JPH03501208A - 細胞毒性結合体 - Google Patents
細胞毒性結合体Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
細胞毒性結合体
(本発明の分野)
本発明は一般的に言うと、がん治療又は自己免疫不全の治療及びその他のヒト治
療等において、インビトロ又はインビボで細胞を殺傷する部位指定トキシンの使
用、そしてより特定して言うとこれら組成物の効率の増加に関する。
(本発明の背景)
がん細胞又は望ましくない免疫応答を示す細胞(例えば特定の抗原特異的T及び
B細胞)等の特定の細胞群の選択的除去は現代医学研究の第1の目標である。何
年間もの間、この目標に到達することにより行ってきた。化学療法については、
アルキル化剤、抗代謝剤、抗生物質、酵素等の抗増殖側の使用が最も背反してい
る方法である。いくらかは確かに成功しているが、これらの細胞毒性剤は一般に
非特異的であり、この治療を施した患者に多くの重大な副作用をひき起こす、投
与量及び投与方法の変化又は他の細胞毒性剤と組合せによる使用でいくらかの改
善が達成し得るが、この種の治療に関する問題は多い。
これらの困難に打ち勝つ試みの中で、研究者達は“魔法の弾丸”という着想に焦
点を集めだした。しばしばこの魔法の弾丸はトキシンと結合した免疫グロブリン
、特にモノクローナル抗体、すなわち°イムノトキシン°から成る。抗体分子又
はその他の認識成分は、患者体内のll瘍等の所定の細胞群に対し選択的に毒性
剤を送り込み、結果として望ましくない細胞のみ死滅させ得る。さらに理論的に
は、がん細胞又はその他の疾患又は望ましくない細胞をほとんどの治療法に共通
する非特異的副作用を起こすことなしに死滅させ得る。
これらの組成物の使用に内在する数多くの可能性にもかかわらず精力的な研究努
力に反して成功を収める生産物はほとんど開発されていない、実際に現在受は入
れられている化学療法又はその他の治療の効率を事実上高めうる認諏剤(tar
geting agent)及びトキシンの適当な組合せを発見するのは極端に
難かしいことが分ってきた。
おそらく、最も広く臨床的にテストされているイムノトキシンはりシン及びジフ
テリアトキシンのような、毒性剤としてのりボゾーム阻害タンパク質を利用して
いる。死滅化のためには、これらのトキシンが細胞の細−脂質に入ることが必要
であり、その後トキシンが触媒的にリボゾームタンパク合成を不活性化し、最終
的に細胞が死滅する。事実、一般に使用される実質的に全てのイムノトキシンは
この性質を有する。すなわち有効性を発揮するためには一般にこれらのトキシン
はサイドシル中に取り込まれなければならない0重要なことは、一般的にトキシ
ンも活性となる前にモノクローナル抗体又は他の認識成分から切り離さなければ
ならない。
不幸なことに、部分的には多くの細胞がイムノトキシン又はそのトキシン成分を
細胞膜を通し、かつ細胞の中に簡単に輸送しないことから、これらのトキシン結
合体の使用は一般的に理想的なものではない、さらに、しばしばvll酸成分細
胞毒性剤との結合は、不適当な時期、すなわち目的細胞に結合する前に切断して
しまう、このことは重大なランダムな細胞の死滅化を起こし、合併迅速に除去さ
れ、結局望ましくない細胞群と作用し得るトキシン量が減少してしまう。
さらに、これらの毒性結合体の多くは製造するのが難しい、しばしばトキシンが
非常に毒性が高いため熟練者のみがそれらを取扱い得る。また、使用されている
特定の結合システムはしばしば複雑であり、かつ非経済的であるため生産収量が
低い、最後にこれらの物質の製造における品質管理の問題が非常に難しい。
このように、特にインビボで秀れた性質を示す部位指定トキシン結合体の必要性
がある。これらの結合体は高い特異的細胞毒性を保持しするが、宿主への非特異
的毒性は最小限のものであるべきである。理想的には、これらは製造するのに比
較的経済的であり、かつ再現性があるべきである。また、単純でかつ系統的な方
法で毒性結合体の構造を修正でき、場合に応じた結合体の細胞毒性の改変又は修
正し得ることが望ましい0本発明はこれらの条件を満たしている。
(本発明の概要)
本発明は、患者体内の真核又は原核細胞を選択的に死滅し得る新しい認識結合体
組成物を用いた愚者のインビボにおける治療のような、細胞群から所定の細胞を
除去するための改良組成物及び改良法を提供する。この組成物は2つの成分から
成る。それらは1個以上のアミノ酸リンカ−により連結するか、又は単一のポリ
ペプチドとして組換え的に合成した、ポリペプチド毒性成分に結合したポリペプ
チド認識成分である。認識成分は細胞膜構成マーカーに結合し得、また毒性成分
は膜を破壊することにより細胞を死滅し得る。認識成分は望ましい細胞のみに特
異的であることが好ましく、またそれらには免疫グロブリン、特に低い免疫原性
を示すよう修正した免疫グロブリンを使用しでき、もしくは死滅すべき細胞群の
レセプターに実質的に特異的なヒト成長因子も使用し得る。毒性成分には細胞死
滅を導くのに十分な細胞膜破壊が可能な、細菌性又はホ乳類タンパク質である多
くの酵素又は他の試薬が使用し得る。これら2つの成分をペプチド結合させる際
、標準的組換えDNA技術及び細胞培養生産などによる結合組成物の単離な生産
及び修正操作を行ない得る。また、この結合体の医薬組成物も多種の治療処理に
おいて使用し得るものが提供される。
また、代表的トキシンである、クロストリジウム(C1ostridiu+s)
ホスホリパーゼCポリペプチドをコードする、クローン化組換えDNA配列も提
供されている。この配列は、発現制御配列に機能的に結合し、かつ宿主中で発現
した時、実質的に天然のクロストリジウム(C1ostridiu−)遺伝子産
物を含まない、クロストリジウム(Clostridium)ホスホリパーゼC
5又はそのフラグメントを生成する。クロストリジウム(Clostridiu
m)ホスホリパーゼCの一次構造の一部、及び、又はそのトキシンの1個以上の
生物学的性質を有する新しいポリペプチドは、天然の遺伝子をコードするDNA
配列を修正することにより容易に生成し得る。またこの遺伝子は関連遺伝子の単
離及びヒトfi者由来のサンプル中のクロストリジウム(Clostridiu
m)存在の同定用のプローブとして使用し得る。
(図面の簡単な説明)
第1図は遺伝的構築に用いるオリゴヌクレオチドを示している。
a)PLO遺伝子の末端に制限部位を導入するのに用いたオリゴヌクレオチド。
b) G]y2Pro5G1y2ボジシッナーをコードするDNAを合成するの
に用いたオリゴヌクレオチド。
C) ポリプロリンポジショナ−をコードするDNAを合成するのに用いたオリ
ゴヌクレオチド、矢印はWPS12及びCNC25の間、及びCNC26及びW
PS13の間の境界を示している。
d) ランダムボジシッナーを構築するのに用いたオリゴヌクレオチド。
第2図は、PLC及びタンパク質Aの間の結合領域の配列を示している。矢印は
PLC遺伝子の3′端、を導入したAPa1部位及びタンパク質A遺伝子の5′
端から分離している。
第3図はトキシン及び抗Tac抗体に結合したトキシンの毒性を示している。毒
性はCR2−2細胞の生存率(%)で測定した(トリパンブルー色素排除試験)
。
第4図はトキシン及びボジシッナーを介して抗Tac抗体に結合したトキシンの
毒性を示している。毒性はCR2−2細胞の生存率(%)で測定した(L)バン
プルー色素排除試験)。
第5図はトキシン及びG1y2Pro5G1y2ボジシッナーを介して抗Tac
抗体に結合したトキシンの毒性を示している。毒性は3H−ロイシン取込み率(
%)で測定した。100%−トキシン処理なし条件下での取込み。
第6図はトキシン及びG]y2Pro5G1y2ボジシッナーを介してMA2.
