JPH09503751A - 細胞毒性抱合体の単一起源性製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と細胞毒性物質との抱合体の単一起源性製剤を提供する。その結果生じる単一起源性製剤の細胞毒性抱合体の実質的にすべてが、ＦＧＦ受容体と反応するポリペプチドと同一モル比の細胞毒性物質を含有する。抱合体は化学的抱合により、さらに融合タンパク質を産生するよう抱合体をコードするＤＮＡの発現によっても生成される。少なくとも１つの置換又は欠失された反応性システインを有するＦＧＦを精製モノ誘導化サポリンと、又はシステイン残基の付加又はシステインによる残基の置換により一端又は一端付近で修飾されたサポリンと反応させることにより、化学的抱合体を調製する。その結果生じる製剤は、実質的に単一起源性である。融合タンパク質は、１つ又はそれ以上のあらゆる反応性システインが欠失又は置換されたＦＧＦのムテインをコードするＤＮＡ構築物を発現することにより生成する。細胞毒性物質をコードするＤＮＡとの結合も提供する。ＤＮＡ構築物は宿主細胞内で発現されて細胞毒性ＦＧＦ抱合体の単一起源性製剤を生成する。抱合体のＦＧＦ部分が修飾されていて反応に用いられるシステインがない態様では、その結果生じる組成物は集合体を含有しない。本明細書で提供される抱合体の単一起源性製剤はＦＧＦ受容体を保有する細胞に対する強力な殺細胞物質である。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞毒性抱合体の単一起源性製剤 産業上の利用分野 本発明は細胞毒性抱合体の製造及び使用に関する。特に細胞毒性抱合体の実質 的単一起源性製剤、細胞毒性抱合体の均質組成物及びこのような細胞毒性抱合体 の製造方法が提供される。 発明の背景 薬理学の一目標は、標的細胞又は組織にのみ高特異的活性で作用する特異的薬 剤を設計することである。この目標は、例えば腫瘍性疾患及びウイルス起源の疾 患といったような疾患の治療のための薬剤の設計に特に重要であって、この場合 、毒性用量対治療用量の比は非常に低く、投与量は最小限にしなければならない 。この目標を達成するために多数のアプローチが開発されてきた。これらの例と しては、特異的細胞にのみ作用する成長因子のような薬剤の使用、及び細胞内に 供給されないかぎりは相対的に非毒性である毒素の使用が挙げられる。 繊維芽細胞成長因子及び繊維芽細胞成長因子受容体 この25年間、特定の細胞型の成長、増殖及び分化を刺激する因子の同定及び特 性表示に多大の注意が向けられてきた。多数の成長因子並びに構造的及び機能的 特徴を共有する成長因子の族が同定されている。これらの因子の多数が多機能活 性を有し、広範囲の細胞型に影響を及ぼす。 広範囲の活性を有する成長因子の一族が、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）族で ある。この族のタンパク質としては、ＦＧＦ−１〜Ｆ ＧＦ−９（又はそれぞれ酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ）、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、 ｉｎｔ−２、ｈｓｔ−１／Ｋ−ＦＧＦ、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６／Ｈｓｔ−２、 ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ＦＧＦ−８及びＦＧＦ−９）と呼ばれるＦ ＧＦが挙げられる。これらのタンパク質はヘパリンと結合する能力を共有し、細 胞内受容体媒介チロシンリン酸化及びｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡ転写の発現を誘発し 、ＤＮＡ合成及び細胞増殖を刺激する。 特性表示されたＦＧＦ族の最初の成員である酸性及び塩基性ＦＧＦは、アミノ 酸レベルで約55％同一で、種の間に高度に保存される。塩基性ＦＧＦは約16kDの 分子量を有し、酸及び温度感受性で、高等電点を有する。酸性ＦＧＦは、酸性等 電点を有する。ＦＧＦ族の他の成員は、ａＦＧＦ及びｂＦＧＦとのアミノ酸配列 相同性並びに１つ又はそれ以上のＦＧＦ受容体と結合する能力を含めた共通の物 理学的及び生物学的特性に基づいて、その後同定された。塩基性ＦＧＦ、ｉｎｔ −２，ｈｓｔ−１／Ｋ−ＦＧＦ、ＦＧＦ−５、ｈｓｔ−２／ＦＧＦ−６及びＦＧ Ｆ８は腫瘍遺伝子である。例えばｂＦＧＦは黒色腫で発現され、ｉｎｔ−２は乳 癌ウイルスで発現され、ｈｓｔ−１／Ｋ−ＦＧＦは血管由来の腫瘍で発現される 。酸性ＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＫＧＦ及びＦＧＦ−９は、正常細胞及び組織で発現さ れる。 ＦＧＦは広範囲の間葉、内分泌及び神経細胞に有糸分裂誘発作用を及ぼす。そ れらは分化及び発生においても重要である。特に興味深いのは、側副血管新生及 び脈管形成に及ぼすそれらの刺激作用である。このような作用は、治療薬として の、例えば創傷治癒、血管新生、神経再生及び軟骨修復のための薬としてのＦＧ Ｆにおける少なからぬ関心を刺激した。潜在的に有用な増殖作用の他に、ＦＧＦ 誘発性有糸分裂誘発刺激は、いくつかの場合には有害なことがある 。例えば細胞増殖及び脈管形成は、腫瘍成長に欠くことのできない面である。ｂ ＦＧＦを含めたＦＧＦ族の成員は、例えば腫瘍の発達、慢性関節リウマチ、増殖 性糖尿病性網膜症及び他の糖尿病合併症において病態生理学的役割を演じると考 えられる。 ＦＧＦの作用は、細胞表面膜又はＦＧＦ反応性細胞上で高親和性受容体チロシ ンキナーゼにより媒介される（例えばImamura et al.,(1988) Biochem．Biophys ．Res．Comm．155:583-590; Huang et al.,(1986) J．Biol．Chem．261:9568-95 71参照。これらは参照により本明細書中に含まれる）。低親和性受容体もＦＧＦ 活性を媒介するに際してある役割を演じる。細胞型により110〜150kDの範囲の分 子量を有する一本鎖ポリペプチドである高親和性受容体タンパク質が、構造的に 関連したＦＧＦ受容体の一族を構成する。４つのＦＧＦ受容体遺伝子が同定され ており、これらの遺伝子の少なくとも２つが一次転写産物の代替的スプライシン グを経て多数のｍＲＮＡ転写産物を生成する。 リボソーム不活化タンパク質 リシン、アブリン及びサポリンを含めたリボソーム不活化タンパク質（ＲＩＰ ）は、真核生物リボソームを触媒的に不活化する植物タンパク質である。いくつ かのＲＩＰ、例えば毒素であるアブリン及びリシンは２つの構成分鎖を含有する ：即ち細胞表面受容体との結合を媒介し、分子を取り込む細胞結合鎖と；毒性の 原因となる鎖である。このようなＲＩＰはＩＩ型ＲＩＰである。一本鎖ＲＩＰ、 例えばサポリンは細胞結合鎖を有しない。その結果、取り込まれないかぎり、そ れらは２つの鎖を有するＲＩＰよりも全細胞に対する毒性が実質的に低い。 ＲＩＰは、タンパク質合成のタンパク質延長工程を妨害することによりリボソ ームを不活化する。例えばＲＩＰサポリン（以後ＳＡ Ｐと呼ぶ）は、ラット２８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）における位置4324で のアデニンのｎ−グリコシド結合の切断により６０Ｓリボソームを不活化するこ とが示されている。ｒＲＮＡにおいてＡ⁴³²⁴が位置する特定領域は、原核及び真 核生物の間で高度に保存される。２８ＳｒＲＮＡにおけるＡ⁴³²⁴は、大腸菌（E ．coli）２３ＳｒＲＮＡのＡ₂₆₆₀に対応する。いくつかのＲＩＰがさらに例えば 大腸菌のような原核生物におけるタンパク質合成を妨害すると思われる。 植物 Saponaria officinalis（シャボンソウ）の種子及び葉から、いくつかの 構造的に関連したＲＩＰが単離されている。これらの中で、ＳＡＰ−６は最も活 性で且つ多量で、全種子タンパク質の７% に相当する。サポリンは非常に安定で 、高等電点を有し、炭水化物を含有せず、変性物質、例えばドデシル硫酸ナトリ ウム（ＳＤＳ）、及び種々のプロテアーゼに耐性である。種子からのいくつかの サポリン−６アイソフォームのアミノ酸配列が公知であって、少数のアミノ酸残 基で異なるサポリンＲＩＰの族であると考えられる。サポリンはＩ型ＲＩＰであ るため、それは細胞結合鎖を保有しない。したがって、全細胞に対するその毒性 は、他の毒素、例えばリシン及びアブリンよりもたいそう低い。しかしながら真 核細胞に取り込まれた場合は、その細胞毒性はリシンＡ鎖より100〜1000倍強力 である。 細胞毒性抱合体 細胞毒素、例えばサポリン及びリシンＡ鎖は、細胞表面結合タンパク質と共有 結合して細胞毒性化学抱合体を生成するか、又は抗体と結合して特異細胞に標的 にされてそれに取り込まれる免疫毒素を生成する。例えば塩基性繊維芽細胞成長 因子（ｂＦＧＦ）はサポリン−６と化学的に抱合してミトトキシンｂＦＧＦ−Ｓ ＡＰを生成す る（例えば米国特許第5,191,067号(Lappi et al);及びLappi et al.(1989) Bioc hem．and Biophys．Res．Comm. 160:917-923参照）。その結果生じるＦＧＦ−Ｓ ＡＰ抱合体を用いて再狭窄（例えば、国際特許出願第WO 92/11872号（これは米 国特許出願第07/637,074号に基づいている）参照；さらに米国特許第5,308622号 参照）、及びその他のＦＧＦ媒介性疾患を治療した。治療は、例えばバルーン血 管形成術後に治療的有効量のＦＧＦ抱合体を局所又は静脈内投与することにより 実施する。塩基性ＦＧＦ−ＳＡＰ抱合体はさらにある主の腫瘍の治療のための薬 剤として期待されている。ＦＧＦと結合する受容体を発現する黒色腫又は他の腫 瘍の成長はＦＧＦ- ＳＡＰにより阻害される可能性がある（例えば公告済の国際 出願WO 92/04918号（これは1990年9 月19日提出の米国特許出願第07/585,319号 に基づいている）；及びBeitz et al.(1992) Cancer Research 52:227-230 参 照）。 抱合体はしばしば、細胞毒性部分及び標的部分中に、リシンＡ鎖の場合のよう に、天然にいずれも見出される反応性スルフヒドリルを用いて合成される。存在 しない場合には、化学的共役を用いて細胞毒性物質中にスルフヒドリルを導入し て、抱合体が自然のままの又は利用できるスルフヒドリルを欠いた抗体に又はＳ ＡＰのようなＲＩＰに適するようにする。しかしながら抱合の化学は種々の構造 物を生じ手、互いに分離するのが難しい生成物質の異種集団を生じる。これらの 構造物は標的部分に付着する１つより多いＲＩＰ、ＲＩＰに付着する１つより多 い標的部分、又は１つより多い標的部分に付着する１つより多いＲＩＰを含有す る抱合体を含む。抱合体間の、特に抱合体中の遊離スルフヒドリル間の相互作用 のために、その結果生じる構造物はさらに集合体を形成する。その結果生じる異 なる構造物を有する抱合体を分離する場合に遭遇する困難のために 、実験には、そして治療に適用する場合でさえ、異種混合物がしばしば用いられ る。 例えば、システインを介してｂＦＧＦを、先ずＮ−スクシニミジル−３（２− ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）で誘導されるサポリンと抱合する 。塩基性ＦＧＦは、ＳＰＤＰ誘導化サポリンとの反応に利用できる少なくとも２ 個のシステインを有する。したがってｂＦＧＦをＳＰＤＰ誘導化ＳＡＰと反応さ せると、分子列を生じるが、これは恐らく生物学的関連特性に関して異なってい て、in vivo 適用には理想的でない。ゲル電気泳動及びウエスタンブロティング は、多数のより高い分子量の種が生成されることを立証する。この種はＳＡＰ対 ＦＧＦ比が0.5、１、２及び他のオリゴマー的組合せを含む。異種集団の種々の 構成成分の相対的活性に関してはごくわずかの情報しかないが、しかしポリマー ＲＩＰが非特異的毒性を増大したことが報告されている。 有害な疾病状態を治療するための許容可能な製剤中へのＦＧＦ−ＳＡＰ及び他 の細胞毒性物質を開発するためには、物理学的、化学的及び生物学的に十分特性 表示された単一起源性分子を有するのが望ましい。したがって、細胞毒性ＦＧＦ 抱合体の単一起源性製剤の並びにＦＧＦ及び細胞毒素の抱合体を含有する均質組 成物の製造方法を提供することが本明細書における目的である。さらにこれらの 方法により調製されるＦＧＦ細胞毒性抱合体を提供することが本明細書の目的で ある。ＦＧＦ細胞毒性抱合体の均質集団又は単一起源性細胞毒性抱合体の混合物 を含有する組成物を提供することも本発明の目的である。 本発明の要約 細胞毒性抱合体及び細胞毒性抱合体の均質（非凝集）集団を含有 する組成物の単一起源性製剤を提供する。細胞毒性抱合体は、細胞毒性物質と結 合するｂＦＧＦのようなＦＧＦ受容体（本明細書中ではＦＧＦタンパク質とも呼 ばれる）と反応するポリペプチドを含有する。規定の製剤では、実質的にすべて の細胞毒性抱合体が同一比のＦＧＦ受容体と反応性のポリペプチド対細胞毒性物 質比を有する。好ましい態様において、細胞毒性抱合体は細胞毒性物質１モル当 たり１モルのＦＧＦタンパク質を含有する。 ＦＧＦ受容体（ＦＧＦタンパク質）と反応性のポリペプチドとしては、ＦＧＦ 受容体を保有して結合細胞毒性物質の取込みを生じる細胞でＦＧＦ受容体と反応 するあらゆる分子が挙げられる。特に好ましいＦＧＦ受容体と反応性のポリペプ チドとしては、その結果生じるポリペプチドがＦＧＦ受容体と結合して、結合細 胞毒性物質を取込み、そしてＦＧＦタンパク質を含有する細胞毒性抱合体のその 結果生じる製剤が単一起源性である限り（即ちこのような抱合体の製剤中の各抱 合体が同一モル比のＦＧＦタンパク質対細胞毒性物質比を有する）において、ポ リペプチドのＦＧＦ族の成員、これらのポリペプチドのムテイン、並びにこれら のあらゆる族成員の部分を含有するキメラ又はハイブリッド分子が挙げられる。 細胞毒性物質としては、取り込まれた場合に、真核細胞に対して細胞毒性であ るあらゆる分子が挙げられる。このような細胞毒性物質としてはリボソーム不活 化タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質合成の阻害剤、並びに他の 代謝阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。ある態様では、細胞毒性物 質はリボソーム不活化タンパク質（ＲＩＰ）、例えばサポリンであるが、しかし 他の細胞毒性物質を用いても有益である。 その結果生じる抱合体が化学的抱合体であるような化学的手段により、又はキ メラ分子をコードするＤＮＡを用いて融合タンパク質 を生成して、製剤を製造し得る。ＤＮＡの発現により、あるいは化学合成又は当 業界で公知のあらゆる他の方法により、抱合体の成分を生成してもよい。 抱合体は次式： （ＦＧＦ）_n−（細胞毒性物質）_m で表され、ＦＧＦ及び細胞毒性物質は、その結果生じる抱合体がＦＧＦ受容体と 結合して、ＦＧＦ受容体を保有する細胞中に細胞毒性物質を取り込む限りにおい て、あらゆる順序で、あらゆる適切な結合を介して結合し得ると理解される。Ｆ ＧＦはＦＧＦ受容体と反応性のポリペプチドを指し、ｎ及びｍは、単一起源性製 剤においては整数であって、同一であっても異なってもよく、１〜６、好ましく は１〜４、一般的には１又は２であって、ｍ又はｎ、あるいはｍ及びｎが１より 大きい場合には、抱合体は１つより多い細胞毒性物質及び１つより多いＦＧＦを 含有し得る。 細胞毒性物質と結合したＦＧＦタンパク質の複数のモノマーを含有する細胞毒 性抱合体も提供される。数個の、一般的には２〜約６個のモノマーを含有するこ れらの抱合体は、単一プロモーター領域の転写制御下で、一般的には頭一尾のＦ ＧＦ融合タンパク質をコードするＤＮＡの多数のコピーを結合させることにより 生成し得る。 細胞毒性抱合体の単一起源性製剤又はこのような抱合体の均質組成物を製造す るためには、本明細書で提供される方法によりＦＧＦ受容体と反応性のポリペプ チドと細胞毒性物質を結合させる。その結果生じる細胞毒性抱合体の製剤の各成 員は、同一モル比の細胞毒性物質対ＦＧＦ受容体と反応性のポリペプチドを含有 する。一般的には、各抱合体は１分子の各構成成分を含有する。さらに、好まし い態様では、その結果生じる抱合体は集合体を形成しない。 サポリンを含めたしかしこれに限定されないリボソーム不活化タ ンパク質（ＲＩＰ）のような細胞毒性物質及びＦＧＦポリペプチド、並びに一定 モル比の各構成成分を含有する細胞毒性抱合体の単一起源性製剤の製造方法を提 供する。これらの方法としては、化学的抱合法、及び細胞毒性抱合体の組換え体 産生による方法が挙げられる。本方法により、好ましい態様において、単一起源 性細胞毒性抱合体の均質組成物を調製するために用いられる細胞毒性抱合体の単 一起源性製剤が生成される。 化学的方法は、いくつかの手段によって、その結果生じる細胞毒性抱合体の不 均質性を減じ、そして集合体形成を引き起こす抱合体間の相互作用を回避する。 好ましい態様では、抱合体のＦＧＦ部分を処理して、１個のシステインだけが細 胞毒性物質との反応に利用可能で、細胞毒性物質は、必要な場合には、誘導され て、単一種のみが修飾化ＦＧＦとの反応のために選択されるようにする。システ イン残基を含有するために細胞毒性物質を修飾してもよい。システイン残基の座 を選択して、システイン残基がＦＧＦポリペプチド中で利用可能なシステインと の抱合に用いられて、その結果生じる抱合体が標的真核細胞に取り込まれた場合 に細胞毒性であるようにする。 本態様に従って、修飾サポリンが提供される。このような修飾としてはＮ末端 での又はＮ末端付近へのＣｙｓ残基の導入が挙げられるが、これに限定されない 。Ｍｅｔ−Ｃｙｓの付加によるＤＮＡのＮ末端コード部分でのシステイン残基の 付加により、サポリンを修飾する。サポリンはさらに、本明細書中では、野性型 残基の位置４又は１０にシステインを挿入して修飾した。その結果生じたサポリ ンを次にＦＧＦ上で利用可能なシステインと反応させて、サポリン上に付加され たＣｙｓ又はＭｅｔ−Ｃｙｓを介して結合される抱合体を生成する。 化学的方法を実施するに際しては、特定部位の突然変異誘発を用いて、ｂＦＧ Ｆ中の反応性システインの１つを、結果的に生じる抱合体の細胞毒性を変えない 例えばセリンのような残基で置換し、細胞毒性物質との反応に用いられるシステ インを１個だけ残すことにより、化学的抱合体の不均質性を減じた。好ましい態 様では、細胞毒性物質は単一種の誘導化ＳＡＰである。ＳＡＰの誘導時に生じた 異なる誘導化ＳＡＰ種間のわずかな電荷差のために、実質的に純粋なモノ誘導化 ＳＡＰを単離し得るということが、本明細書中で判明した。もの誘導化ＳＡＰと モノ反応性システイン塩基性ＦＧＦとの反応により、細胞毒性抱合体及びＦＧＦ 受容体保有細胞に対して高度に細胞毒性の抱合体の均質集団の単一起源性製剤が 生成された。他の態様においては、システイン残基を含有するためにＮ末端で又 はその付近でサポリンを修飾して、その結果生じる修飾化サポリンがさらに誘導 することなくＦＧＦタンパク質と反応し得るようにする。 組換え体法は、集合体形成に関与するすべてのシステインを除去するために修 飾され、細胞毒性抱合体をコードするＤＮＡに結合されるＦＧＦタンパク質をコ ードするＤＮＡの発現に依っている。ＦＧＦポリペプチドをコードするＤＮＡを 突然変異原化して、システインが、他の抱合体との相互作用のためにその結果生 じる抱合体中で用いられないようにする。修飾化ＦＧＦタンパク質をコードする ＤＮＡをサポリンポリペプチドのＮ末端をコードするＤＮＡに直接、あるいは１ つ、好ましくは２つ又はそれ以上のリンキングペプチド又はアミノ酸をコードす るコドンを介して、結合する。リンキングコドンの数は、その結果生じるＤＮＡ が選択された細胞に対して細胞毒性である融合タンパク質をコードするように選 択する。 修飾化ＦＧＦタンパク質と連鎖細胞毒性物質との組合せは、組換 え体ＤＮＡ法を用いてキメラとして調製する。融合タンパク質分子は、抱合体の ＦＧＦタンパク質部分がそのそれぞれの細胞表面受容体の認識に用いられ、抱合 体をそのそれぞれの細胞表面受容体を含有する細胞に対する標的にし得るような 方法で意図され、生成される。好ましい態様では、ＦＧＦタンパク質は位置７８ 及び９６でシステイン残基をセリン残基に置換することにより修飾したＦＧＦで ある。 その結果生じる抱合体の単一起源性製剤及び本明細書に記載のあらゆる方法で 生成される抱合体の均質組成物を製薬組成物中に用いて、ＦＧＦ受容体を有する 細胞を特異的に標的にして、細胞の増殖を阻害するか又は細胞死を引き起こして 、ＦＧＦ媒介性病態生理学的症状を治療し得る。このような病態生理学的症状と しては、例えば腫瘍の発達、再狭窄、デュピュイトラン拘縮、糖尿病のある種の 合併症例えば増殖性糖尿病性網膜症、及び慢性関節リウマチが挙げられる。治療 は、例えば生理学的に許容可能な賦形剤中の治療的有効量のＦＧＦ抱合体を投与 することにより実施する。さらに、抱合体を用いて細胞毒性物質をＦＧＦ受容体 を有する細胞への標的にして、このような細胞の増殖を阻害することができる。 その結果生じる単一起源性ＦＧＦ抱合体の製剤又は抱合体の均質組成物を抗腫 瘍剤、例えばシスプラチンといっしょに投与し得る。このような組合せ治療は、 ＦＧＦ抱合体の抗腫瘍活性を増強する。特に、ＦＧＦ細胞毒性抱合体といっしょ にシスプラチンを投与すると、ＦＧＦ細胞毒性抱合体の抗腫瘍活性が増強される 。特に、増殖阻害量の細胞毒性抱合体及び細胞毒性量のシスプラチンを投与する ことにより（この場合、各々の量は細胞毒性抱合体及びシスプラチンの組合せが 腫瘍細胞を殺戮するか又はその成長を阻害するような量である）、ＦＧＦ受容体 を保有する腫瘍細胞の増殖を阻害する方 法が提供される。 好ましい態様の詳細な説明 定義 別記しない限り、本明細書中で用いられる技術的及び科学的用語はすべて、本 明細書中の対象物が属する当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。本 明細書中で言及したすべての米国特許及び全出版物は、その全記載内容が参照に より本明細書中に含まれるものとする。 本明細書中に見られる種々のアミノ酸配列で生じるアミノ酸は、それらの十分 公知の三文字又は一文字略語により同定される。種々のＤＮＡ断片で生じるヌク レオチドは、当業界で慣用的に用いられる標準単一文字名称で呼ばれる。 本明細書中で用いる場合、細胞毒性物質としてはサポリン、リシン、アブリン 及びその他のＲＩＰ、シュードモナス外毒素、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質合 成の阻害剤、又は当業者に公知の他の代謝阻害剤が挙げられる。サポリンが好ま しいが、他の適切なＲＩＰとしてはリシン、リシンＡ鎖、トウモロコシＲＩＰ、 ゲロニン、ジフテリア毒素、ジフテリア毒素Ａ鎖、トリコサンチン、トリチン、 アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、オシロイバナ抗ウイルス タンパク質（ＭＡＰ）、Dianthins 32及び30、アブリン、モノルジン、ブリオジ ン、シガ、並びにその他の当業者に公知の物が挙げられる。ＲＩＰという用語は 、本明細書中ではこのような細胞毒素、並びに転写、翻訳、生合成又は分解経路 、ＤＮＡ合成及び他のこのような工程を含めた細胞代謝工程を阻害する、あるい は細胞を殺戮する他の細胞毒素分子を広範に含めて用いられる。 本明細書中で用いる場合、サポリン（本明細書ではＳＡＰと略す ）は、天然植物宿主 Saponaria officinalis中に見出されるアミノ酸配列、並び にアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を有するが依然として本質的リボソーム 不活化活性を発現する修飾配列を有するポリペプチドを指す。サポリンの精製製 剤はしばしば、タンパク質の数個の分子的同形を含むことが観察される。アミノ 酸配列の差は異なる種からのサポリンで、並びに同一種の個々の生物からのサポ リン分子間で生じると理解される。 本明細書中で用いる場合、Ｎ末端延長は、サポリンポリペプチドの生物学的に 活性な部分のアミノ末端に連結するペプチド領域を指す。本明細書中で実証する ように、宿主細胞中でコーディングするＤＮＡを発現させてサポリンを生成した 場合、それはＮ末端延長を伴って発現される。Ｎ末端延長は、サポリン含有タン パク質のサポリンポリペプチド部分を宿主中でのタンパク質の発現時に宿主に対 して非毒性にさせるか又はＮ末端延長を伴わないサポリンポリペプチドの発現よ りも宿主に対して実質的に低い毒性にさせるのに役立つ。２個という少数から多 数個までのアミノ酸を有するＮ末端延長が提供される。Ｎ末端延長の長さは、そ の結果生じる細胞毒性抱合体が細胞表面受容体と結合して、細胞毒性物質を取込 んでそして取込み時に細胞毒性であり、使用し得る限りは、重要でない。上限に 関する正確な数は、当業者に公知の、本明細書中に例示したような細胞毒性検定 を用いて、経験的に確定し得る。目下好ましいＮ末端延長領域は、約２〜15アミ ノ酸のオーダーである。