JPH03501208A - 細胞毒性結合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞毒性結合体 （本発明の分野） 本発明は一般的に言うと、がん治療又は自己免疫不全の治療及びその他のヒト治 療等において、インビトロ又はインビボで細胞を殺傷する部位指定トキシンの使 用、そしてより特定して言うとこれら組成物の効率の増加に関する。

（本発明の背景） がん細胞又は望ましくない免疫応答を示す細胞（例えば特定の抗原特異的Ｔ及び Ｂ細胞）等の特定の細胞群の選択的除去は現代医学研究の第１の目標である。何 年間もの間、この目標に到達することにより行ってきた。化学療法については、 アルキル化剤、抗代謝剤、抗生物質、酵素等の抗増殖側の使用が最も背反してい る方法である。いくらかは確かに成功しているが、これらの細胞毒性剤は一般に 非特異的であり、この治療を施した患者に多くの重大な副作用をひき起こす、投 与量及び投与方法の変化又は他の細胞毒性剤と組合せによる使用でいくらかの改 善が達成し得るが、この種の治療に関する問題は多い。

これらの困難に打ち勝つ試みの中で、研究者達は“魔法の弾丸”という着想に焦 点を集めだした。しばしばこの魔法の弾丸はトキシンと結合した免疫グロブリン 、特にモノクローナル抗体、すなわち°イムノトキシン°から成る。抗体分子又 はその他の認識成分は、患者体内のｌｌ瘍等の所定の細胞群に対し選択的に毒性 剤を送り込み、結果として望ましくない細胞のみ死滅させ得る。さらに理論的に は、がん細胞又はその他の疾患又は望ましくない細胞をほとんどの治療法に共通 する非特異的副作用を起こすことなしに死滅させ得る。

これらの組成物の使用に内在する数多くの可能性にもかかわらず精力的な研究努 力に反して成功を収める生産物はほとんど開発されていない、実際に現在受は入 れられている化学療法又はその他の治療の効率を事実上高めうる認諏剤（ｔａｒ ｇｅｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）及びトキシンの適当な組合せを発見するのは極端に 難かしいことが分ってきた。

おそらく、最も広く臨床的にテストされているイムノトキシンはりシン及びジフ テリアトキシンのような、毒性剤としてのりボゾーム阻害タンパク質を利用して いる。死滅化のためには、これらのトキシンが細胞の細−脂質に入ることが必要 であり、その後トキシンが触媒的にリボゾームタンパク合成を不活性化し、最終 的に細胞が死滅する。事実、一般に使用される実質的に全てのイムノトキシンは この性質を有する。すなわち有効性を発揮するためには一般にこれらのトキシン はサイドシル中に取り込まれなければならない０重要なことは、一般的にトキシ ンも活性となる前にモノクローナル抗体又は他の認識成分から切り離さなければ ならない。

不幸なことに、部分的には多くの細胞がイムノトキシン又はそのトキシン成分を 細胞膜を通し、かつ細胞の中に簡単に輸送しないことから、これらのトキシン結 合体の使用は一般的に理想的なものではない、さらに、しばしばｖｌｌ酸成分細 胞毒性剤との結合は、不適当な時期、すなわち目的細胞に結合する前に切断して しまう、このことは重大なランダムな細胞の死滅化を起こし、合併迅速に除去さ れ、結局望ましくない細胞群と作用し得るトキシン量が減少してしまう。

さらに、これらの毒性結合体の多くは製造するのが難しい、しばしばトキシンが 非常に毒性が高いため熟練者のみがそれらを取扱い得る。また、使用されている 特定の結合システムはしばしば複雑であり、かつ非経済的であるため生産収量が 低い、最後にこれらの物質の製造における品質管理の問題が非常に難しい。

このように、特にインビボで秀れた性質を示す部位指定トキシン結合体の必要性 がある。これらの結合体は高い特異的細胞毒性を保持しするが、宿主への非特異 的毒性は最小限のものであるべきである。理想的には、これらは製造するのに比 較的経済的であり、かつ再現性があるべきである。また、単純でかつ系統的な方 法で毒性結合体の構造を修正でき、場合に応じた結合体の細胞毒性の改変又は修 正し得ることが望ましい０本発明はこれらの条件を満たしている。

（本発明の概要） 本発明は、患者体内の真核又は原核細胞を選択的に死滅し得る新しい認識結合体 組成物を用いた愚者のインビボにおける治療のような、細胞群から所定の細胞を 除去するための改良組成物及び改良法を提供する。この組成物は２つの成分から 成る。それらは１個以上のアミノ酸リンカ−により連結するか、又は単一のポリ ペプチドとして組換え的に合成した、ポリペプチド毒性成分に結合したポリペプ チド認識成分である。認識成分は細胞膜構成マーカーに結合し得、また毒性成分 は膜を破壊することにより細胞を死滅し得る。認識成分は望ましい細胞のみに特 異的であることが好ましく、またそれらには免疫グロブリン、特に低い免疫原性 を示すよう修正した免疫グロブリンを使用しでき、もしくは死滅すべき細胞群の レセプターに実質的に特異的なヒト成長因子も使用し得る。毒性成分には細胞死 滅を導くのに十分な細胞膜破壊が可能な、細菌性又はホ乳類タンパク質である多 くの酵素又は他の試薬が使用し得る。これら２つの成分をペプチド結合させる際 、標準的組換えＤＮＡ技術及び細胞培養生産などによる結合組成物の単離な生産 及び修正操作を行ない得る。また、この結合体の医薬組成物も多種の治療処理に おいて使用し得るものが提供される。

また、代表的トキシンである、クロストリジウム（Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉｕ＋ｓ） ホスホリパーゼＣポリペプチドをコードする、クローン化組換えＤＮＡ配列も提 供されている。この配列は、発現制御配列に機能的に結合し、かつ宿主中で発現 した時、実質的に天然のクロストリジウム（Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉｕ−）遺伝子産 物を含まない、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）ホスホリパーゼＣ ５又はそのフラグメントを生成する。クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕ ｍ）ホスホリパーゼＣの一次構造の一部、及び、又はそのトキシンの１個以上の 生物学的性質を有する新しいポリペプチドは、天然の遺伝子をコードするＤＮＡ 配列を修正することにより容易に生成し得る。またこの遺伝子は関連遺伝子の単 離及びヒトｆｉ者由来のサンプル中のクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕ ｍ）存在の同定用のプローブとして使用し得る。

（図面の簡単な説明） 第１図は遺伝的構築に用いるオリゴヌクレオチドを示している。

ａ）ＰＬＯ遺伝子の末端に制限部位を導入するのに用いたオリゴヌクレオチド。

ｂ）　Ｇ］ｙ２Ｐｒｏ５Ｇ１ｙ２ボジシッナーをコードするＤＮＡを合成するの に用いたオリゴヌクレオチド。

Ｃ）　ポリプロリンポジショナ−をコードするＤＮＡを合成するのに用いたオリ ゴヌクレオチド、矢印はＷＰＳ１２及びＣＮＣ２５の間、及びＣＮＣ２６及びＷ ＰＳ１３の間の境界を示している。

ｄ）　ランダムボジシッナーを構築するのに用いたオリゴヌクレオチド。

第２図は、ＰＬＣ及びタンパク質Ａの間の結合領域の配列を示している。矢印は ＰＬＣ遺伝子の３′端、を導入したＡＰａ１部位及びタンパク質Ａ遺伝子の５′ 端から分離している。

第３図はトキシン及び抗Ｔａｃ抗体に結合したトキシンの毒性を示している。毒 性はＣＲ２−２細胞の生存率（％）で測定した（トリパンブルー色素排除試験） 。

第４図はトキシン及びボジシッナーを介して抗Ｔａｃ抗体に結合したトキシンの 毒性を示している。毒性はＣＲ２−２細胞の生存率（％）で測定した（Ｌ）バン プルー色素排除試験）。

第５図はトキシン及びＧ１ｙ２Ｐｒｏ５Ｇ１ｙ２ボジシッナーを介して抗Ｔａｃ 抗体に結合したトキシンの毒性を示している。毒性は３Ｈ−ロイシン取込み率（ ％）で測定した。１００％−トキシン処理なし条件下での取込み。

第６図はトキシン及びＧ］ｙ２Ｐｒｏ５Ｇ１ｙ２ボジシッナーを介してＭＡ２． １抗体に結合したトキシンの毒性を示している。毒性は３Ｈ−ロイシン取込み率 （％）で測定した。１００％−トキシン処理なし条件下での取込み。

第７図はランダムボジシッナーを介して抗Ｔａｃ抗体に結合したトキシンによる 細胞死滅化の程度を示している。細胞死滅化は、２種の濃度のトキシン結合体添 加後の３Ｈ−チミジン取込み率（％）で測定した。１００％−トキシン処理なし 条件下（抗体のみ）での取込み。

（好ましい態様の説明） 例えば患者体内の所定の細胞を死滅させる等、細胞群の中からある細胞を除去す るのに使用し得る、認識毒性結合体の効果を増加する新しい組成物及び方法が提 供される。一般にこの結合体には、細胞膜を破壊することにより細胞を死滅し得 る毒性成分に、ペプチド結合により、又は１個以上のアミノ酸を含むリンカ−を 介して結合した、細胞膜マーカーに結合し得るポリペプチド認識成分が含まれる 。従って、インビボ又は身体外（ｅｘｔｒａ−ｃｏｒｐｏｒｅａｌｌｙ）で、非 特異的毒性を増加することなく所定の細胞群の死滅化を増加し得る。毒性の改善 は巾広い原核及び真核細胞に対する利用を可能にし、またこの結合体は、組換え ＤＮＡ技術により容易に生産し得ると同時に、この技術で該結合体構築物の単純 な修正が可能である。さらにこのことは該結合体の細胞毒性又はその他の特性の 調整も可能とする。

ここで使用されているように、“認識成分°という語句は細胞毒性剤と複合体を 作った特異的結合成分を意味する。該結合体の特異的結合成分又は認識成分は、 カルシノーマを形成する細胞のような、一般に予め選択された特定の細胞に毒性 薬剤を運ぶ手段を提供し得るポリペプチドである。認識成分は、望ましい細胞に 結合体全体が付着した後でさえ毒性成分が認識成分から分離しないことを保証す るような方法でポリペプチド毒性成分に結合される。

本発明の結合体で処理し得る典型的な病気には器官移植拒絶及びＭｉ織移植−宿 主症などの組織移植関連状態；■型糖尿病、リューマチ関節炎、全身狼癒紅斑症 、筋無力症及び多発性硬化症などの自己免疫症、及びリンパ腫、白血病及びその 他のがんが含まれる０組織移植する前に損傷細胞を除去するために骨髄などの組 織の前処理に用いることが好ましい（例えば供与Ｔ細胞；参考として引用してい る米国特許第４．４８９．７１０号参照）。