1抗体に結合したトキシンの毒性を示している。毒性は3H−ロイシン取込み率
(%)で測定した。100%−トキシン処理なし条件下での取込み。
第7図はランダムボジシッナーを介して抗Tac抗体に結合したトキシンによる
細胞死滅化の程度を示している。細胞死滅化は、2種の濃度のトキシン結合体添
加後の3H−チミジン取込み率(%)で測定した。100%−トキシン処理なし
条件下(抗体のみ)での取込み。
(好ましい態様の説明)
例えば患者体内の所定の細胞を死滅させる等、細胞群の中からある細胞を除去す
るのに使用し得る、認識毒性結合体の効果を増加する新しい組成物及び方法が提
供される。一般にこの結合体には、細胞膜を破壊することにより細胞を死滅し得
る毒性成分に、ペプチド結合により、又は1個以上のアミノ酸を含むリンカ−を
介して結合した、細胞膜マーカーに結合し得るポリペプチド認識成分が含まれる
。従って、インビボ又は身体外(extra−corporeally)で、非
特異的毒性を増加することなく所定の細胞群の死滅化を増加し得る。毒性の改善
は巾広い原核及び真核細胞に対する利用を可能にし、またこの結合体は、組換え
DNA技術により容易に生産し得ると同時に、この技術で該結合体構築物の単純
な修正が可能である。さらにこのことは該結合体の細胞毒性又はその他の特性の
調整も可能とする。
ここで使用されているように、“認識成分°という語句は細胞毒性剤と複合体を
作った特異的結合成分を意味する。該結合体の特異的結合成分又は認識成分は、
カルシノーマを形成する細胞のような、一般に予め選択された特定の細胞に毒性
薬剤を運ぶ手段を提供し得るポリペプチドである。認識成分は、望ましい細胞に
結合体全体が付着した後でさえ毒性成分が認識成分から分離しないことを保証す
るような方法でポリペプチド毒性成分に結合される。
本発明の結合体で処理し得る典型的な病気には器官移植拒絶及びMi織移植−宿
主症などの組織移植関連状態;■型糖尿病、リューマチ関節炎、全身狼癒紅斑症
、筋無力症及び多発性硬化症などの自己免疫症、及びリンパ腫、白血病及びその
他のがんが含まれる0組織移植する前に損傷細胞を除去するために骨髄などの組
織の前処理に用いることが好ましい(例えば供与T細胞;参考として引用してい
る米国特許第4.489.710号参照)。
一般に、本発明の結合体は一般式
%式%
で表わされる。この記述において、“SBA”は特異的結合剤、“T”は毒性剤
及び“L”は各試剤の本来の活性、すなわち結合以前の活性を実質的に失なうこ
となく毒性剤に特異的結合剤を結合するペプチド結合、又はオリゴペプチド又は
他のタンパク質性構造である両試剤間のリンカ−を表わしている。
例えば、本発明の1つのB様にはヒトのインターロイキン2レセプターと特異的
に反応するモノクローナル抗体(抗Tac抗体)にタンパク質入フラグメントを
介して結合する酵素C,パーフリンゲンス(perfringens)ホスホリ
パーゼC(PLC)を含む結合体がある。これら両ポリペプチドに対する遺伝子
が単離され、かつ各々は多くの細胞宿主において容易に発現される。この2つの
タンパク質は宿主細胞から精製した後結合させるのが望ましい。
PLO遺伝子の下流に結合するスタフィロコン力スアウレウス(Staphyl
ococcus aureus)のタンパク質Aの5個の反復単位のうちの2個
をコードするDNAセグメントを用いて、タンパク質A領域が続<PLCをコー
ドする融合タンパク質が得られる。これを精製したモノクローナル抗Tac抗体
と混合し、さらにFPLCサイズ分別カラムに通すことにより本発明の結合体が
生成する。
最終的結合体はタンパク質A単位が抗Tac抗体に高い親和性を有することから
、” PLC−タンパク質A−抗Tac″の構造をもつ。
この結合体は細胞表面にIL−2レセプターを含む細胞を死滅させる上で、PL
O−タンパク質A単独の場合より約20倍も有効であることが示された。さらに
死滅活性の増加は酵素とタンパク質Aの間にポジシッナーアミノ酸を加えること
により可能となる。特に、種々のボジシッナーを酵素の後、タンパク質A−抗体
タンパク質の前に挿入したとき5〜10倍の死滅活性の増加が見られる。9.1
4.16及び42個のアミノ酸を有するグリシン及びプロリンを組合せた多くの
ポジショナ−は死滅化能力の増加を示した。重要なことにこれらのタンパク質が
本来の結合体をコードする発現ベクターに適当なりNA配列を挿入することによ
り容易に生成される。
結合体における細胞毒性剤の配給ベヒクルとして働く特異的結合剤は多くの起源
に由来し得る。Fv 、Fab、F(ab)2’ 、半分の抗体分子(すなわち
単一の重/軽鎮対)など免疫グロブリンフラグメント又は本来の免疫グロブリン
が用いられることが望ましい。その免疫グロブリンは最終的用途に応じて、マウ
ス、ヒト又は他のホ乳類に由来するIgM又はIgGアイソタイプのモノクロー
ナル抗体であることが最も望ましい。選択される細胞群上のレセプターに結合し
得る(例えばインターロイキンレセプター、PDGFレセプター、インシュリン
レセプター等)成長因子(例えばインシュリン様成長因子、インターロイキン、
繊維芽細胞成 。
長因子、血小板由来成長因子[PDGF]等)を含むその他のタンパク質や試剤
も使用される。一般に特異的結合剤は、糖タンパク質、脂質タンパク質多糖類等
受容し得る細胞成分に十分な親和性を持って結合し、毒性剤を作用させ得る能力
のみにより制限を受ける。従って、標的に対する特異的結合剤の結合親和性は一
般的に少なくとも約10−’、好ましくは約10−”〜10−”以上である。
モノクローナル抗体技術の一般的な免疫化、融合、スクリーニング及び拡張法は
マーカーの選択も含めて当分野ではよく知られており本発明の一部を形成するこ
とはない。
最近の技術進歩は別の型の免疫グロブリン及びそれらの製造法を提供した。例え
ば、組換DNA技術の使用は、結合体への使用に適した機能的に類似する免疫グ
ロブリン又はハイプリント免疫グロブリンを生成した(例えばマウスの可変又は
超可変領域と結合する、ヒトのモノクローナル抗体由来の可変領域存在又は非存
在の定常領域等、例えば参考として引用するE P −A−85305604,
2参照)(参考として引用するEPA84302368.O参照)。
−i的に、抗体分子は悪性細胞又はTwi胞の膜構成物であるマーカーのエピト
ープに結合し得る。一般的にこのマーカーは表面の糖タンパク質であるが、膜上
に細胞により提供されているその他のタンパク質、リポタンパク質、多II類等
の多種類のマーカーは本発明に従って使用し得る。
さらに、ここで説明されているイムノトキシンに対する標的として働き得る、い
くつかの又は全てのT細胞の膜上のタンパク質にはCD2 (Tl 1) 、C
D3、CD4 (ヘルパーT細胞)及びIL−2レセプター(白血球分類m、A
、J、マクミカエル、 (McMichael) !、オックスフォード大学出
版、1987 (参考として引用する))が含まれる。標的としての役割を果し
得るB細胞上に圧倒的に存在するタンパク質にはCDl0 (CALLA抗原)
、CD19及びCD20が含まれる。CD45はリンパ球上に広く存在する有効
な標的となる。
標的として働き得るがん細胞上の抗原にはがん胎児性抗原(CEA)、トランス
フェリンレセプター及び17−IA抗体(バーリン(Herlyn)等プロシー
ディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス(Proc、 N
atl、 Acad、 Set、) U S A 76 、1438゜1979
)、L6抗体(ヘルストロム(Dellstrom)等、キャンサーリサーチ(
Cancer Res、)↓6,3917−3923.1986)及びB6.2
抗体(コルチャー(Colcher)等、プロシーディング・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンス(Proc、 Natl、 Acad。
Sci、)USA、78.3199.1981)によりL521ftされる抗原
が含まれる。がん細胞上の他のタンパク質標的は、第3回がんに対するモノクロ
ーナル抗体免疫結合体に関する国際会議要旨集で説明されている(サンジエゴ、
CA、1988)。
細胞に隣接して配向したとき本発明のトキシン成分は細胞膜を損傷し得る。ここ
で用いている°損傷ゝとは細胞の破壊又は死を誘導するのに十分な膜、その正常
な機能又は1個以上の膜成分の変化を意味する。一般的にトキシンは膜構造成分
又はチャンネル又はボアを形成している成分を切断しく例えばバクテリア由来の
チオール活性化細胞溶解トキシン)、最終的に膜に穴を開けてしまうように、細
胞表面で活性を示す、また、トキシンは重要な構造成分を破壊すること、界面活
性剤様の界面作用、いくつかの必須成分を引き離すこと、又は膜結合酵素を永久
的に活性化又は失活させることにより細胞膜に損傷を与える(例えば大腸菌の熱
安定エンテロトキシン;参考として引用する“バクテリアルトキシンズ”第2版
、J、ステファン(Stephen)及びR,A、ペイトロスキー(Per t
ro+eski)、アメリカ微生物学会、1986参照)。
これに関して、バクテリア由来の適当なトキシンは例として提供するもので、制
限を与えるものではない以下に示す第1表に示されている(″動物、細菌及び植
物性トキシンの特異性と作用”“レセプターと認識”Bシリーズ、1巻、クアト
レカサス(Cuatrecasas) 、P W、チャツプマン・アンドホール
(Cbapmanand Hall)版、ロンドン、イギリス、1976 (参
考として引用する))。
第1表