最も好ましいＮ末端延長領域は、約２〜約10アミノ酸の 範囲である。 本明細書中で用いる場合、サポリンのような細胞毒性物質のＮ末端に実質的に 近い位置で行われる修飾は、一般的にはタンパク質の最初の約10残基内で実行さ れる。このような修飾としては、残基の付加又は欠失が挙げられ、例えばシステ インの付加はＦＧＦ受容体 と反応性のポリペプチド又はポリペプチドの断片間の抱合体又は細胞毒性部分が 、限定モル比、好ましくは１：１の細胞毒性物質対ＦＧＦ受容体と反応性のポリ ペプチド又はポリペプチドの断片を含有する細胞毒性物質を生成するのを促す。 本明細書中で用いる場合、有糸分裂毒素はミトゲンにより特異的細胞を標的に する細胞毒性分子である。 本明細書中で用いる場合、細胞毒性物質という用語は、細胞機能を阻害し得る 分子を指す。その物質は細胞の増殖を阻害し、又は細胞に対して有毒である。本 用語は、細胞中に運搬される場合にのみ毒性作用が媒介される物質、及びその毒 性作用が細胞表面で媒介される物質を包含する。種々の細胞毒性物質を用い得る が、その例としては、タンパク質合成を阻害するもの、細胞の成長又は生存に不 可欠なある種の遺伝子の発現を阻害するものが含まれる。細胞毒性物質としては 、細胞死を引き起こすもの、並びに細胞の成長、増殖及び／又は分化を阻害する ものが挙げられる。 本明細書中で用いる場合、リガンドは、細胞表面タンパク質と結合し得る、そ して細胞中へのリガンド含有融合タンパク質の取込みを促進し得るあらゆるポリ ペプチドを指す。このようなリガンドとしては、成長因子、抗体又はその断片、 ホルモン、及び他の型のタンパク質が挙げられる。 本明細書中で用いる場合、”ＦＧＦ受容体と反応性のポリペプチド”という用 語は、ＦＧＦ受容体、好ましくは高親和性ＦＧＦ受容体と特異的に相互作用し、 ＦＧＦ受容体とのその相互作用によって細胞中に運搬されるあらゆるポリペプチ ドを指す。ＦＧＦ受容体と反応性のポリペプチドはさらに本明細書中ではＦＧＦ タンパク質とも呼ばれる。ＦＧＦタンパク質としては、その結果生じるペプチド 又はタンパク質がＦＧＦ受容体と特異的に相互作用し、この相互作 用により取り込まれる限りは、ＦＧＦ族のペプチドの成員、例えばＦＧＦ−１〜 ＦＧＦ−９、任意のＦＧＦ−１〜ＦＧＦ−９のキメラ又はハイブリッド、あるい はアミノ酸の欠失（例えば公告済の国際出願WO 90/02800、国内出願、及びそれ を基礎にした特許を参照）又は挿入を有するＦＧＦが挙げられる。 本明細書中で用いる場合、ＦＧＦは、自然ＦＧＦタンパク質のアミノ酸配列を 有する、並びに自然タンパク質中のアミノ酸置換、欠失、挿入又は付加修飾配列 を有するがしかしＦＧＦ受容体と結合し、取り込まれる能力を保持するポリペプ チドを指す。このようなポリペプチドとしては、ＦＧＦ−１〜ＦＧＦ−９が挙げ られるが、これらに限定されない。例えばｂＦＧＦは一般的に、ウシｂＦＧＦ又 はヒトｂＦＧＦあるいは酸性ＦＧＦと実質的に同じアミノ酸配列及び受容体標的 活性を有するポリペプチドを指す、と理解されるべきである。アミノ酸配列の差 は、異なる種のＦＧＦ間で、並びに個々の生物又は種からのＦＧＦ間で生じ、そ してすべてのＦＧＦがすべてのＦＧＦ受容体亜型と結合する訳ではないと理解さ れる。ＦＧＦは少なくとも１つのＦＧＦ受容体と結合することが必要なだけであ る。 ＦＧＦについての言及は、天然供給源から単離されたタンパク質、並びに例え ば組換え法により、又はおそらくは化学的合成によって合成されたタンパク質を 包含するものとする。ＦＧＦはさらに、ＦＧＦ受容体発現細胞に対してサポリン を標的にする能力を有するＦＧＦのムテインを包含する。このようなムテインと しては、その結果生じるタンパク質がＦＧＦ保有細胞と結合する能力を有して、 結合した細胞毒性物質を取り込む限りにおいて、本明細書中に示すような１つ又 はそれ以上のシステインをセリンで置換することにより生成されるもの、あるい は欠失又は置換されたあらゆる他のアミ ノ酸を有するものが挙げられるが、これらに限定されない。一般的には、このよ うなムテインは、例えば下記の表１に示すような保存性アミノ酸変化を有する。 このようなムテインをコードするＤＮＡは、変性コドンの置換により修飾されな い限り、少なくとも低い緊縮性の条件下でｂＦＧＦをコードするＤＮＡ（配列番 号１２及び１３）と、又は配列番号２４〜３２に記載のあらゆるＦＧＦをコード するＤＮＡとハイブリダイズする。 本明細書中で用いる場合、ＦＧＦペプチド又はＦＧＦ受容体と反応性のポリペ プチドをコードするＤＮＡは、このようなペプチドをコードすると本明細書に記 載されたあらゆるＤＮＡ断片、当業者に公知のあらゆるこのようなＤＮＡ断片、 ＦＧＦ受容体と結合してそれにより取り込まれるＦＧＦをコードし、前述のあら ゆるＤＮＡ断片をプローブとして用いてヒト細胞ライブラリーから単離し得るあ らゆるＤＮＡ断片、配列番号２４〜３２で記載されるあらゆるＦＧＦペプチドを コードするあらゆるＤＮＡ断片（このようなＤＮＡ配列は公的にアクセス可能な データベースで利用可能である。例えばＤＮＡ^*（1993年7 月、DNASTAR，Inc．M adison,WIからリリース；米国特許第4,956,455号、米国特許第5,126,323号、米 国特許第5,155,217号、米国特許第4,868,113号、公告済国際出願WO 90/08771（ 及びその公布時の対応する米国特許）（これは1989年1 月31日提出の米国特許出 願第07/304,281号、及びMiyamoto et al.(1993) Mol．Cell．Biol．13:4251-425 9に基づいている）））、並びに変性コドンの置換により前述のあらゆるＤＮＡ 断片から生成され得るあらゆるＤＮＡ断片を指す。ＦＧＦペプチドのようなペプ チドの完全アミノ酸配列、及びこのようなペプチドをコードするあるＤＮＡ断片 が一旦当業者に利用されると、変性コドンを置換してこのようなペプチドをコー ドする考え得るあらゆるＤＮＡ断片を生成するの は慣例であると理解される。アミノ酸配列に基づいてこのようなペプチドをコー ドするＤＮＡを合成することも一般的には可能である。 本明細書中で用いる場合、ＦＧＦ受容体は、タンパク質のＦＧＦ族の成員と特 異的に相互作用してそれを細胞中に運搬する受容体を指す。これらの例としては 、国際出願WO 91/00916（これは米国特許出願第07/377,033号に基づいている） 、国際出願WO 92/00999（これは米国特許出願第07/549,587号に基づいている） 、国際出願WO90/05522、及び国際出願WO 90/12948に記載された受容体が挙げら れ、並びにImamura(1988) Biochem．Biophys．Res．Comm．155:583-590及びMosc atelli(1987) J．Cell．Physiol．131:123-130も参照さたい。 本明細書中で用いる場合、細胞毒性物質を標的にするとは、ＦＧＦ受容体と反 応性のポリペプチドとその物質を結合させることにより選択された受容体を発現 する細胞にそれを向けることを意味する。受容体との結合に際して、サポリン含 有タンパク質は細胞に取り込まれ、細胞に対して細胞毒性である。 本明細書中で用いる場合、単一起源性抱合体の製剤とは、各抱合体が同一の、 一般的に約１：１の（必ずと言うわけではない）モル比の標的分子対標的化物質 を有する抱合体の製剤である。単一起源性抱合体は、それらが区別のつかない化 学的及び物理的特性を有するという点で実質的に同一であり、一般的にこのよう な抱合体の製剤は１種の抱合体のみを含有する。もちろん、種間にはなんらかの 変異性が存在し、抱合体の各成員の活性が実質的に同一である程度に耐容される と理解される。例えば、本明細書中に示すように細菌宿主中で発現されるサポリ ンは、Ｎ末端で異なる種の混合物を含有し得る。しかしながら、このような組換 えにより生成されたサポリ ンは、本明細書に記載の方法により化学的に抱合される抱合体を生成するのに用 いるのに適している。その結果生じる製剤は、ほんん明細書に記載されているよ うに単一起源性で、各抱合体は同一モル比のＦＧＦタンパク質対標的化物質を含 有するが、しかし各抱合体は必ずしも同一でなく、しかし各抱合体が実質的に同 じ生物学的活性を有するという点で同一である。 本明細書中で使用する場合、抱合体の均質の集団又は組成物とは、集団又は組 成物の構成成員が単一起源性であってさらに集合体を形成しないことを意味する 。 本明細書中で使用する場合、分泌シグナルとは、宿主の細胞質からの前駆体タ ンパク質の細胞質周囲間隙中への又は細胞外成長培地中への分泌を指図する前駆 体タンパク質内のペプチド領域を指す。このようなシグナルは、前駆体タンパク 質のアミノ末端又はカルボキシ末端に存在する。好ましい分泌シグナルは、Ｎ末 端延長領域のアミノ末端と結合する。 本明細書中で用いる場合、ベクター又はプラスミドとは、異種ＤＮＡの発現の ためにあるいはクローン化異種ＤＮＡの置換のために細胞中に異種ＤＮＡを導入 するために用いられる別々の要素を指す。このようなベクター及びプラスミドの 選択及び使用は、十分、当業者のレベル内である。 本明細書中で用いる場合、発現ベクターは、このようなＤＮＡ断片の発現を実 行できる例えばプロモーター領域のような調節配列との有効連鎖において存在す るＤＮＡ断片を発現し得るベクターを包含する。したがって、発現ベクターとは 、組換え体ＤＮＡ又はＲＮＡ構築物、例えばプラスミド、ファージ、組換え体ウ イルス、又は適切な宿主細胞中導入するとクローン化ＤＮＡの発現を引き起こす 他のベクターを指す。適切な発現ベクターは当業者には十分公知で あって、その例としては真核細胞及び／又は原核細胞中で複製可能なもの、並び に依然としてエピソーム性であるか又は宿主細胞ゲノムに組み込まれるものが挙 げられる。 本明細書中で用いる場合、プロモーター、エンハンサー、転写及び翻訳停止部 位のようなヌクレオチドの調節及びエフェクター配列、並びに他のシグナル部位 との異種ＤＮＡの有効連鎖又は有効会合とは、このようなＤＮＡとヌクレオチド のこのような配列との間の機能的関係を指す。例えば異種ＤＮＡのプロモーター との有効連鎖とは、このようなＤＮＡの転写が読取り枠内のＤＮＡを特異的に認 識し、結合し、転写するＲＮＡポリメラーゼによりプロモーターから開始される ようなＤＮＡ及びプロモーター間の物理的及び機能的関係を指す。 本明細書中で用いる場合、プロモーター領域とは、それが有効に結合されるＤ ＮＡの転写を制御する遺伝子のＤＮＡの部分を指す。プロモーター領域の一部分 は、ＲＮＡポリメラーゼ認識、結合及び転写開始に十分なＤＮＡの特異的配列を 包含する。プロモーター領域のこの部分はプロモーターと呼ばれる。さらに、プ ロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼのこの認識、結合及び転写開始活性を調 節する配列を包含する。これらの配列はシス作用性であるか又はトランス作用性 因子に反応する。プロモーターは、調節の性質によって、構成要素を成すか又は 調節される。本明細書中での使用に関しては、誘導プロモーターが好ましい。宿 主により発現されるＲＮＡポリメラーゼによりプロモーターを認識する。ＲＮＡ ポリメラーゼは宿主に対して内生的であるか、又は宿主中での遺伝子工学的処理 により、宿主染色体の一部として又はサポリン含有ポリペプチドをコードするＤ ＮＡを含有するプラスミドを含めたエピソーム性要素上で導入される。本明細書 での使用に最も好ましいプロモーターは 、誘導がない場合には、サポリン含有タンパク質が発現されないようにしっかり 調節される。 本明細書中で用いる場合、転写終結領域は、（ａ）ポリアデニル化シグナル及 び転写体中のポリアデニル化部位をコードするサブセグメント、及び／又は（ｂ ）選定プロモーターを認識するポリメラーゼにより転写を終結する転写終結シグ ナルを提供するサブセグメントを有する。完全転写ターミネーターは、プロモー ターの供給源である遺伝子と同一であっても異なってもよいタンパク質コード遺 伝子から得られる。好ましい転写ターミネーター領域は、大腸菌中で機能的な領 域である。転写ターミネーターは本明細書中では発現系の任意の成分であるが、 好ましい態様においては用いられる。 本明細書中で用いる場合、トランスフェクションとは、宿主細胞によるＤＮＡ 又はＲＮＡの取込みを指す。形質転換は、ＤＮＡが染色体外要素として又は宿主 の染色体ＤＮＡの一部として複製されるような方法で実行されるこの工程を指す 。トランスフェクション及び形質転換を実行するための方法及び手段は、当業者 には十分公知である（例えばWigler et al.(1979) Proc．Natl．Acad．Sci．USA 76:1373-1376; Cohen et al.(1972) Proc．Natl．Acad．Sci．USA 69:2110 参 照）。 本明細書中で用いる場合、生物学的に活性なという用語、あるいはサポリン含 有ポリペプチドの生物学的活性又はサポリン含有ポリペプチドの細胞毒性につい ての言及は、in vivo 又はin vitroでリボソームの不活化によりタンパク質合成 を阻害する、あるいは細胞によるサポリン含有ポリペプチドの取込み時に細胞の 成長を阻害するか又は細胞を殺戮するこのようなポリペプチドの能力を指す。好 ましい生物学的活性サポリンポリペプチドは、細胞に入った場合に真核細胞に対 して有毒であるものである。このような生物学的又は 細胞毒性活性は、当業者に公知のあらゆる方法により、例えばタンパク質合成を 測定するin vitro検定、及び細胞増殖又はタンパク質合成に及ぼす被験物質の作 用を測定することにより細胞毒性を検定するin vivo 検定により検定し得るが、 これらに限定されない。しかしながら特に好ましいのは、標的化細胞中の細胞毒 性を査定する検定である。 本明細書中で用いる場合、ＦＧＦ媒介性病態生理学的症状とは、ｂＦＧＦ有糸 分裂刺激に感受性の細胞の増殖を特徴とするか又はそれにより引き起こされる有 害な症状を指す。塩基性ＦＧＦ媒介性病態生理学的症状としては、ある種の腫瘍 、慢性関節リウマチ、再狭窄、デュピュイトラン拘縮及び糖尿病のある種の合併 症例えば増殖性網膜症が挙げられるが、これらに限定されない。 本明細書中で用いる場合、実質的に純粋なとは、当業者が用いる薄層クロマト グラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ Ｃ）のような標準的方法により測定した場合に容易に検出可能な不純物が含有さ れないと思われるに十分に均質なという、あるいはさらに精製しても物質の酵素 活性及び生物学的活性といったような物理的及び化学的特性の変化が検出されな いほど十分に純粋なという意味である。実質的に化学的に純粋な化合物を生成す るための化合物の精製方法は、当業者には公知である。しかしながら実質的に化 学的に純粋な化合物は、立体異性体の混合物である。このような場合、さらに精 製すると化合物の特定の活性を増大し得る。 本明細書中で用いる場合、単離された実質的に純粋なＤＮＡとは、当業者に用 いられる標準技法により精製されたＤＮＡ断片を指す（例えばManiatis et al.( 1982) Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborato ry Press，Cold Spring Ha rbor，NY 及びSambrook et al.(1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manua l, Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY 参照）。 本明細書中で用いる場合、特定緊縮条件下でハイブリダイズすることは、２つ の１本鎖ＤＮＡ断片間に形成されるハイブリッドの安定性を説明するために用い られ、洗浄の場合より低い又はそれと等しい緊縮の条件下でのアニーリング後、 このようなハイブリッドを洗浄するイオン強度及び温度の条件を指す。一般的に は高、中及び低緊縮は以下の条件又はそれと等価の条件を包含する： １）高緊縮： 0.1 x SSPE又はSSC，0.1% SDS，65 ℃。 ２）中緊縮： 0.2 x SSPE又はSSC，0.l% SDS，50 ℃。 ３）低緊縮： 0.1 x SSPE又はSSC，0.1% SDS，50 ℃。 等価条件とは、その結果生じるハイブリッド中での実質的に同一パーセンテージ の不適正を選択する条件を指す。ホルムアミド、フィコール、デンハートDenhar dt溶液といった成分の付加は、ハイブリダイゼーションが実施される温度及び反 応の速度といったパラメーターに影響を及ぼす。したがって20% ホルムアミド中 で42℃で5 xＳＳＣでのハイブリダイゼーションは、低緊縮の条件下での上記ハ イブリダイゼーション条件と実質的に同じである。ＳＳＰＥ、ＳＳＣ及びデンハ ートDenhardt溶液に関するレシピ並びに脱イオン化ホルムアミドの調製は、例え ばSambrook et al.(1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spri ng Harbor Laboratory Press，Chapter 8 に記載されている（Sambrook et al. ，vol.3，p.B.13 参照。さらに一般に用いられる実験室溶液を記載した多数の 目録も参照）。ＳＳＰＥはpH7.4 リン酸塩緩衝化0.18 ＮａＣｌである。 本明細書中で用いる場合、発現とは、核酸がｍＲＮＡに転写され て、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に翻訳される工程を指す。核酸がゲ ノムＤＮＡ由来である場合、発現は、適切な真核宿主細胞又は生物を選択すれば 、ｍＲＮＡのスプライシングを包含し得る。 本明細書中で用いる場合、”培養”とは、それらの成長を伝導する培地中での 細胞の繁殖及びそのすべての継代培養を指す。”継代培養”という用語は、当該 継代培養及び供給源培養間で実施された継代培養回数には関係なく、別の培養（ 供給源培養）の細胞から成長した細胞の培養、又は供給源培養のあらゆる継代培 養を指す。 本明細書中で用いる場合、核酸についての言及は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮ Ａ、三本鎖、二本鎖又は一本鎖ＲＮＡを含めたあらゆる形態のＲＮＡ、アンチセ ンスＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、一本鎖ヌクレオチド並び にその誘導体を包含する。 本明細書中で用いる場合、特定疾患の治療のための化合物の有効量とは、疾患 に関連した症状を改善する、又は何らかの方法で軽減するのに十分な量である。 このような量を１回投与量として投与し、あるいはレジメンにしたがって投与す れば、有効である。その量は疾患を治癒し得るが、しかし一般的には疾患の症状 を改善する為に投与する。症状の所望の改善を達成するためには、反復投与が必 要である。 本明細書中で用いる場合、抱合体の製薬上許容可能な塩、エステル又は他の誘 導体は、このような誘導のための公知の方法を用いて当業者により容易に調製さ れる、並びに実質的な毒性作用を伴わずに動物又はヒトに投与し得る、そして製 薬的に活性であるか又はプロドラッグである化合物を生成するあらゆる塩、エス テル又は誘導体を包含する。 本明細書中で用いる場合、プロドラッグは、in vivo投与した場 合に、生物学的、製薬的又は治療的に活性な形態の化合物に代謝されるか又は別 の方法で変換される化合物である。プロドラッグを生成するには、製薬的に活性 な化合物を修飾して、活性化合物が代謝工程により再生されるようにする。プロ ドラッグは、薬物の代謝安定性又は運搬特性を変え、副作用又は毒性を遮蔽し、 薬物の風味を改善するかあるいは薬物の他の特徴又は特性を変えるよう設計され る。In vivo の薬力学的工程及び薬物代謝の知識に基づいて、当業者は、一旦製 薬的に活性な化合物が分かれば、その化合物のプロドラッグを設計し得る（例え ばNorgrady(1985) Medical Chemistry A Biochemical Approach，Oxford Univer sity Press，New York，pages 388-392 参照）。 本明細書中で用いる場合、治療とは、状態、障害又は疾患の症状が改善される か又は別の方法で有益に変えられるあらゆる方法を意味する。治療はさらに、本 明細書の組成物のあらゆる製薬的使用を包含する。 本明細書中で用いる場合、特定の製薬組成物の投与による特定の障害の症状の 改善とは、恒久的であるか又は一時的か、継続的か一過性かにかかわらず、組成 物の投与が関与するか又は関連するあらゆる低減を指す。 本明細書中で用いる場合、ＥＤ₅₀とは、一般的には72時間又は他の特定時間、 ＦＧＦ−ＳＡＰのような毒素と一緒にインキュベーション後に、50% の細胞が殺 戮される濃度を指す。 本明細書中で用いる場合、ＩＤ₅₀とは、処置細胞におけるタンパク質合成を、 タンパク質の非存在下でのタンパク質合成の50% まで阻害するのに要するサポリ ン含有タンパク質の濃度を指す。 Ａ．ポリペプチド及び細胞毒性物質の調製 １．ＦＧＦ受容体と反応性のポリペプチド 本明細書の方法には、ＦＧＦ受容体と反応性のあらゆるポリペプチドを用い得 る。ＦＧＦ−１〜ＦＧＦ−９を含めたＦＧＦペプチド族の成員が特に好ましい。 ポリペプチドの修飾は、当業者に公知のあらゆる手段により実施し得る。本発明 の好ましい方法は、ポリペプチドをコードするＤＮＡの修飾及び修飾ＤＮＡの発 現に依る。 ＦＧＦポリペプチドをコードするＤＮＡは単離され、合成されるか、あるいは 市販の供給源から得られる（ＦＧＦ−１〜ＦＧＦ−９のアミノ酸配列は配列番号 ２４〜３２に記載されている；ＤＮＡ配列はこれらのアミノ酸配列を基礎にする か又は当業者に公知のものである（例えばＤＮＡ（1993年7 月DNASTAR，Inc．Ma dison，WI からリリース）参照。さらに米国特許第4,956,455号、米国特許第5,1 26,323号、米国特許第5,155,217号、米国特許第4,868,113号、公告済国際出願WO 90/08771（及びその公布時の対応する米国特許第号）（これは1989年1 月31日 提出の米国特許出願第07/304,281号、及びMiyamoto et al.(1993) Mol．Cell．B iol．13:4251-4259に基づいている）参照））。酵母菌及び大腸菌における組換 え体ｂＦＧＦの発現は、Barr et al.，J．Biol．Chem．263:16471-16478(1988） 、同時係属中の国際ＰＣＴ出願PCT/US93/05702及び同時係属中の米国特許出願第 07/901,718号に記載されている。組換え体ＦＧＦタンパク質の発現は、本発明に 記載されているように実施し得る。ＦＧＦタンパク質をコードするＤＮＡは、本 発明の方法の出発物質として用い得る。 突然変異は、タンパク質をコードするＤＮＡの座位特異的又は特定部位の突然 変異誘発、並びにＤＮＡ鋳型における変化を誘発及び増幅するためにプライマー を用いるＤＮＡ増幅法の使用を含めた当業者に公知のあらゆる方法により実施し 得る。座位特異的突然変異誘発は一般的には、一本鎖及び二本鎖形態を有するフ ァージベクタ ー、例えば十分公知の市販されているＭ１３ファージベクターを用いて実施し得 る。複製の一本鎖ファージオリジンを含有する他の適切なベクターを用いてもよ い（例えばVeira et al.(1987) Meth．Enzymol．15:3参照）。概して、特定部位 の突然変異誘発は、当該タンパク質（即ちＦＧＦ族の一成員又は細胞毒性分子、 例えばサポリン）をコードする一本鎖ベクターを調製することにより実施する。 一本鎖ベクター中のＤＮＡと相同の領域内に所望の突然変異を含有するオリゴヌ クレオチドプライマーをベクターとアニーリングした後、ＤＮＡポリメラーゼ、 例えば大腸菌ポリメラーゼＩクレノウ断片を付加するが、これはヘテロ二重鎖を 生成するためにプライマーとして二本鎖領域を用い、この場合、一本の鎖は変化 した配列をコードし、他の鎖は元の配列をコードする。ヘテロ二重鎖を適切な細 菌細胞に導入し、所望の突然変異を含有するクローンを選択する。その結果生じ る変化したＤＮＡ分子を適切な宿主細胞中で組換え的に発現させて、修飾タンパ ク質を生成する。 アミノ酸の適切な保存的置換は当業者には公知であって、一般的にその結果生 じる分子の生物学的活性を変えることなく作製される。概して、ポリペプチドの 非必須領域中の単一アミノ酸置換は生物学的活性を実質的に変えないことを、当 業者は認識している（例えばWatson et al．Molecular Biology of the Gene，4 th Edition,1987，The Bejacmin/Cummings Pub．co.，p.224参照）。 このような置換はおそらく、下記の表１に記載されたものによってなされるも のと思われる： 他の置換も可能であって、経験的に又は公知の保存的置換にしたがって確定し 得る。 ２．細胞毒性物質 サポリン及び他のリボソーム不活化タンパク質（ＲＩＰ）が、本発明で使用す るのに好ましい細胞毒性物質である。取り込まれた場合に細胞成長、細胞増殖又 は他の必須細胞機能を阻害するあらゆる細胞毒性物質が本発明に使用できる。