-tüszőüregek mélységét a vastagbélben. Ahhoz, hogy mennyiségileg értékeljük a nyálsejtek termelődésében beállt változásokat, a PASpozitív nyálsejteket megszámláljuk a patkóbélvillusok bázisánál kezdve, 10 pm hosszúságban. A bélrendszer minden területén méréseket végeztünk, csak azokon a mirigyeken és a villusokon, amelyek merőlegesek az alattuk levő izmokra. Az eredményeket mikronban rögzítjük, illetve a vékonybélnyálsejtek esetében átlagszám per területegységben. Emellett meghatároztuk a vastagbél egy meghatározott hosszát elfoglaló tüszőüregek számát és a hiperplasztikus (kétágú vagy háromágú) tüszőüregek számát. Állatonként öt-tíz ismételt mérést végzünk, majd átlagoljuk. Minden adatot páratlan kétfarkú Student-féle t-teszttel vagy egyutas ANOVA-val elemeztünk, a többcsoportos összehasonlításhoz (Statview II, Abacus Concepts, Berkeley, CA).
Eredmények és megbeszélés
Dózis-hatás vizsgálatot végeztünk, először azért, hogy a KGF egy hatásos dózisát meghatározzuk. A KGF-et naponta adtuk be, négy napig, majd a szerveket összegyűjtöttük. Kifejezett dózisválaszt a mirigygyomorban, a vékonybélben és a vastagbélben figyeltünk meg (15. ábra).
Az állatokat egy, négy és hétnapos, napi 5 mg/kg dózisú KGF-fel való kezelés után elemeztük. A teljes boncolási vizsgálat szerint az előbél erősen megvastagodott, gyűrődéssel a nyálkánál, négy- és hétnapos kezelésnél. Az előbél, a mirigygyomor, a patkóbél és a vastagbél szignifikánsan megvastagodott négy és hét nap elteltével, de egy nap elteltével nem. Hét nap után a mirigygyomor súlya 0,65±0,01 g volt a KGF-fel kezelt állatokban, és 0,48±0,02 g volt a kontrollállatokban (p=0,0001).
A nem mirigyes előbél súlya szignifikánsan megnövekedett négy- és hétnapos kezelés hatására. Hisztológiailag a nem mirigyes előgyomor pikkelyes epitéliuma enyhén (negyedik nap) - jelentősen (hetedik nap) hiperplasztikus volt a KGF-fel kezelt állatokban. A szaporodó epitélium hirtelen megváltozott az ereknél, a nyelőcső normálpikkelyes epitéliumából a kezelt előbél szaporodó epitéliumává. Egynapos kezelés után a mirigyes gyomomyálka hisztológiailag normálisnak tűnt. A negyedik és hetedik napon megnövekedett számú nyálsejt vált láthatóvá hisztológiailag, olyan sejtek formájában, amelyek tiszta nyitott citoplazmával rendelkeznek. A négy vagy hét napig KGF-fel kezelt állatokban a nyálka vastagsága enyhén megnövekedett (21. ábra). A hetedik napon a nyálka nyaksejtrétege kiszélesedett, és a sávos felszín felé teqeszkedett. A negyedik és hetedik napon végzett PAS-festés meglepő változásokat mutatott a PAS-pozitív (mucintermelő) nyálsejtek számában és méretében. A BrdU-val festett szekciók továbbazonosították ezt a réteget, a mirigygyomorban levő osztódó sejtrétegként, és azt is mutatták, hogy a kezeléssel a szaporodó sejtek száma megnőtt. A gyomomyálka belső felszínén a PAS-pozitív sejtek száma is jelentősen megnőtt, négy- és hétnapos KGFkezelés hatására (21. ábra).
A vizsgált időpontokban a vékonybél nagyjából normális volt. A PAS-festéssel nagyobb számú nyáltermelő nyálsejtet lehetett kimutatni. Ez a különbség jelentős volt a negyedik és hetedik napon (22. ábra). A villusok magassága nem volt különböző egyik időpontban sem, de a tüszőüreg mélysége lényegesen nagyobb volt egy és hét nap elteltével (22. ábra).
