CN117018158B

CN117018158B - 一种石墨烯暖宫止痛穴位贴及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN117018158B
Application number: CN202311235091.2A
Authority: CN
Inventors: 王富春; 刘佳; 蒋海琳; 李铁; 张楠; 王晋莹; 曹文轩; 刘武; 赵雪玮; 王琳
Original assignee: Changchun University of Chinese Medicine
Current assignee: Changchun University of Chinese Medicine
Priority date: 2023-09-25
Filing date: 2023-09-25
Publication date: 2023-12-08
Anticipated expiration: 2043-09-25
Also published as: CN117018158A

Abstract

本发明提供了一种石墨烯暖宫止痛穴位贴及其制备方法和应用，属于中药技术领域。本发明所述石墨烯暖宫止痛穴位贴由中药、石墨烯、热熔胶、远红外陶瓷粉、热感剂、樟脑和薄荷脑组成。本发明石墨烯暖宫止痛穴位贴不会产生急性毒性，无皮肤刺激性，不会诱导过敏。本发明石墨烯暖宫止痛穴位贴中药物小分子延胡索乙素、欧前胡素、丁香酚和芍药苷的释放速率较普通暖宫止痛贴更快，具有更加明显的镇痛效果，同时能改善凝血功能，并抑制体内前列腺素的分泌、COX‑2和IL‑1β蛋白的表达，抑制子宫的过度收缩和炎症的发生，进而达到治疗痛经的效果。

Description

一种石墨烯暖宫止痛穴位贴及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于中药技术领域，尤其涉及一种石墨烯暖宫止痛穴位贴及其制备方法和应用。

背景技术

石墨烯材料自面世以来，以其优异的导热和导电性能，迅速成为国内外研究的热点，其在医药领域的应用主要集中在药物载体、光热治疗、靶向治疗等方面。目前，国内外基于石墨烯而开发的温热理疗器械已有上市，其能在作用部位温和而持续不断地供给热量，从而达到理疗的目的。

在中药贴剂的研究应用领域，石墨烯材料被广泛应用于退烧贴，创可贴，降血压贴等的制备。除此之外，石墨烯还具备强大的载药能力，用作缓释中药制剂的载体材料，显示出巨大的价值和广阔的前景。然而并没有将石墨烯材料用于痛经中药中，来治疗痛经的相关记载和报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种石墨烯暖宫止痛穴位贴及其制备方法和应用，本发明石墨烯暖宫止痛穴位贴具有镇痛、缓解子宫肿胀等功效，对治疗痛经有积极的效果。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种石墨烯暖宫止痛穴位贴，包括以下重量份的原料：中药25份、石墨烯0.1份、热熔胶64份、远红外陶瓷粉2份、热感剂3份、樟脑3份、薄荷脑3份；所述中药由香附、丁香、延胡索、乳香、没药、当归、白芷、益母草、红花、茴香、桂枝、干姜和白芍组成。

优选的，所述香附、丁香、延胡索、乳香、没药、当归、白芷、益母草、红花、茴香、桂枝、干姜和白芍的质量比为1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1。

本发明还提供了上述石墨烯暖宫止痛穴位贴的制备方法，包括：将中药粉碎，与石墨烯混匀，得到中药-石墨烯混合物；将融化后的热熔胶与远红外陶瓷粉、热感剂、中药-石墨烯混合物、樟脑和薄荷脑混合后，涂布于贴上，即得到所述石墨烯暖宫止痛穴位贴。

本发明还提供了上述石墨烯暖宫止痛穴位贴在制备治疗痛经药物中的应用。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种石墨烯暖宫止痛穴位贴，由中药、石墨烯、热熔胶、远红外陶瓷粉、热感剂、樟脑和薄荷脑组成。本发明石墨烯暖宫止痛穴位贴不会产生急性毒性，无皮肤刺激性，不会诱导过敏。本发明石墨烯暖宫止痛穴位贴相比于未添加石墨烯材料的暖宫贴可以显著增加穴贴于皮肤的持续粘着时间并显著提升穴贴与皮肤间的剥离抵抗力。本发明石墨烯暖宫止痛穴位贴中药物小分子延胡索乙素，欧前胡素，丁香酚和芍药苷的释放速率较普通暖宫止痛贴更快。本发明石墨烯暖宫止痛穴位贴具有明显的镇痛效果，同时能改善凝血功能，并抑制体内前列腺素的分泌、COX-2和IL-1β蛋白的表达，抑制子宫的过度收缩和炎症的发生，进而达到治疗痛经的效果。本发明石墨烯暖宫止痛穴位贴在临床上经过三个疗程的治疗后可以显著改善气滞血虚型、寒凝血瘀型和青春期原发性痛经症状，降低患者VAS评分和CMSS评分。

附图说明

图1：石墨烯的加入对暖宫止痛贴持粘力与剥离强度的影响；注：与暖宫止痛贴组对比，**p＜0.01；

图2：延胡索乙素、欧前胡素、丁香酚和芍药苷的Q-t渗透动力学曲线（n=3）；A：延胡索乙素；B：欧前胡素；C：丁香酚；D：芍药苷；

图3：急性毒性实验结果；A：大鼠行为状态，面部及口鼻分泌物观察结果；B：破损皮肤大鼠体重变化图；C：完整皮肤大鼠体重变化图；

图4：皮肤刺激性实验结果；A：完整皮肤单次刺激观察图；B：破损皮肤单次刺激观察图；C：完整皮肤多次刺激观察图；D：破损皮肤多次刺激观察图；

图5：过敏性实验结果；A：致敏接触结果图；B：激发接触结果图；

图6：穴位贴对醋酸致大鼠扭体的抑制效果；A：扭体次数统计；B：扭体潜伏时间统计；C：扭体抑制率统计结果；注：与空白对照组相比：*p<0.05，***p<0.001，ns p>0.05；与石墨烯暖宫贴组相比：#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001；