こ のような細胞毒性物質は本 明細書に記載のＲＩＰと機能的に等価であると考えられ、その例としてはサポリ ン、リシン、アブリン及び他のＲＩＰ、シュウドモナス外毒素、ＤＮＡ、ＲＮＡ 又はタンパク質合成の阻害剤、あるいは当業者に公知の他の代謝阻害剤が挙げら れるが、これらに限定されない。サポリンが好ましいが、しかし他の適切なＲＩ Ｐとしてはリシン、リシンＡ鎖、トウモロコシＲＩＰ、ゲロニン、ジフテリア毒 素ジフテリア毒素Ａ鎖、トリコサンチン、トリチン、アメリカヤマゴボウ抗ウイ ルスタンパク質（ＰＡＰ）、オシロイバナ抗ウイルスタンパク質（ＭＡＰ）、ジ アンチン Dianthin３２及び３０、アブリン、モノルジン、ブリオジン、シガ並 びに当業者に他の公知のものが挙げられるが、これらに限定されない（例えばBa rbieri et al.(1982) Cancer Surveys 1:489-520 及び公告済の欧州特許出願第 0466 222号（多数のＲＩＰ及びそれらの供給源のリストを提示する）（参照によ り本明細書中に含めるものとする）、さらに米国特許第5,248,608号（Walsh et al.）（これはトウモロコシからのＲＩＰを提示する）参照）。 選択した細胞毒性物質は、必要な場合には、誘導して選択ＦＧＦ上のシステイ ンと反応性の基を生成する。誘導により反応性種の混合物が生じた場合は、モノ 誘導化形態の細胞毒性物質を単離して、突然変異化ＦＧＦと抱合させる。 ａ．サポリン及びサポリンをコードするＤＮＡの単離 本発明ではサポリンが好ましい。サポリンポリペプチドは、Saponaria offici nalis 又は関連種から単離されるサポリンのあらゆるアイソフォーム、あるいは 細胞毒性活性を保持する修飾化形態を包含する。特にこのような修飾化サポリン は、１つ又はそれ以上のアミノ酸を変えるか、あるいは１つ又はそれ以上のアミ ノ酸、例えばＦＧＦ又は他の細胞表面結合タンパク質との抱合を容易にするシス テインを欠失又は挿入することにより、タンパク質をコードするＤＮＡを修飾す ることにより生成し得る（例えば国際ＰＣＴ出願 PCT/US 93/05702（1993年6 月 14日提出）（米国特許出願第07/901,718号の一部継続である）参照；さらに同時 係属中の米国特許出願第07/885,242号（1992年5 月20日提出）及び1992年1 月15 日にイタリアで譲渡された特許第1231914号参照）。本発明に記載されているよ うなＦＧＦと抱合する場合に、標準in vitro又はin vivo 検定において、本明細 書に記載のサポリン抱合体の少なくともおよその大きさの等級内で細胞毒性を示 すこのようなサポリン又はその一部分はすべて、本発明に使用し得るものとする 。 したがって、本発明で用いるＳＡＰは、天然供給源から単離した、又は組換え 体発現により生成したあらゆるタンパク質を包含する（例えば同時係属中の国際 ＰＣＴ出願PCT/US 93/05702（1993年6 月14日提出）（1992年6 月16日提出の米 国特許出願第07/901,718号の一部継続である）参照；さらに下記の実施例１参照 ）。 ＳＡＰ又はあらゆる細胞毒性物質をコードするＤＮＡは、本発明の組換え法に 用い得る。細胞毒性物質がシステイン残基を含有しない場合には、この場合ＳＡ ＰをコードするＤＮＡを選択すると、ＤＮＡは修飾されてシステインコドンを含 有する。コドンは、その結果生じるタンパク質の細胞毒性を低減しないか又はほ ぼ一等級未満の大きさだけ低減するあらゆる遺伝子座に挿入し得る。このような 遺伝子座は、タンパク質を修飾し、細胞無含有タンパク質合成検定のような検定 で細胞毒性に関してそれを試験することにより経験的に確定し得る。システイン 残基の挿入のためのＳＡＰにおける好ましい遺伝子座は、Ｎ末端又はその近く（ Ｎ末端の約10残基内）である。 ｂ．サポリン含有ポリペプチドの発現のための宿主細胞 宿主生物としては、異種タンパク質の組換え体生成が実施されたことのある生 物、例えば細菌（例えば大腸菌）、酵母菌（例えばビール酵母菌 Saccharomyces cerevisiae及びPichia pastoris）、哺乳類細胞、昆虫細胞が挙げられるが、こ れらに限定されない。目下好ましい宿主生物は細菌株である。最も好ましい宿主 生物は大腸菌株である。 ｃ．サポリンの組換え体生成方法 細胞毒性物質例えばサポリンタンパク質をコードするＤＮＡを、選択した宿主 生物中でのポリペプチドの発現のために適切なプロモーターとの有効連鎖でプラ スミドに導入する。目下好ましいサポリンタンパク質は、Ｃｙｓ残基の付加によ りあるいはサポリンのアミノ−又はカルボキシル末端又はその付近で非必須残基 のＣｙｓによる置換によって修飾されたサポリン残基である。配列番号７のよう なサポリンは、Ｎ末端でのＭｅｔ−Ｃｙｓ残基の挿入により修飾され、そしてそ れぞれ位置４及び１０でのＡｓｎ又はＩｌｅ残基の置換により修飾されている（ 実施例４参照）。サポリンをコードするＤＮＡ断片はさらに、ペリプラズム又は 培地中に成熟ポリペプチドを向かわせるよう選択された宿主中で機能するタンパ ク質分泌シグナルを包含する。その結果生じるサポリンタンパク質は、当業界で 慣用的に用いられる方法、例えば本発明の実施例に記載の方法により精製し得る 。 適切な宿主細胞、好ましくは細菌細胞、さらに好ましくは大腸菌細胞の形質転 換方法、並びに異種タンパク質をコードする遺伝子を含有する上記の細胞を培養 するのに用いうる方法は、当業界で一般に公知である（例えばSambrook et al.( 1988) Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laborat ory Press,Cold Spring Harbor，NY 参照）。 あらゆる適切な方法、例えばプラスミド、ウイルス又は細菌ファージベクター を用いた形質転換、トランスフェクション、電気穿孔法、リポフェクション等（ これらに限定されない）により、サポリンタンパク質をコードするＤＮＡ構築物 を宿主細胞に導入する。異種ＤＮＡは、任意にサポリン含有プラスミドの染色体 外保持を可能にする複製のオリジンのような配列を含み得るか、又は宿主のゲノ ムに組み込まれるよう意図される（宿主中の安定な保持を確かにするための代替 手段として）。 陽性形質転換は、ＤＮＡ組込みの部位に関してはサザンブロット分析（Sambro ok et al.(1988) Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harb or Laboratory Press,Cold Spring Harbor，NY）により、誘導プロモーター反応 性サポリン遺伝子発現に関してはノーザンブロットにより、そして細胞質、ペリ プラズム又は成長培地中のサポリン含有タンパク質の存在に関しては生成物分析 により特性化し得る。 サポリンコードＤＮＡ断片が一旦宿主細胞中に導入されれば、プロモーターが 誘導され、それにより有効に連鎖したＤＮＡが転写される条件下に宿主細胞を置 くことにより、所望のサポリン含有タンパク質を生成し得る。好ましい態様では 、このような条件は、大腸菌ｌａｃオペロンからの発現を誘導するものである。 サポリン我宇タンパク質をコードするＤＮＡを含有するプラスミドはさらに、プ ロモーター内にｌａｃオベレーター（Ｏ）領域を包含し、ｌａｃリプレッサータ ンパク質をコードするｌａｃ遺伝子も含み得る（例えばMuller-Hill et al.(196 8) Proc．Nadtl．Acad．Sci USA 59:1259-12649参照）。ｌａｃリプレッサーは 、サポリン含有タンパク質をコードするＤＮＡの転写を誘導するのに十分な量で のＩＰＴＧの付加により誘導されるまで、ｌａｃプロモーターからの発現を抑制 する。 したがって、大腸菌中でのサポリンの発現は、二段階工程で達成される。第一 段階では、形質転換化大腸菌細胞の培養を形質転換中のプラスミド内のサポリン 含有タンパク質の発現、好ましくは実施例４に記載されているようなサポリンの コード化がｌａｃリプレッサーによって抑制されるような条件下で増殖させる。 この段階出は、細胞密度は増大する。最適密度に達すると、リプレッサーのオペ レーターとの結合を阻止し、それによりｌａｃプロモーター及びサポリンコード ＤＮＡの転写を誘導するＩＰＴＧの付加により第二段階が開始する。 好ましい態様では、プロモーターはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターで あり、これをｌａｃオペレーターと連結させると、大腸菌宿主株は、ｌａｃオペ レーター及びプロモーター、好ましくはｌａｃＵＶ５プロモーターと任意に連結 するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを包含する。目下の好ましい プラスミドは、ｐＥＴ １１ａ（NOVAGEN，Madison，WI）で、これはＴ７ ｌａ ｃプロモーター、Ｔ７ターミネーター、誘導大腸菌ｌａｃオペレーター及びｌａ ｃリプレッサー遺伝子を含有する。Ｈｉｓカラム及びカラム上での精製後の切断 を可能にするトロンビン切断部位による精製に用いるためのＨｉｓ−Ｔａｇ^TMリ ーダー配列（配列番号３６）、Ｔ７−ｌａｃプロモーター領域及びＴ７ターミネ ーターを含有するプラスミドｐＥＴ１５ｂ（NOVAGEN，Madison，WI）を、サポリ ンの発現のために本発明で用いた。ＩＰＴＧの付加は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ 及びＴ７プロモーター（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより認識される）の発現を誘 導する。 当業界で十分公知の適切な方法により、発酵器中で所望の表現型及び遺伝子型 を有する形質転換株を増殖させる。第一（又は成長） 段階では、発現宿主を、誘導条件を、好ましくはＩＰＴＧを欠いた限定最小培地 中で培養する。このような条件下で増殖させると、異種遺伝子発現が完全に抑制 され、異種タンパク質発現の非存在下で細胞塊が生成される。異種遺伝子発現の 抑制下手の増殖期間後、誘導物質、好ましくはＩＰＴＧを発酵ブロスに加え、そ れによりＩＰＴＧ反応性プロモーター（ｌａｃオペレーターを含有するプロモー ター領域）と有効に連結したあらゆるＤＮＡの発現を誘導する。この最終段階は 誘導段階である。 その結果生じるサポリン含有タンパク質は、当業界で慣用的に用いられる方法 により、例えば実施例１．Ｅ〜Ｆ及び２．Ｄに記載去れているような適切なアフ ィニティーカラム；硫酸アンモニウムによる沈殿；ゲル濾過；クロマトグラフィ ー分離用平床等電点電気泳動；ゲル電気泳動；高性能液体クロマトグラフィー（ ＨＰＬＣ）等を用いて、他の発酵生成物から適切に単離し得る。サポリンの単離 方法は、実施例１で提供される（Lappi et al(1985) Biochem．Biophys．Res．C ommun．129:934-942 参照）。発現サポリンタンパク質は、細胞質、ペリプラズ ム、または細胞培地から単離する（下記のＢ．１．ｂの考察参照。並びに好まし い方法及びサポリンタンパク質に関しては例えば実施例４参照）。 ３．ＦＧＦペプチド、細胞毒性物質及びＦＧＦペプチド細胞毒性物質キメラの 発現のためのプラスミド ＤＮＡ構築物を所望の宿主中での発現のためにプラスミドに導入する。好まし い態様では、宿主は細菌宿主である。プロモーター及びオペレーターのような調 節領域であるプラスミド中のヌクレオチドの配列は、サポリン含有タンパク質を コードするヌクレオチドの配列の転写のための別の配列に操作的に関連する。サ ポリン含有タンパク質をコードするヌクレオチドの配列は分泌シグナルをコード するＤＮＡを含み、それによりその結果生じるペプチドはサポリンの前駆体であ る。その結果生じる処理済サポリンタンパク質は、その結果生じるタンパク質が 元のサポリンと同一であるように処理去れていない場合には、元のサポリンタン パク質の細胞毒性活性を保持し、ペリプラズム間隙又は発酵培地から回収される 。 好ましい態様では、ＤＮＡプラスミドはさらに転写ターミネーター配列を含有 する。プロモーター領域及び転写ターミネーターは、同一の又は異なる遺伝子か ら各々別々に選択される。 本発明で使用するプラスミドは、好ましくはサポリン含有タンパク質をコード するＤＮＡと使用可能的に関連してプロモーターを包含し、細菌宿主中でのタン パク質の発現のために設計される。サポリンの発現のためにはしっかり調節でき るプロモーターが好ましいということが判明している。サポリン含有タンパク質 の発現に適したプロモーターは広範に利用され、当業界で十分公知である。調節 領域と結合する誘導プロモーター又は構成プロモーターが好ましい。このような プロモーターとしては、Ｔ７ファージプロモーター及び他のＴ７様ファージプロ モーター、例えばＴ３、Ｔ５及びＳＰ６プロモーター、ｔｒｐ、ｌｐｐ及びｌａ ｃプロモーター例えば大腸菌からのｌａｃＵＶ５；バキュロウイルス／昆虫細胞 発現系のＰ１０又は多面体遺伝子プロモーター、及び他の真核生物発現系からの 誘導プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。サポリン含有タンパ ク質の発現のために、このようなプロモーターをｌａｃオペロンのような制御領 域と有効に連鎖してプラスミド中に挿入する。 好ましいプロモーター領域は、大腸菌中で誘導性及び機能的であるものである 。適切な誘導プロモーター及びプロモーター領域の例としては、イソプロピルβ −Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴ Ｇ；例えばNakamura et al.(1979) Cell 18:1109-1117参照）に反応性の大腸菌 ｌａｃオペレーター；重金属（例えば亜鉛）誘導に反応性のメタロチオネインプ ロモーター金属調節エレメント（例えば米国特許第4,870,009号(Evans et al.) 参照）；及びＩＰＴＧに反応性のファージＴ７ｌａｃプロモーター（例えば米国 特許第4,952,496号；及びStudier et al.(1990) Meth．Enzymol.185:60-89参照 ）が挙げられるが、これらに限定されない。 プラスミドはさらに、好ましくは選択マーカー遺伝子又は宿主中で機能性の遺 伝子を含む。選択マーカー遺伝子は、形質転換細菌細胞が同定され、膨大な非形 質転換細胞中から選択的に増殖されるようにする細菌に表現型を賦与するあらゆ る遺伝子を含む。細菌宿主として適した選択マーカーは、例えばアンピシリン耐 性遺伝子（Ａｍｐ’）、テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃ’）及びカナマイシ ン耐性遺伝子（Ｋａｎ’）が挙げられる。目下はカナマイシン耐性遺伝子が好ま しい。 好ましいプラスミドはさらに、操作可能的サポリン含有タンパク質の分泌のた めのシグナルをコードするＤＮＡを含む。使用に適した分泌シグナルは広範に利 用可能で、当業界で十分公知である。大腸菌中で機能性の原核生物及び真核生物 分泌シグナルを用い得る。目下好ましい分泌シグナルとしては、以下の大腸菌遺 伝子によりコードされるものが挙げられるが、これらに限定されない：ｏｍｐＡ 、ｏｍｐＴ、ｏｍｐＦ、ｏｍｐＣ、ベータラクタマーゼ及びアルカリ性ホスファ ターゼ等（von Heijne(1985) J．Mol．Biol．184:99-105）。さらに細菌ｐｅｌ Ｂ遺伝子分泌シグナル（Lei et al.(1987) J．Bacteriol.169:4379）、ｐｈｏＡ 分泌シグナル及び昆虫細胞中で機能性のｃｅｋ２を用い得る。最も好ましい分泌 シグナルは、大腸菌ｏｍｐＡ分泌シグナルである。当業者に公知のその他の原核 生物及び真核生物分泌シグナルも用い得る（例えばvon Heijne(1985）J．Mol．B iol．184:99-105 参照）。本明細書に記載の方法を用いて、当業者は、酵母菌 、昆虫又は哺乳類細胞中でこれらの細胞からサポリン含有タンパク質を分泌する ために機能する分泌シグナルを置換し得る。 大腸菌細胞の形質転換に特に好ましいプラスミドは、ｐＥＴ発現ベクターを包 含する（米国特許第4,952,496号(NOVAGEN，Madison,WI)参照）。このようなプラ スミドとしては、ｐＥＴ １１ａ（Ｔ７ｌａｃプロモーター、Ｔ７ターミネータ ー、誘導大腸菌ｌａｃオペレーター及びｌａｃリプレッサー遺伝子を含有）；ｐ ＥＴ １２ａ（Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーター及び大腸菌ｏｍｐＴ分泌 シグナル含有）；及びｐＥＴ １５ｂ(NOVAGEN，Madison，WI）（Ｈｉｓカラム 及びカラム上での精製後の切断を可能にするトロンビン切断部位による精製に用 いるためのＨｉｓ−Ｔａｇ^TMリーダー配列（配列番号３６）を含有）が挙げられ る。 他の好ましいプラスミドとしては、ｐＫＫプラスミド、特にｐＫＫ ２２３− ３（ＴＡＣプロモーター含有）（Pharmaciaから入手；Brosius et al.(1984) Pr oc.，Natl．Acad．Sci．81:6929; Ausubel et al.，Current Protocols in Mole cular Biology；米国特許第5,122,463号、第5,173,403号、第5,187,153号、第5, 204,254号、第5,212,058号、第5,212,286号、第5,215,907号、第5,220,013号、 第5,223,483号及び第5,229,279号参照）（ＴＡＣプロモーター含有）が挙げられ る。プラスミドｐＫＫは、Ｓｃａｌでの消化によるアンピシリン耐性マーカー遺 伝子の崩壊、並びにＥｃｏＲＩ付着端を除去し、盲端を生成するためにＨｉｎｃ ＩＩで切断したカナマイシン耐性カセット（Pharmaciaから購入；ｐＵＣ４Ｋか ら得られた。例えばVieira et al.(1982) Gene 19:259-268;及び米国 特許第4,719,179号参照）の挿入により修飾された。バキュロウイルスベクター 、例えばｐＢｌｕｅＢａｃ（ｐｊＶＥＴＬとも呼ばれる。及びその誘導体）ベク ター、特にｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（例えば米国特許第5,278,050号、第5,244,8 05号、第5,243,041号、第5,242,687号、第5,266,317号、第4,745,051号及び第5, 169,78４号参照；INVITROGEN，San Diegoから入手）は、昆虫細胞中でのポリペ プチドの発現のために用い得る。ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩベクターは二重プロモ ーターベクターであって、このプラスミドが昆虫認識ＥＴＬプロモーターの制御 下ではβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）を含有し、ＩＰＴＧにより誘導 可能であるので、青色／白色スクリーニングによる組換え体の選択を提供する。 ＤＮＡ構築物をバキュロウイルスベクターｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（INVITROGEN ，San Diego）に挿入して、昆虫細胞に野性型ウイルスを同時トランスフェクト した（ｓｆ９細胞；例えばLuckow et al.(1988) Bio/technology 6:47-55 及び 米国特許第4,745,051号参照）。 他のプラスミドとしては、ｐＩＮ−ＩＩＩｏｍｐＡプラスミド（米国特許第4, 575,013号(Inouye)参照; Duffaud et al.(1987) Meth．Enz.153:492-507も参照 ）、例えばｐＩＮ−ＩＩＩｏｍｐＡ２が挙げられる。ｐＩＮ−ＩＩＩｏｍｐＡプ ラスミドは、大腸菌のリポタンパク質由来の４つの機能性断片による読取り相で の転写発現のために連結される異種ＤＮＡ（サポリン含有タンパク質をコードす るＤＮＡ）に対する挿入部位を含む。プラスミドはさらに、所望のポリペプチド がそのアミノ末端でｏｍｐＡシグナルペプチドにより発現され、それにより細胞 質膜を通して有効な分泌がなされるように位置する大腸菌のｏｍｐＡ部分のシグ ナルペプチドをコードするＤＮＡ断片を含む。プラスミドはさらに、所望のポリ ペプチドの転写発現のために適正な配向で位置する大腸菌ｌａｃプロモーター− オペレーターの特異的セグメントをコードするＤＮＡ、並びにそれからの転写を 防止するためにｌａｃオペロン誘導物質の非存在以下で、ｌａｃプロモーター− オペレーターと相互作用する関連リプレッサー分子をコードする別々の機能性大 腸菌ｌａｃＩ遺伝子を含む。所望のポリペプチドの発現は、リポタンパク質（ｌ ｐｐ）プロモーター及びｌａｃプロモーター−オペレーターの制御下にあるが、 しかしいずれかのプロモーターからの転写は通常はリプレッサー分子により遮断 される。リプレッサーは、誘導物質分子により選択的に不活性化され、それによ り両プロモーターからの所望のポリペプチドの転写発現を誘導する。 好ましい態様では、ＤＮＡ断片は細菌細胞中で、好ましくは大腸菌中で複製さ れる。好ましいＤＮＡ断片はさらに、細菌の世代から世代へＤＮＡ断片を確実に 維持するための、複製の細菌オリジンを含む。この方法では、細菌中での複製に より大量のＤＮＡ断片が生成される。複製の好ましい細菌オリジンとしては複製 のｆｌ−ｏｒｉ及びｃｏｌＥ１オリジンが挙げられるが、これらに限定されない 。好ましい宿主は、操作可能的に誘導プロモーター、例えばｌａｃＵＶプロモー ターと連結するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの染色体コピーを 含有する（米国特許第4,952,496号）。このような宿主としては溶原菌大腸菌株 ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＨＭＳ１ ７４（ＤＥ３）及びＢＬ２１（ＤＥ３）が挙げられるが、これらに限定されない 。ＢＬ２１（ＤＥ３）株が好ましい。ｐＬｙｓ株は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ の天然阻害剤であるＴ７リゾチームを低レベルで提供する。 提供されるＤＮＡ断片はさらに、リプレッサータンパク質をコードする遺伝子 を含有する。リプレッサータンパク質は、リプレッサ ータンパク質が結合するヌクレオチドの配列を含有するプロモーターの転写を抑 制し得る。プロモーターは、細胞の生理学的条件を変えることにより、脱抑制さ れる。変化は、例えばオペレーターと又は調節タンパク質又はＤＮＡの他の領域 と相互作用する能力を阻害する分子の成長培地への付加により、あるいは成長培 地の温度を変えることにより達成される。好ましいリプレッサータンパク質とし てはＩＰＴＧ誘導に反応性の大腸菌ｌａｃＩリプレッサー、温度感受性ｃ１８５ ７リプレッサー等が挙げられるが、これらに限定されない。大腸菌ｌａｃＩリプ レッサーが好ましい。 全長ｂＦＧＦ又はｂＦＧＦムテインをコードするＤＮＡを成熟サポリンタンパ ク質をコードするＤＮＡと結合させて、ＦＧＦ−ＳＡＰ融合タンパク質の、それ ぞれ細胞内及びペリプラズム発現のためのｐＥＴ−１１ａ及びｐＥＴ−１２ａ発 現ベクター（NOVAGEN，Madison,WI）を含めたｐＥＴベクターに導入した。その 結果生じる融合タンパク質は細胞活性を示し、化学的抱合化ＦＧＦ−ＳＡＰ製剤 と少なくとも同じ程強力であると思われる。その結果生じるｂＦＧＦ融合タンパ ク質は、標的細胞に取り込まれた場合は、高細胞毒性である。 Ｂ．細胞毒性抱合体の単一起源製剤及び細胞毒性抱合体の均質集団の合成 細胞毒性ＦＧＦ抱合体の組成物及び製剤の異質性の問題は、いくつかの方法で 本明細書で扱われている。第一の方法は化学的抱合体に依っており、第二の方法 は組換え体ＤＮＡ技術に依る。本発明の方法は、ｂＦＧＦ及びＳＡＰに関して記 載されている。しかしながら、同一方法を用いて、ＦＧＦ族のあらゆる成員とＳ ＡＰ、主食ＳＡＰ、又はあらゆる他の細胞毒性物質との抱合の均質集団を修飾及 び調製し得ると理解される。 １．化学的抱合体 本発明の化学的抱合を実行するために、ＦＧＦタンパク質を修飾し、次いで細 胞毒性物質と結合させた。細胞毒性物質がペプチド又はタンパク質以外、例えば 非ペプチド薬剤である場合には、化学的抱合を用いなければならない。 ａ．ＦＧＦタンパク質の選択 ＦＧＦタンパク質含有化学抱合体の製剤の不均質性を減じるために、不均質を 引き起こすＦＧＦ上の部位を欠失又は置換することによりＦＧＦタンパク質を修 飾する。このような部位は、一般的には、タンパク質の折り畳みに際して、他の システインとの相互作用あるいはＦＧＦペプチド１分子当たり１又はそれ以上の 細胞毒性分子との相互作用に依然として利用できるシステイン残基である。した がって、このようなシステイン残基は、ＦＧＦペプチドの適正な折り畳みに又は ＦＧＦ受容体を結合して取り込む能力の保持に必要ないかなるシステイン残基も 含まない。化学的抱合に関しては、生理学的条件で相互作用に利用出来る１つの システイン残基は、それが細胞毒性部分を連結するための部位として用いられる ために、置換されない。