A hétnapos kezelési csoportban a vastagbél nyálkája redőkbe fodrozódott, ami jelentősen megnövelte az teljes felszín méretét. A hiperplázia, a kétágú és háromágú vastagbél-tüszőüreg indikátorai megfigyelhetők voltak mindegyik csoportban, beleértve a kontrollokat is, de a legnagyobb számúak és legkifejezettebbek a rövid kezelést kapott csoportokban voltak, azaz az egyés négynapos kezelést követően, és a hiperplasztikus tüszőüregek száma a kezelés hosszának növekedésével csökkent (23. ábra). Ennek megfelelően a vastagbél-tüszőüregek mélysége nőtt a kezeléssel (24. ábra).
A PÁS- és Alcian-kék-festés azt mutatta, hogy a nyálkában a nyálkatermelő nyálsejtek száma megnőtt a vastagbélben, a KGF-kezelést követően. Emellett a belső felszínen az Alcian-kék nyálsejtek száma megnőtt a hetedik napra, mindegyik kezelt állatban. A kezelt állatokban már a negyedik napon jelentősen megnőtt a PAS-pozitív sejtek száma a vastagbél-tüszőüregek felső felében és egyharmadában.
Ezek az eredmények azt igazolják, hogy a KGF-nek jelentős mitogén és differenciáló hatása van az emésztőrendszer epiteliális szöveteiben. Az nyilvánvaló a BrdUjelzésből, hogy a KGF iniciálja a sejtek szaporodását a gyomomyálka nyálnyakrétegében. Ezek a sejtek képezik a mirigygyomor őssejtjeit. Az osztódást követően az ebből a rétegből származó sejtek vagy felfelé vándorolnak, a bélüreg felé, hogy felszíni sejteket hozzanak létre, vagy lefelé, a savós felszín felé, hogy olyan sejtekké váljanak, amelyek elfoglalják a gyomormirigyeket [Toner és munkatársai: Gastrointestinal and Esophageal Pathology, Churchill Livingstone, New York, NY, 13-28 (1989)].A KGF emellett elősegíti a nyálka nyaksejtjeinek szelektív differenciálódását, amelyek felfelé mozognak és nyálsejtekké válnak. A gyomomyálka teljes vastagsága megnő a kezelés negyedik és hetedik napján. Hasonló hatások figyelhetők meg a vékony- és a vastagbélben is. A KGF elősegítette a fokozott sejtszaporodást, aminek az eredménye meghosszabbodott tüszőüregek, az őssejtek serkentése révén. A KGF emellett indukálja az osztódó tüszőüregsejtek differenciálódását, amit a fokozott nyálkatermelés és a nyálsejtek megnőtt száma jellemez a villusokban vagy a tüszőüregekben.
HU 220 641 Bl
Jóllehet a jelen találmányt a specifikus megvalósítási módok és példák segítségével írjuk le, az nyilvánvaló, hogy ezzel a leírással nem szándékozunk korlátozni a találmány oltalmi körét. Tehát például a KGF-nek minden olyan formája, amely lényegében ugyanazok- 5 kai biológiai tulajdonságokkal rendelkezik, mint a természetben előforduló KGF, az ismertetett leírásban alkalmazható. Az ilyen formák közé tartozik a tisztított természetes eredetű KGF, a kémiai módszerekkel szintetizált KGF, és a rekombináns eredetű KGF, amelyet az ismertetettől eltérő expressziós rendszerrel állítunk elő, valamint az analógok variánsok, kimérák stb., amelyek a természetes eredetű aminosavszekvencián alapulnak. Minden ilyen formát fel lehet használni a jelen találmány gyakorlatában.