一般に、本発明の結合体は一般式 ％式％ で表わされる。この記述において、“ＳＢＡ”は特異的結合剤、“Ｔ”は毒性剤 及び“Ｌ”は各試剤の本来の活性、すなわち結合以前の活性を実質的に失なうこ となく毒性剤に特異的結合剤を結合するペプチド結合、又はオリゴペプチド又は 他のタンパク質性構造である両試剤間のリンカ−を表わしている。

例えば、本発明の１つのＢ様にはヒトのインターロイキン２レセプターと特異的 に反応するモノクローナル抗体（抗Ｔａｃ抗体）にタンパク質入フラグメントを 介して結合する酵素Ｃ，パーフリンゲンス（ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）ホスホリ パーゼＣ（ＰＬＣ）を含む結合体がある。これら両ポリペプチドに対する遺伝子 が単離され、かつ各々は多くの細胞宿主において容易に発現される。この２つの タンパク質は宿主細胞から精製した後結合させるのが望ましい。

ＰＬＯ遺伝子の下流に結合するスタフィロコン力スアウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌ ｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）のタンパク質Ａの５個の反復単位のうちの２個 をコードするＤＮＡセグメントを用いて、タンパク質Ａ領域が続＜ＰＬＣをコー ドする融合タンパク質が得られる。これを精製したモノクローナル抗Ｔａｃ抗体 と混合し、さらにＦＰＬＣサイズ分別カラムに通すことにより本発明の結合体が 生成する。

最終的結合体はタンパク質Ａ単位が抗Ｔａｃ抗体に高い親和性を有することから 、”　ＰＬＣ−タンパク質Ａ−抗Ｔａｃ″の構造をもつ。

この結合体は細胞表面にＩＬ−２レセプターを含む細胞を死滅させる上で、ＰＬ Ｏ−タンパク質Ａ単独の場合より約２０倍も有効であることが示された。さらに 死滅活性の増加は酵素とタンパク質Ａの間にポジシッナーアミノ酸を加えること により可能となる。特に、種々のボジシッナーを酵素の後、タンパク質Ａ−抗体 タンパク質の前に挿入したとき５〜１０倍の死滅活性の増加が見られる。９．１ ４．１６及び４２個のアミノ酸を有するグリシン及びプロリンを組合せた多くの ポジショナ−は死滅化能力の増加を示した。重要なことにこれらのタンパク質が 本来の結合体をコードする発現ベクターに適当なりＮＡ配列を挿入することによ り容易に生成される。

結合体における細胞毒性剤の配給ベヒクルとして働く特異的結合剤は多くの起源 に由来し得る。Ｆｖ　、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２’　、半分の抗体分子（すなわち 単一の重／軽鎮対）など免疫グロブリンフラグメント又は本来の免疫グロブリン が用いられることが望ましい。その免疫グロブリンは最終的用途に応じて、マウ ス、ヒト又は他のホ乳類に由来するＩｇＭ又はＩｇＧアイソタイプのモノクロー ナル抗体であることが最も望ましい。選択される細胞群上のレセプターに結合し 得る（例えばインターロイキンレセプター、ＰＤＧＦレセプター、インシュリン レセプター等）成長因子（例えばインシュリン様成長因子、インターロイキン、 繊維芽細胞成　。

長因子、血小板由来成長因子［ＰＤＧＦ］等）を含むその他のタンパク質や試剤 も使用される。一般に特異的結合剤は、糖タンパク質、脂質タンパク質多糖類等 受容し得る細胞成分に十分な親和性を持って結合し、毒性剤を作用させ得る能力 のみにより制限を受ける。従って、標的に対する特異的結合剤の結合親和性は一 般的に少なくとも約１０−’、好ましくは約１０−”〜１０−”以上である。

モノクローナル抗体技術の一般的な免疫化、融合、スクリーニング及び拡張法は マーカーの選択も含めて当分野ではよく知られており本発明の一部を形成するこ とはない。

最近の技術進歩は別の型の免疫グロブリン及びそれらの製造法を提供した。例え ば、組換ＤＮＡ技術の使用は、結合体への使用に適した機能的に類似する免疫グ ロブリン又はハイプリント免疫グロブリンを生成した（例えばマウスの可変又は 超可変領域と結合する、ヒトのモノクローナル抗体由来の可変領域存在又は非存 在の定常領域等、例えば参考として引用するＥ　Ｐ　−Ａ−８５３０５６０４， ２参照）（参考として引用するＥＰＡ８４３０２３６８．Ｏ参照）。

−ｉ的に、抗体分子は悪性細胞又はＴｗｉ胞の膜構成物であるマーカーのエピト ープに結合し得る。一般的にこのマーカーは表面の糖タンパク質であるが、膜上 に細胞により提供されているその他のタンパク質、リポタンパク質、多ＩＩ類等 の多種類のマーカーは本発明に従って使用し得る。

さらに、ここで説明されているイムノトキシンに対する標的として働き得る、い くつかの又は全てのＴ細胞の膜上のタンパク質にはＣＤ２　（Ｔｌ　１）　、Ｃ Ｄ３、ＣＤ４　（ヘルパーＴ細胞）及びＩＬ−２レセプター（白血球分類ｍ、Ａ 、Ｊ、マクミカエル、　（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ）　！、オックスフォード大学出 版、１９８７　（参考として引用する））が含まれる。標的としての役割を果し 得るＢ細胞上に圧倒的に存在するタンパク質にはＣＤｌ０　（ＣＡＬＬＡ抗原） 、ＣＤ１９及びＣＤ２０が含まれる。ＣＤ４５はリンパ球上に広く存在する有効 な標的となる。

標的として働き得るがん細胞上の抗原にはがん胎児性抗原（ＣＥＡ）、トランス フェリンレセプター及び１７−ＩＡ抗体（バーリン（Ｈｅｒｌｙｎ）等プロシー ディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、）　Ｕ　Ｓ　Ａ　７６　、１４３８゜１９７９ ）、Ｌ６抗体（ヘルストロム（Ｄｅｌｌｓｔｒｏｍ）等、キャンサーリサーチ（ Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）↓６，３９１７−３９２３．１９８６）及びＢ６．２ 抗体（コルチャー（Ｃｏｌｃｈｅｒ）等、プロシーディング・ナショナル・アカ デミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、７８．３１９９．１９８１）によりＬ５２１ｆｔされる抗原 が含まれる。がん細胞上の他のタンパク質標的は、第３回がんに対するモノクロ ーナル抗体免疫結合体に関する国際会議要旨集で説明されている（サンジエゴ、 ＣＡ、１９８８）。

細胞に隣接して配向したとき本発明のトキシン成分は細胞膜を損傷し得る。ここ で用いている°損傷ゝとは細胞の破壊又は死を誘導するのに十分な膜、その正常 な機能又は１個以上の膜成分の変化を意味する。一般的にトキシンは膜構造成分 又はチャンネル又はボアを形成している成分を切断しく例えばバクテリア由来の チオール活性化細胞溶解トキシン）、最終的に膜に穴を開けてしまうように、細 胞表面で活性を示す、また、トキシンは重要な構造成分を破壊すること、界面活 性剤様の界面作用、いくつかの必須成分を引き離すこと、又は膜結合酵素を永久 的に活性化又は失活させることにより細胞膜に損傷を与える（例えば大腸菌の熱 安定エンテロトキシン；参考として引用する“バクテリアルトキシンズ”第２版 、Ｊ、ステファン（Ｓｔｅｐｈｅｎ）及びＲ，Ａ、ペイトロスキー（Ｐｅｒ　ｔ ｒｏ＋ｅｓｋｉ）、アメリカ微生物学会、１９８６参照）。

これに関して、バクテリア由来の適当なトキシンは例として提供するもので、制 限を与えるものではない以下に示す第１表に示されている（″動物、細菌及び植 物性トキシンの特異性と作用”“レセプターと認識”Ｂシリーズ、１巻、クアト レカサス（Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ）　、Ｐ　Ｗ、チャツプマン・アンドホール （Ｃｂａｐｍａｎａｎｄ　Ｈａｌｌ）版、ロンドン、イギリス、１９７６　（参 考として引用する））。

第１表 クロストリジウムパーフリンゲンス　５ｙａｙｔｂ、　Ｃ，（１９７５）　Ｊ、 　Ｇｅｎ。

θ−トキシン　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　８７：２１９−２３８バチルスセレウス 　Ｊｏｈａｎｓｅｎ、　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８８）ホスホリパーゼＣ鉦胚 ６５７２９３−３０４シユードモナスアエルジノサ　Ｌｉｕ、　Ｐ、Ｖ、（１９ ６６）Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ。

ホスホリパーゼＣ匡１１６：１１２−１１６本発明のＢ様により、トキシンであ るクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）ホスホリパーゼＣ（ＰＬＯ）酵 素のポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列が提供される０発現ベクター及び 適当な真核性及び原核性宿主中に入れたとき、天然のクロストリジウム（Ｃｌｏ ｓｔｒｉｄｉｕｍ）　Ｐ　Ｌ　Ｃの１個以上の種々の生物学的性質を示す大量の ポリペプチドを生成し得る。望ましいことにこれらは本発明の結合体にも使用し 得る。

このように本発明はクロストリジウム（Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉｕｓ＋）　Ｐ　Ｌ　 Ｃポリペプチドをコードし、かつ（ａ）第Ｈ表に示されるクロストリジゥムパー フリンゲンスＣＣ１ｏｓｔＢｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）のＤＮＡ配列 及び第１表に示されるクロストリジウムビフェルメンタンス（Ｃ１ｏｓｔｒｉｄ ＋ｕｍ　ｂｉｆｅｒｅｘｅｎｔａｎｓ’）のＤＮＡ７ラグメント又はそれらの相 補鎖、（ｂ）発現に際し、例えばコード縮重等により第■及び第ｍ表に示すポリ ヌクレオチド配列をコードするＤＮＡ配列又はそれらの相補鎖、及び（ｃ）　− ｍ的にはストリンジェント条件で上記の（ａ）又は（ｂンのＤＮＡ配列にハイブ リダイズし、がつＰＬＣの少なくとも１個の生物学的活性を示すポリペプチドを 生産するＤＮＡ配列（例えばその他のクロストリジウム（Ｃ］ｏｓｔｒｊ＋Ｈｕ ｓ）種由来の）、からなる群から選ばれるＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡセグメ ントとの単離に関する。天然の、もしくは変更させた遺伝子配列をコードするも のを含むハイブリダイズ配列は通常、以下の表に示す遺伝子配列の同様の大きさ の領域に対し、少なくとも約５０〜６０％、好ましくは８５〜９０％以上の相同 性を有する。

