JP2001526239A

JP2001526239A - 角質細胞増殖因子−２製剤

Info

Publication number: JP2001526239A
Application number: JP2000525126A
Authority: JP
Inventors: ライナー・エル・ゲンツ; アービンド・チョプラ; パルベーン・コウシャル; トーマス・スピッツネイゲル; エドワード・アンズワース; フェイザル・カーン
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1997-12-22
Filing date: 1998-12-22
Publication date: 2001-12-18
Also published as: CA2316015A1; WO1999032135A8; US6653284B2; KR20010033484A; US20040063639A1; WO1999032135A1; US6238888B1; CN1283997A; AU1905799A; NZ505324A; EP1041996A1; EP1041996A4; US20020016295A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、角質細胞増殖因子−２（ＫＧＦ−２）およびその誘導体の液体および凍結乾燥形態に関する。本発明はさらに、治療目的の使用、たとえば、創傷の治癒を促進するためのＫＧＦ−２の製剤に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、角質細胞増殖因子−２（ＫＧＦ−２）およびその誘導体の液体およ
び凍結乾燥製剤に関する。本発明はさらに、柔組織の増殖および再生を必要とす
る適応症において治療用途に用いることのできるＫＧＦ−２製剤、とりわけ局所
および注射製剤に関する。

【０００２】（背景技術）繊維芽細胞増殖因子ファミリーは、柔組織の増殖および再生に関与する増殖因
子の大きなファミリーとして登場してきた。このファミリーは、現在のところ、
幾つかの成員を含み、これらはタンパク質レベルで種々の程度の相同性を示し、
また一つの例外を除いて類似の広いマイトジェンスペクトルを有する、すなわち
、中胚葉および神経外胚葉起源の種々の細胞の増殖を促進し、および／または血
管形成を促進する。

【０００３】ＫＧＦはもともと、配列ホモロジーまたは因子精製およびクローニングにより
ＫＧＦファミリーの一員として同定された。角質細胞増殖因子（ＫＧＦ）は、培
養したマウスの角質細胞株からマイトジェンとして単離された（Rubin, J. S.ら
、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 802-806 (1989)）。ＫＧＦファミリーの他の成員と異なり、間充織由来の細胞に対する活性はほとんど有しないが、上皮細
胞の増殖を刺激する。角質細胞増殖因子は皮膚および胎児の肺に由来する繊維芽
細胞により産生される（Rubinら(1989)）。角質細胞増殖因子のｍＲＮＡは、成人の腎臓、結腸および腸骨では発現されるが、脳または肺では発現されないこと
がわかっている（Finch, P. W.ら、Science 245: 752-755 (1989)）。ＫＧＦは、ＦＧＦタンパク質ファミリー内で保存された領域を呈示する。ＫＧＦはＦＧＦ
−２レセプターと高親和性で結合する。

【０００４】創傷治癒が損なわれることは、重要な罹患源であって、被裂、解剖学的破損（
anatomic breakdown）および治癒しない創傷などの合併症を起こす結果となる。
通常の個体では、創傷治癒は併発症を伴うことなく達成される。対照的に、創傷
治癒が損なわれると、糖尿病、感染、免疫抑制、肥満および栄養不良などの幾つ
かの病的状態を伴う（Cruse, P. J.およびFoord, R., Arch. Surg. 107: 206 (1
973); Schrock, T. R.ら、Ann. Surg. 177: 513 (1973); Poole, G. U., Jr., S
urgery 97: 631 (1985); Irvin, G. L.ら、Am. Surg. 51: 418 (1985)）。

【０００５】創傷の修復は複雑な反応および生物学的プロセスの結果である。通常の創傷治
癒では３つの相が記載されている：急性の炎症相、細胞外マトリックスおよびコ
ラーゲン合成、および再建（remodeling）である（Peacock, E. E., Jr., Wound
Repair, 第２版、WB Saunders、フィラデルフィア(1984)）。このプロセスは、
創傷部位での角質細胞、繊維芽細胞および炎症細胞の相互作用が関与している。

【０００６】柔組織の増殖および再生を促進および亢進することができるポリペプチドを、
（１）長期の貯蔵期間にわたって安定であり、（２）該ポリペプチドの薬理活性
または有効性を増大させ、および／または（３）治療計画において該ポリペプチ
ドの適用または投与を容易にする医薬組成物に調合することが望ましい。

【０００７】（発明の要約）本発明は、ＫＧＦ−２およびその欠失変異体または点変異体または置換変異体
（以下、ＫＧＦ−２ポリペプチドという）の液体および凍結乾燥調合物に関する
。本発明はさらに、たとえば、創傷治癒において、またはムコサイティス（muco
cytis）または炎症性腸疾患の治療において、柔組織の増殖または再生を促進または亢進するためのＫＧＦ−２ポリペプチドのかかる調合物の使用に関する。本
発明の好ましい調合物は、ＫＧＦ−２の新規な変異体を用い、一つの態様におい
て本明細書においてＫＧＦ２−Δ３３と称する欠失変異体を用いる。該調合物に
用いる併用成分は、（１）ＫＧＦ−２ポリペプチドに貯蔵安定性を付与し、（２
）該治療組成物の柔組織治癒活性をさらに促進し、および／または（３）特定の
治療目的のための適用および投与を容易にしながら、活性形のＫＧＦ−２ポリペ
プチドを提供する。

【０００８】本発明の第一の側面は、ＫＧＦ−２ポリペプチドおよび約ｐＨ５.０〜約ｐＨ８.０で緩衝能を有する緩衝液を含む調合物に関する。有用な緩衝液としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、アコニット酸緩衝液、コハク酸緩衝液、リンゴ酸緩
衝液、炭酸緩衝液およびクエン酸緩衝液が挙げられ、クエン酸緩衝液が好ましい
。

【０００９】本発明の第二の側面は、ＫＧＦ−２ポリペプチド、凍結乾燥バルク剤（bulkin
g agent）および約ｐＨ５.０〜約ｐＨ８.０で緩衝能を有する緩衝液を含む調合物に関する。有用な緩衝液としては、リン酸緩衝液、アコニット酸緩衝液、コハ
ク酸緩衝液、リンゴ酸緩衝液、炭酸緩衝液およびクエン酸緩衝液が挙げられ、ク
エン酸緩衝液が好ましい。

【００１０】本発明の第三の側面は、ＫＧＦ−２ポリペプチド、およびＫＧＦ−２ポリペプ
チドを安定化しうるチオール含有化合物、好ましくはモノチオグリセロールを含
む調合物に関する。この調合物は、好ましくは約ｐＨ５.０〜約ｐＨ８.０で緩衝
能を有する緩衝液を含む。この調合物はまた、１またはそれ以上の抗酸化剤およ
び／または１またはそれ以上のキレート化剤を含む。

【００１１】本発明の第四の側面は、ＫＧＦ−２ポリペプチド、緩衝液、およびある所定の
温度で調合物をゲル化させる高分子量化合物を含む調合物に関する。好ましい高
分子量化合物は、PluronicまたはPoloxamerポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマーである。該ポリペプチドに安定性を付与するため、モ
ノチオグリセロールなどのチオール含有化合物を調合物に含ませることができる
。

【００１２】本発明の第五の側面は、ＫＧＦ−２ポリペプチド、緩衝液、および増粘剤を含
む調合物に関する。増粘剤は、調合物の粘度を増加させるために用いる。好まし
い増粘剤は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロ
ース（ＨＥＣ）、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、Natros
olおよびCarbomersである。

【００１３】さらに、本発明の調合物はまた、金属キレート化剤、抗酸化剤またはチオール
含有化合物、たとえば、アスコルビン酸エステル、モノチオグリセロール、シス
テイン、トコフェロール、ブチル化ヒドロキシアニソール、硫酸ナトリウム、重
亜硫酸ナトリウムおよびメタ亜硫酸ナトリウム（sodium metasulfite）、および
保存剤、たとえば、フェノール、クロロブタン、ベンジルアルコール、メチルパ
ラベンおよびプロピルパラベンを含んでいてよい。本発明の調合物はまた、バイ
アルの上部空間に窒素ブランケットオーバーレイ（nitrogen blanket overlay）
を有していてよい。さらに、本発明の調合物は、ヘリウム、アルゴンまたは窒素
を用いて調合物緩衝液を除去すること（purging the formulation buffer）を含
む。

【００１４】（発明を実施するための最良の形態）ＫＧＦ−２は表皮角質細胞の増殖は刺激するが、繊維芽細胞などの間充織細胞
の増殖は刺激しない。従って、「ＫＧＦ−２タンパク質様活性を有するポリペプ
チド」とは、下記の角質細胞増殖アッセイにおいてＫＧＦ−２活性を示し、ＦＧ
Ｆレセプターイソ型1-iiibおよび2-iiibに結合するポリペプチドを含む。

【００１５】本発明は、ＫＧＦ−２ポリペプチドの医薬調合物および動物医薬調合物に関す
る。本明細書においてＫＧＦ−２ポリペプチドは、図１（配列番号：２）のポリ
ペプチドまたは寄託してあるｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドを参照し
て定義され、図１（配列番号：２）のポリペプチドまたは寄託してあるｃＤＮＡ
によりコードされるポリペプチドの断片、誘導体およびアナログであって本質的
に親ポリペプチドと同じ生物学的機能を保持しているものを包含する。本発明に
用いるポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチドまたは合成ポ
リペプチド、好ましくは組換えポリペプチドであってよい。

【００１６】ＫＧＦ−２ポリペプチドは、４.５またはそれ以下のｐＨ、または約８を超えるｐＨでは不十分な活性しか示さないことがわかっている。本発明者らは、ＫＧ
Ｆ−２ポリペプチドが酸化し、沈殿することを見出した。これらポリペプチドは
、治療目的のために調合物にしようとすると難題を提示する。物理化学的特性お
よび生物学的活性を維持するため、ＫＧＦ−２ポリペプチドは、抗酸化剤、たと
えば酸素捕捉化合物、および／またはタンパク質安定化剤、たとえばチオール含
有化合物、および／または金属キレート化剤、たとえばＥＤＴＡとともに調合す
ることができる。本明細書において安定化とは、所定の期間にわたってＫＧＦ−
２ポリペプチドの物理化学的特性および実質的な生物学的活性の両者を維持する
ことをいう。本発明による調合物は、ゲル、増粘溶液、溶液および凍結乾燥形態を含む。調
合物はまた本明細書において「医薬組成物」または「組成物」とも称する。

【００１７】注射用調合物液体調合物本発明の第一の側面は、ＫＧＦ−２ポリペプチド、および約ｐＨ５.０〜約ｐＨ８.０、さらに好ましくはｐＨ５.５〜約ｐＨ６.５、最も好ましくはｐＨ６.２
で緩衝能を有する緩衝液を含む液体調合物に関する。好ましい緩衝液としては、
リン酸、酢酸、アコニット酸、クエン酸、グルタル酸、リンゴ酸、コハク酸およ
び炭酸に由来する緩衝液が挙げられる。典型的に用いられるのは、上記酸の一つ
のアルカリまたはアルカリ土類塩である。さらに好ましくは、緩衝液は酢酸塩ま
たはクエン酸塩、最も好ましくはクエン酸塩であろう。たとえば、調合物は、緩
衝量のクエン酸またはその薬理学的に許容しうる塩をＫＧＦ−２Δ３３と水中で
混合することにより生成する組成物を含んでいてよい。調合物はまた、緩衝量の
酢酸またはその薬理学的に許容しうる塩をＫＧＦ−２Δ３３と水中で混合するこ
とにより生成する組成物を含んでいてよい。好ましい緩衝液濃度は、約５ｍＭ〜
約５０ｍＭである。最も好ましくは、酢酸緩衝液は約２０ｍＭの濃度を有し、ク
エン酸緩衝液は約１０ｍＭ〜約２０ｍＭであろう。調合物はまた、ＮａＣｌを等
張化剤（tonicifier）として約０.０１ｍＭ〜１５０ｍＭ、最も好ましくは約１２５ｍＭの濃度にて、および金属キレート化剤、たとえばＥＤＴＡを約０.１ｍＭ〜１０ｍＭ、最も好ましくは約１ｍＭの濃度にて含んでいてよい。さらに、本
発明の液体調合物はまた、１またはそれ以上の（ａ）安定化量の抗酸化剤、たと
えばアスコルビン酸および／または（ｂ）タンパク質安定化量のチオール化合物
、たとえばモノチオグリセロール（ＭＴＧ）を含んでいてよい。理論に拘泥する
ことを意図するものではないが、ＭＴＧなどのチオール化合物はＫＧＦ−ポリペ
プチド中に存在する遊離のスルフヒドリル基を保護する働きをすると考えられる
。液体調合物の貯蔵条件は、一般に約２℃〜約８℃である。あるいは、貯蔵条件
は−２０℃またはそれ以下である。最も好ましくは貯蔵条件は−２０℃である。
ＫＧＦ−２液体調合物を凍結状態で維持することは該ポリペプチドに対して酸化
量を制限し、このことが安定なポリペプチド調合物という結果をもたらす。

【００１８】好ましくは、液体調合物は、（１）治療学的有効量のＫＧＦ−２ポリペプチド；（２）約ｐＨ５.０〜約ｐＨ８.０で緩衝能を有する緩衝液の有効量；（３）薬理学的に許容しうる希釈剤；および（４）任意に下記成分の１またはそれ以上：（ａ）等張化剤としてのＮａＣｌ、（ｂ）キレート化剤、（ｃ）安定化量の抗酸化剤、および（ｄ）安定化量のタンパク質安定化剤を含む。ＫＧＦ−２ポリペプチドは、好ましくは溶液中に保持される。

【００１９】本発明の組成物は、上記成分を好ましくは本明細書に記載した濃度および比率
にて混合することにより製造する。液体調合物に用いることのできる抗酸化剤としては、アスコルビン酸、トコフ
ェロール、およびブチル化ヒドロキシアニソールが挙げられる。さらに、液体調
合物に用いることのできる安定化剤はまた、システイン、メチオニンおよびチオ
グリセロールなどのチオール類を含む。使用できるキレート化剤としては、エチ
レンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、またはジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴ
Ａ）が挙げられ、ＥＤＴＡが好ましい。

【００２０】抗酸化剤またはチオール類を含む本発明の調合物は、ＫＧＦ−２ポリペプチド
の安定性を増大させることができる。このことは、一層長期の貯蔵寿命を有する
医薬製品とすることを可能とする。

【００２１】さらに好ましい液体調合物は、（１）約０.０２〜約４０ｍｇ／ｍｌ(ｗ／ｖ)、さらに好ましくは約０.０５〜約
３０ｍｇ／ｍｌ(ｗ／ｖ)、さらに一層好ましくは約０.１〜約２０ｍｇ／ｍｌ(ｗ
／ｖ)、もっと一層好ましくは約１０ｍｇ／ｍｌ(ｗ／ｖ)、最も好ましくは約０.
２〜４ｍｇ／ｍｌの濃度範囲のＫＧＦ−２ポリペプチド；（２）約ｐＨ５.０〜約ｐＨ８.０で緩衝能を有し、約５ｍＭ〜約５０ｍＭ、好ま
しくは約５ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度範囲の緩衝液；および（３）組成物を所定の容量とする、薬理学的に許容しうる希釈剤、好ましくは水
を含む。

【００２２】本発明の調合物に有用な緩衝液としては、酢酸、アコニット酸、クエン酸、グ
ルタル酸、リンゴ酸、コハク酸、リン酸および炭酸に由来する緩衝液が挙げられ
る。典型的に用いられるのは、上記酸の一つのアルカリまたはアルカリ土類塩で
ある。酢酸およびクエン酸緩衝液、たとえば、酢酸または薬理学的に許容しうる
その塩、またはクエン酸または薬理学的に許容しうるその塩が好ましい。溶液調
合物の好ましいｐＨ範囲は、約ｐＨ５.０〜約ｐＨ８.０、好ましくはｐＨ５.５〜ｐＨ６.５である。酢酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムが好ましい緩衝液であり、クエン酸ナトリウムが最も好ましい。

【００２３】上記溶液にはまた、（４）約０.１ｍＭ〜約１０ｍＭ、さらに好ましくは約１ｍＭの濃度範囲のキレート化剤、たとえばＥＤＴＡ；（５）約０.０１ｍＭ〜約１５０ｍＭ、さらに好ましくは約１２５ｍＭの濃度範囲のＮａＣｌを加えるのが好ましい。

【００２４】場合により、液体調合物はまた、以下よりなる群から選ばれた化合物をタンパ
ク質安定化量で含んでいてよい。（ａ）約０.５％〜約２％ｗ／ｖのグリセロール、（ｂ）約０.１％〜約１％ｗ／ｖのメチオニン、または（ｃ）約０.１％〜約２％ｗ／ｖのモノチオグリセロール。

【００２５】本発明のこの側面の好ましい態様は、（１）約０.０２〜約４０ｍｇ／ｍｌ(ｗ／ｖ)、さらに好ましくは約０.１〜約２
０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０.２〜４ｍｇ／ｍｌの濃度のＫＧＦ−２ポリペプチド；（２）１０ｍＭのクエン酸ナトリウムまたは２０ｍＭの酢酸ナトリウム；（３）１２５ｍＭのＮａＣｌ；（４）１ｍＭのＥＤＴＡ；および（５）希釈剤としての水を混合することにより生成する組成物を包含する。

【００２６】さらに好ましくは、溶液調合物は、（１）約０.２〜４ｍｇ／ｍｌのＫＧＦ−２ポリペプチド；（２）２０ｍＭの酢酸ナトリウム；（３）１２５ｍＭのＮａＣｌ；（４）１ｍＭのＥＤＴＡ；および（５）希釈剤としての水を混合することにより生成する組成物を包含し、該溶液は約ｐＨ６.２であり、約−２０℃で貯蔵する。