图7：穴位贴对热板致大鼠撤足的抑制效果；A：大鼠撤后足时间统计；B：痛阈提高百分率统计图；注：与空白对照组相比：**p<0.01，***p<0.001，ns p>0.05；与石墨烯暖宫止痛穴位贴组相比：##p<0.01，###p<0.001；

图8：石墨烯暖宫止痛穴位贴对原发性痛经大鼠的扭体评分，子宫脏器系数以及对前列腺素分泌情况的检测；A：扭体评分统计；B：子宫脏器系数统计；C：大鼠血清中PGE₂的分泌情况；D：大鼠血清中PGF_2α的分泌情况；E：PGE₂和PGF_2α的比值计算；注：与模型组相比：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns p>0.05；

图9：石墨烯暖宫止痛穴位贴对原发性痛经大鼠的凝血功能检测；A：纤维蛋白原检测结果；B：凝血酶原时间检测结果；C：凝血酶时间检测结果；D：活化部分凝血酶原时间检测结果；注：与模型组相比：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns p>0.05；

图10：石墨烯暖宫止痛穴位贴对原发性痛经大鼠的血流变学指标检测；A:高切环境下血液粘稠度检测；B：中切环境下血液粘稠度检测；C：低切环境下血液粘稠度检测；注：与模型组相比：**p<0.01，***p<0.001，ns p>0.05；

图11：石墨烯暖宫止痛穴位贴对原发性痛经大鼠子宫组织炎症相关蛋白表达影响结果（Western blot）；A:COX-2蛋白的相对表达情况；B：IL-1β蛋白的相对表达情况；注：与模型组相比：**p<0.01，***p<0.001，ns p>0.05。

具体实施方式

本发明中药方中延胡索、乳香、没药合用，同为君药，苦有降泄之功，辛有行散之效，温有温通之力，共凑活血行气、消肿止痛之功，以解不通则痛之症；针对女性气血不足，不荣则痛之症，当归补血、活血、止痛，白芍养血敛阴、缓急止痛，二药合用，益血培元，补养结合，同时配合红花活血、祛瘀、通经，益母草活血、祛瘀、消肿，既补养血气，又通行血脉，四者合力，祛瘀生新，共为益血养元臣药。针对困扰女性的寒凝血瘀诸症，桂枝温通经脉、散寒除痹，丁香温热助阳、散寒止痛，茴香散寒止痛，干姜祛湿散寒，四药合用，通经络、开痹涩，舒筋脉之挛急，利关节之壅阻，同为祛寒止痛臣药；香附调经止痛、白芷抗炎消肿，以助药效，同为佐使。

上述13味中药配合石墨烯纳米颗粒，通过穴位刺激，药效渗透，石墨烯载药靶向释放三重作用，经皮给药渗透直达病灶，借助石墨烯靶向释放作用提高药物渗透率及效值，达到补血养元、活血化瘀、温经散寒、暖宫止痛、抗炎消肿等多重效用。

本发明热熔胶购于宿迁市华腾新材料科技有限公司，批号为230811；所述远红外陶瓷粉购于福建省德化第五瓷厂，批号为20230501；热感剂购于吉水县威海药用油厂，批号为230726。

本发明中药所述香附、丁香、延胡索、乳香、没药、当归、白芷、益母草、红花、茴香、桂枝、干姜和白芍的质量比优选为1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1。

本发明对所述原料的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

石墨烯暖宫止痛穴位贴的制备

（1）准确称量香附、丁香、延胡索、乳香、没药、当归、白芷、益母草、红花、茴香、桂枝、干姜、白芍各1000g，打成粉，加入石墨烯100g混匀，得到中药-石墨烯混合物；

（2）将64g热熔胶加热融化，在融化的膏状热熔胶中依次加入2g远红外陶瓷粉、3g热感剂，25g步骤（1）中药-石墨烯混合物、3g樟脑，3g薄荷脑，得到胶状物；

（3）将胶状物涂布于贴上，制成每贴含有10g热熔胶（含药2.5g）的石墨烯暖宫止痛穴位贴。

实施例2

石墨烯暖宫止痛穴位贴的载药及释放效率

（1）石墨烯材料对穴位贴载药效率的影响

分别将实施例1制备得到的石墨烯暖宫止痛穴位贴和暖宫止痛穴贴（吉林省国大生物工程有限公司生产，吉林省艾络康医药科技开发有限公司监制，生产批号：20220801，相对于实施例1仅未添加石墨烯）固定在试验板上，与洁净的聚酯薄膜粘接，粘贴后放置30分钟后进行试验。将聚酯薄膜的自由端对析(180°)，把薄膜自由端和试验板分别上、下夹持于试验机上。应使剥离面与试验机线保持一致。试验机以300mm/min±10mm/min速度连续剥离，并有自动记录仪绘出剥离曲线，具体结果如图1所示。

由图1可知，石墨烯暖宫止痛贴组的持粘力与剥离强度显著高于暖宫止痛贴组（P＜0.01）。表明，石墨烯加入可以显著增加穴贴与皮肤的持续粘着时间并显著提升穴贴与皮肤间的剥离抵抗力。