クロストリジウムパーフリンゲンス 5yaytb、 C,(1975) J、
Gen。
θ−トキシン Microbiol、 87:219−238バチルスセレウス
Johansen、 T、 et al、(1988)ホスホリパーゼC鉦胚
657293−304シユードモナスアエルジノサ Liu、 P、V、(19
66)J、Infect。
ホスホリパーゼC匡116:112−116本発明のB様により、トキシンであ
るクロストリジウム(Clostridium)ホスホリパーゼC(PLO)酵
素のポリペプチド配列をコードするDNA配列が提供される0発現ベクター及び
適当な真核性及び原核性宿主中に入れたとき、天然のクロストリジウム(Clo
stridium) P L Cの1個以上の種々の生物学的性質を示す大量の
ポリペプチドを生成し得る。望ましいことにこれらは本発明の結合体にも使用し
得る。
このように本発明はクロストリジウム(C1ostridius+) P L
Cポリペプチドをコードし、かつ(a)第H表に示されるクロストリジゥムパー
フリンゲンスCC1ostBdium perfringens)のDNA配列
及び第1表に示されるクロストリジウムビフェルメンタンス(C1ostrid
+um biferexentans’)のDNA7ラグメント又はそれらの相
補鎖、(b)発現に際し、例えばコード縮重等により第■及び第m表に示すポリ
ヌクレオチド配列をコードするDNA配列又はそれらの相補鎖、及び(c) −
m的にはストリンジェント条件で上記の(a)又は(bンのDNA配列にハイブ
リダイズし、がつPLCの少なくとも1個の生物学的活性を示すポリペプチドを
生産するDNA配列(例えばその他のクロストリジウム(C]ostrj+Hu
s)種由来の)、からなる群から選ばれるDNA配列を含む組換えDNAセグメ
ントとの単離に関する。天然の、もしくは変更させた遺伝子配列をコードするも
のを含むハイブリダイズ配列は通常、以下の表に示す遺伝子配列の同様の大きさ
の領域に対し、少なくとも約50〜60%、好ましくは85〜90%以上の相同
性を有する。
第2表
第2表(続き)
第2表(続き)
Leu Val Ala Tyr Ile Ser Thr Ser Gly
Glu Lys Asp Ala にIy TbrAsp Asp 7yr M
et Tyr Phe Gly Ile Lys Thr Lys Asp G
ay Lys ThrGln Glu Trp (+Iu Met Asp A
sn Pro Gly Asn Asp Phe ?Iet Thr GlyS
er Lys Asp Thr Tyr Thr Phe Lys Lea L
ys Asp GJu Asn Leu Lyslie Asp Asp li
e Gin Asn Met Trp lie Arg Lys Arg L5
/s Tyr ThrAla Phe Ser Asp Aha Tyr Ly
s Pro Glu Asn lie Lys Ile Ile AlaAsn
Gly Lys Valνal Val Asp Lys Asp fle
Asn Glu Trp Ile Ser第3表
Met Lys Ala Leu Lys Lys Val Ser Asn
lie Leu Cys Val Leu GayLeu Cys Thr L
eu Met Gly Gly Tbr Ser Tyr Aha Trp A
sp Gly LysLys Asp Gly Thr Gly Tbr Hj
s Ser Leu Ile Ala Glu Hjs Gly LeuSer
Met Leu Asn Asn Asp Leu Ser Gly Asn
Glu Ser Gla Gln Val第3表(続き)
第3表(続き)
一般にこのDNAセグメントは天然のプロモーター領域を含む、PLCコード配
列に機能的に結合する発現コントロールDNA配列を含む。この発現コントロー
ル配列は原核性宿主細胞を形質転換又は形質導入し得るベクター中の原核性プロ
モーター配列であることが好ましい。一度このベクターが適当な宿主中に組込ま
れれば、この宿主をこの配列の高レベルの発現に適した条件下に維持し、ついで
望ましくはこのクロストリジウム (C1ostrjdiuIIl)PLCポリ
ペプチドの回収及び精製を行う。
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の単離、精製したヌクレオチド配列に
基づく2個の推定されるアミノ酸配列を第■及び第■表に示す、第■表の最初の
22個のアミノ酸及び第■表の最初の23個のアミノ酸は分泌される成熟タンパ
ク質のリーダー又はシグナル配列(矢印で示す)から期待されるように疎水性ア
ミノ酸に冨んでいる。
種々のクロストリジウム(Clostridium)由来の天然のPLCクロス
トリジウム(C1ostridiua)遺伝子がよく知られているノ入イプリダ
イゼーション法により同定及び単離される0種々のPLO遺伝子間の相同性を区
別することから、/%イブリダイゼーション条件のイオン強度を種により調整し
なければならない、ここで参考として引用する“核酸ハイブリダイゼーション”
(実際的方法)、ヘイメス(HaIIes)及びハギンス(+laggins
) m、IRLプレス、ワシントン、D、C,(1985)に一般的に述べられ
ているノ1イプリダイゼーションバソファ及び操作を用いたフィルター71イプ
リダイゼーシヨン法が好ましい。
この“成熟”クロストリジウム(Clostridium) P L Cの本来
の形は、クロストリジウム(Clostridium)種間により、配列中の1
個以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加によりその長さが様々であること
が分っている0種々の適切なりNA配列が得られるクロストリジウム(C1os
tridiu*)の一般的種には、C,パーフリンゲンス(perfringe
ns) 、C,ビフエルメンタンス(bifer−wentans)、 C,タ
ーチウム(tertius)及びC,スポロゲネス(sporogenes)、
C,ノビ(novyi) * C、スプチカム(spttcum)及びC,ヒ
ストリチカム(hisLolyticum)が含まれる。これらの種のサンプル
はアメリカンタイブカルチャーコレクシツンのような種々の提供源から入手し得
る(参考として引用する、“バクテリア、ファージ及びrDNAベクターのカタ
ログ、第16版(1985)ロックビル、メリランド、U、 S、 A、 )。
これら天然のクロストリジウム(Clostridium) P L Oに加え
、その他のクロストリジウム(Clostridium) P L Cペプチド
も当分野でよく知られている種々の組換えDNA技術を用いて容易に設計及び製
造し得る。例えばポリペプチドはアミノ酸置換、末端及び中間アミノ酸付加及び
欠失により一次構造レベルで変化し得る。別に、その−次構造の一部分のみを含
むポリペプチドフラグメントで1個以上のクロストリジウム(Clostrid
ium) P L C活性(例えば、酵素活性)を含む一方免疫原性が低いフラ
グメントも生成し得る。特に多くの遺伝子のように、クロストリジウム(Clo
stridium) P L C遺伝子が各々1個以上の別個の生物学的活性を
有する別個の機能領域を含み得ることに注意が必要である。一般に遺伝子の修正
は天然の成熟クロストリジウム(Clostridium) P L Cの種々
の類似体及び誘導体を生成するのに使用し得る部位指定突然変異誘発(参考とし
て引用する、ギルマン(Gellman)及びスミス(Sa+1th)ジーン(
gene) 8.81−97 (1979)参照)などの種々の従来法で容易に
行ない得る。
バクテリアトキシンに加え、種の動物トキシンも本発明に従い使用し得る。治療
用のトキシンは、動物、特にヒトの膵臓ホスホリパーゼA、(例えば、−ユーウ
ェンフィゼン(Nieuwenhuizen)Wl等、メソッズ・イン−、Zン
ザイモロジー(Meth−Enzymol−)328.147〜154.197
4)が好ましい。蛇毒由来のホスホリパーゼ(例えばハチモリ(Hachimo
ri)、 Y−等(1971)バイオケミストリー(Biochem、) 10
: 4084−4089)及びナジャナジャ(例えばサラチ(Salach)
、J、1.等(1968)バイオケム・バイオフィズ・リサーチ・コミコニケ
ーションミツバチ毒のメリチン(例えばアピスメリテラ;ヘイバーマン(Hab
ermann) r E、及びジエンシュ(Jentsch)、J、 (196
7)バイオケミカルZ、 (Biochemical Z、)が適している。°
またホ乳類補体タンパク質及び細胞毒性Tリンパ球由来の細胞死滅化因子(例え
ばパーホリン)も使用し得る。
明細書及び特許請求項で使用している“リンカ−′という言葉は毒性剤への特異
的結合剤の確実な結合を巾広く含んでいる。このような結合はペプチド結合によ
る共有結合であることが好ましいが、共有結合のことも、非共存結合のこともあ
る0両試剤の結合は直接的でもよいが、より一般的には、タンパク質A又はGな
どのポリペプチド結合剤によって行なわれる。しかし、この共有結合は、各々の
試剤の本来の活性を実質的に妨害してはならない。
一般的に同成分はリンカ−による結合後、望ましい活性の約80〜90%、好ま
しくは95%以上を保持している。
以下に詳細に説明されているように、特異的結合剤が遺伝子レベルで毒性剤と結
合している、本発明の融合結合体を生産し得る。
例えば、形質転換細胞が、Fc領域をトキシンとしての機能を果す異種タンパク
質で置換った抗体を分泌する抗体/毒性側結合体を生産し得る(例えば、ニュー
