JP2002541849A - 血管内皮細胞増殖因子変異体とその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、少なくとも天然ＶＥＧＦ配列中に１つのアミノ酸変異、及びＫＤＲレセプター又はＦＬＴ−１レセプターのどちらかに対して選択的結合親和性を有するＶＥＧＦ変異体を提供する。また、ＶＥＧＦ変異体を作製する方法及びＶＥＧＦ変異体を使用する方法が提供されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)変異体、該変異体を調製する方法
、さらに該変異体を利用した方法、組成物及びアッセイに関する。特に本発明は
、天然ＶＥＧＦのものとは異なるＶＥＧＦレセプター、ＫＤＲ及びＦＬＴ−１に
対する結合親和性特性を有するＶＥＧＦ変異体に関する。 （発明の背景） 脈管系の２つの主要な細胞構成要素は内皮及び平滑筋細胞である。内皮細胞
は全血管の内部表面の内張りを形成し、血液と組織の間の非血栓形成性界面を構
成する。加えて、内皮細胞は新しい毛細血管や血管の発育のために重要な成分で
ある。よって、内皮細胞は、腫瘍増殖及び転移並びに種々の非新生物疾病又は疾
患に随伴した、脈管形成または新血管形成の間に増殖する。

【０００２】 天然に生じる種々のポリペプチドは内皮細胞の増殖を誘発することが報告され
ている。これらのポリペプチドには、塩基性および酸性の線維芽細胞増殖因子（
ＦＧＦ）、Burgess及びMaciag、Annual Rev．Biochem., 58:575（1989）、血小
板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、Ishikawa等, Nature、338:557（1
989）、並びに血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、Leung等, Science 246:1306（19
89）；Ferrara及びHenzel、Biochem．Biophys．Res．Commun．161:851（1989）
；Tischer等, Biochem．Biophys．Res．Commun．, 165:1198（1989）；Ferrara
等, ＰＣＴ公開特許第ＷＯ 90/13649号（1990年11月15日公開）がある。 ＶＥＧＦは最初、ウシ下垂体小胞または星状小胞細胞で条件づけた培地中で同
定された。生化学分析によって、ウシＶＥＧＦは二量体タンパク質であって、見
かけの分子量は約45,000ダルトンであり、血管内皮細胞に対して明白な細胞分裂
誘発性特異性を有していることが示されている。ウシＶＥＧＦをコードするＤＮ
Ａは、ハイブリッド形成プローブとしてタンパク質のアミノ末端アミノ酸配列に
基づくオリゴヌクレオチドを使用して、該細胞から調製したｃＤＮＡライブラリ
ーをスクリーニングして単離された。

【０００３】 ヒトＶＥＧＦは、ウシＶＥＧＦ ｃＤＮＡをハイブリッド形成プローブとして
使用して、ヒト細胞から調製したｃＤＮＡライブラリーを先ずスクリーニングす
ることにより得られた。こうして同定された１つのｃＤＮＡは、ウシＶＥＧＦと
９５％より高いの相同性を有する１６５アミノ酸のタンパク質をコードし；この
１６５アミノ酸タンパク質は一般にヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ）又はＶＥＧＦ_{１ ６５} と称されている。ヒトＶＥＧＦの細胞分裂促進活性は、哺乳動物宿主細胞中
でヒトＶＥＧＦ ｃＤＮＡを発現することによって確認された。ヒトＶＥＧＦ ｃ
ＤＮＡでトランスフェクションした細胞で条件づけた培地は毛細血管内皮細胞の
増殖を促進したが、コントロール細胞では促進しなかった。[Leung等, Science
246:1306（1989）]。 血管内皮細胞成増殖因子は、後の治療用途のために天然の原料から単離及び精
製することができるが、濾胞細胞の該タンパク質の比較的低胃濃度と、努力と経
験の両方の点からしてコストの高いＶＥＧＦ回収は、商業的に無益に提供されて
いた。従って、クローン化と組換えＤＮＡ技術を用いたＶＥＧＦの発現のための
更なる努力が試みられた。[例えばLaboratory Investigation, 72:615(1995)、
及びこの中で引用される文献を参照]。

【０００４】 ＶＥＧＦは、過剰な組織成長のない状態において血管内皮細胞での選択的活性
が重要である状態、例えば糖尿病性潰瘍及び皮下創傷のような損傷から生じる血
管損傷のある症状を治療するのに対して有用であることが報告されている。ＶＥ
ＧＦ、血管（動脈及び静脈）内皮細胞増殖因子は、傷ついた細胞を修復すること
ができ、脈管形成と称されるプロセス、さらに新しい管の形成を促進することが
できる、血管新生と称されるプロセス。[例えば、Ferrara等, Endocrinol. Rev.
, 18:4-25(1997)参照]。 ＶＥＧＦは、選択的ＲＮＡスプライシングから生じる多重ホモ二量体型(モノ
マー当たり１２１、１６５、１８９及び２０６のアミノ酸)として様々な組織に
おいて発現される。ＶＥＧＦ_１２１はヘパリンに結合しない可溶性分裂促進因子
である；ＶＥＧＦの長い型は連続的により高い親和性をもってヘパリンに結合す
る。ＶＥＧＦのヘパリン結合型は、プラスミンによりカルボキシ末端で切断でき
、ＶＥＧＦの拡散性型を放出する。プラスミン切断後に同定されたカルボキシ末
端ペプチドのアミノ酸配列はＡｒｇ_１１０−Ａｌａ_１１１である。アミノ末端「
コア」タンパク質である、ホモ二量体として単離されるＶＥＧＦ(１−１１０)は
、中和モノクローナル抗体(例えば４．６．１及び３．２Ｅ３．１．１と呼ばれ
る抗体)、及びＦＬＴ−１並びにＫＤＲレセプター可溶型と、無傷のＶＥＧＦ_１
６５ホモ二量体と比較して同様の親和性で結合する。

【０００５】 ＶＥＧＦは、ＫＤＲ（キナーゼドメイン領域）とＦＬＴ-１（ＦＭＳ様チロシ
ンキナーゼ）レセプターへの結合のそれぞれの原因である２つの部位を含む。こ
れらのレセプターは内皮(血管)細胞上にのみ存在すると考えられている。例えば
外傷等のために細胞に酸素が欠乏した細胞のＶＥＧＦ産生が増加し、従って、生
物学的反応を生じるシグナル伝達経路のトリガーのために各レセプターＶＥＧＦ
を結合させる。例えば、該レセプターに対するＶＥＧＦの結合は、血管透過性を
増大させ、細胞が分割され拡大されて新しい血管経路を形成する−つまり脈管形
成と血管新生。[例えば、Malavaud等, Cardiovascular Research, 36:276-281(1
997)参照]。ＫＤＲレセプターを通じたＶＥＧＦ誘発性シグナル伝達は、ＶＥＧ
Ｆの分裂促進効果、及びおそらくは広範囲のＶＥＧＦの血管新生活性の原因であ
ると報告されている。[Waltenberger等, J. Biol. Chem., 269:26988-26995(199
4)]。しかしながら、ＦＬＴ−１の生物学的役割はよくわかっていない。

【０００６】 レセプター結合に関与するＶＥＧＦタンパク質の部位又は領域は、同定され、
近接した位置にあることがわかっている。[Weismann等, Cell, 28:695-704(1997
); Muller等, Proc. Natl. Acad. Sci., 94:7192-7197(1997); Muller等, Struc
ture, 5:1325-1338(1997); Fuh等, J. Biol. Chem., 273:11197-11204(1998)参
照]。ＫＤＲレセプターは、主にＶＥＧＦの８２の部位にアルギニン（Ａｒｇ又
はＲ）、８４の位置にリジン（Ｌｙｓ又はＫ）、及び８６の位置にヒスチジン（
Ｈｉｓ又はＨ）を含むループの部分を通じてＶＥＧＦを結合することが分かって
いる。ＦＬＴ−１レセプターは、主に６３の位置にアスパラギン酸（Ａｓｐ又は
Ｄ）、６４の位置にグルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、及び６７の位置にグルタミ
ン酸（Ｇｌｕ又はＥ）を含むループの位置を通じてＶＥＧＦを結合することが分
かっている。[Keyt等, J. Biol. Chem., 271:5638-5646(1996)]。ＶＥＧＦの結
晶構造とＶＥＧＦのＫＤＲ結合部位の機能的マッピングに基づき、ＶＥＧＦは、
分子の末端に位置する２つの対称的な結合部位を用いてＫＤＲレセプターと結合
することが更に分かった。それぞれの部位は、ＶＥＧＦ二量体の両サブユニット
由来の残基からなる、結合のための２つの「ホットスポット」で構成されている
。[上掲のMuller等]。これらの２つの結合決定基は、トランスフォーミング成長
因子β２（ＴＧＦ−β）及び血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）で保存されている
短い３重のβシート構造上の優性なホットスポットにある。

【０００７】 その他のものではない、１つのレセプターと選択的に結合する特定のＶＥＧＦ
関連分子が同定されている。分子、ＰｌＧＦは、ＶＥＧＦのＰＤＧＦ様ドメイン
と５３％の同一性で共有している。ＰｌＧＦは、高い親和性を有するＦｌｔ−１
を結合するが、ＫＤＲと反応すことができないことが明らかである。文献に記載
されているように、ＰｌＧＦは内皮細胞の細胞分裂活性において重大な可変性が
ある。[Maglione等, Proc. Natl. Acad. Sci.,88:9267-9271 (1991); Park等, J
. Biol. Chem., 269:25646-25654(1994); Sawano等, Cell Growth & Different
iation, 7:213-221(1996); Landgren等, Oncogene, 16:359-367(1998)]。 近年、Ogawa等は、哺乳動物ＶＥＧＦと２５％アミノ酸同一性を有するポリペ
プチド（ＶＥＧＦ−Ｅと呼ばれる）をコードする遺伝子を記載した。ＶＥＧＦ−
Ｅは、ヒツジやヤギ，まれにはヒトに感染し、一般に血管新生を伴う病変を生じ
るパラポックスウィルス群に属する、Ｏｒｆウィルス（ＮＺ−７株）の遺伝子で
同定された。発明者は、細胞増殖アッセイを実施し、ＶＥＧＦ−Ｅが、ヒトＶＥ
ＧＦとほとんど同程度にヒト臍静脈内皮細胞並びにラット肝臓類洞内皮細胞の成
長を促進することが報告された。結合研究も報告された。従来の実験は、一定量
の^１２５Ｉ標識したヒトＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ−Ｅを持つＫＤＲレセプター又は
ＦＬＴ−１レセプターのどちらかを過剰発現する細胞をインキュベートし、次い
で増加した量の標識していないヒトＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ−Ｅを加えることで実
施されてきた。発明者は、ＶＥＧＦ−ＥはＦＬＴ−１に比較してＫＤＲレセプタ
ーと選択的に結合することを報告した。[Ogawa等, J. Biological Chem., 273:3
1273-31281(1998)]。

【０００８】 Meyer等, EMBO J., 18: 363-374 (1999)にはまた、ＶＥＧＦ−Ｅと呼ばれるＶ
ＥＧＦファミリーののメンバーが同定されている。Meyer等によって報告された
ＶＥＧＦ−Ｅ分子はＯｒｆウィルス株Ｄ１７０１の遺伝子で同定された。インビ
トロで、ＶＥＧＦ−Ｅは組織因子の放出を促進し、血管内皮細胞の増殖を促進す
ることが発見された。ウサギのインビボモデルにおいては、ＶＥＧＦ−Ｅはウサ
ギの角膜での血管新生を促進した。Meyer等により報告されたＶＥＧＦ−Ｅ分子
の結合特性の分析は、任意のアッセイにおいて該分子がＦＬＴ−１レセプターに
比べてＫＤＲレセプターと選択的に結合することを明らかにした。また、Wise等
, Proc. Natl. Acad. Sci., 96:3071-3076(1991)を参照。 Olofsson等, Proc. Natl. Acad. Sci., 95:11709-11714(1998)では、「ＶＥＧ
Ｆ−Ｂ」と呼ばれるタンパク質は選択的にＦＬＴ−１と結合することが報告され
ている。発明者は、ＶＥＧＦ−ＥのＡｓｐ６３、Ａｓｐ６４及びＧｌｕ６７残基
がアラニン残基に変異する突然変異実験を開示した。ＶＥＧＦ−Ｂの突然変異体
の結合特性分析では、該突然変異体タンパク質がＦＬＴ−１との減少した親和性
を示すことを明らかにした。

【０００９】 （発明の概要） 本出願人は、（天然ＶＥＧＦアミノ酸配列と比較して）少なくとも１のアミノ
酸突然変異、特にアミノ酸位置１７〜２５及び／又は位置６３〜６５で、又はそ
の間で少なくとも１のアミノ酸突然変異を含むＶＥＧＦ変異体を同定した。出願
人はまた、（天然ＶＥＧＦアミノ酸配列と比較して）４３、４６、７９、又は８
３の位置で少なくとも１のアミノ酸置換を含む、特に４３、４６、７９、及び８
３の位置の各々でアラニンへのアミノ酸置換を含むＶＥＧＦ変異体を同定した。
驚くべきことに、本出願人は、様々なＶＥＧＦ変異体が、（天然ＶＥＧＦに比べ
て）ＫＤＲ及びＦＬＴ−１レセプターに関して改変された結合親和性を示し、更
にＫＤＲレセプター又はＦＬＴ−１レセプターに対する選択的結合親和性を示す
ことを発見した。 本発明は、（天然ＶＥＧＦアミノ酸配列と比較して）少なくとのも１のアミノ
酸残基を含み、ＫＤＲレセプターに対して選択的な結合親和性を有するＶＥＧＦ
変異体を提供する。随意的には、少なくとも１のアミノ酸突然変異が天然ＶＥＧ
Ｆポリペプチドのアミノ酸置換を構成する。 一実施態様では、本発明は、ＶＥＧＦの１７と２５の位置で又はその間で、少
なくとも１のアミノ酸突然変異を含んでなるＶＥＧＦ変異体を提供する。随意的
には、そのようなＶＥＧＦ変異体は１７と２５の位置で又はその間でアミノ酸置
換を含んでいてもよい。特にアミノ酸置換は、Ｆ１７Ｉ、Ｍ１８Ｅ、Ｙ２１Ｌ、
Ｙ２１Ｆ、Ｑ２２Ｒ、Ｑ２２Ｋ、Ｑ２２Ｅ、Ｙ２５Ｓ、又はＹ２５Ｉを含む。好
ましい実施態様では、該ＶＥＧＦ変異体は、ＶＥＧＦの１８及び／又は２１の位
置で少なくとも１のアミノ酸置換を含いでいてもよく、位置１８でメチオニンア
ミノ酸残基がグルタミン酸と置換され、及び／又は位置２１でチロシンアミノ酸
残基はロイシンに置換されている。

【００１０】 他の実施態様では、本発明は、ＶＥＧＦ６３と６６の位置で又はその間で、少
なくとも１のアミノ酸突然変異を含んでなるＶＥＧＦ変異体を提供する。随意的
には、そのようなＶＥＧＦ変異体は６３と６６の位置で又はその間でアミノ酸置
換を含んでいてもよい。特にアミノ酸置換は、Ｄ６３Ｓ、Ｇ６５Ｍ、Ｇ６５Ａ、
Ｌ６６Ｒ、又はＬ６６Ｔを含む。好ましいＶＥＧＦ変異体は、ＶＥＧＦの６３、
６５及び／又は６６の位置で１又は複数のアミノ酸置換を有し、位置６３でアミ
ノ酸残基アスパラギン酸がセリンと置換され、位置６５でアミノ酸残基グリシン
がメチオニンと置換され、及び／又は位置６６のアミノ酸残基ロイシンはアルギ
ニンに置換されている。 更に好ましくは、ＶＥＧＦ変異体は、ＶＥＧＦの６３、６５及び／又は６６の
位置での複合（つまり１以上の）アミノ酸突然変異、及び／又はＶＥＧＦの１７
、１８、２１、２２、及び／又は２５の１又は複数の位置で１又は複数のアミノ
酸突然変異を含み得る。更により好ましくは、ＶＥＧＦ変異体は、位置１８がグ
ルタミン酸と置換され、及び／又は位置２１がロイシンと置換された、ＶＥＧＦ
の位置１８及び／又は２１での１又は複数のアミノ酸置換を含み、さらに位置６
３がセリンと置換され、位置６５がメチオニンと置換され、及び／又は位置６６
がアルギニンと置換された、ＶＥＧＦの位置６３、６５及び／又は６６での１又
は複数のアミノ酸置換を含む。最も好ましくは、ＶＥＧＦ変異体は、アミノ酸置
換の次の群：Ｍ１８Ｅ、Ｙ２１Ｌ、Ｑ２２Ｒ、Ｙ２５Ｓ；Ｄ６３Ｓ、Ｇ６５Ｍ、
Ｌ６６Ｒ；Ｍ１８Ｅ、Ｄ６３Ｓ、Ｇ６５Ｍ、Ｌ６６Ｒ；又はＹ２１Ｌ、Ｄ６３Ｓ
、Ｇ６５Ｍ、Ｌ６６Ｒの１つを含みうる。

【００１１】 好ましい実施態様では、ＶＥＧＦ変異体は、本出願に記載される１又は複数の
アミノ酸置換を含むＶＥＧＦ１６５アミノ酸配列を含んでなるポリペプチドであ
る。 ＶＥＧＦ配列の該位置で複合アミノ酸置換を含んでなる更に好ましいＶＥＧＦ
変異体は、表２に示される。 更なる実施態様では、本発明は、ＦＬＴ−１レセプターに対する選択的結合親
和性を有するＶＥＧＦ変異体を提供し、該ＶＥＧＦ変異体は４３、４６、７９又
は８３の１又は複数の位置で１又は複数のアミノ酸突然変異を含みうる。好まし
くは、該ＦＬＴ−１選択ＶＥＧＦ変異体は、ＶＥＧＦの位置４３、４６、７９及
び／又は８３で（例えば１よりも多い）アミノ酸突然変異を含んでなりうる。さ
らにより好ましくは、該ＦＬＴ−１選択ＶＥＧＦ変異体は、ＶＥＧＦの位置４３
、４６、７９及び／又は８３で１又は複数のアラニンへのアミノ酸置換を含んで
なりうる。最も好ましくは、該ＦＬＴ−１選択ＶＥＧＦ変異体は、アミノ酸置換
のセット：Ｉ４３Ａ、Ｉ４６Ａ、Ｑ７９Ａ及び／又はＩ８３Ａを含んでなりうる
。 他の態様では、本発明は、ここで記載されるＶＥＧＦ変異体をコードする単離
された核酸を提供する。また、本発明のＶＥＧＦ変異体を発現することのできる
発現ベクター、該ベクターを含む宿主細胞、及びＶＥＧＦ変異体を作成する条件
下で宿主細胞を培養することによるＶＥＧＦ変異体の作成方法も提供される。 更なる実施態様では、本発明はＶＥＧＦ変異体及び担体を含んでなる組成物を
提供する。随意的には、担体は、製薬的に許容可能な担体であり得る。 本発明は更に、脈管回路網の損傷、例えば血管の外科的切開、創傷、裂傷、穿
通、及び表面潰瘍のような脈管形成及び血管新生が所望される症状を治療する方
法を提供する。該方法において、ＶＥＧＦ変異体の有効量が、該症状を有する哺
乳動物に投与されうる。 また本発明は、インビトロのＶＥＧＦ変異体を用いた診断方法を提供する。一
実施態様では、該方法は、ＫＤＲ及び／又はＦＬＴ−１レセプターの存在又は非
存在を検知するために、ＶＥＧＦ変異体を用いた細胞又は組織のアッセイを含む
。 最後に、本発明はここで記載されるＶＥＧＦ変異体を含むキット及び製造品を
提供する。

