UA56166C2 - Компонент в як агент, що рубцює - Google Patents

Abstract

Винахід стосується застосування компоненту В як агента для рубцювання, зокрема в разі лікування ран, виразок та інших травматичних ушкоджень тканин тіла, загоєння яких супроводжується рубцюванням.

Description

Опис винаходу

Настоящее изобретение относится к использованию Компонента В в качестве рубцующего агента, в 2 частности, в лечении ран, язв и других травматических повреждений любьх тканей тела.

Компонент В представляет собой белок, состоящий из 81 аминокислотьії, первоначально вьіделенньій из мочи человека. Человеческий ген бьіл клонирован и зкспрессирован в СНО клетках, как рекомбинантньй человеческий Компонент В. Молекула имеет молекулярньій вес около 8,9кДа и подробно описана в У 94/14259.

Такой белок содержит десять цистеиновьїх остатков и несет основной злемент, типичньій для ферментов сериновой протеазь. Проверка последовательности в базе данньїх белков показала некоторое сходство

Компонента В с известньми молекулами, такими как СО59, рецептор урокиназь! (ПРА-К) и некоторьми ядовитьіми токсинами.

Сведения, полученнье Заявителем из изучения распределения Компонента В в органах и тканях мьішей 72 показьівали, что глаз, легкоє и кожа являются теми участками, в которьїх в основном зкспрессирована РНК

Компонента В. Обнаружено, что в тканях человека Компонент В широко зкспрессирован в сквамозном зпителийи и слизистой, например, в коже, пищеводе и зкзоцервиксе, как определено иммуногистохимическими методами.

Наконец, обнаружено, что ЕСЕ индуцирует зкспрессию РНК Компонента В в А 431 клетках сквамозного зпидермиса человека.

Есть сообщения, что компонент В обладаєт противовоспалительной, антикоагулирующей и противоопухолевой активностью, так же как и активностью в качестве ингибитора связьівания ТОБ-о со своим рецептором.

В настоящее время заявитель обнаружил, что Компонент В также пригоден в качестве рубцующего агента, и что следовательно он пригоден, в частности, для лечения ран, язв и других травматических повреждений с 75 любих тканей тела. Ге)

Следовательно, основньім предметом настоящего изобретения является использование Компонента В для получения фармацевтической композиции, пригодной в качестве рубцующего агента, в частности в лечениий ран, язв и других травматических повреждений любьїх тканей тела.

Еще одним обьектом данного изобретения является способ лечения ран, язв и других травматических шо повреждений тканей тела, включающий применение зффективного количества Компонента В вместе с «о фармацевтически приемле-мьїм зксципиентом.

Другим аспектом изобретения являются фармацевтические композиции, полученньєе так, как описано вьіше. -

Что касается способа получения Компонента В и его аминокислотной последовательности, то они (Се) раскрьіваются в МО 94/14259.

Зо Активньй ингредиент может вводиться оральньіїм, внутривенньім, внутримьшшечньі!м или подкожньїм путем, що или применяться местно. Данное изобретение включает и другие пути введения, позволяющие создать в крови желаемьій уровень соответствующих ингредиентов.

Для лечения человека предпочтительнье дозь! составляют 1мг/кг или менее для системного применения и « 4мкг/см? или менее для местного применения. - то Кроме того, изобретение иллюстрируется с помощью следующих примеров, которье не должнь с рассматриваться, как ограничивающие настоящее изобретение. В Примерах дань! отсьілки к Фигурам, как :з» указано ниже.

Краткое описание рисунков

Фигура 1: показан зффект от внутривенного применения Компонента В в сравнении с зффектом от сл но бетаметазона (ВепіепакЮ) в зкспериментальном заживлении рань. В частности, суммировань! результать

Зксперимента 1. Анализируемье лекарства назначали ежедневно в течение 6 последовательньх дней с 0 (дня (22) образования рань) до 5 дня (включительно). - Фигура 2: показан зффект внутривенного применения Компонента В (серия 0004-0015) в сравнениий с зффектом от бетаметазона (Вепіепа(є) в зкспериментальном заживлений рань. В частности, суммировань (о) 50 результать! Зксперимента 2. Анализируемье лекарства вводились ежедневно в течение б последовательньх

Ф дней с 0 (дня образования раньї) до 5 дня.

Фигура 3: показан зффект местного применения Компонента В (серия 004-001) в зкспериментальном заживлений рань. В частности, суммированьй результатьь Зксперимента 3. Анализируемье лекарства вводились ежедневно в течение 5 последовательньмх дней с 0 (для образования рань) до 4 дня.

