CN113491681A - 大麻素分子cbg在制备炎症性疼痛药物中的应用及药用制剂 - Google Patents

大麻素分子cbg在制备炎症性疼痛药物中的应用及药用制剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了大麻素分子CBG在制备炎症性疼痛药物中的应用及药用制剂。本发明通过局部给药实验发现，不同大麻素分子对炎症性疼痛有不同的效果，进一步发现了CBG效果最优，且强于针对SNI疼痛的效果。进一步，对CBG的有效剂量(0.25～3mg/kg)和作用时间(60min～140min)进行了筛选，优选了CBG的起效剂量(1～3mg/kg)和作用时间(60～100min)。最后通过动物关节炎模型验证，发现CBG可以治疗关节炎痛。本发明的结果表明大麻素分子CBG更适合用于治疗炎症性疼痛，且可开发为外用制剂。

Description

大麻素分子CBG在制备炎症性疼痛药物中的应用及药用制剂
技术领域
本发明属于大麻素药物技术领域，具体涉及大麻素分子CBG在制备炎症性疼痛药物中的应用及药用制剂。
背景技术
关于大麻素分子在治疗疼痛方面的用途主要为GW公司2012年公布的专利“用于治疗神经性疼痛的大麻素类化合物”，该专利提出了利用大麻素治疗神经性疼痛，包括CBD/CBG/CBC/CBDV/THCV这5个成分，并对5个大麻素分子针对SNI(坐骨神经痛)模型小鼠的镇痛活性进行了考察和比较，发现CBDV/THCV/CBG在2.5mg/kg和5mg/kg的效果强于CBD。GW公司的专利主要通过构建SNI模型，然后于模型构建后每天给药(腹腔给药)，在3、7、14天时测定机械痛阈或热痛阈；该专利中构建的疼痛模型较为单一，神经痛不一定为最优适应症。
关节炎导致的疼痛是临床常见病症。常见药物为口服解热镇痛药或局部使用中药贴剂，可能有副作用且效果一般。开发局部使用的镇痛药物具有广泛应用前景。上述GW发明专利发现了腹腔注射(系统给药)大麻素(CBD/CBG/CBC/CBDV/THCV)治疗神经痛的效果，针对其他疼痛类型及其他给药方式的效果尚未明确。
发明内容
本发明的目的是，提供大麻素分子CBG在制备炎症性疼痛药物中的应用及药用制剂。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：
本发明提供了大麻素分子CBG在制备炎症性疼痛药物中的应用。
作为优选实施方案，由大麻素分子CBG制备的炎症性疼痛药物为局部给药药物。
本发明还提供一种用于治疗炎症性疼痛的药用制剂，该制剂包含大麻素分子CBG。
作为优选实施方案，该制剂为局部给药制剂。
作为优选实施方案，该制剂含有以实验小鼠给药剂量1-3mg/kg为计算基础换算得到的人用剂量。进一步优选地，该制剂含有以实验小鼠给药剂量2mg/kg为计算基础换算得到的人用剂量。
作为优选实施方案，所述制剂用一种或多种药学上可接受的载体配制。
作为优选实施方案，所述制剂与一种或多种其他药用物质联合使用。
本发明首先构建了角叉菜胶诱导的炎症性疼痛模型。由于角叉菜胶是一种经典致炎剂，通过局部足底注射角叉菜胶可诱导类似关节炎的足肿胀和疼痛敏感。造模后通过机械刺激发现了角叉菜胶诱导的炎症会使小鼠的痛阈下降。进一步，通过局部注射大麻素(CBD/CBC/CBG)研究小鼠的痛阈变化，该给药方式可模拟外用制剂局部起效，相比于GW专利的腹腔给药，局部给药起效更快、安全性更好、顺应性更高。
初步研究发现，CBG对炎症痛的镇痛效果优于CBD/CBC，与多种阳性药物镇痛效果相似。进一步，对CBG的有效剂量(0.25～3mg/kg)和作用时间(60min～140min)进行了筛选。优选了CBG的起效剂量(1～3mg/kg)和作用时间(60～100min)。此外，考察了CBG的安全性，腹腔注射最高到60mg/kg未引发小鼠死亡。
