UA46706C2 - Спосіб лікування та запобігання хворобливому стану пацієнта, фармацевтична композиція - Google Patents

Abstract

В численних експериментах на тваринах in vivo було доведено, що ФРК (фактор росту кератиноцитів) стимулює проліферацію, ріст і диференціювання не тільки кератиноцитів, а й інших клітин епітеліального походження. Розуміння біологічних ефектів ФРК in vivo дозволяє застосовувати цей поліпептид як терапевтичний засіб, який може входити до складу фармацевтичних композицій. Такі композиції можуть знайти застосування для специфічного лікування хвороб та станів, при яких зашкоджуються придатки шкіри, печінка, легені та шлунково-кишковий тракт.

Description

Опис винаходу

Настоящее изобретение относится к применению фактора роста кератиноцитов (ФРК) для стимулирования 2 пролиферации, роста и дифференцировки клеток, отличньїх от кератиноцитов, а также предусматриваєт введение ФРК пациентам, для которьх указаннье биологические зффекть! могут бьть полезнь! при регенерации поврежденньх или больньїх клеток и тканей.

Достижения биотехнологии в последние годь! привели к разработке и терапевтическому применению новьх рекомбинантньїх полипептидов, включая зритропозтин и гранулоцитарньій колониестимулирующий фактор, что 70 принесло реальную пользу многим больньм. Бьл открьт ряд и других полипептидов, обладающих биологическими зффектами іп міго. Однако для ввіяснения потенциальньїх терапевтических применений таких факторов необходимо установить, какие клетки являются мишенями их действия и определить биологические зффектьї данньїх факторов іп мімо.

ФРК - известньій митоген, первоначально идентифицированньй как специфический ростовой фактор 75 запителиальньх клеток, в частности, кератиноцитов. Кибріп еї аї., Ргос.МакН.Асаа.Зсі БА 86:802-806 (1989);

Ріпсп еї аїЇ.,, Зсіепсе, 245:752-755 (1989); Магспезе еї аї...Сеїї, Рпуз. 144:326-332(1990). Зкспрессия мРНК

ФРК бьіла обнаружена в нескольких линиях стромальньх фибробластов, полученньїх из змбриональньх, неонатальньх и тканей взрослого человека. Зта РНК бьла вьіделена из нормальной взрослой почки и желудочно-кишечного тракта. Подобная РНК не бьіла обнаружена в глиальньїх клетках, легких, мозге, или же различньх клеточньх линиях зпителиальной природь, таких как чешує клеточнье карциномь), зпителиальнье клетки молочной железьі, иммортализованнье клетки зпителия бронхов, иммортализованнье кератиноцить а также в культурах первичньїх кератиноцитов (Ріпсі еї а!., Зсіепсе, см. вьіше). Однако ФРК митогенно активен в отношений клеток перевиваемой мьішиной линии ВАЇВ/МК. У/еізтапп апа Аагопзоп, СеїЇ, 32:599 (1983), см. такюке РМАЗ и Зсіепсе вьіше. с

Зто наблюдение свидетельствует в пользу паракринного действия ФРК в коже, с образованием ФРК в Ге) дермисе (но не в зпидермисе) и влияния ФРК на кератиноцить!.

Кроме того, зкспрессией генов филагрина и кератинов бьіло показано влияние ФРК на дифференцировку и созревание кератиноцитов. См. .).СеїІ.РАув. вьіше.

Большинство упомянутьїх работ по исследованию биологической активности ФРК бьло вьшполнено с о использованиєм рекомбинантного ФРК, доступность которого позволила значительно расширить изучение («3 данного фактора. В опубликованной заявке РСТ (МО) 90/08711 описана очистка ФРК из кондиционированной средь! линии клеток змбриональньїх фибробластов человека, частичная аминокислотная последовательность - вьіделенного полипептида, клонирование гена и его зкспрессия в бактериальньх клетках (Е.соїї) для получения Ге) рекомбинантного, биологически активного ФРК. 3о Поскольку роль ФРК как стимулирующего агента для кератиноцитов іп міо бьіла точно установлена, З предстояло изучить, на какие другие типьі клеток ФРК может воздействовать как ростовой фактор и охарактеризовать зти возможнье воздействия іп мімо.

Для понимания возможной роли ФРК как терапевтического препарата подобная информация бьіла особенно -«Ф необходима. З 70 Вкратце, настоящее изобретение основано на обнаружениий стимулирующего воздействия ФРК на с зпителиальнье клетки, отличнье от кератиноцитов. В частности, в настоящее время установлено, что іп мімо з» ФРК индуцирует пролиферацию и дифференцировку в таких нормальньїх зкстразмбриональньх структурах, как себоцить! (клетки сальньх желез) и клетки волосяного фолликула, гепатоцитьі и клетки слизистого дьїхательного зпителия (пневмоцить! типа ІІ). Имеются также серьезнье указания на то, что ФРК стимулирует пролиферацию и рост клеток слизистой оболочки пищеварительного тракта, таких как муцин - образующиє е бокаловидньюе клетки железистой части желудка и тонкого кишечника, клетки крипт прямой кишки и другие

Ге»! зпителиальнье клетки пищеварительного тракта.

Даннье наблюдения, послужившие основой настоящего изобретения, могут иметь существенное значение 7 для коррекции нарушений, связанньїх с повреждением или недостаточностью указанньіїх типов клеток. Далее о 20 описаньі заболевания и медицинские показания, по которьім может бьіть применен ФРК согласно настоящему изобретению. с Стимуляция пролиферации и дифференцировки таких зкстразмбриональньїх структур, как волосянье фолликуль, потовне железьї и сальнье железьі, являются чрезвьмчайно важньми для регенерации зпидермиса и дермь! у пациентов с ожогами и другими повреждениями кожи различной глубиньі В настоящее время 25 поверхностньє повреждения заживляются путем образования шрамов с вьходом на поверхность

ГФ) кератиноцитов; полная регенерация кожи все еще невозможна. Репопуляции волосяньїх фолликулов, потовьх юю желез и сальньїх желез на всю толщину дефектов кожи, включая ожоги, все еще не происходит. Использование

ФРК делаєет возможной зту репопуляцию.

Буллозньй зпидермолиз (болезнь Гольдшейдера) представляет собой нарушение прикрепления 60 зпидермиса к подлежащей дерме, что проявляется в образований открьїтьїх болезненньїх волдьрей.

Ускоренная резпителизация таких повреждений, достигагемая применением ФРК, привела бьї к снижению риска инфицирования, снижению болезненности и меньшей частоте перевязок.

В ходе химиотерапии неоплазий у большого числа больньїх наблюдается обльсение как результат такой терапии. В настоящее время нет терапевтических средств, которше предотвращали бь гибель клеток бо волосяньїх фолликулов, приводящую к временной потере волос. ФРК может служить таким терапевтическим средством.

Обльсение у мужчин широко распространено и практически не поддается лечению. Прогрессирующая утрата волос у мужчин и женщин является серьезной косметологической проблемой. Зто нарушение могло бь

Мзлечиваться системньм или же местньім применением ФРК при абсорбции препарата кожей головь! или путем распьіиляющих иньекций в кожу головьі при помощи воздушного пистолета или других подобньїх методов введения.

Язвьі желудка, хотя и поддающиеся лечению Но2-антагонистами, широко распространень и часто возобновляются снова и снова. Их заживление происходит через образование рубца на слизистой оболочке. 7/0 Возможность ускоренной регенерации железистой слизистой оболочки благодаря применению ФРК стала бь значительньім усовершенствованием терапии язв желудка.

Как и язвьі желудка, язвьі двенадцатиперстной кишки поддаются лечению, однако разработка терапевтического агента для более полной и более бьістрой регенерации слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки явилась бьї значительньмм достижением. Безусловно, терапевтический агент для /5 регенеративного заживления таких язв и снижения частотьії их рецидивов бьл бь весьма полезен. ФРК обладает таким потенциалом.

Воспалительнье заболевания кишечника, такие как болезнь Крона (затрагивающая в основном тонкий кишечник) и язвенньій колит (поражающий в основном толстьій кишечник) - зто хронические заболевания невьіясненной зтиологии, приводящие к разрушению слизистой оболочки, воспалению, образованию рубцов и 2о спаек при заживлений. Частота зтих заболеваний довольно вьісока. Существующая на сегодня терапия в основном направлена на сдерживание воспаления. Такие терапевтические средства как ФРК, стимулирующие восстановление слизистой оболочки и приводящие к более бьстрому заживлению, могут оказаться чрезвьчайно полезньіми при лечений подобньхх заболеваний.