その結果生じる修飾ＦＧＦを、単一種の細胞毒性抱合体 と抱合する。 ＦＧＦ受容体と反応するあらゆるタンパク質が、本発明で用い得る。特にＦＧ Ｆ−１〜ＦＧＦ−９のすべてが、本発明で用いるために修飾され、又は細胞毒性 試薬と反応させて、その結果生じる抱合体が単一起源性となるようにする。ＦＧ Ｆ−１は、位置３１、９８及び１３２にシステインを有する；ＦＧＦ−２は位置 ３４、７８、９６及び１０１にシステインを有する；ＦＧＦ−３は位置５０及び １１５にシステインを有する；ＦＧＦ−４は位置８８及び１５５にシステインを 有する；ＦＧＦ−５は位置１９、９３、１６０及び２ ０２にシステインを有する；ＦＧＦ−６は位置８０及び１４７にシステインを有 する；ＦＧＦ−７は位置１８、２３、３２、４６、７１、１３３及び１３７にシ ステインを有する；ＦＧＦ−８は位置１０、１９、１０９及び１２７にシステイ ンを有する；そしてＦＧＦ−９は位置６８及び１３４にシステインを有する。生 物学的活性の保持に不可欠であると思われる、そして欠失又は置換されるべきで ないＦＧＦ−１〜ＦＧＦ−９の各々からのシステイン残基を以下に示す： ＦＧＦペプチドは下記のように修飾し得る。あるいはＦＧＦ受容体と結合する 能力への各システインの関与を経験的に確定する。各システイン残基は、保存性 アミノ酸変化（上記表１参照）と規則的に置換し得るか、又は欠失し得る。その 結果生じるムテインを欠くことのできない生物学的活性、ＦＧＦ受容体と結合し 連結した細胞毒性部分を取り込む能力に関して試験する。ムテインがこの活性を 保持する場合には、システイン残基は必要でない。付加的システインを規則的に 欠失及び置換して、その結果生じるムテインを活性に関して試験する。この方法 では、ＦＧＦ受容体と結合して取り込む 能力を保持するのに必要なシステインの最小数及び同一性を測定し得る。 各ＦＧＦペプチドに関しては、完全アミノ酸配列が公知である（例えば配列番 号２４（ＦＧＦ−１）及び配列番号２６〜３２（それぞれＦＧＦ−３〜ＦＧＦ− ９）参照）。配列を調べ、システイン残基を同定する。ＦＧＦ−１〜ＦＧＦ−９ のアミノ酸配列間の比較により、１つのＣｙｓがＦＧＦ族のペプチド中に保存さ れることが明らかになる（表２参照）。これらのシステイン残基は二次構造に必 要であり変えられるべきである。これらの残基は置換されるべきではない。残り のシステイン残基は各々、セリン残基又はタンパク質の構造を変えると予測され ない他の残基により規則的に欠失及び／又は置換され得る。その結果生じるペプ チドを、生物学的活性に関して試験する。システイン残基が生物学的活性の保持 に必要な場合には、それは欠失されない；それが必要でない場合には、それは好 ましくはセリン又はその結果生じるタンパク質の二次構造を変えないように選択 される他の残基で置換される。 ｂ．化学的抱合のためのＦＧＦタンパク質の修飾 受容体結合には必要でないが適切に誘導された細胞毒性物質との反応に利用で きる１つ又はそれ以上の反応性システインを除去して、その結果生じるＦＧＦタ ンパク質が細胞毒性物質との抱合に利用できるシステイン残基を１つだけ有する ようにして、ＦＧＦ受容体と反応するポリペプチドを修飾する。他のシステイン 残基は除去し、好ましくはその結果生じる突然変異体ＦＧＦの生物学的活性を実 質的に変えないアミノ酸と置換する。次に、細胞毒性物質をＦＧＦ受容体を発現 する細胞に対する標的として、このような細胞中に細胞毒性物質を取り込む能力 の保持に関して、その結果生じた突然変異体ＦＧＦを試験する。増殖活性の保持 はこのような活性の保持を 示すが、しかし明確ではない。増殖活性は、例えば以下に例示するような副腎毛 細管内皮細胞の細胞数の増加を測定するといった、あらゆる適切な増殖検定によ り測定し得る。しかしながら、修飾化又は突然変異体ＦＧＦは増殖活性の減少を 示すか又は全く示さないことには留意すべきであるが、それらが結合細胞毒性物 質を未修飾ＦＧＦが結合し、細胞毒性部分の取込みを引き起こす受容体を保有す る細胞の標的にする能力を保持する場合には、本発明での使用に適している。 ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４及びＦＧＦ−６は化学的抱合のために２つだけシステ インを有するため、好ましくはいずれかの末端近くの別の残基がシステインと置 換されない限りは、２つのシステインはいずれも好ましくは欠失又は置換されな い。他のＦＧＦ族成員に関しては、少なくとも１つのシステイン、恐らくは２つ のシステイン、しかし少なくとも表２に記載のシステインは、依然として細胞毒 性抱合体との抱合に利用できなければならない。２番目のシステインは、ジスル フィド結合を形成する必要がある。したがって、３つ以上のシステインを有する あらゆるＦＧＦペプチドが、他のシステイン残基を欠失又は置換することにより 化学的抱合のために修飾される。１つのシステインを除去することにより３つの システイン残基を有するＦＧＦペプチドを修飾し、細胞毒性部分と抱合させて、 ＦＧＦ受容体と結合して細胞毒性部分を取り込む能力に関して試験する。 本発明の方法に従って、化学的抱合のための塩基性ＦＧＦの２つのムテインが 生成された（抱合体の組換え体発現のためのムテインの調製を下記に示す）。ｐ ＦＣ８０（同時係属中の国際ＰＣＴ出願PCT/US93/05702（米国特許出願第07/901 ,718号の一部継続である）参照；さらに配列番号１２参照）から得られた塩基性 ＦＧＦをコ ードするＤＮＡを突然変異化した。塩基性ＦＧＦのシステイン７８のセリンへの （〔Ｃ７８Ｓ〕ＦＧＦ）、又はシステイン９６のセリンへの（〔Ｃ９６Ｓ〕ＦＧ Ｆ）突然変異誘発は、培養中の内皮細胞増殖を刺激する能力により判定した場合 、元の塩基性ＦＧＦのほとんど完全な増殖活性を有する２つの突然変異体を産生 した。２つの突然変異体及び元のタンパク質の活性は、効能又は最大反応により 査定した場合、有意に異ならない。修飾ＤＮＡの配列分析からは、突然変異体の 各々がセリンに関するコドンに変換されるシステインに関する１つのコドンを有 することが立証された。 その結果生じるムテインＦＧＦ又は未修飾ＦＧＦは、単一種の細胞毒性物質と 反応する。ｂＦＧＦムテインは、単一種の誘導化サポリン（モノ誘導化サポリン ）と反応し、それによりＦＧＦ−ＳＡＰ抱合体の単一起源性製剤及びＦＧＦ−Ｓ ＡＰ化学抱合体の均質組成物を生じた。その結果生じる化学抱合体は凝集せず、 必要な生物学的活性を保持する。 ｃ．サポリンの調製 （１）モノ誘導化ＳＡＰの単離 化学的抱合のために、ＳＡＰを誘導又は修飾して、それがＦＧＦタンパク質と の抱合のためのシステイン残基を含むようにする。 一般的には、ＳＰＤＰとの反応により、ＳＡＰを誘導する。これは異質集団を 生じる。例えば、ＳＰＤＰによりＳＡＰＩモル当たり0.9 モルのピリジン−ジス ルフィドのレベルに誘導されるＳＡＰは、非誘導化、モノ誘導化及びジ誘導化Ｓ ＡＰを包含する。ＳＰＤＰによりひどく誘導されるリボソーム不活性化タンパク 質は、感受性リシンとの反応のために活性を失う（Lambert et al.(1988) Cance r Treat．Res．37:175-209）。非精製物質の製剤中の非誘導化ＳＡＰの量は判定 が難しく、これにより反応混合物に付加する誘導化Ｓ ＡＰの正確な割合を概算し得る場合に誤差を生じる。 ＳＰＤＰのリシンとの反応による負電荷の除去のために、３つの種は電荷の差 を示す。本発明の方法は、モノＳ陽イオン交換クロマトグラフィーによるモノ誘 導化ＳＡＰの精製に関してこの電荷差に依っている。精製モノ誘導化ＳＡＰの使 用は、非精製物質よりも明らかに有益である。ＳＡＰと反応し得る塩基性ＦＧＦ の量は、モノ誘導体物質につき１モルに限定され、それは、さらに均質の抱合体 が生成されるという本発明の結果に認められる。本発明に使用したモノ誘導化Ｓ ＡＰと異質性の供給源が依然として存在する。種子それ自体から精製されるよう な元のＳＡＰは、タンパク質配列で判断した場合、４つのアイソフォームの混合 物である（例えば国際ＰＣＴ出願PCT/US93/05702及び同時係属中の米国特許出願 第07/901,718号参照； Montecucchi et al.(1989) Int．J．Pept．Prot．Res.33 :263-267；Maras et al.(1990) Biochem．Internat．21:631-638; 及びBarra et al.(1991) Biothchnol．Appl．Biochem．13:48-53 参照）。ＳＰＤＰとの反応 がおそらくは各々のアイソフォームと同等に起こるために、これは抱合体のなん らかの異質性を生じる。異質性のこの供給源は、例えば大腸菌中に発現されるＳ ＡＰの使用により克服し得る。 （２）サポリンの組換え体発現 本発明のＤＮＡは、サポリンポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列及 びサポリンのアミノ末端に連結するＮ末端延長配列を包含する。Ｎ末端延長は、 細菌宿主中にサポリンを発現させる。サポリンがＦＧＦペプチドをコードするＤ ＮＡに連結する場合には、Ｎ末端延長は必要ないが、しかしその結果生じるサポ リンペプチドが細胞毒性活性を保持する限りは、約１から20〜30までの、又は所 望によりそれ以上のアミノ酸残基を包含し、含有し得る。 適切なＮ末端延長領域は実質的に中性で、サポリンポリペプチドをそれが発現 される宿主に対して無毒性又は低毒性にする以外のあらゆる生物学的機能を欠い ている。Ｎ末端延長領域から作られる特異的アミノ酸は、サポリン含有タンパク 質をタンパク質の発現時に宿主に対して無毒性又は低毒性にさせるのに不可欠で あるとは思えない。 好ましい態様では、Ｎ末端延長領域は、タンパク質分解性シグナル配列の一般 的細胞内分解によるか又は座位特異的タンパク質分解プロセッシングにより、真 核生物細胞内プロテアーゼによる切断を受けやすく、したがって取込み時にサポ リン含有融合タンパク質のＮ末端領域は、単一断片サポリンタンパク質を生物学 的に活性にして細胞死を引き起こす細胞性真核生物プロテアーゼにより切断又は 分解される（例えば同時係属中の米国特許出願第08/ , , 号（本明細書と同 時に提出）参照）。 本発明のＤＮＡ分子は、位置４８及び９１のアミノ酸で異質性を有する４つの アイソフォームの全てを含めたサポリン−６（ＳＯ−６）と実質的に同じアミノ 酸配列及びリボソーム不活性化活性を有するサポリンをコードする（例えばMara s et al.(1990) Biochem．Internat．21:631-638; 及びBarra et al.(1991) Bio thchnol．Appl．Biochem．13:48-53並びに配列番号３〜７参照）。他の適切なサ ポリンポリペプチドとしては、ＳＯ−１及びＳＯ−３（Fordham-Skelton et al. (1990) Mol．Gen．Genet．221:134-138）、ＳＯ−２（例えば米国特許出願第07/ 885,242号（英国特許第2,216,891号に対応する）参照；Fordham-Skelton et al. (1991) Mol．Gen．Genet．229:460-466も参照）、ＳＯ−４（例えば英国特許第2 ,194,241号参照; Lappi et al.(1985) Biochem．Biophys．Res．Commun．129:93 4-942参照）及びＳＯ−５（例えば英国特許第2,194,241号参 照; Montecucchi et al.(1989) Int．J．Peptide Protein Res.33:263-267参照 ）を含めたアイソフォームのサポリン型ＲＩＰをコードする多遺伝子族の他の成 員が挙げられる。0.1 M リン酸塩緩衝液,pH７で抽出し、その後ホウ酸ナトリウ ム緩衝液，pH９に対して上清を透析し、１〜0.3 M ＮａＣｌの勾配及びＳＡＰ活 性を有する一次溶離クロマトグラフィー分画を用いて、負荷電イオン交換樹脂、 例えばMono S（Pharmacia Fine Chemicals,Sweden）から選択的に溶離すること により、配列番号３３で示されるＮ末端４０アミノ酸を包含するＳＯ−４をSapo naria officinalisの葉から単離する。二次溶離分画はＳＯ−５である。 本明細書中に例示したサポリンポリペプチドは、配列番号３〜７で示されるも のと実質的に同じアミノ酸配列を有するものを含む。 これらのタンパク質をコードするＤＮＡの単離及び発現は、実施例１に記載する 。 （３）サポリンの修飾 ＳＡＰ上の１つより多いアミノ基がスクシニミジル部分と反応し得るため、タ ンパク質表面上の１つより多いアミノ基が反応することができる。これはモノ誘 導化ＳＡＰにおける異質性の可能性を生じる。異質性のこの供給源は、上記のよ うにコード配列中に挿入された付加的システインを有する大腸菌中に発現される 抱合修飾化ＳＡＰにより解明された。 したがって、他の態様においては、サポリンを誘導してスルフヒドリルを導入 する代わりに、システイン残基をＳＡＰに導入して修飾し、その結果生じる修飾 化サポリンタンパク質がＦＧＦタンパク質と反応して真核細胞上でＦＧＦ受容体 と結合して、このような細胞に取り込まれた場合に細胞毒性である単一起源性細 胞毒性抱合体を生成するようにする。システイン残基の導入のための好ましい遺 伝子座としては、Ｎ末端領域、好ましくは細胞毒性物質、例えばＳＡＰのＮ末端 から約１〜20残基内が挙げられる。本発明の細菌宿主系中でのＳＡＰの発現のた めには、サポリンタンパク質のＮ末端をコードするＤＮＡと連結するメチオニン をコードするＤＮＡを付加することも望ましい。ＳＡＰをコードするＤＮＡは、 成熟タンパク質の最初の残基に対するコドンのすぐ近くのＮ末端にＭｅｔ−Ｃｙ ＳをコードするＤＮＡ（ＡＴＧ ＴＧＴ又はＡＴＧ ＴＧＣ）を挿入することに より修飾された。 システイン残基がＮ末端に付加されたムテイン、並びに位置４又は１０のアミ ノ酸がシステインで置換されたムテインを、サポリンをコードするＤＮＡを修飾 することにより調製した（実施例４参照）。結果的に生じるＳＡＰの発現及び精 製に関して本明細書に記載したようにして、修飾化ＤＮＡを発現させ、その結果 生じるサポリンタンパク質を精製し得る。次に修飾化サポリンを修飾化ＦＧＦと 反応させて、ＦＧＦ上の１回曝露システイン残基と修飾化ＳＡＰ上のシステイン 残基との間にジスルフィド結合を形成する。 結果的に生じるＳＡＰの発現及び精製に関して本明細書に記載したようにして 、修飾化ＤＮＡを発現させ、その結果生じるサポリンタンパク質を精製し得る。 次に修飾化サポリンを修飾化ＦＧＦと反応させて、ＦＧＦ上の１回曝露システイ ン残基と修飾化ＳＡＰ上のシステイン残基との間にジスルフィド結合を形成する 。 いずれかの方法（モノ誘導化ＳＡＰをＦＧＦペプチドと反応させるか、又はｃ ｙｓ残基をＳＡＰに導入する）を用いて、その結果生じるＦＧＦ−ＳＡＰ化学抱 合体の製剤は単一起源性である；抱合体を含有する組成物は凝集物を含有しない と思われる。 異質性に関する上記の供給源も、下記のように細胞毒性物質をコードするＤＮ Ａと結合する修飾化ＦＧＦタンパク質をコードするＤ ＮＡの発現により、融合タンパク質として細胞毒性抱合体を生成することにより 回避し得る。 ２．修飾化ＦＧＦを含有する細胞毒性抱合体の組換え体産生 異質性の問題は、組換え体ＤＮＡ技術を用いて融合タンパク質として抱合体を 調製することにより処理した。未反応システインを介してといったようにＦＧＦ 及び／又は標的化薬剤を修飾して各抱合体間の相互作用を阻止することにより、 融合タンパク質を含有する製剤をより均質にし得る。細胞毒性物質と結合するＦ ＧＦタンパク質の融合をコードするＤＮＡの発現により、細胞毒性抱合体の単一 起源製剤が生成された。しかしながらこのような集団は集合体を形成する。未反 応システインを介してといったようにＦＧＦ及び／又は細胞毒性物質を修飾して 各抱合体間の相互作用を阻止することにより、融合タンパク質を含有する製剤を より均質にさせた。ＦＧＦ上のシステイン残基を欠失又は置換させたムテイン構 築物を調製することにより、集合体形成を排除した。位置７８及び９６のシステ インがセリンに置換されたｂＦＧＦを含有する細胞毒性抱合体を調製した。その 結果生じる細胞毒性抱合体の製剤は細胞毒性活性を保持し、単一起源性で、集合 体を含有しない。 ａ．抱合体の組換え体産生のためのムテインの調製 本発明の方法に用いる組換え体発現に関しては、生物学的活性に必要とされな いＦＧＦペプチドのシステインのすべてを欠失又は置換させる；本発明の方法を 化学的抱合に用いるためには、細胞毒性物質との化学的抱合に用いられるこれら のシステインの１つを除いて全てを欠失又は置換させる。実際に、２つのシステ イン（表２に記載のシステイン残基の各々を含む）だけが、そしておそらくは表 ２に記載のシステインだけが、ＦＧＦペプチドの必要な生物学的活性の保持のた めに必要とされる。したがって、残りのシステインを セリンで置換することにより、２つより多いシステインを有するＦＧＦペプチド を修飾する。その結果生じるムテインを、必要な生物学的活性に関して試験する 。 表２には載せられていない第二のシステインを置換することにより２つのシス テインを有するＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４及びＦＧＦ−６のようなＦＧＦペプチド を修飾し、その結果生じるムテインをＦＧＦコードＤＮＡと結合する細胞毒性物 質をコードするＤＮＡを含有する構築物の一部として用い得る。適切な宿主中で 構築物を発現させて、その結果生じるタンパク質を、ＦＧＦ受容体と結合し、細 胞毒性物質を取り込む能力に関して試験する。 以下に例示するように、Ｃｙｓ⁷⁸及びＣｙｓ⁹⁶をセリン残基で置換したｂＦＧ Ｆムテインを含有する抱合体を調製した。その結果生じた抱合体は、野性型ＦＧ Ｆ成分を有する組換え体抱合体と少なくとも同じ活性で、且つＦＧＦの化学的抱 合体と少なくとも同じ活性を示す。さらに組換え的に産生された抱合体は低毒性 で、したがって必要な場合には高用量で投与し得ると思われる。 ｂ．ＤＮＡ構築物及びＤＮＡ構築物の発現 組換え法を用いて細胞毒性抱合体の単一起源製剤を生成するために、ＦＧＦタ ンパク質をコードするＤＮＡを修飾して、発現時に、その結果生じる融合タンパ ク質のＦＧＦ部分が反応に利用できるいかなるシステインも含まないようにする 。好ましい態様では、ＦＧＦポリペプチドをコードするＤＮＡをサポリンポリペ プチドをコードするＤＮＡと結合させる。翻訳停止コドン、並びに存在し得る他 の転写又は翻訳停止シグナルを除去するために、そして利用できるシステインを コードするＤＮＡを除去又は置換するために、ＦＧＦポリペプチドをコードする ＤＮＡを修飾する。次にそのＤＮＡをサポリンポリペプチドをコードするＤＮＡ と直接又はサポリンの最初 のコドンとＦＧＦの最後のコドン間の１つ又はそれ以上のコドンのスペーサー領 域を介して結紮する。スペーサー領域の大きさは、その結果生じる抱合体が標的 細胞に取り込まれた場合に細胞毒性活性を示す限りは、いかなる長さでもよい。 目下、約１から約７５〜９０コドンまでのスペーサー領域が好ましい。 ＦＧＦペプチドをコードするＤＮＡ及び／又はアミノ酸配列ＦＧＦは、当業者 には公知である（例えば配列番号２４〜３２参照）。ＤＮＡは、ＦＧＦのアミノ 酸配列又は公知のＤＮＡ配列に基づいて合成的に調製し得るか、あるいは当業者 に公知の方法を用いて単離し得るか、あるいは市販の又は当業者に公知の他の供 給源から得られる。例えばペプチドのＦＧＦ族の事実上全てをコードするＤＮＡ が公知である。例えばヒトａＦＧＦ（Jaye et al.(1986) Science 233:541-545 ）、ウシｂＦＧＦ（Abraham et al.(1986) Science 233:545-548）、ヒトｂＦＧ Ｆ（Abraham et al.(1986) EMBO J．5:2523-2528; 及びAbraham et al.(1986) Q uant.Biol.51:657-668）、及びラットｂＦＧＦ（Shimasaki et al.(1988) Bioch em．Biophys．Res．Comm．及びKurokawa et al.(1988) Nucleic Acid Res．16:5 201参照）、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−７及びＦＧＦ−９が公知である（米国特許第5 ,155,214号、米国特許第4,956,455号、米国特許第5,026,839号及び米国特許第4, 994,559号、DNASTARデータベース並びに上記及び下記の参考文献参照）。ウシ下 垂体組織から単離した適例の哺乳類ｂＦＧＦのアミノ酸配列も公知である（例え ばEsch et al.(1985) Proc．Natl．Acad．Sci．USA82:6507-6511; 及び米国特 許第4,956,455号参照）。 単離哺乳類塩基性ＦＧＦタンパク質は、一般的には約16kDの分子量及び約9.6 のplを有する１４６残基ポリペプチドである：それは約９残基のアミノ末端延長 により発現されて、その結果生じるタ ンパク質が約18kDの分子量を有するようになる。 次に標準的方法を用いてこのようなＤＮＡに突然変異原を与えて、上記のよう に集合体形成に関与するあらゆるシステイン残基を欠失し又は欠失及び置換する 。必要な場合には、集合体形成に関与するシステイン残基の同一性を、システイ ン残基を欠失し、及び／又は欠失及び置換して、その結果生じる置換システイン を有するＦＧＦが生理学的に許容可能な緩衝液及び塩を含有する溶液中に集合体 を形成するか否かを確かめることにより、経験的に確認する。 上記のように、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）及び酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ）のほか にＨＳＴ、ＩＮＴ／２、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＫＧＦ（ＦＧＦ−７）、ＦＧ Ｆ−８及びＦＧＦ−９（例えばBaird et al.(1989) Brit．Med．Bull 45:438-45 2; Tanaka et al.(1992) Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:8928-8932; Miyamoto et al.(1993）Mol．Cell．Biol．13:4251-4259参照、さらにＦＧＦ族のＤＮＡ 及びアミノ酸配列に関してはデータベースＤＮＡ^*（1993年7 月DNASTAR,Inc．Ma dison,WIからリリース）参照；ＦＧＦ-1〜ＦＧＦ-9のアミノ酸配列に関しては、 それぞれ配列番号２４〜３２参照）を含めたあらゆるＦＧＦタンパク質を、本発 明の方法により修飾及び発現し得る。ＦＧＦタンパク質はすべて、広範な正常二 倍体中胚葉由来及び神経陵由来細胞における有糸分裂活性を誘導し、この活性は ＦＧＦ細胞表面受容体との結合及びその後の取込みにより媒介される。ＦＧＦ受 容体との結合及びその後の取込みは、本発明に用いるのに適したＦＧＦタンパク 質に必要な活性である。ＦＧＦ受容体と結合し、取り込まれる能力を反映するこ のような”ＦＧＦ有糸分裂活性”の試験は、Gospodarowicz et al.(1982) J．Bi ol．Chem.257:12266-12278; Gospodarowicz et al.(1976) Proc．Natl．Acad．S ci．USA 73:4120-4124に記載されているような培養ウシ大動脈 内皮細胞の増殖を刺激する能力である。 その結果生じる修飾ＦＧＦ−ＳＡＰをコードするＤＮＡを上記のようにプラス ミドに挿入して選択宿主中で発現させて、ＦＧＦ−ＳＡＰの単一起源製剤及び単 一起源性ＦＧＦ−ＳＡＰを含有する均質組成物を生成し得る。 修飾化ＦＧＦ−ＳＡＰキメラ又は修飾化ＦＧＦ−細胞毒性物質キメラの多数の コピーを、一プロモーターと有効に連鎖させて単一プラスミドに挿入し得る。発 現した場合、その結果生じるタンパク質は多重結合体である。一般的には、キメ ラの２〜６個のコピーを、好ましくは頭一尾方式で、一プラスミドに挿入する。 配列番号１２を有するヒトｂＦＧＦ−ＳＡＰをコードするＤＮＡを、重複延長 （ＳＯＥ）によるスプライシングを用いて実施例に記載されているように突然変 異を起こさせた。別の好ましいコード領域は、配列番号１３のヌクレオチド１〜 ４６５に示される。いずれの場合も、好ましい態様においては、位置７８及び９ ６のシステインをセリンで置換することによりＤＮＡを修飾する。ＦＧＦ−ＳＡ ＰコードＤＮＡ（配列番号１２）中のＦＧＦの位置７８及び９６のシステイン残 基をコードするコドンを、ＳＯＥによりセリンコドンに変換した。ＳＯＥ法の各 適用には、プライマーとしての相補端を有し、突然変異体が所望の遺伝子座に変 化したコドンを包含してハイブリッド生成物を生じる２つの増幅オリゴヌクレオ チド生成物を使用する。非重複末端でアニーリングする２つのプライマーを用い る二次増幅反応は、ハイブリッドを増幅して、所望の変化を有するＤＮＡを生成 する。 Ｃ．