Фигура 4: показан зффект местного применения бьічьего сьівороточного альбумина в зкспериментальном (Ф) заживлений рань. В частности суммировань! результать! Зксперимента 4. Анализируемье лекарства вводились з ежедневно в течение 5 последовательньх дней с 0 (дня образования рань) до 4 дня.

Фигура 5: представлен анализ сигмоидального ответа на введение дозьі в применении к результатам

Зксперимента 1. На оснований результатов Зксперимента 1 проведена статистическая оценка зффекта от бо внутривенного введения Компонента В (серия 004-001 и 0004-0015, обозначеннье как "001" и "0016", соответственно) и бетаметазона (Вепіепа|в) на зкспериментальное заживление рань.

Фигура 6: представлен анализ сигмоидального ответа на введение дозьі в применении к результатам

Зксперимента 2. На оснований результатов Зксперимента 2 проведена статистическая оценка зффекта от внутривенного введения Компонента В (серия 0004-0016, отмеченная как "001Б") и бетаметазона (Вепіепаї! Ф) на б5 зкспериментальное заживление рань.

Фигура 7: представлен анализ сигмоидального ответа на введение дозьі в применении к обьединенньм результатам Зкспериментов 1 и 2. На оснований обьединения результатов Зксперимента 1 и 2, проведена статистическая оценка зффекта от внутривенного введения Компонента В (серия 0004-0015) на Зкспериментальное заживление рань.

Фигура 8: представлен анализ сигмоидального ответа на введение дозьі в применении к кумулятивной частоте, относительно комбинации Зкспериментов 1 и 2. Произведена оценка зффекта Компонента В (серия 004-0016).

Фигура 9: представлен анализ сигмоидального ответа на введение дозьі в применении к результатам 7/0 Зксперимента 3. На оснований результатов Зксперимента З проведена статистическая оценка зффекта от местного и внутривенного введения Компонента В (серия 004-001) на зкспериментальное заживление рань.

Фигура 10: представлен анализ сигмоидального ответа на введение дозьі в применении к результатам

Зксперимента 4. На оснований Зксперимента 4 проведена статистическая оценка сравнения между зффектами, произведенньіми буфером и ВЗА на уменьшение рань.

ПРИМЕРЬ

Материал

Животнье

Мьіши ЗРЕ СО-1 обоих полов, закупленнье у СНагіез Кімег, Италия (СаїЇсо, Сото, Италия) использовались для зкспериментов после, по крайней мере, семидневного периода акклиматизации, проводимого под

Контролем условий окружающей средьі (температура 22 ї- 2"С, влажность 55 - 1095 и двенадцатичасовьм циклом свет/темнота).

Анализируемье соединения -г-ес-й Компонент В партия 004-001 (сульфатированная форма) и 004-0016 (несульфатированная форма) зкспрессировали в СНО клетках и получали, по существу, как описано в УМО 94/14259. с - Коммерческий препарат бетаметазона (Вепіепа!Ф) от СіІахо (Верона, Италия) - Хлорид натрия 0,995 (физиологический раствор) от Вахіег (Триест, Италия) о

Бьічий сьівороточньїй альбумин (В5А), фракция М от бБідта Спетіса! Со (сант-Луис Мо, США)

СспПОСОБЬІ

Зкспериментальное заживление рань! по всей ее толщине Ге)

Используемь!й способ бьіл предложен .).Р. Могіоп и М.Н. Маїоп (Могіоп .).Р. апа Маїоп М.Н., Агер. Іпс.

Рпагтасодуп., 196 : 117, 1972), которне использовали зтот процесс для оценки множества лекарственньх о средств на их ранозаживляющую активность у крьс. «-

Для настоящего исследования Компонента В зтот оригинальньй способ, для удобства его применения на мьішах, біл модифицирован следующим образом. ее,

Круглая чернильная метка (1см в диаметре) наносилась на спинную область самцов мьішей (30 - З5г, ю возраст 6 - 7 недель), и кожа зтого маркированного участка (включая раппісцив согпозив и прилегающие ткани) иссекалась с помощью хирургических ножниц и хирургических щипцов. Рану затем промокали насухо марлевой подушечкой до наступления гемостаза. В 0 день, то есть в день операции, проводили продольньй, поперечньй и два диагональньїх измерения (относительно позвоночного столба) диаметра рань! с точностью до 0,1мм, « используя кронциркуль. Определеннье таким образом точки бьли отмечень! несмьваемьми чернилами, 8 с нанесенньми на примькающий участок кожи. Последующие измерения рань проводились каждьй й последующий день кроме воскресенья до полного закрьтия рань. Как хирургическая процедура, так и "» измерения проводились под легкой анестезией мьішей зфиром.