Основньім оограничением для различньх схем химио- и радиотерапиий является токсичность с соответствующих терапевтических факторов для клеток пищеварительного тракта. Предварительное введение

ФРК может иметь протективньій зффект в отношений слизистой оболочки тонкого кишечника, что позволит і) увеличить дозьї химио- и радиотерапии с уменьшением нежелательньїх побочньїх зффектов.

Воздействие ФРК приводит к значительному увеличению образования слизи в пищеварительном тракте. Зта особенность может иметь существенное значение для защить! слизистой оболочки от повреждающих веществ, («ду зо попадающих в пищеварительньй тракт, или же препятствовать распространению повреждений в случае воспалительньїх процессов в кишечнике. о

Поражения гиалиновьїх мембран у недоношенньїх младенцев приводят к отсутствию поверхностного ї- образования пневмоцитов типа І в легких, что в свою очередь ведет к разрушению альвеол. Хотя кортикостероидь! могут в значительной степени ускорять созревание пневмоцитов у плода, начиная с двадцати ісе) з5 Восьминедельного возраста, подобной терапии для змбрионов более раннего возраста не разработано, что «г приводит к значительной смертности. Такой терапевтический агент как ФРК, индуцирующий пролиферацию и дифференцировку пневмоцитов типа ЇЇ, значительно облегчил бьї лечение подобньїх заболеваний.

Отравление дьімом через дьїхательнье пути является серьеезной причиной смертности в первую неделю ведения после ожоговьіх больньїх, что обусловлено некрозом бронхиолярного зпителия и альвеол. Такой « ростовой фактор как ФРК, способньій индуцировать пролиферацию и дифференцировку указанньїх структур, ще с может внести существенньй прогресс в лечение отравлений такого рода.

При змфиземе легких наблюдается прогрессирующая утрата альвеол. ФРК может стимулировать рост ;» новьїх альвеол и защищать оставшиеся, что безусловно имеет терапевтическое значение. В настоящее время зффективная терапия змфизем не разработана.

Цирроз печени, развившийся как следствие вирусного гепатита или хронического употребления алкоголя, ї5» имеет вьісокую частоту и является серьезной причиной смертности. Пролиферация и дифференцировка гепатоцитов, индуцированная ФРК, может улучшить работу печени и затормозить или предотвратить развитие

Ме. цирроза. -І Острая печеночная недостаточность, развивающаяся на конечной стадии цирроза, представляет угрозу для жизни. Препарат, которьій подобно ФРК, способен индуцировать пролиферацию оставшихся гепатоцитов, будет о оказьишвать терапевтический зффект в случае острой печеночной недостаточности, единственньм методом

Ф лечения которой на сегодня является пересадка печени.

Острьйй вирусньй гепатит часто имеет субклиническое и непродолжительное течение. Однако, у небольшой части больньїх острое поражение печени может наблюдаться в течение нескольких недель. Цитопротективньй ов агент, подобньй ФРК, способен предотвратить гепатоцеллюлярную дегерацию.

Печеночнье отравления, вьізваннье ацетаминофеном, галотаном, четьіреххлористьм углеродом и другими (Ф, ядами, могут бьіть облегченьь применением ростового фактора (ФРК), цитопротективного по отношению к ка гепатоцитам.

Таким образом, настоящее изобретение посвящено терапевтическому (а в отдельньх случаях и бо профилактическому) применению ФРК при указанньїх болезненньїх состояниях, а таюке фармакологическим препаратам, содержащим ФРК в терапевтических дозах.

Краткое описание фигур

На Фигл1 представлена нуклеотидная последовательность синтетического олигонуклеотида, использованного для получения рекомбинантного ФРК, которьй в свою очередь бьіл использован в описанньїх б5 /ниже зкспериментах іп мімо.

На Фиг.2 представлено модельное повреждение уха кролика на неполную толщину дермьі, затрагивающее хрящ и которое позволяет количественно оценить рост новой ткани.

На Фиг.3З отражена резпителизация обработанньїх ФРК и контрольньїх модельньїх повреждений, описанньх на Фиг.2. Слева показана общая площадь регенерирующего зпителия после обработки ФРК, а справа - процент резпителизации ран.

На Фиг.4 показана пролиферация базальньх и супрабазальньїх кератиноцитов на краях рань! на пятьій день после обработки ФРК с использованием той же модельной системні.

На Фиг5 приведен гистологический анализ обработанньх бромдезоксиуридином (Вг4)) волосяньх фолликулов в контрольньх и обработанньїх ФРК ранах. Видна пролиферация клеток. 70 На Фиг.б представлена окраска красньм масляньм красителем сальньїх желез в контрольньх и обработанньїх ФРК ранах.

На Фиг.7 и 8 показано микрососочковое разрастание зпителиальньїх клеток перегородок альвеол в легких здоровьїх крьс, интратрахеально обработанньїх ФРК.

На Фиг.9 и 10 показан кубоидальньійй рост зпителиальньхх клеток в альвеолах больших сегментов легких /5 после интратрахеального введения ФРК тем же здоровьм крьгсам.

На Фиг.11 и 12 видно, что гиперпластические зпителиальнье клетки, вьістилающие перегородки альвеол, у крьсс, обработанньїх ФРК, содержат пластинчатье включения различного размера и формьі!.

На Фиг13 А показано гиперпластическое воздействие ФРК на бронхиальньй зпителий после интратрахеального введения здоровь!м крьісам.

На Фиг.13 В показан бронхиальньій зпителий крьс контрольной (по отношению к представленньм на

Фиг.13А) группь!.

На Фиг.14 представлень результать! теста защить! от РНКазьі РНК рецептора ФРК в легких взрослой крьсь.

На Фиг.15 показано увеличение веса органов пищеварительного тракта и печени в зависимости от дозь применяемого в течение четьірех дней ФРК. сч

На Фиг.16 показано увеличение синтеза белка в печени крьсс, обработанньїх ФРК в течение четьірех дней.

Фиг.17 демонстрирует увеличение пролиферации гепатоцитов в печени животньїх, получавших ФРК от і) одного до семи дней. Уровень пролиферации определяли путем мечения ВгаЧ (А) или подсчетом митозов (В).

На Фиг.18 и 19 показано восстановление массь! печени после обработки ФРК у крьіс, перенесших частичную гепатозктомию. «о зо На Фиг.20 показано увеличение уровня сьівороточной глутаматоксалоацетат трансаминазь! (СГОТ) в сьіворотке отравленньїх четьіреххлористьмм углеродом крьсє. Увеличение наступило в результате обработки о

ФРК. ї-

На Фиг.21 показано увеличение длинь! желудочньїх желез и количества слизи, образуемой в железистом желудке крьс, получавших ФРК от одного до семи дней. ісе)

На Фиг.22 показано увеличение длиньії дуоденальньх крипт и количества слизи, образуемой в тонком «г кишечнике крьс, получавших ФРК от одного до семи дней.

На Фиг.23 показано увеличение доли гиперпластических крипт в толстом кишечнике крьіс, получавших ФРК от одного до семи дней.

На Фиг.24 показано увеличение глубиньі! крипт в толстом кишечнике крьіс, получавших ФРК от одного до « семи дней. в с Описание специфических применений ФРК

Для определения специфических типов зпителиальньїх клеток, на которне ФРК оказьввает значительньй ;» биологический зффект, обусловливающий возможное терапевтическое применение, бьли предпринять широкие исследования на животньїх с введением ФРК іп мімо и тщательньм анализом полученньх результатов.