进一步为了明确CBG对炎症性疼痛的优越性，比较了CBG对SNI模型和炎症痛模型的镇痛效果，发现CBG在SNI模型上剂量较高才起效(20mg/kg)。表明CBG更适用于炎症性疼痛。
最后，构建了胶原诱导的关节炎小鼠模型，该模型为常用关节炎模型，发现关节炎小鼠存在疼痛敏感，通过局部给药方式，发现CBG对关节炎疼痛有较好的治疗效果。相比于腹腔给药，局部给药效果更好。
此外，本发明还发现CBG可能通过TRPV1通路发挥镇痛作用。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1，本发明首先发现了通过局部给药，不同大麻素分子对炎症疼痛有不同的效果，进一步发现了CBG效果最优，且强于针对SNI疼痛的效果。说明炎症性疼痛更适合作为CBG适应症，且可开发为外用制剂。进一步对CBG作用时间、剂量、安全性进行了系统考察。最后通过动物关节炎模型验证，发现CBG可以治疗关节炎痛。
2，本发明对CBG的有效剂量(0.25～3mg/kg)和作用时间(60min～140min)进行了筛选，优选了CBG的起效剂量(1～3mg/kg)和作用时间(60～100min)。初步探索了CBG的作用机制，发现其可能通过激活TRPV1通道导致Ca2+离子内流，引发TRPV1通道脱敏，从而发挥镇痛作用。
3，炎症痛特别是关节炎痛，严重影响患者生活品质。本发明提供了一种大麻素分子在制备炎症性疼痛药物中的应用，可降低患者疼痛，且可通过外用提高顺应性和安全性，因此具备较强的社会价值。市场针对关节痛的常用中药贴剂，效果不佳，因此本发明具备较强的市场前景。
附图说明
图1是本发明实施例1中不同大麻素对炎症疼痛镇痛效果的示意图。
图2是本发明实施例2中CBG和CBD对炎症疼痛镇痛效果的示意图。
图3是本发明实施例3中CBG和不同阳性药物对炎症疼痛镇痛效果的示意图。
图4是本发明实施例4中不同剂量的CBG药物对炎症疼痛镇痛效果的示意图。
图5是本发明实施例5中考察CBG药物起效时间的结果示意图。
图6是本发明实施例8中SNI模型针刺部位示意图。
图7是本发明实施例8中CBG对坐骨神经疼痛小鼠的镇痛效果示意图。
图8是本发明实施例9中CBG局部给药对关节炎疼痛小鼠的镇痛效果示意图。
图9是本发明实施例10中CBG腹腔给药对关节炎疼痛小鼠的镇痛效果示意图。
图10是本发明实施例11中检测不同处理组的细胞内Ca2+离子浓度的荧光图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
实施例1不同大麻素对炎症痛模型小鼠的镇痛作用
清洁级昆明种小鼠购于北京维通利华公司；角叉菜胶购于Sigma公司；蓖麻油、吲哚美辛、布洛芬、阿司匹林购于Adamas公司；针刺足底痛觉测试仪购于深圳瑞沃德生命科技有限公司。
分组：将30只昆明种小鼠(雌性)随机分正常组(生理盐水，即空白对照组)、模型组(2％角叉菜胶)、CBC组、CBD高剂量组、CBD低剂量组、CBG组，每组5只。分组及用药情况如表1所示。
表1
Figure BDA0003206691140000041
CBC、CBD、CBG溶液配制：称取大麻素类药物(CBC/CBD/CBG均为自制，纯度>98％)粉末4mg溶于50μL乙醇中，加入50μL聚氧乙烯基蓖麻油(Titan，P1603588)混合均匀，再加入900μL纯化水，制得4mg/ml的大麻素药物溶液。
2％角叉菜胶配制：称取20mg角叉菜胶(Titan，P1490955)溶于1mL纯化水中，制得2％的角叉菜胶溶液。