結果的に生じる化学的抱合体及び融合タンパク質の特性及び使用 化学的抱合、組換え体ＤＮＡ技術、又は組換え体発現と化学的抱 合の組合せのいずれかにより、細胞毒性抱合体物質を調製し得る。本発明の方法 は、特にｂＦＧＦ及びサポリンに言及する。しかしながら、同一方法を用いてＳ ＡＰ、修飾ＳＡＰ、又は本明細書に記載のあらゆる他の細胞毒性物質を有するＦ ＧＦのあらゆる成員の抱合体を調製及び使用し得ると理解される。 上記及び実施例の方法及び材料を用いて、化学的抱合体及び融合タンパク質を 合成した。これらは以下の構築物を包含する： 構築物の合成についての特定の詳細は、実施例に記載する。上記の構築物が合 成され、プラスミド、例えばｐＥＴ１１（Ｔ７転写タ ーミネーターを伴う場合及び伴わない場合）、ｐＥＴ１２及びｐＥＴ１５（NOVA GEN，Madison，WI）、λｐＰＬ並びにｐＫＫ２２３−３（PHARMACIA，P.L．）及 びｐＫＫ２２３−３の誘導体中に挿入した、あるいは挿入し得る。その結果生じ るプラスミドを、細菌宿主、例えばＢＬ２１、ＢＬ２３１（ＤＥ３）＋ｐＬＹＳ Ｓ、ＨＭＳ１７５（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７５（ＤＥ３）＋ｐＬＹＳ Ｓ（NOVA GEN，Madison，WI）及びＮ４８３０（ｃ１８５７）中に形質転換した、あるいは し得る（Gottesman et al.(1980) J ．Mol．Bol.140:57-75 参照。PL Biochemi cals，Incから市販。さらに例えば米国特許第5,266,465号、第5,260,223号、第5 ,256,769号、第5,256,769号、第5,252,725号、第5,250,296号、第5,244,797号、 第5,236,828号、第5,234,829号、第5,229,273号、第4,798,886号、第4,849,350 号、第4,820,631号及び第4,780,313号参照）。ｅｎｕ４８３０は、突然変異体ｃ １８５７温度感受性リプレッサーを保有する重度欠失ファージラムダプロファー ジ及び活性Ｎ遺伝子を有する。 Ｄ．ＦＧＦ抱合体の治療的使用 マウス異種移植腫瘍モデルは、ＦＧＦ抱合体が抗腫瘍活性を示す ことを立証する。確立されたＳＫ−Ｍｅｌ−５異種移植を有するマウスに、野性 型ｂＦＧＦ−ＳＡＰ抱合体（総用量125μg/kg）を４週間に亘って毎週静注する と、平均腫瘍容積が対照容積の４９% になった。シスプラチン（ＦＧＦ−ＳＡＰ 治療後に５mg/kgを週１回腹腔内投与）を包含するよう毎週のレジメンを修正す ると、60日目の平均腫瘍容積が対照の23% になった。組合せ治療は、処置マウス の10% で腫瘍の完全緩解を引き起こした。 本発明で生成される抱合体をこのようなマウスに注射すると、化学的抱合体の 異質性製剤より低毒性であると思われる。本発明で提供される抱合体のあるもの は、このようなマウスにおいて抗腫瘍活性を示すことが分かった。 特に５μｇ／kg／週のＦＰＦＳＩ及びＣＣＦＳＩを、確立されたＨＴ−１１９ ７（ヒト膀胱癌細胞株）異種移植を有するマウスに投与した。各治療は、61日の 試験を通じて腫瘍増殖の有意の阻害を生じた。別の試験では、0.1又は0.5μｇ／ kg／週のＦＰＦＳ１を、0.5mg/kgのシスプラチンを含有する場合としない場合と で、確立されたヒト前立腺癌細胞腫瘍を有するマウスに投与する。 本発明の化学的抱合体及び融合タンパク質ｂＦＧＦ−ＳＡＰも再狭窄の治療に 用い得る。ＦＧＦ抱合体は、再狭窄のウサギバルーン損傷モデルにおける平滑筋 に抗増殖作用を及ぼす（米国特許第5,308,622号（承認済の米国特許出願第07/91 5,056号（再狭窄の治療のためのＦＧＦ−細胞毒性抱合体の使用を記載）に基づ いている）参照）。 Ｅ．製薬組成物の処方及び投与 本発明の抱合体を局所、限局、静脈内及び全身投与に適した製薬組成物中に処 方し得る。有効濃度の１つ又はそれ以上の抱合体を適切な製薬担体又はビヒクル と混合する。有効である抱合体の濃度及 び量は、投与した場合に、症状を改善し又は疾患を治療する量の供給を必要とす る。一般的には、組成物は１回投与量投与用に処方する。治療的に有効な濃度及 び量は、本明細書に記載したような公知のin vitro及びin vivo 系で抱合体を試 験することにより、経験的に確定し得る；その後ヒト又は他の動物用の投与量を それから推定する。 抱合体にビヒクルを混合又は付加すると、その結果生じる混合物は溶液、懸濁 液、乳濁液等である。その結果生じる混合物の形態は、意図される投与様式、及 び選択される担体又はビヒクル中の抱合体の溶解度を含めた多数の因子に依って いる。有効濃度は、処置される疾患、障害又は状態の症状を改善するのに十分で あり、マウス異種移植モデルからのデータのようなin vitro及び／又はin vivo データに基づいて経験的に確定し得るし、必要な場合には抱合体の製薬上許容可 能な塩又は他の誘導体を調製し得る。 本発明の抱合体の投与に適した製薬担体又はビヒクルとしては、特定の様式の 投与に適していることが当業者に公知のあらゆる担体が挙げられる。さらに抱合 体は、組成物中の単独の製薬上活性な成分として処方し得るし、あるいは他の活 性成分と組合せてもよい。 抱合体は、あらゆる適切な経路で、例えば経口的に、非経口的に、静脈内に、 皮内に、皮下に、又は局所的に、液体、半液体又は固体形態で投与し得るし、各 投与経路に適した方法で処方し得る。好ましい投与様式は、処置される適応症に 依る。皮膚科学的及び眼科学的適応症は一般的には限局的に処置する；一方腫瘍 及び再狭窄は、一般的には全身性、皮内又は筋肉内投与で治療する。 抱合体は、処置される患者に望ましくない副作用を及ぼさずに治療的に有用な 作用を発揮するのに十分な量で製薬上許容可能な担体中に含まれる。副作用の数 及び程度は、抱合体が投与される条件に 依ると理解される。例えば、ある種の有毒且つ望ましくない副作用は、あまり重 大でない障害を治療する場合には耐容されないが、例えば癌のような生命を脅か す疾病を治療する場合には耐容される。 組成物中の抱合体の濃度は、その吸収、不活性化及び排泄率、投与スケジュー ル、及び投与される量、並びに当業者に公知の他の因子に依っている。 一般的には、治療的有効投与量は、活性成分の血清濃度を約0.1ng/mlから約50 〜100μg/mlにする。製薬組成物は一般的には、選択された抱合体／体重１kg／ 日によって、約0.01mgから約100〜200mgの投与量の抱合体を提供する必要がある 。例えば再狭窄の治療のためには、１日の投与量は約0.05〜0.5mg/kg（ＦＧＦ− ＳＡＰ化学的抱合体又はモルベースでそれと等価の本発明の抱合体の量に基づい て）で十分である。投与物の量は、選択される抱合体、治療される適応症及び耐 容される可能性のある副作用の一関数であると理解される。 活性成分は１度に投与してもよいし、又は少量に分けて間隔を置いて投与して もよい。正確な投与量及び治療期間は治療中の疾患の一関数であり、公知の試験 プロトコールを用いてあるいはin vivo又はin vitro試験データからの推定によ り経験的に確定し得る、と理解される。濃度及び投与量の値は、軽減される状態 の重症度に伴って変化するということに留意すべきである。さらに、あらゆる特 定の被験者に関しては、個々の必要性及び組成物の投与を実行又は指示する人の 専門的判断に依って特定の投与レジメンを調整する必要があるし、本明細書に記 載した濃度範囲は例示に過ぎず、特許請求組成物の範囲又は実行を限定するもの ではないと理解される。 非経口的、皮内、皮下又は局所適用に用いられる溶液又は懸濁液は、任意の以 下の成分を含む：滅菌希釈液、例えば注射用水、食塩 溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又 は他の合成溶剤；抗菌剤、例えばベンジルアルコール及びメチルパラベン；酸化 防止剤、例えばアスコルビン酸及び亜硫酸水素ナトリウム；キレート化剤、例え ばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝液、例えば酢酸塩、クエン酸塩及 びリン酸塩；並びに張度調整剤、例えば塩化ナトリウム又はデキストロース。非 経口製剤は、ガラス製の、プラスチック製の又は他の適切な材料で作られたアン プル、使い捨て注射器又は多用量バイアル中に封入される。 静注の場合、適切な担体としては、生理食塩水又はリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢ Ｓ）、及び濃化剤及び可溶化剤、例えばグルコース、ポリエチレングリコール及 びポリプロピレングリコール、並びにその混合物が挙げられる。リポソーム懸濁 液も製薬上許容可能な担体として適している。これらは当業者に公知の方法によ り調製し得る。 抱合体は、経時放出処方物又はコーティングといった体から迅速に排除されな いようそれらを保護する担体とともに調製し得る。このような担体としては、制 御放出処方物、例えば埋め込み型及びマイクロカプセル封入型供給システム、並 びに生物分解性、生物適合性ポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ アンヒドライド、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ乳酸等が挙げら れる。このような処方物の製造方法は、当業者には公知である。 抱合体は、ゲル、クリーム及びローションの形態で限局又は局所適用のために 、そして槽内又は脊椎内適用のために処方し得る。このような溶液は、適切な塩 とともに、0.01% 〜10% 等張液，pH約５〜７として処方し得る。抱合体は局所適 用エアゾールとして処方し得る（例えば米国特許第4,044,126号、第4,414,209号 及び第4,36 4,923号参照）。 経口投与が望ましい場合は、抱合体は胃の酸性環境からそれを保護する組成物 中に提供されねばならない。例えば、組成物は胃の中でその完全性を保持し、腸 で活性化合物を放出する腸溶性コーティング中に処方し得る。組成物はさらに、 制酸薬又は他のこのような成分と組合せて処方し得る。 経口組成物は一般に、不活性希釈剤又は食用担体を包含し、錠剤中に圧縮され るか又はゼラチンカプセル中に封入される。経口治療投与のために、単数又は複 数の活性化合物は賦形剤に組み入れて、錠剤、カプセル又はトローチの形態で用 い得る。製薬上相溶性結合剤及びアジュバント物質を組成物の一部として含入し 得る。 錠剤、ピル、カプセル、トローチ等は、以下の任意の成分、又は同様の性質の 化合物を含有し得る：結合剤、例えば微晶質セルロース、トラガカントゴム及び ゼラチン；賦形剤、例えばデンプン及びラクトース、崩壊剤、例えばアルギニン 酸及びコーンスターチ（これらに限定されない）；滑剤、例えばステアリンサン マグネシウム（これに限定されない）；研磨剤、例えばコロイド二酸化珪素（こ れに限定されない）；甘味剤、例えばショ糖又はサッカリン；風味剤、例えばペ ッパーミント、サリチル酸メチル、及び果物風味。 投与単位形態がカプセルの場合は、それは上記の種類の物質の他に、液体担体 、例えば脂肪油を含有し得る。さらに、投与単位形態は、投与単位の物理的形態 、例えば糖及び他の腸溶性物質のコーティングを修飾する種々の他の物質を含有 し得る。抱合体はさらに、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエファー、チュー インガム等の成分として投与し得る。シロップは、活性化合物の他に、甘味剤と してのショ糖、並びにある種の防腐剤、染料及び着色料、及び風味剤を含有し得 る。 活性物質は他の所望の作用を損なわない活性物質と、又は所望の作用を補足す る物質、例えば腫瘍の治療のためのシスプラチンと混合し得る。 最後に、化合物を、パッケージング材料、パッケージング材料内の１つ又はそ れ以上の本発明の抱合体又は組成物、並びに抱合体が提供される適応症を示すラ ベルを含有するメーカーの製品として包装する。 以下の実施例は説明のためだけのものであって、本発明の範囲を限定するもの ではない。 実施例１ サポリンの組換え体生成 Ａ．材料及び方法 １．細菌株： 大腸菌ＪＡ２２１株（ｌｐｐ^-ｈｄｓＭ＋ｔｒｐＥ５ ｌｅｕＢ６ ｌａｃＹ ｒｅｃＡ１ Ｆ’ 〔ｌａｃＩ^qｌａｃ⁺ｐｒｏ⁺〕）は、アメリカ培養細胞コ レクション（ＡＴＣＣ）（American Type Culture Collection，Rockville，MD 20852）から、受入れ番号ATCC 33875として公に入手できる（ＪＡ２２１は、Nor thern Regional Research Center (NRRL)，Agricultural Research Service，U. S.Department of Agriculture，Peoria，IL 61604からも受入れ番号NRRL B-1521 1で入手できる。さらに米国特許第4,757,013号(Inouye); 及びNakamura et al.( 1979)Cell 18:1109-1117参照）。ＩＮＶ１ａ株は、Invitrogen，San Diego，CA から市販されている。 ２．ＤＮＡ操作 本発明で用いる制限及び修飾酵素は、米国内で市販されている。自然サポリン 及びサポリンに対するウサギポリクローナル抗血清は 、以前にLappi et al.(1985) Biochem．Biophys．Res．Comm．129:934-942に記 載されたようにして得られた。リシンＡ鎖は、SIGMA，Milwaukee，WIから市販さ れている。メーカーの使用説明書に従って、抗血清をＡｆｆｉ−ゲル １０（BI O-RAD，Emeryville，CA）と結合させた。メーカーの使用説明書に従って、Unite d States Biochemical CorporationのSequenaseキット（バージョン２．０）を 用いて、シーケンシングを実施した。プラスミドのミニ調製及びマキシ調製、コ ンピテント細胞の調製、形質転換、Ｍ１３操作、細菌培地、ウエスタンブロッテ ィング及びＥＬＩＳＡ検定は、Sambrook et al．（(1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harb or,NY）に依った。メーカーの使用説明書に従って、Geneclean II キット（Bio 101）を用いてＤＮＡ断片の精製を実施した。ＳＤＳゲル電気泳動をPhastsystem (Pharmacia)で実施した。 メーカーの説明通りに、Phast Transferシステムを用いて電気泳動処理したタ ンパク質をニトロセルロースに移して、ウエスタンブロティングを成し遂げた。 ＳＡＰの抗血清を１：100の希釈で用いた。ホースラディッシュペルオキシダー ゼ標識化抗ＩｇＧを二次抗体として用いた（Davis et al.(1986) Basic methods in molecular biology，New York，Elsevier Science Publishing Co.，pp1-33 8参照）。 Ｂ．サポリンをコードするＤＮＡの単離 １．ゲノムＤＮＡの単離及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー Saponaria officinalisの葉のゲノムＤＮＡをBianchi et al.(1988) Plant Mo l．Biol．11:203-214に記載されているように調製した。ゲノムＤＮＡ増幅のた めのプライマーを３８０Ｂ自動ＤＮＡ合 成機で合成した。サポリンの”センス”鎖に対応するプライマー（配列番号１） は、自然サポリンＮ末端リーダー配列（配列番号１）： のアミノ酸１５に関するＤＮＡコドンのすぐ上流にＥｃｏＲＩ制限Ｖアダプター を包含する。プライマー5’-CTGCAGAATTCGCCTCGTTTGACTACTTTG-3’（配列番号２ ）は、サポリンの”アンチセンス”鎖に対応し、成熟ペプチドのカルボキシル末 端をコードするＤＮＡの最後の５ヌクレオチドから出発するサポリンのコード配 列を補足する。このプライマーを用いると、成熟サポリンをコードする配列の後 に翻訳停止コドン及びＥｃｏＲＩ制限部位が導入される。 ２．サポリンをコードするＤＮＡの増幅 非分別化Saponaria officinalisの葉のゲノムＤＮＡ（１μｌ）を、10mM Tri s-HCl（pH 8.3）、50mM ＫＣｌ、0.01% ゼラチン、２mM ＭｇＣｌ₂、0.2mM ｄＮＴＰｓ、 0.8μｇのプライマーを含有する最終容量100μｌ中に混合した。 次に、2.5U ＴａｑｌＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetus）を加え、混合 物に鉱油（Sigma）30μｌを被せた。ＤＮＡ Thermal Cycler（Perkin Elmer Cet us）中でインキュベーションを実施した。１サイクルには、変性工程（94℃で１ 分）、アニーリング工程（60℃で２分）及び延長工程（72℃で３分）が含まれた 。30サイクル後、各反応液の10μｌアリコートを１.５% アガロースゲル上で処 理して、増幅産物の正確な構造を立証した。 増幅ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化して、ＥｃｏＲＩ １制限 Ｍ１３ｍｐ１８（ NEW ENGLAND BIOLABS，Beverly，MA; Yanisch-Perron et al.(1985)，”Improve d M 13 phage cloning vectors and hoststrains：Nucleotide sequences of th e M13mp 18 and pUC 19 v ectors”，Gene 33: 103参照）にサブクローニングした。サポリンのコード配列 中の内部点に基づいてオリゴヌクレオチドを用いて、組換え体ファージからの１ 本鎖ＤＮＡをシーケンシングした（Bennati et al.(1989) Eur．J．Biochem．18 3:465-470参照）。９つのＭ１３ｍｐ１８誘導体をシーケンシングして、比較し た。９つのシーケンシング処理クローンのうち、５つがそれぞれ配列番号３〜７ で示される独特の配列を有した。クローンをＭ１３ｍｐ１８−Ｇ４、−Ｇ１、− Ｇ２、−Ｇ７及び−Ｇ９と名付けた。これらのクローンは各々、すべてのサポリ ンコード配列及び自然サポリンＮ末端リーダーペプチドをコードするＤＮＡの４ ５ヌクレオチドを含有する。 Ｃ．ｐＯＭＰＡＧ４プラスミド構築 実施例１．Ｂ．２からの配列番号３クローンを含有するＭ１３ｍｐ１８−Ｇ４ をＥｃｏＲＩで消化し、その結果生じた断片を、実施例１．Ａ．２．に記載の方 法を用いてベクターｐＩＮ−ＩＩＩｏｍｐＡ２のＥｃｏＲＩ部位に結紮した（例 えば米国特許第4,575,013号（Inouye）；及びDjffaud et al.(1987)Meth．Enz． 153:492-507参照）。Ｎ末端延長を含めたサポリンをコードするＤＮＡが細菌ｏ ｍｐＡ遺伝子のリーダーペプチドセグメントと融合するように、結紮をおこなっ た。その結果生じたプラスミドｐＯＭＰＡＧ４は、ｌｐｐプロモーター〔Nakamu ra，K．and Inouye，M．Cell.，18:1109-1117(1979)〕、大腸菌ｌａｃプロモー ターオペレーター配列（ｌａｃＯ）、及び大腸菌ｏｍｐＡ遺伝子分泌シグナルを 、互いに、そしてサポリン及び自然Ｎ末端リーダーコードＤＮＡ（配列番号３） と有効に関連して含有する。プラスミドはさらに大腸菌ｌａｃリプレッサー遺伝 子（ｌａｃ Ｉ）を含む。 それぞれ配列番号４〜７を含有する実施例１．Ｂ．２から得られ たＭ１３ｍｐ１８−Ｇ１、−Ｇ２、−Ｇ７及び−Ｇ９クローンを、本実施例でＭ １３ｍｐ１８−Ｇ４に関して上記したように、ＥｃｏＲＩで消化して、ＥｃｏＲ Ｉ消化ｐＩＮ−ＩＩＩｏｍｐＡ２に結紮した。その結果生じたプラスミド、即ち 標識化ｐＯＭＰＡＧ１、ｐＯＭＰＡＧ２、ｐＯＭＰＡＧ７、ｐＯＭＰＡＧ９を、 ｐＯＭＰＡＧ４に関して記載したようにスクリーニングし、発現させて、精製し て、特性表示した。 実施例１．Ａ．２に記載の方法を用いて、単離ｐＯＭＰＡＧ４プラスミドの大 量製剤を得るために、ＩＮＶ１ａコンピテント細胞をｐＯＭＰＡＧ４で形質転換 し、所望のプラスミド構造を含有する培養をさらに増殖させた。 Ｄ．大腸菌中でのサポリン発現： ＩＰＴＧを加えてサポリンコードＤＮＡの発現を誘導した後に増殖の対数期に 、又は対数期終了時にｌａｃリプレッサーによりサポリン含有タンパク質の発現 が抑制される条件下で、ｐＯＭＰＡＧ４形質転換大腸菌細胞を増殖させた。 ｐＯＭＰＡＧ４形質転換大腸菌細胞の大量培養を生成するために、125mg/mlの アンピシリンを含有するＬＢブロス（例えば、Sambrook et al．（(1989) Molec ular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Co ld Spring Harbor,NY参照）中でプラスミドｐＯＭＰＡＧ４で形質転換させたＪ Ａ２２１大腸菌細胞の一夜培養（約１６時間継続）を、125mg/mlのアンピシリン を含むＬＢブロス750mlを入れたフラスコ中で１：100に希釈した。550nmでの光 学密度が分光光度計で測定して0.9に達するまで、37℃で振盪しながら対数期で 細胞を増殖させた。 第二段階では、ＩＰＴＧ（Sigma）を加えて最終濃度を0.2 mMとすることによ り、サポリン発現を誘導した。誘導培養をさらに２時 間増殖させて、遠心分離（25分、6500 x g）で収集した。細胞ペレットを氷冷1. 0 M TRIS，pH9.0、２mM ＥＤＴＡ（10mlをペレット各１ｇに加えた）中に再懸 濁した。再懸濁物質を20〜60分間氷上に保持した後、遠心分離（20分、6500 x g ）して、上清に対応する大腸菌のペリプラズム分画をペレットに対応する細胞内 分画から分離した。 Ｅ．分泌組換え体サポリンの精製 １．抗ＳＡＰイムノアフィニティー精製 実施例１．Ｄ．からのペリプラズム分画をホウ酸塩緩衝食塩水（ＢＢＳ：５mM ホウ酸、1.25 mM ホウ砂、145 mM塩化ナトリウム，pH 8.5）に対して透析した 。透析物を、Lappi et al.，Biochem．Biophys．Res．Comm．129:934-942（1985 ）に記載されたようにして得られ、Affi-gel 10と結合させ、そして約0.5ml/分 の流速でＢＢＳ中で平衡させた抗サポリン抗体のイムノアフィニティーカラム（ 0.5 x２cm）上に載せた。流動の280 nmでの吸光度が基線に低減するまで、ＢＢ Ｓでカラムを洗浄した。次に、サポリンと結合した抗体を含有するカラムを1.0 M 酢酸で溶離し、0.5 ml分画を0.3 mlの２M 水酸化アンモニウム，pH10を含入し た試験管中に収集した。ＥＬＩＳＡにより分画を分析した（例えば、Sambrook e t al．（（1989）Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harb or Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY 参照）。実施例１．Ａ．２に記 載したようにウエスタンブロティングによりＥＬＩＳＡのピーク分画を分析した 結果、自然サポリンより僅かに高い分子量を示す単一帯が示された。次いで、Ｅ ＬＩＳＡで確定したようにサポリンタンパク質を含有した分画をさらに精製する ためにプールした。 ２．逆相高性能液体クロマトグラフィー精製 ペリプラズム中に分泌されたサポリンをさらに精製するために、実施例１．Ｅ ．１からのプール分画を水に溶解した0.1% トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で１： １に希釈して、水に溶解した20% アセトニトリル、0.1% ＴＦＡ中で平衡させた Ｖｙｄａｃ Ｃ４カラム（Western Analytical）上での逆相高圧液体クロマトグ ラフィー（ＨＰＬＣ）でクロマトグラフィー処理した。タンパク質を20分間徐々 に60% アセトニトリルに上げて溶離した。ＨＰＬＣにより、実施例１．Ｅ．１に 記載されているようにウエスタンブロティングにより分析した場合に、抗ＳＡＰ 抗血清を有する免疫反応の唯一の領域である単一ピークを生じた。試料をＥＬＩ ＳＡで検定した。 気相シークエネーター（Applied Biosystems）中でエドマン分解により配列分 析を実施した（例えばLappi et al.(1985) Biochem.Biophys．Res．Comm．129:9 34-942参照）。結果は、成熟した自然サポリンの最初のアミノ酸バリンの前のＮ 末端サポリンリーダー（配列番号３：残基１２〜７）の長さが異なる（７〜１２ アミノ酸）５つのポリペプチドが得られたことを示した。Ｎ末端延長変異体はす べて、細胞毒性活性を保持した。自然リーダーのサイズは１８残基で、これは自 然シグナルペプチドが細菌プロセッシング酵素により適正にプロセッシングされ ていないことを示す。しかしながらｏｍｐＡシグナルは適正にプロセッシングさ れた。 Ｆ．細胞内可溶性サポリンの精製 細胞質ゾル可溶性サポリンタンパク質を精製するために、上記実施例１．Ｅの 細胞内分画からのペレットを溶解緩衝液（30mM TRIS、２mM ＥＤＴＡ、0.1% T riton X-100，pH 8.0。