【００２７】本発明者らは、ＫＧＦ−２ポリペプチドが容易に酸化し、溶液から凝集および
沈降することを見出した。ＫＧＦ−２の酸化は生物学的活性を破壊するものでは
ないが、生成物の酸化の程度を制限することは一層安定な生成物に導く。本発明
者らは、液体調合物があまりにも低いｐＨにあるとＫＧＦ−２ポリペプチドはそ
の生物学的活性を失うことを観察した。さらに、溶液のｐＨがＫＧＦ−２のｐＩ
に近づくにつれて該タンパク質は溶液から沈降するであろう。それゆえ、本発明
者らは、液体調合物は約ｐＨ６.０〜約ｐＨ７.０の範囲に維持すべきであり、ｐ
Ｈ６.２がＫＧＦ−２ポリペプチドを安定化するうえで最適であると決定した。さらに、本発明者らは、驚くべきことに、クエン酸緩衝液がＫＧＦ−２ポリペプ
チドを特異的に安定化させると決定した。

【００２８】約ｐＨ６.０〜約ｐＨ６.２を有するクエン酸緩衝液の使用はＫＧＦ−２ポリペ
プチドの凝集が低減し安定性の増大した液体調合物をもたらすが、該液体ポリペ
プチド調合物は依然としてＫＧＦ−２ポリペプチドの酸化および沈降を受ける。
それゆえ、本発明者らは、以下に記載する凍結乾燥した調合物を開発した。

【００２９】凍結乾燥調合物本発明の第二の側面は、ＫＧＦ−２ポリペプチド、および約ｐＨ５.０〜約ｐＨ８.０、好ましくは約ｐＨ５.５〜約ｐＨ６.５、最も好ましくはｐＨ６.２で緩
衝能を有する緩衝液を含むＫＧＦ−２ポリペプチドの凍結乾燥調合物に関する。
有用な緩衝液としては、リン酸、アコニット酸、クエン酸、グルタル酸、リンゴ
酸、コハク酸および炭酸に由来する緩衝液が挙げられる。典型的に用いられるの
は、上記酸の一つのアルカリまたはアルカリ土類塩である。さらに好ましくは、
緩衝液はリン酸またはクエン酸、最も好ましくはクエン酸であろう。たとえば、
調合物は、緩衝量のクエン酸またはその薬理学的に許容しうる塩をＫＧＦ−２Δ
３３と水中で混合することにより生成する組成物を含んでいてよい。好ましい緩
衝液濃度は、約５ｍＭ〜約５０ｍＭであり、より好ましくは約１０ｍＭである。
最も好ましくは、クエン酸緩衝液は約１０ｍＭの濃度で加えられるであろう。ま
た、調合物は、等張化剤としてのＮａＣｌを約０.０１ｍＭ〜約１５０ｍＭ、最も好ましくは約２０ｍＭの濃度にて、および金属キレート化剤、たとえばＥＤＴ
Ａを約０.０１ｍＭ〜約１０ｍＭ、最も好ましくは約１ｍＭの濃度にて含んでいてよい。さらに、バルク剤／低温保護剤（cryoprotectants）、たとえば、ショ糖、グリシン、マンニトール、トレハロースまたは他の薬理学的に許容しうるバ
ルク剤が調合物中に含まれる。使用するバルク剤の量は、溶液が等張となるよう
な範囲であり、約２％〜約１０％ｗ／ｖの範囲である。好ましい濃度は以下のと
おりである：５％マンニトール、７％ショ糖、８％トレハロース、または２％グ
リシン＋０.５％ショ糖。さらに好ましくは、ショ糖またはショ糖／グリシン混合物を用いる。さらに、本発明の凍結乾燥調合物はまた、１またはそれ以上の（
ａ）安定化量の抗酸化剤、たとえばアスコルビン酸または（ｂ）安定化量のチオ
ール化合物、たとえばモノチオグリセロールを含んでいてよい。凍結乾燥調合物
の貯蔵条件は、一般に約２℃〜約２５℃である。さらに好ましくは、貯蔵条件は
約２℃またはそれ以下〜約８℃である。

【００３０】ＫＧＦ−２ポリペプチドは、最初の溶液中で約０.０２ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度にて凍結乾燥する。最初の凍結乾燥溶液は、（ＫＧＦ−２ポリペプチドに加えて）（１）約５ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度範囲の有効量のクエン酸または薬理学的に許
容しうるその塩、好ましくはクエン酸ナトリウム、（２）約０.０１ｍＭ〜約１２５ｍＭの濃度範囲のＮａＣｌ、（３）約０.１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度範囲のＥＤＴＡ、（４）約２％ｗ／ｖ〜約１５％ｗ／ｖの濃度のショ糖、マンニトール、グリシン
またはトレハロースの１またはそれ以上、および（５）水を含むのが好ましい。凍結乾燥緩衝液の好ましいｐＨ範囲は、約５.５〜約８.０
、好ましくは約ｐＨ６.２である。さらに好ましくは、凍結乾燥緩衝液は、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０
ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６.２、および７％ショ糖を含む。

【００３１】凍結乾燥ＫＧＦ−２ポリペプチド調合物は、約２９０ｍＯｓｍの等張条件を維
持するように滅菌水中で再構成する。ＫＧＦ−２ポリペプチドの再構成は、（ａ
）約０.０１％〜約２％ｗ／ｖのモノチオグリセロール、（ｂ）約０.０１％〜約
２％ｗ／ｖのアスコルビン酸、（ｃ）約０.０１％〜約２％ｗ／ｖのメチオニンまたは（ｄ）それらの混合物を含む安定化量の抗酸化剤を任意に含む滅菌水中で
行うことができる。

【００３２】本発明は、安定なＫＧＦ−２ポリペプチド調合物を生成する凍結乾燥サイクル
を包含する。凍結乾燥サイクルは、最初の乾燥相の間にＫＧＦ−２ポリペプチド
生成物をその崩壊温度以下に保持するように設計する。さらに、水分含量を５％
未満、好ましくは２％未満となるようにする。そのようなプロトコールは、特定
のタンパク質について個々に決定しなければならない。本発明によるＫＧＦ−２
ショ糖含有凍結乾燥調合物のための凍結乾燥サイクルの一例は以下のように決定
された：

【００３３】

【表１】

【００３４】本発明の凍結乾燥調合物は、予期しないほどに安定性の増大した生成物を提供
する。実際、本発明の凍結乾燥ＫＧＦ−２調合物は、４５℃までの温度にて少な
くとも９ヶ月間、生物学的に安定である（図４）。逆相ＨＰＬＣは、本発明の凍
結乾燥ＫＧＦ−２調合物が４５℃またはそれ以下、７５％の相対湿度で８ヶ月ま
でその物理化学的特性を保持したことを示した。このような高温度でこのように
長期にわたって安定であることはタンパク質にとって極めて異例のことである。

【００３５】増粘調合物およびゲル調合物本発明の第三の側面は、ＫＧＦ−２ポリペプチドの増粘調合物およびゲル調合
物に関する。（１）増粘剤：増粘剤を上記液体調合物に加えて、得られる調合物の粘度を増加させることが
できる。粘度の増加した調合物は、制御した放出、創傷の形状への付着または流
出の防止が重要である局所適用には有益である。そのような増粘調合物は、創傷
の治癒などの局所的な使用、皮膚疾患を治療するため、またはＫＧＦ−２医薬組
成物の局所適用によって治療し得る他の使用のために用いる。

【００３６】増粘剤は、粘度を約５０〜約１０,０００ｃｐｓ、さらに好ましくは約５０〜約１,０００ｃｐｓ、および最も好ましくは約２００〜約３００ｃｐｓに上げることができなければならない。粘度は回転紡錘粘度計を用いて測定する。増粘剤
の最も好ましい濃度は、０〜５％（ｗ／ｗ）である。増粘した溶液は、常に液体
の状態であろう。

【００３７】適当な増粘剤の例としては、これに限られるものではないが、水溶性のエーテ
ル化セルロースおよびカルボマー（アリルスクロースかまたはペンタエリトリト
ールのアリルエーテルで架橋されたアクリル酸の高分子量ポリマー）が挙げられ
る。エーテル化セルロースの例は当業者にはよく知られており（ＵＳＰに列挙さ
れている）、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロースおよびアルキ
ルヒドロキシアルキルセルロース、たとえば、メチルセルロース、ヒドロキシエ
チルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセ
ルロースなどが挙げられる。別の態様において、局所ゲルまたは切開（incision
al）ゲルは、分子量が約５０,０００〜約７００,０００のセルロース誘導体を約
０〜約２０重量％含んでいてよい。好ましい態様において、セルロース誘導体は
約２重量％〜約８重量％で含まれ、約８０,０００〜約２４０,０００の範囲の分
子量を有する。好ましいセルロース誘導体はヒドロキシプロピルメチルセルロー
ス、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、およびヒドロキシエチル
セルロースである。

【００３８】増粘剤を上記で詳記した注射用調合物に加える場合には、最適の安定性のため
に塩および緩衝剤を加えるかまたは調合物から除去してよい。たとえば、クエン
酸の濃度を上昇させてよい。クエン酸の好ましい濃度は、たとえば、約１０ｍＭ
〜約５００ｍＭクエン酸、さらに好ましくは約１０ｍＭ〜約５０ｍＭクエン酸、
最も好ましくは約１０ｍＭ〜約２０ｍＭクエン酸である。さらに、凍結乾燥調合
物においてショ糖の量を約０％〜約５％ショ糖の範囲まで減らしてよい。

【００３９】増粘剤は本発明の液体調合物に直接加えてよく、ついで凍結乾燥する。別のや
り方として、その中に増粘剤を溶解した適当な希釈剤、最も好ましくは水を加え
ることにより、本発明による凍結乾燥調合物を再構成してよい。そのような増粘
剤調合物は、スプレーにより投与できるであろう。

【００４０】本発明による好ましい増粘ＫＧＦ−２ポリペプチド溶液の一例は、（１）局所的有効量のＫＧＦポリペプチド、好ましくはＫＧＦ−２Δ３３；（２）約１０ｍＭ〜約５００ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液；（３）約０.０１〜約１５０ｍＭのＮａＣｌ；（４）約０.７５〜約１.２７ｍＭ、好ましくは約１ｍＭのＥＤＴＡ；（５）約０.１％〜約７％のショ糖；（６）約０.７５〜約１５％（ｗ／ｗ）のカルボキシメチルセルロースまたは約０.５〜約１.５％のヒドロキシプロピルメチルセルロースまたは約０.２５〜約０.７５％のヒドロキシエチルセルロースまたは約０〜１％のカルボマーまたはこれらの組み合わせを混合することにより生成した生成物を包含する。そのような調合物のｐＨは、最も好ましくはｐＨ６.２である。

【００４１】（２）ゲル化剤：本発明の他の側面は、ＫＧＦ−２ポリペプチドのゲル調合物に関する。室温で
は液体のままであるが皮膚の表面（約３７℃）に適用したときに固化する調合物
を提供するため、ゲル化剤を本発明の注射用調合物に加える。そのような調合物
は、制御した放出、創傷の形状への付着または流出の防止が重要である局所適用
には有用である。そのようなゲル調合物は、創傷の治癒などの局所的な使用、皮
膚疾患を治療するため、またはＫＧＦ−２医薬組成物の局所適用によって治療し
得る他の使用のために用いる。

【００４２】本発明によるＫＧＦ−２ポリペプチドのゲル調合物は、（１）局所的有効量のＫＧＦ−２ポリペプチド；（２）緩衝液；（３）薬理学的に許容しうる希釈剤、好ましくは水；および（４）ゲル形成高分子量化合物を含む。

【００４３】本発明のゲル調合物の粘度は、室温で約１〜約１０,０００ｃｐｓ、最も好ましくは室温で約２０〜約１００ｃｐｓの範囲であってよい。粘度は回転紡錘粘度
計を用いて測定する。本発明に用いることのできるゲル形成高分子量化合物は、典型的に、粘性の水
溶液を生成しうる水溶性ポリマー、または粘性の溶液を生成することができ皮膚
との接触によりゲル化しうる非水溶性で水膨潤性のポリマー（たとえば、コラー
ゲン）である。

【００４４】有用なゲル形成高分子量化合物は、ビニルポリマー、ポリオキシエチレン−ポ
リオキシプロピレンコポリマー、多糖、タンパク質、ポリ（エチレンオキシド）
、アクリルアミドポリマー、およびその誘導体またはその塩から選ばれてよい。
創傷の治癒に用いる医薬ゲル調合物を製造するのに用いる他の化合物は、米国特
許第５,４２７,７７８号（参照のため本明細書中に引用する）に記載されている
。

【００４５】有用なビニルポリマー（または置換ポリエチレン）としては、ポリアクリル酸
、ポリメタクリル酸、ポリビニルピロリドンおよびポリビニルアルコールが挙げ
られる。有用な多糖としては、セルロース誘導体、グリコサミノグリカン、寒天
、ペクチン、アルギン酸、デキストラン、デンプン（α−アミロースまたはアミ
ロペクチン）、およびキトサンが挙げられる。有用なグリコサミノグリカンとし
ては、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン−４−硫酸、ヘパリン硫
酸およびヘパリンが挙げられる。グリコサミノグリカンは、他のゲル形成ポリマ
ー、たとえば、コラーゲン、ゼラチンまたはフィブロネクチンとともに創傷治癒
を促進するために用いる。アクリルアミドポリマーは、ポリアクリルアミドまた
はポリメタクリルアミドであってよい。

【００４６】好ましい高分子量ゲル形成化合物は、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピ
レンブロックコポリマー、とりわけ取引においてPLURONIC(BASF)またはPOLAXAME
RS(BASF)として表示されるブロックコポリマーである。一つの態様において、本発明のゲルは、平均分子量が約５００〜５０,０００のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを約１０〜約
６０重量％含んでいてよい。さらに好ましい態様において、本発明のゲルは、１
,０００〜１５,０００の範囲の分子量のブロックコポリマーを約１４〜約１８重
量％含んでいてよい。本発明の好ましいブロックコポリマーは、Pluronic F108 およびPluronic F127である。

【００４７】ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー（Pluronicま
たはPoloxamer）は局所用ドラッグデリバリーシステムに使用するのに大きな可能性を持っている。なぜなら、それは逆の熱的ゲル化の挙動を示し、良好な薬物
放出特性を有し、さらに毒性も低いからである。ゲルは溶液を温めると形成され
る。それゆえ、このゲルは室温では低粘性の水溶液であるが、哺乳動物に接触し
、体温により温められると溶液がゲル化するにつれ粘度は上昇する。Pluronicゲ
ルは、たとえば創傷や局所投与が望まれるその他の部位へのＫＧＦ−２ポリペプ
チドの徐放に用いることができる。ＫＧＦ−２ポリペプチドは液体状態でPluron
icと混合し、創傷に適用することができる。ゲル化が起こることにより該ポリペ
プチドが創傷に放出される速度が有効に低減され、それによって該ポリペプチド
と創傷部位との間の長期にわたる接触が可能となる。そのようなゲル調合物を使
用する利益としては、創傷に水分を保持すること、および創傷や該化合物を適用
できる他の部位に形状的にフィッティングする医薬化合物とすることができるこ
とが挙げられる。

【００４８】本発明によるＫＧＦ−２ポリペプチドのための好ましいゲル調合物は、クエン
酸緩衝液およびPluronicを含む。該調合物は、所定量のクエン酸または薬理学的
に許容しうるその塩を含んでいてよい。本発明によるゲル調合物はまた、キレート化剤、安定化量の抗酸化剤またはチ
オール類を含んでいてよい。ゲル調合物は、Pluronicなどの高分子量化合物、ま
たは水溶性のエーテル化セルロースなどを、ゲル化を引き起こす量にて含んでい
るであろう。本発明によるゲル調合物において、ＫＧＦ−２ポリペプチドは約０
.０１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で含まれるのが好ましい。

【００４９】好ましくは、ゲル調合物は、（１）約０.０１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの最終計算濃度のＫＧＦ−２ポリペプチド、好ましくはＫＧＦ−２Δ３３ポリペプチド；（２）有効量の緩衝剤；（３）約１０〜約６０重量％、さらに好ましくは約１４〜約１８重量％の、平均
分子量が約５００〜５０,０００ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー；および（４）薬理学的に許容しうる希釈剤、好ましくは水を混合することにより製造する。

【００５０】他の好ましいゲル調合物は、（１）薬理学的活性量のＫＧＦ−２ポリペプチド；（２）約１０ｍＭ〜約５０ｍＭのクエン酸ナトリウム；（３）約０.０１ｍＭ〜約１５０ｍＭのＮａＣｌ；（４）約１ｍＭのＥＤＴＡ；（５）約０.１％〜約７％のショ糖；（６）約１４％〜約１８％のPluronic F127；および（７）水（該調合物は約ｐＨ６.２にある）を含む。

【００５１】最も好ましくは、ゲル調合物は、（１）約０.０１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは約０.１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０.２ｍｇ／ｍｌの範囲
の濃度のＫＧＦ−２ポリペプチド、好ましくはＫＧＦ−２Δ３３；（２）約５ｍＭ〜約２０ｍＭのクエン酸ナトリウム；（３）約１０％〜約２５％（ｗ／ｖ）、好ましくは約１５〜約２５、最も好まし
くは約１６％のPluronic 127またはPoloxamer 407；（４）約６.７％〜約７.３％のショ糖、好ましくは約７％のショ糖；および（５）所定量とする水を含む。