バーガー(Neuberger)、 M、 S。
等ネイチャー (Nature) 312.604 (1984)(参考として
引用する))。
先に述べたように、リンカ−は死滅活性が増加するように種々の長さ及び構造を
とり得るオリゴペプチド又はタンパク質でもよい(例えば、膜に隣接するトキシ
ンの位置に依存して)、このリンカ−は切断されない方が好ましいが、この切断
は例えばインビボにおける結合体の寿命をコントロールすることが望ましい(補
体活性化などによる;参考として引用する米国特許第4,671.958号参照
)、一般にオリゴペプチドは少なくとも長さが約15Aであり、かつ、約2から
50以上の間のアミノ酸残基、好ましくは約6から20個のアミノ酸残基を含ん
でいる。このリンカ−には、。
グリシン、セリン又はスレオニン等のアミノ酸によるフレキシブル領域にはさま
れる4個から6個のプロリンでできている硬い領域を含み得る。
本発明の結合体は紐換えDNA技術で生産されることが好ましく、かつ標準技術
により原核性又は真核性宿主細胞システムで発現し得る。望ましいポリペプチド
をコードするポリデオキシヌクレオチドは以下に詳しく説明する遺伝子合成及び
遺伝子スプライシングの従来技術により構築し得る。
代表的結合体をコードする二本鎖DNA構築物は、5′から3′の方向で以下の
ように示し得る。
5’ (SBAコードDNA) −(LコードDNA) −(TコードIINA
)5′ c丁コードDNA) −(LコードDNA) −(SBAコードDNA
)例えば試剤がペプチド結合している場合は、LコードDNAは自由に選択でき
る。従って、構築物はSBAをコードする第1のDNA配列及びTをコードする
第2のDNA配列を含み得、そして望ましい場合は、リンカ−オリゴペプチドL
をコードするオリゴヌクレオチドは他の2つのDNA配列の間にはさまれる。ヌ
クレオチドはこれら構築物の5′及び3′末端に付加し、DNAベクターへの構
築物の簡便な挿入のための制限酵素認識部位を提供し得る。最終的産物は、一般
式5BA(L)T又はT(L)SBA(式中、カッコは自由に選択し得るリンカ
−を示している)を有している。
ポリペプチド成分が天然のタンパク質である時、この結合体の領域をコードする
DNA配列は標準的遺伝子クローニング技術により得られるDNA配列を存する
細胞系列から入手し得る。望ましいポリペプチドをコードするDNA配列が既知
の(例えばインターロイキン−2;米国特許第4,738.927号)、又は測
定(決定)され得る場合、そのポリデオキシヌクレオチドは、ホスホトリエステ
ル法及びホスファイトトリエステル法等の標準法で合成し得る。免疫グロブリン
又はそのフラグメントをコードするDNAは種々の起源から入手し得る(参考と
して引用しているEPA84302368.0参照)、この遺伝子はもし必要な
場合、付加的なりNAの短いセグメントにはさまれ、翻訳のための開始及び終止
コドンが提供され、並びに簡便な制限部位が提供される。
しかし、好ましいDNA構築物デザインは、この分子の種々の部分に対応する3
個の′カセット“への、そのDNAの容易な分離を可能にする(すなわち、SB
A’、T及びL DNAセグメント)、このカセット構築物を用いることにより
、生成したタンパク質は、遺伝子レベルで容易に操作でき、生成するポリペプチ
ド産物を簡単に修正し得る。
さらに、構築の際、個々のカセットに唯一存在する制限部位を含め、この分子の
より短い部分への明確な切断を可能にする。このサブカセットフラグメントは容
易に切断及び再配列し、本発明の結合体をコードする別のDNA構築物を提供し
得る。
発現のための原核生物又は真核生物へのDNAベクターの形質転換は、従来の方
法で行なわれる。望ましい結合体をコードするDNA構築物は宿主に適合する発
現コントロールシステム(の機能を保証する位置)に機能的に結合され、かつ宿
主細胞中で複製可能な、適当なりNA発現ベクター上に配置される。
大腸菌は本発明のDNA配列をクローニングするための原核性宿主である。大腸
菌及びそれ以外の微生物宿主は本発明の成分の発現に使用され、これら宿主には
、バチルスサチルス(Bacillus5ubtiHs)等のバチルス、及びサ
ルモネラ(Salmonella) 、セラチア(Serratia)及び種々
のシュードモナス(Pseudomonas)種等の腸内細菌が含まれ得る。こ
れらの原核性宿主において、一般に発現ベクターは、宿主細胞に適合する発現コ
ントロール配列(例えば複製オリジン)を含む、さらに、ラクトースプロモータ
ーシステム、トリプトフアン(trp)プロモーターシステム、β−ラクタマー
ゼブロモーターシステム、又はファージラムタのプロモーターシステム等、多種
多様のプロモーターが存在する。一般的にプロモーターは、ある場合にはプロモ
ーター配列により発現をコントロールし、かつ転写及び翻訳の開始及び完了させ
るリポソーム結合部位配列等を有している。
また、イースト等の微生物も発現に使用される。サフカロミセズ(Saceha
romyces)は、プロモーター等の発現コントロール配列を有し、3−ホス
ホクリセレートキナーゼ又はその他の解糖酵素及び複製オリジン、終止配列及び
その他の望ましいものを含む適当なベクターに対して好ましい宿主である。
微生物に加えて、ホ乳類組繊細胞培養物も本発明のポリペプチドの生産に使用し
得る(参考として引用する、ウィナンカ−(何1nnacker) 、”遺伝子
からクローンへ”、VCH出版、N、Y、N。
Y、(1987)、多くの適当な細胞系列が開発され、それらには、CHO細胞
系列、種々のCO8細胞系列、HeLa細胞、ミエローマ細胞系列等が含まれる
。これらの細胞に対する発現ベクターには、複製オリジン、プロモーター及びリ
ボゾーム結合部位、RNAスプライシング部位、ポリアゾニレ−ジョン部位及び
転写終止配列などの必須プロセンシング情報部位等の発現コントロール配列が含
まれ得る。好ましい発現コントロール配列にはSV40、アテノウイルス、ボビ
ンパピローマウィルス、免疫グロブリン遺伝子等に由来するプロモーターがある
。
目的とするDNAセグメント(例えばPLCコード配列及び発現コントロール配
列)を含むベクターは、細胞性宿主のタイプに依存して異なる従来法により宿主
細胞に転移し得る。例えば一般に原核細胞には塩化カルシウムトランスフェクシ
ョン法が用いられ、一方その他の細胞性宿主にはリン酸カルシウム処理が用いら
れる。(一般的には、マニアチス (Maniatis)等、モレキュラークロ
ーニング、ラボラトリ−マニュアル、コールドスプリングハーバ−プレス(19
82)(参考として引用する)参照)。
2個の結合体成分及びリンカ−の大きさに応じて、従来のポリペプチド技術を用
いてポリペプチドを合成することが望ましい(マンゴリン(Mangol in
)及びメリフィールド(Merrifiald)、アニュアル・レヴユー・オブ
・バイオケミストリー(Ann、Rev。
Biochem、) 39. 841. 1970)。
結合体は、抽出、沈殿化、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィー、HPLC,電気泳動等の標準法により単離、精製される。理想的
には、この結合体は少なくとも約85から95%、好ましくは98から99%以
上の実質的純粋性を有している。
本発明の結合体を生産及び使用するのに有用な条件及び濃度は、文献の参照又は
単にルーチンな実験操作に従かい当業者により容易に決定し得る。
一般に、この結合は医薬的に適当なキャリヤーき共に精製物きして使用される。
一般的にこれらのキャリヤーには、塩又はバッファ媒体を含む水性又はアルコー
ル/水性の溶液、エマルジョン又はサスペンションが含まれる。主ベヒクルには
塩化ナトリウム溶液、リンガーズデキストロース、デキストロース及び塩化ナト
リウム、乳酸リンガーズオイル又は固定化オイルが含まれる。静脈ベヒクルには
、リンガーズデキストロース等に基づく液体及び栄養補給物等を含む0例えば、
抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス等の保存剤又は他の添加物も存在し
得る。一般的にはレミントン・ファーマシューティカル・サイエンス(Remi
ngton’sPharg+aceutical 5ciences)、第16
編、マフツ(Mack) 編、1982(参考として引用する))を参照。
本発明の結合体は、別々に投与される組成物として、又は他の毒性剤と合せて使
用される。これらには抗悪性腫瘍薬(例えばビンデシン、メソトレキセート、ア
ドリアマイシン、シスプラチナム等)、イムノトキシン等、種々の化学治療薬を
含み得る。医薬組成物には本発明の結合体と合せて種々の細胞毒性剤の°カクテ
ル”を含み得る。
本発明の方法に従って調製した医薬組成物の投与経路は、通常当業者に知られて
いるものである。
治療のため、制限化学療法を除いて、本発明の結合体は標注に従かい患者に投与
し得る。投与は、皮下、静脈、腹腔内注射又は、これも適当であるカテーテルを
用いた直接的注入により行なわれる。投与量及び頻度は患者の年令、性別及び症
状、他の薬剤との同時投与、カウンターインジケーション及び医師が判断するそ
の他のパラメータに依存する。
選択される細胞群の少なくとも部分的阻害又は死滅を達成するのに適する量は“
治療効果投与量”と定義される。この投与量を達成するのに必要とされる量は病
気の程度及び患者自身の免疫システムの一般的状態に依存するが、一般的には体
重キログラム当り約o、oosから約5.0mgの結合体、より一般的には0.