Рекомбинантньй ФРК, использованньй в каждом из приведенньїх ниже примеров, получали следующим ї5» образом:

Рекомбинантньй ген ФРК бьіл синтезирован полимеразной цепной реакцией на основе РНК фибробластов

Ме, крайней плоти человека (АС1523) и полученная ДНК бьіл встроена в вектор зкспрессиий рРСЕМ1156 между -І сайтами рестрикции Має и ВатНі. Плазмида рСРМ1156 может бьть получена из плазмидьї рСЕМа836, описанной в патенте США Мо.4,710,473, путем удаления двух зндогенньїх сайтов рестрикции Маеї с заполнением о концов при помощи Т4-полимеразьі, последующим легированием по тупьім концам и замещением небольшого

Ф фрагмента ДНК между уникальньми сайтами рестрикции Сіа!Ї и Крпі следующим олигонуклеотидньім дуплексом, состоящим из последовательности Мо.1 и последовательности Мо.2:

Сід І Крп!1

Б'ЄЄАТТТСАТТСТАСААССАССААТААСАТАТОСТТААСОССТТОСААТТСОСТАС 3 (Ф. 3" ТААДАСТААСАТСТТОСТОСТТАТТОТАТАССААТТОСОСААССТТААОС 5 іме) -

Плазмида рСЕМ1156КОР бьла затем введена в клетки ЕМ5 при помощи стандартной процедурь злектротрансформации (прибор ВіокКай Сепе Риїзег). Для снижения внутренней инициации трансляции бо последовательность ДНК в гене ФРК между сайтами рестрикции Крпі и ЕсоКіІ бьіла заменена синтетическим олигонуклеотидом, сконструированньїм таким образом, чтобь! снизить возможность использования внутреннего сайта связьивания рибосом (Фиг.1.) После лигирования и трансформации клеток ЕМ5 бьіл отобран клон, содержащий плазм иду рРСЕМ1156КОог-аза. Правильность последовательности нуклеотидов гена ФРК в данной плазмиде бьла подтверждена секвенированием. Клетки затем культивировали при 30"С в 10-литровьх бо ферментерах в стандартной ростовой среде, что позволяло клеткам достичь зкспоненциальной фазь роста в условиях дефицита глюкозьї, предотвращающего накопление токсичньїх побочньїх продуктов. При средне - зкспоненциальной плотности клеток температуру кратковременно поднимали до 42"С, чтобьї индуцировать транскрипцию гена ФРК, а затем поддерживали на уровне 37"С на протяжении всего оставшегося времени ферментации. Клеточную массу собирали и хранили в замороженном состоянии. Биологически активньій ФРК очищали из механически лизированньїх бактерий стандартньіми хроматографическими методами, используя тот факт, что белок имеет очень вьісокую изозлектрическую точку (колонки с б-сефарозой Базі Ріомж/ фирмь

РІПаптасіа) и размер (Зирегдех 75 РІаптасіа). Очищенньій рекомбинантньйй ФРК проверяли на наличие зндотоксинов и на биологическую активность в митогенном тесте как описано Кибіп с соавт.(см.РМА5Б, вьіше). 70 Пример 1.

ФРК- стимулируемье пролиферация и дифференцировка зкстра змбриональньхх структур на модели заживления ран іп мімо

В настоящем Примере бьла использована раневая модель с повреждением уха кролика на неполную толщину дермь. Модель кожной язвьі на ухе кролика, описанная Мизіое еї аї., (9У.Сііп. Іпмеві., 87:694-703, 75...1991), била модифицирована с образованием рань через хрящ до дермиса с обратной сторонь! уха с помощью б мм трепана. В результате заживление раньї происходило распространением зпителиальньїх злементов под хрящом, сжатие раньії в процессе заживления бьіло невелико, что давало возможность точно оценить размерь вновь образуемьїх тканей (см. Фиг.2). В качестве терапевтического агента для заживления ран бьіл использован рекомбинантньїй ФРК, полученньїй описанньім вьіше способом.

Материаль и методь

ФРК или, в контроле, растворитель (фосфатньй буферньій раствор) наносились однократно в день операции и рань! (площадью 0.25 см кв.) закривали специальньім защитньім покрьїтием Тедадеїт (ЗМ Сотрапу,

ЗГРаш, ММ). Перед забоем каждому животному внутривенно вводили ВгаШ (Аїагісй Спетіса! Сотрапу,

МімацкКее, МУ!) в количестве 50 мг на килограмм веса тела. Введение Вга)у давало возможность количественно сч ов оценить степень пролиферации базальньх кератиноцитов и кинетику миграции базальньх клеток по о направлению к сосочковому слою и роговому слою.

После забоя из каждой рань бьло приготовлено два образца, один образец замораживали в "среде оптимального охлаждения" (СОО, Міїіез Іпс., ЕІкпагаї, ІМ), второй образце фиксировали в среде Отпіїїх (АІ-Соп,

Сепеїйїсз Іпс., Меїміе, МУ), а затем подвергали обработке согласно стандартнь!м гистологическим методам. Ге)

Срезьі! толщиной З мкм, приготовленньсе из каждой раньї, окрашивали Маззвоп Тгіспготе, масляньїм красньм, а также иммуногистохимически. о

Измерение резпителизации че

Измерения полного просвета рань и зпителиального просвета для каждой рань! производили с помощью калиброванного стационарного микрометра. Процент резпителизации для каждой раньі рассчитьввали, деля ее, з5 разницу в площади между полньім просветом и зпителиальньм просветом на площадь полного просвета. «фр

Даннье для двух срезов каждой раньі усредняли. Отклонения в измерениях зпителиального просвета и в проценте резпителизации анализировали по распределению Стьюдента.

Для каждой использованной дозьї ФРК рассчитьвшвали площадь вновь образованного зпителия в опьтте и в контроле. Результать! зтих зкспериментов бьіли обработаньі по методам Даннетта и АМОМА (вероятностнье « тесть). шщ с Измерение пролиферации и дифференцировки зпителиальньх клеток й Парафиновье срезьі тканей толщиной З мкм окрашивали антителами против ВгЯО (Оако Согр. и? Сагріпіеєгіа,СА), авидинбиотиновь!м комплексом (Месіог І арогаюгіез Іпс., Вигіпдате, СА) и диаминобензидином (ДАБ, бідта Спетіса! Со., БІ. І оції, МО). Срезьі обрабатьвали 0,195 раствором протеазьі, а затем 2н. НОЇ.

Зндогенную пероксидазу подавляли обработкой З90о-ной перекисью водорода. «» Срезьі обрабатьвали 1090-ньмм раствором нормальной лошадиной сьшворотки в фосфатном буферном растворе, а затем инкубировали с анти-Вгд) антителами в разведений 1:400 в 195-ном бьічьем сьівороточном б альбумине. После оотмьвания срезьь инкубировали 20 минут в коньюгированном с пероксидазой -і авидин-биотиновом комплексе в разведений 1:100 в 1956-ном бьічьем сьівороточном альбумине. Затем срезь обрабатьвали ДАВ (10 мг ДАВ, 20 мл фосфатного буферного раствора, 20 мкл 3096 перекиси водорода) в о течение 10 минут.

Ф Фоновую окраску срезов проводили гематоксилином.

Гистологический анализ волосяньїх фолликулов, обработанньїх Вгау

После включения ВгаШ и ІНС-окрашивания определяли общее число фолликулов в раневом ложе и даннье Ообрабатьвали по компаративному тесту КгизкКаїІ-УМаїїв. Дальнейший анализ включал определение для каждой группьії животньїх количества ран (в процентах), в которьїх бьли фолликульй с десятью или более іФ) пролиферирующими клетками (Спі-здцаге тест). Кроме того, для всех фолликулов, имеющих более пяти ко пролиферирующих клеток, определяли число клеток, положительньх по окраске на Вга.

Окрашивание сальньїх желез масляньм красньім во Для идентификации себоцитов и сальньїх желез бьіла применена окраска масляньм красньім, нейтральньм красителем, специфичньм для нейтральньхх липидов. Окрашивание проводили на замороженньїх срезах по методу, описанному Р.Ї.Сагвоп: Нівіоїесппоіоду: А ЗеїІпвіисіопа! Тех АБСР Ргевзв, СпПісадо (1990).

Вкратце, замороженнье срезьі толщиной 7 мкм вьісушивали на воздухе и фиксировали в цинк-формалине в течение 10 минут. Затем препарать! погружали в 0,395 (вес/обьем) раствор масляного красного (Зідта Спетісаї 65 Со., ЗІ. Гоців,МО), затем в 6090-ньій изопропанол на ЗО минут при комнатной температуре, обесцвечивали в бОбо-ном изопропаноле и окрашивали гематоксилином Лернера. Определяли размер сальньїх желез и число клеток в железе.

Результать! и обсуждение

При обработке ран ФРК в дозах 4-40 мкг/см.кв. наблюдалась ускоренная резпителизация и увеличение Толщинь зпителия. На пятьій день после обработки в ранах отмечена усиленная в сравнений с контролем резпителизация (76,795 против 52,595, 1 мкг ФРК). К пятому и седьмому дню после обработки плотность зпителия увеличивалась в зависимости от дозьі ФРК и при дозе 10 мкг на рану площадь зпителия в два раза превьішала таковую в контроле (Фиг.3). Гистологический анализ дает основания считать, что регенерация зпителия происходит в основном за счет распространения в дерме зкстра змбриональньїх злементов, а именно 7/0 сальньх желез, потовьх желез и волосяньїх фолликулов.