【００５２】ゲル調合物はさらに、下記の１またはそれ以上を含んでいてよい：（６）約０.１ｍＭ〜約１０ｍＭのＥＤＴＡ、（７）約０.０１ｍＭ〜約１２５ｍＭの濃度範囲のＮａＣｌ。ゲル調合物の好ましいｐＨ範囲は、約ｐＨ５.０〜約ｐＨ８.０、好ましくはｐＨ
６.２であり、得られるゲル調合物は等張でなければならない。

【００５３】（３）他の安定化剤：本発明の上記調合物はすべて、抗酸化剤、金属キレート化剤、チオール化合物
および他の一般的な安定化剤から利益を受ける。そのような安定化剤の例として
は、これらに限られるものではないが、以下のものが挙げられる：（ａ）約０.５％〜約２％ｗ／ｖのグリセロール、（ｂ）約０.１％〜約１％ｗ／ｖのメチオニン、（ｃ）約０.１％〜約２％ｗ／ｖのモノチオグリセロール、（ｄ）約１ｍＭ〜約１０ｍＭのＥＤＴＡ、（ｅ）約０.１％〜約２％ｗ／ｖのアスコルビン酸、（ｆ）０.００３％〜約０.０２％ｗ／ｖのポリソルベート８０、（ｇ）０.００１％〜約０.０５％ｗ／ｖのポリソルベート２０、（ｈ）アルギニン、（ｉ）ヘパリン、（ｊ）デキストラン硫酸、（ｋ）シクロデキストリン、または（ｌ）以上の組み合わせ。

【００５４】ＫＧＦ−２ポリペプチドの投与本発明のＫＧＦ−２ポリペプチド調合物には、医薬組成物において有用である
ことが知られている適当な製薬的希釈剤を用いてよい。そのような希釈剤として
は、これらに限られるものではないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、
水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせが挙げられる。調合物
は投与方法に適合したものでなければならない。好ましくは、医薬組成物は、本
発明に従って上記のように調合されるであろう。水が好ましい希釈剤である。

【００５５】ＫＧＦ−２活性を有するポリペプチドは、１またはそれ以上の薬理学的に許容
しうる賦形剤とともに医薬組成物として投与することができる。ヒト患者に投与
する場合には、本発明の医薬組成物の１日の全使用量は、担当医により妥当な医
学的判断に基づいて決定されるであろう。ある特定の患者に対して有効な特定の
治療学的有効量は、達成されるべき応答のタイプおよび程度；他の薬剤の使用の
有無を含む特定の組成；患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別および食事
；投与時間、投与経路、および該組成物の排泄速度；処置の期間；特定の組成物
と組み合わせてまたは同時に使用する薬剤（化学療法剤など）；および医学分野
でよく知られた同様の因子を含む種々の因子に依存するであろう。当該技術分野
で知られた適当な調合物は、Remington's Pharmaceutical Sciences（最新版）、マックパブリッシングカンパニー、イーストン、ペンシルベニアに記載されて
いる。従って、本発明の目的のためのＫＧＦ−２の「有効量」は、以上のことを
考慮して決定される。

【００５６】本発明の医薬組成物は、経口、直腸経由、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、関
節内、皮下、鼻内、吸入、眼内または皮内経路などの都合のよい仕方で投与して
よい。非経口および局所送達が好ましい投与経路である。本明細書において「非
経口」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および
注入を含む投与法をいう。

【００５７】本発明の医薬組成物は、特定の適応症の治療および／または予防に有効な量に
て投与する。たいていの場合、投与経路や徴候等を考慮に入れて、ＫＧＦ−２の
投与量は１日当たり約１μｇ／ｋｇ体重〜約３０μｇ／ｋｇ体重である。しかし
ながら、投与量は０.００１μｇ／ｋｇもの低投与量であってよい。たとえば、特定の場合の局所投与では、１ｃｍ²当たり約０.０１μｇ〜９ｍｇの投与量を投
与するのが好ましい。鼻内および眼内投与の場合は、約０.００１μｇ／ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約０.０５μｇ／ｍｇ〜約４ｍｇ／ｍｌの投与量を投与するのが好ましい。

【００５８】一般的な問題として、非経口的に投与するＫＧＦ−２ポリペプチドの薬理学的
に有効な全量は、患者の体重当たり約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の
範囲であろうが、上記のようにこの範囲は治療における裁量に委ねられるであろ
う。連続的に投与する場合には、ＫＧＦ−２ポリペプチドは一般に、１日当たり
１〜４回の注射かまたはたとえばミニポンプを用いた連続的な皮下注入のいずれ
かにより、約１μｇ／ｋｇ／時〜約５０μｇ／ｋｇ／時の投与速度にて投与する
。静脈内バッグ溶液またはボトル溶液を用いることもできる。

【００５９】線溶系に影響を及ぼすＫＧＦ−２ポリペプチド処置のコースは、所定の最小日
数以上（マウスの場合は７日）続けるならば最適であると思われる。変化を観察
するのに要する処置期間の長さおよび応答を生じるための処置後の間隔は、所望
の効果に依存して変わると思われる。

【００６０】非経口投与の場合は、一つの態様において、ＫＧＦ−２ポリペプチドを所望の
純度にて単位注射剤型（液剤、懸濁剤、または乳濁剤）中に、薬理学的に許容し
うる担体、すなわち投与量および使用した濃度において受容者に非毒性であり調
合物の他の配合成分と両立しうるものと混合することにより調合する。たとえば
、調合物は、酸化剤やポリペプチドにとって有害であることが知られている他の
化合物を含まないのが好ましい。

【００６１】一般に、調合物は、ＫＧＦ−２ポリペプチドを液体担体または細分した固体担
体または両者と均一かつ完全に接触させることにより調製する。ついで、必要な
ら生成物を所望の調合物に成形する。好ましくは担体は非経口担体であり、さら
に好ましくは受容者の血液と等張な溶液である。そのような担体ビヒクルの例と
しては、水、食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液が挙げられる。非
水性のビヒクル、たとえば、固定油やオレイン酸エチルなどもリポソームと同様
に用いることができる。当該技術で知られた適当な調合物は、Remington's Phar
maceutical Sciences（最新版）、マックパブリッシングカンパニー、イーストン、ペンシルベニアに記載されている。

【００６２】ＫＧＦ−２ポリペプチドはまた、動物およびヒトにおいて涙腺の障害、疾患お
よび病理を治療するために液剤、滴剤、または増粘液剤、ゲル剤として眼に投与
することができる。ＫＧＦ−２ポリペプチドはまた、動物およびヒトにおいて鼻粘膜および副鼻腔
上皮の疾患、傷害および病理を治療するために滴剤としてまたはスプレーの形態
で鼻粘膜に鼻内投与することができる。

【００６３】一般に、調合物は、ＫＧＦ−２ポリペプチドを液体担体または細分した固体担
体または両者と均一かつ完全に接触させることにより調製する。ついで、必要な
ら生成物を所望の調合物に成形する。好ましくは担体は非経口担体であり、さら
に好ましくは受容者の血液と等張な溶液である。そのような担体ビヒクルの例と
しては、水、食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液が挙げられる。非
水性のビヒクル、たとえば、固定油やオレイン酸エチルなどもリポソームと同様
に用いることができる。当該技術で知られた適当な調合物は、Remington's Phar
maceutical Sciences（最新版）、マックパブリッシングカンパニー、イーストン、ペンシルベニアに記載されている。

【００６４】担体はまた、等張性および化学的安定性を高める物質などの適当な添加剤を少
量含んでいてよい。そのような物質は、使用した投与量および濃度において受容
者に非毒性であり、緩衝液、たとえば、リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、お
よび他の有機酸またはその塩；抗酸化剤、たとえば、アスコルビン酸；低分子量
（約１０残基未満）ポリペプチド、たとえば、ポリアルギニンまたはトリペプチ
ド；タンパク質、たとえば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン
；親水性ポリマー、たとえば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、たとえば、グ
リシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン；単糖、二糖、およ
びセルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストラン
を含む他の炭水化物；キレート化剤、たとえば、ＥＤＴＡ；糖アルコール、たと
えば、マンニトールまたはソルビトール；対イオン、たとえば、ナトリウム；お
よび／または界面活性剤、たとえば、ポリソルベート、ポリオキサマー、または
ＰＥＧを含む。

【００６５】ＫＧＦ−２は、典型的に、そのようなビヒクル中で約０.０１μｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０.０１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度にて、約５〜約８のｐＨ、好ましくは約６〜約７、最も好ましくは約ｐＨ６.２で調合される。上記賦形剤、担体、または安定化剤のいずれかの使用の結果、ＫＧＦ−２
塩が生成されるであろうことは理解されるであろう。

【００６６】治療目的の投与に使用するＫＧＦ−２は滅菌してよい。滅菌は滅菌濾過膜（た
とえば、０.２ミクロン膜）で濾過することにより容易に行うことができる。治療用ＫＧＦ−２組成物は、滅菌アクセスポートを有する容器、たとえば、静脈内
バッグまたは皮下注射針を通すことのできる栓を有するバイアル中に入れてよい
。

【００６７】ＫＧＦ−２は、通常、単回または多回投与容器、たとえば、密封したアンプル
またはバイアル中に水溶液または再構成用の凍結乾燥調合物として貯蔵されるで
あろう。凍結乾燥調合物の例として、３ｍｌ容バイアルに１ｍｌの滅菌濾過した
１％（ｗ／ｖ）ＫＧＦ−２水溶液を充填し、得られた混合物を凍結乾燥する。注
入溶液は、凍結乾燥したＫＧＦ−２を注射用水（Water-for-Injection）（１種またはそれ以上の抗酸化剤を含んでいてよい）を用いて再構成することにより調
製する。

【００６８】投薬は、たとえばＲＩＡ法によって決定されるように、血中で所定濃度のＫＧ
Ｆ−２活性が達成されるように患者に特異的な仕方で取り決めることができる。
それゆえ、患者の投薬は、ＲＩＡにより測定されるように５０〜１０００ｎｇ／
ｍｌ、好ましくは１５０〜５００ｎｇ／ｍｌの次数で常に血中レベルが達成され
るように調節してよい。

【００６９】ＫＧＦ−２はまた、徐放系により適切に投与される。徐放組成物の適当な例と
しては、成型製品、たとえばフィルム、またはマイクロカプセルの形態の半透過
性ポリマーマトリックスが挙げられる。徐放マトリックスは、ポリラクチド（米
国特許第３,７７３,９１９号、ＥＰ５８,４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とガンマ−エチル−Ｌ−グルタメート（U. Sidmanら、Biopolymers 22: 547-556 (1983
)）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（R. Langerら、J. Biomed.
Mater. Res. 15: 167-277 (1981)、およびR. Langer, Chem. Tech. 12: 98-105
(1982)）、エチレンビニルアセテート（R. Langerら、上掲）またはポリＤ−()
−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３,９８８）を含む。徐放ＫＧＦ−２組成物はまた、リポソームに捕獲したＫＧＦ−２を含む。ＫＧＦ−２を含有するリポソー
ムは、自体公知の方法：ＤＥ３,２１８,１２１；Epsteinら、Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 82: 3688-3692 (1985)；Hwangら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:
4030-4034 (1980)；ＥＰ５２,３２２；ＥＰ３６,６７６：ＥＰ８８,０４６；ＥＰ１４３,９４９；ＥＰ１４２,６４１；日本特許出願第８３−１１８００８号；
米国特許第４,４８５,０４５号および同第４,５４４,５４５号；およびＥＰ１０
２,３２４により調製される。通常、リポソームは小さな（約２００〜８００オングストローム）単層のものであって、脂質含量は約３０モルパーセントコレス
テロール以上であるが、選択した比率は最適のＫＧＦ−２療法のために調節でき
る。

【００７０】本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分の１またはそれ以上を充填した１ま
たはそれ以上の容器を含む医薬パックまたはキットをも提供する。そのような容
器には、医薬製品または生物学的製品の製造、使用または販売を取り締まる政府
部局により指令された形態の通知であって、ヒトの投与のための製造、使用また
は販売の該部局による許可を反映するものを添付することができる。さらに、本
発明のポリペプチド、アゴニストおよびアンタゴニストは、他の治療用化合物と
ともに用いることができる。

【００７１】本発明者らが本発明の調合法に従って調製したＫＧＦ−２ポリペプチドの生物
学的活性および安定性を調べたところ、驚くべきことに、モノチオグリセロール
の使用がＫＧＦ−２ポリペプチドを安定化させ、創傷の治癒に際してＫＧＦ−２
ポリペプチドに対して強化剤として振舞うことが見出された。モノチオグリセロ
ールの強化作用のための最適の濃度範囲は、０.１％〜２％ｗ／ｖであった。

【００７２】ＫＧＦ−２ポリペプチドＫＧＦ−２は上皮細胞および表皮の角質細胞の増殖は刺激するが、繊維芽細胞
などの間充織細胞の増殖は刺激しない。それゆえ、「ＫＧＦ−２タンパク質様活
性を有するポリペプチド」には、以下および米国特許出願第０８／９１０,８７５号に示す角質細胞増殖アッセイにおいてＫＧＦ−２活性を示し、ＦＧＦレセプ
ターのイソ型である1-iiibおよび2-iiibに結合しうるポリペプチドが含まれる。
ＫＧＦ−２タンパク質と同一程度の活性を有する必要はないが、「ＫＧＦ−２タ
ンパク質様活性を有するポリペプチド」はＫＧＦ−２タンパク質と比べて実質的
に同様の活性を示すのが好ましい（すなわち、候補ポリペプチドは、参照ＫＧＦ
−２タンパク質よりも高い活性を示すか、または参照ＫＧＦ−２タンパク質の活
性の１／１０以上、好ましくは約１／２以上の活性を示す）。

【００７３】本発明の調合物に使用するＫＧＦ−２ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニンを有
していても有していなくてもよいが、好ましくは該ポリペプチドはＮ末端メチオ
ニンを欠失しているであろう。ＫＧＦ−２ｃＤＮＡクローンは、１９９４年１２月１６日にアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション、特許寄託、１０８０１ユニバーシティー・ブー
ルバール、マナサス、バージニア２０１１０−２２０９にＡＴＣＣ受託番号７５
９７７として寄託してある。さらに、発現ベクターｐＨＥ４−５中に挿入したＫ
ＧＦ−２Δ３３をコードするｃＤＮＡは、ＡＴＣＣに１９９８年１月１日にＡＴ
ＣＣ受託番号２０９５７５として寄託してある。

【００７４】図１（配列番号：２）に示すポリペプチドまたは寄託したｃＤＮＡによりコー
ドされるポリペプチドに言及するときの「断片」、「誘導体」および「アナログ
」なる語は、該ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持した
ポリペプチドを意味する。それゆえ、アナログには、プロタンパク質部分の開裂
により活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生成するプロタンパク質が含まれ
る。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチドまたは合
成ポリペプチドであってよいが、組換えポリペプチドが好ましい。

【００７５】図１（配列番号：２）に示すポリペプチドまたは寄託したｃＤＮＡによりコー
ドされるポリペプチドの断片、誘導体またはアナログは、（i）１またはそれ以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミ
ノ酸残基）により置換され、そのような置換アミノ酸残基が遺伝子コードにより
コードされているかまたはコードされていないものであるもの、または（ii）１
またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むものであるもの、または（iii）成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を長くする化合物（たとえば、ポ
リエチレングリコール）などの他の化合物に融合しているものであるもの、また
は（iv）成熟ポリペプチドに、リーダー配列や分泌配列や該成熟ポリペプチドま
たはプロタンパク質配列の精製に用いる配列などの別のアミノ酸が融合している
ものであるものであってよい。そのような断片、誘導体およびアナログは、本明
細書の教示から当業者の範囲内であると思われる。

【００７６】「ペプチド」および「オリゴペプチド」なる語は（一般に認識されているよう
に）同義であり、ペプチド結合により連結された少なくとも２つのアミノ酸から
なる鎖を示すものとして、文脈に応じて相互に入れ替えて用いることができる。
「ポリペプチド」なる語は、本明細書において１０を超えるアミノ酸残基を含む
鎖に対して用いる。本明細書においてオリゴペプチドおよびポリペプチドの式お
よび配列はすべて、左から右へ、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に記載す
る。

【００７７】ＫＧＦ−２ポリペプチドの幾つかのアミノ酸配列は、該タンパク質の構造およ
び機能に有意の影響を及ぼすことなく変化させ得ることが当該技術分野で認識さ
れるであろう。そのような配列の差異を想定すると、該タンパク質上に活性を決
定する重要な領域が存在するであろうことを銘記すべきである。一般に、同様の
機能を果たす残基を用いることを条件として、三次元構造を形成する残基は置換
可能である。他の例において、変化が該タンパク質中の重要でない領域に起こる
場合には残基の種類は全く重要でない。

【００７８】本発明のポリペプチドは単離形態にあるのが好ましい。「単離したポリペプチ
ド」とは、天然環境から取り出したポリペプチドを意図する。それゆえ、組換え
宿主細胞内で産生されおよび／または含まれるポリペプチドは、本発明の目的の
ためには単離されたと考えられる。組換え宿主細胞または天然源から部分的また
は実質的に精製したポリペプチドも意図される。

【００７９】本発明の医薬調合物は、配列番号：２のＫＧＦ−２ポリペプチド（とりわけ、
成熟ポリペプチド）およびその欠失変異体、並びに配列番号：２のポリペプチド
およびその欠失変異体に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％の類似性（さらに好ましくは、少なくとも９０％、９５％、９６％
、９７％、９８％、９９％の同一性）を有するポリペプチドを含み、また、その
ようなポリペプチドの部分をも含み、ポリペプチドのそのような部分（以下に記
載するような欠失変異体など）は一般に少なくとも３０アミノ酸、さらに好まし
くは少なくとも５０アミノ酸を含む。