第２表 第２表（続き） 第２表（続き） Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　 Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｌａ　にＩｙ　ＴｂｒＡｓｐ　Ａｓｐ　７ｙｒ　Ｍ ｅｔ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｇ ａｙ　Ｌｙｓ　ＴｈｒＧｌｎ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　（＋Ｉｕ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ａ ｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　？Ｉｅｔ　Ｔｈｒ　ＧｌｙＳ ｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅａ　Ｌ ｙｓ　Ａｓｐ　ＧＪｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓｌｉｅ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　ｌｉ ｅ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｔｒｐ　ｌｉｅ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌ５ ／ｓ　Ｔｙｒ　ＴｈｒＡｌａ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｈａ　Ｔｙｒ　Ｌｙ ｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　ｌｉｅ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　ＡｌａＡｓｎ 　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｖａｌνａｌ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　ｆｌｅ　 Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ第３表 Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　 ｌｉｅ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　ＧａｙＬｅｕ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌ ｅｕ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｂｒ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ａｈａ　Ｔｒｐ　Ａ ｓｐ　Ｇｌｙ　ＬｙｓＬｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｂｒ　Ｈｊ ｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｈｊｓ　Ｇｌｙ　ＬｅｕＳｅｒ 　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ 　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌａ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ第３表（続き） 第３表（続き） 一般にこのＤＮＡセグメントは天然のプロモーター領域を含む、ＰＬＣコード配 列に機能的に結合する発現コントロールＤＮＡ配列を含む。この発現コントロー ル配列は原核性宿主細胞を形質転換又は形質導入し得るベクター中の原核性プロ モーター配列であることが好ましい。一度このベクターが適当な宿主中に組込ま れれば、この宿主をこの配列の高レベルの発現に適した条件下に維持し、ついで 望ましくはこのクロストリジウム　（Ｃ１ｏｓｔｒｊｄｉｕＩＩｌ）ＰＬＣポリ ペプチドの回収及び精製を行う。

本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の単離、精製したヌクレオチド配列に 基づく２個の推定されるアミノ酸配列を第■及び第■表に示す、第■表の最初の ２２個のアミノ酸及び第■表の最初の２３個のアミノ酸は分泌される成熟タンパ ク質のリーダー又はシグナル配列（矢印で示す）から期待されるように疎水性ア ミノ酸に冨んでいる。

種々のクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）由来の天然のＰＬＣクロス トリジウム（Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉｕａ）遺伝子がよく知られているノ入イプリダ イゼーション法により同定及び単離される０種々のＰＬＯ遺伝子間の相同性を区 別することから、／％イブリダイゼーション条件のイオン強度を種により調整し なければならない、ここで参考として引用する“核酸ハイブリダイゼーション” 　（実際的方法）、ヘイメス（ＨａＩＩｅｓ）及びハギンス（＋ｌａｇｇｉｎｓ ）　ｍ、ＩＲＬプレス、ワシントン、Ｄ、Ｃ，（１９８５）に一般的に述べられ ているノ１イプリダイゼーションバソファ及び操作を用いたフィルター７１イプ リダイゼーシヨン法が好ましい。

この“成熟”クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）　Ｐ　Ｌ　Ｃの本来 の形は、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種間により、配列中の１ 個以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加によりその長さが様々であること が分っている０種々の適切なりＮＡ配列が得られるクロストリジウム（Ｃ１ｏｓ ｔｒｉｄｉｕ＊）の一般的種には、Ｃ，パーフリンゲンス（ｐｅｒｆｒｉｎｇｅ ｎｓ）　、Ｃ，ビフエルメンタンス（ｂｉｆｅｒ−ｗｅｎｔａｎｓ）、　Ｃ，タ ーチウム（ｔｅｒｔｉｕｓ）及びＣ，スポロゲネス（ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、 　Ｃ，ノビ（ｎｏｖｙｉ）　＊　Ｃ、スプチカム（ｓｐｔｔｃｕｍ）及びＣ，ヒ ストリチカム（ｈｉｓＬｏｌｙｔｉｃｕｍ）が含まれる。これらの種のサンプル はアメリカンタイブカルチャーコレクシツンのような種々の提供源から入手し得 る（参考として引用する、“バクテリア、ファージ及びｒＤＮＡベクターのカタ ログ、第１６版（１９８５）ロックビル、メリランド、Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）。

これら天然のクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）　Ｐ　Ｌ　Ｏに加え 、その他のクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）　Ｐ　Ｌ　Ｃペプチド も当分野でよく知られている種々の組換えＤＮＡ技術を用いて容易に設計及び製 造し得る。例えばポリペプチドはアミノ酸置換、末端及び中間アミノ酸付加及び 欠失により一次構造レベルで変化し得る。別に、その−次構造の一部分のみを含 むポリペプチドフラグメントで１個以上のクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄ ｉｕｍ）　Ｐ　Ｌ　Ｃ活性（例えば、酵素活性）を含む一方免疫原性が低いフラ グメントも生成し得る。特に多くの遺伝子のように、クロストリジウム（Ｃｌｏ ｓｔｒｉｄｉｕｍ）　Ｐ　Ｌ　Ｃ遺伝子が各々１個以上の別個の生物学的活性を 有する別個の機能領域を含み得ることに注意が必要である。一般に遺伝子の修正 は天然の成熟クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）　Ｐ　Ｌ　Ｃの種々 の類似体及び誘導体を生成するのに使用し得る部位指定突然変異誘発（参考とし て引用する、ギルマン（Ｇｅｌｌｍａｎ）及びスミス（Ｓａ＋１ｔｈ）ジーン（ ｇｅｎｅ）　８．８１−９７　（１９７９）参照）などの種々の従来法で容易に 行ない得る。

バクテリアトキシンに加え、種の動物トキシンも本発明に従い使用し得る。治療 用のトキシンは、動物、特にヒトの膵臓ホスホリパーゼＡ、（例えば、−ユーウ ェンフィゼン（Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｚｅｎ）Ｗｌ等、メソッズ・イン−、Ｚン ザイモロジー（Ｍｅｔｈ−Ｅｎｚｙｍｏｌ−）３２８．１４７〜１５４．１９７ ４）が好ましい。蛇毒由来のホスホリパーゼ（例えばハチモリ（Ｈａｃｈｉｍｏ ｒｉ）、　Ｙ−等（１９７１）バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　１０ 　：　４０８４−４０８９）及びナジャナジャ（例えばサラチ（Ｓａｌａｃｈ） 　、Ｊ、１．等（１９６８）バイオケム・バイオフィズ・リサーチ・コミコニケ ーションミツバチ毒のメリチン（例えばアピスメリテラ；ヘイバーマン（Ｈａｂ ｅｒｍａｎｎ）　ｒ　Ｅ、及びジエンシュ（Ｊｅｎｔｓｃｈ）、Ｊ、　（１９６ ７）バイオケミカルＺ、　（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｚ、）が適している。° またホ乳類補体タンパク質及び細胞毒性Ｔリンパ球由来の細胞死滅化因子（例え ばパーホリン）も使用し得る。

明細書及び特許請求項で使用している“リンカ−′という言葉は毒性剤への特異 的結合剤の確実な結合を巾広く含んでいる。このような結合はペプチド結合によ る共有結合であることが好ましいが、共有結合のことも、非共存結合のこともあ る０両試剤の結合は直接的でもよいが、より一般的には、タンパク質Ａ又はＧな どのポリペプチド結合剤によって行なわれる。しかし、この共有結合は、各々の 試剤の本来の活性を実質的に妨害してはならない。

一般的に同成分はリンカ−による結合後、望ましい活性の約８０〜９０％、好ま しくは９５％以上を保持している。

以下に詳細に説明されているように、特異的結合剤が遺伝子レベルで毒性剤と結 合している、本発明の融合結合体を生産し得る。

例えば、形質転換細胞が、Ｆｃ領域をトキシンとしての機能を果す異種タンパク 質で置換った抗体を分泌する抗体／毒性側結合体を生産し得る（例えば、ニュー バーガー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ）、　Ｍ、　Ｓ。

等ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　３１２．６０４　（１９８４）（参考として 引用する））。

先に述べたように、リンカ−は死滅活性が増加するように種々の長さ及び構造を とり得るオリゴペプチド又はタンパク質でもよい（例えば、膜に隣接するトキシ ンの位置に依存して）、このリンカ−は切断されない方が好ましいが、この切断 は例えばインビボにおける結合体の寿命をコントロールすることが望ましい（補 体活性化などによる；参考として引用する米国特許第４，６７１．９５８号参照 ）、一般にオリゴペプチドは少なくとも長さが約１５Ａであり、かつ、約２から ５０以上の間のアミノ酸残基、好ましくは約６から２０個のアミノ酸残基を含ん でいる。このリンカ−には、。

グリシン、セリン又はスレオニン等のアミノ酸によるフレキシブル領域にはさま れる４個から６個のプロリンでできている硬い領域を含み得る。

本発明の結合体は紐換えＤＮＡ技術で生産されることが好ましく、かつ標準技術 により原核性又は真核性宿主細胞システムで発現し得る。望ましいポリペプチド をコードするポリデオキシヌクレオチドは以下に詳しく説明する遺伝子合成及び 遺伝子スプライシングの従来技術により構築し得る。

代表的結合体をコードする二本鎖ＤＮＡ構築物は、５′から３′の方向で以下の ように示し得る。

５’　（ＳＢＡコードＤＮＡ）　−（ＬコードＤＮＡ）　−（ＴコードＩＩＮＡ ）５′　ｃ丁コードＤＮＡ）　−（ＬコードＤＮＡ）　−（ＳＢＡコードＤＮＡ ）例えば試剤がペプチド結合している場合は、ＬコードＤＮＡは自由に選択でき る。従って、構築物はＳＢＡをコードする第１のＤＮＡ配列及びＴをコードする 第２のＤＮＡ配列を含み得、そして望ましい場合は、リンカ−オリゴペプチドＬ をコードするオリゴヌクレオチドは他の２つのＤＮＡ配列の間にはさまれる。ヌ クレオチドはこれら構築物の５′及び３′末端に付加し、ＤＮＡベクターへの構 築物の簡便な挿入のための制限酵素認識部位を提供し得る。最終的産物は、一般 式５ＢＡ（Ｌ）Ｔ又はＴ（Ｌ）ＳＢＡ（式中、カッコは自由に選択し得るリンカ −を示している）を有している。

ポリペプチド成分が天然のタンパク質である時、この結合体の領域をコードする ＤＮＡ配列は標準的遺伝子クローニング技術により得られるＤＮＡ配列を存する 細胞系列から入手し得る。望ましいポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が既知 の（例えばインターロイキン−２；米国特許第４，７３８．９２７号）、又は測 定（決定）され得る場合、そのポリデオキシヌクレオチドは、ホスホトリエステ ル法及びホスファイトトリエステル法等の標準法で合成し得る。免疫グロブリン 又はそのフラグメントをコードするＤＮＡは種々の起源から入手し得る（参考と して引用しているＥＰＡ８４３０２３６８．０参照）、この遺伝子はもし必要な 場合、付加的なりＮＡの短いセグメントにはさまれ、翻訳のための開始及び終止 コドンが提供され、並びに簡便な制限部位が提供される。