Анализ пролиферации базальньїх кератиноцитов и миграции базальньїх клеток показал увеличение числа пролиферирующих базальньїх кератиноцитов по краям рань! уже на первьій день после обработки ФРК (Фиг.4).

Ко второму дню после обработки ФРК возросшее число пролиферирующих кератиноцитов в супрабазальном слое указьвает на сокращение времени перехода пролиферирующих клеток в сторону сосочкового слоя. К 7/5 пятому дню после обработки пролиферация клеток в базальном слое уменьшается, что указьівает на само ограничивающееся ускорение восстановления зпителия и дифференцировки (Фиг.4).

Кератиноцить! претерпевают нормальное созревание по мере их миграции вверх и образования рогового слоя. Неожиданно бьіла обнаружена усиленная пролиферация себоцитов и волосяньїх фолликулов. В ранах, обработанньїх ФРК, по сравнению с контрольньіми и волосянье фолликуль, и сальнье железь! бьли многочисленней и крупнее (Фиг.3 и 6, соответственно).

Анализ гистологических препаратов, окрашенньїх масляньмм красньім для дифференциального вьіявления сальньїх желез, показал значительно возросшее число таких желез и увеличение их размеров, что указьівает на усиленную пролиферацию и дифференцировку себоцитов в зрелье салопродуцирующие клетки. В обработанньїх ФРК ранах отмечено также дозо-зависимоеє увеличение числа пролиферирующих клеток в с Волосяньх фолликулах. Ранее на раневой модели уха кролика бьіли провереньі! зпидермальньй фактор роста (ЕСЕ) и основной фактор роста фибробластов(ЕО (0. Сііп.Іпмезі.,87:694-704,1991 и Ріегсе еї а), Атег.).Раїної. і) 140:1375-1388, 1992). Хотя известно, что оба зти фактора стимулируют резпителизацию, ни ЕСЕ, ни основной

ЕСЕ не влияют на пролиферацию и дифференцировку таких зкстра змбриональньїх структур, как сальнье железьі и волосянье фолликуль. Способность ФРК стимулировать пролиферацию и последующую Ге зо дифференцировку в коже зпителиальньх клеток различньх типов вместе с тем фактом, что он бьл первоначально вьіделен из фибробластов, дают основания считать ФРК мощньїм паракринньім стимулятором о регенеративньїх процессов в коже. ї-

Пример 2

ФРК- стимулирование пролиферация и дифференцировка пневмоцитов типа ЇЇ іп мімо ісе)

Настоящие зксперименть! бьіли проведень с целью оценки воздействия ФРК на зпителиальнье клетки «г респираторного тракта здоровьх крьс.

Материаль и методь

Самцам крьіс Іемів весом 200-250г однократно интратрахеально вводили различнье дозь ФРК, разведенного в физиологическом растворе или фосфатном буферном растворе согласно протоколу, « описанному Шісй еї аї., Атег.).Раїйої., 138:1485-1496, 1991. ФРК вводили в дозах 0,1, 1,0, 5,0 и 10,0 мг/кг ств) с веса. Контрольнье крьіїсь! получали интратрахеальнье иньекции растворителя. Через шесть часов, один, два, три, четьіре, пять и шесть дней после введения ФРК животньїх забивали, через интратрахеальньїй катетер ;» легкие заполняли фиксатором Бузна, сагиттальнье срезьі легсих заключали в парафин и гистологические препарать! окрашивали гематоксилин - зозином.

Результать! и обсуждение ї5» ФРК в дозе 0,1 мг/кг не вьізьівает гистологически различимой гиперплазии зпителиальньїх клеток альвеол.

ФРК в дозе 1,0 мг/кг вьізнівает незначительное, но различимое увеличение числа альвеолярньїх зпителиальньх ме) клеток. Значительная гиперплазия зтих клеток отмечена при дозах ФРК, равньїх 5,0 и 10,0 мг/кг. ФРК не -І вьізьшал гистологически различимой гиперплазий зпителиальньх клеток на сроках б и 24 часа после интратрахеального введения. На второй день после введения ФРК в легких крьіс отмеченьі островковне о микрососочковне разрастания зпителиальньїх клеток перегородок альвеол (Фиг.7,8). На третий день в больших

Ф сегментах легких в вьістилке цельїх альвеол отмечен низко-кубический и кубический рост альвеолярньх зпителиальньїх клеток. При зтом некоторье области легких сохраняют нормальную гистологическую картину.

Гистологическая картина гиперпластического альвеолярного зпителия у крьісь! на третий день после введения ФРК практически совпадаєт с картиной реактивной гиперплазии пневмоцитов типа ІЇ в легких человека. На четвертьй и пятьйй день после интратрахеального введения ФРК количество гиперпластического альвеолярного (Ф, зпителия в легких крьіс заметно снижается. На шестой день легкие контрольньїх и ФРК-обработанньїх крьіс ка бьіли неразличимьі.

Легкие ФРК-обработанньх крьіс оподвергли ультраструктурному анализу на третий день после бо интратрахеального введения ФРК. Гиперпластические альвеолярнье зпителиальнье клетки, вьістилающие перегородки альвеол, неизменно содержали одно или более пластинчатое включение различньїх форм и размеров (Фиг.11,12). На третий день после введения ФРК бронхиальньй зпителий у крьс бьл также гиперпластичен, но зта гиперплазия бьла не столь явной, как в случае альвеолярньїх зпителиальньх клеток.

Проявлениями бронхиальной гиперплазии считают псевдорасслоение (псевдостратификацию) зпителиальной 65 Ввістилки мальх дистальньх бронхов, которье в норме вьістланьі однослойньім зпителием, пучковьій или сосочКовьІій рост бронхиального зпителия, а также увеличение числа митозов в бронхиальном зпителийи

(Фиг.13А, 13В).

Введенньй интратрахегально ФРК вьіїзьшаєт резкую гиперплазию альвеолярньїх зпителиальньїх клеток.

Наличие пластинчатьїх цитоплазматических включений в зтих клетках подтверждает предположение о том, что Зти клетки являются пневмоцитами типа ЇЇ. Зти пластинчатне включения немногочисленнь! и не окрашиваются осмием, в отличие от подобньїх включений, описанньїх в некоторьїх случаях зкспериментальной гиперплазии пневмоцитов типа ІІ у крьісє. Они гораздо больше напоминают пластинчатье включения, встречающиеся в клетках легких нормальньїх крьіс. Кроме гиперплазий альвеолярного зпителия ФРК вьїізьівает гиперплазию бронхиального зпителия. Возможно, что гиперпластический альвеолярньй зпителий представляет собой 7/0 прорастание бронхиального зпителия из терминальньхх бронхиол в альвеолярную паренхиму. Однако, более вероятно, что ФРК действует прямо на пневмоцитьі типа ІЇ, о чем свидетельствует многофокусньй микрососочковьій характер роста пневмоцитов в перегородках альвеол на второй день после введения ФРК.

Такой рост предшествует образованию непрерьівной вьістилки альвеол кубическими клетками на третий день после введения ФРК. Кроме того, пневмоцить! типа ІЇ считают митотически активньми клетками зпителия /5 альвеол и именно зти клетки должнь отвечать пролиферацией на такой зндогенньй медиатор роста альвеолярньх клеток, каким является ФРК. Наконец, идентификация пластинчатьх включений в гиперпластических клетках дает основания считать что зти клетки не только дифференцируются в пневмоцить! типа І, но и происходят из зтих пневмоцитов. Стимулирующий зффект ФРК на пневмоцить! типа ЇЇ подтверждаєтся еще и данньми о том, что количество МРНК рецептора ФРК на зквивалентное количество общей РНК в легких в два-три раза вьіше по сравнению с другими органами молодьйх взросльх крьіс. В зтих опьітах количество МРНК рецептора ФРК определял и модифицированньім методом защить! от РНКазьі Атбіоп (КРА Ії, Мо.1410). "Антисмьісловая" -РНК, использованная в зтих зкспериментах, имела следующую последовательность (ЗЕО).

ІО Мо.:3): сч

БСААОАСОААОССО ОСИ ООБООБСАСОАСАВИСА-СССАСОСАСАСИОвОООБОССОБСССОАОАОДАШ

Обб-АВАССООАСАОАОАОАООССССАССАОССАОСИССО-ОСАСАПОСААСАСАОССАССАСООСИССАООСОА і) ос-

ОАОООДОССССОАСИССАЦС 3" "Антисмьісловая" проба бьіла приготовлена с помощью набора Кіроргоре Сетіпі Ії фирмь! Рготеда (52020) Ге зо на матрице линеаризованной ДНК, кодирующей соответствующую последовательность, описанную вьіше.