05〜2.0mg/Kg/投与の投与量範囲で使用される。
予防的使用に対して、本発明の結合体又はそのカクテルを含む組成物も同様もし
くはわずかに低い投与量で投与される。
認識結合体組成物は予防的及び治療的に使用され病気の症状に依存して、感染生
物を含むホ乳類の巾広い所定の細胞群の死滅又は除去を助ける0例によると、本
発明の結合体の特異的結合タンパク質は腫瘍細胞、免疫細胞、ホルモン担当細胞
及び成長因子担当細胞、菌類、細菌、寄生虫又はウィルス感染細胞を認識し得る
。
別の態様において、ここで説明されている結合体は、不均一細胞集合体からある
細胞群を選択的に死滅、消滅又は効果的に除去するため、体外又はインビトロで
使用される。ホ乳類由来の血液を体外で結合体と合わせ、望ましくない細胞を死
滅又は血液から除き、再び標準技術を用いてホ乳類へ戻される。別の特徴には、
不均一細胞のインビトロ培養物を処理し、ここで説明している結合体を介して混
入する選択された細胞を死滅又は阻害することが 。
含まれる。
治療的用途に加え、この結合体は診断法及びインビボにおける他の目的のために
使用される0例えば、この結合体はあるリンパ球のみ(例えばB−又はT−細胞
)を除去することが望まれる末梢血液細胞の検体において、又は同様に細胞培養
物において望ましくない細胞を除外するため、特定の細胞の死滅に使用し得る。
次に示す例は説明を目的とするもので、制限を意図するものではない。
実 験
(例 1)
C,パーフリンゲンス(PERFRINGENS)由来のホスホリパーゼ遺伝子
のクローニング
C,パーフリンゲンス(perfringens) (A T CC13124
)細菌細胞を遠心で集菌し、25−Mトリス、pH8,0,10閣MEDTA、
5(1+Mグルコース、4mg/■lリゾチームに再懸濁した後23℃、10分
間インキュベートした。SDSを最終濃度0.2%、プロテアーゼKを最終濃度
100μg / m 1となるように添加し、このサンプルを37℃で4時間イ
ンキュベートした。
このサンプルを等容量のフェノールで2回抽出した後、2倍容のエタノールを攪
拌せずに水層に加えた。DNAをガラス棒でかき回すことにより溶液から捲き取
り、’lrag/lanのRNaseとインキュベートしてからフェノール抽出
を行った。その後エタノール沈殿してからDNAを乾燥し、TEバンファ(1(
1+M)リス、pH7,4,1nMEDTA)に再懸濁した。染色体DNAをH
ind I[[又はEcoRIで消化し、次に示すようにプラスミドpEMBL
8+(参考として引用する、デンテ(Dente)等、ヌクレイフクアシッズリ
サーチ(Nucl、 Ac1ds Res、)1土、1645〜1655 (1
983)の各制限部位にクローン化した。約5μgの精製クロストリジウム(C
lostridium) D N Aを)(ind mで消化した。そのサンプ
ルをフェノール抽出後エタノール沈殿し、THに再懸濁した。約2μgのpEM
BL8+DNAをHind mで消化後TEバッファで5倍に希釈し、2.5ユ
ニツトのウシ腸ホスファターゼを添加して、さらに1時間65℃でインキュベー
トした。このサンプルをフェノール抽出し、エタノール沈殿後TEに再懸濁した
* Hind I[[消化したクロストリジウム(C1ostridiu■)及
びpEMBL 8 +DNAを74DNAリガーゼにューイングランドバイオラ
ブス)を用いてライゲーションし、標準法(マニアチス(Maniatis)等
、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−、コールドスプリングハーバ−、N
Y、1982年、250〜251)に従がいライゲートしたDNAで大腸菌を形
質転換した。
同様の操作をEcoRIについても行った。
Hind m及びEcoRIで生成したプラスミドを大腸菌宿主叶1(ハナハン
(Hanahan) (1983)ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー(J、 Mo1. Bfol、)上66.557−580)の形質転換に用
い、そのトランスホーマントを50μg / m lアンピシリン及び1%(V
/V)ヒツジ赤血球を含むLB寒天培地にブレーティングした。各ライブラリー
から2000個のトランスホーマントをスクリーニング後、溶血帯を作る計5個
のコロニーを単離した。
5個全ての単離物はフラグ(Krug)及びケント(Kent) (上述)の方
法による検定でその細胞周辺腔にホスホリパーゼC活性を示した。コロニー中の
2種類のプラスミド(Hind m及びEcoRI 。
で生成した組換え体)の制限分析は、それらが挿入物中に共通する2、0キロベ
ース(kb ) EcoRI −Hlnd mフラグメントを有していることを
示した。その後、この2. Okb EcoRI −Hind■フラグメントを
詳細な制限及びDNA配列分析用にpEMBL8+のEcoRI及びHindI
[1部位の間にサブクローンした。生成したプラスミドp8PLCを保持する大
腸菌トランスホーマントは溶血性でかつその細胞周辺腔にホスホリパーゼC活性
を示す、このことはその遺伝子がこの2.0kbフラグメント中に存在していた
ことを示している。さらにDHI/p8PLCの細胞周辺腔由来の浸透圧シay
り液(ノーサル(Nossal)及びヘラペル(Heppel)、(1966)
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J、 Biol、 Cbe
s、)241. 3055 2060)中に、43000kDの分子量を有する
主タンパク質が存在する。このタンパク質は宿主細胞のシテソク液には存在しな
い。
第■表は、天然クロストリジウム(Clostridium) P L Oと比
較して本発明のPLCポリペプチド(非グリコジル化)由来のPLC酵素活性を
示している0組換え的に生成したポリペプチドは浸透圧ショックにより、形質転
換生物の細胞周辺腔から得た。細胞ペレフトは約250allの培養物から得、
その細胞を5allMトリス・塩酸pH7,8で洗浄後遠心した。このペレット
を40%スクロースを含む洗浄バンファ2(Janに再懸濁し、これにEDTA
を2mMとなるように添加した。10分後、この溶液を遠心し、細胞ペレフトを
10allの冷水に再懸濁してから約10分間氷上に放置した。この溶液を遠心
すると、上滑はシコック液が含まれている。
PLC−アルカリホスファターゼ共役検定法を以下のように行った。
試薬
トリス−HCl、0.4M、pH7,3,37℃塩化カルシウム、50−M
ウシ血清アルブミン、1 mg/a1
ホスファチジルコリン、エタノール910mM硫酸アンモニウム、0.2M
アルカリホスファターゼ(大腸菌、シグマ社、タイプlll−3)100μ10
.3鵬j! 2.5M(NH4)zsOaサスペンションラウリル硫酸ナトリウ
ム、20%
アスコルビン酸−モリブデン酸試薬、1部の10%アスコルビン酸及び6部のI
N 1hsOJ中0.42%モリブデン酸アンモニウム
操作
試薬を次の順番及び指示されている最終濃度となるように加える(最終容積40
μjり;50mMトリスーHC1,6,3腸M塩化カルシウム、0.13鵬g
/ m 1ウシ血清アルブミン、2.5霧Mホスファチジルコリン、70纏M硫
酸アンモニウム(アルカリホスファターゼサスベンジッンに寄因する硫酸アンモ
ニウム量を含む)、0.15ユニツトのアルカリホスファターゼ及び0.1〜1
×10−3ユニツトのホスホリパーゼC,ルーチンにはホスホリパーゼC以外の
全ての検定成分は1つの大きなサスベンジタンとして合せ、そしてその部分標本
を各検定用に取り出し得る。この検定混合物を振盪水槽中37℃で15分間イン
キュベートする。その反応を40μlのラウリル硫酸ナトリウムの添加で停止し
た後、200μlのアスコルビン酸−モリブデン酸試薬を添加し、45℃で20
分間、又は37℃で60分間インキュベートする一870nmの吸光度を測定す
る。無機リン酸1゛ナノモルは、反応混合物ブランク吸光度0.040を差し引
いた正味約0.045の吸光度に対応する。ホスホリパーゼC活性は1ユニツト
は1分間当りL口O1の無機リン酸を生成する量と定義される。
第■表
ホスホリパーゼC(PLC)検定
2、 Okb EcoRI −H3nd mフラグメントの配列分析(サンガー
(Sanger)等、(1977)プロシーディング・イン・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンス(Proc、 Natl、 Acad、 Sci、
)USA74 : 5463 : 5467)は、Hindln7ラグメント半
分中に1196塩基対(b p)の読み枠が存在することが明らかになった(第
■表)、その配列は22個のアミノ酸の推定シグナルペプチド及び377個のア
ミノ酸の成熟タンパク質をコードしており、そのアミノ酸組成は先の報告(フラ
ッグ(Krug)及びゲント(Kent)上述)と一致する。
(例 2)
Cビフアーメンタンス(BIFERMENTANS)由来のホスホリパーゼCの
クローニング
C,ビフアーメンタンス(bifermentans) (A T CC638
)細胞を調製し、例1と同様にDNAを抽出した。それからその染色体DNAを
EcoRIで消化し、GgtlOアーム(ストラタジーン社)のEcoR1部位
にクローン化してからバンキングした(バイン(Huynh)等、(1984)
DNAクローニングテクニ7り、実践技術、デビットグローバー(David
Glover) &W、IRLプレス版、オックスフォード50−70 (参考
として引用する))。
このゲノムライブラリーを大腸菌宿主C600Hfl上にブレーティングし、プ
ローブとして先にクローニングしたC、バーフリンゲンス(perfringe
ns>ホスホリパーゼC遺伝子を用いたプラークハイブリダイゼーションにより
スクリーニングした(ベントン(Benton)及びデービス(Davis)
(1977)サイエンス(Science)196.180〜182)、ハイブ
リダイゼーションは、5xSSC150%ホルムアミド/IXデンハー)10.