しかし、好ましいＤＮＡ構築物デザインは、この分子の種々の部分に対応する３ 個の′カセット“への、そのＤＮＡの容易な分離を可能にする（すなわち、ＳＢ Ａ’、Ｔ及びＬ　ＤＮＡセグメント）、このカセット構築物を用いることにより 、生成したタンパク質は、遺伝子レベルで容易に操作でき、生成するポリペプチ ド産物を簡単に修正し得る。

さらに、構築の際、個々のカセットに唯一存在する制限部位を含め、この分子の より短い部分への明確な切断を可能にする。このサブカセットフラグメントは容 易に切断及び再配列し、本発明の結合体をコードする別のＤＮＡ構築物を提供し 得る。

発現のための原核生物又は真核生物へのＤＮＡベクターの形質転換は、従来の方 法で行なわれる。望ましい結合体をコードするＤＮＡ構築物は宿主に適合する発 現コントロールシステム（の機能を保証する位置）に機能的に結合され、かつ宿 主細胞中で複製可能な、適当なりＮＡ発現ベクター上に配置される。

大腸菌は本発明のＤＮＡ配列をクローニングするための原核性宿主である。大腸 菌及びそれ以外の微生物宿主は本発明の成分の発現に使用され、これら宿主には 、バチルスサチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ５ｕｂｔｉＨｓ）等のバチルス、及びサ ルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）　、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）及び種々 のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種等の腸内細菌が含まれ得る。こ れらの原核性宿主において、一般に発現ベクターは、宿主細胞に適合する発現コ ントロール配列（例えば複製オリジン）を含む、さらに、ラクトースプロモータ ーシステム、トリプトフアン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、β−ラクタマー ゼブロモーターシステム、又はファージラムタのプロモーターシステム等、多種 多様のプロモーターが存在する。一般的にプロモーターは、ある場合にはプロモ ーター配列により発現をコントロールし、かつ転写及び翻訳の開始及び完了させ るリポソーム結合部位配列等を有している。

また、イースト等の微生物も発現に使用される。サフカロミセズ（Ｓａｃｅｈａ ｒｏｍｙｃｅｓ）は、プロモーター等の発現コントロール配列を有し、３−ホス ホクリセレートキナーゼ又はその他の解糖酵素及び複製オリジン、終止配列及び その他の望ましいものを含む適当なベクターに対して好ましい宿主である。

微生物に加えて、ホ乳類組繊細胞培養物も本発明のポリペプチドの生産に使用し 得る（参考として引用する、ウィナンカ−（何１ｎｎａｃｋｅｒ）　、”遺伝子 からクローンへ”、ＶＣＨ出版、Ｎ、Ｙ、Ｎ。

Ｙ、（１９８７）、多くの適当な細胞系列が開発され、それらには、ＣＨＯ細胞 系列、種々のＣＯ８細胞系列、ＨｅＬａ細胞、ミエローマ細胞系列等が含まれる 。これらの細胞に対する発現ベクターには、複製オリジン、プロモーター及びリ ボゾーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアゾニレ−ジョン部位及び 転写終止配列などの必須プロセンシング情報部位等の発現コントロール配列が含 まれ得る。好ましい発現コントロール配列にはＳＶ４０、アテノウイルス、ボビ ンパピローマウィルス、免疫グロブリン遺伝子等に由来するプロモーターがある 。

目的とするＤＮＡセグメント（例えばＰＬＣコード配列及び発現コントロール配 列）を含むベクターは、細胞性宿主のタイプに依存して異なる従来法により宿主 細胞に転移し得る。例えば一般に原核細胞には塩化カルシウムトランスフェクシ ョン法が用いられ、一方その他の細胞性宿主にはリン酸カルシウム処理が用いら れる。（一般的には、マニアチス　（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、モレキュラークロ ーニング、ラボラトリ−マニュアル、コールドスプリングハーバ−プレス（１９ ８２）（参考として引用する）参照）。

２個の結合体成分及びリンカ−の大きさに応じて、従来のポリペプチド技術を用 いてポリペプチドを合成することが望ましい（マンゴリン（Ｍａｎｇｏｌ　ｉｎ ）及びメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉａｌｄ）、アニュアル・レヴユー・オブ ・バイオケミストリー（Ａｎｎ、Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　３９．　８４１．　１９７０）。

結合体は、抽出、沈殿化、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマ トグラフィー、ＨＰＬＣ，電気泳動等の標準法により単離、精製される。理想的 には、この結合体は少なくとも約８５から９５％、好ましくは９８から９９％以 上の実質的純粋性を有している。

本発明の結合体を生産及び使用するのに有用な条件及び濃度は、文献の参照又は 単にルーチンな実験操作に従かい当業者により容易に決定し得る。

一般に、この結合は医薬的に適当なキャリヤーき共に精製物きして使用される。

一般的にこれらのキャリヤーには、塩又はバッファ媒体を含む水性又はアルコー ル／水性の溶液、エマルジョン又はサスペンションが含まれる。主ベヒクルには 塩化ナトリウム溶液、リンガーズデキストロース、デキストロース及び塩化ナト リウム、乳酸リンガーズオイル又は固定化オイルが含まれる。静脈ベヒクルには 、リンガーズデキストロース等に基づく液体及び栄養補給物等を含む０例えば、 抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス等の保存剤又は他の添加物も存在し 得る。一般的にはレミントン・ファーマシューティカル・サイエンス（Ｒｅｍｉ ｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｇ＋ａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）、第１６ 編、マフツ（Ｍａｃｋ）　編、１９８２（参考として引用する））を参照。

本発明の結合体は、別々に投与される組成物として、又は他の毒性剤と合せて使 用される。これらには抗悪性腫瘍薬（例えばビンデシン、メソトレキセート、ア ドリアマイシン、シスプラチナム等）、イムノトキシン等、種々の化学治療薬を 含み得る。医薬組成物には本発明の結合体と合せて種々の細胞毒性剤の°カクテ ル”を含み得る。

本発明の方法に従って調製した医薬組成物の投与経路は、通常当業者に知られて いるものである。

治療のため、制限化学療法を除いて、本発明の結合体は標注に従かい患者に投与 し得る。投与は、皮下、静脈、腹腔内注射又は、これも適当であるカテーテルを 用いた直接的注入により行なわれる。投与量及び頻度は患者の年令、性別及び症 状、他の薬剤との同時投与、カウンターインジケーション及び医師が判断するそ の他のパラメータに依存する。

選択される細胞群の少なくとも部分的阻害又は死滅を達成するのに適する量は“ 治療効果投与量”と定義される。この投与量を達成するのに必要とされる量は病 気の程度及び患者自身の免疫システムの一般的状態に依存するが、一般的には体 重キログラム当り約ｏ、ｏｏｓから約５．０ｍｇの結合体、より一般的には０． ０５〜２．０ｍｇ／Ｋｇ／投与の投与量範囲で使用される。

予防的使用に対して、本発明の結合体又はそのカクテルを含む組成物も同様もし くはわずかに低い投与量で投与される。

認識結合体組成物は予防的及び治療的に使用され病気の症状に依存して、感染生 物を含むホ乳類の巾広い所定の細胞群の死滅又は除去を助ける０例によると、本 発明の結合体の特異的結合タンパク質は腫瘍細胞、免疫細胞、ホルモン担当細胞 及び成長因子担当細胞、菌類、細菌、寄生虫又はウィルス感染細胞を認識し得る 。

別の態様において、ここで説明されている結合体は、不均一細胞集合体からある 細胞群を選択的に死滅、消滅又は効果的に除去するため、体外又はインビトロで 使用される。ホ乳類由来の血液を体外で結合体と合わせ、望ましくない細胞を死 滅又は血液から除き、再び標準技術を用いてホ乳類へ戻される。別の特徴には、 不均一細胞のインビトロ培養物を処理し、ここで説明している結合体を介して混 入する選択された細胞を死滅又は阻害することが　。

含まれる。

治療的用途に加え、この結合体は診断法及びインビボにおける他の目的のために 使用される０例えば、この結合体はあるリンパ球のみ（例えばＢ−又はＴ−細胞 ）を除去することが望まれる末梢血液細胞の検体において、又は同様に細胞培養 物において望ましくない細胞を除外するため、特定の細胞の死滅に使用し得る。

次に示す例は説明を目的とするもので、制限を意図するものではない。

実　験 （例　１） Ｃ，パーフリンゲンス（ＰＥＲＦＲＩＮＧＥＮＳ）由来のホスホリパーゼ遺伝子 のクローニング Ｃ，パーフリンゲンス（ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）　（Ａ　Ｔ　ＣＣ１３１２４ ）細菌細胞を遠心で集菌し、２５−Ｍトリス、ｐＨ８，０，１０閣ＭＥＤＴＡ、 ５（１＋Ｍグルコース、４ｍｇ／■ｌリゾチームに再懸濁した後２３℃、１０分 間インキュベートした。ＳＤＳを最終濃度０．２％、プロテアーゼＫを最終濃度 １００μｇ　／　ｍ　１となるように添加し、このサンプルを３７℃で４時間イ ンキュベートした。

このサンプルを等容量のフェノールで２回抽出した後、２倍容のエタノールを攪 拌せずに水層に加えた。ＤＮＡをガラス棒でかき回すことにより溶液から捲き取 り、’ｌｒａｇ／ｌａｎのＲＮａｓｅとインキュベートしてからフェノール抽出 を行った。その後エタノール沈殿してからＤＮＡを乾燥し、ＴＥバンファ（１（ １＋Ｍ）リス、ｐＨ７，４，１ｎＭＥＤＴＡ）に再懸濁した。染色体ＤＮＡをＨ ｉｎｄ　Ｉ［［又はＥｃｏＲＩで消化し、次に示すようにプラスミドｐＥＭＢＬ ８＋（参考として引用する、デンテ（Ｄｅｎｔｅ）等、ヌクレイフクアシッズリ サーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）１土、１６４５〜１６５５　（１ ９８３）の各制限部位にクローン化した。約５μｇの精製クロストリジウム（Ｃ ｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）　Ｄ　Ｎ　Ａを）（ｉｎｄ　ｍで消化した。そのサンプ ルをフェノール抽出後エタノール沈殿し、ＴＨに再懸濁した。約２μｇのｐＥＭ ＢＬ８＋ＤＮＡをＨｉｎｄ　ｍで消化後ＴＥバッファで５倍に希釈し、２．５ユ ニツトのウシ腸ホスファターゼを添加して、さらに１時間６５℃でインキュベー トした。このサンプルをフェノール抽出し、エタノール沈殿後ＴＥに再懸濁した ＊　Ｈｉｎｄ　Ｉ［［消化したクロストリジウム（Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉｕ■）及 びｐＥＭＢＬ　８　＋ＤＮＡを７４ＤＮＡリガーゼにューイングランドバイオラ ブス）を用いてライゲーションし、標準法（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等 、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−、コールドスプリングハーバ−、Ｎ Ｙ、１９８２年、２５０〜２５１）に従がいライゲートしたＤＮＡで大腸菌を形 質転換した。