采用足底给药的方式，左后肢注射生理盐水，右后肢先注射角叉菜胶，20min后给药。分别于60min、100min测定小鼠痛阈变化。
痛阈值测定：将小鼠置于针刺足底痛觉测试仪(RWD,37450,中国)上，让其自由活动，当小鼠停止探索行为，相对安静后，移动刺激单元，利用反光镜辅助将刺激针对准脚爪表面的刺激区域，然后按下刺激单元手柄一侧的开始按钮。以小鼠因感到疼痛而抬起脚爪所测得的回避受力值为观察指标，记录每只小鼠的回避力度(g)。测试60min、100min后小鼠给药侧后肢和对照侧后肢的回避力度(g)。为了避免误差，每个后肢都测量5次，取平均值。
统计分析：计算同一只小鼠的痛阈值变化百分比(％)，计算公式为：痛阈值变化百分比(％)＝(给药侧后肢回避力度－对照侧后肢回避力度)/对照侧后肢回避力度*100％。
计算同组小鼠的痛阈值变化百分比均值及SD值，然后通过T-test检验不同组间统计学差异，p<0.05被认为具有统计学差异。
不同大麻素对炎症疼痛的镇痛效果如图1所示。角叉菜胶诱导的炎症疼痛小鼠痛阈值变化百分比在造模后明显降低，与正常组相比，模型组在60min、100min时均有显著性差异(P<0.05，P<0.001)，说明造模成功。与模型组相比，低剂量CBD组(1mg/kg)在100min时回避受力提高百分比明显升高(P<0.05)，高剂量CBD组(2mg/kg)在60min、100min时回避受力百分比均显著升高(P<0.01，P<0.001)；CBG组在60min、100min时回避受力百分比也明显升高(P<0.01，P<0.001)。CBC组相比于模型组没有显著变化。实验结果表明：CBD、CBG有较好的镇痛作用，而CBC无镇痛作用。
实施例2CBG和CBD对炎症痛模型小鼠的镇痛作用比较
分组：将80只小鼠随机分为正常组、模型组、CBD组、CBG组，每组20只小鼠，雌雄各10只。采用足底给药的方式，左后肢注射生理盐水，右后肢注射角叉菜胶，20min后左后肢注射基质，右后肢注射相应药物，正常组、模型组两个后肢都注射基质，采用针刺法来评价CBD、CBG的镇痛作用。分组及用药情况如下表2所示。
表2
Figure BDA0003206691140000061
CBD、CBG溶液配制：称取药物(CBD/CBG均为自制)粉末4mg溶于50μL乙醇中，加入50μL聚氧乙烯基蓖麻油(Titan，P1603588)混合均匀，再加入900μL纯化水，制得4mg/ml的药物溶液。
2％角叉菜胶配制：称取20mg角叉菜胶(Titan，P1490955)溶于1mL纯化水中，制得2％的角叉菜胶溶液。
采用足底给药的方式，左后肢注射生理盐水，右后肢先注射角叉菜胶，20min后给药。分别于60min、100min测定小鼠痛阈变化。
痛阈值测定：将小鼠置于针刺足底痛觉测试仪(RWD,37450,中国)上，让其自由活动，当小鼠停止探索行为，相对安静后，移动刺激单元，利用反光镜辅助将刺激针对准脚爪表面的刺激区域，然后按下刺激单元手柄一侧的开始按钮。以小鼠因感到疼痛而抬起脚爪所测得的回避受力值为观察指标，记录每只小鼠的回避力度(g)。测试60min、100min后小鼠给药侧后肢和对照侧后肢的回避力度(g)。为了避免误差，每个后肢都测量5次，取平均值。
统计分析：计算同一只小鼠的痛阈值变化百分比(％)，计算公式为：痛阈值变化百分比(％)＝(给药侧后肢回避力度－对照侧后肢回避力度)/对照侧后肢回避力度*100％。
计算同组小鼠的痛阈值变化百分比均值及SD值，然后通过T-test检验不同组间统计学差异，p<0.05被认为具有统计学差异。