2%5DS10、1 mg/w lウシ胸腺DNA、30℃で1晩行った。20
00個のプラークをスクリーニング後、プローブがハイブリダイズした計20倍
のプラークを単離した。これら全てのプラークは2.5kbのEcoRI挿入物
を含み、後にこれをpEMBL8+にサブクローンしてプラスミドpcBPLc
1を生成した。制限及びサウザーン分析はEcoRI及びHindl[[で消化
し、そのフラグメントをアガロースゲルで分画後、分離したフラグメントをニト
ロセルロースに転移させることにより行った(サウザーン(Southern>
のDNAに二フクトランスレーションにより、先にクローン化したC、パーフリ
ンゲンス(perfringens)遺伝子から調製した放射性プローブをハイ
ブリダイズした。 0.83 kb H4nd m−EcoRIフラグメントの
みがハイブリダイズした。このことは、C,バーフリンゲンス(perfrin
gens)ホスホリパーゼC遺伝子に関する配列が、挿入物末端のこのフラグメ
ント中にのみ存在することを示している。このフラグメントのDNA配列分析は
、事実このフラグメントがホスホリパーゼCコード配列の一部を含んでいるが、
EcoR1部位で切り取られていることが明確にした。そのため、失なわれたコ
ード配列を単離するため第2のゲノムライブラリーを作った。
この第2ライフ゛ラリ−はC,ビフアーメンタンス(bjfermen−tan
s)由来のHiadm消化染色体DNAをpUCのHindl[[部位にクロー
ニングすることにより作成した(参考として引用する、ノランダー(Norra
nder)等、(1983)ジーン(Gene) 26.101〜110)、組
換えプラスミドを含む大腸菌トランスホーマントをプローブとしてpcBPLc
1由来の0.83 kb Hindm−EcoRIフラグメントを用いたコロニ
ーハイブリダイゼーシッン(フラツグ−(Norrander) J 0等、上
述)によりスクリーニングした。2000個のトランスホーマントから、そのプ
ローブにパイプリダイズする7個のコロニーを単離した0代表的なものをpCB
PLC2と命名した。これらコロニー中の全てのプラスミドは・その挿入物中に
5.2kb Hind mフラグメントを含んでいる。染色体中のpCBPのE
coRI挿入物に隣接する1、OkbのEcoR1フラグメントをPCBPLC
2からpcBPLclにサブクローンし、ホスホリパーゼC遺伝子全体を再構成
した。生成したプラスミドをpCBPLC3と呼ぶ、pCBPLC3中のホスホ
リパーゼCの全コード配列を第1表に示す、この遺伝子は、シグナルペプチドに
相当する約30個のN末端残基とともに377個のアミノ酸残基のタンパク質を
コードしている。
C,パーフリンゲンス(perfringens)及びC,ビフアーメンタンス
(bifermentans)のホスホリパーゼCタンパク質は、全アミノ酸に
関して51%の相同性がある。2つの遺伝子はヌクレオチドレベルで64%の相
同性がある。
(例 3)
PLC突然変異体の構築
完全なりロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridiusperf
ringens)のPLC遺伝子を含むプラスミドp8PLCのDNAを、PL
C配列(第■表)のヌクレオチド76〜81に存在する唯一のAccI部位で切
断した。その末端をポリメラーゼIのクレノーフラグメントを用いて充填した。
入匝リンカ−にューイングランドバイオラブス)をポリヌクレオチドキナーゼで
処理後T4DNAリガーゼを用いてプラスミドDNA切断物にライゲーションし
た。ライゲーションしたDNAをXbalで切断し、1%アガロースゲルに流し
た。線状プラスミドDNAをアガロースから精製し、再びライゲーションしてか
ら大腸菌に形質転換した。
コロニーをピックアンプし・プラスミドを精製(p8PLC−Xbaと命名する
)した後、Xbalリンカ・−挿入物付近の配列決定を行った。この構築物には
、アミノ酸26番のValの欠失及び欠失部位への4個のアミノ酸、cly、
Ser+ Arg及びAlaの挿入がある。この突然変異体タンパク質を精製し
検定した。これらの活性には正常なPLOとの差が検出されなかった。
プラスミドp8PLCのDNAを、PLO遺伝子の上流約800ヌクレオチドを
切断するEcoRIで切断した。この切断プラスミドを、切断により生じたDN
A末端から順次ヌクレオチドを除去するヌクレアーゼBa131で処理した。こ
のDNAをクレノーフラグメントで充填し、X ba Iリンカ−とライゲーシ
ョン後HindmとXbalで切断し、PLC遺伝子の末端を切断した。このD
NAをアガロースゲルに流し、PLO遺伝子の始めから0〜100ヌクレオチド
除去した大きさのXba 1− Hind mフラグメントを単離した。これら
のフラグメントをp8PLC−Xbaフラグメントの大きい方のXba 1−
Hind mフラグメントとライゲージシンし、大腸菌の形質転換に用いた1種
々のコロニーからDNAを抽出し、Xba部位付近の配列を決定した。
(例 4)
突然変異体の溶血活性
さらに研究を行うため2つの突然変異体を選択した。1つの突然変異体RICH
yb−3の場合、++8PLC−Xba中の変異したPLO遺伝子をさらにアミ
ノ酸27−30 、Tyr Aha Trp Aspの欠失により変化させた。
別の突然変異体RICHyb−9の場合、アミノ酸27−35、Tyt・・・・
・・Glyを欠失させた。変異体のPLCタンパク質の溶血活性は各々正常PL
Cタンパク質の約10倍及び50倍減少した。
先に述べたことから、単離したDNA配列はクロストリジウム(C1ostri
diu−)ホスホリパーゼCポリペプチドの実質的量の安定かつ経済的生産の改
善手段を提供する0重要なことに、クロストリジウム(Clostridium
)ホスホリパーゼC産物は実質的に天然のクロストリジウム(C1ostrid
iu−)タンパク質を含むことなく生産される。
(例 5)
PLO−タンパク質A融合物遺伝子の構築C,バーフリンゲンス(perfri
ngens)ホスホリパーゼC遺伝子を遺伝子的にS、オーレウス(aureu
s)タンパク質A遺伝子に融合するため、参考として引用するU、S、S、N、
223.037に報告されているインビトロ突然変異誘発法を用いて新しい制限
部位をPLO遺伝子の3′端に導入した。特に、PLO遺伝子の950bpのB
amHI −Hind mフラグメントを報告されているようにプラスミドp8
PLCから単離し、ファージM13mplOにサブクローンした。BamH1部
位に向って、ファージDNAからIINA合成を開始するのに合成オリゴヌクレ
オチドブライマーCNC(第1A図)を使用した。この38塩基のプライマーは
PLCの3′端に相補的である。残りはApa I 、5WAa I 、 Ec
oRI 、 TAG終止コドン及び)(indl[[部位を含むテールを形成す
る。DNAを熱変性後、新しく合成されるDNA鎖の合成を開始するのに、もう
1つのオリゴヌクレオチドブライマーにューイングランドバイオラブス、#12
01)を使用した。Ba+sHiによる消化により、PLO遺伝子の3′端及び
それにつづく導入された制限部位を含む950bpの突然変異を受けたフラグメ
ントを放出した。
このフラグメントを挿入するベクターを以下のように構築した。
l)全PLC遺伝子と、そのプロモーター及びシグナル配列を含む2、Okbの
EcoR1−Hind mフラグメントをp8PLCから単離し、pBR322
のEcoRI及びHindl[1部位の間にサブクローンしてプラスミドpBR
PLc1を作製した。及び2)pBRPLclをEcoRIで消化し、クレノー
フラグメントで充填後ライゲーションすることにより、このプラスミド中のEc
oR1部位を破壊した。この新しいプラスミドをpBRPLclと呼ぶ、このプ
ラスミドをBamHI及びPvuIIで消化し、950bPの変異させたフラグ
メントを両部位の間にクローン化し、PLO遺伝子の本来の3′側半分を置き換
えた。このようにpBRPLC2と呼ばれる新しいプラスミドは全PLC遺伝子
とそれにつづいて導入制限部位Apa1.5IIal、EcoRI及びHind
mを含んでいる。
プラスミドpEZ23308はEドメインとそれにつづく2コピーのIgG結合
結合ドメインノドメインむ合成タンパクiA遺伝子を含んでいる(参考として引
用する、エルシン(Nilsson) r B。
等プロティンエンジニアリング(Protein Enginieering)
(1987)上、107〜113) 、タンパク質AのE及び両Zドメインを含
む366bpのFsp I −EcoRmフラグメントをpEZZ330Bから
単離し、ついでPLO遺伝子につづ< pBRPLC2のSma I及びEco
R1部位の間にライゲーションした。タンパク質への一部を読み枠を同じくして
融合したPLC遺伝子を含む最終的構築物はpBRPLCZZと呼ぶ、連結領域
の配列を第2図に示す。
(例 6)
a)プロリン−グリシンポジショナ−の構築ペプチドポジショナ−をコードする
DNAセグメントをPLCとタンパク質Aの間のApaI部位に挿入した。ポジ
ショナ−Guy2Pro5GIy2は2個の相補的オリゴヌクレオチドCNC1
0及びCNCII(第1B図)を合成することにより作った。これらをアニール
し、Apalで消化後PLO及びタンパクIAO間のApa1部位にクローニン
グした5Apa1部位自体はCr1yProをコードするので、連結部の最終的
配列は、GlyProG1y2Pro5G1y2Proであった。同様にポジシ
ョナ−はGly2 Prol OGly2及びGly2Pro5G]y2Pro
5GIy2の配列を有するものを作製した。
b)ポリプロリンポジショナ−の構築
10個以上のプロリンからなるボジシッナーを生産する戦術はプロリンコドンの
直列反復物を生成し得るオリゴヌクレオチドの重複による(第1C図)、OCT
及びCCAの修正はオリゴマーが最も安定となるような唯一の読み枠となるよう
にアニールし得るように設計した。CNC25及びCNC26は互いに反復的に
アニールし得る。一度2個の外側のWPS12及びWPS13がアニールすると
伸長は停止する。WPS12及びWPS13はプラスミドへの挿入に用いるAp
a1部位を含む。
まず、各々200ngのCNC25及びCNC26を95℃、3分間でアニール
し、ついでゆっくりと冷却する。その後ATP。
dNTP、タレノーポリメラーゼ及びT4リガーゼ存在下、40ngのWPS1
3及び23ngのWPSを加えた。この混合物を16℃、1晩でライゲーション
後、ApaIで消化した。このDNAを5%アクリルアミドゲルで分画し、5O
−200bp間、及び200bp以上のバンドを精製した。これをpBRPLC