（2）石墨烯材料对暖宫止痛穴贴体外释放效率

选择Franz扩散池法及UHPLC-Q-TOF-MS技术，取45只KM种小鼠随机分为3组，暖宫止痛穴贴组、实施例1石墨烯暖宫止痛穴贴组和空白贴组（即贴敷材料组），处死小鼠剥离皮肤组织，放置在Franz扩散池的供给池与接收池的结合处。分别取适量石墨烯穴贴膏剂与等量的暖宫止痛穴贴膏剂涂抹在离体小鼠皮肤表面，将取出的接收液在UHPLC-Q-TOF-MS 拟分析条件下对延胡索乙素（C₂₁H₂₅NO₄）、欧前胡素（C₁₆H₁₄O₄）、芍药苷（C₂₃H₂₈O₁₁）、丁香酚（C₁₀H₁₂O₂）进行定性与定量分析，计算扩散池溶液中上述4种成分的含量及累积透过量Q。以药物累积透过量Q对取样时间t做曲线，并对直线部分进行线性回归，求出透皮速率J，具体结果如图2所示。

由图2可知，石墨烯的加入可显著提高4种成分的12 h累积释放量（P＜0.01），其中，延胡索乙素、丁香酚2种成分在两组2 h后，石墨烯组释放速度高于普通暖宫止痛贴组。石墨烯暖宫止痛贴组的芍药苷与欧前胡素2种成分释放速度从1 h高于普通暖宫止痛贴组。

根据图2数据得到的拟合方程：暖宫止痛贴中延胡索乙素y=42.299x+15.028，R²=0.9732；欧前胡素y=4.4972x+0.1371，R²=0.9946；丁香酚y=8.7648x-13.784，R²=0.9732；芍药苷拟合方程y=70.816x-104.48，R²=0.9861。石墨烯暖宫止痛穴位贴中延胡索乙素y=48.181x+22.818，R²=0.9739；欧前胡素y=4.8872x+4.2631，R²=0.9993。丁香酚y=9.6276x-13.432，R²=0.9914；芍药苷拟合方程y=85.335x-122.03，R²=0.9886。从整体上来看，石墨烯暖宫止痛贴较暖宫止痛贴的释放速度高。

实施例3

石墨烯暖宫止痛穴贴的安全性研究

本实施例中的穴位贴基质材料的制备方法与实施例1相似，不同的是不添加中药-石墨烯混合物。

（1）急性毒性实验

30只SD大鼠随机分为3组，每组10只：分别为穴位贴基质材料/暖宫止痛穴贴组/实施例1石墨烯暖宫止痛穴贴组。每组又分为完整皮肤组和破损皮肤组，每组5只。

大鼠背部两侧脱毛后，破损皮肤组的大鼠用注射器针头在皮肤上划“#”，以渗血为准。将各穴贴贴敷于各组大鼠左侧皮肤，右侧用纱布沾生理盐水覆盖，贴敷24h后，用温水除去残留于皮肤的受试物，正常饲养14天，记录给药前（第0天），给药后第7和14天大鼠体重，观察大鼠体征等指标，判断是否有中毒表现，具体结果如图3所示。

由图3可知，与空白组比较，大鼠在给药之后仍然对外界刺激存在反应，给药后14d后并未出现死亡现象。给药组大鼠皮毛、眼睛、黏膜、呼吸、及自主活动等均未发现明显变化，未见发抖、震颤、流涎、腹泻、懒动、嗜睡、昏迷等中毒表现及死亡情况（图3A）。由图3B和图3C可知，破损皮肤组大鼠体重增长速度略低于完整皮肤组，暖宫止痛穴贴组对破损或完整皮肤组无抑制情况，给予石墨烯暖宫止痛穴贴的大鼠体重增长速度均较慢。

综合结果表明，石墨烯暖宫止痛穴贴以及材料和更新产品对大鼠不会导致急性毒性反应发生，总体产品安全性有保证。

（2）皮肤刺激性实验

32只家兔常规饲养一周后随机分为4组，每组8只：分别为空白对照组/穴位贴基质材料组/暖宫止痛穴贴组/实施例1石墨烯暖宫止痛穴贴组，每组又分为单次刺激组和多次刺激组，每组4只。

将家兔背部两侧脱毛，背部一侧做完整皮肤，另一侧做损伤皮肤，采用同体左右侧自身对比，破损皮肤组的家兔用注射器针头在皮肤上划“#”，以渗血为准，以上操作完成后24h开始实验。将透气纱布/穴位贴基质材料/暖宫止痛穴贴组/石墨烯暖宫止痛穴贴分别单次贴敷于完整和损伤皮肤6h，于单次用药结束后1h、24h、48h和72h肉眼观察并拍照记录评分，如存在持久性损伤，有必要延长观察期。

多次刺激性实验中，将透气纱布/穴位贴基质材料/暖宫止痛穴贴/石墨烯暖宫止痛穴贴分别贴敷于完整和损伤皮肤6h，每天一次，持续7d。于给药前（0d）和给药后第1d给药结束后，第2d给药前和第7d末次给药结束后1h、24h、48h和72h肉眼观察并拍照记录评分，具体结果如图4所示。

由图4可知，空白对照组在家兔完整皮肤和破损皮肤用药1周后，在去除药物1 h内无水肿和红斑现象，只有暖宫止痛穴贴组出现了轻度红斑但无水肿，石墨烯暖宫止痛穴贴组无刺激现象。在家兔多次皮肤刺激性实验中和在家兔皮肤单次刺激性实验中，16只家兔所有敷贴部位均未出现红斑和水肿，在之后的24h、48h和72h内观察结果一致，没有明显变化，表明实施例1石墨烯暖宫止痛穴贴是无刺激性的。