【００８０】当該技術分野で知られているように、２つのポリペプチドの間の「類似性」は
、一方のポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存性アミノ酸置換配列を第二
のポリペプチドの配列と比較することにより決定する。２つのポリペプチドの「類似％」とは、Bestfitプログラム（Wisconsin Seque
nce Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group、ユニバーシティー・リサーチ・パーク、５７５サイエンス・ドライブ、マジソン、ウ
イスコンシン５３７１１）および類似性を決定するための不履行セッティング（
default settings）を用いて２つのポリペプチドのアミノ酸配列を比較すること
により得られる類似性のスコアを意図する。Bestfitは、２つの配列間の最大の類似性のセグメントを見出すため、SmithおよびWatermanのローカルホモロジーアルゴリズム（local homology algorithm)(Advances in Applied Mathematics
2: 482-489, 1981）を採用している。

【００８１】たとえば、ＫＧＦ−２ポリペプチドの参照配列に対して少なくとも９５％の「
同一性」のアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、ＫＧＦ−２ポリペプチドの
参照アミノ酸配列の各１００アミノ酸当たり５アミノ酸までの変化を該ポリペプ
チド配列が含む他は、該ポリペプチドのアミノ酸配列が該参照配列と同一である
ことを意味する。言い換えれば、参照アミノ酸配列に対して少なくとも９５％の
同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るには、該参照配列中の５％ま
でのアミノ酸残基を欠失または他のアミノ酸で置換してよく、または該参照配列
中の全アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸を該参照配列中に挿入してよい。
参照配列中のこれら変更は、参照配列のアミノ末端またはカルボキシ末端の位置
にて、またはこれら末端位置の間のいずれかの部位で、参照配列の残基中に個々
ばらばらにかまたは参照配列内の１またはそれ以上の連続したグループ中に散在
して生じてよい。

【００８２】実際問題としては、特定のポリペプチドがたとえば図１（配列番号：２）に示
すアミノ酸配列または寄託したｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配
列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の
同一性を有するか否かの決定は、Bestfitプログラム（Wisconsin Sequence Anal
ysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group、ユニバーシティー・リサーチ・パーク、５７５サイエンス・ドライブ、マジソン、ウイスコン
シン５３７１１）などの公知のコンピュータープログラムを用いて常法通り行え
る。特定の配列が本発明による参照配列に対してたとえば９５％の同一性を有す
るか否かを決定するためにBestfitや他の配列アラインメントプログラムを用いる場合には、パラメーターのセッティングはもちろん、同一性のパーセントの計
算が参照アミノ酸配列の全長にわたって行われ、参照配列中のアミノ酸残基の全
数の５％までのホモロジーギャップが可能となるようにして行う。

【００８３】ＫＧＦ−２欠失変異体天然のＫＧＦ−２は水性状態において相対的に不安定であり、処理および貯蔵
の間に化学的および物理的な分解を受けて生物学的活性の喪失という結果となる
。天然のＫＧＦ−２はまた、水溶液中では上昇温度で凝集しやすく、酸性条件下
では不活化される。

【００８４】特に好ましいＫＧＦ−２ポリペプチドは、以下に示す欠失変異体である（番号
付けはタンパク質の第一のアミノ酸（Ｍｅｔ）から開始）：Ｔｈｒ（残基３６）−−Ｓｅｒ（残基２０８）Ｃｙｓ（３７）−−Ｓｅｒ（２０８）Ｇｌｎ（３８）−−Ｓｅｒ（２０８）Ａｌａ（３９）−−Ｓｅｒ（２０８）Ｌｅｕ（４０）−−Ｓｅｒ（２０８）Ｇｌｙ（４１）−−Ｓｅｒ（２０８）Ｇｌｎ（４２）−−Ｓｅｒ（２０８）Ａｓｐ（４３）−−Ｓｅｒ（２０８）Ｍｅｔ（４４）−−Ｓｅｒ（２０８）Ｖａｌ（４５）−−Ｓｅｒ（２０８）Ｓｅｒ（４６）−−Ｓｅｒ（２０８）Ｐｒｏ（４７）−−Ｓｅｒ（２０８）Ｇｌｕ（４８）−−Ｓｅｒ（２０８）Ａｌａ（４９）−−Ｓｅｒ（２０８）Ｔｈｒ（５０）−−Ｓｅｒ（２０８）Ａｓｎ（５１）−−Ｓｅｒ（２０８）Ｓｅｒ（５２）−−Ｓｅｒ（２０８）Ｓｅｒ（５３）−−Ｓｅｒ（２０８）Ｓｅｒ（５４）−−Ｓｅｒ（２０８）Ｓｅｒ（５５）−−Ｓｅｒ（２０８）Ｓｅｒ（５６）−−Ｓｅｒ（２０８）Ｐｈｅ（５７）−−Ｓｅｒ（２０８）Ｓｅｒ（５９）−−Ｓｅｒ（２０８）Ｓｅｒ（６２）−−Ｓｅｒ（２０８）Ａｌａ（６３）−−Ｓｅｒ（２０８）Ｇｌｙ（６４）−−Ｓｅｒ（２０８）Ａｒｇ（６５）−−Ｓｅｒ（２０８）Ｖａｌ（６７）−−Ｓｅｒ（２０８）Ｓｅｒ（６９）−−Ｓｅｒ（２０８）Ｖａｌ（７７）−−Ｓｅｒ（２０８）Ａｒｇ（８０）−−Ｓｅｒ（２０８）

【００８５】Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ｈｉｓ（２０７）Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ｖａｌ（２０６）Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ｖａｌ（２０５）Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ｍｅｔ（２０４）Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ｐｒｏ（２０３）Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ｌｅｕ（２０２）Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ｐｈｅ（２０１）Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ｈｉｓ（２００）Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ａｌａ（１９９）Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ｓｅｒ（１９８）Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ｔｈｒ（１９７）Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ａｓｎ（１９６）Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ｌｙｓ（１９５）Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ａｒｇ（１９４）Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ａｒｇ（１９３）Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ｔｈｒ（１９２）Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ｌｙｓ（１９１）Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ａｒｇ（１８８）Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ａｒｇ（１８７）Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ｌｙｓ（１８３）

【００８６】好ましい変異体としては、Ｎ末端欠失Ａｌａ（６３）−−Ｓｅｒ（２０８）（
ＫＧＦ−２Δ２８）およびＳｅｒ（６９）−−Ｓｅｒ（２０８）（ＫＧＦ−２Δ
３３）が挙げられる。他の好ましいＮ末端およびＣ末端欠失変異体としては、Ａ
ｌａ（３９）−−Ｓｅｒ（２０８）；Ｐｒｏ（４７）−−Ｓｅｒ（２０８）；Ｖ
ａｌ（７７）−−Ｓｅｒ（２０８）；Ｇｌｕ（９３）−−Ｓｅｒ（２０８）；Ｇ
ｌｕ（１０４）−−Ｓｅｒ（２０８）；Ｖａｌ（１２３）−−Ｓｅｒ（２０８）
；およびＧｌｙ（１３８）−−Ｓｅｒ（２０８）が挙げられる。他の好ましいＣ
末端欠失変異体としては、Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）
−−Ｌｙｓ（１５３）が挙げられる。

【００８７】さらに本発明に含まれるのは、Ｎ末端とＣ末端の両方でアミノ酸が欠失した欠
失変異体である。そのような変異体には、上記Ｎ末端欠失変異体とＣ末端欠失変
異体とのあらゆる組み合わせが含まれ、たとえば、Ａｌａ（３９）−−Ｈｉｓ（
２００）；Ｍｅｔ（４４）−−Ａｒｇ（１９３）、Ａｌａ（６３）−−Ｌｙｓ（
１５３）、Ｓｅｒ（６９）−−Ｌｙｓ（１５３）等が挙げられる。そのような組
み合わせは、当業者に知られた組換え法を用いて調製できる。

【００８８】それゆえ、本発明の医薬調合物に使用するのに好ましいＫＧＦポリペプチドは
、図１（配列番号：２）に示す少なくとも最初の３８個のＮ末端アミノ酸残基を
欠失しているが（すなわち、少なくともＭｅｔ（１）−Ｇｌｎ（３８）の欠失）
最初の１４７個のＮ末端アミノ酸残基までは欠失していない他は図１（配列番号
：２）に示すアミノ酸配列を含むものを包含する。別の態様において、本発明の
調合物は、図１（配列番号：２）に示す少なくとも最初の３８個のＮ末端アミノ
酸残基を欠失しているが（すなわち、少なくともＭｅｔ（１）−Ｇｌｎ（３８）
の欠失）最初の１３７個のＮ末端アミノ酸残基までは欠失していないであろう欠
失を有する変異体を含む。別の態様において、本発明の調合物は、図１（配列番
号：２）に示す少なくとも最初の４６個のＮ末端アミノ酸残基を欠失しているが
最初の１３７個のＮ末端アミノ酸残基までは欠失していないであろう欠失を有す
る変異体を含む。別の態様において、本発明の調合物は、図１（配列番号：２）
に示す少なくとも最初の６２個のＮ末端アミノ酸残基を欠失しているが最初の１
３７個のＮ末端アミノ酸残基までは欠失していないであろう欠失を有する変異体
を含む。別の態様において、本発明の調合物は、図１（配列番号：２）に示す少
なくとも最初の６８個のＮ末端アミノ酸残基を欠失しているが最初の１３７個の
Ｎ末端アミノ酸残基までは欠失していないであろう欠失を有する変異体を含む。
別の態様において、本発明の調合物は、図１（配列番号：２）に示す少なくとも
最初の７６個のＮ末端アミノ酸残基を欠失しているが最初の１３７個のＮ末端ア
ミノ酸残基までは欠失していないであろう欠失を有する変異体を含む。別の態様
において、本発明の調合物は、図１（配列番号：２）に示す少なくとも最初の９
２個のＮ末端アミノ酸残基を欠失しているが最初の１３７個のＮ末端アミノ酸残
基までは欠失していないであろう欠失を有する変異体を含む。別の態様において
、本発明の調合物は、図１（配列番号：２）に示す少なくとも最初の１０３個の
Ｎ末端アミノ酸残基を欠失しているが最初の１３７個のＮ末端アミノ酸残基まで
は欠失していないであろう欠失を有する変異体を含む。別の態様において、本発
明の調合物は、図１（配列番号：２）に示す少なくとも最初の１２２個のＮ末端
アミノ酸残基を欠失しているが最初の１３７個のＮ末端アミノ酸残基までは欠失
していないであろう欠失を有する変異体を含む。

【００８９】上記Ｎ末端欠失変異体の範囲を有するＫＧＦ−２変異体を含む調合物に加えて
、本発明はまた、上記範囲のすべての組み合わせ、たとえば、図１（配列番号：
２）に示す少なくとも最初の６２個のＮ末端アミノ酸残基だが最初の６８個のＮ
末端アミノ酸残基を超えない欠失；図１（配列番号：２）に示す少なくとも最初
の６２個のＮ末端アミノ酸残基だが最初の７６個のＮ末端アミノ酸残基を超えな
い欠失；図１（配列番号：２）に示す少なくとも最初の６２個のＮ末端アミノ酸
残基だが最初の９２個のＮ末端アミノ酸残基を超えない欠失；図１（配列番号：
２）に示す少なくとも最初の６２個のＮ末端アミノ酸残基だが最初の１０３個の
Ｎ末端アミノ酸残基を超えない欠失；図１（配列番号：２）に示す少なくとも最
初の６８個のＮ末端アミノ酸残基だが最初の７６個のＮ末端アミノ酸残基を超え
ない欠失；図１（配列番号：２）に示す少なくとも最初の６８個のＮ末端アミノ
酸残基だが最初の９２個のＮ末端アミノ酸残基を超えない欠失；図１（配列番号
：２）に示す少なくとも最初の６８個のＮ末端アミノ酸残基だが最初の１０３個
のＮ末端アミノ酸残基を超えない欠失；図１（配列番号：２）に示す少なくとも
最初の４６個のＮ末端アミノ酸残基だが最初の６２個のＮ末端アミノ酸残基を超
えない欠失；図１（配列番号：２）に示す少なくとも最初の４６個のＮ末端アミ
ノ酸残基だが最初の６８個のＮ末端アミノ酸残基を超えない欠失；図１（配列番
号：２）に示す少なくとも最初の４６個のＮ末端アミノ酸残基だが最初の７６個
のＮ末端アミノ酸残基を超えない欠失；等を有する調合物に関する。

【００９０】他の態様において、Ｃ末端欠失変異体を含む調合物が本発明により提供される
。好ましくは、該Ｃ末端欠失変異体のＮ末端アミノ酸残基は、図１（配列番号：
２）の１（Ｍｅｔ）、３６（Ｔｈｒ）または３７（Ｃｙｓ）である。そのような
変異体を含む調合物としては、図１（配列番号：２）に示す少なくとも最後のＣ
末端アミノ酸残基（Ｓｅｒ（２０８））を欠失しているが最後の５５個のＣ末端
アミノ酸残基（すなわち、アミノ酸残基Ｇｌｕ（１５４）−Ｓｅｒ（２０８）の
欠失）までは欠失していない他は図１（配列番号：２）に示すアミノ酸配列を含
むものを包含する。別の態様において、本発明の調合物は、図１（配列番号：２
）に示す少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基を欠失しているが最後の６５個の
Ｃ末端アミノ酸残基までは欠失していないであろう欠失を有する変異体を含む。
別の態様において、本発明の調合物は、図１（配列番号：２）に示す少なくとも
１０個のＣ末端アミノ酸残基を欠失しているが最後の５５個のＣ末端アミノ酸残
基までは欠失していないであろう欠失を有する変異体を含む。別の態様において
、本発明の調合物は、図１（配列番号：２）に示す少なくとも２０個のＣ末端ア
ミノ酸残基を欠失しているが最後の５５個のＣ末端アミノ酸残基までは欠失して
いないであろう欠失を有する変異体を含む。別の態様において、本発明の調合物
は、図１（配列番号：２）に示す少なくとも３０個のＣ末端アミノ酸残基を欠失
しているが最後の５５個のＣ末端アミノ酸残基までは欠失していないであろう欠
失を有する変異体を含む。別の態様において、本発明の調合物は、図１（配列番
号：２）に示す少なくとも４０個のＣ末端アミノ酸残基を欠失しているが最後の
５５個のＣ末端アミノ酸残基までは欠失していないであろう欠失を有する変異体
を含む。別の態様において、本発明の調合物は、図１（配列番号：２）に示す少
なくとも５０個のＣ末端アミノ酸残基を欠失しているが最後の５５個のＣ末端ア
ミノ酸残基までは欠失していないであろう欠失を有する変異体を含む。

【００９１】上記Ｃ末端欠失変異体の範囲を有するＫＧＦ−２変異体を含む調合物に加えて
、本発明はまた、上記範囲のすべての組み合わせ、たとえば、図１（配列番号：
２）に示す少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基だが最後の１０個のＣ末端アミ
ノ酸残基を超えない欠失；図１（配列番号：２）に示す少なくとも最後のＣ末端
アミノ酸残基だが最後の２０個のＣ末端アミノ酸残基を超えない欠失；図１（配
列番号：２）に示す少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基だが最後の３０個のＣ
末端アミノ酸残基を超えない欠失；図１（配列番号：２）に示す少なくとも最後
のＣ末端アミノ酸残基だが最後の４０個のＣ末端アミノ酸残基を超えない欠失；
図１（配列番号：２）に示す少なくとも最後の１０個のＣ末端アミノ酸残基だが
最後の２０個のＣ末端アミノ酸残基を超えない欠失；図１（配列番号：２）に示
す少なくとも最後の１０個のＣ末端アミノ酸残基だが最後の３０個のＣ末端アミ
ノ酸残基を超えない欠失；図１（配列番号：２）に示す少なくとも最後の１０個
のＣ末端アミノ酸残基だが最後の４０個のＣ末端アミノ酸残基を超えない欠失；
図１（配列番号：２）に示す少なくとも最後の２０個のＣ末端アミノ酸残基だが
最後の３０個のＣ末端アミノ酸残基を超えない欠失；等を有する調合物に関する
。

【００９２】さらに他の態様において、ＫＧＦ−２ポリペプチドは、Ｎ末端残基およびＣ末
端残基の両方でアミノ酸が欠失した欠失変異体であってよい。そのような変異体
は、上記Ｎ末端欠失変異体とＣ末端欠失変異体とのすべての組み合わせを包含す
る。そのような変異体としては、図１（配列番号：２）に示す少なくとも最初の
４６個のＮ末端アミノ酸残基を欠失しているが最初の１３７個のＮ末端アミノ酸
残基までは欠失しておらず、少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基を欠失してい
るが最後の５５個のＣ末端アミノ酸残基までは欠失していない他は図１（配列番
号：２）に示すアミノ酸配列を含むものを包含する。別の態様において、欠失は
、図１（配列番号：２）の少なくとも最初の６２個、６８個、７６個、９２個、
１０３個または１２２個のＮ末端アミノ酸残基だが最初の１３７個のＮ末端アミ
ノ酸残基を超えない欠失および図１の少なくとも最後の１０個、２０個、３０個
、４０個、または５０個のＣ末端アミノ酸残基だが最後の５５個のＣ末端アミノ
酸残基を超えない欠失を含んでいてよい。