ZZのApa1部位にライゲーションし、ついで融合タンパク質の存在に関する
コロニーのスクリーニングを行った。スクリーニング操作はブルーム(Broo
se) S 、及びギルバート(Gillbert)W、の方法(プロシーディ
ング・イン・ナショナル・アカデミ−・オブサイエンス(Proc、 Natl
、 Acad、 5ci)USA、 75. 2746 2749(1978)
)に基づき、かつそれは融合タンパク質のタンパク質At+i域のアルカリホス
ファターゼ結合1gGを結合する能力に依存する。ポジティブコロニー由来のD
NAを組込まれたプロリン数を測定するため配列決定した。1つの挿入物はG1
y2Pro4GIy2をコードしていた。
C)ランダムポジショナ−の構築
長さ一定の組成ランダムポジショナ−を作るのに用いたオリゴヌクレオチドAC
Iを第1D図に示す、ACIはApar部位を含む固定配列の前後に45個のラ
ンダムヌクレオチドを含んでいた。
M 13ユニバーサルブライマーをACIにアニールし、タレノーポリメラーゼ
を用いて伸長することにより二本鎖DNAとした。
この混合物をApalで消化し、55bpのフラグメントをゲルで精製してから
pBRPLcZZにう°イゲーション後、大腸菌の形質転換を行った。先に述べ
たスクリーニング操作をPLO−タンパク質A融合タンパク質を生産するバクテ
リアコロニーのみを選択するのに用いた。ApaI部位に起因するアミノ酸のた
め、融合タンパク質の結合部は、配列G1yPro (XXX)15G]yPr
oを大腸菌からのPLC−タンパク質A融合タンパク質の調製適当なプラスミド
を有する大腸菌DHI株を100μg/warのアンピシリンを含む11のN9
培地を用い、0D600が0.8〜1.0となるまで増殖した。細胞を遠心で回
収し、60I11の50mMトリス・HCl(ρ117−8)で洗浄後、50m
12の40%スクロース、50閣Mトリス・HCI、2sM EDTA (pH
78)に再懸濁した。この混合物を時々緩やかに振りながら20℃で10分間イ
ンキュベートした。15,000Xg、30分間の遠心後、ベレフト化した細胞
を5置!の氷冷水に再懸濁し、0℃で10分間インキュベートした。細胞を15
000xg、10分間の遠心で除去し、抽出された細胞周辺腔タンパク質を含む
上清を50mMトリス・HCl、pH7−8となるように調整した。
この細胞周辺腔抽出物を50mM)リス150mM Naclp)I8.0()
リス−NaC1)で平衡化した0、5■lのウサギIgGアガロースカラム(シ
グマ社)に通した。5−iのトリス−NaCRで洗浄後、結合したPLO−タン
パク質A融合タンパク質を10(1+Mグリシン(pH3,0>で溶出した。2
25μ104104O0リス−HCj! (pH8,0)を含む試験中に450
pjtのフラクションを回収した。PLC−タンパク質Aの調製物は、5AS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動につづくコマージ染色による見積りによると9
0%以上の純度であった。
(例 8)
融合タンパク質−抗体免疫結合体の調製200マイクログラムの抗体(参考とし
て引用するU、S、S、N181.862参照)を最終体積700μlの50m
M)リス−HCj! (pH8,0) 、150@M NaC1中4〜10倍モ
ル過剰量のPLC−タンパク質A融合タンパク質と混合した。この混合物を0℃
゛で20分間インキュベートした。抗体に結合した融合タンパク質は50mM)
リス−HCj! (pH8,0) 、150+*M Na1Jで平衡化したスー
パーロース12 (Superose)を用い、ファルマシアFPLCシステム
に連結したゲル濾過クロマトグラフィーにより、遊離した融合タンパク質から分
離した0分離は、カラムフラクションのA280をモニターすることにより確認
した。免疫結合体の最終濃度はヒツジ赤血球に関する溶血検定により測定しく以
下参照)、PLC■g/mlで表わした。
(例 9)
ランダムポジショナ−融合タンパク質層の免疫結合体の小規模調製LB−amp
の一晩培養物を0D550が0.2となるようなカザミノ酸を補った1 0+j
!のN9−amp培地の接種に用いた。細胞を37℃でインキュベートし、それ
らが0D550−1.0に到達してから1時間後収穫した。細胞周辺腔からの融
合タンパク質を抽出するためこの細胞ベレフトを1.0mlの50mM)リス−
HCA (pH8,0) T:洗浄し、8K、25分間の遠心後、氷上10分間
、200μl氷冷水で浸透圧ショック処理を行ない、ついで10に、10分間の
遠心を行った。10μlのウサギIgGアガロースカラム(シグマ)を用い、浸
透圧ショック液がらPLC−タンパク貧Aタンパク質をバッチ精製した。ショッ
ク液を室温、1時間でカラムに結合させた。このカラムを100μlの50−M
)リス−HC1(pH8,0) 、5 (1+M NaCj!で二回洗浄し、結
合したPLC−タンパク質Aタンパク質を室温で5分間、50μi! 100m
Mグリシン−HCl (pH3,0)の処理で溶出した。
回収した上滑を25.c+#0200mM)!JスーHC1(pH8,0)で平
衡化した。
精製したタンパク質をコマージ染色ゲル上の観察及びブランドフォード検定法に
より定量した。50+wMl−リス−HCl! (pH8,0) 、150mM
NaCj、0.1 mg/m 1ゼラチンバフフア中、氷上30分間で3.5
μgトキシンと2.1μg抗Tac抗体とを結合した。RPMI培地を用い5倍
毎の連続希釈を行った。
(f!i 10)
a))リバンブル染色による細胞毒性検定1 m j! Aンク塩溶液(Ban
k’s 5alts)巾約lXl0’個のCR2−2細胞の部分標本を37℃で
90分間、トキシン又は抗体に結合したトキシン希釈物とともに、24穴プレー
ト中でインキュベートシた。PBS中0.5%トリパンプル液100IJj!を
各ウェルに添加し、顕微鏡下で色素排除(生存を示す)する細胞を数えた。
b)”H−ロイシン取込みによる細胞毒性検定5%FC3を補ったlsJのRP
MI培地中、約lXl0’個のCR2−2細胞の部分標本を37℃で18時間、
トキシン又は抗体に結合したトキシンの希釈物とともに24穴プレート中でイン
キュベートした。各ウェルに5μlCiの3H−ロイシン(アマ−ジャム、17
1 Ci/m閣01e)を添加し、この細胞をさらに4時間インキュベートした
、各ウェル由来の細胞を遠心により回収し、バンク塩溶液で1回洗浄した後、2
00μlの蒸留水に再慈濁して溶解した。800μeの冷10%TCAを加えて
タンパク質を沈殿させた。それからこのサンプルをグラスファイバーフィルター
で濾過し、冷10%TCAで洗浄してから計算した。
c)”H−チミジン取込みによる抗体に結合したランダムボジシ!ナー融合タン
パク質の細胞毒性検定
96六マイクロプレート中10’細胞/ウエルのCR2をRPMI培地中、37
℃、7.5%CCh雰囲気下で1晩、420ng/m1及び、84ng/mfの
抗Tac抗体に結合した融合タンパク質で処理した。翌日、1μCiの3H−チ
ミジンを各ウェルに加え、この細胞を37℃で4時間インキュベートした。PH
D細胞収穫器(ケンブリッジテクノロジー社)を用いて細胞をグラスファイバー
フィルター上に収穫し、取込まれたラベルを測定した。取込み率は(wA胞+ト
キシンcps1 ) / (細胞−トキシンcps )で計算した。
d) P L O−ポジショナーータンパク質入融合タンパク質の溶血検定
ヒツジ赤血球を低速遠心で回収し、等張ホウ酸バフフ1で2回洗浄した後(13
(1+M NaCj、 3.5aM B5BO3,1,5mMNatBaOt
、1.2++M CaCj!g s p[B7.6) 、1%(V/V)となる
ように同バッファに再!A濁した。この1%赤血球サスベンジッン300μlを
、等張ホウ酸バッファ中300pj!の融合タンパク質と混合した。この混合物
を37℃で30分間インキュベーシッン後、さらに0℃で30分間インキュベー
トした。細胞溶解は、遠心により細胞を除去し、つづいて上清のA350を計測
することにより測定した。
(例 11)
プロリン−グリシンポジショナ−融合タンパク質の結果PLC−タンパク質A、
P L C−Gly2 Pro5 G1y2−タンパク質ASPLC−タンパ
ク質A−抗Tac結合体及びpLc−c+y2Pro5G1y2−タンパク質A
−抗Tac結合体の毒性を、種々の° 濃度のこれらタンパク質を、抗Tac抗
体が結合するCR2−2細胞とインキュベートすることにより比較した。90分
後、残存する生細胞率をトリパンブルー色素排除試験で測定した(第3図)。
トキシン自体よりも結合したトキシンの方が細胞死滅は著しく、またG1y2P
ro5G1y2ボジシッナーを含むトキシン結合体が最も毒性が強かった。50
%死滅率はP L C−G1y2 Pro5 Gly2−タンパク質Aのみの場
合、1.25μgPLC/sJで観測され、一方PLO−タンパク質A−抗Ta
c及びP L CG1y2 Pro5G1y2−タンパク質A−抗Tacは各々
33倍(37,5Hg/mjり及び180倍(7Hg/mAり低いPLO濃度で
標的細胞の50%を死滅させた。抗TaeへのPLCの結合はIL−2レセプタ
ーを発現しないCEMIII胞への毒性を増加しなかった。これらの結果は抗T
ac抗体とPLCとの結合は、それらが認識し得るT細胞系列への特異的毒性を
増加したことを示している。またこれらの結果はG]y2Pro5G]y2ポジ
ショナ−が、抗Tacに結合したときにはPLC−タンパク質入融合タンパク質
の毒性を増加するが、結合していないときは増加しないことをことも示している
。
同様の毒性比較を、PLOとタンパク質Aが配列GIy2Pro5G1y2 P
ro5 G1y2 (第4図)及びGIy2Prol 0Gly2をもつポジシ
ョナ−によって結合しているPLC−タンパク質入−抗Tac結合体について行
った6両方の場合において結合トキシンの毒性はトキシン自体よりも実質的に大
きく、またGl)’2Pro5G]y2ポジショナーを存するトキシン結合体と
同様であった。
トリパンブルー排除試験ではなく’H−ロイシン取込みにより細胞死滅の測定を
行っても、同様の結果が得られた(第7図)。
しかし、死滅の程度は、タンパク質合成従ってロイシン取込みが細胞死滅後も続
行することからこの方法で測定するといくぶん小さくなった。
(例 12)
MA2.1抗体の結果
これらの結果が抗Tacではない他の認識抗体についても適用することを確める
ため、MA2.1抗体を用いた。この抗体は例えばJY細胞表面のHLA分子に
結合する(ウニイス(Ways)、J、及びバーハム(Parham)、Po、
バイオケミカルジャーナル(Biochem。
J)216;423−432 (1983))、抗体は先に述べた方法でPLC