Проба РНК бьла вьіделена из содержащего мочевину полиакриламидного геля путем вьірезания полось о соответствующего размера и злюции РНК в растворе Атрбіоп Б. М "Смьісловая" РНК, кодирующая последовательность, комплиментарную "антисмьсловой" пробе, имеет следующую структуру (ЗЕО. ІЮ МО.:4): ісе)

БСОБАСАСМОСООБСАОССОвСАВОИОСОАСИСОАДО-АССАОССАСИСОООБАОАААОАОСИОССААО СА «г

АА-СОССОвОСИОСОБООСААОВОБАСОСАВАОСОАОСИО-БООБААОАОАОДОВОААвООСОССААООАОАОАО

ООб-САСОСССААССАСОСОвССОвОСОСАСОВОССООССССА-

ААСАССАдОО 3 "Смьісловой" стандарт РНК приготавливали немеченьм (без радиоактивной метки) с использованием « набора Кіроргоре Сетіпі ІІ, Рготеда (22020) и очищали на колонке (350 Зерпадех Опціск гріп. з с Согласно стандартному протоколу Атбіоп (КРА ІІ 21410), 50 мкг тотальной РНК инкубировали с 100000 срт пробьі сначала при 957С четьіре минутьї, затем от двенадцати до восемнадцати часов при 457С. РНкКаза (в ;» разведений 1:500 в растворе Атбіоп К) бьіла добавлена к гибридизационной смеси на сорок минут при 37"С, а затем бьіл добавлен инактивирующий и осаждающий агент (раствор Ох).

Фрагментьі РНК, защищенньсе от РНкКазьї, разделяли по размеру злектрофорезом в полиакриламидном геле ї5» с мочевиной, а затем весь гель зкспонировали с пленкой Рпозрпогітадег. Количественную оценку содержания

РНК в полосах проводили при помощи прибора РІіозрпогітадег фирмь! Моїіесшаг Бупатісв. Результать ме) представлен на Фиг.14. -І Идентификация ФРК как ростового фактора пневмоцитов типа ІІ откриівает возможности терапевтического 5р применения ФРК, которьій подобно кортикостероидам может бьіть использован для стимулирования созревания о легких змбриона. Другое возможное клиническое оприменение ФРК состоит в стимулирований

Ф бронхоальвеолярной регенерации после повреждения легких у взросльїх. Пролиферативное действие ФРК на пневмоцить типа ІЇ дает основания предполагать его важную роль в регуляции синтеза и секреции слизи.

Пример З

ФРК- стимулирование пролиферация и дифференцировка гепатоцитов

Оценивали зффекть! систематического введения ФРК на зпителиальньсе ткани печени взросльх крьс. (Ф, Материаль и методь ка Самць крьс получали воду и пищу ай Ірішт. Всем животньім ежедневно интраперитонеально вводили ФРК или фосфатньй буферньй раствор в течение одного, четьірех или семи дней. Во всех зкспериментах из каждой бор группь анализировали по крайней мере пять животньх.

Всех животньїх умерщвляли с помощью СО2, сразу же после гибели забирали кровь путем сердечной пункции для получения сьворотки, которую хранили замороженной до использования. Сьіворотку анализировали обьічньм методом на содержание химических веществ и злектролитов. Печень взвешивали слепьім способом и вес вьіражали в граммах по отношению к 100 граммам веса тела (процент к весу тела). 65 Образцьі тканей помещали в 1095-ньій забуференньй формалин для последующего гистологического исследования.

Срезьі печени окрашивали гематоксилином и зозином (Го и З). За час до умерщвления крьсам интраперитонеально вводили 50 мг/кг Вга. Для визуального вьіявления ВгдО, включившегося в ДНК реплицирующихся клеток, использовали иммуногистохимический метод, основанньій на использовании антител вок Вга|.

Индекс мечения (ИМ) печени определяли с помощью калиброванной окулярной сетки. Для каждого животного подсчитьівали и усредняли десять полей зрения. Определяли общее число ядер и число меченьх ядер на единицу площади. Для стандартизации подсчета все поля зрения на препаратах вьібирали таким образом, чтобьї они прилегали к портальной триаде. 70 Все даннье анализировали по распределению Стьюдента или тесту АМОМА для множественньх групп сравнения.

Результать! и обсуждение

Для определения зффективной дозьі ФРК использовали методику дозо-зависимого ответа. ФРК иньецировали ежедневно в течение четьірех дней и забирали органьі. Вес печени, вьіраженньй в процентах к /5 весу тела, значительно отличался от контрольного только при самой вьісокой ежедневной дозе ФРК (5 мг/кг) при сравнений методом АМОМА (Фиг.15). Примечательно, что содержание сьівороточньїх белков, холестерина и триглицеридов, синтезируемьїх печенью, бьіло значительно вьіше по сравнению с контрольньім при дозах ФРК 1,0 и 5,0 мг/кг (Фиг.16).

Исследовали животньїх, которьім ежедневно в течение одного, четьірех или семи дней вводили ФРК в дозе 5

Мг/кг. Как показали исследования органов, печень бьіла значительно увеличена в размерах по состоянию на седьмой день зксперимента. Вес печени у получавших ФРК крьс бьл существенно увеличен во всех исследуемьїх временньїхх точках (седьмой день, ФРК: 4,08 ї- 0,0895; контроль: 3,49 ї- 0,0695, р-0,0003). Подсчет

ВгаО-положительньїх ядер показал трех-четьюрех кратное превьішение их числа у ФРК-обработанньїх крьіс по сравнению с контрольньми через день после введения ФРК (Фиг.17). Митотический индекс, вніраженньй как сч об число митозов в поле зрения при большом увеличений микроскопа, бьіл существенно вьіше по сравнению с контролем на первьіїй день после введения ФРК, что согласуется с подсчетом ВгадО-положительньх ядер. і)

Приведеннье результать! указьівают на сильное митогенное и дифференцировочное воздействие ФРК на печень. Бьістрое увеличение веса печени на первьій день после введения ФРК в сочетании с увеличенньім митотическим индексом и доли ВгаО-положительньїх клеток указьівают на бьістрое и мощное воздействие ФРК (й зо на зту прейимущественно зпителиальную ткань. Хотя митотическое воздействие ФРК бьстро спадает, вес печени, вніраженньїй в процентах к весу тела, продолжает возрастать в ходе зкспериментов. Возрастание веса о первоначально обусловлено увеличением числа клеток, гистологически различимьм уже через день после м. введения ФРК. Зто же увеличение веса сохраняется на четвертьй и седьмой дни зксперимента. Поскольку при регенерации масса печени может увеличиваться более чем в два раза менее чем за две недели, не ісе) з5 удивительно, что столь существеннье различия обнаруживаются уже через день после введения ФРК. «г

Повьшенньй уровень альбумина не связан с каким-либо болезненньм состоянием за исключением дегидратации. По-видимому, ФРК индуцирует повьішение уровня альбумина (и других белков) в сьіворотке за счет увеличения числа функционирующих гепатоцитов. Индуцируемое ФРК усиление синтеза белков может иметь исключительное значение для пациентов с терминальньми стадиями заболеваний печени, в частности « циррозом. шщ с Пример 4

ФРК- стимулированнье пролиферация и восстановление клеток печени іп хмімо после частичной ;» гепатактомий

В настоящих зкспериментах в качестве подопьітньх животньїх бьли использованьй самць! крьс Зргадое-Оамеу весом 300-340 г. ї5» Материаль и методь

Каждой из крьіс удаляли до двух третей печени по методике Ніддіпе и Ападегзоп, Агспімез ої Раїпоіоаду,

Ме, МоЇцте 12, раде 186 (1931). Начиная с восьми часов после операции и затем ежедневно крьсам подкожно -І вводили фосфатньій буферньй раствор (контроль) или ФРК в дозе 1 мг/кг. Контрольньїх и ФРК-обработанньх Крьіс взвешивали и забивали на четвертьй, седьмой, десятьй и четьірнадцатьй день после операции. Удаляли о и взвешивали остатки печени.

Ф Результать! и обсуждение

Установлено, что обработка ФРК крьіс, перенесших частичную гепатактомию, приводит к значительному ускорению восстановления массь! печени, как в абсолютньх, так и в относительньїх величинах, как показано, в боответственно, на Фиг.18 и 19. У обработанньїх ФРК крьіс масса печени возвращалась к исходному значению в течение семи дней. Напротив, в контрольной группе ни абсолютная, ни относительная масса печени не (Ф, восстанавливались полностью даже к четьірнадцатому дню после гепатактомии. ка Пример 5

Положительное воздействие ФРК при химическом отравлений печени во Самць крьіс Зргадое-Оаміеу весом 300-340 г бьіли использовань! для оценки терапевтического воздействия

ФРК на печень при введений химического токсина.