同様の操作をＥｃｏＲＩについても行った。

Ｈｉｎｄ　ｍ及びＥｃｏＲＩで生成したプラスミドを大腸菌宿主叶１（ハナハン （Ｈａｎａｈａｎ）　（１９８３）ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ ジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｆｏｌ、）上６６．５５７−５８０）の形質転換に用 い、そのトランスホーマントを５０μｇ　／　ｍ　ｌアンピシリン及び１％（Ｖ ／Ｖ）ヒツジ赤血球を含むＬＢ寒天培地にブレーティングした。各ライブラリー から２０００個のトランスホーマントをスクリーニング後、溶血帯を作る計５個 のコロニーを単離した。

５個全ての単離物はフラグ（Ｋｒｕｇ）及びケント（Ｋｅｎｔ）　（上述）の方 法による検定でその細胞周辺腔にホスホリパーゼＣ活性を示した。コロニー中の ２種類のプラスミド（Ｈｉｎｄ　ｍ及びＥｃｏＲＩ　。

で生成した組換え体）の制限分析は、それらが挿入物中に共通する２、０キロベ ース（ｋｂ　）　ＥｃｏＲＩ　−Ｈｌｎｄ　ｍフラグメントを有していることを 示した。その後、この２．　Ｏｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−Ｈｉｎｄ■フラグメントを 詳細な制限及びＤＮＡ配列分析用にｐＥＭＢＬ８＋のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩ ［１部位の間にサブクローンした。生成したプラスミドｐ８ＰＬＣを保持する大 腸菌トランスホーマントは溶血性でかつその細胞周辺腔にホスホリパーゼＣ活性 を示す、このことはその遺伝子がこの２．０ｋｂフラグメント中に存在していた ことを示している。さらにＤＨＩ／ｐ８ＰＬＣの細胞周辺腔由来の浸透圧シａｙ り液（ノーサル（Ｎｏｓｓａｌ）及びヘラペル（Ｈｅｐｐｅｌ）、（１９６６） ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｂｅ ｓ、）２４１．　３０５５　２０６０）中に、４３０００ｋＤの分子量を有する 主タンパク質が存在する。このタンパク質は宿主細胞のシテソク液には存在しな い。

第■表は、天然クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）　Ｐ　Ｌ　Ｏと比 較して本発明のＰＬＣポリペプチド（非グリコジル化）由来のＰＬＣ酵素活性を 示している０組換え的に生成したポリペプチドは浸透圧ショックにより、形質転 換生物の細胞周辺腔から得た。細胞ペレフトは約２５０ａｌｌの培養物から得、 その細胞を５ａｌｌＭトリス・塩酸ｐＨ７，８で洗浄後遠心した。このペレット を４０％スクロースを含む洗浄バンファ２（Ｊａｎに再懸濁し、これにＥＤＴＡ を２ｍＭとなるように添加した。１０分後、この溶液を遠心し、細胞ペレフトを １０ａｌｌの冷水に再懸濁してから約１０分間氷上に放置した。この溶液を遠心 すると、上滑はシコック液が含まれている。

ＰＬＣ−アルカリホスファターゼ共役検定法を以下のように行った。

試薬 トリス−ＨＣｌ、０．４Ｍ、ｐＨ７，３，３７℃塩化カルシウム、５０−Ｍ ウシ血清アルブミン、１　ｍｇ／ａ１ ホスファチジルコリン、エタノール９１０ｍＭ硫酸アンモニウム、０．２Ｍ アルカリホスファターゼ（大腸菌、シグマ社、タイプｌｌｌ−３）１００μ１０ ．３鵬ｊ！　２．５Ｍ（ＮＨ４）ｚｓＯａサスペンションラウリル硫酸ナトリウ ム、２０％ アスコルビン酸−モリブデン酸試薬、１部の１０％アスコルビン酸及び６部のＩ 　Ｎ　１ｈｓＯＪ中０．４２％モリブデン酸アンモニウム 操作 試薬を次の順番及び指示されている最終濃度となるように加える（最終容積４０ μｊり；５０ｍＭトリスーＨＣ１，６，３腸Ｍ塩化カルシウム、０．１３鵬ｇ　 ／　ｍ　１ウシ血清アルブミン、２．５霧Ｍホスファチジルコリン、７０纏Ｍ硫 酸アンモニウム（アルカリホスファターゼサスベンジッンに寄因する硫酸アンモ ニウム量を含む）、０．１５ユニツトのアルカリホスファターゼ及び０．１〜１ ×１０−３ユニツトのホスホリパーゼＣ，ルーチンにはホスホリパーゼＣ以外の 全ての検定成分は１つの大きなサスベンジタンとして合せ、そしてその部分標本 を各検定用に取り出し得る。この検定混合物を振盪水槽中３７℃で１５分間イン キュベートする。その反応を４０μｌのラウリル硫酸ナトリウムの添加で停止し た後、２００μｌのアスコルビン酸−モリブデン酸試薬を添加し、４５℃で２０ 分間、又は３７℃で６０分間インキュベートする一８７０ｎｍの吸光度を測定す る。無機リン酸１゛ナノモルは、反応混合物ブランク吸光度０．０４０を差し引 いた正味約０．０４５の吸光度に対応する。ホスホリパーゼＣ活性は１ユニツト は１分間当りＬ口Ｏ１の無機リン酸を生成する量と定義される。

第■表 ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）検定 ２、　Ｏｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−Ｈ３ｎｄ　ｍフラグメントの配列分析（サンガー 　（Ｓａｎｇｅｒ）等、（１９７７）プロシーディング・イン・ナショナル・ア カデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 ）ＵＳＡ７４　：　５４６３　：　５４６７）は、Ｈｉｎｄｌｎ７ラグメント半 分中に１１９６塩基対（ｂ　ｐ）の読み枠が存在することが明らかになった（第 ■表）、その配列は２２個のアミノ酸の推定シグナルペプチド及び３７７個のア ミノ酸の成熟タンパク質をコードしており、そのアミノ酸組成は先の報告（フラ ッグ（Ｋｒｕｇ）及びゲント（Ｋｅｎｔ）上述）と一致する。

（例　２） Ｃビフアーメンタンス（ＢＩＦＥＲＭＥＮＴＡＮＳ）由来のホスホリパーゼＣの クローニング Ｃ，ビフアーメンタンス（ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）　（Ａ　Ｔ　ＣＣ６３８ ）細胞を調製し、例１と同様にＤＮＡを抽出した。それからその染色体ＤＮＡを ＥｃｏＲＩで消化し、ＧｇｔｌＯアーム（ストラタジーン社）のＥｃｏＲ１部位 にクローン化してからバンキングした（バイン（Ｈｕｙｎｈ）等、（１９８４） ＤＮＡクローニングテクニ７り、実践技術、デビットグローバー（Ｄａｖｉｄ　 Ｇｌｏｖｅｒ）　＆Ｗ、ＩＲＬプレス版、オックスフォード５０−７０　（参考 として引用する））。

このゲノムライブラリーを大腸菌宿主Ｃ６００Ｈｆｌ上にブレーティングし、プ ローブとして先にクローニングしたＣ、バーフリンゲンス（ｐｅｒｆｒｉｎｇｅ ｎｓ＞ホスホリパーゼＣ遺伝子を用いたプラークハイブリダイゼーションにより スクリーニングした（ベントン（Ｂｅｎｔｏｎ）及びデービス（Ｄａｖｉｓ）　 （１９７７）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）１９６．１８０〜１８２）、ハイブ リダイゼーションは、５ｘＳＳＣ１５０％ホルムアミド／ＩＸデンハー）１０． ２％５ＤＳ１０、１　ｍｇ／ｗ　ｌウシ胸腺ＤＮＡ、３０℃で１晩行った。２０ ００個のプラークをスクリーニング後、プローブがハイブリダイズした計２０倍 のプラークを単離した。これら全てのプラークは２．５ｋｂのＥｃｏＲＩ挿入物 を含み、後にこれをｐＥＭＢＬ８＋にサブクローンしてプラスミドｐｃＢＰＬｃ １を生成した。制限及びサウザーン分析はＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌ［［で消化 し、そのフラグメントをアガロースゲルで分画後、分離したフラグメントをニト ロセルロースに転移させることにより行った（サウザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ＞ のＤＮＡに二フクトランスレーションにより、先にクローン化したＣ、パーフリ ンゲンス（ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）遺伝子から調製した放射性プローブをハイ ブリダイズした。　０．８３　ｋｂ　Ｈ４ｎｄ　ｍ−ＥｃｏＲＩフラグメントの みがハイブリダイズした。このことは、Ｃ，バーフリンゲンス（ｐｅｒｆｒｉｎ ｇｅｎｓ）ホスホリパーゼＣ遺伝子に関する配列が、挿入物末端のこのフラグメ ント中にのみ存在することを示している。このフラグメントのＤＮＡ配列分析は 、事実このフラグメントがホスホリパーゼＣコード配列の一部を含んでいるが、 ＥｃｏＲ１部位で切り取られていることが明確にした。そのため、失なわれたコ ード配列を単離するため第２のゲノムライブラリーを作った。

この第２ライフ゛ラリ−はＣ，ビフアーメンタンス（ｂｊｆｅｒｍｅｎ−ｔａｎ ｓ）由来のＨｉａｄｍ消化染色体ＤＮＡをｐＵＣのＨｉｎｄｌ［［部位にクロー ニングすることにより作成した（参考として引用する、ノランダー（Ｎｏｒｒａ ｎｄｅｒ）等、（１９８３）ジーン（Ｇｅｎｅ）　２６．１０１〜１１０）、組 換えプラスミドを含む大腸菌トランスホーマントをプローブとしてｐｃＢＰＬｃ １由来の０．８３　ｋｂ　Ｈｉｎｄｍ−ＥｃｏＲＩフラグメントを用いたコロニ ーハイブリダイゼーシッン（フラツグ−（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ）　Ｊ　０等、上 述）によりスクリーニングした。２０００個のトランスホーマントから、そのプ ローブにパイプリダイズする７個のコロニーを単離した０代表的なものをｐＣＢ ＰＬＣ２と命名した。これらコロニー中の全てのプラスミドは・その挿入物中に ５．２ｋｂ　Ｈｉｎｄ　ｍフラグメントを含んでいる。染色体中のｐＣＢＰのＥ ｃｏＲＩ挿入物に隣接する１、ＯｋｂのＥｃｏＲ１フラグメントをＰＣＢＰＬＣ ２からｐｃＢＰＬｃｌにサブクローンし、ホスホリパーゼＣ遺伝子全体を再構成 した。生成したプラスミドをｐＣＢＰＬＣ３と呼ぶ、ｐＣＢＰＬＣ３中のホスホ リパーゼＣの全コード配列を第１表に示す、この遺伝子は、シグナルペプチドに 相当する約３０個のＮ末端残基とともに３７７個のアミノ酸残基のタンパク質を コードしている。