Площадь каждой рань! бьіла получена путем умножения квадрата из среднего диаметра, составлявшего около 0,7854. Затем рассчитьшвалось процентное закрьтие рань относительно 0 дня. Средние значения с процента закрьттия рань для каждого дня измерения вносились в таблицу для каждой зкспериментальной группьї и интерполировалось время 5095 затягивания (СТ 50). б Системное лечение - Проводились два Зксперимента (Зксперименть 1 и 2). Во втором зксперименте в каждьйй день проведения 5ор измерений они проводились одним и тем же оператором, которьій не знал схемь! лечения. В каждом б зксперименте животньх делили на 4 группьї и лечили в соответствии со следующей схемой. 42) з о іме)

Животнье получали лечение 1 раз в день в течение б последующих дней. Вес тела животньїх измеряли в бр /Течение всего времени проведения зксперимента.

Местная обработка

В следующем зксперименте (Зксперимент 3) зффект местного применения различньїх доз Компонента В (серия 004-001) изучали при использований уже описанньїх способов нанесения раньії с последующим лечением по схеме, описанной в приведенной ниже таблице. бо Номер группь! Лечение

В первьій и второй дни раствор исследуемого вещества наносили (в обьеме 0,О05мл) на поверхность ран, тогда как в последующие дни, когда образовьивался струп, его вводили под струп с помощью шприца, 70 снабженного 250 иглой.

Компонент В, вводимьй овнутривенно в дозе мг/кг, использовался в качестве положительного сравнительного стандарта.

Чтобьі исключить возможность неспецифического зффекта от местного применения белкового раствора, в параллельном зксперименте исследовали зффект от местного применения ВЗА в таких же молярньх 7/5 Концентрациях (8,8 х 10-9М) как и Компонент В в сравнений с фосфатньм буферньм раствором (Зксперимент 4).

РЕЗУЛЬТАТЬ

Заживление рань!

На Фигуре 1 показаньь даннье первого Зксперимента, в котором сравнивалась активность двух серий (004-001 и 004-001Б5) Компонента В. Они обе показали способность к ускорению процесса рубцевания, причем их зффект бьл очевиден уже после 1 дня лечения. СТ со, то есть время, в течение которого происходил 5095 закрьтие (снижение площади) раньі, составляет 3,0 и 3,4 дня, соответственно, и зти значения не бьіли статистически различньми. Но в оотличие от зтого, при применении бетаметазона (Вепіепа(ф) и физиологического раствора СТбво наблюдалось на 7,8 и 7, дня соответственно (смотри параграф, с ов озаглавленньй "Статистический анализ").

Во втором зксперименте (Фигура 2) исследовались две дозьі Компонента В (партия 0004-0015). При самьх і) больших дозах, мг/кг, СТво составляло 3,7 дня, тогда как при самьїх низких дозах (0,1мг/кг) оно составляло 6,6 дней. Группьії, обработаннье физиологическим раствором и бетаметазоном, показали СТво как 91 и 10 дней соответственно (смотри параграф, озаглавленньій "Статистический анализ"). «я зо Положительное влияние Компонента В на заживление рань! также подтверждается другим показателем, а именно ЕТво, которьій указьвает время, когда у 50956 животньїх происходит полное закрьтие рань! (смотри ке, параграф, озаглавленньій "Статистический анализ"). -

Результать! зксперимента, в котором Компонент В (партия 004-001) наносится место на поверхность рань! (Зксперимент 3), представлень на фигуре 3. Соединение исследовалось в дозах 1,2 и 4мкг/день в течение 5 со

З5 последовательньх дней. Все исследованнье дозьі проявили способность к усилению процесса заживления ран ю по сравнению с контролем. В частности, при дозах от 2 до 4мкг величина СТ5о составляла 38 и 44 соответственно, что сравнимо с полученньім Сто (3,9) при применениий Компонента В в дозе мг/кг, введенной внутривенно. При самьїх низких дозах (1мкг) величина СТро составляла 5,3 дня, что вьіше величинь! СТ во, полученной двумя другими дозами при местном применений, но все-таки значительно отличается от контроля « (смотри параграф, озаглавленньй "Статистические анализьг"). шщ с Зти даннье позволяют думать, что доза в 2мкг при местном нанесений на рану дает максимальньій зффект, и что доза 1мкг все еще остается зффективной в ускоренийи процесса рубцевания. ;з» Чтобьі проверить, является ли положительног влияние Компонента В на процесс заживления ран специфической характеристикой продукта, проводился параллельньй зксперимент, в котором зффект В5А в тех же молярньх концентрациях, что и Компонент В, сравнивался с зффектом от применения фосфатного «сл буфера (Зксперимент 4). Зти даннье представлень на Фигуре 4. СТео, составляющий 9,9 и 7,9 дней, бьіло отмечено с ВЗА и фосфатньім буфером, соответственно. Вьішеприведеннье значения не являются значимо іа различньмми (смотри параграф "Статистический анализ"), таким образом указьвая на то, что стандартньй -к раствор белка, такого как В5А, не влияет на затягивание кожей рань.