（3）皮肤过敏性实验

25只豚鼠随机分为5组，每组5只：分别为空白对照组/阳性药组/穴位贴基质材料组/暖宫止痛穴贴组/实施例1石墨烯暖宫止痛穴贴组。

将豚鼠背部两侧脱毛，各组豚鼠左侧皮肤贴敷纱布或者各种贴剂6h，阳性药组用棉签涂抹1% 2,4-二硝基氯苯溶液，并于第7d和14d重复给药一次。于每次给药后0h和24h观察观察皮肤过敏性情况并评分。在第28d给予豚鼠激发给药，各组豚鼠右侧皮肤贴敷纱布或者各种贴剂6h，阳性药组用棉签涂抹0.1% 2，4-二硝基氯苯溶液，用药0h、24h、48h和72h再次观察皮肤过敏情况并评分，同时密切观察动物是否出现有哮喘、站立不稳或休克等严重的全身性过敏反应，具体结果如图5所示。

由图5可知，致敏接触结果如图5A，空白对照组未见红斑、水肿等皮肤变态反应情况，暖宫止痛穴贴组，石墨烯暖宫止痛穴贴组和穴位贴基质材料组观察结果和空白组相似，可见药效成分或贴剂材料不会引起过敏反应。阳性对照组比给药组产生了轻微的红斑，但没有出现水肿和严重过敏症状，而各组豚鼠也没有出现全身性过敏反应，例如哮喘或站立不稳。这些结果表明暖宫止痛穴贴不会导致动物过敏反应，是一种相对安全的疗法。

激发接触实验结果图如图5B，与致敏结果相似，激发后72h观察期间，与空白对照组相比，穴位贴基质材料组，暖宫止痛穴贴组和石墨烯暖宫止痛穴贴组全身状况均未见异常，未出现排尿、咳嗽、喷嚏、呼吸急促等症状，无站立不稳、哮喘、运动障碍、休克和痉挛等严重的全身性过敏反应出现。以上结果表明，实施例1石墨烯暖宫止痛穴贴对豚鼠皮肤基本上无致敏反应。

实施例4

石墨烯暖宫止痛穴贴对原发性痛经的作用

（1）石墨烯暖宫穴贴对热板致大鼠疼痛的影响

40只SD大鼠随机分为4组，每组5只，分别为空白组，暖宫止痛穴贴贴组、石墨烯暖宫穴位贴组以及阳性对照组（乐松贴组），大鼠腹部脱毛后，除空白组外，将各组贴剂贴敷于SD大鼠腹部4-6h，用医用胶布缠绕固定，连续给药7d，空白组大鼠在腹部处用胶带缠绕一圈。大鼠于末次给药后分别于30min和60min两次将大鼠放入52℃的热板仪中，记录明显感受大鼠后足后撤的时间，取平均值做痛阈值。空白组大鼠的痛阈值做基础痛阈值。根据公式计算各组大鼠给药后不同时间点的痛阈值提高百分率。计算公式：痛阈值提高百分率(%)=[(给药后的痛阈-基础痛阈)/基础痛阈]×100%。(若大鼠在热板仪上60s内仍无痛觉反应，立即取出按60s计算并统计给药前后的痛阈值)，具体结果如图7所示。

通过对记录30min检测点时间整理绘图得到图7A，与空白对照组相比，给药后其余三组大鼠受热刺激后发生足后撤反应的时间均有所延长，其中石墨烯暖宫止痛穴贴组大鼠为四组中最长。在60min检测点检测时，给药组大鼠的疼痛阈值会出现不同情况的上升，石墨烯暖宫止痛穴贴相较于暖宫止痛穴贴与乐松贴效果更佳，对于SD大鼠痛阈值的提升更为显著。图7B表明石墨烯暖宫止痛穴贴对大鼠的痛阈提高百分率最高。由此可以再次说明，实施例1石墨烯暖宫止痛穴贴的镇痛作用优于暖宫止痛穴贴。

（2）石墨烯暖宫穴贴对醋酸致大鼠疼痛的影响

40只SD大鼠随机分为4组，每组5只，分别为空白组，暖宫止痛穴贴贴组、石墨烯暖宫穴位贴组以及阳性对照组（乐松贴组），大鼠腹部脱毛后，除空白组外，将各组贴剂贴敷于SD大鼠腹部4-6h，用医用胶布缠绕固定，连续给药7d，空白组大鼠在腹部处用胶带缠绕一圈。大鼠于末次给药后1h后，对其进行腹腔注射2%冰醋酸溶液（3ml/kg），注射后开始计时并同时观察注射完冰醋酸后的大鼠出现第一次扭体反应的潜伏期（s）和15min内出现扭体反应的次数。根据公式计算扭体抑制率。计算公式：抑制率(%)=(模型组扭体反应均数-给药组扭体反应均数)/模型组扭体反应均数×100%，具体结果如图6所示。

由图6可知，大鼠扭体次数统计如图6A，与空白对照组相比，贴敷了暖宫止痛穴贴、石墨烯暖宫止痛穴贴、乐松贴的三组SD大鼠的扭体次数均显著低于空白组（p<0.001），说明三组贴剂给药后均可以明显抑制大鼠的扭体次数，其中石墨烯暖宫止痛穴贴组大鼠的扭体次数最低，抑制效果最强；在SD大鼠的扭体潜伏情况如图6B，暖宫止痛穴贴与乐松贴两组的扭体潜伏时间均长于空白组，其中石墨烯暖宫止痛穴贴组中的大鼠扭体潜伏时间显著长于其余2组，印证了穴贴改良药效提升效果；通过观察图6C，暖宫止痛穴贴的扭体抑制率高出其他两组贴剂的一倍左右，由此足以得出结论，添加石墨烯材料的暖宫止痛穴贴的镇痛效果得到了进一步的强化。