CBG和CBD对炎症疼痛的镇痛效果如图2所示。角叉菜胶诱导的炎症疼痛小鼠痛阈值变化百分比在造模后明显降低，与空白对照组相比，模型组在60min、100min时均有显著性差异，说明造模成功。与模型组相比，CBG组在60min、100min时回避受力百分比也显著升高。然而CBD组在60min相比于模型组没有显著变化。实验结果表明：在较大样本量及雌雄两种性别试验基础上，CBG相比于CBD有较好的镇痛作用。
实施例3CBG和多种阳性药物对炎症痛模型小鼠的镇痛作用比较
分组：将96只昆明小鼠随机分为6组，每组雌雄共计16只，正常组、模型组、模型+CBG 2mg·kg-1组、模型+吲哚美辛2mg·kg-1组、模型+阿司匹林2mg·kg-1组、模型+布洛芬2mg·kg-1组。模型组小鼠左后肢注射生理盐水，右后肢注射1％角叉菜胶致炎，采用足底给药的方式，20分钟后左后肢注射基质，右后肢注射相应药物，正常组和模型组两个后肢都注射基质，采用针刺法来评价CBG的镇痛效果。分组及用药情况如表3所示。
表3
Figure BDA0003206691140000071
CBG及阳性药物溶液配制：称取药物(CBG为自制)粉末4mg溶于50μL乙醇中，加入50μL聚氧乙烯基蓖麻油(Titan，P1603588)混合均匀，再加入900μL纯化水，制得4mg/ml的药物溶液。
2％角叉菜胶配制：称取20mg角叉菜胶(Titan，P1490955)溶于1mL纯化水中，制得2％的角叉菜胶溶液。
采用足底给药的方式，左后肢注射生理盐水，右后肢先注射角叉菜胶，20min后给药。分别于60min、100min测定小鼠痛阈变化。
痛阈值测定
将小鼠置于针刺足底痛觉测试仪(RWD,37450,中国)上，让其自由活动，当小鼠停止探索行为，相对安静后，移动刺激单元，利用反光镜辅助将刺激针对准脚爪表面的刺激区域，然后按下刺激单元手柄一侧的开始按钮。以小鼠因感到疼痛而抬起脚爪所测得的回避受力值为观察指标，记录每只小鼠的回避力度(g)。测试60min、100min后小鼠给药侧后肢和对照侧后肢的回避力度(g)。为了避免误差，每个后肢都测量5次，取平均值。
统计分析：计算同一只小鼠的痛阈值变化百分比(％)，计算公式为：痛阈值变化百分比(％)＝(给药侧后肢回避力度－对照侧后肢回避力度)/对照侧后肢回避力度*100％。
计算同组小鼠的痛阈值变化百分比均值及SD值，然后通过T-test检验不同组间统计学差异，p<0.05被认为具有统计学差异。
CBG和不同阳性药物对炎症疼痛的镇痛效果如图3所示。角叉菜胶诱导的炎症疼痛小鼠痛阈值变化百分比在造模后明显降低，与空白对照组相比，模型组在60min、100min时均有显著性差异，说明造模成功。与模型组相比，CBG组和阳性药物均有显著镇痛作用。结果表明：CBG组和不同阳性药物组之间没有显著差异，表明CBG和多种上市药物的镇痛效果相当。
实施例4CBG针对炎症疼痛的有效剂量筛选
分组：将40只雌性小鼠随机分为8组，每组5只，正常组、模型组、模型+CBG0.25mg·kg-1组、模型+CBG 0.5mg·kg-1组、模型+CBG 1mg·kg-1组、模型+CBG 2mg·kg-1组、模型+CBG 3mg·kg-1组、模型+布洛芬2mg·kg-1组。模型组小鼠左后肢注射生理盐水，右后肢注射1％角叉菜胶致炎，采用足底给药的方式，20分钟后左后肢注射基质，右后肢注射相应药物，正常组和模型组两个后肢都注射基质，采用针刺法来评价CBG的镇痛效果。分组及用药情况如下表4所示。
表4
Figure BDA0003206691140000081
Figure BDA0003206691140000091