Amint azt a szakterületen jártas szakemberek el kell hogy ismeijék, számos különböző gazdavektorrendszer használható a KGF-fehéqét kódoló szekvencia expreszszálására. Ezek közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a vírussal (azaz például vakcíniaví- 20 russal, adenovírussal stb.) fertőzött emlőssejtrendszerek; a vírussal (azaz például bakulovírussal) fertőzött rovarsejtrendszerek; a mikroorganizmusok, úgymint az élesztővektort tartalmazó élesztősejtek, vagy baktériumok az Escherichia coli mellett, amelyeket bakteriofág DNS-sel, 25 plazmid DNS-sel vagy kozmid DNS-sel fertőztünk. Ezeknek a vektoroknak az expressziós elemei változó erősségűek és specifitásúak. A használt gazdavektorrendszertől függően a számos megfelelő transzkripciós és transzlációs elem közül bármelyik használható.
Ha egyszer a KGF cDNS expresszió fehérjetermékét izoláltuk, tisztítottuk és vizsgáltuk a KGF aktivitását, az ebben a leírásban ismertetett módszerek, vagy egyéb, a szakterületen jártas szakember számára ismert módszerek alkalmazásával, akkor számos különböző készítményként formulázhatjuk. Tipikus esetekben az ilyen készítmények tartalmaznak egy megfelelő, általában kémiailag definiált hordozót vagy töltőanyagot a terápiás ágenshez (KGF), és a beadás szándékolt módjá10 tói függően más adalék anyagokat is. A készítmény tartalmazhat vizes hordozóanyagokat, vagy lehet szilárd fázisú készítmény, amelyekben a KGF-et nemvizes hordozóba visszük be, azaz például kollagénbe, hialuronsavba és különböző polimerekbe. A készítményt megfe15 lelően formulázhatjuk, hogy számos különböző módon be lehessen adni, beleértve az injekciót, az orális, topikális, intranazális és pulmonáris beadást.
A képzett gyakorló orvos számára nyilvánvaló, a KGF dózisa változhat, a kezelendő betegség és a beadás módjától függően, de hatásos lehet például a 0,01-500 mg/testsúlykilogramm tartományban. Használhatjuk egyszer, de használhatjuk ismételten is, a beteg betegségétől és állapotától függően. Használható egyéb kezelésekkel együtt is, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, más citokineket és növekedési faktorokat, és más gyógyászati készítményeket, amelyeket a bőr, tüdő, máj és emésztőrendszer kezelésére alkalmaznak.
Szekvenciák jegyzéke
1. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hosszúság: 55 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása: 1. számú szekvencia CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC
2. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hosszúság: 49 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása: 2. számú szekvencia CGAATTCCAA CGCGTTACC ATATGTTATT CCTCCTTCTA GAATCAAAT
5. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hosszúság: 164 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása: 3. számú szekvencia GAAUACGAAUUCCUUGCUGUUUGGGCAGGACAGUGA GCCAGGCAGACUGGUUGGCCUGCCCUAUAUAAUUGG AGACCUUACAUAUAUAUUCCCCAGCAUCCAUCUCCG
HU 220 641 BI
UCACAUUGAACAGAGCCAGCACUUCUGCAUUGGAGC
UAUUUAUCCCCGAGUGGAUC
4. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hosszúság: 191 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása: 4. számú szekvencia GGGAGACAAGCUUGCAUGCCUGCAGGUCGACUCUAG AGGAUCCACUCGGGGAUAAAUAGCUCCAAUGCAGAA GUGCUGGCUCUGUUCAAUGUGACGGAGAUGGAUGCU GGGGAAUAUAUAUGUAAGGUCUCCAAUUAUAUAGGG CAGGCCAACCAGUCUGCCUGGCUCACUGUCCUGCCCA AACAGCAAGG
Claims (9)
1. Keratinocitanövekedési faktor (KGF) alkalmazása epiteliális sejtek, így hepatociták, ΙΙ-es típusú pneu- 25 mociták, nyálkatermelő nyálsejtek, valamint egyéb epiteliális sejtek és a bőrben, tüdőben, májban, emésztőrendszerben levő őssejtjeik proliferációját vagy differenciálódását elősegítő terápiás vagy preventív hatású gyógyszerkészítmények előállítására.