（3）石墨烯暖宫穴贴对原发性痛经大鼠的治疗作用

30只SD大鼠随机分为6组，分别为空白组，模型组，暖宫止痛穴位贴贴组、石墨烯暖宫穴位贴组和阳性对照组（布洛芬颗粒组和乐松贴组）每组5只。适应性饲养后，采取股部皮下注射苯甲酸雌二醇联合腹腔注射缩宫素的方法制备原发性痛经动物模型，苯甲酸雌二醇剂量的造模剂量为第1天和第10天分别为0.5mg/只，第2~9天均为0.2mg/只。暖宫止痛穴贴组和石墨烯暖宫穴贴组两组每日在神阙穴，三阴交穴的穴位处给予穴位贴剂刺激4~6 h，乐松贴组在神阙穴给予穴位贴剂刺激4~6 h，贴剂医用胶带缠绕固定，其余三组应用胶带缠绕。布洛芬颗粒组通过灌胃的方式给药。第10天SD大鼠股部皮下注射最后一次苯甲酸雌二醇1h后，腹腔注射缩宫素2 U/只，空白组注射等量生理盐水，完成后观察记录大鼠扭体和弓背情况并赋分。记录扭体结果后将麻醉大鼠并收集血液和子宫组织，部分血液离心获取血清，应用ELISA法检测血清中前列腺素F_2α和前列腺素E₂的含量，部分血液用于血液流变学检测和凝血功能检测。子宫组织称重计算脏器系数，提取子宫组织总蛋白用Western blot法检测炎症相关蛋白的表达情况，具体结果如图8-图11所示。

如图8A所示，模型组扭体和弓背情况十分严重，暖宫止痛穴位贴和石墨烯暖宫止痛穴位贴均有较好治疗效果，但两组无明显差别。图8B显示出模型组与空白组相比子宫系数显著上升（由于肿胀），暖宫止痛穴位贴和石墨烯暖宫止痛穴位贴组大鼠子宫的重量比模型组显著下降。图8C-E显示血清中前列腺素的分泌情况：模型组PGE₂和PGF_2α的分泌数量比空白组相比显著增加，二种贴剂同样表现出了显著的抑制效果，其中石墨烯暖宫止痛穴贴的对PGF_2α的调控效果优于口服阳性药布洛芬。

图9显示，模型组大鼠的凝血功能比空白组大鼠显著增加（病态水平），暖宫止痛穴位贴和石墨烯暖宫止痛穴位贴治疗后的大鼠凝血功能向正常水平转变，二者之间治疗效果比较相当。

图10显示，模型组相比空白组血液粘稠度降低，且只有石墨烯暖宫止痛穴贴的治疗效果具有显著性。

图11显示，模型组COX-2和IL-1β蛋白的表达显著上调，暖宫止痛穴位贴和石墨烯暖宫止痛穴位贴二组可以下调这两种蛋白的表达，表明这两种贴剂可以通过抑制炎症反应的发生从而抑制原发性痛经的产生。

实施例5

石墨烯暖宫止痛穴贴对原发性痛经的临床研究

1、石墨烯暖宫穴位贴治疗气滞血瘀型原发性痛经的临床研究

（1）诊断标准

1）西医诊断标准

原发性痛经的诊断标准参照2017年加拿大妇产科协会制定的《原发性痛经临床指南》制定：①有生育能力的女性月经前或月经后数小时出现的月经疼痛，可持续2-3天；②通常在下腹正中，亦可放射至两侧下腹部、腰部及大腿部，呈绞痛或钝痛；③或伴腹泻、恶心、呕吐、疲劳、头晕、头痛等症状，甚则影响正常工作、生活；④B超及妇科检查：排除盆腔器质性病变。

2）中医诊断标准

依据《中医妇科病证诊断疗效标准》制定：

中医痛经的诊断标准：①经期或经行前后周期性小腹疼痛，痛及腰骶，甚则昏厥；②多发于青年未婚女性；③排除盆腔器质性病变。

原发性痛经（气滞血瘀型）的辨证标准：①主症：经前或经期小腹胀痛拒按；②次症：或伴经血量少；血行不畅；血色紫黯有块；经前乳房胀痛；胸闷不适；③舌脉：舌质紫黯或有瘀斑，脉弦或涩；辨证依据：有主症，同时有任意2项及以上次症，并结合舌脉。

（2）疗效观察指标

1）疼痛视觉模拟评分(VAS)

VAS评分，采用一条标有10个刻度的线段，0代表不痛，10代表极痛。

2）COX痛经症状量表(CMSS)

CMSS评分由经期小腹部疼痛、恶心、呕吐、食欲不振、头痛、腰背酸痛、乏力、眩晕、腹泻、面色变化、胃痛、腿痛、面红、全身痛、抑郁（心情低落、压抑、喜静等）、易激惹（情绪变化，如紧张、生气等引起才会腹泻）、神经质（对人物、事物反应较平时敏感）、失眠18项组成。每个条目根据严重程度和持续时间均采用5级计分法。

每项的评分包括严重程度和持续时间：①严重程度：0-无不适，1-轻度不适，2-中度不适，3-重度不适，4-非常严重；②持续时间：0-无，1-持续＜3h，2-持续3-7h，3-持续7-24h，4-持续＞24h。

3）痛经中医症状评分

参照《中药新药临床研究指导原则》制定中医证候（气滞血瘀型）评分标准，包括主症、次症和舌脉：

①主症（经前或经期小腹胀痛拒按）0分：无小腹胀痛；2分：经前或经期小腹疼痛明显，但能坚持工作，无全身症状；4分：经前或经期小腹疼痛难忍，用止痛措施后疼痛缓解；6分：经前或经期小腹疼痛难忍，坐卧不安，严重影响工作和日常生活，必须卧床休息，采用止痛措施后无明显缓解。