１mM ＰＭＳＦ、10μｇ／ml ペプスタチンＡ、10μｇ アプロチニン、 μｇ／mlロイペプチン及び100μｇ／ml リゾチーム、3.5ml/g の原ペレットを加える）中に再懸濁した。細胞を溶解するために、懸濁液を室 温で１時間放置し、その後液体窒素中で凍結させて、37℃浴中で３回解氷し、次 いで２分間音波処理した。溶解物を11,500 x gで30分遠心分離した。上清を取り 出して、保存した。ペレットを等容量の溶解緩衝液中に再懸濁し、前と同様に遠 心分離して、この二次上清を最初の上清と併合した。プール上清をＢＢＳに対し て透析し、実施例１．Ｅ．１に記載したようにイムノアフィニティーカラム上で クロマトグラフィー処理した。この物質も細胞毒性活性を保持した。 Ｇ．細胞毒性活性に関する検定 ヌクレアーゼ処理ウサギ赤血球溶解物（Promega）における細胞無含有タンパ ク質合成を測定するin vitro検定で、組換え体サポリンのＲＩＰ活性を自然ＳＡ ＰのＲＩＰ活性と比較した。実施例１．Ｅ．１で得られたイムノアフィニティー 精製サポリンの試料をＰＢＳで希釈して、５μl の試料を氷上で35μl のウサギ 赤血球溶解物と、0.5μl のBromeモザイクウイルスＲＮＡ、１mM アミノ酸混合 物−ロイシン、５μCiのトリチウム化ロイシン及び３μl の水を含有する反応混 合物10μl とに加えた。検定試験管を30℃水浴中で１時間インキュベートした。 試験管を氷に移して反応を停止させ、検定混合物５μl を３通り、Millititer H A 96ウエル濾過プレート（Millipore）のウエル中の75μl の１N 水酸化ナトリ ウム、2.5%過酸化水素に加えた。赤色が試料カラ漂白された時点で、氷冷25% 酉 クロロ酢酸（ＴＣＡ）300μl を各ウエルに加えて、プレートを氷上にさらに30 分間放置した。Millipore真空ホルダーを用いて真空濾過を実施した。ウエルを 氷冷８% ＴＣＡ 300μl で３回洗浄した。乾燥後、96ウエルプレートから円形 濾紙をつつきだして、液体シンチレーション法で計数した。 組換え体及び自然サポリンに関するＩＣ₅₀は、約20pMであった。 したがって、組換え体サポリン含有タンパク質は、自然サポリンと比較した場合 、完全タンパク質合成阻害活性を有する。 実施例２ ＦＧＦ−ＳＡＰ融合タンパク質の組換え体生成 Ａ．一般的説明 １．細菌株及びプラスミド 大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＨＭＳ１７４ （ＤＥ３）及びＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳは、NOVAGEN，Madison，WIか ら購入した。下記のプラスミドｐＦＣ８０は、ＷＩＰＯ国際特許出願WO 90/0280 0に記載されているが、但し、本発明でｐＦＣ８０と呼ばれるプラスミドのｂＦ ＧＦコード配列は配列番号１２、ヌクレオチド１〜４６５で示される配列を有す る。本発明のプラスミドは、出発物質としてｐＦＣ８０を用いて、あるいはＦＧ ＦコードＤＮＡ（配列番号１２）に結合したＣＩＩリボソーム結合部位（配列番 号１５）を含有する断片を用いて開始することにより調製し得る。 ２．ＤＮＡ操作 本発明で用いる制限及び修飾酵素は、米国内で市販されている。自然サポリン 、化学的抱合化ｂＦＧＦ−ＳＡＰ及びサポリンに対するウサギポリクローナル抗 血清は、Lappi et al.，Biochem．Biophys．Res．Comm．129:934-942（1985）及 びLappi et al.，Biochem．Biophys．Res．Comm．160:917-923 (1989)に記載さ れたようにして得られた。pET System Induction Controlは、NOVAGEN，Madison ,WIから購入した。United StatesBiochemical CorporationのSequenaseキット（ バージョン 2.0）を用いて、異なる構築のシーケンシングを実施した。プラスミ ドのミニ調製及びマキシ調製、コンピテント細胞の調製、形質転換、Ｍ１３操作 、細菌培地、ウエスタンブ ロッティング及びＥＬＩＳＡ検定は、慣用的方法を用いて実施した（Sambrook e t al．（1989）Molecular Cloning:ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor L aboratory Press,Cold Spring Harbor,NY参照）。GenecleanII キット（Bio 101 から購入）を用いてＤＮＡ断片の精製を実施した。ＳＤＳゲル電気泳動をPhasts ystem(Pharmacia)で実施した。 Ｂ．ＦＧＦ−ＳＡＰ融合タンパク質をコードするプラスミドの構築 １．ＦＧＦと結合するＣＩリボソーム結合部位をコードするＤＮＡを含有する ＦＧＦＭ１３の構築 特定部位の突然変異誘発法により、Amersham in vitro突然変異誘発システム ２．１を用いて、Ｎｃｏ Ｉ制限部位を、実施例１．Ｂ．２に記載されているよ うに調製したＳＡＰコードＤＮＡ Ｍ１３ｍｐ１８−Ｇ４中に導入した。Ｎｃｏ Ｉ制限部位を作るために用いるオリゴヌクレオチドを、３８０Ｂ自動ＤＮＡ合 成機（Applie d Biosystems）を用いて合成した。その配列を以下に示す： Ｎｃｏ Ｉ部位を含有するこのオリゴヌクレオチドは、配列番号３、ｎｔｓ３２ 〜５３で原ＳＡＰ含有コード配列を置換する。その結果生じたＭ１３ｍｐ１８− Ｇ４誘導体をｍｐＮＧ４と呼ぶ。 停止コドンが除去されるｂＦＧＦコード配列を生成するために、ＦＧＦコード ＤＮＡをＭ１３ファージ中でサブクローニングして、特定部位の突然変異誘発を 施した。プラスミドｐＦＣ８０はｐＤＳ２０の誘導体であって（例えば、Dueste r et al.(1982) Cell 30:855-864参照 ;さらに米国特許第4,914,027号、第5,037 ,744号、第5,100,784号及び第5,187,261号参照；さらにＰＣＴ国際出願WO 90/02 800参照；並びに欧州特許出願第267703 A1 号）、これはプラ スミドｐＫＧ１８００（Bernardi et al.(1990) DNA Sequence 1:147-150参照; さらにMcKenney et al.(1981) pp.383-415 in Gene Amplification and Analysi s 2: Analysis of Nucleic Acids by Enzymatic Methods，Chirikjian et al.,e ds，North Holland Publishing Company，Amsterdam 参照）とほとんど同じで あるが、但しそれは、ｐＤＳ２０のヌクレオチド2440及び2880間のｑａｌＫの遠 位端にエキストラ440bpを含有する。プラスミドｐＫＧ１８００は、アンピシリ ン耐性遺伝子及び複製のオリジンを含有するｐＢＲ３２２の2800bp ＥｃｏＲＩ −Ｐｖｕ ＩＩを含む。 全ｑａｌＫ遺伝子を配列番号１２のＦＧＦコードＤＮＡで置換して、ｔｒｐプ ロモーター（配列番号１４）及びＦＧＦコードＤＮＡの上流でそれと有効に結合 するバクテリオファージラムダＣＩＩリボソーム結合部位（配列番号１５；例え ばSchwarzetal.(1978) Nature 272:410参照）を挿入して、プラスミドｐＦＣ８ ０を調製した。ｔｒｐプロモーターはプラスミドｐＤＲ７２０（Pharmacia PL B iochemicals）から得られるか、又は配列番号１４により合成し得る。プラスミ ドｐＦＣ８０は、ｐＳＤ２０の2880 bp ＥｃｏＲＩ-ＢａｍＨＩ断片、Ｔｒｐプ ロモーター領域をコードする合成ＳａｌＩ−ＮｄｅＩ断片（配列番号１４）： 及びＣＩＩリボソーム結合部位（配列番号１５）： を含有する。 ＦＧＦコードＤＮＡを、以下のようにそれを処理してｐＦＣ８０から取り出し た。ｐＦＣ８０プラスミドをＨｇａＩ及びＳａｌＩで 消化すると、ＦＧＦコードＤＮＡに結合するＣＩＩリボソーム結合部位を含有す る断片が生じた。その結果生じた断片をクレノウ試薬で盲端化して、ＳｍａＩに より開環され、盲端結紮のためにアルカリ性ホスファターゼで処理されていたＭ １３ｍｐ１８に挿入した。停止コドンを除去するために、以下のオリゴヌクレオ チド（配列番号９）：GCTAAGAGCGCCATGGAGAを用いて、上記のようにAmershamキ ットを用いてＯＲＩ−方向の挿入物に突然変異を起こさせた。配列番号９は、Ｆ ＧＦカルボキシ末端セリンコドンとＮｃｏＩ制限部位との間に１つのヌクレオチ ドを含有し、それは配列番号１０を有する以下の野性型ＦＧＦコードＤＮＡ： を置換した。 その結果生じたＭ１３ｍｐ１８のｂＦＧＦのカルボキシ末端セリンコドンの後 ろの自然停止コドンを欠いた突然変異体誘導体を、ＦＧＦＭ１３と称した。ＦＧ ＦＭ１３の突然変異化領域は正しい配列（配列番号１１）を含有した。 ２．ＦＧＦ−ＳＡＰ融合タンパク質をコードするプラスミドｐＦＳ９２（ＰＺ １Ａ）、ＰＺ１Ｂ及びＰＺ１Ｃの調製 ａ．プラスミドｐＦＳ９２（別名ＰＺ１Ａ） プラスミドＦＧＦＭ１３をＮｃｏＩ及びＳａｃＩで切断して、置換された停止 コドンを有するｂＦＧＦコード配列と結合したＣＩＩリボソーム結合部位を含有 する断片を生じた。 サポリンコード配列を含有するＭ１３ｍＰ１８誘導体ｍｐＮＧ４をさらに制限 エンドヌクレアーゼＮｃｏＩ及びＳａｃＩで切断して、ＦＧＦＭ１３からのｂＦ ＧＦコード断片を融合タンパク質ｂＦＧＦ−ＳＡＰをコードするＤＮＡとの結紮 によりＭ１３ｍｐ１８誘導 体に挿入して、ｍｐＦＧＦ−ＳＡＰを生じたが、これはＦＧＦ−ＳＡＰ融合タン パク質に結合するＣＩＩリボソーム結合部位を含有する。融合タンパク質の配列 は配列番号１２に示すが、これはＦＧＦタンパク質カルボキシ末端及びサポリン タンパク質アミノ末端が、２つのアミノ酸Ａｌａ Ｍｅｔをコードする６ヌクレ オチド（配列番号１２及び１３、ｎｔｓ４６６〜４７１）により分離されること を示す。 プラスミドｍｐＦＧＦ−ＳＡＰをＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、その結果 生じたｂＦＧＦ−ＳＡＰコード配列を含有する断片を単離し、ＥｃｏＲＩ及びＸ ｂａＩで処理されていたプラスミドｐＥＴ−１１ａ（NOVAGEN，Madison，WIから 入手；プラスミドの説明に関しては、米国特許第4,952,496号参照；さらにStudi er et al.（1990）Meth．Enz．185:60-89; Studier et al.(1986)J.Mol.Biol.18 9:113-130; Rosenberg et al.(1987) Gene 56:125-135参照）に結紮した。その 結果生じたプラスミドをｐＦＳ９２と呼んだ。それをＰＺ１Ａと改名した。 プラスミドｐＦＳ９２（又はＰＺ１Ａ）はＤＮＡ全塩基性ＦＧＦタンパク質（ 配列番号１２）、２−アミノ酸長連結ペプチド、及び成熟ＳＡＰタンパク質のア ミノ酸１〜２５３を含有する。プラスミドｐＦＳ９２はさらに、ＦＧＦ−ＳＡＰ 融合タンパク質に結合するＣＩＩリボソーム結合部位及びｐＥＴ−１１ａからの Ｔ７プロモーター領域を含む。 大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（NOVAGEN，Madison，WI）を、メーカ ーの使用説明書及び実施例２．Ａ．２に記載の方法に従ってｐＦＳ９２で形質転 換した。 ｂ．プラスミドＰＺ１Ｂ プラスミドｐＦＳ９２をＥｃｏＲＩで消化し、ヌクレオチド三リ ン酸塩及びクレノウＤＮＡポリメラーゼを付加して末端を修復し、次いでＮｄｅ Ｉで消化して、ＣＩＩリボソーム結合部位を有しないＦＧＦコードＤＮＡを放出 した。この断片をＢａｍＨＩ消化し、処置して末端を修復し、ＮｄｅＩで消化し ておいたｐＥＴ１１ａに結紮した。その結果生じたプラスミドをＰＺ１Ｂと名付 けた。ＰＺ１ＢはＴ７転写ターミネーター及びｐＥＴ−１１ａリボソーム結合部 位を含む。 大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（NOVAGEN，Madison，WI）を、メーカーの使用説 明書及び実施例２．Ａ．２に記載の方法に従ってＰＺＩＢで形質転換した。 ｃ．プラスミドＰＺ１Ｃ アンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子で置換して、ＰＺ１Ｂから プラスミドＰＺ１Ｃを調製した。 ｄ．プラスミドＰＺ１Ｄ プラスミドｐＦＳ９２をＥｃｏＲＩ及びＮｄｅＩで消化して、ＣＩＩリボソー ム結合部位を有しないＦＧＦコードＤＮＡを放出し、末端を修復した。この断片 を、ＢａｍＨＩ消化し、処置して末端を修復しておいたｐＥＴ１２ａに結紮した 。その結果生じたプラスミドをＰＺ１Ｄと名付けた。ＰＺ１Ｄは、融合タンパク 質をコードするＤＮＡと任意に結合するＯＭＰ Ｔ分泌シグナルをコードするＤ ＮＡを含む。 大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＨＭＳ１７４（ ＤＥ３）及びＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（NOVAGEN，Madison，WI）を 、メーカーの使用説明書及び実施例２．Ａ．２に記載の方法に従ってＰＺ１Ｄで 形質転換した。 Ｃ．組換え体ｂＦＧＦ−ＳＡＰ融合タンパク質の発現： 上記の２段階法を用いて、組換え体ｂＦＧＦ−ＳＡＰタンパク質 （以後ｂＦＧＦ−ＳＡＰ融合タンパク質と呼ぶ）を生成した。 １．ｐＦＳ９２（ＰＺ１Ａ）からのｒｂＦＧＦ−ＳＡＰの発現 アンピシリン（50μg／ml）及びクロラムフェニコール（25μg／ml）を含有す るＬＢブロス ３リットルに、実施例２．Ｂにより得られた一夜培養（１：100 希釈）からのｐＦＳ９２プラスミド含有細菌細胞（ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ Ｓ株）を植えつけた。細胞をインキュベーター振盪器中で37℃で増殖させてＯＤ₆₀₀ を0.7とした。ＩＰＴＧ（Sigma Chemical，St．Louis，MO）を加えて最終濃 度を0.2mMとし、1.5時間増殖させて、細胞を遠心分離した。その後、37℃を30℃ に変えると、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株細胞の増殖が改善されて収率が上 がった。細胞を30℃で増殖させた場合、ＯＤ₆₀₀は誘導前の1.5倍になった。誘導 後、増殖を約２〜2.5時間続けた後に、遠心分離により細胞を収集した。 ペレットを溶解液（45〜60ml／ペレット16ｇ；20mM TRIS,pH7.4、5 mM ＥＤ ＴＡ、10% ショ糖、150 mM ＮａＣｌ、リゾチーム、100μg／ml アプロチニン 、10μg／ml ロイペプシン、10μg／ml ペプスタチンＡ、10μg／ml及び１mMP ＭＳＦ）中に再懸濁し、攪拌しながら室温で１時間インキュベートした。溶液を 凍結し、３回解氷して、2.5分間音波処理した。懸濁液を12,000 x gで１時間遠 心分離し、その結果生じた一次上清を篩にかけて、ペレットをリゾチームを含ま ない別の容量の溶解液に再懸濁した。再懸濁物質を再び遠心分離して二次上清を 生成し、２つの上清をプールして、ホウ酸塩緩衝食塩水，pH8.3に対して透析し た。 ２．ＰＺ１Ｂ及びＰＺ１ＣからのｂＦＧＦ−ＳＡＰ融合タンパク質の発現 アンピシリン（100μg／ml）を含有するＬＢ培地 250mlにＰＺ１Ｂの新鮮な グリセロールストックを植えつけた。細胞をインキ ュベーター振盪器中で30℃で増殖させてＯＤ₆₀₀を0.7とし、４℃で一夜保存した 。翌日、細胞をペレット化し、新鮮なＬＢ培地（アンピシリン無含有）中に再懸 濁した。細胞を５つの１リットルバッチに分けて、インキュベーター振盪器中で 30℃で増殖させてＯＤ₆₀₀を1.5とした。ＩＰＴＧ（Sigma Chemical,St.Louis，M O）を加えて最終濃度を0.1mMとし、約２〜2.5時間増殖させて、細胞を遠心分離 して収集した。 ＰＺ１Ｃを増殖させるために、誘導前に、アンピシリンの代わりにカナマイシ ン（50μg／ml）を含有する培地中で細胞を増殖させた。 ３．ＰＺ１ＤからのｂＦＧＦ−ＳＡＰ融合タンパク質の発現 アンピシリン（100μg／ml）を含有するＬＢ培地 250mlにＰＺ１Ｂの新鮮な グリセロールストックを植えつけた。細胞をインキュベーター振盪器中で30℃で 増殖させてＯＤ₆₀₀を0.7とし、４℃で一夜保存した。翌日、細胞をペレット化し 、新鮮なＬＢ培地（アンピシリン無含有）中に再懸濁した。細胞をＬＢ培地の１ リットルバッチに植えつけて、インキュベーター振盪器中で30℃で増殖させてＯ Ｄ₆₀₀を1.5とした。ＩＰＴＧ（Sigma Chemical,St.Louis，MO）を加えて最終濃 度を0.1mMとし、約２〜2.5時間増殖させて、細胞を遠心分離して収集した。 細胞ペレットを氷冷1.0 M Tris，pH9.0、２mM ＥＤＴＡ中に再懸濁した。再 懸濁物質を氷上でさらに20〜60分間保持し、次いで遠心分離してペリプラズム分 画（上清）を細胞内分画（ペレット）カラ分離した。 Ｄ．ｂＦＧＦ−ＳＡＰ融合タンパク質のアフィニティーの精製 実施例２．Ｃ．からのｂＦＧＦ−ＳＡＰを含有する透析溶液 30mlを、10mM Tris，pH 7.4に溶解した0.15 M ＮａＣｌ （緩衝液Ａ ）で平衡させたＨｉＴｒａｐ ヘパリン−セファロースカラム（Pharmacia,Upps ala，Sweden）に適用した。カラムを洗浄した：１回目 平衡緩衝液；２回目 緩衝液Ａに溶解した0.6 M ＮａＣｌ；３回目 緩衝液Ａに溶解した1.0 M ＮａＣ ｌ。最後に緩衝液Ａに溶解した2 M ＮａＣｌを用いて1.0 ml分画中に溶離した。 ＥＬＩＳＡ法により試料を検定した。 結果は、ｂＦＧＦ−ＳＡＰ融合タンパク質が、自然及び組換え的生成ｂＦＧＦ と同じ濃度（2 M ＮａＣｌ）のヘパリン−セファロースカラムから溶離すること を示す。これは、ヘパリン親和性がｂＦＧＦ−ＳＡＰ融合タンパク質中に保持さ れることを示す。 Ｅ．ｂＦＧＦ−ＳＡＰ融合タンパク質の特性表示 １．アフィニティー精製ｂＦＧＦ−ＳＡＰ融合タンパク質のウエスタンブロテ ィング ＳＤＳゲル電気泳動を、20% ゲルを用いるPhastsystem(Pharmacia)で実施した 。メーカーの説明通りに、Phast Transferシステムを用いて電気泳動処理したタ ンパク質をニトロセルロースに移して、ウエスタンブロティングを成し遂げた。 ＳＡＰの抗血清及びｂＦＧＦを１：1000の希釈で用いた。ホースラディッシュペ ルオキシダーゼ標識化抗ＩｇＧを二次抗体として用いた（Davis et al.(1986) B asic methods in molecular biology，New York，Elsevier Science Publishing Co.，pp1-338参照）。 抗ＳＡＰ及び抗ＦＧＦ抗血清は、分子量約48,000 kdのタンパク質と結合した 。これはＳＡＰ（30,000）及びｂＦＧＦ（18,000）の個々の分子量の和に相当す る。 ２．ＦＧＦ−ＳＡＰ融合タンパク質の細胞毒性を評価するための検定 ａ．細胞無含有タンパク質合成に及ぼすｂＦＧＦ−ＳＡＰ融合タ ンパク質の作用 実施例１．Ｇに記載されているように、ｂＦＧＦ−ＳＡＰ融合タンパク質のＲ ＩＰ活性をＦＧＦ−ＳＡＰ化学的抱合体のＲＩＰ活性と比較した。結果は、ｂＦ ＧＦ−ＳＡＰ融合タンパク質のＩＣ₅₀は約0.2 nMであり、化学的抱合化ＦＧＦ- ＳＡＰのＩＣ₅₀は約0.125であることを示した。 ｂ．ｂＦＧＦ−ＳＡＰ融合タンパク質の細胞毒性 Promega(Madison，WI) CellTiter 96 細胞増殖／細胞毒性検定ヲ用いて、細胞 毒性実験を実施した。ヒト黒色腫細胞株であるＳＫ−Ｍｅｌ−２８細胞約1,500 個を90μl ＨＤＭＥＭ＋10% ＦＣＳを含入する96ウエルプレートの各ウエルに入 れ、37℃、５% ＣＯ₂で一夜インキュベートした。翌朝、培地10μl のみ、又は 種々の濃度のｒｂＦＧＦ−ＳＡＰ融合タンパク質、塩基性ＦＧＦ又はサポリンを 含有する培地 10μl をウエルに加えた。プレートを37℃で72時間インキュベー トした。インキュベーション後、Promega キットとして供給される市販の染料Ｍ ＴＴの取込み及び変換を測定することにより、生存細胞数を確定した。ＭＴＴ溶 液 15μl を各ウエルに加え、インキュベーションを４時間継続した。次に、Pr omegaキットの一部として供給される標準可溶化溶液 100μl を各ウエルに加え た。プレートを室温で一夜放置し、560nmでの吸光度をＥＬＩＳＡプレート読み 取り器（Titertek Multiskan PLUS，INC．Flow，Costa Mesa，CA）で読み取った 。 結果は、化学的ＦＧＦ−ＳＡＰ抱合体のＩＤ₅₀は0.3 nMであり、ｂＦＧＦ- Ｓ ＡＰ融合タンパク質のＩＤ₅₀は0.6 nMであり、細胞表面に結合できない非抱合化 ＳＡＰのＩＤ₅₀は200 nMであることを示した。したがって、取り込まれた場合、 ｂＦＧＦ−ＳＡＰ融合タンパク質は化学的抱合化ＦＧＦ−ＳＡＰとほぼ同じ細胞 毒性活性を有 するものと思われる。 実施例３ ＦＧＦムテインの調製 Ａ．材料及び方法 １．試薬 制限及び修飾酵素は、ＢＲＬ（Gaithersburg，MD）、Stratagene（La Jolla， CA）、及びNew England Biolabs（Beverly，MA）から購入した。自然ＳＡＰ、化 学的抱合化塩基性ＦＧＦ−ＳＡＰ及びＳＡＰ及び塩基性ＦＧＦに対するウサギポ リクローナル抗血清は、Saponaria officinalisから得られた（例えば、Stirpe et al.(1983) Biochem．J．216:617-625 参照）。手短に言えば、0.14M ＮａＣ ｌを含有する５mM リン酸ナトリウム緩衝液，pH7.2中ですりつぶして種子を抽 出し、チーズ布で抽出物を漉して、28,000ｇで30分遠心分離し、粗製抽出物を生 成した。これを５mMリン酸ナトリウム緩衝液，pH 6.5に対して透析し、遠心分離 して、ＣＭ−セルロース（ＣＭ５２，Whatman，Maidstone，Kent，U.K.）に適用 した。ＣＭカラムを洗浄し、ＳＯ−６をリン酸塩緩衝液中の０〜0.3 M ＮａＣｌ 勾配で溶離した。 塩基性ＦＧＦコード配列を含有するプラスミドｐＦＣ８０は、Farmitalia Car lo Erba（Milan，Italy）の Paolo Sarmientos及びAntonellaIsacchi両博士か ら頂いた。プラスミドｐＦＣ８０は、WIPO国際特許出願 WO 90/02800 及び同時 係属中の国際ＰＣＴ出願 PCT/US93/05702（WO 93/25688として公告）（これら の記載内容は参照により本明細書中に含めるものとする）に記載されている。ｐ ＦＣ８０中のｂＦＧＦをコードするＤＮＡの配列は、同時係属中の国際ＰＣＴ出 願 PCT/US93/05702 及び配列番号１２に記載される。ｐＦＣ８０の構築は、実 施例２に上記されている。 プラスミド単離、コンピテント細胞の産生、形質転換及びＭ１３操作は、発表 済の手法に従って実施した（Sambrook et al．(1989)Molecular Cloning: A Lab oratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N Y）。ＤＮＡ断片の精製は、Geneclean IIキット（Bio 101，La Jolla，CAから購 入）を用いて達成した。異なる構築物のシーケンシングは、United States Bioc hemical Corporation のSequenase キット（バージョン２．０）を用いて実施し た。 ２．ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル電気泳動及びウエスタンブロティ ング ＳＤＳゲル電気泳動を、20% ゲルを用いるPhastsystem(Pharmacia)で実施した 。メーカーの説明通りに、Phast Transferシステム（Pharmacia）を用いて電気 泳動処理したタンパク質をニトロセルロースに移して、ウエスタンブロティング を成し遂げた。ＳＡＰ及び塩基性ＦＧＦの抗血清を１：1000の希釈で用いた。ホ ースラディッシュペルオキシダーゼ標識化抗ＩｇＧを二次抗体として用いた（Da vis et al.(1986) Basic methods in molecular biology，New York,）。 Ｂ．特定部位の突然変異誘発による突然変異化ＦＧＦの調製 Amersham(Arlington Heights，IL) in vtro突然変異誘発系2.1を用いる特定オ リゴヌクレオチド突然変異誘発により、システイン−セリン置換を実施した。３ ８０Ｂ自動ＤＮＡ合成機（Applied Biosystems，Foster City，CA）を用いて、 新規のアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドを合成した。 １．