【００１２】 Ａ．定義 ここで使用する「ＶＥＧＦ」及び「天然ＶＥＧＦ」という用語は、Leung等、S
cience 246:1306（1989）、及びHouck等、Mol．Endocrin．5:1806（1991）に記
載され（及び更にＦｉｇ．１に示され）ているような、１６５−アミノ酸血管内
皮細胞増殖因子、および関連のある１２１−、１８９−および２０６−アミノ酸
血管内皮細胞増殖因子と、天然に生じる対立遺伝子体及びそのプロセシングを受
けた形態を意味する。また「ＶＥＧＦ」及び「天然ＶＥＧＦ」という用語は、１
６５−アミノ酸血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸８〜１０９又は１〜１０９を含
んでなるポリペプチドの切断された形態に関して使用される。ＶＥＧＦの任意の
そのような形態に関しては、例えば「ＶＥＧＦ（８−１０９）」、「ＶＥＧＦ（
１−１０９）」又は「ＶＥＧＦ１６５又はＶＥＧＦ（１−１６５）」により本出
願の中で同定されうる。「切断された」天然ＶＥＧＦのアミノ酸位置は、天然Ｖ
ＥＧＦ配列での表示で番号付けされる。例えば、切断された天然ＶＥＧＦのアミ
ノ酸位置１７（メチオニン）はまた、天然ＶＥＧＦのアミノ酸位置１７（メチオ
ニン）である。切断された天然ＶＥＧＦは好ましくは、天然ＶＥＧＦに相当する
ＫＤＲ及びＦＬＴ−１の結合親和性を有する。

【００１３】 ここで使用される「ＶＥＧＦ変異体」という用語は、天然ＶＥＧＦ配列の１ま
たは複数のアミノ酸突然変異を含み、ＫＤＲレセプター又はＦＬＴ−１レセプタ
ーどちらかに対する選択的な結合親和性を有するＶＥＧＦポリペプチドを意味す
る。一実施態様では、ＫＤＲレセプターに対して選択的な結合親和性を有するＶ
ＥＧＦ変異体は、天然ＶＥＧＦ配列の１７〜２５及び／または６３〜６６の位置
のいずれかで１又は複数のアミノ酸突然変異を含む。随意的には、１又は複数の
アミノ酸突然変異はアミノ酸置換を含む。好ましいＫＤＲ選択ＶＥＧＦ変異体は
、１又は複数のアミノ酸突然変異を含み、天然ＶＥＧＦのＫＤＲレセプターに対
する結合親和性より大きいか又は等しい（≧）ＫＤＲレセプターに対する結合親
和性があり、更により好ましくはＶＥＧＦ変異体は、天然ＶＥＧＦに存在するＦ
ＬＴ−１に対する結合親和性よりもＦＬＴ−１レセプターに対して小さい親和性
（＜）がある。ＫＤＲレセプターに対する該ＶＥＧＦ変異体の結合親和性が、天
然ＶＥＧＦに比較してほぼ等しい（変わらない）か、又はよりも大きく（増加し
ている）、更にＦＬＴ−１レセプターに対するＶＥＧＦ変異体の結合親和性が、
天然ＶＥＧＦに比べてそれよりも小さいか又はほとんどない場合には、ここでの
意味で、ＶＥＧＦ変異体の結合親和性はＫＤＲレセプターに対して「選択的」で
あるとみなされる。本発明の好ましいＦＬＴ−１選択ＶＥＧＦ変異体は、（天然
ＶＥＧＦに比較して）ＦＬＴ−１レセプターに対して少なくとも１０倍小さい結
合親和性を有し、更により好ましくは（天然ＶＥＧＦに比較して）ＦＬＴ−１レ
セプターに対して少なくとも１００倍小さい結合親和性を有しうる。ＶＥＧＦ変
異体のそれぞれの結合親和性は、当該分野で既知のＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び／
又はＢＩＡコアアッセイによって決定してもよく、以下の実施例に更に記載され
る。また本発明の好ましいＫＤＲ選択ＶＥＧＦ変異体は、ＫＤＲレセプターのリ
ン酸化を誘発する能力の反映による（実施例に記載されるような）ＫＩＲＡアッ
セイで活性を有しうる。本発明の好ましいＫＤＲ選択ＶＥＧＦ変異体は、内皮細
胞増殖（それは実施例にあるＨＵＶＥＣ増殖アッセイのような既知の技術方法に
より決定される）をさらに又は代わりに誘発しうる。内皮細胞増殖の誘発は現在
、ＫＤＲレセプターによるシグナル伝達の結果生じると考えられている。

【００１４】 一実施様態では、ＦＬＴ−１に対する選択的な結合親和性を有するＶＥＧＦ変
異体は、天然ＶＥＧＦ配列の４３、４６、７９又は８３の位置のいずれか１つで
１又は複数のアミノ酸突然変異を含む。随意的には、１又は複数のアミノ酸突然
変異は、アミノ酸置換、好ましくはアラニンへのアミノ酸置換を含む。好ましい
ＦＬＴ−１選択ＶＥＧＦ変異体は、１又は複数の突然変異を含み、ＦＬＴ−１レ
セプターに対する天然ＶＥＧＦの結合親和性よりも大きいか又は等しい（≧）Ｆ
ＬＴ−１レセプターに対する結合親和性があり、更により好ましくはそのような
ＶＥＧＦ変異体は、天然ＶＥＧＦに存在するＫＤＲに対する結合親和性よりもＫ
ＤＲレセプターに対して小さい親和性（＜）がある。ＦＬＴ−１レセプターに対
する該ＶＥＧＦ変異体の結合親和性が、天然ＶＥＧＦに比較してほぼ等しい（変
わらない）か、又はよりも大きく（増加している）、更にＫＤＲレセプターに対
するＶＥＧＦ変異体の結合親和性が、天然ＶＥＧＦに比べてそれよりも小さいか
又はほとんど無い場合には、ここでの意味で、ＶＥＧＦ変異体の結合親和性はＦ
ＬＴ−１レセプターに対して「選択的」であるとみなされる。本発明の好ましい
ＦＬＴ−１選択ＶＥＧＦ変異体は、（天然ＶＥＧＦに比較して）ＫＤＲレセプタ
ーに対して少なくとも１０倍小さい結合親和性を有し、更により好ましくは（天
然ＶＥＧＦに比較して）ＫＤＲレセプターに対して少なくとも１００倍小さい結
合親和性を有しうる。ＶＥＧＦ変異体のそれぞれの結合親和性は、当該分野で既
知のＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び／又はＢＩＡコアアッセイによって決定してもよ
く、以下の実施例に更に記載される。

【００１５】 ここで記載されるＶＥＧＦ変異体の略記指定のために、番号は（上掲のLeung
等及び上掲のHouck等で規定される）推定の天然ＶＥＧＦのアミノ酸配列による
アミノ酸位置に照らされて記載される。アミノ酸同定は、アミノ酸のアルファベ
ット一文字を使用する、つまり、 Ａｓｐ Ｄ アスパラギン酸 Ｉｌｅ Ｉ イソロイシン Ｔｈｒ Ｔ トレオニン Ｌｅｕ Ｌ ロイシン Ｓｅｒ Ｓ セリン Ｔｙｒ Ｙ チロシン Ｇｌｕ Ｅ グルタミン酸 Ｐｈｅ Ｆ フェニルアラニン Ｐｒｏ Ｐ プロリン Ｈｉｓ Ｈ ヒスチジン Ｇｌｙ Ｇ グリシン Ｌｙｓ Ｋ リジン Ａｌａ Ａ アラニン Ａｒｇ Ｒ アルギニン Ｃｙｓ Ｃ システイン Ｔｒｐ Ｗ トリプトファン Ｖａｌ Ｖ バリン Ｇｌｎ Ｑ グルタミン Ｍｅｔ Ｍ メチオニン Ａｓｎ Ｎ アスパラギン

【００１６】 「作用可能に結合し」とは、構成要素の通常の機能が働きうるような並列に関
していう。よって、コントロール配列に対して「作用可能に結合し」ているコー
ド配列とは、コード配列がこれらの配列のコントロール条件で発現し、結合され
ているＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していてリーデ
ィングフェーズにある構造を意味する。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダー
のＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されてい
るなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又
はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に
結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような
位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。結合は簡便な制限部位
でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従
来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用
される。 「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合
したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好
適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及び
リボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化
シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。

【００１７】 「発現システム」とは、作用可能に関連した所望のコード配列又はコントロー
ル配列を含むＤＮＡ配列を意味し、これらの配列で形質転換された宿主はコード
されタンパク質を産生することができる。形質転換をもたらすために、発現シス
テムはベクターに含まれうる；しかしながら、次いで関連のＤＮＡはまた、宿主
染色体に組み込まれうる。 「細胞」、「株化細胞」及び「細胞培養」は相互に交換可能な意味で用いられ
、その全ての用語は子孫を含むものと理解される。従って、「形質転換体」ある
いは「形質転換細胞」は、最初の対象細胞及び何度培養が継代されたかに関わら
ず最初のものから誘導された培養を含む。また、全ての子孫が、意図的な変異あ
るいは意図しない変異の影響で、正確に同一のＤＮＡを有するわけではないこと
も理解すべきである。本来の形質転換細胞についてスクリーニングしたものと同
じ機能又は生物活性を有する変異体子孫が含まれる。命名を区別することが意図
されている場合は、文脈から明らかであろう。 「プラスミド」とは、大文字及び／又は数字が先付けされる及び／又はその後
に付随される小文字「ｐ」で示される。ここでの開始プラスミドは、商業的に入
手可能で、制限のない基盤で公的に利用可能で、又は公知の手段に乗じてそのよ
うな利用可能なプラスミドから構築することができる。更に他の相当するプラス
ミドは、当該分野において既知で、通常の専門家に明らかであろう。

【００１８】 ここで使用する「ＶＥＧＦレセプター」という用語は、ＶＥＧＦの細胞内レセ
プターで、通常は血管内皮細胞に見られる細胞表面レセプター、並びにＶＥＧＦ
を結合する能力を保持しているそれらのフラグメントと変異体（例えば、レセプ
ター細胞外ドメインの断片又は切断された形態）を意味する。ＶＥＧＦレセプタ
ーの一つの例は、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ（ＦＬＴ又はＦＬＴ−１）、チロシ
ンキナーゼファミリーの膜貫通レセプターである。本出願で使用される「ＦＬＴ
−１レセプター」という用語は、例えばDeVries等、Science 255:989（1992）；
Shibuya等、Oncogene 5:519（1990）に記載されているＶＥＧＦレセプターを意
味する。全長ＦＬＴ−１レセプターは、チロシンキナーゼ活性を持つ細胞内ドメ
イン、膜貫通ドメイン、および細胞外ドメインを含んでいる。細胞外ドメインは
ＶＥＧＦの結合に関与しているが、細胞内ドメインはシグナル伝達に関与してい
る。ＶＥＧＦレセプターのもう一つの例はＫＤＲレセプター（ＦＬＴ−１とも称
される）である。本出願で使用される「ＫＤＲレセプター」という用語は、例え
ばMatthews等、Proc．Nat．Acad．Sci．88:9026（1991）；及びTerman等、Oncog
ene 6:1677（1991）；Terman等、Biochem．Biophys．Res．Commun．187:1579（1
992）に記載されるＶＥＧＦレセプターを意味する。

【００１９】 ここで使用される「治療」とは、治癒的処置、予防的療法及び防止的療法の両
方を意味し、患者は標的とする病理学的状態又は疾患を防止又は低下（減少）さ
せられる。治療が必要なものとは、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患に罹
りやすいもの又は疾患が防止されているものを含む。 「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式での薬剤を投与し、初期
の治療効果（活性）を長時間に渡って維持することを意味する。間欠投与とは、
中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理で
ある。 治療の対象のための「哺乳動物」は、ヒト、家畜及び農業用動物、動物園、ス
ポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタなどを
含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトで
ある。 １又は複数の治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の
順序での連続した投与を含む。

【００２０】 Ｂ．方法及び組成物 １．ＶＥＧＦ変異体の調製 ＶＥＧＦのアミノ酸配列は、ＶＥＧＦ ＤＮＡの突然変異により作成される。
そのような変異体は、例えば、上掲のLeung等及び上掲のHouck等に示されるアミ
ノ酸配列の残基からの欠失、該残基への挿入又は置換を含む。欠失、挿入、及び
置換のあらゆる組み合わせが、所望の活性を有する最終構築物となりうる。随意
的には、変異体をコードするＤＮＡで作られうる突然変異は、読み枠以外の配列
を配置する必要はなく、好ましくは２次ｍＲＮＡ構築をつくることのできる相補
領域を作成しない[EP75444A参照]。 ＶＥＧＦ変異体は、随意的には天然ＶＥＧＦをコードするＤＮＡのヌクレオチ
ドの部位特異的突然変異誘発又はファージディスプレイ技術によって作成され、
それにより変異体をコードするＤＮＡを作成し、従って組換え細胞培養でＤＮＡ
を発現する。 アミノ酸配列変異体を導入するための部位が見積もられるが、突然変異それ自
体は見積もる必要はない。例えば、与えられた部位での突然変異の遂行を最適化
するために、無作為な突然変異が標的コドン又は領域でおこる可能性があり、発
現したＶＥＧＦ変異体は所望の活性の最適な組み合わせをスクリーニングする。
既知の配列を有するＤＮＡの見積もられた部位での置換突然変異を作るための技
術は、例えば部位特異的突然変異としてよく知られている。

【００２１】 ここで記載されるＶＥＧＦ変異体の調製は、好ましくは実施例１に記載される
ようなファージディスプレイ技術により実施される。 そのようなクローンが選択された後、突然変異したタンパク質領域はタンパク
質産生のための適したベクター、一般に適した宿主の形質転換に使用される該タ
イプの発現ベクターに移動、配置される。 アミノ酸欠失は、通常約１〜３０残基、より好ましくは１〜１０残基にわたり
、一般的には近接している。 アミノ酸配列挿入は、本来制限されていない長さのポリペプチドに対する１つ
の残基由来のアミノ-及び／又はカルボキシル-末端融合、並びに１つの又は複合
アミノ残基の内部配列挿入を含む。内部配列挿入（つまり、天然ＶＥＧＦ配列へ
の挿入）は、通常約１〜１０残基、より好ましくは１〜５残基の範囲でありうる
。末端挿入の例は、宿主細胞、組換え宿主からの分泌を促進するためにＮ末端と
異なる又は類似しているどちらのシグナル配列の融合も含む。 付加的ＶＥＧＦ変異体は、天然ＶＥＧＦの少なくとも１つのアミノ酸残基が取
り除かれたものとその部分に挿入された異なる残基である。そのような置換は、
表１示されるものに基づいて作成されうる。

【００２２】 表１ 元の残基 例示的置換 Ala(A) gly; ser Arg(R) lys Asn(N) gln; his Asp(D) glu Cys(C) ser Gln(Q) asn Glu(E) asp Gly(G) ala; pro His(H) asn; gln Ile(I) leu; val Leu(L) ile; val Lys(K) arg; gln; glu Met(M) leu; tyr; ile Phe(F) met; leu; tyr Ser(S) thr Thr(T) ser Trp(W) tyr Tyr(Y) trp; phe Val(V) ile; leu

【００２３】 機能又は免疫学的認識の変化は、表１のものよりも小さい保存である置換の選
択、つまり、（ａ）例えばシート状又はらせん状の立体構造のような置換の領域
のポリペプチドバックボーンの構造、（ｂ）標的部位での分子の荷電又は疎水性
、又は（ｃ）側差の大部分を維持するそれらの効果においてより大きく異なる残
基の選択によりなされ得る。通常ＶＥＧＦ変異体特性の最も重大な変化をもたら
すことが予期される置換は、（ａ）グリシン及び／又はプロリン（Ｐ）が他のア
ミノ酸に置換されるか又は欠失又は挿入され；（ｂ）例えばセリル又はトレオニ
ルのような親水性基が、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バ
リル、又はアラニルのような親水性基に置換され；（ｃ）システイン残基が任意
の他の残基に（又はによって）置換され；（ｄ）例えばリシル、アルギニル、又
はヒスチジルのような電気陰性側鎖を有する残基が、例えばグルタミル又はアス
パルチルのような電気陰性電荷を有する残基に（又はによって）置換され；（ｅ
）電気陰性側鎖を有する残基が、電気陰性電荷を有する残基に（又はによって）
置換され；（ｆ）例えばフェニルアラニンのようなかさの大きい側鎖を有する残
基が、そのような側鎖、例えばグリシンを有しないものに（又はによって）置換
されるものであり得る。

【００２４】 置換、欠失、又は挿入の影響は、従来のスクリーニング技術を用いた当該分野
の熟練技術により評価されうる。例えば、ファージディスプレイ選択ＶＥＧＦ変
異体は、組換え細胞培地で発現され、任意に細胞培地から精製されうる。次いで
ＶＥＧＦ変異体は、ＫＤＲ又はＦＬＴ−１レセプター結合親和性及び本出願に記
載されているような他の生物学的活性が評価されうる。結合特性もしくは細胞溶
解物又は精製されたＶＥＧＦ変異体の活性は、所望の特性を適したスクリーニン
グ技術でスクリーニングすることができる。例えば、天然ＶＥＧＦと比較したＶ
ＥＧＦ変異体の免疫学的特性の変化、例えば与えられた抗体に対する親和性が、
所望されうる。そのような変化は、対抗したタイプのイムノアッセイにより測定
してもよく、当該分野において既知の技術に基づいて実施することができる。Ｖ
ＥＧＦ変異体のそれぞれのレセプター結合親和性は、当該分野で既知のＥＬＩＳ
Ａ、ＲＩＡ、及び／又はＢＩＡｃｏｒｅで決定されてもよく、以下の実施例で更
に詳しく記載される。また本発明の好ましいＶＥＧＦ変異体は、ＫＤＲレセプタ
ーのリン酸化を誘発する能力を反映する（本実施例に記載されるような）ＫＩＲ
Ａアッセイにおいて活性を示す。本発明の好ましいＶＥＧＦ変異体は、内皮細胞
増殖（本実施例のＨＵＶＥＣ増殖アッセイのような既知の技術方法で決定するこ
とができる）を更に又は代わって誘発しうる。