【００９３】ＫＧＦ−２置換変異体有用なＫＧＦ−２ポリペプチドにはアミノ酸置換を有するものが含まれる。天
然の成熟ＫＧＦ−２は４４個の荷電残基を含み、そのうち３２個は正の荷電を有
している。そのような残基のタンパク質の三次元構造中での位置に依存して、こ
れらクラスター（塊）を作った残基を１またはそれ以上を負の荷電または中性の
荷電を有するアミノ酸で置換することは、タンパク質の安定性の増大および凝集
の低減を達成するのに有用である。タンパク質の凝集は活性の喪失をきたすだけ
に留まらず、医薬調合物を調製する際に問題となる。なぜなら、そのような凝集
は免疫原性であり得るからである（Pinckardら、Clin. Exp. Immunol. 2: 331-3
40 (1967), Robbinsら、Diabetes 36: 838-845 (1987), Clelandら、Crit. Rev.
Therapeutic Drug Carrier Systems 10: 307-377 (1993)）。いかなる修飾であ
ろうと、タンパク質分子の三次元構造内での電荷の反発を最小にすることを考慮
しなければならない。それゆえ、特に興味のもたれるのは、荷電アミノ酸を他の
荷電アミノ酸および中性または負に荷電したアミノ酸と置換することである。後
者の置換では正の荷電の減少したタンパク質となり、ＫＧＦ−２の特性が改善さ
れる。そのような改善には、天然のＫＧＦ−２タンパク質と比較してアナログの
安定性が高くなり凝集が低減することが含まれる。

【００９４】アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターへの結合の選択性をも変化させ得
る。Ostadeら、Nature 361: 266-268 (1993)は、２つの知られたＴＮＦレセプタ
ーの一方のみへのＴＮＦアルファの結合となるある種のＴＮＦアルファ変異体を
記載している。

【００９５】ＫＧＦ−２分子は、天然の変異かまたはヒトによる操作のいずれかにより、１
またはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を含んでいてよい。幾つかの
好ましい変異体の例としては：Ａｌａ（４９）Ｇｌｎ、Ａｓｎ（５１）Ａｌａ、
Ｓｅｒ（５４）Ｖａｌ、Ａｌａ（６３）Ｐｒｏ、Ｇｌｙ（６４）Ｇｌｕ、Ｖａｌ
（６７）Ｔｈｒ、Ｔｒｐ（７９）Ｖａｌ、Ａｒｇ（８０）Ｌｙｓ、Ｌｙｓ（８７
）Ａｒｇ、Ｔｙｒ（８８）Ｔｒｐ、Ｐｈｅ（８９）Ｔｙｒ、Ｌｙｓ（９１）Ａｒ
ｇ、Ｓｅｒ（９９）Ｌｙｓ、Ｌｙｓ（１０２）Ｇｌｎ、Ｌｙｓ１０３（Ｇｌｕ）
、Ｇｌｕ（１０４）Ｍｅｔ、Ａｓｎ（１０５）Ｌｙｓ、Ｐｒｏ（１０７）Ａｓｎ
、Ｓｅｒ（１０９）Ａｓｎ、Ｌｅｕ（１１１）Ｍｅｔ、Ｔｈｒ（１１４）Ａｒｇ
、Ｇｌｕ（１１７）Ａｌａ、Ｖａｌ（１２０）Ｉｌｅ、Ｖａｌ（１２３）Ｉｌｅ
、Ａｌａ（１２５）Ｇｌｙ、Ｉｌｅ（１２６）Ｖａｌ、Ａｓｎ（１２７）Ｇｌｕ
、Ａｓｎ（１２７）Ｇｌｎ、Ｔｙｒ（１３０）Ｐｈｅ、Ｍｅｔ（１３４）Ｔｈｒ
、Ｌｙｓ（１３６）Ｇｌｕ、Ｌｙｓ（１３７）Ｇｌｕ、Ｇｌｙ（１４２）Ａｌａ
、Ｓｅｒ（１４３）Ｌｙｓ、Ｐｈｅ（１４６）Ｓｅｒ、Ａｓｎ（１４８）Ｇｌｕ
、Ｌｙｓ（１５１）Ａｓｎ、Ｌｅｕ（１５２）Ｐｈｅ、Ｇｌｕ（１５４）Ｇｌｙ
、Ｇｌｕ（１５４）Ａｓｐ、Ａｒｇ（１５５）Ｌｅｕ、Ｇｌｕ（１５７）Ｌｅｕ
、Ｇｌｙ（１６０）Ｈｉｓ、Ｐｈｅ（１６７）Ａｌａ、Ａｓｎ（１６８）Ｌｙｓ
、Ｇｌｎ（１７０）Ｔｈｒ、Ａｒｇ（１７４）Ｇｌｙ、Ｔｙｒ（１７７）Ｐｈｅ
、Ｇｌｙ（１８２）Ｇｌｎ、Ａｌａ（１８５）Ｖａｌ、Ａｌａ（１８５）Ｌｅｕ
、Ａｌａ（１８５）Ｉｌｅ、Ａｒｇ（１８７）Ｇｌｎ（１９０）Ｌｙｓ、Ｌｙｓ
（１９５）Ｇｌｕ、Ｔｈｒ（１９７）Ｌｙｓ、Ｓｅｒ（１９８）Ｔｈｒ、Ａｒｇ
（１９４）Ｇｌｕ、Ａｒｇ（１９４）Ｇｌｎ、Ｌｙｓ（１９１）Ｇｌｕ、Ｌｙｓ
（１９１）Ｇｌｎ、Ａｒｇ（１８８）Ｇｌｕ、Ａｒｇ（１８８）Ｇｌｎ、Ｌｙｓ
（１８３）Ｇｌｕが挙げられる。

【００９６】たとえば、Ａｌａ（４９）Ｇｌｎのような表示は、図１（配列番号：２）の位
置４９のＡｌａがＧｌｎで置換されていることを意味する。タンパク質の折り畳みや活性に有意の影響を及ぼさない保存的なアミノ酸置換
などのように最小の性質の変化であるのが好ましい。当業者に知られた保存的な
アミノ酸置換の例は以下に挙げるとおりである：芳香族アミノ酸：フェニルアラニントリプトファンチロシン疎水性アミノ酸：ロイシンイソロイシンバリン極性アミノ酸：グルタミンアスパラギン塩基性アミノ酸：アルギニンリジンヒスチジン酸性アミノ酸：アスパラギン酸グルタミン酸小さなアミノ酸：アラニンセリントレオニンメチオニングリシン

【００９７】もちろん、当業者が行うことのできるアミノ酸置換の数は、上記のものを含む
多くの因子に依存する。一般的にいって、所定のＫＧＦ−２ポリペプチドの置換
数は、対象に依存して５０、４０、３０、２０、１０、５、または３を超えない
であろう。たとえば、安定性を改善するため、所定数の置換をＫＧＦ−２のＣ末
端で行うことができる。

【００９８】ＫＧＦ−２中のアミノ酸で機能にとって本質的なものの同定は、部位特異的突
然変異誘発やアラニンスキャニング突然変異誘発などの当該技術分野でよく知ら
れた方法により行うことができる（CunninghamおよびWells, Science 244: 1081
-1085 (1989)）。後者の方法は、分子のすべての残基に単一のアラニン変異を導
入するものである。ついで、得られた変異体分子をレセプター結合性やインビト
ロおよびインビボ増殖活性などの生物学的活性について試験する。（たとえば、
実施例１を参照）。リガンド−レセプター結合に重要な部位はまた、結晶化、核
磁気共鳴または光親和性標識などの構造分析によっても決定できる（たとえば、
Smithら、J. Mol. Biol. 224: 899-904 (1992);およびde Vosら、Science, 255:
306-312 (1992)を参照）。

【００９９】他の有用なＫＧＦポリペプチドは、アミノ酸位置３７および１０６および１５
０のシステインの代わりにセリンの置換を有するポリペプチドを含む。奇数のシ
ステインは、少なくとも一つのシステイン残基がタンパク質の所望でない三次元
構造をとることを引き起こし得る分子間架橋または結合に利用されることを意味
する。１またはそれ以上のシステインがセリンまたはたとえばアラニンによって
置換された新規なＫＧＦ−２タンパク質は、一般に可溶性で正しく折り畳まれた
タンパク質として高収率で精製される。理論に拘泥されることを意図するもので
はないが、位置１０６のシステイン残基が機能にとって重要であると思われる。
このシステイン残基は他のすべてのＦＧＦファミリーの成員のなかでも非常に保
存されている。

【０１００】ＫＧＦ−２ポリペプチド組成物の治療学的使用本発明のポリペプチドは、角質細胞の増殖を刺激する。従って、本発明の組成
物は、創傷の治癒のための上皮細胞および基底角質細胞の増殖を刺激するため、
および毛髪の毛包産生の刺激および真皮創傷の治癒のために用いることができる
。これら創傷は表面的な性質のものであってよいが、深部のもので皮膚の真皮お
よび上皮の損傷が関わるものであってもよい。ＫＧＦ−２は多くの疾患および状態を治療するのに有用である。たとえば、Ｋ
ＧＦ−２は、種々の創傷治癒モデルにおいてインビトロおよびインビボで活性で
ある。１９９７年８月１３日に出願された米国特許出願第０８／９１０,８７５号および１９９８年２月１３日に出願された米国特許出願第０９／０２３,０８２号を参照。

【０１０１】ＫＧＦ−２を投与する個体は、通常の速度で創傷を治癒するかまたは治癒が損
なわれていてよい。治癒が損なわれていない個体に投与する場合には、ＫＧＦ−
２は通常の治癒プロセスを促進するために投与する。治癒が損なわれた個体に投
与する場合には、ＫＧＦ−２は、さもなければゆっくりとしか治癒しないかまた
は全く治癒しない創傷の治癒を容易にするために投与する。多くの苦痛や病気は
治癒力を損なう結果となる。これら苦痛および病気としては、糖尿病（たとえば
、II型糖尿病）、ステロイド剤および非ステロイド剤の両者での治療、および虚
血性の遮断阻害または傷害が挙げられる。

【０１０２】多くの増殖因子が治癒の損なわれた個体において創傷治癒を促進することが示
されている。これら増殖因子としては、成長ホルモン放出因子、血小板由来増殖
因子、および塩基性繊維芽細胞増殖因子が挙げられる。それゆえ、本発明は、１
またはそれ以上の他の増殖因子または創傷治癒を促進する他の薬剤とともにＫＧ
Ｆ−２組成物を投与することをも包含する。

【０１０３】本発明の組成物はまた、通常の速度で治癒する個体および治癒の損なわれた個
体の両者において外科的手順により引き起こされた吻合その他の創傷の治癒をも
促進する。本発明の組成物はまた、細胞、たとえば、筋肉細胞、神経組織を構成する細胞
、前立腺細胞、および肺細胞の分化を刺激するために用いることができる。

【０１０４】本発明の組成物は、通常の個体および異常な創傷治癒を誘発する状態、たとえ
ば、尿毒症、栄養不良、ビタミン不足、肥満、感染、免疫抑制、およびステロイ
ド剤、放射線療法、および抗新生物剤および代謝拮抗物質による全身的治療に付
随する合併症にさらされた個体において、外科的創傷、切開創傷、真皮および上
皮の損傷を含む深部の創傷、眼組織の創傷、歯科組織の創傷、口腔創傷、糖尿病
性潰瘍、真皮の潰瘍、肘の潰瘍、動脈の潰瘍、静脈欝血性潰瘍、および熱または
冷の極端な温度への暴露、または化学物質への暴露の結果としての火傷を含む創
傷の創傷治癒を刺激するのに臨床的に有用である。本発明の組成物はまた、虚血
および虚血傷害、たとえば、静脈循環系復帰および／または不足の傷害に付随す
る創傷の治癒の促進のため；真皮の喪失後の真皮の再確立の促進のため；真皮の
引っ張り強さおよび真皮の厚さを増加させるため；および皮膚移植片の創傷床へ
の付着の増大および創傷床からの再上皮形成の促進のためにも有用である。

【０１０５】ＫＧＦ−２ポリペプチドの他の治療的用途としては、これに限られるものでは
ないが、火傷および皮膚欠損、たとえば乾癬や表皮水泡症などを治療する目的で
上皮細胞増殖および基底角質細胞を刺激することが挙げられる。ＫＧＦ−２は、
皮膚移植片の創傷床への付着を増大させるため、および該創傷床からの再上皮形
成を刺激するために用いることができる。ＫＧＦ−２はまた、放射線照射、化学
療法およびウイルス感染の結果生じる消化管毒性の副作用を低減するために用い
ることもできる。ＫＧＦ−２は、肝臓、肺、腎臓、乳房、膵臓、胃、小腸、およ
び大腸の疾患および病的状態を治療するのに用いることができる。ＫＧＦ−２は
、炎症性腸疾患、糖尿病、血小板減少症、低フィブリノーゲン血症、低アルブミ
ン血症、低グロブリン血症（hypoglobulinemia）、出血性膀胱炎、口内乾燥症、
乾性角結膜炎の治療に用いることができる。ＫＧＦ−２は、唾液腺、涙腺の上皮
細胞を刺激するため、および副鼻腔再上皮形成および鼻粘膜の増殖を刺激するた
めに用いることができる。本発明の組成物により治療しうる他の多くの適応症は、米国特許出願第０８／
９１０,８７５号および同第０９／０２３,０８２号（参照のため本明細書中に引
用する）に記載してある。

【０１０６】本発明は、ＫＧＦ−２およびその欠失変異体の新規な液体および凍結乾燥調合
物に関する。本発明はさらに、ＫＧＦ−２の調合物の治療目的の使用に関する。
本発明の調合物は活性なＫＧＦ−２ポリペプチドに優れた安定性を付与し、幾つ
かの場合には該ポリペプチドの創傷治癒活性を強化し劇的に増大させる。

【０１０７】本明細書において「個体」とは、動物、好ましくは哺乳動物（ヒトニザル（ap
es）、ウシ、ウマ、ブタ、イノシシ、ヒツジ、齧歯類、ヤギ、イヌ、ネコ、ニワ
トリ、サル、ウサギ、ケナガイタチ（ferrets）、クジラ、およびイルカ）、さらに好ましくはヒトを意味する。本発明の調合物に用いるＫＧＦ−２Δ３３ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニン
を有していても有していなくてもよいが、該ポリペプチドはＮ末端メチオニンを
欠いているのが好ましい。本発明のＫＧＦ−２ポリペプチド調合物の安定性は、
以下に記載する増殖アッセイにより決定される。

【０１０８】角質細胞増殖アッセイ皮膚角質細胞は、皮膚の表皮に存在する細胞である。皮膚内での角質細胞の増
殖および拡張は創傷治癒の重要なプロセスである。それゆえ、角質細胞の増殖ア
ッセイは、角質細胞の増殖、従って創傷治癒を刺激するうえでのタンパク質活性
の価値ある指標である。

【０１０９】しかしながら、角質細胞をインビトロで増殖させるのは困難である。角質細胞
株はほとんど存在しない。これら細胞株は、異なる細胞性および遺伝性の欠陥を
有する。細胞性の欠陥、たとえば基本的な増殖因子レセプターの喪失や基本的な
増殖因子の増殖への依存により本アッセイが錯綜することを避けるため、一次皮
膚角質細胞を本アッセイのために選択する。これら一次角質細胞はClonetics, I
nc.（サンジエゴ、カリフォルニア）から入手する。

【０１１０】ＫＧＦ−２ポリペプチドの生物学的活性は、繊維芽細胞増殖因子2iiibレセプター（ＦＧＦＲ2iiib）をトランスフェクションしてあるマウスＢａｆ３２ｂ細
胞を用いた細胞増殖アッセイにより決定することができる。細胞の増殖は、以下
に記載するように細胞を該タンパク質に暴露した後に［メチル−³Ｈ］−チミジンの導入により測定する。アッセイは、各ウエルに約２２,０００個のＢａｆ３
２ｂ細胞を入れた９６ウエル組織培養クラスタープレート中で行う。細胞を種々
の濃度のＫＧＦ−２ポリペプチドに３回ずつ曝し、ＣＯ₂インキュベーター中で３７℃にて４８時間インキュベートする。ついで、標識チミジンを含む適当な量
の細胞培地を各ウエルに加え、インキュベーションをさらに５時間続ける。つい
で、細胞をセルハーベスターを用いて９６ウエルフォーマットにてガラス繊維フ
ィルターマット上に回収する。フィルターマットを乾燥させ、各試料に導入され
た放射能をフラット−ベッド液体シンチレーションカウンターを用いてカウント
する。このようなアッセイ条件下において、ＫＧＦ−２に暴露された細胞は、プ
ラセボ緩衝液の適当な希釈液かまたは単にリン酸緩衝食塩水のいずれかで処理し
た対照細胞と比較して増大した放射能の導入を示す。

【０１１１】他の有用な角質細胞増殖アッセイは、Alamar Blueを用いるものである。Alama
r Blueは、培地に添加したときにミトコンドリアによって代謝される成育可能な
青色染料である。ついで、この染料は組織培養上澄み液中で赤変する。赤色染料
の量は、５７０ｎｍと６００ｎｍとの間の光学密度の差異を読み取ることにより
直接定量できる。この読み取りは、細胞の活性および細胞数を反映する。

【０１１２】正常な一次皮膚角質細胞（ＣＣ−０２５５、ＮＨＥＫ−Ｎｅｏプールしたもの
）をClonetics, Inc.から購入する。これら細胞は継代２である。角質細胞を８０％のコンフルエンシーに達するまで完全角質細胞増殖培地（ＣＣ−３００１、
ＫＧＭ；Clonetics, Inc.）中で増殖させる。細胞を製造業者の指示に従ってトリプシン処理する。簡単に説明すると、細胞をハンクスの平衡塩類溶液で２回洗
浄する。２〜３ｍｌのトリプシンを細胞に室温にて約３〜５分間かけて加える。
トリプシン中和溶液を加え、細胞を回収する。細胞を６００×ｇにて室温で５分
間回転させ、前以て温めた培地を用いて１ｃｍ²当たり３,０００細胞にて新たな
フラスコにプレーティングする。