Введение

Группам из двенадцати самцов крьіс Зргадце-Оау/еу перорально вводили четьірех-хлористьій углерод (СС14) в растительном масле в дозах 1 мг/кг и 2 мг/кг. Каждая группа бьіла разделена на две подгруппь! по 65 шесть крьіс в каждой. Через три часа после введения СС14 и затем ежедневно крьісам соответствующей подгруппьї вводили фосфатньіїй буферньй раствор или ФРК в дозе 1 мг/кг/день. Через 24, 72 и 144 часа после введения СС14 у каждой крьісь! брали пробу крови и определяли уровень сьівороточной глутамат-оксалоацетат трансаминазь (СГОТ).

Результать! и обсуждение

Как видно из Фиг.20, подкожное введение ФРК после перорального введения

СС14 значительно увеличивает в сьіворотке содержание фермента СГОТ, являющегося индикатором повреждения печени. Зффект особенно вьіражен при дозе 2 мг/кг на первьій день после введения ФРК.

Пример 6

ФРК- стимулирование пролиферация и дифференцировка зпителиальньх клеток слизистой оболочки 7/0 кишечника

В данном примере оценивается биологическое воздействие ФРК на зпителиальнье клетки слизистой оболочки кишечника здоровьїх крьс.

Материаль и методь

Самць крьіс получали воду и пищу ай Ірішт. Животньм вводили ФРК или фосфатньій буферньй раствор 7/5 (контроль) интраперитонеально в течение одного, четьірех или семи дней. Анализировали не менее пяти животньїх в каждой группе. Всех крьіс умерщвляли при помощи СО02. Главнье органьії взвешивали слепь/м методом и их вес вьіражали в граммах на 100 граммов веса тела (процент к весу тела). Пищеварительньй тракт разделяли на нежелезистьій желудок, железистьй желудок, тонкий кишечник и толстьій кишечник. Образць тканей помещали в 1095-ньій забуференньй формалин для последующего стандартного гистологического го исследования.

Срезьі! всех отобранньїх органов окрашивали гематоксилином и зозином (Г и З). За час до забоя крьісам интраперитонеально вводили 50 мг/кг Вга). Для визуализации включения Вга)у в ДНК реплицирующихся клеток бьл использован иммуногистохимический метод с антителами к ВгдО. Отдельнье ткани бьіли окрашень перийодат-Шиффом (РАЗ), альциановь/м голубь/м при рН 2,5 и Мессон-трихромом. сч

Для измерения толщинь! слизистой желудка и глубиньі! ее прокрашивания РА5 использовали калиброванньй окуляр. Аналогично определяли длину ворсинок и глубину кишечньїх крипт в двенадцатиперстной кишке и і) глубину крипт ободочной кишки. Чтобьї оценить количественнье изменения в образованийи бокаловидньх клеток подсчитьївали РАЗ-положительнье бокаловиднье клетки на 100 мкм длинь! дуоденальной ворсинки, начиная с основания. Для всех отделов пищеварительного тракта измерения проводили только на тех железах или «о зо Ворсинках, которне бьіли перпендикулярнь! подстилающим мьішцам. Результать! ввіражали в микронах или, в случае бокаловидньїх клеток тонкого кишечника, средним числом на единицу площади. Кроме того, для о ободочной кишки определяли число обьічньїх и гиперпластических (бифурцированньїх и трифурцированньмх) ї- крипт на единицу длиньї кишки.

Для каждого животного проводили от пяти до десяти повторньїх измерений и результать! усредняли. Все ісе) з5 даннье обрабатьвали по распределению Стьюдента или тесту АМОМА для множественньїх групп сравнения «г (біаїміем/ ІІ, Арасив Сопсерів, Вегкеіеу.СА).

Результать! и обсуждение

Для определения зффективной дозьі ФРК первоначально бьли поставленьй зксперименть! по типу "доза-ответ". ФРК вводили ежедневно в течение четьірех дней, и органьі! опьітньїх животньїх забирали для « обследования. Вьіраженньй ответ на введение ФРК наблюдался в отношений железистого желудка, тонкого в с кишечника и ободочной кишки (Фиг.15).

Животньїх обследовали после одного, четьрех и семи дней ежедневньх введений ФРК в дозе 5 мг/кг. ;» Согласно данньмм патологоанатомического обследования, на четвертьй и седьмой дни введения ФРК нежелезистьій желудок бьіл значительно утолщен с образованием складок слизистой оболочки.

На четвертьй и седьмой дни обработки ФРК, но не на первьїй день, нежелезистьй желудок, железистьй ї5» желудок, двенадцатиперстная кишка и ободочная кишка имели значительное увеличение по весу по сравнению с контролем. На седьмой день железистьїй желудок весил 0.65 ї- 0,01 г у животньх,

Ме, обработанньїх ФРК, и 0,48 к- 0,02 г у контрольньх (р- 0,0001). -І На четвертьй и седьмой дни обработки ФРК нежелезистьйй желудок значительно превьішал по весу Контрольньй. Гистологически у ФРК-обработанньїх животньїх чешуйчатьй зпителий нежелезистого желудка бьл о слегка (на четвертьй день) или значительно (на седьмой день) гиперпластирован. В кардии характер зпителия

Ф резко менялся от чешуйчатого зпителия пищевода до пролиферирующего зпителия обработанного ФРК нежелезистого желудка. После одного дня обработки ФРК слизистая оболочка железистого желудка вьіглядела гистологически нормальной. На четвертьій и седьмой дни гистологически вьіявлялось возросшее число ов бокаловидньх клеток, различимьїх по обширной прозрачной цитоплазме. У животньїх, получавших ФРК в течение четьрех и семи дней, отмечено умеренное увеличение толщинь! слизистой оболочки (Фиг.21). На (Ф, седьмой день слой слизистьїх клеток оказьивается расширенньм и смещенньм к поверхности серозной ка оболочки. Окраска РАБ на четвертьій и седьмой дни вьявляет значительное возрастание числа

РАБ-положительньїх (муцин продуцирующих) бокаловидньх клеток. Окрашивание срезов ВгаО также бо подтверждает, что указаннье клетки образуют пролиферирующий клеточньй слой в железистом желудке.

Кроме того, число делящихся клеток возрастает при обработке ФРК. Толщина РА5-положительного слоя на люминальной поверхности слизистой оболочки желудка на четвертьій и седьмой дни обработки ФРК также значительно увеличиваеєется (Фиг.21).

Во все временнье точки тонкий кишечник оставался в основном нормальньм. Окраска РАБ вьіявляла 65 Возросшее число бокаловидньїх клеток, продуцирующих слизь. Зти бьло особенно заметно на четвертьй и седьмой дни (Фиг.22). Длина ворсинок оставалась одинаковой, а глубина крипт бьіла значительно больше на первьій и седьмой дни (Фиг.22).

К седьмому дню обработки слизистая оболочка ободочной кишки образовьвшвала морщинистье складки, которье значительно увеличивали общую площадь поверхности. Признаки гиперплазии (бифурцированнье и трифурцированньсе крипть! ободочной кишки) имели место во всех группах животньх, включая контрольньх, но они бьіли более вьіраженньмми и многочисленньіми в тех группах, которне получали ФРК в течение коротких временньїх интервалов (один и чЧетьіре дня), причем число гиперпластических крипт уменьшалось с увеличением сроков обработки (Фиг.23). Соответственно, глубина крипт ободочной кишки возрастала с увеличением сроков обработки (Фиг.24). 70 Окраска препаратов РАБ и альциановьмм голубьім показала возрастание числа продуцирующих слизь бокаловидньїх клеток в ободочной кишке после обработки ФРК. Кроме того, у всех обработанньїх ФРК животньх к седьмому дню отмечали возрастание числа окрашиваемьх альциановьм голубьм бокаловидньїх клеток на люминальной поверхности кишки. Обработка животньїх ФРК уже к четвертому дню приводила к заметному увеличению числа РАЗ-положительньх клеток в верхних трех четвертях крипт ободочной кишки.