【００２５】 ＶＥＧＦ変異体は、当該技術で既知の技術、例えば組換え方法によって作成さ
れうる。これらの方法で使用される単離されたＤＮＡは、ここでは３'−及び／
又は５'−フランキング領域を有するか又は有しない化学的に合成されたＤＮＡ
、ｃＤＮＡ、染色体、又は染色体外ＤＮＡを意味すると理解される。好ましくは
、ここでのＶＥＧＦ変異体は、組換え細胞培養での合成により作られる。 その様な合成のために、第１にＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ変異体をコードする核酸
を入手することが必要である。ＶＥＧＦ分子をコードするＤＮＡは、ウシ下垂体
濾胞細胞から（ａ）これらの細胞由来のｃＤＮＡライブラリの調製、（ｂ）相同
な配列を含むライブラリのクローンを検出するために（１００塩基対の長さまで
又はそれより長い）ＶＥＧＦ又はその断片をコードする標識されたＤＮＡでのハ
イブリダイゼーション分析の実施、及び（ｃ）全長クローンを同定するための制
限酵素分析及び核酸配列決定によるクローンの分析により得られうる。全長クロ
ーンはｃＤＮＡライブラリに存在せず、次いで適した断片が、初めここで記載さ
れる核酸配列の情報を使用して様々なクローンから回収され、ＶＥＧＦをコード
する全長クローンを組み立てるためにクローンに一般的な制限部位で結合されう
る。あるいは、遺伝子ライブラリが所望のＤＮＡを提供しうる。 いったん該ＤＮＡがライブラリから同定され、単離されると、それは更なるク
ローニング又は発現のために複製可能なベクターに結合される。

【００２６】 組換え発現システムの１つの例として、ＶＥＧＦコード化遺伝子はＶＥＧＦを
コードするＤＮＡを含む発現ベクターを用いた形質転換により細胞システムで発
現される。宿主細胞の培地又はペリプラズムのＶＥＧＦを得る、つまり分泌分子
を得るために、そのようなプロセッシングを為し遂げることのできる宿主細胞を
形質転換することが好ましい。 「トランスフェクション」とは、任意のコード化配列が実際に発現するかどう
か分からないを宿主細胞による発現ベクターの入手を意味する。トランスフェク
ションの多くの方法は、通常の技能を有する技術者に知られており、例えば、Ｃ
ａＰＯ_４及び電気穿孔法がある。一般に成功したトランスフェクションは、宿主
細胞に生じる該ベクターの働きの兆候が現れた時に認識される。 「形質転換」は、生物にＤＮＡを導入し、染色体外成分として又は染色体組み
込みによって、ＤＮＡが複製されることを意味する。使用される宿主細胞によっ
て、形質転換は、該細胞に適した基本的な技術を用いて成される。Cohen, Proc.
Natl. Acad. Sci. (USA), 69: 2110(1972)及びMandel等, J. Mol. Biol., 53:
154 (1970)に記載されているような塩化カルシウムを使用したカルシウム処理は
、一般に頑丈な細胞壁バリヤーを含む原核生物又は他の細胞で使用される。その
ような細胞壁を持たない哺乳動物細胞にとって、Graham及びvan der Eb, Virolo
gy, 52: 456-457 (1978)のリン酸カルシウムの析出方法が好ましい。哺乳動物細
胞ホストシステム形質転換の一般的な形態は、Axelにより、１９８３年８月１６
日公開の米国特許第4399216号に記載されている。酵母の形質転換は、典型的に
はVan Solingen等, J. Bact., 130:946(1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad.
Sci. (USA), 76:3829(1979)の方法により実施される。しかしながら、核酸移入
又はプロトプラスト融合によるような細胞にＤＮＡを導入する他の方法も、また
使用されうる。

【００２７】 ここに開示したベクター及び方法は、広範囲の原核生物及び真核生物に亘る宿
主細胞に使用するのに適している。 一般的には勿論、本発明に有用なベクターを作成する際、ＤＮＡ配列の最初の
クローニングには原核生物が好適である。例えばＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２菌株２９
４(ＡＴＣＣ Ｎｏ．３１４４６)が特に有用である。使用し得るその他の微生物
菌株はＥ．ｃｏｌｉ菌株、例えばＥ．ｃｏｌｉＢ及びＥ．ｃｏｌｉＸ１７７６(
ＡＴＣＣ Ｎｏ．３１５３７)を包含する。これらの例は、勿論例示であって限定
を意味するものでない。 発現用にも原核生物を使用することができる。上記の菌株並びにＥ．ｃｏｌｉ
Ｗ３１１０(Ｆ-,λ-,原始栄養性(prototrophic)、ＡＴＣＣ Ｎｏ．２７３２５)
、Ｋ５７７２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３６３５）、及びＳＲ１０１、桿菌例えばBac
illus subtilus、及び他の腸内細菌例えばSalmonella typhimurium又はSerratia
marcesans及び各種のPseudomonas種を使用することができる。 一般に、レプリコン及び制御配列を含有し宿主細胞に適合性の種由来のプラス
ミドベクターを、これら宿主と関連して使用する。通常、ベクターは複製部位並
びに形質転換細胞に表現型選択を与え得るマーカー配列を有する。例えばＥ．ｃ
ｏｌｉは、典型的にはｐＢＲ３２２即ちＥ．ｃｏｌｉ種から得られるプラスミド
(Bolivar等,Gene2:95(1977))を用いて形質転換される。ｐＢＲ３２２はアンピシ
リン耐性及びテトラサイクリン耐性遺伝子を有し、従って形質転換細胞を同定す
るための便利な手段を与える。ｐＢＲ３２２プラスミド又はその他の微生物プラ
スミドは、又、微生物がそれ自身の蛋白質を発現するように使用し得るプロモー
ターを含有し又は含有するよう改変されなければならない。

【００２８】 組換ＤＮＡの作成に最も一般的に使用されるプロモーターは、β−ラクタマー
ゼ(ペニシリナーゼ)及び乳糖プロモーター系[Chang等, Nature, 375:615(1978);
Itakura等, Science,198:1056(1977);Goeddel等, Nature,281:544(1979))並びに
トリプトファン(trp)プロモーター系[Goeddel等,Nucleic Acids Res.,8:4057(19
80);ＥＰＯ出願公開第００３６７７６号]を包含する。これらが特に一般的に使
用されるが、他の微生物プロモーターも見出され且つ利用されており、これらヌ
クレオチド配列に関する詳細が公開されており、当業者はこれらをプラスミドベ
クターと機能的に結合させることができる[Siebenlist等,Cell,20:269(1980)]。 原核生物の他に、酵母培養物のような真核微生物も使用することができる。Sa
ccharomyces cerevisiae即ち一般的なパン酵母が真核微生物として最も一般的に
使用されるが、他の多くの菌株も一般的に使用し得る。Saccharomycesに於ける
発現については例えばプラスミドＹＲｐ７、[Stinchcomb等,Nature,282:39(1979
);Kingsman等,Gene,7:141(1979)；Tschemper等, Gene,10:157(1980)]が一般的に
使用される。このプラスミドは既にトリプトファン中で増殖する能力を欠如した
酵母の突然変異菌株、例えばＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７６即ちＰＥＰ４−１[Jone
s,Genetics,85:12(1977)]に対し選択マーカーを与えるｔｒｐ１遺伝子を含有す
る。酵母宿主細胞ゲノムの特性としてｔｒｐ１欠陥(lesion)が存在するため、ト
リプトファンの不在下での増殖による形質転換の検出用に有効な環境が得られる
。

【００２９】 酵母ベクターに於ける適当なプロモーター配列は３−ホスホグリセレートキナ
ーゼ[Hitzeman等,J.Biol.chem.,255:2073(1980)]又はその他の糖分解酵素(Hess
等,J.Adv.Enzymc Reg.,７:149(1968)；Holland等,Biochemistry，17:4900(1978)
)例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ
、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、
グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ
、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコー
スイソメラーゼ及びグルコキナーゼに対するプロモーターを包含する。適する発
現プラスミドを作成する際、これら遺伝子に関連する停止配列も、mＲＮＡのポ
リアデニル化及び停止を行なうように発現させたり配列の発現ベクター３'中へ
結合させる。増殖条件により制御される転写の付加的利点を更に有する他のプロ
モーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸ホスファ
ターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素並びに上記のグリセルアルデヒド−３−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼ及びマルトースとガラクトースとの利用に関する酵
素(Holland,上記)に対するプロモーター領域である。酵母適合性のプロモーター
と複製のオリジンと停止配列とを有するプラスミドベクターが適している。 微生物の他に、多細胞生物由来細胞の培養物も宿主として使用することができ
る。原則として、任意のこの種の細胞培養物は、脊椎動物由来であっても、或い
は無脊椎動物の培養物であっても使用可能である。然しながら、最も興味がある
ものは脊椎動物細胞であり、脊椎動物細胞の培養(組織培養)による増殖が、近年
日常の手法となった[Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson編
(1973)]。この種の有用な宿主細胞系の例は、ＶＥＲＯ細胞及びＨeＬa細胞、チ
ャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞系並びにＷ１３８,ＢＨＫ,ＣＯＳ−７及
びＭＤＣＫ細胞系である。この種の細胞に対する発現ベクターは一般に、(必要
に応じ)複製のオリジン、発現すべき遺伝子の前方に位置するプロモーター並び
に任意の必要なリポソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部
位及び転写停止配列を含む。

【００３０】 哺乳動物細胞に於いて使用するには、発現ベクターに対する制御機能がしばし
ばウィルス性材料により与えられる。例えば一般的に使用されるプロモーターは
ポリオーマ、アデノウィルス２及び特にしばしばサルウィルス４０(ＳＶ４０)か
ら得られる。ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターが特に有用である。
何故なら、これら両者は複製のＳＶ４０ウィルスオリジンをも含有する断片とし
てウィルスから容易に得られるからである[Fiers等,Nature,273:113(1978)]。よ
り小さい又はより大きいＳＶ４０断片も使用し得るが、但しＨｉｎｄＩＩＩから
複製のウィルスオリジン内に存在するＢｇｌＩ部位まで延びる約２５０ｂｐ配列
が含まれることが必要である。更に一般に所望の遺伝子配列に関連するプロモー
ター又は制御配列を使用することもでき、且つ使用するのがしばしば望ましい。
但し、この種の制御配列は、宿主細胞系に対し適合性であるものとする。 複製のオリジンは、例えばＳＶ４０又はその他のウィルス(例えばポリオーマ
、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ等)源から得られるような外来オリジンを含むように
ベクターを作成して供給するか、或いは宿主細胞の染色体複製メカニズムにより
供給することができる。ベクターが宿主細胞の染色体中に組み込まれれば、これ
でしばしば充分である。 タンパク質の十分な量は、細胞培養によって生成される；しかしながら、第２
のコード化配列を用いた精製は、生成レベルを促進するのに役立つ。１つの第２
のコード化配列は、外見的に制御されたパラメータ、例えばメトトレキセート（
ＭＴＸ）に影響されるデヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）を含み、よ
ってメトトレキセート濃度の制御により発現の制御ができる。

【００３１】 ＶＥＧＦ及びＤＨＦＲタンパク質の両方をコードするＤＮＡ配列を含む本発明
のベクターによるトランスフェクションのためのこの増井宿主の選択において、
使用されるＤＨＦＲのタイプにより宿主細胞を選択するのが好ましい。野生型Ｄ
ＨＦＲを用いた場合、ＤＨＦＲを欠いた宿主細胞を選択し、よって、ヒポキサン
チン、グリシン、及びチミジンを欠いた選択培地で選択的にトランスフェクショ
ンするための標識としてＤＨＦＲコード配列が使用できることが好ましい。この
場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:
4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠
陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞系である。 一方、ＭＴＸに対する低い結合親和性を有するＤＨＦＲタンパク質が、コント
ロール配列として使用される場合には、ＤＨＦＲ欠陥細胞を使用する必要はない
。突然変異ＤＨＦＲがメトトレキセートに耐性があるので、ＭＴＸ含有培地は、
宿主細胞それ自体メトトレキセート感受性であることを条件とする選択の方法と
して使用される。ＭＴＸを収容することのできる多くの真核細胞は、メトトレキ
セート感受性であると考えられる。利用できるそのような細胞株の1つはＣＨＯ
株、 ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）である。 所望のコード及びコントロール配列を含む適したベクターの構築は、通常のラ
イゲーション技術を使用する。単離されたプラスミド又はＤＮＡ断片は、要求さ
れるプラスミドを作成するのに所望される形態で、分割され、調製され、再連結
される。

【００３２】 平滑断端が要求される場合には、調製は、フェノールクロロホルム抽出され、
エタノール沈殿されたポリメラーゼＩ（Klenow）の１０ユニットを用いて１５℃
で１５分間処理されうる。 分割された断片のサイズ分別は、実施例の方法により、Goeddel等, Nucleic A
cids Res., 8:4057(1980)に記載されている６％ポリアクリルアミドゲルを用い
て実施されうる。 正確な配列がプラスミドで構築されることを確認するために、ライゲーション
混合物は、通常、組換えＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２菌株２９４(ＡＴＣＣ Ｎｏ．３１
４４６)又は他の適したＥ．ｃｏｌｉ株、及び適切にあるアンピシリン又はテト
ラサイクリン耐性によって選択された成功する形質転換に使用される。形質転換
由来のプラスミドは、Messing等, Nucleic Acids Res., 9:309(1981)の方法によ
る、又はMaxam等, Methods of Enzymology, 65:499(1980)の方法による制限地図
及び／又はＤＮＡ配列決定によって調製され、分析される。 哺乳動物細胞ホストへのＤＮＡの挿入及び適切な核酸移入のための培地のの選
択の後、ＤＨＦＲタンパク質コード配列の増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）
、ＤＨＦＲ活性の拮抗阻害剤の濃度が約２０，０００−５００，０００ｎＭで存
在する培地で宿主細胞を成育させることが効果的である。濃度の効果的な範囲は
、硬度に依存し、もちろんＤＨＦＲ遺伝子の性質及びホストの特性にもよる。一
般に、定義される上限及び低限ははっきりと確認することはできない。適した濃
度の他の葉酸類似物又は他のＤＨＦＲ阻害化合物もまた使用されうる。しかしな
がら、ＭＴＸはそれ自体、便利で、すぐに利用可能で、効果的である。

【００３３】 ２．ＶＥＧＦ変異体の共有結合的修飾 本発明のＶＥＧＦ変異体はまた、更なる修飾を構成しうる。実施例は１又は複
数のアミノ酸残基への共有結合修飾を含む。例えば、システイニル残基は、ハロ
アセタート（及び対応するアミン）、例えば、クロロ酢酸又はクロロアセトアミ
ドと反応し、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。シ
ステイン残基もまた、ブロモトリフルオロアセトン；β-ブロモ-(５-イミドゾイ
ル)プロピオン酸；クロロアセチルホスフェート；Ｎ-アルキルマレイミド類；３
-ニトロ-２-ピリジルジスルフィド；メチル-２-ピリジルジスルフィド；ｐ-クロ
ロ水銀安息香酸；２-クロロ水銀-４-ニトロフェノール；又はクロロ-７-ニトロ
ベンゾ-２-オキサ-１，３-ジアゾールとの反応によって誘導体化される。 他の例は、ｐＨ５．５−７．０でジエチルピロカルボナートとの反応によって
誘導体化されるヒスチジル残基を含む。ｐ-ブロモフェナシルブロミド、この反
応は、好ましくはｐＨ６．０で０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム中で行われる。 リジニル及びアミノ末端残基はスクシン又は他のカルボン酸無水物と反応させ
られうる。これらの試薬を用いた誘導体形成は、リシニル残基の電荷を逆転させ
る効果を有する。β−アミノ含有残基を誘導体化する他の適当な試薬は、イミド
エステル、例えば、メチルピコリンイミダート、リン酸ピリドキサル、ピリドキ
サル、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ-メチルイソ尿
素、２，４-ペンタンジオン、及びグリオキシラートを用いたトランスアミナー
ゼにより触媒される反応である。

【００３４】 アルギニル残基は一あるいは幾つかの従来の試薬との反応によって修飾され、
とりわけ、フェニルグリオキサール、２，３-ブタンジオン、１，２-シクロヘキ
サンジオン及びニンヒドリンがある。また、これらの試薬はリジンのε-アミノ
基を修飾するのに使用されうる。アルジニン残基の誘導体化は、グアニジン官能
基の高いｐＫ_ａのために反応がアルカリ性条件下で行われることを必要とする。 チロシル残基の特異的修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメ
タンとの反応によるチロシル残基内へのスペクトル標識の導入に特に興味を持っ
て、なされる。最も一般的には、N-アセチルイミジゾールとテトラニトロメタン
を使用して、それぞれがＯ-アセチルチロシル種と３-ニトロ誘導体を形成する。
チロシル残基はラジオイムノアッセイ用の標識化タンパクを調製するために^{１２ ５} Ｉ又は^１３１Ｉを用いてヨウ素化され、クロラミンＴ法が適切である。 カルボキシル側基（アスパルチル又はグルタミル）がカルボジイミド（Ｒ’−
Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’）、例えば、１-シクロヘキシル-３-（２-モルホリニル−(４-
エチル)）カルボジイミド又は１-エチル-３-（４-アゾニア-４，４-ジメチルペ
ンチル）カルボジイミドとの反応によって選択的に修飾される。さらには、アス
パルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラ
ギニル及びグルタミニル残基へ変換されうる。