CBG及阳性药物溶液配制：称取药物(CBG为自制)粉末4mg溶于50μL乙醇中，加入50μL聚氧乙烯基蓖麻油(Titan，P1603588)混合均匀，再加入900μL纯化水，制得4mg/ml的药物溶液。
2％角叉菜胶配制：称取20mg角叉菜胶(Titan，P1490955)溶于1ml纯化水中，制得2％的角叉菜胶溶液。
采用足底给药的方式，左后肢注射生理盐水，右后肢先注射角叉菜胶，20min后给药。分别于60min、100min测定小鼠痛阈变化。
痛阈值测定：将小鼠置于针刺足底痛觉测试仪(RWD,37450,中国)上，让其自由活动，当小鼠停止探索行为，相对安静后，移动刺激单元，利用反光镜辅助将刺激针对准脚爪表面的刺激区域，然后按下刺激单元手柄一侧的开始按钮。以小鼠因感到疼痛而抬起脚爪所测得的回避受力值为观察指标，记录每只小鼠的回避力度(g)。测试60min、100min后小鼠给药侧后肢和对照侧后肢的回避力度(g)。为了避免误差，每个后肢都测量5次，取平均值。
统计分析：计算同一只小鼠的痛阈值变化百分比(％)，计算公式为：痛阈值变化百分比(％)＝(给药侧后肢回避力度－对照侧后肢回避力度)/对照侧后肢回避力度*100％。
计算同组小鼠的痛阈值变化百分比均值及SD值，然后通过T-test检验不同组间统计学差异，p<0.05被认为具有统计学差异。
CBG的有效剂量筛选结果如图4所示。角叉菜胶诱导的炎症疼痛小鼠痛阈值变化百分比在造模后明显降低，与空白对照组相比，模型组在60min、100min时均有显著性差异，说明造模成功。与模型组相比，CBG的镇痛效果表现一定的剂量依赖性，在1-3mg/kg剂量时，其痛阈值变化百分比与模型组有显著差异。在0.25-5mg/kg剂量时，CBG没有显著镇痛效果。2mg/kg与3mg/kg没有明显差异，表明随剂量再增高，CBG的镇痛作用不再增加。以上结果表明1-3mg/kg为CBG的有效剂量。
实施例5CBG针对炎症疼痛的起效时间考察
分组：将15只昆明小鼠随机分为正常组、模型组、CBG组每组5只小鼠。采用足底给药的方式，左后肢注射生理盐水，右后肢注射角叉菜胶，20min后左后肢注射基质，右后肢注射相应药物，正常组、模型组两个后肢都注射基质，采用针刺法来评价CBG的镇痛作用。分组及用药情况如表5所示。
表5
Figure BDA0003206691140000101
CBG及阳性药物溶液配制：称取药物(CBG为自制)粉末4mg溶于50μL乙醇中，加入50μL聚氧乙烯基蓖麻油(Titan，P1603588)混合均匀，再加入900μL纯化水，制得4mg/ml的药物溶液。
2％角叉菜胶配制：称取20mg角叉菜胶(Titan，P1490955)溶于1mL纯化水中，制得2％的角叉菜胶溶液。
采用足底给药的方式，左后肢注射生理盐水，右后肢先注射角叉菜胶，20min后给药。分别于60min、100min、140min测定小鼠痛阈变化。
痛阈值测定：将小鼠置于针刺足底痛觉测试仪(RWD,37450,中国)上，让其自由活动，当小鼠停止探索行为，相对安静后，移动刺激单元，利用反光镜辅助将刺激针对准脚爪表面的刺激区域，然后按下刺激单元手柄一侧的开始按钮。以小鼠因感到疼痛而抬起脚爪所测得的回避受力值为观察指标，记录每只小鼠的回避力度(g)。测试60min、100min后小鼠给药侧后肢和对照侧后肢的回避力度(g)。为了避免误差，每个后肢都测量5次，取平均值。
统计分析：计算同一只小鼠的痛阈值变化百分比(％)，计算公式为：痛阈值变化百分比(％)＝(给药侧后肢回避力度－对照侧后肢回避力度)/对照侧后肢回避力度*100％。
计算同组小鼠的痛阈值变化百分比均值及SD值，然后通过T-test检验不同组间统计学差异，p<0.05被认为具有统计学差异。