【０１１３】増殖アッセイのため、最外列を除いて完全培地中のコーニング平底９６ウエル
プレートの各ウエル当たり１,０００〜２,０００個の角質細胞をプレーティング
する。外側のウエルには２００μｌの滅菌水を満たす。このことにより、ウエル
の温度および湿度の変動を最小限に保持することができる。細胞を３７℃にて一
夜増殖させる。細胞を角質細胞基本培地（ＣＣ−３１０１、ＫＢＭ、Clonetics,
Inc.）で２回洗浄し、１００μｌのＫＢＭを各ウエルに加える。２４時間インキュベートする。増殖因子をＫＢＭで系列希釈により希釈し、１００μｌを各ウ
エルに加える。ＫＧＭを正の対照として、ＫＢＭを負の対照として用いる。各濃
度の時点について６つのウエルを用いる。２〜３日インキュベートする。インキ
ュベーションの終了時点で細胞をＫＢＭで１回洗浄し、１０％ｖ／ｖのalamar B
lueを前以て混合したＫＢＭの１００μｌを加える。ＫＧＭ正の対照で培地の赤変が始まるまで６〜１６時間インキュベートする。プレートをプレートリーダー
に直接置くことにより、Ｏ.Ｄ.５７０ｎｍマイナスＯ.Ｄ.６００ｎｍを測定する
。

【０１１４】ＫＧＦ−２欠失変異体の構築本発明の組成物に使用するのに有用な欠失変異体は以下のプロトコールにより
構築することができる。欠失変異体の構築を、最適化ＫＧＦ−２構築物を鋳型として用いてＫＧＦ−２
遺伝子の５'末端および３'末端から行った。欠失は、大腸菌での発現にマイナス
に影響するかもしれない遺伝子の領域に基づいて選択した。５'欠失に関しては、以下に列挙したプライマーを５'プライマーとして用いた。これらプライマーは、示した制限部位および開始メチオニンをコードするＡＴＧを含んでいる。Ｋ
ＧＦ−２（ＦＧＦ−１２）２０８アミノ酸３'ＨｉｎｄIIIプライマーを３'プライマーとして用いた。２５サイクルのＰＣＲ増幅を標準条件を用いて行った。Ｋ
ＧＦ−２３６アミノ酸／２０８アミノ酸欠失変異体の生成物を５'部位について
はＢｓｐＨＩ制限し、３'部位についてはＨｉｎｄIII制限し、ＢｓｐＨＩおよび
ＨｉｎｄIIIで消化したｐＱＥ６０中にクローニングした。他のすべての生成物は、５'制限酵素についてはＮｃｏＩで制限し、３'部位についてはＨｉｎｄIII 制限し、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄIIIで消化したｐＱＥ６０中にクローニングした。ＫＧＦ−２（ＦＧＦ−１２）３６アミノ酸／１５３アミノ酸および１２８ア
ミノ酸については、３'ＨｉｎｄIIIを３'プライマーとして用い、ＦＧＦ−１２
３６アミノ酸／２０８アミノ酸を５'プライマーとして用いた。ＦＧＦ−１２６
２アミノ酸／１５３アミノ酸、１２８アミノ酸については、３'ＨｉｎｄIIIを３
'プライマーとして用い、ＦＧＦ−１２６２アミノ酸／２０８アミノ酸を５'プライマーとして用いた。得られたクローンの命名は、欠失の結果得られるポリペ
プチドの最初と最後のアミノ酸を示している。たとえば、ＫＧＦ−２３６アミノ酸／１５３アミノ酸は、該欠失変異体の最初のアミノ酸がＫＧＦ−２のアミノ
酸３６であり、最後のアミノ酸がアミノ酸１５３であることを示している。これ
らＫＧＦ−２欠失変異体の構築もまた、米国特許出願第０８／９１０,８７５号および同第０９／０２３,０８２号（参照のため本明細書中に引用する）に記載してある。さらに、以下に示すように、各変異体はＮ末端のメチオニンが付加し
ている。しかしながら、本発明による調合物に用いるＫＧＦ−２欠失ポリペプチ
ドはＮ末端メチオニンを有していても有していなくてもよく、該ポリペプチドは
Ｎ末端メチオニンを欠いているのが好ましいであろう。

【０１１５】欠失プライマーの配列は以下のとおりである：ＦＧＦ１２３６アミノ酸／２０８アミノ酸：５'ＢｓｐｈＩＧＧＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＣＡＧＧＣＴＣＴＧＧＧＴ
ＣＡＧＧＡＣ（配列番号：３）ＦＧＦ１２６３アミノ酸／２０８アミノ酸：５'ＮｃｏＩＧＧＡＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＣＧＴＣＡＣＧＴＴＣＧ（配
列番号：４）ＦＧＦ１２７７アミノ酸／２０８アミノ酸：５'ＮｃｏＩＧＧＡＣＡＧＣＣＡＴＧＧＴＴＣＧＴＴＧＧＣＧＴＡＡＡＣＴＧ（
配列番号：５）ＦＧＦ１２９３アミノ酸／２０８アミノ酸：５'ＮｃｏＩＧＧＡＣＡＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＡＡＡＡＣＧＧＴＡＡＡＧＴＴＴ
Ｃ（配列番号：６）ＦＧＦ１２１０４アミノ酸／２０８アミノ酸：５'ＮｃｏＩＧＧＡＣＣＣＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＣＴＧＣＣＣＧＴＡＧＡＧＣ（
配列番号：７）ＦＧＦ１２１２３アミノ酸／２０８アミノ酸：５'ＮｃｏＩＧＧＡＣＣＣＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＡＧＣＣＡＴＴＡＡＣＡＧＣＡ
ＡＣ（配列番号：８）ＦＧＦ１２１３８アミノ酸／２０８アミノ酸：５'ＮｃｏＩＧＧＡＣＣＣＣＣＡＴＧＧＧＧＡＡＡＣＴＣＴＡＴＧＧＣＴＣＡＡ
ＡＡＧ（配列番号：９）ＦＧＦ１２３'ＨｉｎｄIII：（上記すべての欠失クローンに使用）ＣＴＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＴＡＴＧＡＧＴＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＴＧＧＡＡ
Ｇ（配列番号：１０）ＦＧＦ１２３６アミノ酸／１５３アミノ酸：５'ＢｓｐｈＩ（上記）３'ＨｉｎｄIII ＣＴＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＴＡＣＴＴＣＡＧＣＴＴＡＣＡＧＴＣＡＴＴＧＴ（配列番号：１１）ＦＧＦ１２６３アミノ酸／１５３アミノ酸：５'ＮｃｏＩおよび３'ＨｉｎｄIII上記。

【０１１６】Ｎ末端欠失変異体ＫＧＦ−２Δ３３の構築ｐＱＥ６中でのＫＧＦ−２Δ３３の構築複製連鎖反応指向増幅および大腸菌発現ベクターｐＱＥ６中へのＫＧＦ−２Δ
３３のサブクローニングを行うため、ＫＧＦ２の所望の領域に相補的な２つのオ
リゴヌクレオチドプライマー（５９５２および１９１３８）を以下の塩基配列に
て合成した。プライマー５９５２：５'ＧＣＧＧＣＡＣＡＴＧＴＣＴＴＡＣＡＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＴＧ３'（配列番号：１２）プライマー１９１３８：５'ＧＧＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＧＴＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴ３'（配列番号：１３）

【０１１７】Ｎ末端プライマー（５９５２）の場合はＡｆｌIII制限部位を導入し、一方、Ｃ末端プライマー（１９１３８）の場合はＨｉｎｄIII制限部位を導入した。プライマー５９５２はまたＡＴＧ配列をＫＧＦ２コード領域に隣接しかつインフレ
ームにて含むことによってクローニング断片の大腸菌での翻訳を可能とし、一方
、プライマー１９１３８は２つの停止コドン（大腸菌で優先的に用いられるもの
）をＫＧＦ２コード領域に隣接しかつインフレームにて含むことによって大腸菌
での正しい翻訳停止を確実にする。複製連鎖反応は、当業者によく知られた標準的条件および鋳型として成熟ＫＧ
Ｆ−２（アミノ酸３６〜２０８）のヌクレオチド配列を用いて行った。得られた
アンプリコン（amplicon）をＡｆｌIIIおよびＨｉｎｄIIIで消化し、ＮｃｏＩ／
ＨｉｎｄIII消化したｐＱＥ６タンパク質発現ベクター中にサブクローニングした。

【０１１８】ｐＨＥ１中でのＫＧＦ−２Δ３３の構築複製連鎖反応指向増幅および大腸菌発現ベクターｐＨＥ１中へのＫＧＦ−２Δ
３３のサブクローニングを行うため、ＫＧＦ２の所望の領域に相補的な２つのオ
リゴヌクレオチドプライマー（６１５３および６１５０）を以下の塩基配列にて
合成した。プライマー６１５３：５'ＣＣＧＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＴＡＣＡＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧ３'（配列番号：１４）プライマー６１５０：５'ＣＣＧＧＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＴＴＡＴＧＡＧＴＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＴＧＧ３'（配列番号：１５）

【０１１９】Ｎ末端プライマー（６１５３）の場合はＮｄｅＩ制限部位を導入し、一方、Ｃ
末端プライマー（６１５０）の場合はＡｓｐ７１８制限部位を導入した。プライ
マー６１５３はまたＡＴＧ配列をＫＧＦ２コード領域に隣接しかつインフレーム
にて含むことによってクローニング断片の大腸菌での翻訳を可能とし、一方、プ
ライマー６１５０は２つの停止コドン（大腸菌で優先的に用いられるもの）をＫ
ＧＦ２コード領域に隣接しかつインフレームにて含むことによって大腸菌での正
しい翻訳停止を確実にする。複製連鎖反応は、当業者によく知られた標準的条件および鋳型として成熟ＫＧ
Ｆ−２（アミノ酸３６〜２０８）のヌクレオチド配列を用いて行った。得られた
アンプリコンをＮｅｄＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、ＮｄｅＩ／Ａｓｐ７１８
消化したｐＨＥ１タンパク質発現ベクター中にサブクローニングした。

【０１２０】ＫＧＦ−２Δ３３のヌクレオチド配列ＡＴＧＴＣＴＴＡＣＡＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＴＧＡＣＧＴＴＣＧＴＴＧＧ
ＣＧＴＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＣＴＴＴＣＡＣＣＡＡＡＴＡＣＴＴＣＣＴＧＡＡＡ
ＡＴＣＧＡＡＡＡＡＡＡＣＧＧＴＡＡＡＧＴＴＴＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＣＴＧ
ＣＣＣＧＴＡＣＡＧＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＡＴＡＡＣＡＴＣＡＧＴＡＧＡＡＡＴ
ＣＧＧＡＧＴＴＧＴＴＧＣＣＧＴＣＡＡＡＧＣＣＡＴＴＡＡＣＡＧＣＡＡＣＴＡＴＴＡＣＴＴＡＧ
ＣＣＡＴＧＡＡＣＡＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡＡＣＴＣＴＡＴＧＧＣＴＣＡＡＡＡ
ＧＡＡＴＴＴＡＡＣＡＡＴＧＡＣＴＧＴＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＴＡＧＡＧＧＡＡＡＡＴ
ＧＧＡＴＡＣＡＡＴＡＣＣＴＡＴＧＣＡＴＣＡＴＴＴＡＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＴ
ＡＡＴＧＧＧＡＧＧＣＡＡＡＴＧＴＡＴＧＴＧＧＣＡＴＴＧＡＡＴＧＧＡＡＡＡＧＧＡＧＣＴＣＣ
ＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＣＡＧＡＡＡＡＣＡＣＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＣＡＣＣＴＣＴＧＣＴ
ＣＡＣＴＴＴＣＴＴＣＣＡＡＴＧＧＴＧＧＴＡＣＡＣＴＣＡＴＡＡ（配列番号：
１６）

【０１２１】ＫＧＦ−２Δ３３のアミノ酸配列ＭＳＹＮＨＬＱＧＤＶＲＷＲＫＬＦＳＦＴＫＹＦＬＫＩＥＫＮＧＫＶＳＧＴＫＫ
ＥＮＣＰＹＳＩＬＥＩＴＳＶＥＩＧＶＶＡＶＫＡＩＮＳＮＹＹＬＡＭＮＫＫＧＫ
ＬＹＧＳＫＥＦＮＮＤＣＫＬＫＥＲＩＥＥＮＧＹＮＴＹＡＳＦＮＷＱＨＮＧＲＱ
ＭＹＶＡＬＮＧＫＧＡＰＲＲＧＱＫＴＲＲＫＮＴＳＡＨＦＬＰＭＶＶＨＳ（配列
番号：１７）

【０１２２】Ｂ．最適化ＫＧＦ−２Δ３３ポリヌクレオチド配列の構築大腸菌中でのＫＧＦ−２Δ３３の発現レベルを増加させるため、全遺伝子のコ
ドンを大腸菌で最もしばしば用いられているものに適合させるべく最適化した。
ＫＧＦ２Δ３３を生成するのに利用した鋳型はＮ末端領域内でコドン最適化して
あったので、Ｃ末端アミノ酸（８４〜２０８）を最適化する必要があった。

【０１２３】まず、アミノ酸１７２〜２０８をコドン最適化してＫＧＦ２Δ３３（ｓ１７２
−２０８）を生成した。このことは、重複ＰＣＲ戦略により達成した。オリゴヌ
クレオチドＰＭ０７およびＰＭ０８（アミノ酸１７２〜２０８に対応）を混合し
、７０℃に加熱しついで３７℃に冷却することにより一緒にアニールした。つい
で、アニールしたオリゴヌクレオチドを標準ＰＣＲ反応（プライマーＰＭ０９お
よびＰＭ１０により指令される）に鋳型として用いた。当業者によく知られた標
準的な条件に従いかつ鋳型としてＫＧＦ２Δ３３を用いた別のＰＣＲ反応におい
て、オリゴヌクレオチドＰＭ０５（ＫＧＦ２のコード領域内のＰｓｔＩ部位と重
複している）およびＰＭ１１を用いてアミノ酸８４〜１７２に対応するＫＧＦ２
の領域を増幅させた。第三のＰＣＲ反応において、第一のＰＣＲ反応の生成物（
コドン最適化したアミノ酸１７２〜２０８に対応）と第二のＰＣＲ反応の生成物
（コドンを最適化していないアミノ酸８４〜１７２に対応）とを混合し、オリゴ
ヌクレオチドＰＭ０５およびＰＭ１０により指令された標準ＰＣＲ反応の鋳型と
して用いた。得られたアンプリコンをＰｓｔＩ／ＨｉｎｄIIIで消化し、ＰｓｔＩ／ＨｉｎｄIII消化したｐＱＥ６ＫＧＦ２Δ３３中にサブクローニングして対応のコドン最適化していない領域を置換し、ｐＱＥ６ＫＧＦ２Δ３３（ｓ１７２
−２０８）を生成した。

【０１２４】ＫＧＦ２のコドン最適化を完成させるため、アミノ酸８４〜１７２に対応する
ＫＧＦ２の領域についてコドン最適化した合成遺伝子を重複オリゴヌクレオチド
を利用して作成した。４つのオリゴヌクレオチド（ＰＭ３１、ＰＭ３２、ＰＭ３
３およびＰＭ３４）を混合し、以下のＰＣＲを７サイクル行った：９４℃、３０
秒；４６.５℃、３０秒；および７２℃、３０秒。

【０１２５】ついで、プライマーＰＭ３５およびＰＭ３６により指令された第二のＰＣＲ反
応を、１μｌの第一のＰＣＲ反応物を鋳型として用いて標準手順により行った。
ついで、得られたコドン最適化した遺伝子断片をＰｓｔＩ／ＳａｌＩで消化し、
ＰｓｔＩ／ＳａｌＩ消化したｐＱＥ６ＫＧＦ２Δ３３（ｓ１７２−２０８）中に
サブクローニングして完全に最適化されたＫＧＦ２コード遺伝子であるｐＱＥ６
ＫＧＦ２Δ３３ｓを生成した。

【０１２６】別の大腸菌タンパク質発現ベクターを生成するため、ｐＱＥ６ＫＧＦ２Δ３３
ｓ上でＰＭ１０２およびＰＭ１３０を用いてＫＧＦ２Δ３３ｓをＰＣＲ増幅させ
た。得られたアンプリコンをＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、ＮｄｅＩおよ
びＡｓｐ７１８（平滑末端化）で消化しておいたｐＨＥ１発現ベクター中にサブ
クローニングしてｐＨＥ１Δ３３ｓを生成した。