【００３５】 二官能性試薬による誘導体形成は、水不溶性支持体マトリックス又は表面への
ＶＥＧＦ変異体の架橋に有用である。通常使用される架橋剤には、例えば、１,
１-ビス(ジアゾアセチル)-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロ
キシスクシンイミドエステル類、例えば、４-アジドサリチル酸とのエステル、
３,３'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオナート)のようなジスクシンイミ
ジルエステルを包含するホモ二官能性イミドエステル、及びビス-Ｎ-マレイミド
-１,８-オクタンのような二官能性マレイミドが含まれる。メチル-３-［(ｐ-ア
ジドフェニル)ジチオ］プロピオイミダートのような誘導体化剤は、光の存在下
で架橋を形成することができる光活性化中間体を生じる。また、臭化シアン活性
化炭水化物のような反応性の水不溶性マトリックス及び米国特許第３９６９２８
７号；３６９１０１６号；４１９５１２８号；４２４７６４２号；４２２９５３
７号及び４３３０４４０号に記載されている反応性基質がタンパク固定に用いら
れる。 グルタミニル及びアスパラギニル残基は、相当するグルタミル及びアスパルチ
ル残基へしばしば脱アミド化される。あるいは、これらの残基は中性又は塩基性
条件下で脱アミド化される。これらの残基の両方の型は本発明の範囲内に入る。 その他の修飾は、プロリンとリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル
残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖の
ａアミノ基のメチル化［T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular
Properties, 79-86 (W.H. Freeman & Co., San Francisco, (1983))］、Ｎ末端
アミンのアセチル化、及び、ある場合にはＣ末端カルボキシル基のアミド化を含
む。

【００３６】 更なる修飾は、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ変異体（又はＶＥＧＦアゴニスト）のポ
リエチレングリコールのような非タンパク質系ポリマーへの結合又は融合を含む
。タンパク質ＰＥＧ化(pegylating)の方法は、当該分野で既知である。 ＶＥＧＦ変異体阿もの酸配列は、Ｎ−結合を通じてグリコシル化される可能性
があり、天然ＶＥＧＦで通常グリコシル化されない少なくとも１のアミノ酸配列
を含みうる。 変異体のＮ結合型グリコシル化部位の導入は、式：アスパラギン-Ｘ-セリン又
はアスパラギン-Ｘ-スレオニンのトリペプチジル配列が必要であり、ここでアス
パラギンはアクセプターであり、Ｘはプロリンを除く遺伝的にコードされた２０
のアミノ酸の任意のものであり、グリコシル化を防ぐ。[Struck及びLennarz, in
The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans 35 (Lennarz版., Ple
num Press, (1980))、Marshall, Biochem. Soc. Symp., 40:17(1974)；及びWinz
ler, in Hormonal Proteins and Peptides, 1-15(Li, .版., Academic Press, N
ew York,(1973))]。ここでのアミノ酸配列変異体は、適当な部位のアミノ酸に対
してグリコシル化に影響するように適切なアミノ酸を置換することにより修飾さ
れる。 Ｏ結合型グリコシル化が用いられる場合、Ｏ-グリコシド結合は動物細胞にお
いてＮ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースと、いくつかの
ヒドロキシアミノ酸の一つ、最も一般的にはセリン又はスレオニンとの間で生じ
るが、またいくつかの場合では分子の適切な領域に配された５-ヒドロキシプロ
リン又は５-ヒドロキシリジン残基との間で生じる。

【００３７】 哺乳動物により生成されるタンパク質のグリコシル化型は、The Plasma Prote
ins：Structure, Function and Genetic Control271-315(Putnam, ed., 2nd edi
tion, Academic Press, New York(1984))に詳細に記載されている。この章では
、アスパラギン様オリゴ糖が議論され、それは、複合体、高マンノース、及びハ
イブリッド構造と呼ばれる少なくとも３つのグループの細区分、並びにＯ-グリ
コシド結合オリゴ糖を含む。 グリコシドのタンパク質への化学的又は酵素的結合は、例えば、1987年9月11
日に発行されたWO 87/05330、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem.
, 259-306 (1981)に記載されているような、様々な活性基を用いて達成される。
化学カップリング技術の利点は、それらが比較的単純で、天然Ｏ-及びＮ-結合グ
リコシル化に必要とされる複雑な酵素機構に必要ないことである。用いられる結
合形態に応じて、糖(類)は、(ａ)アルギニンとヒスチジンに、(ｂ)遊離のカルボ
キシル基に、(ｃ)遊離のスルフヒドリル基、例えばシステインのものに、(ｄ)セ
リン、スレオニン又はヒドロキシプロリンのもののような遊離のヒドロキシル基
に、(ｅ)フェニルアラニン、チロシン又はトリプトファンのような芳香族残基、
又は(ｆ)グルタミンのアミノ基に結合される。これらの方法は１９８７年９月１
１日公開の国際特許出願第ＷＯ８７／０５３３０号にさらによく記載されている
。 酵母に産生されるタンパク質のグリコシル化型は、Tanner及びLehle, Biochim
. Biophys. Acta, 906(1):81-99(1987)及びKukuruzinska等, Annu. Rev. Bioche
m., 56:915-944(1987)に詳細に記載されている。 天然ＶＥＧＦのグリコシル化は生物活性には必須ではない[Walter等, Laborat
ory Investigation, 74:546(1996)]が、必要なら、前述の方法はＶＥＧＦ変異体
のグリコシル化を変化させるのに使用されうる。

【００３８】 ３．治療及び診断の方法 本発明はまた、記載されたＶＥＧＦ変異体を使用した方法を提供する。該方法
は、脈管形成又は血管新生を含む方法のような治療方法を含む。また、該方法は
、精神的外傷を包含する血管内皮細胞増殖に鑑みた血管ネットワークの外傷の治
療に関する。そうして治療することのできる外傷の例としては、これに限らない
が、外科的切開、特に心臓に関するもの、裂傷、切開、及び血管の穿通を含む創
傷、及び糖尿病、血友病、及び静脈瘤性潰瘍のような血管内皮に関する表面潰瘍
を含む。ＫＤＲレセプターに対する選択的結合親和性有する好ましいＶＥＧＦ変
異体は、ＫＤＲレセプターの活性化を得るが、ＦＬＴ−１レセプター活性化を伴
いうる潜在的な副作用を避けることを所望する場合に使用されうることが予期さ
れる。同様に、ＦＬＴ−１レセプターに対する選択的結合親和性を有する好まし
いＶＥＧＦ変異体は、ＦＬＴ−１レセプターの活性化を得るが、ＫＤＲレセプタ
ー活性化を伴いうる潜在的な副作用を避けることを所望する場合に使用されうる
。 ＶＥＧＦ変異体は、治療すべき特定の疾患、個々の患者の状態、ＶＥＧＦ変異
体の送達部位、投与方法、及び実務者に知られた他の要因を考慮して良好な医学
的実務に合致する形式で計画及び投薬される。ＶＥＧＦ変異体の「治療的有効量
」は、治療される状態又はその症状の抑制、悪化の軽減、緩和、又は回復させる
量を含む。

【００３９】 本発明の化合物は、製薬的に有用な組成物を調製するための周知の方法に従っ
て処方でき、それによりＰＲＯポリペプチドが媒体との混合物に混合される。 ＶＥＧＦ変異体は、貯蔵又は投与のために、所望の純度を有するＶＥＧＦ変異
体と製薬的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤を混合することにより調製さ
れうる。好適な担体媒体及びその処方は、他のヒトタンパク質、例えばヒト血清
アルブミンを含むが、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed
., 1980, Mack Publishing Co., Oslo等編集に記載されている。通常、適切な量
の製薬的に許容可能な塩が、等張化するために製剤に使用される。担体の例とし
ては、サリン、リンガー溶液、及びデキストロース溶液のような緩衝剤を含む。
溶液のｐＨは、好ましくは約５．０〜約８．０である。例えばＶＥＧＦ変異体が
水溶性である場合には、約７．０〜約８．０のｐＨでリン酸塩又は他の有機酸塩
のような緩衝剤で製剤されうる。ＶＥＧＦ変異体が水に一部しか溶解しない場合
、それを０．０４−０．０５％（w/v）の量のＴｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ
又はＰＥＧ等の非イオン性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ８０とともに製剤して
溶解性を向上させ、マイクロエマルションとして調製してもよい。 更に担体は、マイクロカプセル及び移植可能な製品の形態を包含する持続放出
調製物含む。持続放出調製物の例は、例えばマトリックスが成形物、例えばフィ
ルム、リポソーム又はマイクロカプセルの形態の半透性マトリクスを含む。持続
放出ＶＥＧＦ変異体組成物の調製のために、ＶＥＧＦ変異体は、生物分解性マト
リックス又はマイクロカプセルに取り込まれるのが好ましい。この目的に適した
物質は、ポリアクチドであるが、ポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸[EP133988A]の
ようなポリ(β-ヒドロキシエチル-メタクリレート)の他のポリマーが使用されう
る。例えばポリ(ラクトン)、ポリ(アセタール)、ポリ(オルトエステル)、又はポ
リ(オルトカーボネート)のような他の生物分解性ポリマーもまた、適している。

【００４０】 持続性放出組成物については、米国特許第3,773,919号、EP58,481A、米国特許
第3,887,699号、EP 158,277A、カナダ国特許番号1176565、Sidman等, Biopolyme
rs 22:547 (1983)、及びLanger等, Chem. Tech., 12:98(1982)を参照のこと。 任意の担体はより好ましくは、例えば投与されるVEGF変異体のの投与経路及び
濃度に依存することは、当該分野の技術者には明らかであろう。 場合によっては、酸化防止剤、例えばアスコルビン酸；低分子量（約１０残基
未満）ポリペプチド、例えばポリアルギニン又はトリペプチド；タンパク質、例
えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば
ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン酸、アスパラギ
ン酸、又はアルギニン；セルロース又はその誘導体、グルコース、マンノース、
又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレ
ート剤；及びマンニトール又はソルビトール等の糖といった他の成分を添加して
もよい。賦形剤、担体、安定化剤、又は他の添加剤の使用は、結果的にＶＥＧＦ
変異体の塩の形態となりうる。 担体、賦形剤、又は安定化剤を選択する場合、選択される化合物及び相当する
分解産物は、無毒で、治療される状態及び／又はその症状の悪化を避けるもので
なくてはならない。これは、目的とする障害の哺乳動物での、該モデルが利用で
きない場合には、通常の動物での従来からあるスクリーニングで決定することが
できる。

【００４１】 治療投与に用いられるＶＥＧＦ変異体は無菌でなければならない。無菌性は、
滅菌濾過膜（例えば、０．２ミクロン膜）を通すことにより容易に達成される。
ＶＥＧＦ変異体は通常は凍結乾燥形態又は熱的及び酸化的変性に対して安定性が
高い場合には水溶液中に貯蔵される。ＶＥＧＦ変異体組成物のｐＨは典型的には
約５．０から８．０であるが、より高い又は低いｐＨ値が適している場合もある
。 哺乳動物への投与は、注射(例えば、静脈、腹腔内、皮下、筋内)、又は点滴
のように、有効な形態で血流への送達を確実にする他の方法によりなすことがで
きる。ＶＥＧＦ変異体が非経口で用いられる場合、ＶＥＧＦ変異体を含有する治
療用組成物は一般的に無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、静脈内溶
液バッグ又は皮下注射針で穿孔可能なストッパーを具備するバイアルに配される
。 一般に、症状が許すところでは、部位特異的な送達のためにＶＥＧＦ変異体を
製剤化子、投与してもよい。これは、創傷及び潰瘍の場合に便利である。 ＶＥＧＦ変異体は、局所的に適用する場合には、担体、アジュバント、安定化
剤、又は賦形剤等の添加剤と適宜組み合わせる。上記のように、ＶＥＧＦ変異体
との混合物の添加物を選択する場合、添加剤は製薬的に許容され、それらの意図
する投与にとって有効でなければならない。それら他の成分の特徴については、
生理的に許容でき、投与法に有効であり、組成物の主成分の活性を劣化しないも
のであれば特に限定しない。更に添加剤は、ＶＥＧＦ変異体の活性に影響しない
ようにしなければならない。適切な局所製剤の例には、精製コラーゲンを伴うか
伴わない、軟膏、クリーム、ゲル、又は懸濁液がある。組成物はまた経皮的パッ
チ、プラスター、及び包帯、好ましくは液体もしくは半液体状のものに含浸させ
ることができる。

【００４２】 所望の粘度を有するゲル製剤は、ＶＥＧＦ変異体を、セルロース誘導体等の水
溶性多糖類又はポリエチレングリコール等の合成ポリマーと混合して、調製され
てもよい。多糖類及びポリエチレングリコールに適用される「水溶性」という用
語は、コロイド溶液及び分散物も含むことを意味する。一般に、セルロース誘導
体等の溶解性はエーテル基の置換の程度によって決まり、ここで有用な安定化誘
導体は、そのようなエーテル基をセルロース鎖の無水グルコース単位当たりに誘
導体を水溶性とするのに十分な量有していなければならない。無水グルコース単
位当たりに少なくとも０．３５のエーテル基というエーテル置換度が一般的には
十分である。さらに、セルロース誘導体はアルカリ金属塩、例えばＬｉ、Ｎａ、
Ｋ、又はＣｓ塩の形態であってもよい。 適した多糖類の例は、例えば、セルロース誘導体、例えばアルキルセルロース
、ヒドロキシアルキルセルロース、及びヒドロキシアルキルセルロースを含むエ
ーテル化セルロース誘導体、例えばメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロ
ース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及
びヒドロキシプロピルセルロース；デンプン及び分別デンプン；寒天；アルギン
酸及びアルギン酸塩；アラビアゴム；プルラン；アガロース；カラゲナン；デキ
ストラン；デキストリン；フルクタン；インシュリン；マンナン；キシラン；ア
ラビナン；キトサン；グリコーゲン；グルカン；及び合成バイオポリマー；並び
にゴム、例えばキサンタンゴム；グアールゴム；イナゴマメゴム；アラビアゴム
；トラガカントゴム；及びカラヤゴム；及びこれらの誘導体及び混合物である。
ここで好ましいゲル化剤は、生物学系に不活性で、非毒性で、調製が単純で、な
おかつ緩すぎず粘りすぎず、そしてそこに保持されるＶＥＧＦ変異体を不安定化
させないものである。

【００４３】 好ましくは、多糖類はエーテル化セルロース誘導体、より好ましくは良好に定
義され、精製され、米国特許に記載されたものであり、例えば、ヒドロキシプロ
ピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、及びヒドロキシプロピルメチル
セルロースなどのメチルセルロース及びヒドロキシアルキルセルロース誘導体で
ある。ここで最も好ましいのはメチルセルロースである。例えば、メチルセルロ
ースを含有するゲル化剤は、好ましくは約２−５％のメチルセルロース及びゲル
１ｍｌ当たりに約３００−１０００ｍｇののＶＥＧＦ変異体を含んでなる。更に
好ましくは、ゲル形態は、３％のメチルセルロースを含む。 ゲル化剤に有用なポリエチレングリコールは、典型的には適切な粘度を得るた
めの低及び高分子量ポリエチレングリコールの混合物である。例えば、分子量４
００−６００のポリエチレングリコールと分子量１５００のものとの混合物は、
ペーストを得るのに適した比率で混合した場合にこの目的に有効となるであろう
。 用いられる投与量は上記の要因に依存する。一般的な提案として、ＶＥＧＦ変
異体は、組織において約０．１ｎｇ／ｃｃより大きく、有効だが過度に毒性では
ない最大用量までのＶＥＧＦ変異体レベルを確立することのできる投与量で製剤
され標的部位又は組織に輸送される。この細胞内濃度は、もし可能ならば、連続
的吸入、持続放出、局所適用、又は経験的に決められる頻度での注射により維持
されるべきである。

【００４４】 ここで、ＶＥＧＦ変異体治療を、細胞増殖、生存、分化及び再生の促進におい
て、ＶＥＧＦ-Ｅを含む任意の成長因子の活性を向上させるための他の新規な又
は従来からの治療薬（例えば、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ
、ＮＧＦ、タンパク同化ステロイド、ＥＧＦ又はＴＧＦ-ａ等の成長因子）と組
み合わせるのも範囲内である。これらの協働治療薬は、それ自体が本発明の組成
物に含まれる必要はないが、それらの薬剤がタンパク質性であるのが便利である
。そのような混合物は、ＶＥＧＦ変異体が単独で用いられるのと同様の方式及び
同様の目的で適切に投与される。 抗体を投与するための有効な用量とスケジュールは経験的に決定することがで
き、そのような決定は当業者の技量の範囲に含まれる。 また本発明のＶＥＧＦ変異体は、診断方法又はアッセイでの有用性を有する。
例えば、ＶＥＧＦ変異体は細胞又は組織のＫＤＲレセプターの発現又は存在を検
知する為の診断アッセイに使用されうる。インビボイメージングアッセイ、競合
結合アッセイ、直接及び間接サンドウィッチアッセイ、及び不均一又は均一相の
何れにおいても実施される免疫沈降アッセイのような当該技術で既知の様々な診
断アッセイ技術が使用される。該アッセイに使用されるＶＥＧＦ変異体は、検出
可能部分で標識することができる。検出可能部分は、直接的に又は間接的に検出
可能なシグナルをつくりだすことができなければならない。例えば検出可能部分
は、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ又は^１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセ
インイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化
合物、もしくはアルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ又はセイヨウワ
サビペルオキシダーゼ等の酵素であってもよい。 また、ＶＥＧＦ変異体は組換え細胞培養又は天然供給源からのＫＤＲレセプタ
ー又はＦＬＴ−１レセプターのアフィニティー精製にも有用である。当該分野で
よく知られている方法を使用して、ＶＥＧＦ変異体は樹脂や濾紙のような適当な
支持体に固定化することができる。次に、固定化されたＶＥＧＦ変異体を、ＫＤ
Ｒレセプター又はＦＬＴ−１レセプターを含む試料と接触させた後、ＶＥＧＦ変
異体に結合したＫＤＲレセプター又はＦＬＴ−１レセプター以外の試料中の物質
を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。所望されるなら、ＫＤ
Ｒレセプター又はＦＬＴ−１レセプターをＶＥＧＦ変異体から脱離させる他の適
当な溶媒で支持体を洗浄する。

【００４５】 ４．製造品 さらに本出願により、製造品及びキットが提供される。診断アッセイ又はここ
で記載される症状の治療に利用されるＶＥＧＦ変異体を含むキットのような製造
品は、少なくとも容器とラベルとを具備してなる。好適な容器は、例えば、ビン
、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチックな
どの材料から形成されてよい。容器は、状態を診断し治療するのに有効な組成物
を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通
可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成
物中の活性剤は通常、ＶＥＧＦ変異体である。容器上又は添付されるラベルは、
組成物が選択した状態の診断又は治療のために使用されることを示す。製造品は
さらに、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液などの製薬的に許
容されるバッファーを含む第２の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファ
ー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用上の指示を付けたパッケージ
挿入物を含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。ま
た、この製造品は、上述の他の活性剤を収容した第２又は第３の容器を具備して
もよい。 以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を
決して限定することを意図するものではない。 本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに
取り込む。