②次症：a.经血量少 0分：无，1分：有；b.血行不畅 0分：无，1分：有；c.血色紫黯有块 0分：无，1分：有；d.经前乳房胀痛 0分：无，1分：有；e.胸闷不适 0分：无，1分：有。

③舌脉：a.舌质紫黯或有瘀斑 0分：无，1分：有；b.脉弦 0分：无，1 分：有。

测评治疗后两组患者的痛经中医症状评分。

4）总疗效判定标准

疗效判定标准：参考《中药新药临床研究指导原则》制定。

疗效指数（n）=[(治疗前积分－治疗后积分)÷治疗前积分]×100%；积分=VAS评分+COX痛经症状量表评分+中医症状评分。

①痊愈：n≥95%，腹痛及其它症状消失；②显效：95%＞n≥70%，腹痛显著减轻，余症状好转；③有效：70%＞n≥30%，腹痛稍减轻，余症状好转；④无效：n＜30%，腹痛及余症状无明显变化；总有效率=痊愈率+显效率+有效率。

（3）病例标准

纳入标准：①符合PD的西医诊断、中医诊断标准者；②年龄16-35岁；③月经周期规律：21-35天/3-7天；④VAS评分≥4分；⑤COX痛经症状评分＞10分；⑥平素无严重药物过敏史；⑦自愿签署知情同意书；注：同时满足以上全部项目者，即可纳入。

排除标准：①存在盆腔器质性病变，如子宫腺肌病等；②存在肝、肾等严重原发病及恶性肿瘤等；③正在服用避孕药或使用避孕环者；④存在严重精神疾者，如焦虑等；⑤存在严重药物过敏史；⑥VAS评分及COX痛经症状评分不符合上述要求，不能配合治疗者；注：满足上述任何一项者，均可排除。

脱落、剔除标准：①试验过程中，受试者出现严重不良反应或病情恶化者；②试验过程中，受试者出现其他疾病或服用其它影响疗效和安全性判断的药物；③试验过程中，受试者出现特殊生理变化，如妊娠等；④受试者依从性差，不服从、不配合医生者或因各种原因而退出者；⑤试验期间参加其他临床试验者；⑥因各种原因而中途破盲者；注：满足上述任何一项者即可。

（4）病例分组

根据中西医痛经的诊断标准以及气滞血瘀型原发性痛经的辩证标准选取60例原发性痛经患者。按照简单随机法（抽签法），将60例气滞血瘀型原发性痛经患者随机分配至石墨烯暖宫穴位贴组（试验组）和安慰剂穴位贴组（对照组，成分为荞麦粉、蜂蜜与赋形剂），实施过程各组脱落一例患者，即实际纳入患者试验组和对照组各29例。实验组和对照组患者的年龄、病程均具有可比性，差异无统计学意义，可进一步开展研究。

试验组和对照组的操作相同：患者取仰卧位，暴露少腹、下肢，局部皮肤常规消毒后，将石墨烯暖宫穴位贴或安慰剂穴位贴贴在关元、子宫（双侧）、三阴交（双侧）、血海（双侧）穴位处，每次贴敷5小时。

两组均于在月事来临前7日开始治疗，每日1次，连续贴10日，以1个月经周期为一个疗程，并持续治疗3个疗程，3个疗程治疗结束后进行效果评估（包括VAS、COX和痛经中医症状评分），结果通过SPSS 26.0软件进行统计学分析。

（5）VAS评分组间比较

VAS评分组间比较结果见表1。

表1 VAS评分组间比较

注：#代表由两独立样本t检验所得t值，*代表由两独立样本秩和检验所得Z值，^¨由两独立样本t检验所得P值，^•代表由两独立样本秩和检验所得P值。

由表1可知，第二疗程和第三疗程后，两组差异具有统计学意义。表明，试验组治疗可显著降低气滞血瘀型原发性痛经患者的VAS评分。

（6）COX痛经症状量表评分（CMSS）组间比较

COX痛经症状量表评分（CMSS）组间比较结果如表2所示。

表2 CMSS评分组间比较

由表2可知，第一、二、三个疗程，试验组和对照组差异均具有统计学意义。表明，试验组治疗可显著降低气滞血瘀型原发性痛经方面显著高于对照患者的CMSS评分。

（7）痛经中医症状评分组间比较

痛经中医症状评分组间比较结果如表3所示。

表3 痛经中医症状评分组间比较

由表3可知，第一、二、三个疗程，试验组和对照组差异均具有统计学意义。表明，试验组治疗可显著降低气滞血瘀型原发性痛经患者的中医症状评分。

（8）临床总有效率

试验组和对照组临床总有效率比较结果如表4所示。

表4 两组临床总有效率比较（例）

由表4结果可知，两组临床总有效率的差异具有统计学意义。表明石墨烯暖宫止痛穴位贴治疗的气滞血瘀型原发性痛经的总有效率高。

2、石墨烯暖宫穴位贴治疗寒凝血瘀型原发性痛经的临床研究

（1）诊断标准

1）西医诊断标准

寒凝血瘀型西医诊断标准同气滞血瘀型原发性痛经诊断标准。

2）中医诊断标准

参照教材《中医妇科学》及《中医妇科病证诊断疗效标准》[66]的相关内容。

主症：在经期或经前，出现小腹冷痛，疼痛拒按，得热痛减。次症：①经血量少；②经血色暗；③经血夹血块；④畏寒肢冷；⑤面色㿠白；⑥冷汗淋漓；⑦恶心呕吐；⑧腹泻。舌脉：舌暗，或边有瘀点，苔白，脉沉紧。注：主症必备，次症具备两项或以上，结合舌、脉即可诊断。