突然変異誘発 システイン７８のin vitro突然変異誘発のために用いたオリゴヌクレオチドは 、ＡＧＧＡＧＴＧＴＣＴＧＣＡＴＡＡＣＣ（配列番号 １７）であり、これは配列番号１２のヌクレオチド２７９〜３０２に及ぶ。突然 変異性複製型ＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０９株中で形質転換し、単一プラークを摘出 して、突然変異立証のためにシーケンシングした。次にＦＧＦ突然変異化遺伝子 をＭ１３から切り出して、除去された非突然変異型遺伝子を有する発現ベクター ｐＦＣ８０に結紮し、大腸菌ＪＭ１０９株中で形質転換した。単一コロニーを摘 出し、突然変異が存在することを立証するためにプラスミドをシーケンシングし た。適切な突然変異を有するプラスミドを次に大腸菌ＦＩＣＥ２株中で形質転換 し、これらの形質転換からの単一コロニーを用いて突然変異体塩基性ＦＧＦを得 た。約20mg／発酵ブロス１ｌという優れた発現レベルに達した。 ２．突然変異化ＦＧＦの精製 100μg／mlアンピシリンを含有するＬＢブロス 20ml中で細胞を一夜増殖させ た。翌朝、細胞をペレット化し、100μg／mlアンピシリンを含有するＭ９培地 500mlに移して、７時間増殖させた。細胞をペレット化し、溶解溶液（10mM TRIS ,pH 7.4、150mM ＮａＣｌ、リゾチーム、10μg／ml アプロチニン、10μg／ml ロイペプチン、10μg／ml ペプスタチンＡ、10μg／ml及び１mM ＰＭＳＭ； 45〜60ml／ペレット16ｇ）中に再懸濁して、攪拌しながら室温で１時間インキュ ベートした。溶液を３回凍結及び解氷して、2.5 分間音波処理した。懸濁液を遠 心分離し、上清を篩にかけて、ペレットをリゾチームを含まない別の溶解液に再 懸濁し、再び遠心分離して、上清をプールした。抽出液(40ml)を10mM TRIS,pH 7 .4（緩衝液Ａ）で50mlに希釈した。プールしたものを緩衝液Ａに溶解した150 mM 塩化ナトリウムで平衡させた５mlＨｉ−Ｔｒａｐ ヘパリン−セファロースカラ ム（Pharmacia,Uppsala，Sweden）上に載せた。カラムを緩衝液Ａに溶解した0.6 M 塩化ナトリウム及び1 M 塩化ナトリウムで洗浄し、次いで緩衝液Ａ中の2 M 塩化ナトリウムで溶離した。 280 nmでの光学密度により測定した場合、2 M 溶離液のピーク分画をプールし、 ゲル電気泳動により純度を測定した。精製タンパク質の収量は、Ｃｙｓ⁷⁸突然変 異体に関しては10.5mg、Ｃｙｓ⁹⁶突然変異体に関しては10.9mgであった。 〔Ｃ７８Ｓ〕ＦＧＦ及び〔Ｃ９６Ｓ〕ＦＧＦの生物学的活性を、培養中の副腎 毛細管内皮細胞に関して測定した。10% 仔ウシ血清−ＨＤＭＥＭ １ml中に24ウ エルプレートのウエル当たり細胞3000個で、細胞をプレーティングした。細胞が 付着した時点で、指示濃度で３通りに試料を加え、37℃で48時間インキュベート した。等量の試料を加えて、さらに48時間インキュベートした。培地を吸引して 、トリプシン（容量１ml）で細胞を処理して、９mlのHematall希釈液に細胞を取 り出して、Coulter カウンターで計数した。結果は、培養中の内皮細胞増殖を刺 激する能力により判定した場合、２つの突然変異体が自然塩基性ＦＧＦの増殖活 性をほとんど完全に保持することを示す。 実施例４ サポリンの調製：モノ誘導化サポリンの誘導化及び精製 濃度4.1mg/mlの濃度のサポリン（ＳＡＰ；49mg）を、0.1M リン酸ナトリウム 、0.1 M 塩化ナトリウム，pH 7.5に対して透析した。1.1 モルの過剰量（無水エ タノール156μl 中に63μg ）のＳＰＤＰ（Pharmacia,Uppsala，Sweden）を加え て、反応混合物を直ちに攪拌して30分間揺り台に載せた。次に溶液を同一緩衝液 に対して透析した。Pharmaciaの使用説明書に従って、誘導化の程度に関して透 析溶液のアリコートを調べた。誘導化度は、ＳＰＤＰ 0.86mol／ＳＡＰ 1molで あった。これらの実験中、反応混合物中の等量のＳＰＤＰを用いてＳＡＰの別の バッチを誘導化し、その結果、ＳＰ ＤＰ対ＳＡＰのモル比は0.79であった。 誘導化ＳＡＰ(32.3mg)を0.1 M ホウ酸ナトリウム，pH 9.0中で透析し、透析緩 衝液に溶解した25mM 塩化ナトリウムで平衡させたMono S 16/10カラムに適用し た。透析緩衝液中の25mM〜125mM塩化ナトリウムの勾配を動かしてＳＡＰ及び誘 導化ＳＡＰを溶離した。流速は4.0 ml／分で、分画４mlを収集した。分画のアリ コートをタンパク質濃度（ＢＣＡタンパク質検定 Pierce Chemical，Chicago， IL）に関して、及び還元剤により放出されるピリジルチオンに関して検定した。 25〜37の個々の分画をタンパク質濃度及びピリジルジスルフィド濃度に関して分 析し、表５に示した。分画24〜28は約２mol の２−ピリジルジスルフィド／ＳＡ Ｐ１mol に対応し、29〜33は１mol／１mol に対応し、そして34〜37は非誘導化 ＳＡＰを含有する。これらのデータは、ＳＰＤＰによる誘導化のレベルによる分 離を示す。最初の溶離ピークは、およそジ誘導化されるＳＡＰを構成する；第二 のピークは、モノ誘導化であり、第三ピークは非誘導化を示す。ジ誘導化物質は 、３つのピークの20% を占める；第二は48% を占め、第三ピークは32% を含有す る。第二ピークからの物質をプールした結果、ピリジルジスルフィド対ＳＡＰの 平均比は0.95であった。分画３３は、ピリジン−２−チオン対タンパク質の発散 比を示したが、これはおそらく低濃度のためと思われる。それはプールから除外 した。プール化物質を、本発明の抱合に用いた。0.85より大きく1.05未満のＳＰ ＤＰ対ＳＡＰ比を示した分画をプールし、0.1 M 塩化ナトリウム、0.1 M リン酸 ナトリウム，pH7.5に対して透析し、塩基性ＦＧＦによる誘導化に用いた。これ らの物質のプールは、ＳＰＤＰ対ＳＡＰのモル比が0.9 で、最終収量は4.6 mgで あった。 実施例５ サポリンの調製：修飾化サポリンの調製 ＳＡＰを誘導化する代わりに、システイン残基をＤＮＡのＮ末端部分に付加す ることにより、又は位置４又は１０のシステインの付加によって、ＳＡＰを修飾 した。次に、その結果生じたサポリンをＦＧＦで利用可能なシステインと反応さ せて、サポリン上の付加Ｃｙｓ又はＭｅｔ−Ｃｙｓを介して結合する抱合体を生 成した。 修飾化ＳＡＰは、位置１にＭｅｔ−Ｃｙｓ又はＣｙｓをコードす るＤＮＡを挿入することにより、又はＮ末端の１０又はそれ以下の残基内のＩｌ ｅ又はＡｓｐコドンを置換することにより、サポリンをコードするＤＮＡを修飾 して調製した。その結果生じたＤＮＡをｐＥＴ１１ａ及びｐＥＴ１５ｂに挿入し 、ＢＬ２１細胞中で発現させた。その結果生じたサポリンタンパク質をＦＰＳ１ （−１にＣｙＳを有するサポリン）、ＦＰＳ２（位置４にＣｙｓを有するサポリ ン）及びＦＰＳ３（位置１０にＣｙｓを有するサポリン）と名付けた。ＦＰＳ１ をコードする並びにＦＰＳ１の発現のために存在したプラスミドをＰＺ５０Ｂと 名付けた。ＦＰＳ２をコードする、並びにＦＰＳ１の発現のために用いられたプ ラスミドをＰＺ５１Ｂ（ｐＥＴ１１ａ−ベースのプラスミド）及びＰＺ５１Ｅ（ ｐＥＴ１５ｂ−ベースのプラスミド）と名付けた。ＦＰＳ３をコードする、並び にＦＰＳ３の発現のために用いられたプラスミドをＰＺ５２Ｂ（ｐＥＴ１１ａ− ベースのプラスミド）及びＰＺ５２Ｅ（ｐＥＴ１５ｂ−ベースのプラスミド）と 名付けた。 Ａ．材料及び方法 １．細菌株 Novablue（NOVAGEN，Madison，WI）及びＢＬ２１（ＤＥ３）（NOVAGEN，Madis on，WI）。 ２．ＤＮＡ操作 実施例１及び２に記載されているようにＤＮＡ操作を実施した。 実施例２に記載のプラスミドＰＺ１Ｂ（ＰＺ１Ｂ１と呼ぶ）をＤＮＡ鋳型とし て用いた。 Ｂ．Ｎ末端に付加システイン残基を有するサポリンの調製 １．プライマー （ａ）プライマー＃１ − サポリンのセンス鎖、配列番号１２のヌクレオチ ド４７２〜４９２に対応し、ＮｄｅＩ部位を組み込み 、成熟タンパク質の最初のコドンにｃｙｓコドン５’を付加する（Ｍｅｔ及びＶ ａｌ間）： （ｂ）プライマー＃２ − アンチセンスプライマーは、配列番号１２のヌク レオチド５４７〜５６７に及ぶサポリンのコード配列を相補し、ＢａｍＨＩ部位 を含有する： ２．サポリンコードＤＮＡの単離 上記のプライマーを用いて、以下のようにＰＺＩＢ１ ＤＮＡをＰＣＲにより 増幅した。ＰＺＩＢ１ ＤＮＡ（１μl ）を、10mM Tris-HCl（pH 8.3）、50mM ＫＣｌ、0.01% ゼラチン、２mM ＭｇＣｌ₂、0.2 mMｄＮＴＰｓ、O.8μg のプラ イマーを含有する最終容量100μl 中に混合した。次に、2.5 U ＴａｑｌＤＮＡ ポリメラーゼ（Boehringer Mannheim）を加え、混合物に鉱油（Sigma）30μl を 被せた。ＤＮＡ Thermal Cycler（Ericomp）中でインキュベーションを実施した 。１サイクルには、変性工程（94℃で１分）、アニーリング工程（60℃で２分） 及び延長工程（72℃で３分）が含まれた。35サイクル後、各反応液の10μl アリ コートを1.5% アガロースゲル上で処理して、増幅産物の正確な構造を立証した 。 増幅ＤＮＡをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化して、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ消 化ｐＺ１Ｂ１中でサブクローニングした。この消化及びサブクローニング工程に よりＦＧＦコードＤＮＡ及びヌクレオチド５５５〜５６０（配列番号１２）のＢ ａｍＨＩ部位までのＳＡＰの５’部分を取り出して、この部分を、自然成熟ＳＡ Ｐタンパク質の出発部位に対して位置１にシステイン残基を含有するサポリン分 子をコードするＤＮＡで置換した。その結果生じたプラスミドをｐＺ５０Ｂ１と 呼ぶ。 Ｃ．自然タンパク質の位置４又は１０にシステイン残基を有するサポリンの調 製 これらの構築物は、位置４のイソロイシン残基又は位置１０のアスパラギン残 基をシステインで置換することにより自然タンパク質の位置４又は１０にシステ イン残基を導入するよう意図された。 １．材料 （ａ）細菌株 細菌株は、Novablue及びＢＬ２１（ＤＥ３）（NOVAGEN，Madison，WI）であっ た。 （ｂ）ＤＮＡ操作 上記のようにＤＮＡ操作を実施した。 ２．修飾化ＳＡＰコードＤＮＡの調製 ＦＧＦ−ＳＡＰ融合タンパク質をコードする親プラスミドｐＺ１Ｂ１からポリ メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＳＡＰを増幅した。 （ａ） プライマー （１）配列番号１２のヌクレオチド４６６〜５０１に及ぶサポリンのセンス鎖 に対応するプライマーは、ＮｄｅＩ部位を組み込み、成熟タンパク質の位置４で ＩｌｅコドンをＣｙｓコドンで置換する（配列番号３８）： （２）配列番号１２のヌクレオチド４６６〜５１５に及ぶサポリンのセンス鎖 に対応するプライマーは、ＮｄｅＩ部位を組み込み、成熟タンパク質の位置１０ でＡｓｐコドンをＣｙｓコドンで置換する（配列番号３９）： （３）プライマー＃２ − アンチセンスプライマーは配列番号 １２のヌクレオチド５４７〜５６７に及ぶサポリンのコード配列を相補し、Ｂａ ｍＨＩ部位を含有する（配列番号３５）： （ｂ）増幅 以下のサイクルを用いて、上記のようにＰＣＲ反応を実施した：94℃で１分の 変性工程、60℃で２分間のアニーリング及び72℃で２分間35サイクルの延長。増 幅ＤＮＡをゲル精製し、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化して、ＮｄｅＩ及びＢａ ｍＨＩ消化ｐＺ１Ｂ１中でサブクローニングした。この消化により親ＦＧＦ−Ｓ ＡＰベクター（ｐＺ１Ｂ１）からＦＧＦ及びＳＡＰの５’部分（新規付加Ｂａｍ ＨＩまで）を取り出して、この部分を、自然成熟ＳＡＰタンパク質の出発部位に 対して位置４又は１０にシステイン残基を含有するＳＡＰ分子で置換した。その 結果生じたプラスミドをそれぞれｐＺ５１Ｂ１及びｐＺ５２Ｂ１と呼ぶ。 Ｄ．ベクターｐＥＴ１５ｂ中のＳＡＰ突然変異体をコードするＤＮＡのクロー ニング 本構築の初期工程は、ヌクレオチド５４３〜５７０（配列番号１２）に対応す るが、ヌクレオチド５５５（Ｌｙｓコドンの第三位置）でＧをＡに変えるセンス プライマーを用いたＰＣＲによるｐＺ１Ｂ１のヌクレオチド５５５〜５６０（配 列番号１２）の内部ＢａｍＨＩ部位の突然変異誘発であった。センスプライマー の補体は、アンチセンスプライマーとして用いられた。ＰＣＲ反応は、上記Ｂに 記載したように実施した。その結果生じたＰＣＲ産物 １μl は、サポリンコー ドＤＮＡの５’末端にＮｄｅＩ部位及びＣｙｓコドンを導入するために、上記Ｂ に記載の同一センスオリゴヌクレオチドを用いる二次ＰＣＲ反応に用いた。アン チセンスプライマーはサポリンタンパク質の３’末端を相補的で、クローニング のためのＢａ ｍＨＩ部位及び停止コドンをコードする（配列番号３７）： その結果生じたプラスミドをＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで消化して、Ｈｉｓ−Ｔａ ｇ^TMリーダー配列（配列番号３６）を有し、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで消化してい たｐＥＴ１５ｂ（NOVAGEN，Madison，WI）に挿入した。 センスプライマーとしてそれぞれ配列番号３８及び３９を、アンチセンスプラ イマーとして配列番号３７を用いて、ＳＡＰ−Ｃｙｓ−４及びＳＡＰ−Ｃｙｓ− １０突然変異体を同様にｐＥＴ１５ｂに挿入した。 非修飾ＳＡＰをコードするＤＮＡ（実施例１）は、修飾化ＳＡＰコードＤＮＡ に関して下に記載したと同様に、ｐＥＴ１５ｂ又はｐＥＴ１１ａに挿入し、発現 し得る。 Ｅ．修飾サポリンコードＤＮＡの発現 実施例２に記載したようにＢＬ２１（ＤＥ３）をその結果生じたプラスミドで 形質転換して、培養したが、但しインキュベーションは37℃の代わりに30℃で実 施した。手短にいえば、単一コロニーをＬＢ ＡＭＰ₁₀₀中で増殖させてＯＤ₆₀₀ を1.0〜1.5とし、次いでＩＰＴＧ（最終濃度0.1mM）で２時間誘導した。細胞を 遠心分離して収集した。 Ｆ．修飾化サポリンの精製 溶解緩衝液（20mM ＮａＰＯ₄，pH7.0、５mM ＥＤＴＡ、５mM ＥＧＴＡ、１ mM ＤＴＴ、0.5μg／ml ロイペプチン、１μg／mlアプロチニン、O.7μg／ml ペプスタチンＡ）をｒＳＡＰ細胞ペースト（上記のようにＢＬ２１細胞中でｐＺ ５０Ｂ１から生成）に1.5 ml緩衝液／細胞１ｇの比で加えた。この混合物を、Po lytron 均質化剤を介して均一に懸濁し、２回、ミクロ流動化装置に通 した。 その結果生じた溶解物を50,000rpmで45分間遠心分離した。上清をＳＰ 緩衝 液Ａ（20mM ＮａＰＯ₄、１mM ＥＤＴＡ，pH7.0）で希釈して、伝導率が2.5 mS /cm以下になるようにした。次に希釈溶解物上清をＳＰ−セファロースカラムに 入れて、ＳＰ 緩衝液Ａに溶解して総量６カラム容量とした０〜30% ＳＰ緩衝液 Ｂ（1 M ＮａＣｌ、20mMＮａＰＯ₄、１mM ＥＤＴＡ，pH7.0）線状勾配を適用し た。ｒＳＡＰを含有する分画を併合し、その結果生じたｒＳＡＰは90% 以上の純 度を有した。 ここで緩衝液交換工程を用いて、ＳＰ溶離物を50mM ＮａＢＯ₃、１mM ＥＤ ＴＡ，pH 8.5を含有する緩衝液（Ｓ緩衝液Ａ）中に取った。次にこの試料を、Ｓ 緩衝液Ａで予備平衡させたResource Sカラム（Pharmacia，Sweden）に適用した 。精製ｒＳＡＰを、ＳＰ緩衝液Ａに溶解した０〜300mM ＮａＣｌの線状勾配 1 0カラム容量によりカラムから溶離した。最終ｒＳＡＰは純度約98% で、ｒＳＡ Ｐの全収量の約50% であった（粗製溶解物中のｒＳＡＰの量は、ＥＬＩＳＡで測 定した）。 この調製では、超遠心分離を用いて溶解物を透明にした；例えば濾過及び凝集 剤の使用といった他の方法を用いてもよい。さらに、Streamline S（Pharmacia ，Sweden）を大量生産用に用いてもよい。 実施例６ Ａ．抱合体の細胞毒性検定 Promega （Madison，WI）CellTiter 96 細胞増殖／細胞毒性検定により、細 胞毒性実験を実施した。使用した細胞型は、ＳＫ−Ｍｅｌ−２８、ヒト黒色腫Ｓ ｗｉｓｓ ３Ｔ３マウス繊維芽細胞（Pamela Maher博士、La Jolle，CA の提供 による）、Ｂ１６Ｆ１０、 マウス黒色腫、ＰＡ−１、ヒト卵巣癌（Julie Beitz博士、Roger Williams Hosp ital，Providence，RIの提供による）、及びベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）〔 アメリカ培養細胞コレクション（ＡＴＣＣ）から入手〕であった。１ウエル当た り2500個の細胞をプレーティングした。 Ｂ．ＦＧＦムテインのＳＡＰとの共役 １．〔Ｃ７８Ｓ〕ＦＧＦ−ＳＡＰ（ＣＣＦＳ２）及び〔Ｃ９６Ｓ〕ＦＧＦ−Ｓ ＡＰ（ＣＣＦＳ３）の化学合成 リン酸塩緩衝化食塩水に対して透析済の〔Ｃ７８Ｓ〕ＦＧＦ又は〔Ｃ９６Ｓ〕 ＦＧＦ（１mg；56nmol）を2.5mgモノ誘導化ＳＡＰ（塩基性ＦＧＦ突然変異体よ り1.5モル余分）に付加し、揺り台上に一夜放置した。翌朝、紫外線−可視光線 波長スペクトルを適用して、343nmで吸着して公知の吸光係数を有するピリジル チオンの放出により反応の程度を測定した。ピリジルチオン対塩基性ＦＧＦ突然 変異体の比は、〔Ｃ７８Ｓ〕ＦＧＦに関しては1.05、〔Ｃ９６Ｓ〕ＦＧＦに関し ては0.92であった。反応混合物を以下の方法で精製のために同様に処理した：反 応混合物を、緩衝液Ａに溶解した0.15 M 塩化ナトリウムで平衡させた HiTrap ヘパリン−セファロースカラム（１ml）に0.5ml／分の流速で通した。カラムを 緩衝液Ａに溶解した0.6 M ＮａＣｌ及び1.0 M ＮａＣｌで洗浄し、生成物を緩衝 液Ａに溶解した2.0 M ＮａＣｌで溶離した。分画（0.5ml）をゲル電気泳動及び2 80nmでの吸光度で分析した。ピーク試験管をプールし、10mM リン酸ナトリウム ，pH7.5に対して透析して、同一緩衝液で緩衝したMono-S 5/5 カラムに適用し た。緩衝液中の０〜1.0 M 塩化ナトリウム勾配 10mlを用いて生成物質を溶離し た。ゲル電気泳動により純度を測定し、ピーク分画をプールした。収量は、〔Ｃ ７８Ｓ〕ＦＧＦ−ＳＡＰに関しては1.6mg（〔Ｃ７８Ｓ〕ＦＧ Ｆの出発量に関しては60% ）、及び〔Ｃ９６Ｓ〕ＦＧＦ−ＳＡＰに関しては0.96 mg（35% ）であった。 ほぼ100 % の突然変異体ＦＧＦがモノ誘導化ＳＡＰと反応した（〔Ｃ７８Ｓ〕 ＦＧＦ：105 % 、〔Ｃ９６Ｓ〕ＦＧＦ：92% ）。各突然変異体の遊離表面システ インが遊離スルフヒドリルとして作用するため、細菌から精製後にシステインを 低減させる必要はなかった。その結果生じた生成物質をヘパリン−セファロース により精製し（データは示されていない）、したがって抱合体のヘパリン結合活 性が保持されることが確定された。 精製タンパク質のCoomassie染色及びウエスタンブロティングにより、ＳＡＰ 及びｂＦＧＦの併合分子量に対応して、約48,000の分子量で顕著な帯が示された 。それより僅かに低い分子量で非常に明るい帯が検出されたが、ＳＤＳ−ゲル電 気泳動（例えば、Lappi et al.(1985) Biochem．Biophys．Res．Commun．129:93 4-942参照）において汚染を引き起こすＳＡＰの高等電点(10.5)により生じた人 工物の説明済の移動度とみなされた（Gelfiet al.(1987) J.Biochem．Biophys.M eth．15:41-48）。塩基性ＦＧＦ１モル当たり１分子より多いＳＡＰを、又はＳ ＡＰ１モル当たり１分子より多い塩基性ＦＧＦを含有する抱合体に対応するより 高分子の帯は、〔Ｃ７８Ｓ〕ＦＧＦ−ＳＡＰの、及び〔Ｃ９６Ｓ〕ＦＧＦ−ＳＡ ＰのCoomassie染色ゲルでは検出されなかった。このような帯は、野性型ｂＦＧ Ｆ及び非精製誘導化ＳＡＰから合成された等量（重量）の異質ＦＧＦ−ＳＡＰを 負荷したゲルのレーンで認められた。 ＳＡＰ又は塩基性ＦＧＦに対する抗体を用いたウエスタンブロティングからは 、480ngの〔Ｃ７８Ｓ〕ＦＧＦ−ＳＡＰ又は〔Ｃ９６Ｓ〕ＦＧＦ−ＳＡＰが十分 可視化された帯（付加的にわずかに低分子量の帯を伴う）を生じる一方、前記手 順により生成した等量の抱 合体が殆ど検出されないことが明示された。Coomassie染色の場合と同様に、突 然変異体ＦＧＦ−ＳＡＰのウエスタンブロティングからは、非突然変異化塩基性 ＦＧＦ及び非精製誘導化ＳＡＰを用いて合成した異質ＦＧＦ−ＳＡＰの場合より もより高い均質性が示された。 ２．〔Ｃ９６Ｓ〕ＦＧＦ−ｒＳＡＰ（ＣＣＦＳ４）の調製 実施例４に記載したようにクローン化し、ＢＬ２１細胞中で発現させ、そして 単離した、Ｎ末端に付加されたｃｙｓを有する組換え体サポリン（ＳＡＰ−Ｃｙ ｓ−（−１））を（５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸））ＤＴＮＢ （エルマン試薬ともいう）と結合させた。ｒＳＡＰ及び〔Ｃ９６Ｓ〕ＦＧＦを各 々10mM ジチオトレイトール（ＤＴＴ）と反応させて、室温で１時間インキュベ ートし、抱合緩衝液（0.1 M ＮａＰＯ₄、100 ＮａＣｌ、１mMＥＤＴＡ,pH 7.5 ）中でゲル濾過によりＤＴＴを除去した。100倍モル余分量のＤＴＮＢをｒＳＡ Ｐに付加し、室温で１時間インキュベートした。未反応ＤＴＮＢをゲル濾過によ り除去した。〔Ｃ９６Ｓ〕ＦＧＦをＤＴＮＢ処理ＳＡＰに付加し（〔Ｃ９６Ｓ〕 ＦＧＦ：ＳＡＰのモル比３：１）、室温で約１時間、又は４℃で16時間インキュ ベートした。混合物を10mM ＮａＰＯ₄、１mMＥＤＴＡ，pH６中でヘパリン−セ ファロース上に載せて、抱合体及び遊離〔Ｃ９６Ｓ〕ＦＧＦを10mM ＮａＰＯ₄ 、１mMＥＤＴＡ，pH６中の2 M ＮａＣｌで溶離した。遊離〔Ｃ９６Ｓ〕ＦＧＦを Sephacryl S100（Pharmacia）上でのゲル濾過により除去した。その結果生じた 抱合体をＣＣＦＳ４と名付けた。 Ｃ．〔Ｃ７８Ｓ〕ＦＧＦ−ＳＡＰ（ＣＣＦＳ２）、〔Ｃ９６Ｓ〕ＦＧＦ−ＳＡ Ｐ（ＣＣＦＳ３）及び〔Ｃ９６Ｓ〕ＦＧＦ−ｒＳＡＰ（ＣＣＦＳ４）の細胞毒性 いくつかの細胞型に対する２つの突然変異体ＦＧＦ−ＳＡＰの細胞毒性を試験 した。異質ＦＧＦ−ＳＡＰ（ＣＣＦＳ１）は、ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞、ヒト黒 色腫細胞に対して非常に細胞毒性が高く、ＥＤ₅₀は約８ng/mlであった。突然変 異体ＦＧＦ−ＳＡＰもこれらの細胞に対して強い細胞毒性を示した。〔Ｃ７８Ｓ 〕ＦＧＦ−ＳＡＰ及び〔Ｃ９６Ｓ〕ＦＧＦ−ＳＡＰは各々、異質化学的抱合体に 匹敵するＥＤ₅₀を有し、これは突然変異体ＦＧＦが異質ＦＧＦ−ＳＡＰと事実上 同程度にＳＡＰを取り込むことができることを示す。 同様の結果は、卵巣癌細胞型、ＰＡ−１、Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞、Ｂ１６Ｆ １０、マウス黒色腫及びＢＨＫ細胞に関しても得られた（表６）。 ＣＣＦＳ４をin vitro細胞毒性検定で試験し、その活性が野性型化学抱合体（ ＣＣＦＳ１）と少なくとも同じくらい良好であることがわかった。 Ｄ．重複延長によるスプライシング（ＳＯＥ）によるＦＧＦ−ＳＡＰムテイン の同質混合物の調製 １．Ｃｙｓ７８のＳｅｒ７８への変換 （ａ）材料 （１）プラスミド 実施例２に記載のプラスミドＰＺＩＢ（ＰＺＩＢ１と呼ぶ）をＤＮＡ鋳型とし て用いた。プライマーを以下のように調製した： （２）プライマー （ａ）プライマー＃１ − プラスミドｐＺＩＢからのＦＧＦコードＤＮＡの ５’末端でのＮｄｅＩに及ぶ： （ｂ）プライマー＃２ − Ｃｙｓ７８に及ぶヌクレオチド（Ｓｅｒ７８を生 じる塩基変化を伴う配列番号１２のヌクレオチド２２０〜２４９）に対するアン チセンスプライマー： （ｃ）プライマー＃３ − Ｃｙｓ７８に及ぶヌクレオチド（Ｓｅｒ７８を生 じる塩基変化を伴う配列番号１２のヌクレオチド２２０〜２４９）に対するセン スプライマー： （ｄ）プライマー＃４ − ｐＺＩＢにおけるＦＧＦのＮｃｏＩ部位に及ぶヌ クレオチド（配列番号１２のヌクレオチド４５６〜４８５に対応する）に対する アンチセンスプライマー： （ｂ）反応 （１）反応Ａ ＰＺＩＢ１ ＤＮＡ（100ng）をプライマー＃ｌ（50μM）；プライマー＃２（ 50μM）、10mM Tris-HCl（pH8.3）、50mMＫＣｌ、0.1% ゼラチン、２mM Ｍｇ Ｃｌ₂、0.２mM ｄＮＴＰと混合した（Ｔａｑポリメラーゼ付加時の最終容量 １００μl ）。 （２）反応Ｂ 上記と同様。但しプライマー＃３（50μM）及びプライマー＃４（50μM）をプ ライマー＃１及びプライマー＃２の代わりに用いた。 各反応混合物を５分間95℃に加熱して、0.5 U ＴａｑＩ ＤＮＡポリメラーゼ （１μl ；Boehringer Mannheim）を加え、混合物を100μl の鉱油（Perkin Elm er Cetus）で覆った。