【００４６】 （実施例） 実施例に相当する商業的に入手可能な試薬は、他に示されていなければ、製造
者による指示書に従って使用された。ＡＴＣＣ受託番号によって、下記の実施例
、及び明細書を通して同定された細胞の起源は、バージニアー州、マナサス、ア
メリカン タイプ カルチャー コレクションである。

【００４７】 実施例１： ＫＤＲ特異的ＶＥＧＦ変異体の選択 ＫＤＲ特異的変異体を作製するために、二つのファージライブラリーが、Ｆｌ
ｔ−１結合にとっては重要であるがＫＤＲ結合にとっては重要でないＶＥＧＦ（
１−１０９）の残基がランダムに変異された中に構築された。 ファージの構築 ファージライブラリーを構築するために、ＶＥＧＦの１−１０９残基をコード
するｃＤＮＡを有するファージミドベクターが、最初に作製された。ファージミ
ドベクターｐＢ２１０５（ジェネンテク，インコーポレイテッド）は、ＮｓｉＩ
／ＸｂａＩ制限酵素断片のファージミドベクターｐｈＧＨａｍ−ｇ３（ジェネン
テク，インコーポレイテッド）への後の結合を可能にしたプライマーを使用し、
ＶＥＧＦの１−１０９残基をコードするｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって作製され
た。このことは、１０９残基のすぐ後にアンバーコドンを導入し、ＶＥＧＦの１
−１０９残基のｃＤＮＡを残基２４９から４０６を包含する半分のｇＩＩＩのＣ
-末端へ融合させた。 一つのライブラリーでは、すべての可能性のある残基の組合せは、ＶＥＧＦ１
−１０９の位置１８、２１、２２、及び２５で認められ（Ｎ＝Ｇ、Ａ、Ｔ又はＣ
、及びＳ＝Ｃ又はＧである、ＮＮＳ配列へ標的コドンを変化したオリゴヌクレオ
チドを使用することによる）、変化は、位置１７において４０％の確率で認めら
れた（野生型の７０％の確率、及び標的コドンの各塩基の三つの各他の塩基型の
１０％の確率を実施することによる）。

【００４８】 次のオリゴヌクレオチドは、標的コドンをＮＮＳ配列へ変化させることに使用
された： Ｌ−５２８：CACGAAGTGGTGAAGTTCNNSGATGTCNNSNNSCGCAGCNNSTGCCATCCAATCGAG （配列番号：１） Ｌ−５３０：GGGGGCTGCTGCAATNNSGAGNNSNNSGAGTGTGTGCCCACT （配列番号：２） ２番目のライブラリーでは、すべての可能性のある残基の組合せは、ＶＥＧＦ
１−１０９の位置６３、６５、及び６６で認められ、変化は、位置６４において
４０％の確率で認められた。 三番目のライブラリーでは、すべての可能性のある残基の組合せは、ＶＥＧＦ
（１−１０９）の位置４７及び４８において認められ、変化は、位置４３及び４
６において５０％の確率で認められた。四番目のライブラリーでは、すべての可
能性のある残基の組合せは、ＶＥＧＦ（１−１０９）の位置６３、６５、及び６
６において認められ、変化は、位置６４において５０％認めらた。 ＫＤＲ選択変異体を生成するために、変異領域は、示されているように５つの
群に分割され、最初の４つは、後のファージディスプレイ選択のためのライブラ
リーの構築に使用された。星印（★）で目印されたものは、野生型へ５０％偏っ
た「ソフトランダム化」、そして二つの星印で目印された残基は、「ハードラン
ダム化」されたものである（Figure ７、下部を参照のこと）。

【００４９】 ヘテロ二重鎖ＤＮＡの合成 ヘテロ二重鎖ＤＮＡは、Kunkelら, Meth. Enzym. 204:125-139(1991)を改良し
た手法に従って合成された。この方法では、突然変異誘発オリゴヌクレオチドは
、生物的に活性な共有結合的閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃ-ＤＮＡ）分子へ導入された
。この手法は、下記の段階に従って実行された。 最初に、上記のオリゴヌクレオチドは５'-リン酸化物である。これは、エッペ
ンドルフチューブ内で、２μｇのオリゴヌクレオチド、２μｌの１０ｘＴＭ緩衝
液（500mM Tris-HCl、100mM MgCl2、pH7.5）、２μｌの１０ｍＭ ＡＴＰ、及び１
μｌの１００ｍＭ ＤＴＴを混合をし、そして次に全容量が２０μｌとなるよう
に水を加えることによって調製された。２０ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（Weiss ユニット）がこの混合液へ添加され、この混合液は１時間、３７
℃でインキュベートされた。 次に、各５'-リン酸化オリゴヌクレオチドは、ファージミドテンプレート（du
t-/ung-大腸菌株ＣＪ-２３６より精製された一本鎖ＤＮＡ）へアニールされた。
これは，最初に、１μｇの一本鎖ＤＮＡテンプレート、０．１２μｇのリン酸化
オリゴヌクレオチド、及び２．５μｌの１０ｘＴＭ緩衝液（500mM Tris-HCl、100
mM MgCl2、pH7.5）を混合し、全容量が２５μｌとなるように水を加えることによ
って行われた。ＤＮＡ量は、オリゴヌクレオチドのテンプレートに対する長さの
比率が１：１００と推測される、３：１のオリゴヌクレオチドのテンプレートに
対するモル比率を与えた。混合液は、２分間、９０℃でインキュベートされ、次
に５分間、２０℃でインキュベートされた。 各５'-リン酸化オリゴヌクレオチドは、次に、アニール化混合液へ次の試薬を
加えることによって、酵素的に伸張され、ｃｃｃ−ＤＮＡ分子が形成されるよう
に結合された：１μｌの１０ｍＭ ＡＴＰ、１μｌの２５ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１．
５μｌの１００ｍＭ ＤＴＴ、３ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ、及び３ユニッ
トのＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ。この混合液は、３時間、２０℃でインキュベー
トされた。 ＤＮＡは、エタノール沈殿で精製され、１５μｌの水に再溶解された。

【００５０】 大腸菌エレクトロポレーション ライブラリーファージは、大腸菌エレクトロポレーションによって、大腸菌Ｘ
Ｌ１−ｂｌｕｅ（Stratagene, ラヨラ、カリフォルニア）として知られる大腸菌
のサプレッサー菌株中に生成された。エレクトロポレーションのために、精製ヘ
テロ二重鎖ＤＮＡは、まず、氷上の０．２-ｃｍ ギャップ エレクトロポレーシ
ョンキュベットで冷却され、１００μｌの一定分量のエレクトロコンピテント大
腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅは、氷上で解凍された。大腸菌細胞は、ＤＮＡへ添加され
、数回ピペットを上下することにより混合された。 混合液は、キュベットへ移され、ジーンパルサー（Bio-rad, ヘラクレス、 カ
リフォルニア）を使用して以下の条件でエレクトロポレーションされた：２．５
ｋＶの磁界強度、２００ｏｈｍｓの電気抵抗、及び２５ｍＦの電気容量。その直
後、１ｍｌのＳＯＣ培地（5gの細菌−酵母抽出物、20gの細菌−トリプトン、0.5
g のNaCl、0.2gのKCl；水を加えて１リッターとし、NaOHによりpHを7.0へ調整；
オートクレーブ；次に5mlのオートクレーブされた2MのMgCl₂、及び20mLのフィル
ターにより無菌化された1Mのグルコースを加える）を加え、混合液は無菌培養試
験管へ移され、３７℃で３０分間振とうして生育された。 ライブラリーの多様性を決定するために、連続希釈液は２ＹＴ（10gの細菌−
酵母抽出物、16gの細菌−トリペプトン、5gのNaCl；水を加えて１リッターとし
て、NaOHによりpHを7.0へ調整；オートクレーブ）プレート（50μg/mlのアンピ
シリンで補われた）へプレートされた。更に、培養液は、２５ｍｌの２ＹＴ、２
５ｍｇ／ｍｌのアンピシリン、Ｍ１３−ＶＣＳ（10¹⁰pfu/mL）（Stratagene、ラ
ヨラ、カリフォルニア）を含むバッフルフラスコへ移され、３７℃で一晩振とう
された。

【００５１】 培養液は、次に、１０分間、１０kpmで２℃のSorval GSA ローター（16000g）
で遠心分離された。その上清は新鮮な試験管へ移され、ファージを沈殿するため
に１／５容量のＰＥＧ−ＮａＣｌ溶液（200g/LのPEG-8000、146g/LのNaCl；オー
トクレーブ）が添加された。その上清／ＰＥＧ−ＮａＣｌ溶液は、室温で５分間
インキュベートされ、ファージペレットを得るために再び遠心分離された。 上清は容器を傾けて移され、そして廃棄された。ファージペレットは、簡単に
再遠心分離され、残存上清は取り除かれて廃棄された。ファージペレットは、１
／２０容量のＰＢＴ緩衝液（PBS, 0.2% BSA, 0.1% Tween20）へ再懸濁され、不
溶性物質は、不溶性ペレットを５分間、１５krpmで２℃のSS-34ローター（27000
g）で遠心分離することによって取り除かれて廃棄された。残存上清がファージ
を含んでいた。 上清は確保され、結合親和性によってＶＥＧＦ変異体を識別することに使用さ
れた。大腸菌のサプレッサー菌株中にファージを生成することにより、ＶＥＧＦ
（１−１０９）変異体−ｇＩＩＩ融合タンパク質はファージ表面に発現、表示さ
れ、ファージがＫＤＲ及び／又はＦｌｔ−１レセプターへ結合することが可能と
なった。

【００５２】 ライブラリーのアフィニテイー分類 各ライブラリーは、H.Jin, J. Clin. Invest., 98:969(1996)が使用した方法
に類似し、レセプター選択変異体の生成に有用であると示されている競合的結合
技法を使用して、ＫＤＲ（１−３）単量体への結合によって分類された。 競合的結合技法を実施するために、各ライブラリーは、高濃度（100nM）の競
合Ｆｌｔ−１（１−３）単量体（ジェネンテック，インコーポレイテッド）の溶
液中での存在下で、固定化ＫＤＲ（１−３）単量体（ジェネンテック，サウス
サンフランシスコ、カリフォルニア）への結合によって分類された。これは、最
初に、Maxisorp イムノプレートウェル（Nalge Nunc International, ロチェス
ター、ニューヨーク）の各ウェルを、８０μｌのコーティング緩衝液（pH9.6の5
0mM炭酸ナトリウム）に含まれる２−５μｇ／ｍｌのＫＤＲ（１−３）単量体で
コーティングし、４℃で一晩インキュベートすることで完遂された。必要とされ
るウェルの数は、ライブラリーの多様性に依存した。コーティング溶液は、２０
０μｌのＰＢＳに含まれる０．２％ＢＳＡによって１時間に渡って取り除かれて
ブロックされた。同時に、負のコントロールとして、同じ数のコーティングされ
ていないウェルがブロックされた。 ウェルは、ブロック緩衝液を取り除くために、ＰＴ緩衝液（ＰＢＳ、0.05% Tw
een20）によって８回洗浄された。ＰＢＴ緩衝液（PBS, 0.2% BSA, 0.1% Tween20
）に含まれる１００μｌのライブラリーファージ溶液の一定量は、次に、各コー
ティングされた及びされていないウェルへ加えられた。Ｆｌｔ−１（１−３）単
量体は、ファージ溶液とともに加えられた。ウェルは、室温で２時間に渡って穏
やかに振とうされた。 次に、ウェルは、ファージ溶液とすべてのＦｌｔ−１結合ファージを除くため
にＰＴ緩衝液（PBS, 0.05% Tween20）によって１０回洗浄された。ＫＤＲ−結合
ファージは、ウェルを１００μｌのｐＨ２の０．２ｍＭグリシンで、室温で５分
間インキュベートすることによって、ウェルから溶出された。ＫＤＲ−結合ファ
ージを収集するために、グリシン溶液はエッペンドルフチューブへ移され、ｐＨ
８．０の１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌによって中和された。

【００５３】 続いて、溶出ファージ溶液の半分を活発に生育中の大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ（
OD₆₀₀<10）の１０倍等量へ加え、３７℃で３０分間振とうすることによって、Ｋ
ＤＲ−結合ファージを再増殖した。次に、溶出ファージ数を定量するために、培
養液の連続希釈液を２ＹＴ／ａｍｐプレート（50mg/mlのアンピシリンで補充さ
れた２ＹＴ）へプレートした。溶出ファージ数は、ＫＤＲ（１−３）単量体で被
覆されたウェル、及び非被覆コントロールウェルの両方について定量された。 プレートからの培養は、２ＹＴ／ａｍｐ／ＶＣＳ（50mg/mlのアンピシリン及
び10¹⁰pfu/ml M13-VCSで補充された2YT）の１０倍等量へ移され、３７℃で一晩
の振とうでインキュベートされた。そして、ファージは単離された。 再増殖したファージは、再び、高濃度（100nM）の競合Ｆｌｔ−１（１−３）
単量体の存在下における固定化ＫＤＲ（１−３）単量体への結合によって分類さ
れ、続いてＦｌｔ−１結合ファージを洗い流し、ＫＤＲ結合ファージを再増殖し
た。アフィニティ−分類手法は、濃縮比率を計算することによってモニターされ
、濃縮比率が最高値（約５から６選別周期）に達するまで繰り返された。 濃縮比率とは、ＫＤＲ（１−３）単量体によって被覆されたウェルより溶出し
たファージ数を非被覆コントロールウェルへ結合しているファージ数で割ったも
のである。１より大きな比率は、通常は、ファージが、特に、ＫＤＲ（１−３）
タンパク質への結合において不活性であり、従って、添加されたＦｌｔ−１（１
−３）単量体への結合に対しては耐性であることを示す。濃縮比率が最高値に達
した場合には、個々のクローンは特定の結合について分析された。

【００５４】 ファージＥＬＩＳＡ ＶＥＧＦ１−１０９変異体−ｇＩＩＩタンパク質を表面に持つファージのＫＤ
Ｒ（１−３）への特異的な結合は、Muller ら，PNAS, 94:7192(1997)に記載のフ
ァージＥＬＩＳＡを使用して測定された。ファージＥＬＩＳＡでは、マイクロタ
イタープレート（Maxisorp, Nunc-Immunoplate, Nalgc Nunc International, ロ
チェスター，ニューヨーク）を、ｐＨ９．６で５０ｍＭ 炭酸ナトリウム中の精
製ＫＤＲ（１−３）単量体又はＦｌｔ−１（１−３）単量体（5μg/ml）で被覆
し、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、０．５％ＢＳＡでブロックし
た。次に、ほぼ飽和した濃度の競合レセプター（ＫＤＲ（１−３）単量体又はＦ
ｌｔ−１（１−３）単量体）をともなうＶＥＧＦ１−１０９変異体の連続希釈液
を、１００μｌの緩衝液（PBS, 0.5% Tween20, 0.5% BSA）中のウェルへ添加し
た。平衡化の後、プレートは洗浄され、そして結合しているファージミドを、製
造者指示書に従って、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼ共役抗-Ｍ１３抗体（
ファルマシア バイオテク，Piscataway, ニュージャージー）によって染色した
。親和性（EC50）は、ファージミド結合の最高値の半分となる競合レセプターの
濃度として計算された。 アフィニティ−分類より得られ、Ｆｌｔ−１（１−３）単量体へ耐性を示した
ＶＥＧＦ１−１０９変異体の配列は、ファージミドｃＤＮＡの配列から決定され
た。

【００５５】 ＶＥＧＦ１−１０９変異体の精製 ＶＥＧＦ１−１０９変異体タンパク質は、大腸菌（27c7）の振盪フラスコ培養
からの牽引体として単離された。変異タンパク質のリフォールディングは、Yiha
iら, J.Biol.Chem..271:3154-3162(1996)に記載のように行われた。変異体は、
ｐＨ６で１ｍＭ酸化グルタチオンを加えた６Ｍグアニジン塩酸と混合、そしてア
ンフォウルドされ、２ｍＭ還元グルタチオンを含む２Ｍ尿素及び２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−塩酸に含まれる０．５ｍＭ酸化グルタチオンに対して、ｐＨ８で１０時間
に渡って透析された。尿素は、４℃で一晩、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ８
）の２０倍容量に対してゆっくりと透析することで除かれた。各変異体は、ミス
フォウルドされた単量体の痕跡を除くために、更に、アニオン交換（ファルマシ
ア HiTrap Q, 1ml）（ファルマシア バイオテク，Piscataway, ニュージャージ
ー）によって精製された。純変異体産物の同一性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量
分析法によって確認された。

【００５６】 表２は、ＶＥＧＦ変異体識別符号、導入されたアミノ酸置換、及び小各々の置
換されたアミノ酸をコードするコドンを示す。ある変異体識別符号（例えばLK-V
RB-1s）の次の星印（★）は、特に好ましい結合親和性及び／又は生物活性を明
示した種々のＶＥＧＦ変異体を示す。「ｓ」（例えばLK-VRB-1s）を含む変異体
識別符号は、ＶＥＧＦの１−１０９切断型で構成され、表中に提供され詳述され
た変異体を含むＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを示す。「ｆ」（例えばLK-VRB-1f
）を含んだ変異体識別符号は、ＶＥＧＦの全長１−１６５型を構成し、表に提供
され詳述された変異体を含んだＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを示す。変異体配列
の変異の命名及び同定は、命名の協定に従う。例えば、表２の最初のエントリー
では、変異は「Ｍ１８Ｅ」に相当する。これは、天然ＶＥＧＦ配列の１８位置（
Leung ら，上掲 及びHouckら，上掲 に報告されている天然ヒトＶＥＧＦのアミ
ノ酸配列の番号化を使用した）が、ＶＥＧＦ変異体を調製するために、その位置
の天然メチオニン（Ｍ）がグルタミン酸残基へ置換されるように変異されたこと
を意味する。「ヌクレオチド配列」に相当する表２の欄は、各々のアミノ酸変異
をコードする（5'→3'）各々のコドンを提供する。例えば、表２の最初のエント
リーでは、Ｍ１８Ｅ変異は、コドン「ＧＡＧ」によってコードされている。