Приведеннье результать! показьівают, что ФРК обладаеєт сильньмм мито генньім и дифференцировочньм действием на зпителиальнье ткани желудочно-кишечного тракта. Из опьітов по включению Вгд)у очевидно, что

ФРК инициирует пролиферацию слизистьїх клеток в слизистой оболочке желудка. В железистом желудке зти клетки являются клетками-предшественниками. По мере деления они мигрируют наверх, по направлению к просвету желудка, и образуют поверхностнье клетки, или же перемещаются вниз и образуют клетки, 2о формирующие железьі желудка. (Топег еї а), 1989, іп СавігоіпіезНпа! апа Еворпадеа! Раїпоіоду, Спигепнії

Іміпдвіопе, Мем/ ХогКк, МУ, аг радез 13-28). Кроме того, ФРК ускоряет селективную дифференцировку слизистьсх клеток желудка в клетки, которне мигрируют наверх и становятся бокаловидньіми клетками. На четвертьй и седьмой дни обработки общая толщина слизистой оболочки желудка значительно увеличивается. Аналогичнье зффекть! отмечаются также для тонкого и толстого кишечника. с

Стимулируя клетки-предшественники, ФРК ускоряет клеточное деление и приводит к удлинению крипт.

Кроме того, ФРК индуцирует дифференцировку делящихся клеток крипт, что приводит к увеличению і) образования слизи и возрастанию числа бокаловидньх клеток в ворсинках и криптах.

При том, что указаньі отдельнье применения данного изобретения и оно раскрьто в конкретньїх примерах, следует понимать, что приведенное описание не является исчерпьівающим. Так, например, любая из форм «о

ФРК, обладающая усиленньми биологическими свойствами природного ФРК, может бьіть использована для решения перечисленньїх в данной заявке задач. Зти формь! могут включать очищенньій природньій ФРК, о синтезированньйй химическим путем ФРК, рекомбинантньй ФРК, полученньй в системах зкспрессии, отличньїх (М от описанной в данной заявке, а также аналоги, варианть,, химерь и т.п., основаннье на природной аминокислотной последовательности. Все зти формь! должнь! применяться на практике с учетом настоящего ісе) изобретения. «г

Опьїтному исследователю очевидно, что различнье системь! "вектор-хозяин" могут бьіть использовань! для зкспрессии белок-кодирующей последовательности ФРК. Зти системь могут не ограничиваться клетками млекопитающих, инфицированньми вирусами (например, вирусом осповакцинь, аденовирусами и т.д.); клетками насекомьїх, инфицированньми вирусами, в частности, бакуловирусами); дрожжами, содержащими « 0 дрожжевне векторь, а также бактериями, отличньми от Е.соїї, трансформированньми фаговьми, плазмидньми 7-2) с или космидньіми ДНК. Злементьі, контролирующие зкспрессию, в зтих векторах могут отличаться по силе и специфичности. В зависимости от использованной системь! "хозяин-вектор" могут бьіть применень! те или инье ;» транскрипционньсе и трансляционнье злементь!.

Будучи вьіделен, очищен и проверен на активность с использованием описанньх в данной заявке или других Методов, белковьій продукт зкспрессии КДНК ФРК может бьїіть включен в состав различньїх фармакологических ї5» композиций. Как правило, такие композиции включаютудобньй, обьічно химически определенньій носитель или растворитель для терапевтического агента (ФРК) и, в зависимости от способа применения, другие компоненть.

Ме. Композиции могут включать водньй растворитель или же могут бьіть твердофазньми, в которьїх ФРК включен в -І состав неводньїх носителей, таких как коллагеньї, гиалуроновая кислота и различнье полимерьі. Состав такой Композиции может бьть подобран в соответствий с методом введения, включая иньекции, пероральное о введение, наружное и назальное введение, а также введение в легкие.

Ф Как понятно опьітному специалисту, дозировка ФРК будет меняться в зависимости от заболевания и метода введения, но зффективнь!ми могут оказаться дозьі в интервале от 0,01 мг до 500 мг на килограмм веса тела. В зависимости от заболевания и состояния пациента ФРК может применяться однократно или многократно. ФРК дв Может бьть использован в сочетаний с другими препаратами, например цитокинами и ростовьіми факторами, и с другими фармакологическими препаратами, применяемьми для лечения заболеваний кожи, легких, печени и (Ф, пищеварительного тракта. ка СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ (1) ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ: во () ЗАЯВИТЕЛЬ: Атадеп Іпс. (ї) НАЗВАНИЄЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: Терапевтические применения фактора роста кератиноцитов (її) ЧИСЛО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 4 (м) АДРЕС ДЛЯ ПЕРЕПИСКИ: 65 (А) АДРЕСАТ: Атдеп Іпс. (В) УЛИЦА: Атдеп Сепіег, 1840 ЮепамПапа Огіме

(С) ГОРОД: Тпоизапа Оакв (0) ШТАТ: Саїйогпіа (Е) СТРАНА: ОА (Р) ПОЧТОВЬЙ КОД: 91320-1789 (у) ФОРМА ДЛЯ РАБОТЬІЇ С КОМПЬЮТЕРОМ: (А) НОСИТЕЛЬ ИНФОРМАЦИИ: Дискета, 3,5 дюйма, 05, 2,0 МЬ (В) КОМПЬЮТЕР: ІВМ-совместимьй (С) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА: М5-БбО5 70 (Б) ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ: Місгозоїї Ууога

Мегвіоп 5.1а (мі) ТЕКУЩИЕ ДАННЬЕ ПО ЗАЯВКЕ: (А) НОМЕР ЗАЯВКИ: (В) ДАТА ПОДАЧИ: 26-03-1993 (С) КЛАССИФИКАЦИЯ: (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО: 1: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 55 пар оснований (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная (хї) ОПИСАНИЄ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕБЕО ОО МОМ: СОАТТТОАТТ СТАСААОСАС СААТААСАТА

ТОСТТААСОС СТТОСААТТС СОСТАС

(3) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІЮ МО:2: с () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 49 пар оснований і) (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная «о зо (хї) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІЮО МО: 2: ССААТТССАА СОСОТТААСС АТАТОТТАТТ

ССТОСТТСТА СААТСААДАТ о (4) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО: 3: ї- () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 164 парьї оснований ісе) (В) ТИП: нуклеиновая кислота «Е (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО: 3:

СААОАСОААО ССС вО ПОБООСАСОА САСИСАСССА СОСАСАСООСО «

ОО СсСуСссС СОАОАОДАШИ БАСАССООА САОАДОАДОАОО ССССАССАОС в с САОСИССОвОС АСАООСААСА САОССАССАС ПСИССАОЄ ЗАССОДОООАд

Й ОССССбАСИОО АОС и?» (5У ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО ІО МО:4: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 191 пара оснований (В) ТИП: нуклеиновая кислота ї5» (С) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная

Ме. (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО4: -І СОбАСАСААО СООСАООСС ОБСАСОИСОА СОСОАСАОСА ОССАСООСОоСО

САОАААОАОС ОССААДОССАС ААСОССООвОоС ОСОБООСААО ВИОСАСОСАСА о ОСБАОСООО СБААОАОАОА ШООААСОООСИ ССААООАДОАО АооОСсАСОСсс

Ф ААССАСИСОО ССБОССАС ОБИССООССС АААСАССААО о

Claims (1)

1. Формула винаходу (Ф) 1. Способ лечения или предотвращения болезненного состояния у пациента с применением зффективного ГІ количества фактора роста кератиноцитов (ФРК), входящего в состав фармацевтической композиции, путем стимулирования пролиферации или дифференцировки зпителиальньх клеток, вьібранньх из группь, во содержащей гепатоцитьї, пневмоцитьі типа І, муцин-продуцирующие бокаловиднье клетки и другие зпителиальньсе клетки и их предшественники, содержащиеся в печени, легких и желудочно-кишечном тракте.

   2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что болезненное состояние вьібрано из группь!: кожная патология, патологические состояния желудочно-кишечного тракта и дьхательньх путей, цирроз печени, острая печеночная недостаточность, токсический инсульт печени. 65 3. Способ по любому из пп. 1, 2, отличающийся тем, что фармацевтическая композиция содержит неводньй носитель.

   4. Способ по п. З, отличающийся тем, что неводньім носителем является коллаген, гиалуроновая кислота или карбоксиметилцеллюлоза.

   5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что ФРК является природньім ФРК, синтезированньм Химическим путем ФРК или рекомбинантньім ФРК.

   6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что рекомбинантньй ФРК содержит аминокислотную последовательность природного ФРК.