ＤＮＡ Thermal Cycler(Ericomp)中でインキュベーション を実施した。各サイクルには、変性工程（95℃で１分）、アニーリング工程（60 ℃で1.5分）及び延長工程（75℃で３分）が含まれた。20サイクル後、反応混合 物を、最終延長のために75℃で10分間インキュベートした。生成物を２% アガロ ースゲル上で分解して、正しいサイズ（２４７bp及び２５０bp）のＤＮＡを精製 した。ヌクレオシドトリホスフェート及びクレノウＤＮＡポリメラーゼを付加し て、末端を修復した。 （３）反応Ｃ 反応Ａ及び反応Ｂの各生成物１μl を、プライマー＃１及び＃４（各々の最終 濃度は50μM）；10mM Tris-HCl（pH8.3）、50mMＫＣｌ、0.01% ゼラチン、２mM ＭｇＣ１₂、0.2mM ｄＮＴＰと混合した（Ｔａｑポリメラーゼ付加時の最終容 量100μl ）。 その結果生じた反応混合物を５分間、９５℃に加熱し、0.5 U ＴａｑＩＤＮＡ ポリメラーゼ（１μl ；Boehringer Mannheim）を加え、混合物を100μl の鉱油 （Perkin Elmer Cetus）で覆った。ＤＮＡ Thermal Cycler(Ericomp)中でインキ ュベーションを実施した。各サイクルには、変性工程（95℃で１分）、アニーリ ング工程（60℃で1.5分）及び延長工程（75℃で３分）が含まれた。20サイクル 後、反応混合物を、最終延長のために75℃で10分間インキュベートした。 増幅生成物を1.5% アガロースゲル上で分解して、正しいサイズ （460bp）の断片（ＦＧＦＣ７８Ｓ−ＳＡＰと呼ぶ）を精製した。 ２．ＦＧＦＣ７８／Ｃ９６Ｓ−ＳＡＰをコードするＤＮＡの生成 （ａ）材料 （１）鋳型 ＦＧＦＣ７８Ｓ−ＳＡＰをコードするＤＮＡ。 （２）プライマー （ａ）プライマー＃５ − Ｃｙｓ９６に及ぶセンスプライマー（Ｓｅｒ９６ を生じる塩基変化を伴う配列番号１２のヌクレオチド２７５〜３００）： （ｂ）プライマー＃６ − Ｃｙｓ９６に及ぶアンチセンスプライマー（Ｓｅ ｒ９６を生じる塩基変化を伴う配列番号１２のヌクレオチド２７５〜３００）： （ｂ）反応 （１）反応Ｄ ＦＧＦＣ７８Ｓ−ＳＡＰコードＤＮＡ（100ng）をプライマー＃１（50μM）； プライマー＃２（50μM）、10mM Tris-HCl（pH8.3）、50mMＫＣｌ、0.01% ゼラ チン、２mM ＭｇＣｌ₂、0.2mM ｄＮＴＰと混合した（Ｔａｑポリメラーゼ付加 時の最終容量 100μl ）。 （２）反応Ｅ 上記と同様。但しプライマー＃４（50μM）及びプライマー＃６（50μM）をプ ライマー＃１及びプライマー＃５の代わりに用いた。 各反応混合物を５分間95℃に加熱して、0.5 U ＴａｑＩ ＤＮＡ ポリメラーゼ（１μl ；Boehringer Mannheim）を加え、混合物を100μl の鉱油 （Perkin Elmer Cetus）で覆った。ＤＮＡ Thermal Cycler(Ericomp)中でインキ ュベーションを実施した。各サイクルには、変性工程（95℃で１分）、アニーリ ング工程（60℃で1.5分）及び延長工程（75℃で３分）が含まれた。20サイクル 後、反応混合物を、最終延長のために75℃で10分間インキュベートした。生成物 を２% アガロースゲル上で分解して、正しいサイズ（２９７bp及び１９０bp）の ＤＮＡを精製した。ヌクレオシドトリホスフェート及びクレノウＤＮＡポリメラ ーゼを付加して、末端を修復した。 （３）反応Ｆ 反応Ｄ及び反応Ｅの生成物（各々100ng）を、上記と同様にプライマー＃１及 び＃４と混合（Ｔａｑポリメラーゼ付加時の最終容量100μl ）し、増幅した。 増幅生成物を1.5% アガロースゲル上で分解して、正しいサイズ（４６５bp）の 断片を精製した。その結果生じた生成物、即ちＦＧＦＣ７８／９６Ｓ−ＳＡＰを コードするＤＮＡは、ＮｄｅＩ及びＮｃｏＩ末端を有した。それをＮｄｅＩ及び ＮｃｏＩで消化し、ＮｄｅＩ／ＮｃｏＩ消化ＰＺ１Ｂ１及びＮｄｅＩ／ＮｃｏＩ 消化ＰＺ１Ｃ１（ＰＺ１Ｃは上記実施例２で説明）に結紮した。その結果生じた 構築物をそれぞれＰＺ２Ｂ１及びＰＺ２Ｃ１と名付けた。 Ｅ．ＰＺ２Ｂ１及びＰＺ２Ｃ１からの組換え体ＦＧＦＣ７８／９６Ｓ−ＳＡＰ 融合タンパク質（ＦＰＦＳ４）の発現 ＦＰＦＳ１の生成に関して上記した２段階法を用いて、組換え体ＦＧＦＣ７８ ／９６Ｓ−ＳＡＰタンパク質（以後ＦＰＦＳ４と呼ぶ）を生成した。 アンピシリン（100μg／ml）を含有するＬＢ培地 250mlにＰＺＩＢの新鮮な グリセロールストックを植えつけて、ＯＤ₆₀₀を0. 7として、４℃で一夜保存した。翌日、細胞をペレット化し、新鮮なＬＢ培地（ アンピシリン無含有）中に再懸濁した。細胞を５つの１ｌバッチに分けて、イン キュベーター振盪器中で30℃で増殖させてＯＤ₆₀₀を1.5とした。ＩＰＴＧ（Sigm a Chemical，St．Louis,MO）を加えて最終濃度を0.1mMとし、約２〜2.5時間増殖 を継続した後、遠心分離で細胞を収集した。 ＰＺ２Ｃ１を増殖させるために、誘導前に、アンピシリンの代わりにカナマイ シン（50μg／ml）を含有した培地中で細胞を増殖させた。 Ｆ．生物学的活性 ＰＺ２Ｂ１（ＦＰＦＳ４）から生成したムテインＦＧＦ−ＳＡＰの細胞毒性を ＳＫ ＭＥＬ ２８で評価した結果、野性型ＦＧＦ−ＳＡＰ化学抱合体、及びＰ ＺＩＢ１から生成した組換え体ＦＧＦ−ＳＡＰの活性と少なくとも等価であった 。 ＰＺ２Ｂ１から生成したムテインＦＧＦ−ＳＡＰのin vivo活性を動物で試験 した結果、ＰＺＩＢ１からのＦＧＦ−ＳＡＰより毒性が低いと思われた。 実施例７ マウス腫瘍異種移植モデルにおける野性型化学的抱合体及び融合タンパク質ｂ ＦＧＦ−ＳＡＰの治療活性 Ａ．材料及び方法 実質的にはBeitz等（1992；Cancer Research 52:227-230）と同様の方法で、 下記の方法を実施した。 （１）試験計画 皮下腫瘍を有する63匹の無胸腺マウスに、被験物質の４週間ボーラス静注を施 した。腫瘍容積は61日間、週に２回測定した。 （２）被験物質 野性型化学的抱合体ｂＦＧＦ−ＳＡＰを、1.0mg/mlの濃度でダルベッコのリン 酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に供給した。大腸菌中の融合タンパク質ｂＦＧＦ− ＳＡＰは、9.0mg/mlの濃度でダルベッコのＰＢＳ中に供給した。塩基性ＦＧＦは 、1.0mg/mlの濃度でダルベッコのＰＢＳ中に供給した。サポリンは、1.0mg/mlの 濃度でダルベッコのＰＢＳ（0.01M リン酸塩、0.14M ＮａＣｌ，pH7.4）中に供 給した。希釈液はすべて、0.1% ウシ血清アルブミン（ＮＢ １００５−１８） を含有するダルベッコのＰＢＳ中に作製した。 （３）種 ８〜１２週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕ 無胸腺マウス（Roger William Hospital Animal Facility，Providence,RI）を無菌環境で飼育した。試験用に 、投与前日の体重が25〜30ｇの範囲の動物63匹を選択した。 （４）管理 動物は隔離室で飼育し、無菌条件下で取り扱った。実験期間中、餌及び水は自 由に摂取させた。 （５）腫瘍細胞 ＰＡ−１ヒト卵巣奇形癌細胞を、アメリカ培養細胞コレクション（Rockville ，MD; ATCC 受入れ番号ＣＲＬ1572）から入手して、10% ウシ胎児血清を補足し たイーグル修正培地中で増殖させた。 （６）腫瘍移植 被験物質注射の５日前に、マウスの右後側腹部に腫瘍細胞（約２ x10⁶ ＰＡ− １ヒト卵巣奇形癌細胞／マウス）を皮下注射した。 （７）腫瘍サイズ測定 キャリパーを用いて各腫瘍の寸法を測定した。最大及び最小幅野測定（mm）は 、被験物質の注射前に、及び６１日間は週２回、実施 した。腫瘍容積（mm³）は、次式： 容積＝〔（最小測定値）² （最大測定値）〕／２ を用いて計算した。 （８）用量調製 被験物質を適切な容量のＰＢＳ／0.1% ＢＳＡと混合して最終用量として、投 与物質を調製した。 （９）投与手順 各動物用に個別の注射液を調製した。マウスには週４回、５、１２、１９及び ２６日目に、尾の静脈に静注（250〜300μl ）し、１日目は腫瘍細胞をマウスに 注射する日とした。用量は、体重差により個々に変えた。 Ｂ．結果 − 腫瘍成長の阻害 全動物において、被験物質の注射前に、及び６１日間は週２回、腫瘍を測定し た。全群の動物からの腫瘍は、処置開始５日目には約55〜60mm³であった。ビヒ クル処置群（0.1% ＢＳＡを含有するＰＢＳ）は、試験61日間に腫瘍容積が50倍 に増大した。他の対照群ハ、同様レベルの腫瘍成長を示した：ＳＡＰ対照群は、 30倍の増大、ｂＦＧＦ対照群は50倍の増大、ｂＦＧＦ＋ＳＡＰ群は50倍の腫瘍容 積増大を示した。全対照群において、腫瘍の成長率は、61日間大体一貫していた 。処置群では、野性型化学的抱合体ｂＦＧＦ−ＳＡＰ及び融合タンパク質ｂＦＧ Ｆ−ＳＡＰを用いた場合、最初の30日間は対照と比較して統計学的に有意の腫瘍 成長の用量関連抑制が認められた。しかしながらこの期間が過ぎると腫瘍容積は 再び増大して、処置群と対照群とにもはや統計学的差は認められなかった。 50μg／kg／週融合タンパク質ｂＦＧＦ−ＳＡＰ処置群は、対照の29% の腫瘍 容積を示したが、しかし30日まで生き残った動物は本処置群では２匹だけであっ たため、対照との比較はおこなわなかっ た。融合タンパク質ｂＦＧＦ−ＳＡＰ5.0μg／kg／週投与は有意の腫瘍成長抑制 を示し、腫瘍容積は対照値の48% であった。0.5μg／kg／週融合タンパク質ｂＦ ＧＦ−ＳＡＰ群は、26日までに腫瘍成長の有意の抑制を示し、腫瘍は対照の71% であった。30日目の0.5μg／kg／週野性型化学的抱合体ｂＦＧＦ−ＳＡＰ及び融 合タンパク質ｂＦＧＦ−ＳＡＰ群における腫瘍容積間の統計学的差は認められな かった。融合タンパク質ｂＦＧＦ−ＳＡＰ群で生き残った動物は２匹岳であった ため、２つの50μg／kg／週処置群の統計学的比較は成されなかった。 全群で６１日試験を生き残った動物は７匹であったが、但し50μg／kg／週化 学抱合体ｂＦＧＦ−ＳＡＰ群では６１日までに７匹中３匹が生き残り、び50μg ／kg／週融合タンパク質ｂＦＧＦ−ＳＡＰ群では６１日までに７匹中１匹が生き 残った。 修正が成されることは当業者には明らかであるため、本発明は添付の請求の範 囲によってのみ限定されるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ， ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ソスナウスキ，バーバラ エー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92118, サンディエゴ，コロナド，アデラ アベニ ュ 1013 (72)発明者 ラピ，ダグラス エー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92014, デル マー，カミニート デ ラス オラ ス 12842 (72)発明者 バード，アンドリュー ジェイ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92122, サンディエゴ，ビア パペル 5039

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．細胞毒性物質及び繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体と反応するポリペ プチドを包含する細胞毒性抱合体の単一起源性製剤であって： 細胞毒性抱合体がＦＧＦ受容体と結合して、ＦＧＦ受容体を保有する細胞内に 細胞毒性物質を取込み；そして 単一起源性製剤中の実質的にすべての細胞毒性抱合体がＦＧＦ受容体と反応す るポリペプチドと同一モル比の細胞毒性物質を含有する製剤。 ２．抱合体が化学的抱合体又は融合タンパク質である請求項１記載の製剤。 ３．抱合体が次式： （ＦＧＦ）_n−（細胞毒性物質）m （式中、ＦＧＦは繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体と反応するポリペプチド であり； 抱合体はＦＧＦ受容体と結合して、ＦＧＦ受容体を保有する細胞内に細胞毒性 物質を取込み； ｎ及びｍは同一であっても異なってもよく、１〜４であって；そして ｍ又はｎ、あるいはｍ及びｎが１より大きい場合には、抱合体はｍ個までの異 なる細胞毒性物質及びｎ個までのＦＧＦポリペプチドを含有する）を有する請求 項１又は２記載の製剤。 ４．抱合体が式 ＦＧＦ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−ＳＡＰ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−ＳＡＰ （式中、ＦＧＦは１つ又はそれ以上のシステイン残基の置換又は欠失により修飾 されている）で示される請求項３記載の製剤。 ５．ＦＧＦが塩基性ＦＧＦであり、位置７８又は９６あるいは両方のシステイ ン残基がセリンで置換される請求項４記載の製剤。 ６．ＦＧＦ受容体と反応するポリペプチドが位置７８又は９６でのセリン残基 によるシステイン残基の置換によりあるいは位置７８及び９６でのセリン残基に よるシステイン残基の置換によって修飾されている塩基性ＦＧＦであり、位置数 が配列番号２４を参照して確定される請求項１〜４のいずれかに記載の単一起源 性製剤。 ７．ＦＧＦ受容体と反応するポリペプチドがセリンによるシステイン残基の置 換により修飾されていてその結果生じるＦＧＦ受容体反応性ポリペプチドが少な くとも２個のシステインを有し、ＦＧＦ受容体と結合する能力を保持して、そし て結合細胞毒性物質を取り込み； ＦＧＦ受容体と反応するポリペプチドがＦＧＦ−１、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−７ 及びＦＧＦ−８から成る群から選択され； ＦＧＦ−１がセリンによる位置３１又は１３２でのシステイン残基の置換によ り修飾されていて； ＦＧＦ−５がセリンによる位置１９、９３又は２０２でのあるいは位置１９、 ９３又は２０２の少なくとも２箇所でのシステイン残基の置換により修飾されて いて； ＦＧＦ−７がセリンによる位置１８、２３、３２、４６、７１又は１３３での あるいは位置１８、２３、３２、４６、７１又は１３３の少なくとも２箇所、あ るいは位置１８、２３、３２、４６、７１又は１３３の少なくとも３箇所、ある いは位置１８、２３、３２、４６、７１又は１３３の少なくとも４箇所、あるい は位置１８、２３、３２、４６、７１又は１３３の少なくとも５箇所でのシステ イン残基の置換により修飾されていて； ＦＧＦ−８がセリンによる位置１０、１９、１０９又は１２７で の、あるいは位置１０、１９、１０９又は１２７の少なくとも２箇所での、ある いは位置１０、１９、１０９及び１２７の少なくとも３箇所でのシステイン残基 の置換により修飾されていて；そして 位置数がＦＧＦ−１に関しては配列番号２４、ＦＧＦ−５に関しては配列番号 ２８、ＦＧＦ−７に関しては配列番号３０並びにＦＧＦ−８に関しては配列番号 ３１を参照して確定される請求項１〜４のいずれかに記載の製剤。 ８．細胞毒性物質がリボソーム不活化タンパク質である請求項１〜７のいずれ かに記載の製剤。 ９．細胞毒性物質が実質的に純粋なモノ誘導化サポリンである請求項１〜８の いずれかに記載の製剤。 １０．細胞毒性物質がＮ末端の約２０個のアミノ酸残基での又はアミノ酸残基 内のシステイン残基の付加により又はシステインによる残基の置換により修飾さ れたサポリンであり；そして その結果生じる修飾サポリンが、真核細胞に取り込まれる場合、真核細胞に対 して有毒である請求項１〜８のいずれかに記載の製剤。 １１．サポリンがＦＰＳ１、ＦＰＳ２又はＦＰＳ３である請求項１０記載の製 剤。 １２．細胞毒性物質（単数又は複数）がメトトレキセート、アントラサイクリ ン及びシュードモナス外毒素から選択される請求項１〜８のいずれかに記載の製 剤。 １３．請求項１〜１２のいずれかに記載の細胞毒性抱合体の単一起源性製剤を 包含する組成物。 １４．請求項１〜１２のいずれかに記載の単一起源性製剤及び生理学的に許容 可能な賦形剤を包含する製薬組成物。 １５．繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体と反応性のポリペプ チドのムテインを細胞毒性物質と反応させて細胞毒性抱合体の単一起源性製剤を 生成することを包含し、ムテインポリペプチドが別のアミノ酸による１つ又はそ れ以上のシステイン残基の置換により修飾されて、その結果生じるムテインが２ 又は３個のシステインを有し、ＦＧＦ受容体と結合する能力を保持して、結合細 胞毒性物質を取り込み；そして 細胞毒性物質が： （ｉ）１個のシステインのみを含有し； （ｉｉ）ポリペプチド上のシステイン残基と反応する部分を導入するために誘 導された単一種の細胞毒性物質であるか；又は （ｉｉｉ）システイン残基の付加により修飾されていて、その結果生じる修飾 化物質が１個のシステインのみを含有する 請求項１記載の細胞毒性抱合体の製造方法。 １６．ＦＧＦ受容体と反応するポリペプチドが塩基性ＦＧＦであり；置換され るシステイン残基がＣｙｓ７８、Ｃｙｓ９６又はＣｙｓ７８とＣｙｓ９６であり ；そして位置数が配列番号２４を参照して確定される請求項１５記載の方法。 １７．ＦＧＦ受容体と反応するポリペプチドがＦＧＦ−１、ＦＧＦ−５、ＦＧ Ｆ−７及びＦＧＦ−８から成る群から選択され； ＦＧＦ−１がセリンによる位置３１又は１３２でのシステイン残基の置換によ り修飾されていて； ＦＧＦ−５がセリンによる位置１９、９３又は２０２でのあるいは位置１９、 ９３又は２０２の少なくとも２箇所でのシステイン残基の置換により修飾されて いて； ＦＧＦ−７がセリンによる位置１８、２３、３２、４６、７１又は１３３での あるいは位置１８、２３、３２、４６、７１又は１３３の少なくとも２箇所、あ るいは位置１８、２３、３２、４６、７ １又は１３３の少なくとも３箇所、あるいは位置１８、２３、３２、４６、７１ 又は１３３の少なくとも４箇所、あるいは位置１８、２３、３２、４６、７１又 は１３３の少なくとも５箇所でのシステイン残基の置換により修飾されていて； ＦＧＦ−８がセリンによる位置１０、１９、１０９又は１２７での、あるいは 位置１０、１９、１０９又は１２７の少なくとも２箇所での、あるいは位置１０ 、１９、１０９及び１２７の少なくとも３箇所でのシステイン残基の置換により 修飾されていて；そして 位置数がＦＧＦ−１に関しては配列番号２４、ＦＧＦ−５に関しては配列番号 ２８、ＦＧＦ−７に関しては配列番号３０並びにＦＧＦ−８に関しては配列番号 ３１を参照して確定される請求項１５記載の方法。 １８．細胞毒性物質が実質的に純粋なモノ誘導化サポリンである請求項１５記 載の方法。 １９．反応前に細胞毒性物質がＮ末端の約２０個のアミノ酸残基での又はアミ ノ酸残基内のシステイン残基の付加により修飾されるサポリンであり、修飾サポ リンが、真核細胞に取り込まれる場合、真核細胞に対して有毒である請求項１５ 記載の方法。 ２０．細胞毒性物質がＮ末端の約２０個のアミノ酸残基での又はアミノ酸残基 内のシステイン残基の付加により修飾された修飾サポリンであり、修飾サポリン が、真核細胞に取り込まれる場合、真核細胞に対して有毒である請求項１〜８の いずれかに記載の製剤。 ２１．修飾化サポリン及びＦＧＦ（繊維芽細胞成長因子）受容体と反応するポ リペプチドを包含する細胞毒性抱合体であって： ＦＧＦ受容体と反応するポリペプチドがＦＧＦ受容体と結合して、ＦＧＦ受容 体を保有する細胞内に細胞毒性物質を取込み； サポリンが修飾されてＮ末端に又は実質的に近くにシステイン残 基を含有し；そして 修飾化サポリンが、真核細胞に取り込まれる場合、真核細胞に有毒である 細胞毒性抱合体。 ２２．ＦＧＦ受容体と反応するポリペプチドがＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧ Ｆ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８及びＦ ＧＦ−９から成る群から選択される請求項２１記載の抱合体。 ２３．ＣＣＦＳ２、ＣＣＦＳ３又はＣＣＦＳ４である請求項２１記載の抱合体 。 ２４．位置７８又は９６のシステイン残基がセリン残基に置換された、あるい は位置７８及び９６のシステイン残基がセリン残基に置換される場合を除いて、 各抱合体が配列番号１２に示される配列を有する請求項１記載の製剤。 ２５．抱合体がＦＰＦＳ２、ＦＰＦＳ３又はＦＰＦＳ４である請求項２４記載 の製剤。 ２６．細胞毒性物質と結合するＦＧＦ受容体と反応する修飾化ポリペプチドを 含有する細胞毒性抱合体をコードするヌクレオチドの配列を包含する単離ＤＮＡ 断片であって： ＦＧＦ受容体と反応するポリペプチドがセリンによるシステイン残基の置換に より修飾されて、その結果生じるＦＧＦ受容体と反応するポリペプチドが少なく とも１個のシステインを含有し、ＦＧＦ受容体と結合する能力を保持して、結合 細胞毒性物質を取込み； 細胞毒性物質がｎ個のアミノ酸のリンカーペプチドを介して結合され；ｎが０ 〜約３０である ＤＮＡ断片。 ２７．プロモーター領域及び転写ターミネーター領域をさらに包 含する請求項２６記載のＤＮＡ断片であって： プロモーター領域が誘導プロモーターを含み； プロモーター領域及び転写ターミネーターが同一又は異なる遺伝子から別々に 選択され、任意にサポリン含有タンパク質をコードするＤＮＡに結合される ＤＮＡ断片。 ２８．細胞毒性物質がサポリンであり、サポリンのアミノ酸配列が配列番号３ 、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７で示される請求項２６記 載のＤＮＡ断片。 ２９．位置７８及び９６のシステイン残基がセリンに置換されるのを除いて、 ＦＧＦタンパク質のアミノ酸配列が配列番号１２又は配列番号１３で示される請 求項２６〜２８のいずれかに記載のＤＮＡ断片。 ３０．任意にサポリン含有タンパク質をコードするＤＮＡに結合される分泌シ グナル配列をコードするＤＮＡをさらに包含する請求項２６〜２９のいずれかに 記載のＤＮＡ断片。 ３１．分泌シグナルがｏｍｐＡ又はｏｍｐＴである請求項３０記載のＤＮＡ断 片。 ３２．プロモーターがＴ７プロモーター又はｌａｃＵＶ５プロモーターである 請求項２７記載のＤＮＡ断片。 ３３．ＦＧＦ受容体と反応するポリペプチドがＦＧＦ−１、ＦＧＦ−３、ＦＧ Ｆ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８及びＦＧＦ−９から 成る群から選択され： ＦＧＦ−１が位置３１又は１３２あるいは位置３１及び１３２でのシステイン 残基の置換により修飾されていて； ＦＧＦ−３が位置５０でのシステイン残基の置換により修飾されており； ＦＧＦ−４が位置８８でのシステイン残基の置換により修飾されており； ＦＧＦ−５が位置１９、９３又は２０２での、あるいは位置１９、９３又は２ ０２の少なくとも２箇所での、あるいは位置１９、９３及び２０２の全箇所での システイン残基の置換により修飾されていて； ＦＧＦ−６が位置８０でのシステイン残基の置換により修飾されており； ＦＧＦ−７が位置１８、２３、３２、４６、７１又は１３３でのあるいは位置 １８、２３、３２、４６、７１又は１３３の少なくとも２箇所、あるいは位置１ ８、２３、３２、４６、７１又は１３３の少なくとも３箇所、あるいは位置１８ 、２３、３２、４６、７１又は１３３の少なくとも４箇所、あるいは位置１８、 ２３、３２、４６、７１又は１３３の少なくとも５箇所での、あるいは位置１８ 、２３、３２、４６、７１及び１３３でのシステイン残基の置換により修飾され ていて； ＦＧＦ−８がセリンによる位置１０、１９、１０９又は１２７での、あるいは 位置１０、１９、１０９又は１２７の少なくとも２箇所での、あるいは位置１０ 、１９、１０９及び１２７の少なくとも３箇所でのシステイン残基の置換により 修飾されていて； ＦＧＦ−９が位置６８でのシステイン残基の置換により修飾されており；そし て 位置数がＦＧＦ−５に関しては配列番号２８、ＦＧＦ−７に関しては配列番号 ３０、ＧＦ−８に関しては配列番号３１並びにＦＧＦ−９に関しては配列番号３ ２を参照して確定される 請求項２６〜３２のいずれかに記載のＤＮＡ断片。 ３４．請求項２６〜３３のいずれかに記載のＤＮＡ断片を包含す るプラスミド。 ３５．ＰＺ２Ｂ１及びＰＺ２Ｃ１である請求項３４記載のプラスミド。 ３６．請求項３４記載のプラスミドにより形質転換される大腸菌細胞。 ３７．細胞毒性抱合体が発現される条件下で請求項３６記載の細胞を培養して ；細胞毒性抱合体を単離することを包含する大腸菌中での細胞毒性抱合体の単一 起源性製剤の製造方法。 ３８．治療的有効量の請求項１３記載の組成物を投与することを包含するＦＧ Ｆ媒介性病態生理学的症状の治療方法。 ３９．細胞に増殖阻害有効量の請求項１３記載の組成物を接触させることを包 含するＦＧＦ受容体を保有する細胞の増殖阻害方法。