【００５７】

【００５８】 実施例２： ＶＥＧＦ変異体のＫＤＲレセプターへの結合 ＶＥＧＦ（１−１０９）変異体及びＶＥＧＦ１６５変異体（実施例１に記載）
のＫＤＲレセプターへの結合は、ビオチン化天然ＶＥＧＦ（８−１０９）のＫＤ
Ｒレセプターへの結合を阻害する変異体の能力を測定することによって評価され
た。評価されたＶＥＧＦ変異体は、表２に示された変異を含んでいた。 レセプター結合アッセイ法は、９６−ウェルのイムノプレート（Maxisorp, Nu
nc-Immunoplate, Nalgc Nunc International, ロチェスター，ニューヨーク）に
て実行された。各ウェルは、ｐＨ９．６で５０ｍＭ 炭酸塩緩衝液中の、ＭＡＫ
Ｄ５（ジェネンテック，サウス サンフランシスコ、カリフォルニア）として知
られているＫＤＲに対する８μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を含む１００μｌ
の溶液で被覆され、４℃で一晩インキュベートされた。上清は廃棄され、ウェル
は洗浄緩衝液（PBS中の0.05% Tween20）で３回洗浄され、プレートはブロック緩
衝液（PBS中の0.5% BSA, 0.01% チメロサール）によって室温で１時間ブロック
された（ウェル当たり150μｌ）。上清は廃棄され、ウェルは洗浄された。

【００５９】 連続希釈された天然ＶＥＧＦ（８−１０９）、天然ＶＥＧＦ（１−１６５）、
天然ＶＥＧＦ（１−１０９）変異体、又はＶＥＧＦ１６５変異体（単量体で0.16
-168nM）は、アッセイ緩衝液（ PBS中の0.5%BSA,0.05% Tween20）中で、ビオチ
ン化天然ＶＥＧＦ（８−１０９）（84nM）及びＫＤＲ（１−３）（1μg/ml）と
室温で２時間インキュベートされた。この混合溶液（100μｌ)の一定量は、予め
被覆されたマイクロタイターウェルに添加され、プレートは室温で１時間インキ
ュベートされた。マイクロタイタープレートに結合したＫＤＲ（１−３）及びビ
オチン化天然ＶＥＧＦの複合体は、ウェルをペルオキシダーゼラベル化ストレプ
トアビジン（0.2mg/ml, シグマ、セントルイス、ミズーリー）と室温で３０分間
インキュベートすることによって検出された。次に、ウェルは、３，３'，５，
５'−テトラメチルベンジジン（0.2グラム／リッター；Kirkegaard & Perry Lab
oratories, ゲーサーズバーグ、メリーランド）と室温で約１０分間インキュベ
ートされた。吸光度は、Vmaxプレートリーダー（Molecular Devices, Menlo Par
k, CA）上で450nmにおいて読んだ。

【００６０】 滴定曲線は、4-変数非線形回帰カーブフィッティングプログラム（KaleidaGra
ph, Synergy Software, Reading, PA）でフィッティングさせた。天然ＶＥＧＦ
（８−１０９）の滴定曲線の中間点吸収に相当するＶＥＧＦ変異体の濃度は計算
され、次いで天然ＶＥＧＦ滴定曲線の中間点吸収に対応する天然ＶＥＧＦの濃度
で除した（Figure 2を参照のこと）。 ＶＥＧＦ（１−１０９）変異体及びＶＥＧＦ１６５変異体のために決定された
結合親和性が、表３に示されている。多くのＶＥＧＦ変異体は、天然ＶＥＧＦ（
８−１０９）の結合の約２倍以内である、ＫＤＲレセプターへの結合を示した。

【００６１】 実施例３： ＶＥＧＦ変異体のＦｌｔ−１レセプターへの結合 ＶＥＧＦ（１−１０９）変異体及びＶＥＧＦ１６５変異体（実施例１に記載）
のＦｌｔ−１レセプターへの結合は、ビオチン化天然ＶＥＧＦ（８−１０９）の
Ｆｌｔ−１レセプターへの結合を阻害する変異体の能力を測定することによって
評価された。評価されたＶＥＧＦ変異体は、表２に示された変異を含んでいた。 レセプター結合アッセイ法は、９６−ウェルのイムノプレート（Maxisorp, Nu
nc-Immunoplate, Nalgc Nunc International, ロチェスター，ニューヨーク）に
て実行される。各ウェルは、ｐＨ９．６で５０ｍＭ 炭酸塩緩衝液中の、ヒトＩ
ｇＧ Ｆｃ（Jackson ImmunoResearch, West Grove, ペンシルバニア）に対する
２μｇ／ｍｌのウサギＦ（ａｂ'）_２を含む１００μｌの溶液で被覆され、４℃
で一晩インキュベートされた。次に上清は廃棄され、ウェルは洗浄緩衝液（PBS
中の0.05% Tween20）で３回洗浄され、プレートはブロック緩衝液（PBS中の0.5%
BSA, 0.01% チメロサール）によって室温で１時間ブロックされた（ウェル当た
り150μｌ）。上清は廃棄され、ウェルは洗浄された。 ウェルは、アッセイ緩衝液（PBS中に0.5%BSA, 0.05% Tween20）中にＦｌｔ−
ＩｇＧ（キメラFlt-ヒト Fc分子）を５０ｎｇ／ｍｌで含む１００μｌの溶液で
満たされた。ウェルは、室温で１時間インキュベートされ、洗浄緩衝液（PBS中
に0.05% Tween20）で３回洗浄された。

【００６２】 連続希釈された天然ＶＥＧＦ（８−１０９）、天然ＶＥＧＦ１６５、天然ＶＥ
ＧＦ（１−１０９）変異体、又はＶＥＧＦ１６５変異体（単量体で0.03-33nM）
は、アッセイ緩衝液（ PBS中の0.5%BSA,0.05% Tween20）中で、ビオチン化天然
ＶＥＧＦ（８−１０９）（0.21nM）又はビオチン化天然ＶＥＧＦ１６５（0.66nM
）と混合された。この混合溶液（100μｌ)の一定量は、予め被覆されたマイクロ
タイターウェルに添加され、プレートは室温で２時間インキュベートされた。マ
イクロタイタープレートに結合したＦｌｔ−ＩｇＧ及びビオチン化天然ＶＥＧＦ
の複合体は、ウェルをペルオキシダーゼラベル化ストレプトアビジン（0.2mg/ml
, シグマ、セントルイス、ミズーリー）と室温で３０分間インキュベートするこ
とによって検出された。次に、ウェルは、３，３'，５，５'−テトラメチルベン
ジジン（0.2グラム／リッター；Kirkegaard & Perry Laboratories, ゲーサーズ
バーグ、メリーランド）と室温で約１０分間インキュベートされた。吸光度は、
Vmaxプレートリーダー（Molecular Devices, Menlo Park, CA）上で450nmにおい
て読んだ。

【００６３】 滴定曲線は、4-変数非線形回帰カーブフィッティングプログラム（KaleidaGra
ph, Synergy software, Reading, PA）でフィッティングさせた。天然ＶＥＧＦ
（８−１０９）の滴定曲線の中間点吸収に相当するＶＥＧＦ変異体の濃度は計算
され、次いで天然ＶＥＧＦ滴定曲線の中間点吸収に対応する天然ＶＥＧＦの濃度
で除した。 ＶＥＧＦ（１−１０９）変異体及びＶＥＧＦ１６５変異体のために決定された
結合親和性が、表３に示されている。多くのＶＥＧＦ変異体は、天然ＶＥＧＦ（
８−１０９）の結合より２，０００倍より低い値より高いＦｌｔ−１レセプター
への結合を示した。表３に報告されている、あるＶＥＧＦ変異体（例えば，LK-V
RB-7s^★及びLK-VRB-8s^★）のＦＬＴ−１レセプターについての相対的結合親和性
は、検出可能な結合がＥＬＩＳＡアッセイ法の感度を越えていたので、ｎＭ値で
は報告されていない。

【００６４】

【００６５】 実施例４： ＶＥＧＦ（１−１０９）変異体によるＫＤＲレセプターリン酸化の
誘発 ＶＥＧＦ変異体の活性を決定するために、変異体のＫＤＲレセプターリン酸化
の誘発する能力は、ＫＩＲＡアッセイ法によって測定された。評価されたＶＥＧ
Ｆ変異体は、表２に見出される変異を含んでいた。特に、次のＶＥＧＦ（１−１
０９）変異体が研究された：LK-VRB-1s^★；LK-VRB-2s^★；LK-VRB-3s；LK-VRB-4s
；LK-VRB-5s；及びLK-VRB-6s。 連続希釈ＶＥＧＦ（１−１０９）変異体（0.01-10nM）は、Ｎ-末端にｇＤタッ
グを有するＫＤＲレセプター（ジェネンテック、サウス サン フランシスコ、カ
リフォルニア）を発現するＣＨＯ細胞へ加えられた。細胞は、ｐＨ７．２で０．
５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓに
よって溶解され、溶解液中のリン酸化ｇＤ−ＫＤＲレセプターは、ＥＬＩＳＡを
実行することで数量化された。 ＥＬＩＳＡでは、９６−ウェルのイムノプレート（Maxisorp, Nunc-Immunopla
te, Nalgc Nunc International, ロチェスター，ニューヨーク）が使用された。
各ウェルは、ｐＨ９．６で５０ｍＭ 炭酸塩緩衝液中の、３ｃ８（ジェネンテッ
ク、サウス サン フランシスコ、カリフォルニア）として知られるｇＤに対する
１μｇ／ｍｌのマウスモノクローナルを含む１００μｌの溶液で被覆され、４℃
で一晩インキュベートされた。上清は廃棄され、ウェルは洗浄緩衝液（PBS中の0
.05% Tween20）で３回洗浄され、プレートはブロック緩衝液（PBS中の0.5% BSA,
0.01% チメロサール）によって室温で１時間ブロックされた（ウェル当たり150
μｌ）。次に、上清は廃棄され、ウェルは洗浄された。

【００６６】 溶解液（100μl）の一定量は、予め被覆されたウェルに加えられ、室温で２時
間インキュベートされた。リン酸化ｇＤ−ＫＤＲレセプターは、ウェルを４Ｇ１
０（0.05mg/ml）（Upstate Biotechnology, レークプラシッド，ニューヨーク）
として知られているホスホチロシンに対するビオチン化モノクローナル抗体と室
温で２時間インキュベートし、続いてウェルをペルオキシダーゼラベル化ストレ
プトアビジン（0.2mg/ml, シグマ、セントルイス、ミズーリー）と室温で１時間
インキュベートすることによって検出された。次に、ウェルは、３，３'，５，
５'−テトラメチルベンジジン（0.2グラム／リッター；Kirkegaard & Perry Lab
oratories, ゲーサーズバーグ、メリーランド）と室温で約１５−２０分間イン
キュベートされた。吸光度は、Vmaxプレートリーダー（Molecular Devices, Men
lo Park, CA）上で450nmにおいて読んだ。 滴定曲線は、4-変数非線形回帰カーブフィッティングプログラム（KaleidaGra
ph, Synergy software, Reading, PA）でフィッティングさせた。天然ＶＥＧＦ
の滴定曲線の中間点吸収に相当するＶＥＧＦ変異体の濃度は計算され、次いで天
然ＶＥＧＦ滴定曲線の中間点吸収に対応する天然ＶＥＧＦの濃度で除した（Figu
re 3を参照のこと）。 ＶＥＧＦ変異体のリン酸化誘発活性は、表４に提供されている。ＶＥＧＦ変異
体は、天然ＶＥＧＦ（８−１０９）の活性の２倍以内のリン酸化誘発活性を示し
た。

【００６７】

【００６８】 実施例５： 内皮細胞増殖アッセイ ＶＥＧＦ（１−１０９）又はＶＥＧＦ１６５変異体（一つのVEGF165変異体、L
K-VRB-2fと同じ）の分裂促進活性は、標的細胞としてヒト臍静脈内皮細胞（HUVE
C）（セル システム、Kirkland、ワシントン）を使用して決定された。評価され
たＶＥＧＦ変異体は、表２中の変異を含んでいた。特に、次のＶＥＧＦ（１−１
０９）変異体が研究された：LK-VRB-1s^★；LK-VRB-2s^★；LK-VRB-7s^★；及びLK-
VRB-8s^★。 ＨＵＶＥＣは、ＣＳ−Ｃ完全生育培地（セル システム、Kirkland、ワシント
ン）中の酸性ＦＧＦなどの成長因子で維持及び生育される初代株化細胞である。
アッセイの準備のためには、初期継代（５継代より早い）の細胞は、洗浄されて
９６−ウェルプレート（ウェル当たり100μｌに3000細胞）に接種され、すべて
の成長因子を除くが２％のダイアフィルトレーションされた胎児ウシ血清（Gibc
oBRL, Gaithersburg, MD)で補充されたＣＳ−Ｃ培地中で、新鮮飢餓培地と交換
する前に、５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で２４時間に渡って飢餓
状態にした。同じ飢餓培地で希釈された幾つかの濃度（約10nMから0.01nM）のＶ
ＥＧＦ変異体は、ウェル当たりの容量が１５０μｌとなるようにウェルへ加えら
れ、１８時間インキュベーションされた。

【００６９】 ＶＥＧＦ変異体によって誘発されたＤＮＡ合成を測定するために、^３Ｈ−チミ
ジン（Amersham Life Science, Arlington Heights, IL）は、０．５μＣｉ／ウ
ェルで各ウェルへ加えられ、細胞が放射能を取り込むように２４時間に渡ってイ
ンキュベートされた。そして、細胞はその他の９６−ウェルフィルタープレート
上へ収集され、過度のラベル（放射能）は、プレートをトップカウント（Packar
d, Meriden, Conneticut）へのせる前に洗い流された。 細胞は、トップカウントによって数えられた。測定されたカウント毎分（CPM
）は、活性を比較するために、個々の変異体の濃度に対してプロットされた（Fi
gure4）。 ＶＥＧＦ変異体の細胞増殖能力は、表５に示されている。一般的に、ＶＥＧＦ
変異体は、天然変異体（８−１０９）の能力の２倍以内の細胞増殖能力を示した
。

【００７０】

【００７１】 実施例６： ＫＤＲ及びＦＬＴ−１レセプターへのＶＥＧＦ変異体の結合を測定
するためのＲＩＡアッセイ ＲＩＡアッセイは、天然ＶＥＧＦ１６５又は天然ＶＥＧＦ（８−１０９）と比
較される、ＫＤＲレセプター及びＦＬＴ−１レセプターへの幾つかのＶＥＧＦ変
異体（表２に記載）の相対的結合親和性を調べるために、Mullerら，PNAS, 94:
7192-7197(1997)に記載のように原則的に実施された。その結果は、下記の表６
に示されている。

【００７２】

【００７３】 実施例７： ＫＤＲ−又はＦＬＴ−１−トランスフェクト細胞へのＶＥＧＦ変異
体の結合 LK-VRB-2s^★の結合特性（実施例１、表２を参照のこと）は、更に、レセプタ
ー−トランスフェクト細胞結合アッセイによって調べられた。ＫＤＲ又はＦｌｔ
−１トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞は、Fuhら，J.Biol.Chem., 273:11187-1
1204(1998)に記載されているように調製された。トランスフェクト細胞は、１０
％ＦＢＳ及び４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（GibcoBRL）で補充されたＦ１２培地
中で維持された。結合アッセイでは、翌日に集密的になるよう１２−ウェルプレ
ートへ１ｘ１０^６／ウェルでプレートされた。そして、^１２５Ｉ−ＶＥＧＦ（１
−１０９）（標準クロラミン−Ｔ法によって調製）を加えて非レベル化ＶＥＧＦ
変異体の濃度を増やす前に、細胞は、１％ＢＳＡを含むHank's緩衝化生理的食塩
水（HBS）によって１時間洗浄及びブロックされた。５０ｐＭ及び１０ｐＭのラ
ベル化ＶＥＧＦ（１−１０９）は、各々ＫＤＲ及びＦｌｔ−１細胞結合に使用さ
れた。プレートは、４℃で３時間インキュベートされ、そして０．５％ＢＳＡを
含むＨＢＳで２回洗浄された。結合、レベル化ＶＥＧＦは、洗浄細胞を１Ｎ Ｎ
ａＯＨに溶解することによって収集され、そしてガンマーカウンター（Isodata,
ICN）でカウントされた。 Figure５に示されているように、LK-VRB-2s^★は、天然ＶＥＧＦ結合に類似し
たＫＤＲを発現するトランスフェクト細胞への結合を示した。しかし、LK-VRB-2
s^★は、Ｆｌｔ−１でトランスフェクトされた細胞へは、約２００倍減少した結
合を示した（Figure６を参照のこと）。

【００７４】 実施例８： Ｆｌｔ−１特異的ＶＥＧＦ変異体の生成及び選択 アラニンスキャンニング（Well, Methods Enzymol., 202: 390-411(1991)）を
、個々のＶＥＧＦ残基のＫＤＲ対Ｆｌｔ−１結合の相対的重要性を定義するため
に使用した。突然変異誘発の為に選択された残基は、Ｐｈｅ４７及びＧｌｕ６４
のみならず、以前、ＫＤＲ−結合決定基（Mullerら, Proc. Natl. Acad. Sci.,
94:7192-7197(1997)と同定された、ＶＥＧＦのレセプター結合ドメインとＦｌｔ
−１のドメイン２の間の複合体の結晶構造に観察された２２の接触残基（Wiesma
nn ら、Cell, 91:695-704(1997)）を含んだ。部位特異的突然変異誘発は、Kunke
lら，Methods Enzymol., 204:125-139(1991)の方法を使用し、ＶＥＧＦのレセプ
ター結合ドメイン（残基１から１０９）をバックグラウンドに実施された。すべ
ての変異は、ＤＮＡシーケンシングによって確かめられた。次のＶＥＧＦ残基は
、個々にアラニンへ変異された：Ｌｙｓ１６、Ｐｈｅ１７、Ｍｅｔ１８、Ｔｙｒ
２１、Ｇｌｎ２２、Ｔｙｒ２５、Ｉｌｅ４３、Ｉｌｅ４６、Ｐｈｅ４７、Ｌｙｓ
４８、Ａｓｐ６３、Ｇｌｕ６４、Ｇｌｙ６５、Ｌｅｕ６６、Ｇｌｎ７９、Ｍｅｔ
８１、Ｉｌｅ８３、Ｈｉｓ８６、Ｇｌｎ８９、Ｉｌｅ９１、Ｌｙｓ１０１、Ｇｌ
ｕ１０３、Ａｒｇ１０５、Ｐｒｏ１０６。これらの残基は、ＶＥＧＦのレセプタ
ー結合ドメイン（残基１から１０９：Keytら，J.Biol.Chem., 271:7788-7795(19
96)；Mullerら，Proc. Natl. Acad. Sci., 94:7192-7197(1997)）をバックグラ
ウンドに、個々にアラニンへ変異された。