（2）疗效观察指标

1）疼痛视觉模拟评分(VAS)

2）COX痛经症状量表(CMSS)

CMSS评分与气滞血瘀型原发性痛经相同。

3）中医症候评分

对主症、次症、舌象和脉象分别积分：

①主症：0分：无下腹冷痛或刺痛；2分：下腹轻微冷痛或刺痛，不影响工作或生活；4分：下腹明显冷痛或刺痛影响工作或生活；6分：下腹冷痛或刺痛难忍，需卧床休息。

②次症：2分：经血色暗；2分：经血量少；2分：畏寒肢冷；2分：面色㿠白；2分：冷汗淋漓；2分：恶心呕吐；2分：腹泻。

③舌象：2分：舌暗，苔白；0分：舌质正常。

④脉象：2分：脉沉紧；0分：脉平。

测评治疗后两组患者的痛经中医症状评分。

4）总疗效判定标准

参照2002年指定的《中药新药临床研究指导原则》。用以下方法计算及评定积分降低率，再根据积分降低率评定每个患者的临床疗效。

痛经症状积分降低率=（治疗前积分-治疗后积分）/治疗前积分×100%；

积分=VAS评分+CMSS评分+中医症候评分。

临床痊愈：痛经症状积分降低率≥95%；显效：70%≤痛经症状积分降低率＜95%；有效：30%≤痛经症状积分降低率＜70%；无效：痛经症状积分降低率＜30%；总有效率=[(痊愈+显效+有效)/总例数]×100%。

（3）病例标准

纳入标准：①符合上述中西医诊断标准，属于原发性痛经（寒凝血瘀型）；②年龄在16-35岁；③月经周期正常（28±7天）；④痛经疼痛视觉模拟评分量表（VAS）评分≥4分；⑤COX痛经症状量表评分＞10分；⑥进入本研究前至少一个月经周期未接受过其他治疗，且治疗前2周内未服用镇静药、止痛药、激素类药物的患者；⑦患者同意参加本项研究，且自愿服从随机分组；⑧既往无药物过敏史；注：需同时满足上述8项纳入标准，方可纳入观察。

病例排除标准：①不符合纳入标准的患者；②年龄＜16岁或年龄＞35岁；③继发性痛经如子宫内膜异位症、子宫腺肌症、子宫肌瘤、盆腔炎的患者；④妊娠、计划妊娠或哺乳期妇女；⑤合并心脑血管、肝、肾和造血系统等严重的原发性疾病及精神异常的患者；⑥贴敷穴位或附近有溃烂、感染的患者；⑦有严重过敏史，对2种以上食物或药物过敏者。注：凡符合上述任意一条者，均予以排除。

病例脱落标准：

①试验过程中，受试者出现过敏反应或严重不良事件，根据医生判断应停止试验者；②试验过程中，受试者发生其他疾病，影响疗效和安全性判断者；③试验过程中，受试者出现特殊生理变化如妊娠等，不宜继续参加研究者；④试验过程中，受试者发生其他疾病影响疗效判定者；⑤受试者中途提出退出临床研究；⑥受试者依从性差，不愿意、不服从治疗，向主管医生提出退出试验要求而中止试验者；⑦受试者虽然明确未提出退出试验，但不再接受用药及监测而失访者；⑧使用了禁止合用的其他治疗或药物等，影响有效性判定者。

病例剔除标准：①因误诊而被纳入者；②虽符合纳入标准而纳入后未曾用药者；③非规定范围内联合用药，特别是合用对试验结果影响较大的药物，影响有效性判定者；④试验期间参加其他临床试验者；⑤纳入试验后无可评价记录者。

（4）病例分组

根据中西医痛经的诊断标准以及寒凝血瘀型原发性痛经的辩证标准选取60例原发性痛经患者，按照简单随机法（抽签法），将60例寒凝血瘀型原发性痛经患者随机分配至石墨烯暖宫穴位贴组（治疗组）和安慰剂穴位贴组（对照组，成分为荞麦粉、蜂蜜与赋形剂），实施过程各组脱落一例患者，即实际纳入患者治疗组和对照组各29例。实验组和对照组患者的年龄、病程均具有可比性，差异无统计学意义，可进一步开展研究。

该试验组和对照组与气滞血瘀型原发性痛经的操作相同。

3个疗程治疗结束后进行效果评估（包括VAS、COX和中医症候评分），结果通过SPSS26.0软件进行统计学分析。

（5）VAS评分组间比较

VAS评分组间比较结果见表5。

表5 两组患者VAS评分组间对比/[M(Q)]比较

注：治疗前、治疗第三个月经周期均不符合正态性分布，故用中位数、四位分距[M(Q)]表示，*表示两独立样本检验所得的t/P值，▲表示Mann-Whitney U 检验所得的Z/P值。

由表5可知，第一、二三疗程，两组差异具有统计学意义。表明，试验组治疗可显著降低寒凝血瘀型原发性痛经患者的VAS评分。

（6）COX痛经症状量表评分（CMSS）组间比较

COX痛经症状量表评分（CMSS）组间比较结果如表6所示。

表6 两组患者CMSS评分组间对比[M(Q)]