2. KGF alkalmazása
a) kemoterápiával indukált szőrhullás,
b) gyomorfekélyek,
c) patkóbélfekély,
d) a gyomor és a nyelőcső erózióinak, előnyösen erozív gasztritisz, ezofagitisz vagy nyelőcsőreflux,
e) gyulladásos bélmegbetegedések,
f) sugárzással vagy kemoterápiával indukált béltoxicitás,
g) hialin membrán betegség,
h) légzőszervi epitélium füst belégzésével okozott nekrózisának,
i) emfízéma,
j) tüdőgyulladás és fibrózis,
k) májcirrózis, 45
m) heveny májelégtelenség,
n) akut vírusos hepatitis vagy
o) a máj toxikus behatásainak kezelésére vagy megelőzésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítására.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás nemvizes hordozóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására.
4. A 3. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a nemvizes hordozóanyag kollagén, hialuronsav vagy karboxi-metil-cellulóz.
30
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, ahol a használt KGF természetben előforduló, kémiai úton szintetizált vagy rekombináns KGF.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti alkal35 mazás, ahol a rekombináns úton előállított KGF a természetben előforduló humán KGF aminosavszekvenciájával rendelkezik.
7. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a rekombináns úton előállított KGF az
40 1. ábra szerinti aminosavszekvenciával rendelkezik.
8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a rekombináns úton előállított KGF baktériumsejtekben, előnyösen E. coliban előállított rekombináns KGF.
9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a gyógyászati készítmény injekció, orális, topikális, intranazális vagy pulmonális adagolásra alkalmas.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US4074293A | 1993-03-26 | 1993-03-26 | |
| PCT/US1994/003208 WO1994023032A1 (en) | 1993-03-26 | 1994-03-24 | Therapeutic uses of keratinocyte growth factor |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9502800D0 HU9502800D0 (en) | 1995-12-28 |
| HUT72711A HUT72711A (en) | 1996-05-28 |
| HU220641B1 true HU220641B1 (hu) | 2002-03-28 |
Family
ID=21912689
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9502800A HU220641B1 (hu) | 1993-03-26 | 1994-03-24 | Keratinocita növekedési faktor alkalmazása |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0619370B1 (hu) |
| JP (1) | JP3578761B2 (hu) |
| KR (1) | KR100390340B1 (hu) |
| CN (1) | CN1064710C (hu) |
| AT (1) | ATE183233T1 (hu) |
| AU (1) | AU707340B2 (hu) |
| CA (1) | CA2159109C (hu) |
| CZ (1) | CZ285996B6 (hu) |
| DE (1) | DE69419958T2 (hu) |
| DK (1) | DK0619370T3 (hu) |
| ES (1) | ES2136673T3 (hu) |
| FI (1) | FI954541A (hu) |
| GR (1) | GR3031509T3 (hu) |
| HU (1) | HU220641B1 (hu) |
| IL (4) | IL137581A (hu) |
| NO (1) | NO953781L (hu) |
| NZ (1) | NZ263967A (hu) |
| RU (1) | RU2146148C1 (hu) |
| SG (1) | SG49841A1 (hu) |
| SI (1) | SI0619370T1 (hu) |
| SK (1) | SK281674B6 (hu) |
| UA (1) | UA46706C2 (hu) |
| WO (1) | WO1994023032A1 (hu) |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AUPN271295A0 (en) * | 1995-05-02 | 1995-05-25 | Gropep Pty Ltd | Method of treatment |
| WO1996011949A2 (en) * | 1994-10-13 | 1996-04-25 | Amgen Inc. | Analogs of keratinocyte growth factor |
| US7232667B2 (en) | 1995-02-14 | 2007-06-19 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 polynucleotides |
| US6693077B1 (en) | 1995-02-14 | 2004-02-17 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 |
| EP0815115B1 (en) * | 1995-02-14 | 2003-05-28 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 |