【００７５】 各変異タンパク質は、生成そして均一に精製され、酵素結合免疫吸着アッセイ
法（ELISA）は、ＫＤＲのドメイン１から３及びＦｌｔ−１（これら３つのドメ
インは、すべてのVEGF-結合部位を含む；Wiesmann ら、Cell, 91:695-704(1997)
）；Fuhら, J. Biol. Chem., 273:11197-11204(1998)）の結合親和性を測定する
ために使用された。 ＥＬＩＳＡでは、マイクロタイタープレートは、５０ｍＭ 炭酸ナトリウム（p
H9.6）に含まれる精製ＶＥＧＦ（８−１０９）（5μg/ml）によって、４℃で一
晩被覆された。プレートは、０．５％ ＢＳＡでブロックされ、競合ＶＥＧＦア
ラニン変異体の連続希釈液及びビオチン-ラベル化レセプター（KDR(1-3)又はFlt
1(1-3)）の亜飽和濃度（100pM）が１００μｌの結合緩衝液（PBS中の0.5% Tween
20,0.5% BSA）中のウェルへ加えられた。１時間後、プレートは洗浄され、結合
タンパク質は、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ共役（ファルマ
シア）で染色され、アッセイされた。親和性は、ＩＣ_５０で評価された：ＫＤＲ
（１−３）又はＦｌｔ１（１−３）の濃度でタンパク質の結合を５０％ブロック
する。 このアッセイの結果は、Figure７に示されている。各残基について記載されて
いるのは、変異体のＩＣ_５０の野生型ＶＥＧＦ（８−１０９）のＩＣ_５０に対す
る比率で、変異体の結合を野生型タンパク質の結合へ比較した場合の減少割合を
表している。野生型ＶＥＧＦ（８−１０９）のＩＣ_５０は、丸括弧で示されてい
る。太字で示されている残基は、Ｆｌｔ−１選択変異体の生成に使用された。

【００７６】 Ｆｌｔ−１結合のためのＶＥＧＦ変異体の同時分析は、類似で重なり合うレセ
プター結合領域を示し、主に２０ｓへリックス及び６０ｓループに位置し、Ｆｌ
ｔ−１−結合決定基はＰｈｅ１７、Ｔｙｒ２１、Ｇｌｎ２２、及びＬｅｕ６６で
ある（Figure７）。対照的に、重要なＦｌｔ−１−結合決定基の変異体は、また
、ＫＤＲに対する親和性をかなり低下させる（Figure７）。 Ｆｌｔ−１レセプターに対して高い選択を持つＶＥＧＦ変異体は、ＫＤＲへ大
きな影響を与えるがＦｌｔ−１結合へはそうではない４つの変異体を組み合わせ
ることによって生成される。Ｉｌｅ４３、Ｉｌｅ４６、Ｇｌｎ７９又はＩｌｅ８
３のアラニンへの変異は、これら残基の側鎖が、ＫＤＲへの堅い結合においては
重要であるがＦｌｔ−１結合においては重要ではないことを示した。変異体（こ
こにおいては「Flt-sel」に相当する）は、部位特異的突然変異誘発法（Kunkel
ら, Meth. Enzymol., 204: 125-139(1991) ）を使用した位置Ｉｌｅ４３、Ｉｌ
ｅ４６、Ｇｌｎ７９及びＩｌｅ８３のアラニン置換によって構築される。この特
定のＦｌｔ−ｓｅｌ変異体は、また、上記の実施例１（及び表２に例示された）
に記載された命名法に従って、識別子、Ｉ４３Ａ／Ｉ４６Ａ／Ｑ７９Ａ／Ｉ８３
Ａによって表される。位置４３、４６、７９及び８３におけるこれら４つのアラ
ニン置換へ相当するコドンは、各々ＧＣＣ／ＧＣＣ／ＧＣＧ／ＧＣＣである（上
記の実施例１に記載及び表２に例示の命名法に従う）。

【００７７】 Ｉ４３Ａ／Ｉ４６Ａ／Ｑ７９Ａ／Ｉ８３Ａ Ｆｌｔ−ｓｅｌ変異体の特性及び
生物活性を調べるために種々のアッセイが行われた。例えば、定量的結合測定は
、上記の実施例６に記載されているような可溶性ラジオイムノレセプター-結合
アッセイ（ＲＩＡ）を使用して行われた。このアッセイでは、天然ＶＥＧＦ（８
−１０９）は、ＫＤＲ及びＦｌｔ−１に対する親和性が、各々０．５ｎＭ及び０
．４ｎＭであった（Figs.８Ａ及び８Ｂ）。Ｆｌｔ−ｓｅｌは、このアッセイに
おいて、少なくとも４７０倍の低下したＫＤＲ-結合親和性が見出された（Ｆｉ
ｇ．８Ａ）。若干驚いたことには、ＥＬＩＳＡ（上記に記載）で、個々の点変異
からＦｌｔ−１-結合の僅かな低下が観察されたので、Ｆｌｔ−ｓｅｌに対する
Ｆｌｔ−ｓｅｌ変異体の親和性は、天然タンパク質の親和性と本質的に同一であ
った（Ｆｉｇ．８Ｂ）。 Ｆｌｔ−ｓｅｌ変異体の活性は、また、実施例７に記載の３Ｔ３トランスフェ
クト細胞-結合アッセイで試験された。ＲＩＡのデータと一致し、Ｆｌｔ−ｓｅ
ｌは、ＫＤＲ-トランスフェクト３Ｔ３細胞へ検出可能な結合を示さず、Ｆｌｔ
−１トランスフェクト細胞への結合が僅かに向上した（Ｆｉｇ．５及び６）。 Ｆｌｔ−ｓｅｌ変異体の活性は、また、実施例４に記載のＫＩＲＡアッセイで
試験された。その結果は、Figure９に示されている。 Ｆｌｔ−ｓｅｌ変異体の活性は、実施例５に記載のＨＵＶＥＣ増殖アッセイで
更に試験された。その結果は、Figure１０に示されている。

【００７８】 実施例９： マトリックスメタロプロテアーゼ９アッセイ ヒト大動脈平滑筋細胞にて発現されるＦｌｔ−１の活性化続くマトリックスメ
タロプロテアーゼ９の分泌のアッセイが行われた（Wang 及びKeiser, Circ. Res
., 83:832-840(1998)）。ヒト大動脈平滑筋細胞（ASMC）（Clonetics）は、１０
％胎児ウシ血清の存在下の６−ウェルポリスチレンプレート（Becton-Dickinson
）で、５％ＣＯ_２及び９５％外気中のＳＭ２培地において３７℃で維持された。
細胞が９０％の集密に達した時に、細胞は、０．２％のウシ血清アルブミン（BS
A）を含む無血清培地中で２４時間生育を停止された。ＶＥＧＦ（１−１０９）
、ＰｌＧＦ（R&D Systems、ミネアポリス、ミネソタ州）又はＶＥＧＦ（１−１０
９）変異体（LK-VRB-2s^★)及びＦｌｔ−ｓｅｌ(上記に記載）は、最終濃度が４
０ｎｇ／ｍｌとなるよう加えられ、細胞は、０．２％のＢＳＡを含む無血清培地
において更に２４時間培養された。そして、馴化培地中のゼラチナーゼは、酵素
電気泳動法で分析された。培養液は収集そして濃縮され、還元剤を含まず又は加
熱せず、２５μｌ一定量の培養液は２ｘのサンプル緩衝液と混合された。サンプ
ルは、電気泳動のために、０．１％ゼラチン（Novex, サンディエゴ、カリフォ
ルニア州）を含む１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷された。標準的な分子量
マーカーの使用に加えて、ＭＭＰ−２及び−９酵素電気泳動標準物（Chemicon、
Temecula, カリフォルニア）がゼラチナーゼの標準物として利用された。電気泳
動の後、タンパク質は、ゲルのインキュベーションを再生緩衝液中で室温で３０
分間、及び展開緩衝液中で室温で一晩行うことによって再生された。ゲルは、０
．２５％クーマシーブリリアントブルー（シグマ）で染色された。ゼラチナーゼ
活性は、脱染色の後に薄く染色されている又は明瞭なバンドとして同定された。 結果は、Ｆｉｇ．１１に示されている。示されているのは、２つの独立した実
験の内の１つの代表的な酵素電気泳動像である。倍数変化は、ＶＥＧＦ（１−１
０９）−、ＶＥＧＦ（１−１０９）、変異体−、又はＰｌＧＦ−処理群対溶媒処
理（PBS）コントロールの相対的バンド密度を表す。LK-VRB-2s^★とは対照的に、
Ｆｌｔ−ｓｅｌは、天然ＶＥＧＦ（１−１０９）又はＰｌＧＦの活性と比較した
場合には、本アッセイにおいては完全に活性であった（Ｆｉｇ．１１）。

【００７９】 実施例１０： ＭＡＰキナーゼの活性化 天然ＶＥＧＦ、ＫＤＲ−選択ＶＥＧＦ変異体、又はＦｌｔ−選択ＶＥＧＦ変異
体が、分裂促進シグナルを媒介することが可能かどうかを決定するためにアッセ
イが行われた。 ４−７継代ＨＵＶＥＣ細胞（Cell Systems、Kirkland, WA）は、ゼラチン被覆
シャーレ上の１０％の胎児子ウシ血清及び成長因子を含むCell System's完全培
地（AZ0-500）にて生育され、０．２％血清中で１４時間飢餓状態され、静止状
態にされた。静止状態のＨＵＶＥＣ細胞は、未処理のまま或いは天然ＶＥＧＦ（
１−１６５）又はＶＥＧＦ変異体（全長165配列を含むFlt-1選択変異体、及び上
記実施例８の「短型」（1-109）Flt-selのために記載のアラニンアミノ置換I43A
/I46A/Q79A/I83A；又はLK-VRB-2f（実施例１；表２を参照のこと）に相当するＫ
ＤＲ−選択変異体（同じく全長１６５配列を含む）（50ng/ml又は10ng/mlのどち
らかの濃度で））で５分間刺激されるかのどちらかであった。天然ＶＥＧＦ（１
−１６５）及びＶＥＧＦ変異体の両方が大腸菌で発現され、Keytら，J. Biol. C
hem., 271:5638-5646(1996)に記載のように精製された。そして、ＨＵＶＥＣ細
胞は、０．１ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム、５ｍＭ パラ-ニトロフェニル
リン酸、１０ｍＭ フッ化ナトリウム、 ０．５マイクロモル オカダ酸及びプロ
テアーゼインヒビター反応混液（Roche MB1836145）を含む０．５−１ｍｌ ＲＩ
ＰＡ緩衝液中で溶解された。次に、ウェスタンブロット分析が行われ、抗-ホス
ホＥＲＫ抗血清（Promega）を使用してリン酸化ＥＲＫ１又はＥＲＫ２が調べら
れた。 ＫＤＲ−選択ＶＥＧＦ変異体，LK-VRB-2fによる活性化は、ＨＵＶＥＣ細胞中
のＥＲＫ１及びＥＲＫ２のリン酸化を誘因した（Ｆｉｇ．１２Ａ）。リン酸化の
広がりは、天然ＶＥＧＦ（１−１６５）を使用して得られたリン酸化からは区別
できない。Ｆｉｔ−１選択ＶＥＧＦ変異体（最高濃度が使用された）は、かろう
じて検出可能なＥＲＫ２のリン酸化を引き起こした。この研究に使用されている
ホモ二量体ＶＥＧＦ変異体は、レセプターのヘテロ二量体の形成を促進すること
は期待されない。従って、Ｆｌｔ−１は、ＭＡＰキナーゼ活性化へ貢献しない。

【００８０】 ＶＥＧＦは、以前、ストレス-活性化 ｐ３８ＭＡＰキナーゼ（Rousseauら, On
cogene, 15:2169-2177(1997)；Yuら, J.Cell. Phys., 178:235-246(1999)）を刺
激すると報告された。どのＶＥＧＦレセプターが関与しているのかを分析するた
めに、ｐ３８のリン酸化状態が、天然ＶＥＧＦ（１−１６５）、Ｆｌｔ−１選択
変異体、又はLK-VRB-2f（上記に記載）をともなう刺激の後に調べられた。 ４−７継代ＨＵＶＥＣ細胞（Cell Systems、Kirkland, WA）は、ゼラチン被覆
シャーレ上の１０％の胎児ウシ血清及び成長因子を含むCell System's完全培地
（AZ0-500）にて生育され、０．２％血清中で１４時間飢餓状態にされ、静止状
態にされた。静止状態のＨＵＶＥＣ細胞は、未処理のまま或いは天然ＶＥＧＦ（
１−１６５）又はＶＥＧＦ変異体（Flt-sel(全長165配列型)又はLK-VRB-2f；両
方ともにERK1及びERK2アッセイのために上記に記載）（50ng/ml又は10ng/mlのど
ちらかの濃度で）で５分間刺激されるのどちらかであった。そして、細胞は、０
．１ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム、５ｍＭ パラ-ニトロフェニルリン酸、
１０ｍＭ フッ化ナトリウム、 ０．５マイクロモル オカダ酸及びプロテアーゼ
インヒビター反応混液（Roche MB1836145）を含む０．５−１ｍｌ ＲＩＰＡ緩衝
液中で溶解された。ｐ３８ストレス-活性化ＭＡＰキナーゼのリン酸化状態は、
抗-ホスホｐ３８特異的抗血清（NEB）で評価された。 Ｆｉｇ．１２Ｂは、ＫＤＲ-選択ＶＥＧＦ変異体がｐ３８リン酸化を刺激する
ことが可能であることを示している。

【００８１】 実施例１１： ＫＤＲは、ＰＩ３'-キナーゼ及びＰＬＣ-ガンマリン酸化を刺激
する ＰＬＣ-ガンマリン酸化及び活性化は、以前、ＶＥＧＦ情報伝達に関係付けら
れた。ＫＤＲ（Dougherら., Oncogene, 18:1619-1627(1999)；Cunninghamら., B
iochem. Biophys. Res. Comm., 240:635-639(1997)）及びＦｌｔ−１(Seetharam
ら., Oncogene, 10:135-147(1995)；Sawanoら., Biochem. Biophys. Res. Comm.
, 238:487-491(1997)；Itoら, J.Biol.Chem., 273:23410-23418(1998)）の両方
へのＰＬＣ-ガンマ結合が、報告されている。 どのＶＥＧＦレセプターが初期内皮細胞のＰＬＣ-ガンマ活性化に関与してい
るのかを決定するために、ＨＵＶＥＣ細胞は、天然ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦレセプ
ター選択変異体とともに処理され、ＰＬＣ-ガンマリン酸化は免疫沈降の後に評
価された。

【００８２】 ４−７継代ＨＵＶＥＣ細胞（Cell Systems、Kirkland, WA）は、ゼラチン被覆
シャーレ上の１０％の胎児ウシ血清及び成長因子を含むCell System's完全培地
（AZ0-500）にて生育され、０．２％血清中で１４時間飢餓状態にされ、静止状
態にされた。静止状態のＨＵＶＥＣ細胞は、未処理のまま或いは天然ＶＥＧＦ（
１−１６５）又はＶＥＧＦ変異体（Flt-sel(全長165配列型)又はLK-VRB-2f；上
記の実施例１０に記載）（20ng/mlの濃度で）で５分間刺激されるのどちらかで
あった。そして、細胞は、０．１ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム、５ｍＭ パ
ラ-ニトロフェニルリン酸、１０ｍＭ フッ化ナトリウム、 ０．５マイクロモル
オカダ酸及びプロテアーゼインヒビター反応混液（Roche MB1836145）を含む０
．５−１ｍｌ ＲＩＰＡ緩衝液中で溶解された。続いて、ＰＬＣ-ガンマは、モノ
クローナル抗体（Upstate Biotechnology）を使用して全細胞溶解液から免疫沈
降され、チロシンリン酸化の分析（Ｆｉｇ．１３Ａ）、又は溶解液は、ｐ８５
ＰＩ３'-キナーゼ（Transduction Labs(P13020)及びNeomarkers(MS424-P)より購
入）に対するモノコローナル抗体で免疫沈降され、ホスホチロシン抗体ＰＹ２０
又はＥ１２０Ｈ（Transduction Labs）を使用するホスホチロシンのための試験
がなされた（Ｆｉｇ．１３Ｂ）。免疫沈降は、次のように行われた。プロテイン
Ａ／Ｇビーズ（Pierce）は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、０．１％ ＴＸ
−１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び１ｍｇ／ｍｌ 卵白アルブミン中で３０分間
、非特異的タンパク質結合のためにブロックされた。抗体は、同じ緩衝液中で４
℃で１時間、head over end rotationで予め共役され、ビーズは溶解緩衝液で３
回洗浄された。ビーズは、可溶化液に加えられて一晩回転された。ビーズは、経
時的に、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＣａＣｌ_２、１％ ＴＸ−
１００、１ｍＭ ＣａＣｌ_２；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．６、５００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、０．１％ ＴＸ−１００、１ｍＭ ＣａＣｌ_２及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ
７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ＴＸ−１００、１ｍＭ ＣａＣｌ_２
で洗浄された。次に、ビーズは、２ｘサンプル緩衝液に再懸濁され、煮沸された
。上清は、４−１２％ Ｔｒｉｓ−グリシングラジエントゲル（Novex）へ直接に
充填された。

【００８３】 Ｆｉｇ．１３Ａに示されているように、天然ＶＥＧＦ及びＫＤＲ-選択ＶＥＧ
Ｆ変異体の両方は、同じ程度にＰＬＣ-ガンマリン酸化を刺激することが可能で
あった。Ｆｌｔ−１選択ＶＥＧＦ変異体は、バックグラウンドレベルより多くＰ
ＬＣ-ガンマリン酸化を増やさず、ＨＵＶＥＣ細胞でのＰＬＣ-ガンマ活性化にお
けるＦｌｔ−１の役割に論駁した。 ＰＩ３'-キナーゼは、幾つかの細胞において、Ａｋｔの活性化を通して生存シ
グナルをを伝達すると証明されている（Marteら, Trends Biochem. Sci., 22: 3
55-358(1997)）。ＶＥＧＦはまた、内皮細胞の生存因子として作用し、このシグ
ナルは、ＰＩ３'-キナーゼ及びＡｋｔキナーゼ活性を必要とする（Gerberら，J.
Biol.Chem., 273:30366-30343(1998)）。種々の細胞型において、ＰＩ３'-キナ
ーゼ活性は、細胞移動と同様に成長因子刺激に続く細胞骨格変化に関与している
ことが証明されている（Wennstronら, Curr. Biol., 4:385-393(1994)）。それ
故に、ＰＩ３'-キナーゼのｐ８５制御サブユニットのリン酸化を生じるＶＥＧＦ
タンパク質の能力は、免疫沈降の後に評価される。天然ＶＥＧＦ及びＫＤＲ−選
択ＶＥＧＦ変異体のみが、Ｆｉｇ．１３Ｂに示されているＰＩ３'-キナーゼ制御
サブユニットのリン酸化を生じせしめることが可能である。