CBG的起效时间考察如图5所示。角叉菜胶诱导的炎症疼痛小鼠痛阈值变化百分比在造模后明显降低，与空白对照组相比，模型组在60min、100min、140min时均有显著性差异，说明造模成功。与模型组相比，CBG的在60min时即达到很好的镇痛效果，随时间延长效果逐渐减弱，在140min时与模型组无显著差异。以上结果表明CBG起效较快，但随时间作用会逐渐减弱。
实施例6CBG安全性考察
分组：将20只昆明小鼠随机分为正常组、CBG组(10mg/kg、20mg/kg、60mg/kg)每组5只小鼠。采用腹腔给药的方式，给药后观察小鼠存活情况。分组及用药情况如表6所示。
表6
Figure BDA0003206691140000111
CBG及阳性药物溶液配制：称取药物(CBG为自制)粉末8mg溶于100μL乙醇中，加入100μL聚氧乙烯基蓖麻油(Titan，P1603588)混合均匀，再加入800μL纯化水，制得8mg/ml的药物溶液。
腹腔注射大剂量的CBG(10mg/kg-60mg/kg)未引发小鼠死亡，CBG局部治疗剂量约为1-3mg/kg，综上表明CBG安全性较好，治疗窗较宽。
实施例7CBG的皮肤刺激性考察
分组：将6只新西兰兔随机分为基质组、CBG组，每组3只兔。将兔背部脊柱两侧的毛剃除，不得损伤皮肤。用棉花蘸取CBG药物溶液(4mg/kg)适量直接涂在皮肤上，涂毕用纱布敷在其上，然后用无刺激胶布固定。另一侧去毛皮肤用基质溶液作为阴性对照。在自然光线下肉眼观察涂抹4h、24h、48h、72h后皮肤反应。实验方法进行皮肤刺激反应评分，实验结束后按表7计算每只动物的总分值(刺激指数)，判定皮肤刺激强度。
表7
刺激反应 分值
红斑
无红斑 0
轻度红斑(勉强可见) 1
中度红斑(明显可见) 2
重度红斑 3
紫红色红斑到轻度焦痂形成 4
水肿
无水肿 0
轻度水肿(勉强可见) 1
中度水肿(明显隆起) 2
重度水肿(皮肤隆起1mm，轮廓清楚) 3
严重水肿(皮肤隆起1mm以上并有扩大) 4
最高总分值 8
CBG的皮肤刺激性考察结果如表8所示，CBG与基质均没有引起明显的皮肤红斑和水肿，表明CBG没有皮肤刺激性，适合作为外用制剂局部起效。
表8
Figure BDA0003206691140000121
实施例8CBG对坐骨神经痛小鼠的镇痛作用
清洁级C57雄鼠购于北京维通利华公司；舒泰50；美洛昔康；噻拉嗪；氨苄青霉素；蓖麻油布洛芬购于Adamas公司；针刺足底痛觉测试仪购于深圳瑞沃德生命科技有限公司。
建立模型：麻醉小鼠(舒泰75mg/kg，噻拉嗪10mg/kg)，将小鼠俯卧位固定于手术台上,将右侧后上肢的毛剃除，并用碘伏消毒，沿坐骨神经分叉处切开右后肢外侧面皮肤，按肌束走行分离股二头肌和臀肌，充分暴露游离坐骨神经和其远心端3个分支，分别为内侧胫神经、中间腓总神经及外侧的腓肠神经，然后用6-0号线分别结扎胫神经与腓总神经并于远心端切断，术中避免牵拉腓肠神经，保持其完好，结扎完成后逐层缝合肌层和皮肤。假手术组手术操作过程与模型组相似，但只暴露游离神经，不进行结扎切断。
分组给药：将48只C57小鼠随机分为8组，每组6只，分别为：假手术组、神经病理性疼痛模型组、阳性对照高、中、低剂量组(SNI+布洛芬20、10、5mg·kg-1)、CBG高、中、低剂量组(SNI+CBG 20、10、5mg·kg-1)。假手术组和模型组均腹腔注射基质，治疗组分别腹腔注射给予相应剂量药物。各组小鼠从手术后第一天开始给药，连续14天。采用针刺法来评价CBG的镇痛效果。将小鼠置于针刺足底痛觉测试仪内，让其自由活动，当小鼠停止探索行为，相对安静后，移动刺激单元，利用反光镜辅助将刺激针对准小鼠脚底的刺激区域，然后按下刺激单元手柄一侧的开始按钮。以小鼠因感到疼痛而抬起脚爪为观察指标，记录每只小鼠的回避力度(g)。测试术前3天和1天、术后1、3、5、7、10、14天后小鼠右后肢损伤部位(如图6所示的Medial部位)的回避力度(g)。为了避免误差，每个后肢都测量5次，取平均值。