【０１２７】コドン最適化したＫＧＦ−２Δ３３ｓの構築に用いたオリゴヌクレオチド配列
は以下のとおりである：ＰＭ０５：ＣＡＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＴＧＡＣＧ（配列番号：１８）ＰＭ０７：ＡＡＣＧＧＴＣＧＡＣＡＡＡＴＧＴＡＴＧＴＧＧＣＡＣＴＧＡＡＣＧ
ＧＴＡＡＡＧＧＴＧＣＴＣＣＡＣＧＴＣＧＴＧＧＴＣＡＧＡＡＡＡＣＣＣＧＴＣ
ＧＴＡＡＡＡＡＣＡＣＣ（配列番号：１９）ＰＭ０８：ＧＧＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＧＡＧＴＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＴＧＧ
ＣＡＧＡＡＡＧＴＧＡＧＣＡＧＡＧＧＴＧＴＴＴＴＴＡＣＧＡＣＧＧＧＴＴＴＴ
ＣＴＧＡＣＣＡＣＧ（配列番号：２０）ＰＭ０９：ＧＣＣＡＣＡＴＡＣＡＴＴＴＧＴＣＧＡＣＣＧＴＴ（配列番号：２１
）ＰＭ１０：ＧＧＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＧＡＧＴＧ（配列番号：２２）ＰＭ１１：ＧＣＣＡＣＡＴＡＣＡＴＴＴＧＴＣＧＡＣＣＧＴＴ（配列番号：２３
）ＰＭ３１：ＣＴＧＣＡＧＧＧＴＧＡＣＧＴＴＣＧＴＴＧＧＣＧＴＡＡＡＣＴＧＴ
ＴＣＴＣＣＴＴＣＡＣＣＡＡＡＴＡＣＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＴＣＧＡＡＡＡＡＡ
ＡＣＧＧＴＡＡＡＧＴＴＴＣＴＧＧＴＡＣＣＡＡＧ（配列番号：２４）ＰＭ３２：ＡＧＣＴＴＴＡＡＣＡＧＣＡＡＣＡＡＣＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＡＣＧ
ＧＡＧＧＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＧＡＴＧＧＡＧＴＡＣＧＧＧＣＡＧＴＴＴＴＣＴ
ＴＴＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＡＡＡＣＴＴＴＡＣＣ（配列番号：２５）ＰＭ３３：ＧＧＴＧＴＴＧＴＴＧＣＴＧＴＴＡＡＡＧＣＴＡＴＣＡＡＣＴＣＣＡ
ＡＣＴＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＴＡＴＧＡＡＣＡＡＧＡＡＡＧＧＴＡＡＡＣＴＧＴ
ＡＣＧＧＴＴＣＣＡＡＡＧＡＡＴＴＴＡＡＣＡＡＣ（配列番号：２６）ＰＭ３４：ＧＴＣＧＡＣＣＧＴＴＧＴＧＣＴＧＣＣＡＧＴＴＧＡＡＧＧＡＡＧＣ
ＧＴＡＧＧＴＧＴＴＧＴＡＡＣＣＧＴＴＴＴＣＴＴＣＧＡＴＡＣＧＴＴＣＴＴＴ
ＣＡＧＴＴＴＡＣＡＧＴＣＧＴＴＧＴＴＡＡＡＴＴＣＴＴＴＧＧＡＡＣＣ（配列
番号：２７）ＰＭ３５：ＧＣＧＧＣＧＴＣＧＡＣＣＧＴＴＧＴＧＣＴＧＣＣＡＧ（配列番号：
２８）ＰＭ３６：ＧＣＧＧＣＣＴＧＣＡＧＧＧＴＧＡＣＧＴＴＣＧＴＴＧＧ（配列番号
：２９）ＰＭ１０２：ＣＣＧＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＴＡＣＡＡＣＣＡＣＣ
ＴＧＣＡＧＧ（配列番号：３０）ＰＭ１３０：ＣＧＣＧＣＧＡＴＡＴＣＴＴＡＴＴＡＡＧＡＧＴＧＴＡＣＣＡＣＣ
ＡＴＴＧ（配列番号：３１）

【０１２８】ＫＧＦ−２Δ３３（ｓ１７２−２０８）のヌクレオチド配列：ＡＴＧＴＣＴＴＡＣＡＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＴＧＡＣＧＴＴＣＧＴＴＧＧ
ＣＧＴＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＣＣＡＡＡＴＡＣＴＴＣＣＴＧＡＡＡ
ＡＴＣＧＡＡＡＡＡＡＡＣＧＧＴＡＡＡＧＴＴＴＣＴＧＧＴＡＣＣＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＴＧ
ＣＣＣＧＴＡＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＴＣＣＧＴＴＧＡＡＡ
ＴＣＧＧＴＧＴＴＧＴＴＧＣＴＧＴＴＡＡＡＧＣＴＡＴＣＡＡＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＴＡＣＣＴＧＧ
ＣＴＡＴＧＡＡＣＡＡＧＡＡＡＧＧＴＡＡＡＣＴＧＴＡＣＧＧＴＴＣＣＡＡＡＧ
ＡＡＴＴＴＡＡＣＡＡＣＧＡＣＴＧＴＡＡＡＣＴＧＡＡＡＧＡＡＣＧＴＡＴＣＧＡＡＧＡＡＡＡＣ
ＧＧＴＴＡＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＧＣＴＴＣＣＴＴＣＡＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＣ
ＡＡＣＧＧＴＣＧＡＣＡＡＡＴＧＴＡＴＧＴＧＧＣＡＣＴＧＡＡＣＧＧＴＡＡＡＧＧＴＧＣＴＣＣ
ＡＣＧＴＣＧＴＧＧＴＣＡＧＡＡＡＡＣＣＣＧＴＣＧＴＡＡＡＡＡＣＡＣＣＴＣ
ＴＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＧＴＧＧＴＡＣＡＣＴＣＴＴＡＡ（配
列番号：３２）

【０１２９】ＫＧＦ−２Δ３３（ｓ１７２−２０８）のアミノ酸配列：ＭＳＹＮＨＬＱＧＤＶＲＷＲＫＬＦＳＦＴＫＹＦＬＫＩＥＫＮＧＫＶＳＧＴＫＫ
ＥＮＣＰＹＳＩＬＥＩＴＳＶＥＩＧＶＶＡＶＫＡＩＮＳＮＹＹＬＡＭＮＫＫＧＫ
ＬＹＧＳＫＥＦＮＮＤＣＫＬＫＥＲＩＥＥＮＧＹＮＴＹＡＳＦＮＷＱＨＮＧＲＱ
ＭＹＶＡＬＮＧＫＧＡＰＲＲＧＱＫＴＲＲＫＮＴＳＡＨＦＬＰＭＶＶＨＳ（配列
番号：３３）

【０１３０】実施例実施例１ＫＧＦ−２液体調合物以下の成分を混合して液体ＫＧＦ−２Δ３３調合物（該調合物は液体であり、
−２０℃で貯蔵する）を生成した。２ｍｇ／ｍｌのＫＧＦ−２Δ３３ポリペプチド、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１２５ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、水、ｐＨ６.２。この調合物は、２〜８℃またはそれ以下での貯蔵条件で１０ヶ月までそのイン
ビトロでの生物学的活性を保持した。１０ヶ月目の生物学的活性を図３に示す。
この調合物は、またはそれ以下での貯蔵条件で１１ヶ月までそのすべての物理化
学的特性を保持した。

【０１３１】生物学的活性は以下の細胞増殖アッセイを用いて測定した。ＢａＦ３細胞を、
１０％ＮＢＣＳ、１０％ＷＥＨＩ細胞ならし培地、２ｍＭグルタミン、６００μ
ｇ／ｍｌのGENETICIN、１μｌのβメルカプトエタノール／５００ｍｌ増殖培地、５０単位のペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰ
ＭＩ１６４０培地中で常法通り増殖させ維持した（Ornitz, D., M.ら（1996）、
J. Biol. Chem. 271: 15292-15297）。細胞増殖アッセイのため、ＢａＦ３細胞を遠心分離により回収し、基本培地（このものは増殖培地と同じ組成を有してい
るが、ＷＥＨＩならし培地は含まず、１μｇ／ｍｌのヘパリンを補足してあった
）で洗浄した。この操作の後、細胞を基本培地中に再浮遊させ、２２,０００細胞／１８０μｌを９６ウエル細胞培養クラスターディッシュのウエル当たりにプ
レーティングした。別の９６ウエルプレートでＫＧＦ２の適当な希釈（必要な最
終濃度よりも１０×高い）をＰＢＳ中で行い、上記細胞に２００μｌの最終容量
にて加えた。細胞プレートを３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーター中で３６〜４０時間インキュベートし、５０μｌの基本培地中の０.５μＣｉメチル−³Ｈチミ
ジンを各ウエルに加えた。プレートをインキュベーター中でさらに５時間インキ
ュベートし、細胞をTomtec Harvester 96を用いてガラス繊維フィルター上で濾過することにより回収した。導入されたチミジンをWallace βプレートシンチレ
ーションカウンターでカウントした。

【０１３２】実施例２ＫＧＦ−２凍結乾燥調合物以下の成分を混合してＫＧＦ−２Δ３３凍結乾燥調合物を生成した。１０ｍｇ／ｍｌのＫＧＦ−２Δ３３、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、７％ｗ／ｖショ糖、水（凍結乾燥により除かれる）ｐＨ６.２この調合物は、４５℃またはそれ以下での貯蔵条件で９ヶ月までそのインビト
ロでの生物学的活性を保持した。９ヶ月目の生物学的活性を図４に示す。生物学
的活性の測定は実施例１に詳記した細胞増殖アッセイを用いて行った。逆相ＨＰ
ＬＣは、この調合物が、４５℃またはそれ以下の温度および７５％の相対湿度で
８ヶ月までその物理化学的特性を保持したことを示した。

【０１３３】実施例３増粘調合物中のＫＧＦ−２以下の成分を混合してＫＧＦ−２Δ３３増粘調合物を生成した。２ｍｇ／ｍｌのＫＧＦ−２Δ３３、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、７％ｗ／ｖショ糖、１.２５％カルボキシメチルセルロース、水ｐＨ６.２。この調合物は、ＫＧＦ−２Δ３３ポリペプチドをカルボキシメチルセルロース
溶液に加えて調製する。得られた調合物の粘度は、回転紡錘粘度計により測定し
たところ約２５０ｃｐｓであった。ＫＧＦ−２ポリペプチドはカルボキシメチル
セルロースの存在下で生物学的活性を保持した。この調合物の生物学的活性を実
施例１に詳記した細胞増殖アッセイを用いてアッセイした。

【０１３４】実施例４ゲル調合物中のＫＧＦ−２以下の成分を混合してＫＧＦ−２Δ３３ゲル調合物を生成した。２ｍｇ／ｍｌのＫＧＦ−２Δ３３、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、７％ｗ／ｖショ糖、１６％Pluronic F127、水ｐＨ６.２ＫＧＦ−２Δ３３をPluronic溶液に約２℃〜約８℃にて加える。得られた溶液
の粘度は２０℃で約５０ｃｐｓであり、約３７℃で固化した。ＫＧＦ−２は、実
施例１に詳記した細胞増殖アッセイによって測定されるようにPluronic F127の存在下で生物学的活性を保持した。

【０１３５】実施例５モノチオグリセロールによるＫＧＦの活性化ＫＧＦ−２Δ３３タンパク質ストック調合物（０.１〜２.０ｍｇ／ｍｌ）をモ
ノチオグリセロール（ＭＴＧ）とともにまたはＭＴＧなしで調製した。これらタンパク質調合物をｐＨ７.２の１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で希釈して細胞増殖アッセイに使用するのに必要な濃度を達成した。

【０１３６】細胞培養ＢａＦ３２ｂ細胞を、１０％ＮＢＣＳ、１０％ＷＥＨＩ細胞ならし培地、２ｍ
Ｍグルタミン、６００μｇ／ｍｌのGENETICIN、１μｌのβメルカプトエタノール／５００ｍｌ増殖培地、５０単位のペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレ
プトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で常法通り増殖させ維持した（Orni
tz, D., M.ら（1996）、J. Biol. Chem. 271: 15292-15297）。

【０１３７】細胞増殖アッセイ細胞増殖アッセイのため、ＢａＦ３２ｂ細胞を遠心分離により回収し、基本培
地（このものは増殖培地と同じ組成を有しているが、ＷＥＨＩならし培地は含ま
ず、１μｇ／ｍｌのヘパリンを補足してあった）で洗浄した。この操作の後、細
胞を基本培地中に再浮遊させ、２２,０００細胞／１８０μｌを９６ウエル細胞培養クラスターディッシュのウエル当たりにプレーティングした。別の９６ウエ
ルプレートでＫＧＦ２の適当な希釈（必要な最終濃度よりも１０×高い）をＰＢ
Ｓ中で行い、上記細胞に２００μｌの最終容量にて加えた。細胞プレートを３７
℃、５％ＣＯ₂インキュベーター中で３６〜４０時間インキュベートし、５０μ ｌの基本培地中の０.５μＣｉメチル−³Ｈチミジンを各ウエルに加えた。プレー
トをインキュベーター中でさらに５時間インキュベートし、細胞をTomtec Harve
ster 96を用いてガラス繊維フィルター上で濾過することにより回収した。導入されたチミジンをWallace βプレートシンチレーションカウンターでカウントし
た。

【０１３８】結果Ａ．ＫＧＦ−２活性に及ぼすＭＴＧ濃度の効果異なる濃度のモノチオグリセロール（ＭＴＧ）に暴露したＫＧＦ−２を用いて
細胞増殖アッセイを行った。対照の試料は賦形剤を含んでいなかった。図５に示
すように種々の濃度のＭＴＧでＫＧＦ−２活性の刺激が観察された。活性の増大
は使用したＭＴＧの濃度に依存して対照の１０〜１５０％であった。このような
細胞増殖活性の促進は、この増殖因子ファミリーの他の成員では観察されなかっ
た。これら観察から、ＭＴＧによるＫＧＦ−２活性の刺激は極めて特異的である
と結論付けられた。結論モノチオグリセロールはＫＧＦ−２のインビトロでの細胞増殖活性を特異的に
刺激するものと思われる。

【０１３９】実施例６クエン酸を用いたＫＧＦ−２ゲル調合物以下の成分を混合してＫＧＦ−２調合物（該調合物は室温で液体であり、皮膚
に適用するとその後ゲル化する）を生成した。２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１２５ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム、１７％Pluronic 127、ｐＨ６.０、水。

【０１４０】実施例７酢酸を用いたＫＧＦ−２ゲル調合物以下の成分を混合してＫＧＦ−２調合物（該調合物は皮膚に適用するとゲル化
する）を生成した。２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１２５ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、１７％Pluronic 127、ｐＨ６.０、水。

【０１４１】実施例８液体ＫＧＦ−２調合物ＫＧＦ−２Δ３３を維持する緩衝液としてのクエン酸ナトリウムの安定性を４
つの別々の調合物で３つのｐＨ：ｐＨ５.０、ｐＨ５.５およびｐＨ６.０にて評定した。調合物：Ａ．ＫＧＦ−２Δ３３１または２ｍｇ／ｍｌ２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１２５ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム、水。Ｂ．さらに１％グリセロールを含む他は「Ａ」と同じＣ．さらに０.０５％メチオニンを含む他は「Ａ」と同じＤ．さらに１％モノチオグリセロールを含む他は「Ａ」と同じＫＧＦ−２Δ３３の濃度は、上記すべての調合物において１および２ｍｇ／ｍ
ｌであった。

【０１４２】２．凍結乾燥調合物ＫＧＦ−２Δ３３を３つのバルク剤：マンニトール、ショ糖およびトレハロー
スの一つの存在下で凍結乾燥した。調合物：Ａ．１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ二ナトリウムおよび４％マンニトール、ｐＨ６.０Ｂ．１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ二ナトリウムおよび７％ショ糖、ｐＨ６.０Ｃ．１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ二ナトリウムおよび８％トレハロース、ｐＨ６.０ＫＧＦ−２ポリペプチドの濃度は３ｍｇ／ｍｌおよび８ｍｇ／ｍｌであった。
評定パラメーターは、水での再構成前および後のＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ、外観であった。

【０１４３】３．１０ｍｇ／ｍｌＫＧＦ−２凍結乾燥調合物が１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質の凍結乾燥を可能とするか否かを、再構
成後のタンパク質の安定性とともに評定した。調合物：１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ二ナトリウムおよび４％マンニトール、ｐＨ６.０凍結乾燥した生成物を水または１％モノチオグリセロールを含有する水で再構
成した。

【０１４４】本発明は上記および実施例に特別に記載した以外の仕方でも実施しうることは
明らかであろう。本発明の多くの修飾および変更が上記教示に照らして可能であり、それゆえ、
添付の特許請求の範囲に含まれる。本明細書中に引用したすべての刊行物（特許、特許出願、週間記事、研究所の
マニュアル、書籍または他の書類を含む）の全開示が参照のために引用される。

【０１４５】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＫＧＦ−２のｃＤＮＡおよびそれから導かれる対応アミノ酸配列
を示す。最初の３５または３６アミノ酸残基は、推定のリーダー配列を表す（下
線）。標準的な一文字略語をアミノ酸について用いている。シークエンシングの
不正確さは、ポリヌクレオチドの配列を決定しようとする際の一般的な問題であ
る。シークエンシングは、３７３自動ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosyste
ms, Inc.）を用いて行った。シークエンサーの正確さは、９７％以上正確である
と予測される（配列番号：１および２）。

【図２】本発明のＫＧＦ−２ポリペプチドによる正常な一次皮膚角質細胞
増殖の刺激を示す。（Ａ）はＫＧＦ−２による正常な一次皮膚角質細胞増殖の刺
激を示す。（Ｂ）は、ＫＧＦ−２Δ３３による正常な一次皮膚角質細胞増殖の刺
激を示す。（Ｃ）は、ＫＧＦ−２Δ２８による正常な一次皮膚角質細胞増殖の刺
激を示す。