−G1y2Pro5Gly2−タンパク質入融合タンパク質に結合した。JY細
胞をマイクロプレートのウェルに分配しく5%FC3を含むRPMI中ウェルつ
り2X10’細胞)、37℃で20時間、トキシン及び抗体に結合したトキシン
の各希釈物とインキュベーションした。1μCiの3H−ロイシンを各ウェルに
添加し、37℃で4時間インキュベーションした。3H−ロイシン取込みで測定
した約50%の細胞死滅は、約10μg / m j!のPLC−G1y2Pr
o5G1)’2−タンパク質A及び約28ng/@fのMA2.1抗体結合PL
C−Gly2Pro5G1y2−タンパク質Aで観測された(第6図)、従って
、この結合トキシンは、JY細胞に対し、トキシン自体よりも約350倍も毒性
が強い。
(例 13)
ランダムポジショナ−融合タンパク質の結果抗Tac及び種々のPLC−ランダ
ムボジショナーータンパク質A融合タンパク質結合体の毒性を、CR2−2細胞
と2つの濃度でインキュベートし、ついで上述のように3H−チミジン取込みに
よる細胞死滅を測定することにより決定した(第7図)、3H−チミジン取込み
量は、抗Tac抗体のみ(トキシンなし)を細胞。
とインキュベートした場合の値に対するパーセンテージで表わした。結果から、
抗Tacに結合後細胞に対して、Pro5より毒性が強い(より少ないチミジン
取込み)融合タンパク質を作る、いくつかのポジショナ−1特にRP7、RP1
9、RP25及びRP29が示され、一方例えばRP8などその他のものはPr
o5と等しいか又はより小さい毒性を有することが示された。
本発明は明確な理解のため実例により詳細に説明してきたが、特定の変化及び修
正が請求の範囲を逸脱することなしに行い得ることは明白である。
浄書(古書:ユニ吏なし〉
融合タンパク質構築に使用するオリゴヌクレオチドPLO−タンパク質A遺伝子
結合領域の?1IFIG=2゜
Pro5 GPGGPPPPPGGP 、43 .43RP7 GPGMRYE
GGLMGCKGIGGP −2534RP8 GPKLRKGεl5SGAG
LIKGP 、44 .65RP19 GPGNTRCERTrTLISAPG
P 、33 .34RP25 GPLTAPPHLGFRRCEPLGP 、2
0 30RP29 GPNGAACSRFSRGASEXGP −2433FI
Q、j。
手続補正書(方式)
%式%
5、補正命令の日付 平成2年12月11日7、補正の内容 別紙のとおり
国際調査報告
1+mnvwMい1111bcab。MN、邸8B104493
Claims (22)
- (1)認識成分が細胞膜構成物に結合し得、かつ毒性成分が細胞膜を損傷するこ とで細胞を死滅し得る、ポリペプチド毒性成分に結合したポリペプチド認識成分 を含む所定の細胞群を死滅し得る結合体組成物で、結合体の成分がペプチド結合 しているか、又は1個以上のアミノ酸を含むリンカーにより結合している組成物 。
- (2)認識成分が成長因子である請求の範囲第1項記載の結合体組成物。
- (3)膜構成物が成長因子に対するレセプターである請求の範囲第2項記載の結 合体組成物。
- (4)腹構成物が本来T細胞及び、又はB細胞上に存在する請求の範囲第1項記 載の結合体組成物。
- (5)認識成分が免疫グロブリンである請求の範囲第1項記載の結合体組成物。
- (6)免疫グロブリンがキメラ型又はヒューマナイズ化免疫グロブリンである請 求の範囲第5項記載の結合体組成物。
- (7)毒性成分が酵素である請求の範囲第1項記載の結合体組成物。
- (8)酵素が細菌性又はホ乳類のタンパク質である請求の範囲第7項記載の結合 体組成物。
- (9)酵素がホスホリパーゼC又はホスホリパーゼA2である請求の範囲第7項 記載の結合体組成物。
- (10)リンカーがペプチド結合で少なくとも1つの成分に結合している請求の 範囲第1項記載の結合体組成物。
- (11)患者に治療効果のある量の、請求の範囲第1、6又は9項記載の結合体 組成物を投与することを含む、患者中の特定の細胞を処理する方法。
- (12)DNA構築物で、 i)細胞表面構成物に結合し得る認識成分をコードする第1DNAセグメント、 及び ii)細胞膜で作用することにより、細胞を死滅し得る毒性成分をコードする第 2DNAセグメント、 を含み、該DNAセグメントが2つの成分を含む単一のポリペプチドをコードす るDNA構築物。
- (13)少なくとも1個のリンカーアミノ酸をコードする第3DNAセグメント を含み、該第3DNAフラグメントが第1及び第2DNAセグメントの間に位置 する請求の範囲第12項記載のDNA構築物。
- (14)第2DNAセグメントが酵素をコードする請求の範囲第12項記載のD NA構築物。
- (15)第2DNAセグメントがホスホリパーゼCポリペプチドをコードし、か つ、(a)第II表及び第III表のDNA配列又はそれらの相補鎖、 (b)発現時に第II表及び第III表のポリペプチド配列をコードするDNA 配列又はその相補鎖、及び c)(a)又は(b)のDNA配列にハイブリダイズするDNA配列、からなる 群から選ばれる請求の範囲第14項記載のDNA構築物。
- (16)さらにコードセグメントに機能的に結合した発現コントロールDNAセ グメントを含む請求の範囲12、13又は15項記載のDNA構築物。
- (17)請求の範囲12、13又は15項記載のDNA構築物でトランスフェク トした細胞。
- (18)細胞膜を損傷することにより細胞を死滅し得るポリペプチド毒性成分に 、1個以上のアミノ酸を含むリンカーにより結合した細胞膜構成物に結合し得る ポリペプチド認識成分を含む、特定の細胞群を死滅し得る結合体組成物。
- (19)リンカーが少なくとも1つの成分とペプチド結合している請求の範囲第 18項記載の結合体組成物。
- (20)リンカ−分子が約5個から約20個のアミノ酸からなるポリペプチドで ある請求の範囲第18項記載の結合体組成物。
- (21)リンカ−分子がタンパク質A又はそのフラグメントである請求の範囲第 18項記載の結合体組成物。
- (22)認識成分が免疫グロブリンである請求の範囲第18項記載の結合体組成 物。
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GB9226065D0 (en) * | 1992-12-14 | 1993-02-10 | Ici Plc | Peptides |
US5474921A (en) * | 1993-10-15 | 1995-12-12 | Merck & Co., Inc. | Expression and purification of phosphoinositide-specific phospholipase C-γ |
FR2768747B1 (fr) * | 1997-09-19 | 2000-12-01 | Pasteur Institut | Acides nucleiques, cellules recombinantes, et procede de preparation de compositions immunogenes |
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US7709610B2 (en) | 2003-05-08 | 2010-05-04 | Facet Biotech Corporation | Therapeutic use of anti-CS1 antibodies |
US20050025763A1 (en) | 2003-05-08 | 2005-02-03 | Protein Design Laboratories, Inc. | Therapeutic use of anti-CS1 antibodies |
US7973134B2 (en) * | 2004-07-07 | 2011-07-05 | Cell Signaling Technology, Inc. | Reagents for the detection of protein phosphorylation in anaplastic large cell lymphoma signaling pathways |
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US7807789B2 (en) * | 2004-12-21 | 2010-10-05 | Cell Signaling Technology, Inc. | Reagents for the detection of protein phosphorylation in EGFR-signaling pathways |
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WO2007127335A2 (en) * | 2006-04-27 | 2007-11-08 | Cell Signaling Technology, Inc. | Reagents for the detection of protein phosphorylation in atm and atr kinase signaling pathways |
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US20090220991A1 (en) * | 2008-02-29 | 2009-09-03 | Cell Signaling Technology, Inc. | Reagents for the detection of protein phosphorylation in leukemia signaling pathways |
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Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JPS5819066B2 (ja) * | 1975-11-17 | 1983-04-15 | 武田薬品工業株式会社 | トガウ イルス hi反応方法 |
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US4545985A (en) * | 1984-01-26 | 1985-10-08 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Pseudomonas exotoxin conjugate immunotoxins |
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