Конкретнье даннье зкспериментов представлень в таблицах ТА - 4В. іа СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Ф Статистическая стратегия

Цель статистического анализа состоит в сравнениим зффекта, оказанного через определенньій промежуток времени от применения двух препаратов Компонента В (Комп.В) как относительно физиологического раствора, дв таки лекарственного средства для сравнения - Вепіепа|.

Кроме зтого, бьіила также проведена оценка зффективности от системного и местного применения одного (Ф, препарата Компонента В. ка В соответствии с графиком лечения зффект от исследуемого лекарства изучался с учетом всего периода наблюдения. во Зксперимент по заживлению рань повторялся дваждьі с целью подтверждения влияния Комп.В при различньїх дозах.

Статистический тест

В статистическом тесте использовали Анализ ответа на введение сигмоидальной дозь! для оценки СТво (то есть времени, когда площадь раньї уменьшается на 50965) (смотри Ріппеу 0..)., Віотеїйгісв, 32, рр. 721-40, 1976). 65 Статистические показатели 1) Уменьшение рань (СТво): Средний процент отклонений от среднего (основного) уровня значений.

2) Кумулятивная частота (ЕТ 50): кумулятивная частота животньїх, показавших полное затягивание рань! в любой момент времени.

Группьї лечения (Зксп. Мо1) 1 - Физиологический раствор - 1Омл/кг/день, интраперитонеально в течение 6 дней. 2 - Вепієепаї - 1мг/кг/день, интраперитонеально в течение 6 дней.

З - Комп.В 004-001 - 1мг/кг/день, внутривенно в течение 6 дней. 4 - Комп.В 004-0016 - 1мг/кг/день, внутривенно в течение 6 дней.

Группьї лечения (Зксп. Мо2) 70 1 - Физиологический раствор - 1Омл/кг/день, внутривенно в течение 6 дней. 2 - Вепіепаї - Тмг/кг/день, внутривенно в течение 6 дней.

З - Комп.В 004-001 - О,1мг/кг/день, внутривенно в течение 6 дней. 4 - Комп.В 004-0016 - 1мг/кг/день, внутривенно в течение 6 дней.

Группьї лечения (Зксп. МоЗ) 1 - Фосфатньйй буфер - 5Омкл/день, местно, в течение 5 дней. 2 - Комп.В 004-001 - Імкг/день, местно, в течение 5 дней.

З - Комп.В 004-001 - 2мкг/день, местно, в течение 5 дней. 4 - Комп.В 004-001 - 4мкг/день, местно, в течение 5 дней. 5 - Комп.В 004-001 - 1мг/кг/день, внутривенно, в течение 5 дней.

Группьї лечения (Зксп. Мо 4) 1 - Фосфатньйй буфер - 5Омкг/день, местно, в течение 5 дней. 2 - Бнічий сьівороточньй альбумин (В5А) - 5Омкл/день, (8,8 х 109М), местно, в течение 5 дней.

Схема лечения (для зкспериментов 1,2, Зи 4)

Фаза 2: Дни повторного введения в соответствий с вьішеприведенньїм описанием лечения для групп. с

Фаза 2: Период наблюдения вплоть до момента полного затягивания рань.

РЕЗУЛЬТАТЬІЇ СТАТИСТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА і)

Диаграммь! (анализ сигмоидальной зависимости "зффект-доза" при введений), показаннье на Фигуре 5 - 10, суммируют зффект исследуемого лекарственного средства, используя площадь рань! в качестве переменной величинь. Ге)

Зксперимент 1

Дается ссьілка на фигуру 5. о

Результатьі анализа сигмоидальной зависимости зффекта от дозьі при введений (СТсо) в примененимй ко о/чее площади раньї, касающиеся зксперимента 1, представлень! в следующей таблице. со зв ю / еизолочесюйрястор 72 5283096, « - с Зксперимент 2

Дается ссьілка на фигуру 6. ;» Результатьі анализа сигмоидальной зависимости зффекта от дозьі при введений (СТво) в применений к площади раньї, касающиеся зксперимента 2, представлень! в следующей таблице. с

Ф 7 Велеянмю 00000000 зв 04 ово, щ мовою 1856. 55 овк (22)

Ф Комбинация Зкспериментов Ти 2

Дается ссьілка на фигуру 7

Суммируются результатьї, полученнье при обьединении данньїх для групп лечения, общих для обоих вв Зкспериментов 1 и 2, то есть физиологического раствора относительно Комп.В - 004-001р мкг/кг.