【００８４】 実施例１２： 内皮細胞移動の効果 内皮細胞に対するＶＥＧＦ作用の中心的側面の１つは、それの化学遊走物質と
しての作用及び内皮細胞の遊走を刺激する能力である。ＨＵＶＥＣ細胞移動は、
以下のような、修正ボイデンチャンバーアッセイによって分析された。 Falcon8.0 micron filter inserts（Falcon 3097）は、タイプ１コラーゲン（
VITROGEN COHESION）によって被覆された。ＨＵＶＥＣ（Cell Systemsより得た
、８継代）は、１０％のＦＣＳを含むCell System's完全培地（4Z0-500）にて生
育された。細胞は，トリプシン処理され、０．１％ＢＳＡを含むＥＢＭ（内皮基
本培地、Clonetics）へ移された。細胞は、上側ののチャンバー当たり５ｘ１０
^４でプレートされた。成長因子（VEGF(1-165)；Ｆｌｔ−１選択変異体；LK-VRB-
2f；上記の実施例１０に記載）は、下側のチャンバーにプレートされ（Ｆｉｇｓ
．１４に示された濃度で）、阻害剤は上側のチャンバーにプレートされた。アッ
セイは、規定通りに、３７℃で１８時間アッセイされた。LY294002阻害剤実験で
は、阻害剤の添加の前に、細胞は３０分間付着することができた。阻害剤が添加
されて２０分後、ＶＥＧＦが底のウェルへ添加され、これら初代細胞のLY294002
（Biomolより購入）処理に関連したアポトーシスの発生を避けるために、アッセ
イは、４時間のみ続けられた。 細胞は、ポリウレタンスワッブによるかきとりによって膜の上側より取り除か
れ、そして残りの細胞は、メタノールで膜の下側へ固定された。細胞は、Yo-Pro
ヨウ化核染色（Molecular Probes)で染色され、Image-Pro cell 認識プログラム
を使用して低出力蛍光の下でカウントされた。

【００８５】 Ｆｉｇ．１４は、修正ボイデンチャンバーアッセイにおけるＨＵＶＥＣ細胞（
表示された濃度で）に対するレセプター選択ＶＥＧＦ変異体の効果を示している
（実験は三通りに行われた；エラー棒は、標準的エラーを表す）。幾つかの独立
した実験では、ＶＥＧＦは、ＨＵＶＥＣ細胞移動において４−５倍の増加を引き
起こした。ＫＤＲ−選択ＶＥＧＦ変異体は、ＨＵＶＥＣ細胞移動の促進において
、天然ＶＥＧＦと同じように効果があった。Ｆｌｔ−１選択変異体は、バックグ
ラウンドレベルより多くの細胞移動を増大することはできなかった。 内皮細胞移動に対するＰＩ３-キナーゼの貢献を決定するために、細胞が膜へ
付着することができた後に、異なる濃度の阻害剤LY294002がアッセイへ加えられ
た。内皮細胞の生存に対するＰＩ３'-キナーゼ阻害の有害な影響のために、短時
間のアッセイが行われた（上記に記載のように）。Ｆｉｇ．１４は、最も高い濃
度において、LY294002は、ＨＵＶＥＣ細胞移動の５６％阻害を引き起こした。従
って、ＰＩ３'-キナーゼ活性は、内皮細胞移動に対して有意な貢献をする。

【００８６】 実施例１３：角膜ポケットアッセイ： このアッセイでは、Polveriniら, Methods Enzymol. 198:440-450(1991)に記
載のように行われた。Sprague Dawleyラットに、ガス（イソフラン）／注射用の
ケタミン（80mg/kg）／キシラジン（15mg/kg）の組合せを使用して麻酔をかけた
。眼をゆっくりと突出させ、非外傷治療用ピンセットで適所に固定した。１５番
の刃を使用し、１．５ｍｍの切り込みを角膜の中心の僅か下に設けた。マイクロ
スパチュラ（ ST 80017、ASSI）を使用し、眼の外眼角の方向に、ゆっくりと鈍
角に切開した(blunt-dissected)。成長因子（200ng）（VEGF(1-165)；Ｆｌｔ−
１選択変異体；LK-VRB-2f；（上記の実施例１０に記載）又はPlGF(R&D System)
）、又はメチルセルロース及びアルミニウムスクラルファート（100ug）（コン
トロール）を、ポケットの基部に挿入した。手術の後、眼は、ゲンタマイシン軟
膏で被覆された。６日目、動物を高分子ＦＩＴＣ-デキストランで注射し、脈管
構造が視覚化されるように安楽死させた。角膜の全マウントは、眼球除去された
眼からできており、新生血管領域の測定は、コンピューター補助イメージ分析（
Image-Pro Plus）を使用して完成した。

【００８７】 Ｆｉｇ．１５Ａに示されているように、ＫＤＲ−選択変異体は、角膜の血管新
生の誘発において、天然ＶＥＧＦと同じように有効であった。Ｆｌｔ−１選択Ｖ
ＥＧＦ変異体が、時折，辺縁性血管新生（Ｆｉｇ．１５Ａ）を誘発するが、幾つ
かの動物における血管形成表層領域の分析は、Ｆｌｔ−１選択ＶＥＧＦ変異体が
、コントロールのレベルを超えて血管新生を刺激すること不可能であることを示
した。ＰｌＧＦは、最低限の反応のみを与えた（Ｆｉｇ．１５）。従って、現在
、Ｆｌｔ−１ではなくＫＤＲが、インビボで血管新生を促進することが可能であ
ると考えられている。 前記に記載の内容は、当該技術分野に熟練した者が本発明を実行するのに十分
であると考えられる。ここにおいて示され、記載された内容に加えて本発明の種
々の改良は、前記の内容より当該技術分野に熟練した者にとっては明らかであり
、添付された請求項の範囲内に収まるものである。

【図面の簡単な説明】

【Ｆｉｇ．１】 １６５アミノ酸天然（「野生型」）ＶＥＧＦの核酸配列と
推定アミノ酸配列を示す。

【Ｆｉｇ．２】 天然ＶＥＧＦ（８−１０９）のＥＬＩＳＡアッセイ滴定曲
線を示す。

【Ｆｉｇ．３】 天然ＶＥＧＦ（８−１０９）のＫＩＲＡアッセイ滴定曲線
を示す。

【Ｆｉｇ．４】 天然ＶＥＧＦ（８−１０９）のＨＵＶＥＣ増殖アッセイ滴
定曲線を示す。

【Ｆｉｇ．５】 様々な濃度のリガンドを用いた、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を発現
するＫＤＲからの^１２５Ｉ−ＶＥＧＦ（１−１６５）の競争的置換により測定さ
れるような、天然ＶＥＧＦ（「ＷＴ ＶＥＧＦ」）、ＬＫ−ＶＲＢ−２ｓ^★（Ｋ
ＤＲ選択変異体）及びＦｌｔ−１−ｓｅｌ（Ｆｌｔ−１選択変異体）によるＫＤ
Ｒに対する結合親和性を示す。アッセイは、実施例７に詳細に記載されている。
それぞれのポイントは複製測定の平均を示し、誤差は１５％未満と見積もられる
。

【Ｆｉｇ．６】 様々な濃度のリガンドを用いた、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を発現
するＦｌｔ−１からの^１２５Ｉ−ＶＥＧＦ（１−１６５）の競争的置換により測
定されるような、天然ＶＥＧＦ（「ＷＴ ＶＥＧＦ」）、ＬＫ−ＶＲＢ−２ｓ^★
（Ｆｌｔ−１選択変異体）及びＦｌｔ−１−ｓｅｌ（Ｆｌｔ−１選択変異体）に
よるＦｌｔ−１に対する結合親和性を示す。アッセイは、実施例７に詳細に記載
されている。それぞれのポイントは複製測定の平均を示し、誤差は１５％未満と
見積もられる。

【Ｆｉｇ．７】 様々なＶＥＧＦアラニン置換変異体の結合の減少割合を割
り出した表である。実施例８に記載されるように、タンパク質ＥＬＩＳＡは様々
なアラニン変異体で実施された。それぞれの残基における天然ＶＥＧＦ（１−１
０９）のＩＣ_５０に対する変異体のＩＣ_５０の割合を挙げ、天然ＶＥＧＦに比較
した変異体の結合の減少割合を示す。天然ＶＥＧＦ（１−１０９）のＩＣ_５０は
括弧内に示されている。太字で示される残基はＦｌｔ−１選択変異体の生成に使
用された。ＫＤＲ選択変異体を生成するために、突然変異領域は、示されるよう
に５つのグループに分けられ、初めから４つは置換ファージディスプレイ選択の
構築ライブラリ構築に使用された。星印（^★）のついた残基は、野生型に５０％
の偏りでソフトランダム化され、２つの星印のついた残基はハードランダム化さ
れた。

【Ｆｉｇ．８Ａ】 ラジオイムノレセプター結合アッセイ（ＲＩＡ）の結果
を示し、Ｆｌｔ−１選択変異体（「Ｆｌｔ−１−ｓｅｌ」）は少なくとも４７０
倍減少したＫＤＲ結合親和性を有することが示された。また天然ＶＥＧＦ（「Ｗ
Ｔ ＶＥＧＦ」）に対する結合親和性も示される。それぞれのポイントは複製測
定の平均を示し、誤差は値の１５％未満と見積もられる。

【Ｆｉｇ．８Ｂ】 ラジオイムノレセプター結合アッセイ（ＲＩＡ）の結果
を示し、Ｆｌｔ−１選択変異体（「Ｆｌｔ−１−ｓｅｌ」）は天然ＶＥＧＦ（「
ＷＴ ＶＥＧＦ」）により示されるものと同等のＦｌｔ−１に対する結合親和性
を有することが示された。それぞれのポイントは複製測定の平均を示し、誤差は
値の１５％未満と見積もられる。

【Ｆｉｇ．９】 ＫＤＲリン酸化を誘発する天然ＶＥＧＦ（「ＷＴ ＶＥＧ
Ｆ」）及びＦｌｔ−１選択変異体（「Ｆｌｔ−１−ｓｅｌ」）の能力を測定する
ＫＩＲＡアッセイの結果を示す。

【Ｆｉｇ．１０】 ＨＵＶＥＣ細胞増殖を誘発する天然ＶＥＧＦ（「ＷＴ
ＶＥＧＦ」）及びＦｌｔ−１選択変異体（「Ｆｌｔ−１−ｓｅｌ」）の能力を測
定するＨＵＶＥＣ増殖アッセイの結果を示す。それぞれのデータのポイントは、
推定誤差１０−２０％のを有する３回の実験の平均である。

【Ｆｉｇ．１１】 天然ＶＥＧＦ、ＬＫ−ＶＲＢ−２ｓ^★（ＫＤＲ選択変異
体）、Ｆｌｔ−ｓｅｌ（Ｆｌｔ−１選択変異体）、及びＰＩＧＦのヒトＡＳＭＣ
細胞によりＭＭＰ−９選択を促進する能力を測定するゼラチン酵素電気泳動分析
の結果を示す。示される酵素電気泳動像は２つの単独の実験の１つである。倍数
変化は、相対するバンドの密度を示す。

【Ｆｉｇ．１２】 天然ＶＥＧＦ（「ＷＴ ＶＥＧＦ」）、Ｆｌｔ−ｓｅｌ
（Ｆｌｔ−１選択変異体）、及びＫＤＲ選択変異体（「ＫＤＲ−ｓｅｌ」）によ
りＭＡＰキナーゼの活性を測定する為に実施されたウエスタンブロット分析を示
す。該アッセイは実施例１０に記載される。

【Ｆｉｇ．１３】 天然ＶＥＧＦ（「ＷＴ」又は「ＶＥＧＦ」）、ＫＤＲ選
択変異体（「ＫＤＲ−ｓｅｌ」）、及びＦｌｔ−１（Ｆｌｔ−ｓｅｌ選択変異体
）の働き及びＰＬＣγのＫＤＲ及びＰＩ３’キナーゼリン酸化を決定する為に実
施されたウエスタンブロット分析を示す。該アッセイは実施例１１に詳細に記載
される。

【Ｆｉｇ．１４】 修正ボイデンチャンバーで実施されたＨＵＶＥＣ移動ア
ッセイの結果を図示する棒グラフを示す。（ａ）は天然ＶＥＧＦ（「ＷＴ」）、
Ｆｌｔ−１選択変異体（「Ｆｌｔ−ｓｅｌ」）、及びＫＤＲ選択変異体（「ＫＤ
Ｒ−ｓｅｌ」）の示される濃度で成されたＨＵＶＥＣ移動を示す。（ｂ）は、天
然ＶＥＧＦ（「ＶＥＧＦ」）に関連するＨＵＶＥＣ移動を減退させるＰＩ３’キ
ナーゼ阻害剤（「ＬＴ」）の添加実験の結果を示す。実験は３回実施され、誤差
の棒は標準誤差を示す。

【Ｆｉｇ．１５】 インビボ角膜ポケット血管新生アッセイの結果を示す。
（ａ）の図のスライドはコントロール処理、天然ＶＥＧＦ（「ＶＥＧＦ」）、Ｋ
ＤＲ選択変異体及びＦｌｔ−１選択変異体に応答する角膜血管新生の範囲の代表
的な例を示す。（ｂ）は、コントロール処理、天然ＶＥＧＦ（「ＶＥＧＦ」）、
ＫＤＲ選択変異体（「ＫＤＲ−ｓｅｌ」）、Ｆｌｔ−１選択変異体（「Ｆｌｔ−
ｓｅｌ」）及びＰＩＧＦの結果生じた角膜血管新生の表面領域の量的分析を示す
。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｈ０４５ 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/68 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/02 5/00 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 カニンガム，ブライアン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94402， サン マテオ，ヒルクレスト ロード 410 (72)発明者 デボス，アブラハム アメリカ合衆国 カリフォルニア 94610， オークランド，イースト サーティサード ストリート 1035 (72)発明者 リ，ビン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94044， フォスター シティー，ドルフィン アイ ル 316 Ｆターム(参考） 2G045 AA24 AA25 CB01 FB02 FB03 FB07 4B024 AA01 BA21 CA04 CA06 DA06 EA03 GA14 HA01 4B063 QA01 QQ08 QR48 QS03 QS33 4B065 AA26X AA90X AA99Y AB01 BA03 CA24 CA44 4C084 AA02 AA07 BA01 BA02 BA08 BA22 BA23 CA18 CA25 DB57 MA01 NA14 ZA361 ZA441 ZB211 ZC411 4H045 AA10 BA10 CA40 DA01 EA28 FA74

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 天然ＶＥＧＦのアミノ酸配列の１又は複数のアミノ酸の変異
   を含み、ＫＤＲレセプターに対する選択的結合親和性を有するＶＥＧＦ変異体ポ
   リペプチド。
2. 【請求項２】 前記１又は複数のアミノ酸の変異が天然ＶＥＧＦ配列の位置
   １７と２５で、又はその間に１又は複数のアミノ酸の置換を含んでなる、請求項
   １に記載のＶＥＧＦ変異体。
3. 【請求項３】 前記１又は複数のアミノ酸の変異が、天然ＶＥＧＦ配列の位
   置６３と６６で、又はその間で１又は複数のアミノ酸置換を含んでなる、請求項
   １に記載のＶＥＧＦ変異体。
4. 【請求項４】 前記ポリペプチドが少なくとも４つの異なるアミノ酸変異を
   含み、４つの前記アミノ酸変異が次のアミノ酸置換：Ｍ１８Ｅ、Ｙ２１Ｌ、Ｑ２
   ２Ｒ、Ｙ２５Ｓである、請求項１に記載のＶＥＧＦ変異体。
5. 【請求項５】 前記ポリペプチドが少なくとも３つの異なるアミノ酸変異を
   含み、３つのアミノ酸変異が次のアミノ酸置換：Ｄ６３Ｓ，Ｇ６５Ｍ、Ｌ６６Ｒ
   である請求項１に記載のＶＥＧＦ変異体。
6. 【請求項６】 前記ポリペプチドが少なくとも４つの異なるアミノ酸変異を
   含み、４つの前記アミノ酸突然変異が次のアミノ酸置換：Ｍ１８Ｅ、Ｄ６３Ｓ，
   Ｇ６５Ｍ、Ｌ６６Ｒである、請求項１に記載のＶＥＧＦ変異体。
7. 【請求項７】 前記ポリペプチドが少なくとも４つの異なるアミノ酸突然変
   異を含み、４つの前記アミノ酸変異が次のアミノ酸置換：Ｙ２１Ｌ、Ｄ６３Ｓ，
   Ｇ６５Ｍ、Ｌ６６Ｒである、請求項１に記載のＶＥＧＦ変異体。
8. 【請求項８】 請求項１に記載のＶＥＧＦ変異体をコードするＤＮＡ配列を
   含んでなる単離された核酸。
9. 【請求項９】 前記ＤＮＡ配列が請求項４に記載のＶＥＧＦ変異体をコード
   する、請求項８に記載の単離された核酸。
10. 【請求項１０】 前記ＤＮＡ配列が請求項５に記載のＶＥＧＦ変異体をコー
    ドする、請求項８に記載の単離された核酸。
11. 【請求項１１】 前記ＤＮＡ配列が請求項６に記載のＶＥＧＦ変異体をコー
    ドする、請求項８に記載の単離された核酸。
12. 【請求項１２】 前記ＤＮＡ配列が請求項７に記載のＶＥＧＦ変異体をコー
    ドする、請求項８に記載の単離された核酸。
13. 【請求項１３】 請求項８に記載の核酸を含んでなるベクター。
14. 【請求項１４】 請求項１３に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
15. 【請求項１５】 請求項１のＶＥＧＦ変異体と担体を含む組成物。
16. 【請求項１６】 前記担体が製薬的に許容可能な担体である、請求項１５に
    記載の組成物。
17. 【請求項１７】 請求項１のＶＥＧＦ変異体を有する細胞又は組織に接触し
    、前記細胞又は組織中に又はその上に存在しうるＫＤＲレセプターに対する前記
    ＶＥＧＦ変異体の結合を測定することを含んでなるＫＤＲをレセプターを検知す
    るアッセイ。
18. 【請求項１８】 請求項１のＶＥＧＦ変異体の有効量に対してＫＤＲレセプ
    ターを発現する哺乳動物細胞を暴露することを含んでなる、脈管形成又は血管新
    生を促進する方法。
19. 【請求項１９】 請求項１５の組成物を含む容器とインビトロ又はインビボ
    で前記組成物を使用する為の指示書を提供する前記容器上のラベルを含んでなる
    、製造品。