CBG对坐骨神经疼痛小鼠的镇痛效果如图7所示。模型组小鼠手术侧回避力度在造模后明显降低，与假手术组对比，模型组回避力度显著降低。与模型组相比，CBG在5mg/kg和10mg/kg没有显著镇痛作用，在20mg/kg时有一定的镇痛作用。上述结果表明，CBG在20mg/kg的高剂量时对SNI模型小鼠有一定的镇痛作用。与坐骨神经痛相比，CBG通过局部给药治疗炎症疼痛剂量更低，效果更好。
实施例9CBG局部给药对关节炎痛小鼠的镇痛作用
清洁级DBA/1雄鼠购于北京维通利华公司；异氟烷；蓖麻油布洛芬购于Adamas公司；针刺足底痛觉测试仪购于深圳瑞沃德生命科技有限公司。
建立模型：称取适量牛Ⅱ型胶原，用0.1mol/L浓度的冰醋酸溶液涡旋溶解，配制成10mg/mL的浓度。然后加入等体积的完全弗氏佐剂(Complete Freund's adjuvant,CFA)，充分乳化至滴在水面不分散为止，4℃保存待用。然后将小鼠在异氟烷气体麻醉的条件下，于尾巴根部皮下注射100μL上述乳剂，进行第一次免疫，并于21天后再次尾巴根部皮下注射上述乳剂100μL，作为加强免疫注射。之后每天观察四肢肿胀程度，以此为标准判断成模与否。具体的判断标准参照相关标准(M.Miyoshi et al.,Collagen-Induced ArthritisModels.Methods Mol Biol.2018.)：0分代表正常；1分代表有一只脚趾红肿；2分代表有两只或者两只以上脚趾红肿，但是脚掌跟踝关节没有异常；3分代表整个爪部有红肿；4分则代表整体爪部伴随踝关节均有红肿症状。四肢分别计分，满分16分。总分大于等于4分提示CIA模型造模成功，可以用于后续实验。
分组给药：将24只小鼠随机分为4组，每组6只，分别为：正常组、模型组、模型+CBG2mg·kg-1组、模型+布洛芬2mg·kg-1组。模型组进行造模，当小鼠的后肢达到4分时开始给药，采用足底给药的方式，正常组和模型组不做处理，其他组给予相应药物。测试给药30、60、90、120、180分钟后小鼠的回避力度(g)，为了避免误差，每个后肢都测量5次，取平均值。此外，还研究了腹腔注射CBG(5mg·kg-1、25mg·kg-1)的镇痛效果。
CBG对关节炎疼痛小鼠的镇痛效果如图8所示。模型组与正常组相比，其回避受力值明显降低，表明关节炎会引发疼痛，该模型能较好模拟关节炎痛的患者。通过局部注射CBG，与模型组相比，CBG具有显著的镇痛作用，其效果与布洛芬相当。表明CBG可用于治疗关节炎痛。
实施例10CBG系统给药对关节炎痛小鼠的镇痛作用
清洁级DBA/1雄鼠购于北京维通利华公司；异氟烷；蓖麻油布洛芬购于Adamas公司；针刺足底痛觉测试仪购于深圳瑞沃德生命科技有限公司。
建立模型：称取适量牛Ⅱ型胶原，用0.1mol/L浓度的冰醋酸溶液涡旋溶解，配制成10mg/mL的浓度。然后加入等体积的完全弗氏佐剂(Complete Freund's adjuvant,CFA)，充分乳化至滴在水面不分散为止，4℃保存待用。然后将小鼠在异氟烷气体麻醉的条件下，于尾巴根部皮下注射100μL上述乳剂，进行第一次免疫，并于21天后再次尾巴根部皮下注射上述乳剂100μL，作为加强免疫注射。之后每天观察四肢肿胀程度，以此为标准判断成模与否。具体的判断标准参照相关标准(M.Miyoshi et al.,Collagen-Induced ArthritisModels.Methods Mol Biol.2018.)：0分代表正常；1分代表有一只脚趾红肿；2分代表有两只或者两只以上脚趾红肿，但是脚掌跟踝关节没有异常；3分代表整个爪部有红肿；4分则代表整体爪部伴随踝关节均有红肿症状。四肢分别计分，满分16分。总分大于等于4分提示CIA模型造模成功，可以用于后续实验。