【図３】ＫＧＦ−２Δ３３液体調合物についての１０ヶ月安定性の生物学
的活性の結果を示す。

【図４】ＫＧＦ−２Δ３３凍結乾燥製剤についての９ヶ月安定性の生物学
的活性の結果を示す。

【図５】ＫＧＦ−２の生物学的活性に対するモノチオグリセロールの効果
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 47/12 Ａ６１Ｋ 47/18 47/18 47/20 47/20 47/26 47/26 47/32 47/32 47/36 47/36 47/38 47/38 Ａ６１Ｐ 17/02 Ａ６１Ｐ 17/02 Ｃ０７Ｋ 14/435 Ｃ０７Ｋ 14/435 Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者アービンド・チョプラアメリカ合衆国20878メリーランド州ゲイザーズバーグ、ラムズデル・コート18番 (72)発明者パルベーン・コウシャルアメリカ合衆国20906メリーランド州シルバー・スプリング、チャペル・ヒル・ロード1704番 (72)発明者トーマス・スピッツネイゲルアメリカ合衆国22180バージニア州ビエナ、ストーンウォール・ドライブ8414番 (72)発明者エドワード・アンズワースアメリカ合衆国20895メリーランド州ケンジントン、グレンリッジ・ストリート4414 番 (72)発明者フェイザル・カーンアメリカ合衆国20878メリーランド州ゲイザーズバーグ、マホガニー・サークル・ナンバー406、15704番Ｆターム(参考） 4C076 AA12 AA29 BB11 CC30 DD23 DD38 DD41Z DD42Z DD43Z DD49Q DD56Q DD67 EE04P EE06P EE09P EE13P EE16P EE30P EE32G EE41P FF11 FF14 FF15 FF17 4C084 AA02 AA03 BA01 BA08 BA22 BA23 DB54 MA01 MA05 NA03 NA10 ZA892 ZB222 4H045 AA30 DA01 EA28

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）約０.０２〜約４０ｍｇ／ｍｌ(ｗ／ｖ)の濃度範囲のＫＧＦ−２ポリペプチド；（ｂ）約ｐＨ５.０〜約ｐＨ８.０で緩衝能を有し、約５ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度
範囲の緩衝液；および（ｃ）組成物を所定の容量とする、薬理学的に許容しうる希釈剤またはその反応生成物を含む医薬組成物。
【請求項２】さらに、（ｄ）約０.１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度範囲のキレート化剤；および（ｅ）約０.０１ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度範囲のＮａＣｌを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】さらに、（ａ）約０.５％〜約２％ｗ／ｖのグリセロール、（ｂ）約０.１％〜約１％ｗ／ｖのメチオニン、または（ｃ）約０.１％〜約２％ｗ／ｖのモノチオグリセロールの一つを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】該ＫＧＦ−ポリペプチドが約０.０５〜約３０ｍｇ／ｍｌ(ｗ
／ｖ)の濃度範囲で含まれる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】該ＫＧＦ−ポリペプチドが約０.１〜約２０ｍｇ／ｍｌ(ｗ／
ｖ)の濃度範囲で含まれる、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】該ＫＧＦ−ポリペプチドが約０.２〜４ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で含まれる、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】該ＫＧＦ−２ポリペプチドがＫＧＦ−２Δ３３である、請求
項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】該希釈剤が水である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】該キレート化剤が約１ｍＭの濃度のＥＤＴＡであり、該Ｎａ
Ｃｌが約１２５ｍＭの濃度で含まれる、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項１０】該ｐＨが約ｐＨ５.５〜約ｐＨ６.５である、請求項１に記
載の医薬組成物。
【請求項１１】該ｐＨが約ｐＨ６.２である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】該緩衝液が、リン酸、酢酸、アコニット酸、クエン酸、グ
ルタル酸、リンゴ酸、コハク酸および炭酸、およびそのアルカリまたはアルカリ
土類塩よりなる群から選ばれたものである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】該緩衝液が、リン酸、酢酸またはクエン酸塩である、請求
項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】該緩衝液がクエン酸塩である、請求項１３に記載の医薬組
成物。
【請求項１５】該緩衝液が、約５ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度範囲で含まれる
、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１６】該緩衝液が、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度範囲で含まれ
るクエン酸塩である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】さらに安定化量の（ａ）抗酸化剤または（ｂ）チオール化
合物の１またはそれ以上を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１８】 −２０℃またはそれ以下の温度で保持される、請求項１に
記載の医薬組成物。
【請求項１９】（ａ）２ｍｇ／ｍｌのＫＧＦ−２Δ３３ポリペプチド（ｗ
／ｖ）；（ｂ）２０ｍＭの酢酸ナトリウム；（ｃ）１２５ｍＭのＮａＣｌ；（ｄ）１ｍＭのＥＤＴＡ；および（ｅ）希釈剤としての水またはその反応生成物を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２０】該ＫＧＦ−２Δ３３ポリペプチドが、Ｎ末端メチオニンを
有するＫＧＦ−２Δ３３ポリペプチド、Ｎ末端メチオニンを欠いたＫＧＦ−２Δ
３３ポリペプチド、およびその混合物よりなる群から選ばれたものである、請求
項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】（ａ）約０.０２〜約４０ｍｇ／ｍｌ(ｗ／ｖ)の濃度範囲のＫＧＦ−２ポリペプチド；（ｂ）約ｐＨ５.０〜約ｐＨ８.０で緩衝能を有し、約５ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度
範囲の緩衝液；（ｃ）バルク剤；および（ｄ）組成物を所定の容量とする、薬理学的に許容しうる希釈剤またはその反応生成物を含む医薬組成物。
【請求項２２】該バルク剤が、ショ糖、グリシン、マンニトール、トレハ
ロース、およびその混合物よりなる群から選ばれたものである、請求項２１に記
載の医薬組成物。
【請求項２３】さらに、（ｅ）約０.１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度範囲のキレート化剤；および（ｆ）約０.０１ｍＭ〜約１２５ｍＭの濃度範囲のＮａＣｌを含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２４】該バルク剤が、ショ糖、またはショ糖とグリシンとの混合
物である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２５】該バルク剤が約２％〜約１０％ｗ／ｖの濃度で含まれる、
請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２６】該バルク剤が、５％のマンニトール、７％のショ糖、８％
のトレハロース、または２％のグリシン＋０.５％のショ糖である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２７】該ｐＨが約ｐＨ６.２である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２８】該希釈剤が水である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２９】該緩衝液が、リン酸、酢酸、アコニット酸、クエン酸、グ
ルタル酸、リンゴ酸、コハク酸および炭酸、およびそのアルカリまたはアルカリ
土類塩よりなる群から選ばれたものである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項３０】該緩衝液が、リン酸またはクエン酸塩である、請求項２９
に記載の医薬組成物。
【請求項３１】該緩衝液がクエン酸塩である、請求項３０に記載の医薬組
成物。
【請求項３２】水の９０％以上が凍結乾燥により除かれる、請求項２８に
記載の医薬組成物。
【請求項３３】約２９０ｍＯｓｍの等張状態を維持するのに有効な所定量
の滅菌水で再構成する、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】該ＫＧＦポリペプチドがＫＧＦ−２Δ３３である、請求項
２１に記載の医薬組成物。
【請求項３５】該ＫＧＦ−２Δ３３ポリペプチドが、Ｎ末端メチオニンを
有するＫＧＦ−２Δ３３ポリペプチド、Ｎ末端メチオニンを欠いたＫＧＦ−２Δ
３３ポリペプチド、およびその混合物よりなる群から選ばれたものである、請求
項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】該緩衝液を約５ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度で加える、請求項
２１に記載の医薬組成物。
【請求項３７】該緩衝液が、約１０ｍＭの濃度のクエン酸塩である、請求
項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】さらに安定化量の（ｇ）抗酸化剤または（ｈ）チオール化
合物の１またはそれ以上を含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項３９】（ａ）約０.０１％〜約２％ｗ／ｖのモノチオグリセロール、（ｂ）約０.０１％〜約２％ｗ／ｖのアスコルビン酸、（ｃ）約０.０１％〜
約２％ｗ／ｖのメチオニンまたは（ｄ）それらの混合物を含む安定化量の抗酸化
剤を含む滅菌水中で再構成する、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項４０】（ａ）約０.０２〜約４０ｍｇ／ｍｌ(ｗ／ｖ)の濃度範囲のＫＧＦ−２ポリペプチド；（ｂ）約５ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度範囲のクエン酸または薬理学的に許容しうる
その塩；（ｃ）約０.０１ｍＭ〜約１２５ｍＭの濃度範囲のＮａＣｌ、（ｄ）約０.１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度範囲のＥＤＴＡ、（ｅ）約２％ｗ／ｖ〜約１５％ｗ／ｖの濃度範囲のショ糖、マンニトール、グリ
シンまたはトレハロースの１またはそれ以上；および（ｆ）水を含む医薬組成物。
【請求項４１】該ＫＧＦ−２ポリペプチドが、約２ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ
／ｍｌ、または約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で含まれる、請求項４０に記載の医薬組
成物。
【請求項４２】水の９０％以上が凍結乾燥により除かれる、請求項４０に
記載の医薬組成物。
【請求項４３】さらに増粘剤を、粘度を約５０〜約１０,０００ｃｐｓに上昇させるのに有効な量で含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４４】該増粘剤が粘度を約５０〜約１,０００ｃｐｓに上昇させるのに有効な量で含まれる、請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項４５】該増粘剤が粘度を約２００〜約３００ｃｐｓに上昇させる
のに有効な量で含まれる、請求項４４に記載の医薬組成物。
【請求項４６】さらに増粘剤を、粘度を約５０〜約１０,０００ｃｐｓに上昇させるのに有効な量で含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項４７】該増粘剤が０〜５％（ｗ／ｗ）の濃度で含まれる、請求項
４３に記載の医薬組成物。
【請求項４８】該増粘剤が、水溶性のエーテル化セルロースまたはアリル
スクロースかまたはペンタエリトリトールのアリルエーテルで架橋されたアクリ
ル酸の高分子量ポリマーである、請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項４９】該エーテル化セルロースが、アルキルセルロース、ヒドロ
キシアルキルセルロース、カルボアルキルセルロースまたはアルキルヒドロキシ
アルキルセルロースである、請求項４８に記載の医薬組成物。
【請求項５０】該エーテル化セルロースが、メチルセルロース、ヒドロキ
シエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチ
ルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースである、請求項４３に記載の
医薬組成物。
【請求項５１】該エーテル化セルロース誘導体が、分子量が約５０,０００〜約７００,０００で、約０〜約２０重量％の濃度で含まれる、請求項４９に記載の医薬組成物。
【請求項５２】該エーテル化セルロース誘導体が、分子量が約８０,０００〜約２４０,０００で、約２重量％〜約８重量％の濃度で含まれる、請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５３】該緩衝液が約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度のクエン酸であ
る、請求項４６に記載の医薬組成物。
【請求項５４】該緩衝液が約１０ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度のクエン酸であ
る、請求項５３に記載の医薬組成物。
【請求項５５】該バルク剤が、約０.０１％〜約５％ショ糖の濃度のショ糖である、請求項５３に記載の医薬組成物。
【請求項５６】該バルク剤を液体調合物に直接加え、その後に凍結乾燥す
る、請求項５５に記載の医薬組成物。
【請求項５７】バルク剤を溶解した適当な希釈剤を加えることにより該調
合物を再構成することによって、凍結乾燥した調合物にバルク剤を加える、請求
項５５に記載の医薬組成物。
【請求項５８】（ａ）局所的有効量のＫＧＦ−２ポリペプチド；（ｂ）約１０ｍＭ〜約５００ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液；（ｃ）約０.０１〜約１５０ｍＭのＮａＣｌ；（ｄ）１ｍＭのＥＤＴＡ；（ｅ）約０.１％〜約７％のショ糖；（ｆ）約０.７５〜約１５％（ｗ／ｗ）のカルボキシメチルセルロースまたは約０.５〜約１.５％のヒドロキシプロピルメチルセルロースまたは約０.２５〜約０.７５％のヒドロキシエチルセルロースまたは約０〜１％のカルボマーまたはこれらの組み合わせを混合することにより生成した、増粘ＫＧＦ−２ポリペプチド溶液組成物。
【請求項５９】さらにゲル化剤を、室温での粘度を約０.１〜約１０,００
０ｃｐｓに上昇させるのに有効な量で含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６０】さらにゲル化剤を、室温での粘度を約０.１〜約１０,００
０ｃｐｓに上昇させるのに有効な量で含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項６１】該ゲル化剤が、粘性の水溶液を生成しうる水溶性ポリマー
、または粘性の溶液を生成することができる非水溶性で水膨潤性のポリマーであ
る、請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項６２】該ゲル化剤が、ビニルポリマー、ポリオキシエチレン−ポ
リオキシプロピレンコポリマー、多糖、タンパク質、ポリ（エチレンオキシド）
、アクリルアミドポリマーまたはその塩よりなる群から選ばれた高分子量ポリマ
ーである、請求項６１に記載の医薬組成物。
【請求項６３】該ゲル化剤が、（１）ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸
、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、およびその塩およびエステル
よりなる群から選ばれたビニルポリマー、または（２）セルロース誘導体、グリ
コサミノグリカン、寒天、ペクチン、アルギン酸、デキストラン、α−アミロー
ス、アミロペクチン、キトサン、およびその塩およびエステルよりなる群から選
ばれた多糖である、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６４】該ゲル化剤が、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロ
イチン−４−硫酸、ヘパリン硫酸、ヘパリンおよびその塩およびエステルよりな
る群から選ばれたグリコサミノグリカンである、請求項６２に記載の医薬組成物
。
【請求項６５】該グリコサミノグリカンが、コラーゲン、ゼラチン、また
はフィブロネクチンとともに含まれる、請求項６４に記載の医薬組成物。
【請求項６６】該ゲル化剤が、ポリアクリルアミドまたはポリメタクリル
アミドから選ばれるアクリルアミドポリマーである、請求項６２に記載の医薬組
成物。
【請求項６７】該ゲル化剤がポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン
ブロックコポリマーである、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６８】平均分子量が約５００〜５０,０００のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを約１０〜約６０重量％含む、請
求項６７に記載の医薬組成物。
【請求項６９】１,０００〜１５,０００の範囲の分子量のポリオキシエチ
レン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを約１４〜約１８重量％含む、
請求項６８に記載の医薬組成物。
【請求項７０】該ゲル化剤が、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレ
ンブロックコポリマー、Pluronic F108、Pluronic F127、またはPoloxamer 407 である、請求項６９に記載の医薬組成物。
【請求項７１】該ＫＧＦ−２ポリペプチドが約０.０１〜約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で含まれる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７２】（ａ）約０.０１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの最終計算濃度のＫＧＦ−２ポリペプチド；（ｂ）有効量の緩衝剤；（ｃ）約１０重量％〜約６０重量％の平均分子量が約５００〜５０,０００のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー；および（ｄ）薬理学的に許容しうる希釈剤、好ましくは水を混合することにより製造する、請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項７３】該ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコ
ポリマーが約１４重量％〜約１８重量％の濃度で含まれる、請求項７２に記載の
医薬組成物。
【請求項７４】（ａ）薬理学的活性量のＫＧＦ−２ポリペプチド；（ｂ）約１０ｍＭ〜約５０ｍＭのクエン酸ナトリウム；（ｃ）約０.０１ｍＭ〜約１５０ｍＭのＮａＣｌ；（ｄ）約１ｍＭのＥＤＴＡ；（ｅ）約０.１％〜約７％のショ糖；（ｆ）約１４％〜約１８％のPluronic F127；および（ｇ）約ｐＨ６.２を含む、ＫＧＦ−２ゲル調合物。
【請求項７５】（ａ）約０.０１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖ）の濃度のＫＧＦ−２ポリペプチド；（ｂ）約５ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度範囲のクエン酸ナトリウム；（ｃ）約１０％〜約２５％（ｗ／ｖ）のPluronic 127またはPoloxamer 407；および（ｄ）所定量とする水を含むＫＧＦ−２ゲル調合物。
【請求項７６】さらに（ａ）約０.１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度範囲のＥＤＴＡ、（ｂ）約０.０１ｍＭ〜約１２５ｍＭの濃度範囲のＮａＣｌを含む、請求項７５に記載の医薬組成物。
【請求項７７】該ＫＧＦ−２ポリペプチドが、Ａｌａ（６３）−−Ｓｅｒ
（２０８）（ＫＧＦ−２Δ２８）およびＳｅｒ（６９）−−Ｓｅｒ（２０８）（
ＫＧＦ−２Δ３３）よりなる群から選ばれたＮ末端欠失体である、請求項１に記
載の医薬組成物。
【請求項７８】該ＫＧＦ−２ポリペプチドが、Ｎ末端メチオニンを有する
もの、Ｎ末端メチオニンを有しないもの、またはそれらの混合物である、請求項
７７に記載の医薬組成物。
【請求項７９】該ＫＧＦ−２ポリペプチドが、Ａｌａ（３９）−−Ｓｅｒ
（２０８）；Ｐｒｏ（４７）−−Ｓｅｒ（２０８）；Ｖａｌ（７７）−−Ｓｅｒ
（２０８）；Ｇｌｕ（９３）−−Ｓｅｒ（２０８）；Ｇｌｕ（１０４）−−Ｓｅ
ｒ（２０８）；Ｖａｌ（１２３）−−Ｓｅｒ（２０８）；Ｇｌｙ（１３８）−−
Ｓｅｒ（２０８）；Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）；およびＣｙｓ（３７）−−
Ｌｙｓ（１５３）よりなる群から選ばれたＮ末端またはＣ末端の欠失変異体であ
る、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８０】該ＫＧＦ−２ポリペプチドが、Ｎ末端メチオニンを有する
もの、Ｎ末端メチオニンを有しないもの、またはそれらの混合物である、請求項
７９に記載の医薬組成物。
【請求項８１】該ＫＧＦ−２Δ３３ポリペプチドが、Ｎ末端メチオニンを
有するＫＧＦ−２Δ３３ポリペプチド、Ｎ末端メチオニンを有しないＫＧＦ−２
Δ３３ポリペプチド、およびそれらの混合物よりなる群から選ばれたものである
、請求項７に記載の医薬組成物。