Кроме того, также оценивалась частота животньїх, показьівающих по прошествии времени полное (Ф. затягивание рань! (анализ зависимости зффекта (ответ) от дозьі при сигмоидальном введений) из обьеединения

ГІ данньїх Зкспериментов 1 и 2.

Результатьі анализа сигмоидальной зависимости зффекта от дозьі при введений (СТво) в применений к бр площеади рань, касающиеся комбинации зкспериментов 1 и 2, представлень! в следующей таблице. бо Для кумулятивной частоть! дается ссьілка на фигуру 8.

Результатьь анализа сигмоидальной зависимости зффект-доза при введений (ЕТво) в применений к кумулятивной частоте, касающиеся комбинации зкспериментов 1 и 2, представлень! в следующей таблице. 1 компвоолоствімію 171 лем ово

В заключение, сравнение значений СТоо. и среди значений ЕТоо является хорошим подтверждением зффекта каждого исследуемого лекарственного средства на зкспериментальной модели. то Обнаружено, что Комп.В-001 (мг/кг, внутривенно), так и Комп.В-0015 (уровень дозьі О,мг/кг и мг/кг, внутривенно) статистически отличаются от физиологического раствора и препарата Вепіепа! в Зкспериментах 1 и 2. Результатьіь сочетания групп лечения, общих для зкспериментов 1 и 2, подтверждают зффект внутривенного пути введения Комп.В мг/кг.

Зксперимент З

Дается ссьілка на фигуру 9.

Проводился дополнительньй зтап зксперимента, в котором продукт применялся местно. В качестве положительного стандарта для сравнения использовался внутривенньй путь введения. Даннье анализировались с использованием статистической модели, описанной вьіше.

Результать! анализа сигмоидальной зависимости зффект-доза при введений (СТео) в применений к площади раньії, касающиеся зксперимента 3, представлень! в следующей таблице. 1 еоратнявююр 0830 7395096 ся о

В заключение, местное применение Комл.В-0016 показало, что при всех исследованньїх дозах уменьшение ї-о рань (СТво) значительно отличается от полученного при использований фосфатного буфера. (Се)

Зксперимент 4

Дается ссьілка на фигуру 10 -

Диаграмма показьивает сравнение между влиянием местного применения фосфатного буфера и ВЗА на (Се) уменьшение рань для того, чтобьї исключить возможность неспецифического воздействия Компонента В.

Результать! анализа сигмоидальной зависимости зффект-дозь! при введений (СТево) в применений к площади о раньії, касающиеся зксперимента 4, представлень! в следующей таблице. « - с 7 ввА777777111ве 111 в5-мя боб з» Вьішеприведеннье результатьь не показьшают какого-либо различия между местньм применением фосфатного буфера и ВЗА.

ВЬІВОДЬІЇ ИЗ ВСЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Интересньім результатом зтого исследования является активность Компонента В в процессе заживления іні ран как при внутривенном, так и при местном применении. Зкспериментальная модель, использованная в зтом

Ф исследований, прямо относится к моделированию травмь! человека и к указаниям по применению Компонента В в заживлениий травматического повреждения кожи и при пластических и реконструктивньїх операциях на - слизистой и зпителии. б 50

Ф

Claims (5)

Формула винаходу

1. Применение Компонента В в качестве рубцующего агента. 99

2. Применение Компонента В в качестве агента для получения лекарственного препарата, пригодного для Ге) лечения ран, язв и других травматических повреждений тканей тела, заживление которьїх сопровождается рубцеванием.

о

3. Применение по пп. 1 или 2, где лекарственньйй препарат пригоден для лечения хирургических ран.

4. Фармацевтическая композиция, пригодная в качестве рубцующего агента и находящаяся в подходящей 60 форме для применения в качестве рубцующего агента, содержащая Компонент В в качестве активного ингредиента вместе с фармацевтически приемлемьм зксципиентом.

5. Способ лечения ран, язв и других травматических повреждений тканей тела, заживление которьх сопровождается рубцеванием, включающий введение зффективного количества Компонента В вместе с фармацевтически приемлемьм зксципиентом. б5