| US6077692A (en) | 1995-02-14 | 2000-06-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 |
| ES2224178T3 (es) * | 1995-10-11 | 2005-03-01 | Chiron Corporation | Cobinacion de pdgf, kgf,igf e igfbp para la cicatrizacion de heridas. |
| GB9619660D0 (en) * | 1996-09-20 | 1996-11-06 | Scient Hospital Suppl Int Ltd | Prevention of gastrointestinal damage |
| US6743422B1 (en) | 1996-10-15 | 2004-06-01 | Amgen, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 products |
| AU725509B2 (en) * | 1996-10-15 | 2000-10-12 | Biovitrum Ab (Publ) | Uses of keratinocyte growth factor-2 |
| SI0941110T1 (en) * | 1996-10-15 | 2004-06-30 | Amgen Inc. | Uses of keratinocyte growth factor-2 |
| US20010006939A1 (en) * | 1997-10-03 | 2001-07-05 | Ralph W. Niven | Secretory leukocyte protease inhibitor dry powder pharmaceutical compositions |
| US6228839B1 (en) * | 1997-12-19 | 2001-05-08 | Emory University | Use of keratinocyte growth factor to improve oxidative status |
| US6238888B1 (en) | 1997-12-22 | 2001-05-29 | Human Genone Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 formulations |
| US6869927B1 (en) | 1997-12-22 | 2005-03-22 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 formulations |
| EP1054900A4 (en) | 1998-02-13 | 2004-12-22 | Human Genome Sciences Inc | THERAPEUTIC USE OF THE KERATINOCTENT GROWTH FACTOR-2 |
| US6335317B1 (en) | 1998-04-10 | 2002-01-01 | Emory University | Use of gut-trophic growth factors to improve oxidative status |
| ES2240430T3 (es) * | 2000-03-20 | 2005-10-16 | Pfizer Products Inc. | Tratamiento combinado con factor de crecimiento de queratinocitos e inhibidor del factor de crecimiento epidermico. |
| CA2437270A1 (en) * | 2001-02-06 | 2002-08-15 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung | Modified keratinocyte growth factor (kgf) with reduced immunogenicity |
| US7202066B2 (en) | 2002-01-29 | 2007-04-10 | Carrington Laboratories, Inc. | Combination of a growth factor and a protease enzyme |
| CA2580107A1 (en) * | 2004-09-13 | 2006-03-23 | University Of Southampton | Growth factor treatment for asthma |
| CN101822821B (zh) * | 2010-04-27 | 2013-01-23 | 复旦大学附属中山医院 | 角质细胞生长因子-2在制备防治肺损伤的药物中的应用 |
| CN104707164B (zh) * | 2015-03-31 | 2017-01-18 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 | 一种复合壳聚糖水凝胶敷料及其制备方法和应用 |
| CN106226511B (zh) * | 2016-07-28 | 2018-04-06 | 苏州金盟生物技术有限公司 | 一种重组人角质细胞生长因子生物学活性检测方法 |
| CN107753932A (zh) * | 2016-08-22 | 2018-03-06 | 中国辐射防护研究院 | Kgf在制备治疗或预防放射性肠炎药物中的用途 |
| WO2020111047A1 (ja) | 2018-11-27 | 2020-06-04 | 株式会社海月研究所 | 頭皮頭髪用組成物 |
| KR20210114646A (ko) * | 2020-03-11 | 2021-09-24 | (주)메디코스바이오텍 | 성장인자를 함유하는 탈모 치료 또는 모발 성장 촉진용 조성물 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1016716A3 (en) * | 1989-01-31 | 2000-07-12 | RUBIN, Jeffrey S | Dna encoding a growth factor specific for epithelial cells |
| JPH04224522A (ja) * | 1990-04-27 | 1992-08-13 | Merck & Co Inc | 繊維芽細胞増殖因子含有組成物による禿頭症の治療又は予防方法 |
| WO1992014480A1 (en) * | 1991-02-22 | 1992-09-03 | Amgen Inc. | Use of gm-csf and g-csf to promote accelerated wound healing |
-
1994
- 1994-03-24 UA UA95104698A patent/UA46706C2/uk unknown