   7. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что ФРК содержит следующую аминокислотную последовательность: Ммаєеї КкСЕ-а5а -

   10 . ТАТСТОСААТОАСАТОАСТОСАСАССАААТООСТАСАААТОТОААСТОТТССАССССТОА АСАСОТТАСТОТАСТОАСОТСТООТТТАСССАТОТТТАСАСТТОАСААСОТСОООАСТ М С МО М т Р ЕО М А ТМ ММ с 55Р Е - СССАСАСАСААСААСТТАТОАТТАСАТОЗААСЗАСОСОАТАТААСАСТОАСААСАСТСТТ состотОотеТТсСтуСААТАСТААТСОТАССТІССТОССОСТАТАТІСТСАСТСТІСТОДОАА В Б т А 570 У МЕ СО ІН У ВК ВА І, Е- Краї Дутяттняятятян---- сИнНТетическая ДНК нн СТСТССААСАСАСТОСТАССТОССТАТССАСАААССССОСАААСТСААСОССАСССААСА САСАССТТОТОТСАССАТОЗАСОСАТАССТОТТТОСОССсСТІТСАСТІССССТОоООоТІСТ св том КІ КНАб КУ Ко то Е- піде 2 о о 2 2 2 2 2 2 2 2 1111 -1-------- с 29 САТОАААААСААСТАСААТАТТАТОСАААТОССТАСТОТТОСТСТТОСТАТССТТОСААТ о СТАСТТТТІСТТОАТСОТТАТААТАССТТТАСОСАТОАСААССАСААССАТАССААССТТА М'Є М М У М І М Е І КТ М А УС ІУАїІ- ЕСОВІ іш кв . о САААССТОТТОААТСТОААТТСТАТСТТОСААТОСААСААССААССААААСТСТАТОСААА СТТТССАСААСТТАСАСТТААСАТАСААССОТТАСТІСТІССТІССТІТТОАСАТАССТТтТ ч- Кб М ЕЕ 5 Е ЕЕ ХХ 0 А М М Кк ЕЕ б ЛК Її хх А К- (Се) САААСААТОСААТСААСАТТОТААСТТСАААСААСТААТТСТОСААЛАССАТТАСААСАС « СТІТСТТАССТТАСТТІСТААСАТТОААСТТІСТІОАТТААСАССТТТТОСТААТотТтТосТо КЕ С М Е 0 С М БЕ КО ЕЕ 0 ОО І 0 ЛЕ М Б хх М т - « АТАТОССАТСАССТАААТОСАСАСАСААСОСАСОССАААТСТІТСТТОСССТТАААТСАДАА ТАТАССТАСТСОАТТТАССТОТОТОТТОССТОСССТТТАСАААСААСООААТТТАСТТТТ - с У А 5 А КМ т НМ б б ЕМ Е М А її Мо Кк- . » " СОСЗАТТССТОТААВАСОСААААААААССААСАААСААСААААААСАССССАСТТТСТТОС ССССТААССАСАТІСТОСТІТТТІТІОСТІСтТТТСтТІСТТТТТТОТСОООТОАААСАдоС : ї» С І Р У Кб КК ТК Кк ЕО КК ТАНЕ М Р- Ге») ТАТООСААТААСТТААТАС АТАСССОТТАТТОААТТАТОССТАО -І М А І т "7 ВалнІ о 50 Ф или ее аналоги, варианть! или химернь!.

   8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что рекомбинантньй ФРК производится в бактериальньїхх клетках, предпочтительно Е. соїї.

   9. Способ по любому из пп. 1-8, огличающийся тем, что его осуществляют іп мімо.

   10. Способ по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что ФРК вводится путем иньекции, орально, местно, ГФ) интраназально или введением через легкие. 7 11. Фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемьій носитель и зффективное количество ФРК для лечения или предотвращения болезненного состояния у пациента путем стимулирования во пролиферации или дифференцировки зпителиальньїх клеток, вьібранньїх из группьі, содержащей гепатоцить, пневмоцитьі типа ІІ, муцин-продуцирующие бокаловиднье клетки и другие зпителиальнье клетки и их предшественники, содержащиеся в печени, легких и желудочно-кишечном тракте.

   12. Фармацевтическая композиция по п. 11, отличающаяся тем, что болезненное состояние вьібрано из группь!: кожная патология, патологические состояния желудочно-кишечного тракта и дьїхательньх путей, цирроз ря печени, острая печеночная недостаточность, токсический инсульт печени.

   13. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 11, 12, отличающаяся тем, что фармацевтически приемлемьїй носитель является неводньім носителем.

   14. Фармацевтическая композиция по п. 13, отличающаяся тем, что неводньм носителем является коллаген, гиалуроновая кислота или карбоксиметилцеллюлоза.

   15. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 11-44, отличающаяся тем, что ФРК является природньім ФРК, синтезированньім химическим путем ФРК или рекомбинантньім ФРК.

   16. Фармацевтическая композиция по п. 15, отличающаяся тем, что рекомбинантньй ФРК содержит аминокислотную последовательность природного ФРК.

   17. Фармацевтическая композиция по п. 15, отличающаяся тем, что ФРК содержит следующую 7/0 аминокислотную последовательность мает коск-аза ТАТОТОСААТОАСАТОАСТОСАСАССАААТООСТАСАААТОТОААСТОТТССАОСССТОА АСАССТТАСТОТАСТОАООТСТООТТТАСОСОАТОТТТАСАСТТОАСААСОТОВОЗАСТ М С М р М т РЕ 0 М А т М У М с 55 Р Е- ССОАСАСАСААСААСТТАТОАТТАСАТОСААСАООЗАТАТААСАСТОАСААСАСТСТТ СсОоСстТоТоТсоТТСтТІСААТАСТААТОТАССТТІССТОСССТАТАТІСТСАСТОТТСТОДОАА в НТ В 5 0 МЕС ОО ІВ У ВА А Е- Краї -----т--------- 0 синтетическая ДНК ------------ СТСТОССААСАСАСТОСТАССТОССОТАТСОАСААЗАСБСООСАААСТСААСОССАСССААБА САСАССТТСОТСТСАССАТОСАСОСАТАССТОТТТОССОССТІТСАСТІССССТОООоТІСТ с Кто мк ІК Ко КМУ Ко то ЕЕ - с пп 00002012... ........ (8) САТОАЛААААСААСТАСААТАТТАТОСАААТОССОТАСТОТТОСТОТТООТАТССТІОСААТ СТАСТТТТТОТТОАТОТТАТААТАССТТТАСОСАТОАСААСОСАСААССАТАССААСОТТА М'К М М хх М І М Е І КТ М А Мб ІУАїІ- (Се) ЕсоВІ (ав) шля . САААСОТСТТСААТСТОААТТІСТАТСТТОСААТСААСААСОСААВСААААСТСТАТОСААА в. СТІТССАСААСТТАСАСТТААСАТАСААСОТТАСТІСОТТССТІССТТІТТОАСАТАСОТТТ с Кк б М ЕЕ 5 ЕЕ БЕ У 0 А М М Кк ЕЕ б Кк 0 т А К- « САДАСААТОСААТОААБАТТОТААСТІСАААСААСТААТТСТООАААЛАССАТТАСААСАС СТТТСТТАССТТАСТІСТААСАТТОАЛАСТТТСТІОАТТААСАССТІТТОСТААТОТТОТО КЕ С М ЕЕ 0 С М ЕЕ К ЕЕ 0 І Б ЕЕ М нн У мМ т- « АТАТОСАТСАССТААЛАТОСАСАСАСААСССАСОССАААТСТТТСТТОССТТАААТСАААА - с ТАТАССТАСТОСАТІТАССТОТОТОТТОССТОСССТІТАСАААСААССОААТІТАСТТТТ чу У А 5 А К М ТТ НН М б б ЕЕ М ЕЕ М А 0 Мо кКк- п СООСБАТТССТСТААСАСОААААЛАЛАСВААСАААСААСААААААСАССССАСТІТСТТСС ССССТААССАСАТТСТоСТТІТІТТТОСТІСтТТІСТІСТІТТТТОТОбОСТОАААСАдоо шк С І Р М В б Кк Кт КК ЕО КК ТАНЕ її Р- Ф ТАТОССААТААСТТААТАО -і АТАССОТТАТІСААТТАТОІСТАЗ с ШІ МА тт: ватні Ф или ее аналоги, варианть! или химернь!.

   18. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 11-17, отличающаяся тем, что рекомбинантньй ФРК производится в бактериальньїхх клетках, предпочтительно Е. сої.

   19. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 11-18, отличающаяся тем, что ее используют іп мімо.

   20. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 11-19, отличающаяся тем, что она вводится путем (Ф, иньекции, орально, местно, интраназально или введением через легкие. іме) 60 б5