Ｃ，パーフリンゲンス（ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）及びＣ，ビフアーメンタンス （ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のホスホリパーゼＣタンパク質は、全アミノ酸に 関して５１％の相同性がある。２つの遺伝子はヌクレオチドレベルで６４％の相 同性がある。

（例　３） ＰＬＣ突然変異体の構築 完全なりロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｓｐｅｒｆ ｒｉｎｇｅｎｓ）のＰＬＣ遺伝子を含むプラスミドｐ８ＰＬＣのＤＮＡを、ＰＬ Ｃ配列（第■表）のヌクレオチド７６〜８１に存在する唯一のＡｃｃＩ部位で切 断した。その末端をポリメラーゼＩのクレノーフラグメントを用いて充填した。

入匝リンカ−にューイングランドバイオラブス）をポリヌクレオチドキナーゼで 処理後Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてプラスミドＤＮＡ切断物にライゲーションし た。ライゲーションしたＤＮＡをＸｂａｌで切断し、１％アガロースゲルに流し た。線状プラスミドＤＮＡをアガロースから精製し、再びライゲーションしてか ら大腸菌に形質転換した。

コロニーをピックアンプし・プラスミドを精製（ｐ８ＰＬＣ−Ｘｂａと命名する ）した後、Ｘｂａｌリンカ・−挿入物付近の配列決定を行った。この構築物には 、アミノ酸２６番のＶａｌの欠失及び欠失部位への４個のアミノ酸、ｃｌｙ、　 Ｓｅｒ＋　Ａｒｇ及びＡｌａの挿入がある。この突然変異体タンパク質を精製し 検定した。これらの活性には正常なＰＬＯとの差が検出されなかった。

プラスミドｐ８ＰＬＣのＤＮＡを、ＰＬＯ遺伝子の上流約８００ヌクレオチドを 切断するＥｃｏＲＩで切断した。この切断プラスミドを、切断により生じたＤＮ Ａ末端から順次ヌクレオチドを除去するヌクレアーゼＢａ１３１で処理した。こ のＤＮＡをクレノーフラグメントで充填し、Ｘ　ｂａ　Ｉリンカ−とライゲーシ ョン後ＨｉｎｄｍとＸｂａｌで切断し、ＰＬＣ遺伝子の末端を切断した。このＤ ＮＡをアガロースゲルに流し、ＰＬＯ遺伝子の始めから０〜１００ヌクレオチド 除去した大きさのＸｂａ　１−　Ｈｉｎｄ　ｍフラグメントを単離した。これら のフラグメントをｐ８ＰＬＣ−Ｘｂａフラグメントの大きい方のＸｂａ　１−　 Ｈｉｎｄ　ｍフラグメントとライゲージシンし、大腸菌の形質転換に用いた１種 々のコロニーからＤＮＡを抽出し、Ｘｂａ部位付近の配列を決定した。

（例　４） 突然変異体の溶血活性 さらに研究を行うため２つの突然変異体を選択した。１つの突然変異体ＲＩＣＨ ｙｂ−３の場合、＋＋８ＰＬＣ−Ｘｂａ中の変異したＰＬＯ遺伝子をさらにアミ ノ酸２７−３０　、Ｔｙｒ　Ａｈａ　Ｔｒｐ　Ａｓｐの欠失により変化させた。

別の突然変異体ＲＩＣＨｙｂ−９の場合、アミノ酸２７−３５、Ｔｙｔ・・・・ ・・Ｇｌｙを欠失させた。変異体のＰＬＣタンパク質の溶血活性は各々正常ＰＬ Ｃタンパク質の約１０倍及び５０倍減少した。

先に述べたことから、単離したＤＮＡ配列はクロストリジウム（Ｃ１ｏｓｔｒｉ ｄｉｕ−）ホスホリパーゼＣポリペプチドの実質的量の安定かつ経済的生産の改 善手段を提供する０重要なことに、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ）ホスホリパーゼＣ産物は実質的に天然のクロストリジウム（Ｃ１ｏｓｔｒｉｄ ｉｕ−）タンパク質を含むことなく生産される。

（例　５） ＰＬＯ−タンパク質Ａ融合物遺伝子の構築Ｃ，バーフリンゲンス（ｐｅｒｆｒｉ ｎｇｅｎｓ）ホスホリパーゼＣ遺伝子を遺伝子的にＳ、オーレウス（ａｕｒｅｕ ｓ）タンパク質Ａ遺伝子に融合するため、参考として引用するＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、 ２２３．０３７に報告されているインビトロ突然変異誘発法を用いて新しい制限 部位をＰＬＯ遺伝子の３′端に導入した。特に、ＰＬＯ遺伝子の９５０ｂｐのＢ ａｍＨＩ　−Ｈｉｎｄ　ｍフラグメントを報告されているようにプラスミドｐ８ ＰＬＣから単離し、ファージＭ１３ｍｐｌＯにサブクローンした。ＢａｍＨ１部 位に向って、ファージＤＮＡからＩＩＮＡ合成を開始するのに合成オリゴヌクレ オチドブライマーＣＮＣ（第１Ａ図）を使用した。この３８塩基のプライマーは ＰＬＣの３′端に相補的である。残りはＡｐａ　Ｉ　、５ＷＡａ　Ｉ　、　Ｅｃ ｏＲＩ　、　ＴＡＧ終止コドン及び）（ｉｎｄｌ［［部位を含むテールを形成す る。ＤＮＡを熱変性後、新しく合成されるＤＮＡ鎖の合成を開始するのに、もう １つのオリゴヌクレオチドブライマーにューイングランドバイオラブス、＃１２ ０１）を使用した。Ｂａ＋ｓＨｉによる消化により、ＰＬＯ遺伝子の３′端及び それにつづく導入された制限部位を含む９５０ｂｐの突然変異を受けたフラグメ ントを放出した。

このフラグメントを挿入するベクターを以下のように構築した。

ｌ）全ＰＬＣ遺伝子と、そのプロモーター及びシグナル配列を含む２、Ｏｋｂの ＥｃｏＲ１−Ｈｉｎｄ　ｍフラグメントをｐ８ＰＬＣから単離し、ｐＢＲ３２２ のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌ［１部位の間にサブクローンしてプラスミドｐＢＲ ＰＬｃ１を作製した。及び２）ｐＢＲＰＬｃｌをＥｃｏＲＩで消化し、クレノー フラグメントで充填後ライゲーションすることにより、このプラスミド中のＥｃ ｏＲ１部位を破壊した。この新しいプラスミドをｐＢＲＰＬｃｌと呼ぶ、このプ ラスミドをＢａｍＨＩ及びＰｖｕＩＩで消化し、９５０ｂＰの変異させたフラグ メントを両部位の間にクローン化し、ＰＬＯ遺伝子の本来の３′側半分を置き換 えた。このようにｐＢＲＰＬＣ２と呼ばれる新しいプラスミドは全ＰＬＣ遺伝子 とそれにつづいて導入制限部位Ａｐａ１．５ＩＩａｌ、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ｍを含んでいる。

プラスミドｐＥＺ２３３０８はＥドメインとそれにつづく２コピーのＩｇＧ結合 結合ドメインノドメインむ合成タンパクｉＡ遺伝子を含んでいる（参考として引 用する、エルシン（Ｎｉｌｓｓｏｎ）　ｒ　Ｂ。

等プロティンエンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｉｅｅｒｉｎｇ） （１９８７）上、１０７〜１１３）　、タンパク質ＡのＥ及び両Ｚドメインを含 む３６６ｂｐのＦｓｐ　Ｉ　−ＥｃｏＲｍフラグメントをｐＥＺＺ３３０Ｂから 単離し、ついでＰＬＯ遺伝子につづ＜　ｐＢＲＰＬＣ２のＳｍａ　Ｉ及びＥｃｏ Ｒ１部位の間にライゲーションした。タンパク質への一部を読み枠を同じくして 融合したＰＬＣ遺伝子を含む最終的構築物はｐＢＲＰＬＣＺＺと呼ぶ、連結領域 の配列を第２図に示す。

（例　６） ａ）プロリン−グリシンポジショナ−の構築ペプチドポジショナ−をコードする ＤＮＡセグメントをＰＬＣとタンパク質Ａの間のＡｐａＩ部位に挿入した。ポジ ショナ−Ｇｕｙ２Ｐｒｏ５ＧＩｙ２は２個の相補的オリゴヌクレオチドＣＮＣ１ ０及びＣＮＣＩＩ（第１Ｂ図）を合成することにより作った。これらをアニール し、Ａｐａｌで消化後ＰＬＯ及びタンパクＩＡＯ間のＡｐａ１部位にクローニン グした５Ａｐａ１部位自体はＣｒ１ｙＰｒｏをコードするので、連結部の最終的 配列は、ＧｌｙＰｒｏＧ１ｙ２Ｐｒｏ５Ｇ１ｙ２Ｐｒｏであった。同様にポジシ ョナ−はＧｌｙ２　Ｐｒｏｌ　ＯＧｌｙ２及びＧｌｙ２Ｐｒｏ５Ｇ］ｙ２Ｐｒｏ ５ＧＩｙ２の配列を有するものを作製した。

ｂ）ポリプロリンポジショナ−の構築 １０個以上のプロリンからなるボジシッナーを生産する戦術はプロリンコドンの 直列反復物を生成し得るオリゴヌクレオチドの重複による（第１Ｃ図）、ＯＣＴ 及びＣＣＡの修正はオリゴマーが最も安定となるような唯一の読み枠となるよう にアニールし得るように設計した。ＣＮＣ２５及びＣＮＣ２６は互いに反復的に アニールし得る。一度２個の外側のＷＰＳ１２及びＷＰＳ１３がアニールすると 伸長は停止する。ＷＰＳ１２及びＷＰＳ１３はプラスミドへの挿入に用いるＡｐ ａ１部位を含む。

まず、各々２００ｎｇのＣＮＣ２５及びＣＮＣ２６を９５℃、３分間でアニール し、ついでゆっくりと冷却する。その後ＡＴＰ。

ｄＮＴＰ、タレノーポリメラーゼ及びＴ４リガーゼ存在下、４０ｎｇのＷＰＳ１ ３及び２３ｎｇのＷＰＳを加えた。この混合物を１６℃、１晩でライゲーション 後、ＡｐａＩで消化した。このＤＮＡを５％アクリルアミドゲルで分画し、５Ｏ −２００ｂｐ間、及び２００ｂｐ以上のバンドを精製した。これをｐＢＲＰＬＣ ＺＺのＡｐａ１部位にライゲーションし、ついで融合タンパク質の存在に関する コロニーのスクリーニングを行った。スクリーニング操作はブルーム（Ｂｒｏｏ ｓｅ）　Ｓ　、及びギルバート（Ｇｉｌｌｂｅｒｔ）Ｗ、の方法（プロシーディ ング・イン・ナショナル・アカデミ−・オブサイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　５ｃｉ）ＵＳＡ、　７５．　２７４６　２７４９（１９７８） ）に基づき、かつそれは融合タンパク質のタンパク質Ａｔ＋ｉ域のアルカリホス ファターゼ結合１ｇＧを結合する能力に依存する。ポジティブコロニー由来のＤ ＮＡを組込まれたプロリン数を測定するため配列決定した。１つの挿入物はＧ１ ｙ２Ｐｒｏ４ＧＩｙ２をコードしていた。