- 1994-03-24 KR KR1019950704154A patent/KR100390340B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-03-24 SK SK1185-95A patent/SK281674B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1994-03-24 CN CN94192037A patent/CN1064710C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-24 CZ CZ952482A patent/CZ285996B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-03-24 NZ NZ263967A patent/NZ263967A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-03-24 CA CA002159109A patent/CA2159109C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-24 JP JP52218894A patent/JP3578761B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-24 RU RU95117959A patent/RU2146148C1/ru active
- 1994-03-24 IL IL137581A patent/IL137581A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-03-24 AU AU65243/94A patent/AU707340B2/en not_active Expired
- 1994-03-24 IL IL10912294A patent/IL109122A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-03-24 WO PCT/US1994/003208 patent/WO1994023032A1/en active IP Right Grant
- 1994-03-24 HU HU9502800A patent/HU220641B1/hu unknown
- 1994-03-25 DE DE69419958T patent/DE69419958T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-25 EP EP94104804A patent/EP0619370B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-25 SG SG1996007376A patent/SG49841A1/en unknown
- 1994-03-25 ES ES94104804T patent/ES2136673T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-25 DK DK94104804T patent/DK0619370T3/da active
- 1994-03-25 SI SI9430265T patent/SI0619370T1/xx unknown
- 1994-03-25 AT AT94104804T patent/ATE183233T1/de active
-
1995
- 1995-09-25 FI FI954541A patent/FI954541A/fi unknown
- 1995-09-25 NO NO953781A patent/NO953781L/no not_active Application Discontinuation
-
1999
- 1999-10-13 GR GR990402604T patent/GR3031509T3/el unknown
-
2000
- 2000-07-30 IL IL13758100A patent/IL137581A0/xx unknown
-
2004
- 2004-04-22 IL IL16156804A patent/IL161568A0/xx unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU220641B1 (hu) | Keratinocita növekedési faktor alkalmazása | |
| US5965530A (en) | Therapeutic uses of keratinocyte growth factor | |
| JP5736397B2 (ja) | コネキシンに対するアンチセンスヌクレオチドを含む配合物 | |
| EP0492614B1 (en) | Epitheliocyte growth accelerator | |
| JPS63502985A (ja) | 角膜基質創傷の治療のための組成物 | |
| JP2001526239A (ja) | 角質細胞増殖因子−２製剤 | |
| JP2003532742A (ja) | 神経損傷の修復 | |
| CN111050785A (zh) | 局部皮肤营养不良状况的治疗 | |
| US9060977B2 (en) | Heparin binding epidermal growth factor (HB-EGF) for use in methods of treating and preventing intestinal injury related to hemorrhagic shock and resuscitation | |
| BR112021003820A2 (pt) | agente para tratamento de distúrbios dermatológicos | |
| PT1506295E (pt) | Muteínas do factor de crescimento placentário do tipo 1, processo de preparação e sua aplicação | |
| AU703793B2 (en) | Recombinant adenoviruses coding for brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | |
| US20230220026A1 (en) | Nucleic acid carrier for producing the single-chain vegf fusion protein with high physiological stability and dimeric efficiency, preparation method thereof, and use thereof | |
| US5883071A (en) | Mammalian growth factor | |
| TW202328443A (zh) | 一種生產具高生理穩定性與高效能二聚體之單鏈ｖｅｇｆ融合蛋白的核酸載體及其製備方法和用途 | |
| CN111592599A (zh) | 一种促进不孕妇女瘢痕子宫内膜重建的靶向生长因子及其应用 | |
| WO1996016669A1 (en) | Use of human recombinant epidermal growth factor in the manufacture of a medicament for treating acne | |
| WO2005005476A1 (en) | Modified epidermal growth factors |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GB9A | Succession in title |
Owner name: BIOVITRUM AB (PUBL), SE Free format text: FORMER OWNER(S): AMGEN INC., US |
|
| FH91 | Appointment of a representative |
Free format text: FORMER REPRESENTATIVE(S): IFJ. SZENTPETERI ADAM, S.B.G. & K. BUDAPESTI NEMZETKOEZI SZABADALMI IRODA, HU Representative=s name: S.B.G. & K. SZABADALMI ES UEGYVEDI IRODAK, HU |