分组给药：将30只小鼠随机分为5组，每组6只，分别为：正常组、模型组、模型+CBG1mg·kg-1组、模型+CBG 5mg·kg-1组、模型+CBG25mg·kg-1组。模型组进行造模，当小鼠的后肢达到4分时开始给药，采用腹腔给药的方式，正常组和模型组不做处理，其他组给予相应药物。测试给药30、60、90、120、180分钟后小鼠的回避力度(g)，为了避免误差，每个后肢都测量5次，取平均值。
通过腹腔注射CBG的镇痛效果如图9所示，与模型组相比，CBG并未显著提高小鼠的回避受力值，即使25mg/kg剂量也没有明显作用。相比之下，局部给予2mg/kg CBG即可显著提高小鼠回避受力值。以上结果表明，CBG更适合通过局部给药来治疗关节炎痛。
实施例11CBG的镇痛作用机制研究
TRP-HEK293细胞株(吉满生物合成)；辣椒素(Adamas)；Fluo-4AM(Adamas)；DPBS(Adamas)
取对数生长期且状态良好的TRP-HEK293细胞进行计数，以每孔3×105个细胞接种到12孔板中，分为4组：正常组、4-AM组、CBG组、辣椒素组，培养过夜。次日给药，正常组和4-AM组不做处理，CBG组和辣椒素组给予相应药物(100μmol)，给药1h后，除去培养基，DPBS溶液洗涤细胞3次，加入Fluo4-AM工作液，37℃细胞培养箱孵育30min，除去Fluo4-AM工作液，DPBS溶液洗涤细胞3次，然后加入DPBS溶液覆盖细胞，于倒置显微镜下检测细胞。
TRPV1通道为Ca2+离子通道，介导Ca2+离子内流和疼痛反应。4-AM为Ca2+离子探针，可以监控细胞内Ca2+离子浓度变化。CBG对TRPV1受体的作用如图10所示，CBG可介导Ca2+离子内流，增强细胞内Ca2+离子浓度，相比于阳性药物辣椒素作用稍弱。以上结果说明CBG可能通过激活TRPV1通道发挥镇痛作用。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

Claims (8)

1.大麻素分子CBG在制备炎症性疼痛药物中的应用。
2.如权利要求1所述的大麻素分子CBG在制备炎症性疼痛药物中的应用，其特征在于：由大麻素分子CBG制备的炎症性疼痛药物为局部给药药物。
3.一种用于治疗炎症性疼痛的药用制剂，其特征在于：该制剂包含大麻素分子CBG。
4.如权利要求3所述的用于治疗炎症性疼痛的药用制剂，其特征在于：该制剂为局部给药制剂。
5.如权利要求4所述的用于治疗炎症性疼痛的药用制剂，其特征在于：该制剂含有以实验小鼠给药剂量1-3mg/kg为计算基础换算得到的人用剂量。
6.如权利要求5所述的用于治疗炎症性疼痛的药用制剂，其特征在于：该制剂含有以实验小鼠给药剂量2mg/kg为计算基础换算得到的人用剂量。
7.如权利要求1-6任一项所述的用于治疗炎症性疼痛的药用制剂，其特征在于：所述制剂用一种或多种药学上可接受的载体配制。
8.如权利要求1-6任一项所述的用于治疗炎症性疼痛的药用制剂，其特征在于：所述制剂与一种或多种其他药用物质联合使用。
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