Ｃ）ランダムポジショナ−の構築 長さ一定の組成ランダムポジショナ−を作るのに用いたオリゴヌクレオチドＡＣ Ｉを第１Ｄ図に示す、ＡＣＩはＡｐａｒ部位を含む固定配列の前後に４５個のラ ンダムヌクレオチドを含んでいた。

Ｍ　１３ユニバーサルブライマーをＡＣＩにアニールし、タレノーポリメラーゼ を用いて伸長することにより二本鎖ＤＮＡとした。

この混合物をＡｐａｌで消化し、５５ｂｐのフラグメントをゲルで精製してから ｐＢＲＰＬｃＺＺにう°イゲーション後、大腸菌の形質転換を行った。先に述べ たスクリーニング操作をＰＬＯ−タンパク質Ａ融合タンパク質を生産するバクテ リアコロニーのみを選択するのに用いた。ＡｐａＩ部位に起因するアミノ酸のた め、融合タンパク質の結合部は、配列Ｇ１ｙＰｒｏ　（ＸＸＸ）１５Ｇ］ｙＰｒ ｏを大腸菌からのＰＬＣ−タンパク質Ａ融合タンパク質の調製適当なプラスミド を有する大腸菌ＤＨＩ株を１００μｇ／ｗａｒのアンピシリンを含む１１のＮ９ 培地を用い、０Ｄ６００が０．８〜１．０となるまで増殖した。細胞を遠心で回 収し、６０Ｉ１１の５０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ρ１１７−８）で洗浄後、５０ｍ １２の４０％スクロース、５０閣Ｍトリス・ＨＣＩ、２ｓＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ ７８）に再懸濁した。この混合物を時々緩やかに振りながら２０℃で１０分間イ ンキュベートした。１５，０００Ｘｇ、３０分間の遠心後、ベレフト化した細胞 を５置！の氷冷水に再懸濁し、０℃で１０分間インキュベートした。細胞を１５ ０００ｘｇ、１０分間の遠心で除去し、抽出された細胞周辺腔タンパク質を含む 上清を５０ｍＭトリス・ＨＣｌ、ｐＨ７−８となるように調整した。

この細胞周辺腔抽出物を５０ｍＭ）リス１５０ｍＭ　Ｎａｃｌｐ）Ｉ８．０（） リス−ＮａＣ１）で平衡化した０、５■ｌのウサギＩｇＧアガロースカラム（シ グマ社）に通した。５−ｉのトリス−ＮａＣＲで洗浄後、結合したＰＬＯ−タン パク質Ａ融合タンパク質を１０（１＋Ｍグリシン（ｐＨ３，０＞で溶出した。２ ２５μ１０４１０４Ｏ０リス−ＨＣｊ！　（ｐＨ８，０）を含む試験中に４５０ ｐｊｔのフラクションを回収した。ＰＬＣ−タンパク質Ａの調製物は、５ＡＳ− ポリアクリルアミドゲル電気泳動につづくコマージ染色による見積りによると９ ０％以上の純度であった。

（例　８） 融合タンパク質−抗体免疫結合体の調製２００マイクログラムの抗体（参考とし て引用するＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ１８１．８６２参照）を最終体積７００μｌの５０ｍ Ｍ）リス−ＨＣｊ！　（ｐＨ８，０）　、１５０＠Ｍ　ＮａＣ１中４〜１０倍モ ル過剰量のＰＬＣ−タンパク質Ａ融合タンパク質と混合した。この混合物を０℃ ゛で２０分間インキュベートした。抗体に結合した融合タンパク質は５０ｍＭ） リス−ＨＣｊ！　（ｐＨ８，０）　、１５０＋＊Ｍ　Ｎａ１Ｊで平衡化したスー パーロース１２　（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）を用い、ファルマシアＦＰＬＣシステム に連結したゲル濾過クロマトグラフィーにより、遊離した融合タンパク質から分 離した０分離は、カラムフラクションのＡ２８０をモニターすることにより確認 した。免疫結合体の最終濃度はヒツジ赤血球に関する溶血検定により測定しく以 下参照）、ＰＬＣ■ｇ／ｍｌで表わした。

（例　９） ランダムポジショナ−融合タンパク質層の免疫結合体の小規模調製ＬＢ−ａｍｐ の一晩培養物を０Ｄ５５０が０．２となるようなカザミノ酸を補った１　０＋ｊ ！のＮ９−ａｍｐ培地の接種に用いた。細胞を３７℃でインキュベートし、それ らが０Ｄ５５０−１．０に到達してから１時間後収穫した。細胞周辺腔からの融 合タンパク質を抽出するためこの細胞ベレフトを１．０ｍｌの５０ｍＭ）リス− ＨＣＡ　（ｐＨ８，０）　Ｔ：洗浄し、８Ｋ、２５分間の遠心後、氷上１０分間 、２００μｌ氷冷水で浸透圧ショック処理を行ない、ついで１０に、１０分間の 遠心を行った。１０μｌのウサギＩｇＧアガロースカラム（シグマ）を用い、浸 透圧ショック液がらＰＬＣ−タンパク貧Ａタンパク質をバッチ精製した。ショッ ク液を室温、１時間でカラムに結合させた。このカラムを１００μｌの５０−Ｍ ）リス−ＨＣ１（ｐＨ８，０）　、５　（１＋Ｍ　ＮａＣｊ！で二回洗浄し、結 合したＰＬＣ−タンパク質Ａタンパク質を室温で５分間、５０μｉ！　１００ｍ Ｍグリシン−ＨＣｌ　（ｐＨ３，０）の処理で溶出した。

回収した上滑を２５．ｃ＋＃０２００ｍＭ）！ＪスーＨＣ１（ｐＨ８，０）で平 衡化した。

精製したタンパク質をコマージ染色ゲル上の観察及びブランドフォード検定法に より定量した。５０＋ｗＭｌ−リス−ＨＣｌ！　（ｐＨ８，０）　、１５０ｍＭ 　ＮａＣｊ、０．１　ｍｇ／ｍ　１ゼラチンバフフア中、氷上３０分間で３．５ μｇトキシンと２．１μｇ抗Ｔａｃ抗体とを結合した。ＲＰＭＩ培地を用い５倍 毎の連続希釈を行った。

（ｆ！ｉ　１０） ａ））リバンブル染色による細胞毒性検定１　ｍ　ｊ！　Ａンク塩溶液（Ｂａｎ ｋ’ｓ　５ａｌｔｓ）巾約ｌＸｌ０’個のＣＲ２−２細胞の部分標本を３７℃で ９０分間、トキシン又は抗体に結合したトキシン希釈物とともに、２４穴プレー ト中でインキュベートシた。ＰＢＳ中０．５％トリパンプル液１００ＩＪｊ！を 各ウェルに添加し、顕微鏡下で色素排除（生存を示す）する細胞を数えた。

ｂ）”Ｈ−ロイシン取込みによる細胞毒性検定５％ＦＣ３を補ったｌｓＪのＲＰ ＭＩ培地中、約ｌＸｌ０’個のＣＲ２−２細胞の部分標本を３７℃で１８時間、 トキシン又は抗体に結合したトキシンの希釈物とともに２４穴プレート中でイン キュベートした。各ウェルに５μｌＣｉの３Ｈ−ロイシン（アマ−ジャム、１７ １　Ｃｉ／ｍ閣０１ｅ）を添加し、この細胞をさらに４時間インキュベートした 、各ウェル由来の細胞を遠心により回収し、バンク塩溶液で１回洗浄した後、２ ００μｌの蒸留水に再慈濁して溶解した。８００μｅの冷１０％ＴＣＡを加えて タンパク質を沈殿させた。それからこのサンプルをグラスファイバーフィルター で濾過し、冷１０％ＴＣＡで洗浄してから計算した。

ｃ）”Ｈ−チミジン取込みによる抗体に結合したランダムボジシ！ナー融合タン パク質の細胞毒性検定 ９６六マイクロプレート中１０’細胞／ウエルのＣＲ２をＲＰＭＩ培地中、３７ ℃、７．５％ＣＣｈ雰囲気下で１晩、４２０ｎｇ／ｍ１及び、８４ｎｇ／ｍｆの 抗Ｔａｃ抗体に結合した融合タンパク質で処理した。翌日、１μＣｉの３Ｈ−チ ミジンを各ウェルに加え、この細胞を３７℃で４時間インキュベートした。ＰＨ Ｄ細胞収穫器（ケンブリッジテクノロジー社）を用いて細胞をグラスファイバー フィルター上に収穫し、取込まれたラベルを測定した。取込み率は（ｗＡ胞＋ト キシンｃｐｓ１　）　／　（細胞−トキシンｃｐｓ　）で計算した。

ｄ）　Ｐ　Ｌ　Ｏ−ポジショナーータンパク質入融合タンパク質の溶血検定 ヒツジ赤血球を低速遠心で回収し、等張ホウ酸バフフ１で２回洗浄した後（１３ （１＋Ｍ　ＮａＣｊ、　３．５ａＭ　Ｂ５ＢＯ３，１，５ｍＭＮａｔＢａＯｔ　 、１．２＋＋Ｍ　ＣａＣｊ！ｇ　ｓ　ｐ［Ｂ７．６）　、１％（Ｖ／Ｖ）となる ように同バッファに再！Ａ濁した。この１％赤血球サスベンジッン３００μｌを 、等張ホウ酸バッファ中３００ｐｊ！の融合タンパク質と混合した。この混合物 を３７℃で３０分間インキュベーシッン後、さらに０℃で３０分間インキュベー トした。細胞溶解は、遠心により細胞を除去し、つづいて上清のＡ３５０を計測 することにより測定した。

（例　１１） プロリン−グリシンポジショナ−融合タンパク質の結果ＰＬＣ−タンパク質Ａ、 　Ｐ　Ｌ　Ｃ−Ｇｌｙ２　Ｐｒｏ５　Ｇ１ｙ２−タンパク質ＡＳＰＬＣ−タンパ ク質Ａ−抗Ｔａｃ結合体及びｐＬｃ−ｃ＋ｙ２Ｐｒｏ５Ｇ１ｙ２−タンパク質Ａ −抗Ｔａｃ結合体の毒性を、種々の°　濃度のこれらタンパク質を、抗Ｔａｃ抗 体が結合するＣＲ２−２細胞とインキュベートすることにより比較した。９０分 後、残存する生細胞率をトリパンブルー色素排除試験で測定した（第３図）。