注：治疗前、第一个月经周期、第二个月经周期、第三个月经周期均不满足正态性分布，故用中位数、四位分距[M(Q)]表示。

由表6可知，第一、二、三个疗程，试验组和对照组差异均具有统计学意义。表明，试验组治疗可显著降低寒凝血瘀型原发性痛经患者的CMSS评分。

（7）中医症候评分组间比较

中医症候评分组间比较结果如表7所示。

表7 两组患者中医症候评分组间对比[M(Q)]

由表7可知，第一、二、三个疗程，试验组和对照组差异均具有统计学意义。表明，试验组治疗可显著降低寒凝血瘀型原发性痛经患者的中医症候评分。

（8）临床总有效率

试验组和对照组临床总有效率比较结果如表8所示。

表8 两组患者总体疗效评价

由表8可知，石墨烯暖宫止痛穴位贴治疗的寒凝血瘀型原发性痛经的总有效率高。

3、石墨烯暖宫穴位贴治疗青春期原发性痛经的临床研究

（1）诊断标准

1）西医诊断标准

青春期西医诊断标准同气滞血瘀型原发性痛经诊断标准。

2）中医诊断标准

参照2017中国中医药出版社《中医妇科学》拟定：①经期或经行前后周期性小腹疼痛，痛及腰骶，甚则昏厥；②好发于青年未婚女子；③排除盆腔器质性疾病所致腹痛。

（2）疗效观察指标

1）疼痛视觉模拟评分(VAS)

2）COX痛经症状量表(CMSS)

CMSS评分与气滞血瘀型原发性痛经相同。

3）总疗效判定标准

该总疗效判定标准与气滞血瘀型原发性痛经相同。

（3）病例标准

纳入标准：①符合原发性痛经的中医及西医诊断标准；②年龄10-19岁未孕育女性；③月经规律：平均月经周期21-35天，平均经期3-7天；④疼痛视觉模拟评分量表（VAS）评分≥4分；⑤COX痛经症状量表评分＞10分；⑥既往无药物过敏史；⑦自愿签署知情同意书（未满18周岁者需监护人同时签名）；注：患者需同时符合以上7项标准，方可纳入。

排除标准：①合并子宫器质性疾病；②合并有心、肝、肾等严重原发病及恶性肿瘤；③正在服用口服避孕药或使用曼月乐环者；④有严重精神类疾病，如中重度焦虑、抑郁者；⑤有严重皮肤过敏史，对多种食物、药物过敏者；⑥准备妊娠或正处于妊娠期、哺乳期者；⑦不能配合贴敷治疗者。注：患者符合以上任何一条标准都需排除。

脱落、中止标准：①出现过敏反应或其他不良事件者；②依从性差，不服从、不按时间治疗者；③服用其他治疗药物或接受其他治疗方法（明确会影响试验结果）者；④各种原因导致试验中途破盲者。

剔除标准：①因误诊而被误纳入者；②纳入后未按期治疗，无可评价记录者；③接受其他治疗方法或服用其他药物（明确会影响试验结果）者；④试验期间参加其他临床试验者。

（4）病例分组

根据中西医痛经的诊断标准选取60例10-19岁未孕育青春期原发性痛经患者，采用随机对照试验方法，按照患者入组顺序进行编号，使用Excle产生随机号将患者分为石墨烯暖宫穴位贴组（治疗组）和安慰剂穴位贴组（对照组，成分为荞麦粉、蜂蜜与赋形剂），实施过程对照组脱落二例患者，即实际纳入患者治疗组30例，对照组28例。实验组和对照组患者的年龄、病程均具有可比性，差异无统计学意义，可进一步开展研究。

该试验组和对照组与气滞血瘀型原发性痛经的操作相同。

（5）VAS评分组间比较

VAS评分组间比较结果见表9。

表9 VAS评分组间比较

注：组内比较，与本组治疗前相比：1）P<0.05，2）P>0.05；组间比较：3）P<0.05。

由表9可知，第一、二、三个疗程，试验组和对照组差异均具有统计学意义。表明，试验组治疗可显著降低青春期原发性痛经患者的VAS评分。

（6）COX痛经症状量表评分（CMSS）组间比较

COX痛经症状量表评分（CMSS）组间比较结果如表10和表11所示。

表10 两组各时期 CMSS 痛经严重程度评分比较

表11 两组各时期CMSS痛经持续时间评分比较

由表10和表11可知，第一、二、三个疗程，试验组和对照组差异均具有统计学意义。表明，试验组治疗可显著降低青春期原发性痛经患者的CMSS评分。

（7）临床总体疗效比较

表12两组治疗后总有效率比较

注：总有效率=（痊愈+显效+有效）/n×100%

由表12可知，石墨烯暖宫止痛穴位贴治疗的青春期原发性痛经的总有效率高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种石墨烯暖宫止痛穴位贴，其特征在于，包括以下重量份的原料：中药25份、石墨烯0.1份、热熔胶64份、远红外陶瓷粉2份、热感剂3份、樟脑3份、薄荷脑3份；所述中药由香附、丁香、延胡索、乳香、没药、当归、白芷、益母草、红花、茴香、桂枝、干姜和白芍组成；所述香附、丁香、延胡索、乳香、没药、当归、白芷、益母草、红花、茴香、桂枝、干姜和白芍的质量比为1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1；

所述石墨烯暖宫止痛穴位贴的制备方法，包括：将中药粉碎，与石墨烯混匀，得到中药-石墨烯混合物；将融化后的热熔胶与远红外陶瓷粉、热感剂、中药-石墨烯混合物、樟脑和薄荷脑混合后，涂布于贴上，即得到所述石墨烯暖宫止痛穴位贴。

2.权利要求1所述石墨烯暖宫止痛穴位贴在制备治疗痛经药物中的应用。