トキシン自体よりも結合したトキシンの方が細胞死滅は著しく、またＧ１ｙ２Ｐ ｒｏ５Ｇ１ｙ２ボジシッナーを含むトキシン結合体が最も毒性が強かった。５０ ％死滅率はＰ　Ｌ　Ｃ−Ｇ１ｙ２　Ｐｒｏ５　Ｇｌｙ２−タンパク質Ａのみの場 合、１．２５μｇＰＬＣ／ｓＪで観測され、一方ＰＬＯ−タンパク質Ａ−抗Ｔａ ｃ及びＰ　Ｌ　ＣＧ１ｙ２　Ｐｒｏ５Ｇ１ｙ２−タンパク質Ａ−抗Ｔａｃは各々 ３３倍（３７，５Ｈｇ／ｍｊり及び１８０倍（７Ｈｇ／ｍＡり低いＰＬＯ濃度で 標的細胞の５０％を死滅させた。抗ＴａｅへのＰＬＣの結合はＩＬ−２レセプタ ーを発現しないＣＥＭＩＩＩ胞への毒性を増加しなかった。これらの結果は抗Ｔ ａｃ抗体とＰＬＣとの結合は、それらが認識し得るＴ細胞系列への特異的毒性を 増加したことを示している。またこれらの結果はＧ］ｙ２Ｐｒｏ５Ｇ］ｙ２ポジ ショナ−が、抗Ｔａｃに結合したときにはＰＬＣ−タンパク質入融合タンパク質 の毒性を増加するが、結合していないときは増加しないことをことも示している 。

同様の毒性比較を、ＰＬＯとタンパク質Ａが配列ＧＩｙ２Ｐｒｏ５Ｇ１ｙ２　Ｐ ｒｏ５　Ｇ１ｙ２　（第４図）及びＧＩｙ２Ｐｒｏｌ　０Ｇｌｙ２をもつポジシ ョナ−によって結合しているＰＬＣ−タンパク質入−抗Ｔａｃ結合体について行 った６両方の場合において結合トキシンの毒性はトキシン自体よりも実質的に大 きく、またＧｌ）’２Ｐｒｏ５Ｇ］ｙ２ポジショナーを存するトキシン結合体と 同様であった。

トリパンブルー排除試験ではなく’Ｈ−ロイシン取込みにより細胞死滅の測定を 行っても、同様の結果が得られた（第７図）。

しかし、死滅の程度は、タンパク質合成従ってロイシン取込みが細胞死滅後も続 行することからこの方法で測定するといくぶん小さくなった。

（例　１２） ＭＡ２．１抗体の結果 これらの結果が抗Ｔａｃではない他の認識抗体についても適用することを確める ため、ＭＡ２．１抗体を用いた。この抗体は例えばＪＹ細胞表面のＨＬＡ分子に 結合する（ウニイス（Ｗａｙｓ）、Ｊ、及びバーハム（Ｐａｒｈａｍ）、Ｐｏ、 バイオケミカルジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｊ）２１６；４２３−４３２　（１９８３））、抗体は先に述べた方法でＰＬＣ −Ｇ１ｙ２Ｐｒｏ５Ｇｌｙ２−タンパク質入融合タンパク質に結合した。ＪＹ細 胞をマイクロプレートのウェルに分配しく５％ＦＣ３を含むＲＰＭＩ中ウェルつ り２Ｘ１０’細胞）、３７℃で２０時間、トキシン及び抗体に結合したトキシン の各希釈物とインキュベーションした。１μＣｉの３Ｈ−ロイシンを各ウェルに 添加し、３７℃で４時間インキュベーションした。３Ｈ−ロイシン取込みで測定 した約５０％の細胞死滅は、約１０μｇ　／　ｍ　ｊ！のＰＬＣ−Ｇ１ｙ２Ｐｒ ｏ５Ｇ１）’２−タンパク質Ａ及び約２８ｎｇ／＠ｆのＭＡ２．１抗体結合ＰＬ Ｃ−Ｇｌｙ２Ｐｒｏ５Ｇ１ｙ２−タンパク質Ａで観測された（第６図）、従って 、この結合トキシンは、ＪＹ細胞に対し、トキシン自体よりも約３５０倍も毒性 が強い。

（例　１３） ランダムポジショナ−融合タンパク質の結果抗Ｔａｃ及び種々のＰＬＣ−ランダ ムボジショナーータンパク質Ａ融合タンパク質結合体の毒性を、ＣＲ２−２細胞 と２つの濃度でインキュベートし、ついで上述のように３Ｈ−チミジン取込みに よる細胞死滅を測定することにより決定した（第７図）、３Ｈ−チミジン取込み 量は、抗Ｔａｃ抗体のみ（トキシンなし）を細胞。

とインキュベートした場合の値に対するパーセンテージで表わした。結果から、 抗Ｔａｃに結合後細胞に対して、Ｐｒｏ５より毒性が強い（より少ないチミジン 取込み）融合タンパク質を作る、いくつかのポジショナ−１特にＲＰ７、ＲＰ１ ９、ＲＰ２５及びＲＰ２９が示され、一方例えばＲＰ８などその他のものはＰｒ ｏ５と等しいか又はより小さい毒性を有することが示された。

本発明は明確な理解のため実例により詳細に説明してきたが、特定の変化及び修 正が請求の範囲を逸脱することなしに行い得ることは明白である。

浄書（古書：ユニ吏なし〉 融合タンパク質構築に使用するオリゴヌクレオチドＰＬＯ−タンパク質Ａ遺伝子 結合領域の？１ＩＦＩＧ＝２゜ Ｐｒｏ５　ＧＰＧＧＰＰＰＰＰＧＧＰ　、４３　．４３ＲＰ７　ＧＰＧＭＲＹＥ ＧＧＬＭＧＣＫＧＩＧＧＰ　−２５３４ＲＰ８　ＧＰＫＬＲＫＧεｌ５ＳＧＡＧ ＬＩＫＧＰ　、４４　．６５ＲＰ１９　ＧＰＧＮＴＲＣＥＲＴｒＴＬＩＳＡＰＧ Ｐ　、３３　．３４ＲＰ２５　ＧＰＬＴＡＰＰＨＬＧＦＲＲＣＥＰＬＧＰ　、２ ０　３０ＲＰ２９　ＧＰＮＧＡＡＣＳＲＦＳＲＧＡＳＥＸＧＰ　−２４３３ＦＩ Ｑ、ｊ。

手続補正書（方式） ％式％ ５、補正命令の日付　平成２年１２月１１日７、補正の内容　別紙のとおり 国際調査報告 １＋ｍｎｖｗＭい１１１１ｂｃａｂ。ＭＮ、邸８Ｂ１０４４９３

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. （１）認識成分が細胞膜構成物に結合し得、かつ毒性成分が細胞膜を損傷するこ とで細胞を死滅し得る、ポリペプチド毒性成分に結合したポリペプチド認識成分 を含む所定の細胞群を死滅し得る結合体組成物で、結合体の成分がペプチド結合 しているか、又は１個以上のアミノ酸を含むリンカーにより結合している組成物 。
2. （２）認識成分が成長因子である請求の範囲第１項記載の結合体組成物。
3. （３）膜構成物が成長因子に対するレセプターである請求の範囲第２項記載の結 合体組成物。
4. （４）腹構成物が本来Ｔ細胞及び、又はＢ細胞上に存在する請求の範囲第１項記 載の結合体組成物。
5. （５）認識成分が免疫グロブリンである請求の範囲第１項記載の結合体組成物。
6. （６）免疫グロブリンがキメラ型又はヒューマナイズ化免疫グロブリンである請 求の範囲第５項記載の結合体組成物。
7. （７）毒性成分が酵素である請求の範囲第１項記載の結合体組成物。
8. （８）酵素が細菌性又はホ乳類のタンパク質である請求の範囲第７項記載の結合 体組成物。
9. （９）酵素がホスホリパーゼＣ又はホスホリパーゼＡ２である請求の範囲第７項 記載の結合体組成物。
10. （１０）リンカーがペプチド結合で少なくとも１つの成分に結合している請求の 範囲第１項記載の結合体組成物。
11. （１１）患者に治療効果のある量の、請求の範囲第１、６又は９項記載の結合体 組成物を投与することを含む、患者中の特定の細胞を処理する方法。
12. （１２）ＤＮＡ構築物で、 ｉ）細胞表面構成物に結合し得る認識成分をコードする第１ＤＮＡセグメント、 及び ｉｉ）細胞膜で作用することにより、細胞を死滅し得る毒性成分をコードする第 ２ＤＮＡセグメント、 を含み、該ＤＮＡセグメントが２つの成分を含む単一のポリペプチドをコードす るＤＮＡ構築物。
13. （１３）少なくとも１個のリンカーアミノ酸をコードする第３ＤＮＡセグメント を含み、該第３ＤＮＡフラグメントが第１及び第２ＤＮＡセグメントの間に位置 する請求の範囲第１２項記載のＤＮＡ構築物。
14. （１４）第２ＤＮＡセグメントが酵素をコードする請求の範囲第１２項記載のＤ ＮＡ構築物。
15. （１５）第２ＤＮＡセグメントがホスホリパーゼＣポリペプチドをコードし、か つ、（ａ）第ＩＩ表及び第ＩＩＩ表のＤＮＡ配列又はそれらの相補鎖、 （ｂ）発現時に第ＩＩ表及び第ＩＩＩ表のポリペプチド配列をコードするＤＮＡ 配列又はその相補鎖、及び ｃ）（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮＡ配列、からなる 群から選ばれる請求の範囲第１４項記載のＤＮＡ構築物。
16. （１６）さらにコードセグメントに機能的に結合した発現コントロールＤＮＡセ グメントを含む請求の範囲１２、１３又は１５項記載のＤＮＡ構築物。
17. （１７）請求の範囲１２、１３又は１５項記載のＤＮＡ構築物でトランスフェク トした細胞。
18. （１８）細胞膜を損傷することにより細胞を死滅し得るポリペプチド毒性成分に 、１個以上のアミノ酸を含むリンカーにより結合した細胞膜構成物に結合し得る ポリペプチド認識成分を含む、特定の細胞群を死滅し得る結合体組成物。
19. （１９）リンカーが少なくとも１つの成分とペプチド結合している請求の範囲第 １８項記載の結合体組成物。
20. （２０）リンカ−分子が約５個から約２０個のアミノ酸からなるポリペプチドで ある請求の範囲第１８項記載の結合体組成物。
21. （２１）リンカ−分子がタンパク質Ａ又はそのフラグメントである請求の範囲第 １８項記載の結合体組成物。
22. （２２）認識成分が免疫グロブリンである請求の範囲第１８項記載の結合体組成 物。