JPH05304991A - Ｉｌ−２受容体重鎖に結合するポリペプチド - Google Patents
Ｉｌ−２受容体重鎖に結合するポリペプチドInfo
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- JPH05304991A JPH05304991A JP3256335A JP25633591A JPH05304991A JP H05304991 A JPH05304991 A JP H05304991A JP 3256335 A JP3256335 A JP 3256335A JP 25633591 A JP25633591 A JP 25633591A JP H05304991 A JPH05304991 A JP H05304991A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明はＩＬ−２レセプターβ鎖に結合し、
かつＩＬ−２とＩＬ−２レセプターβ鎖との結合を阻害
する活性を有するポリペプチド及び該ポリペプチドの製
造法、特に大腸菌による製造法である。 【効果】 本発明に係るポリペプチド及びそれを含有す
る免疫抑制剤は臓器移植時の拒絶反応の予防や自己免疫
疾患の治療に有用な薬剤である。
かつＩＬ−２とＩＬ−２レセプターβ鎖との結合を阻害
する活性を有するポリペプチド及び該ポリペプチドの製
造法、特に大腸菌による製造法である。 【効果】 本発明に係るポリペプチド及びそれを含有す
る免疫抑制剤は臓器移植時の拒絶反応の予防や自己免疫
疾患の治療に有用な薬剤である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒトＩＬ−２受容体重鎖
（以下、β鎖とする）に結合することにより、ヒトＩＬ
−２のヒトＩＬ−２受容体β鎖への結合を阻害する活性
を有する新規ポリペプチドに関する。本ポリペプチド
は、臓器移植時の拒絶反応の予防、自己免疫疾患の治療
に有用でかつ安全性の高い免疫抑制剤として利用しうる
物質である。
（以下、β鎖とする）に結合することにより、ヒトＩＬ
−２のヒトＩＬ−２受容体β鎖への結合を阻害する活性
を有する新規ポリペプチドに関する。本ポリペプチド
は、臓器移植時の拒絶反応の予防、自己免疫疾患の治療
に有用でかつ安全性の高い免疫抑制剤として利用しうる
物質である。
【０００２】
【従来の技術】臓器移植の外科的技術が著しく向上した
現在、臓器移植手術の成否は術後の移植片拒絶反応をい
かにして抑制できるかにポイントが絞られてきている。
拒絶反応は、生体が移植片を異物として認識し、それを
排除するために一連の免疫反応が惹起されることにより
生じる。そこで、従来より拒絶防止薬として、ステロイ
ド剤、アザチオプリン、メトトレキセート、６ーメルカ
プトプリンなどのいわゆる免疫抑制剤と呼ばれている薬
剤の投与が行われてきた。しかし、安全域が狭いこと、
あるいは効果が弱いことなどの理由で生着率の著しい向
上はみられなかった。ところが、近年開発されたサイク
ロスポリンＡの登場により、生着率は格段の向上をみら
れるようになった。しかしながら、サイクロスポリンＡ
には重篤な腎毒性があることが明らかとなり、その使用
の制限を与儀なくされてきている。したがって、より安
全で、かつ効果的な免疫抑制剤の開発が望まれてきてい
る。
現在、臓器移植手術の成否は術後の移植片拒絶反応をい
かにして抑制できるかにポイントが絞られてきている。
拒絶反応は、生体が移植片を異物として認識し、それを
排除するために一連の免疫反応が惹起されることにより
生じる。そこで、従来より拒絶防止薬として、ステロイ
ド剤、アザチオプリン、メトトレキセート、６ーメルカ
プトプリンなどのいわゆる免疫抑制剤と呼ばれている薬
剤の投与が行われてきた。しかし、安全域が狭いこと、
あるいは効果が弱いことなどの理由で生着率の著しい向
上はみられなかった。ところが、近年開発されたサイク
ロスポリンＡの登場により、生着率は格段の向上をみら
れるようになった。しかしながら、サイクロスポリンＡ
には重篤な腎毒性があることが明らかとなり、その使用
の制限を与儀なくされてきている。したがって、より安
全で、かつ効果的な免疫抑制剤の開発が望まれてきてい
る。
【０００３】さて、ＩＬ−２は、ヘルパーＴ細胞から産
生されるタンパク質であり、生体内においてキラーＴ細
胞の増殖や分化誘導、Ｂ細胞の分化誘導など、広汎な働
きを有している生体防御上非常に重要な因子である。臓
器移植や骨髄移植においては、移植片の生着の鍵を握る
と考えられている宿主対移植片反応（ＨＶＧ反応）、あ
るいは移植片対宿主反応（ＧＶＨ反応）に、ＩＬ−２な
どにより活性化されたキラーＴ細胞が深く関与している
ことが示されている。他方、自己免疫疾患は生体内での
免疫系のバランスがくずれ、生体自身を攻撃することに
より発症すると考えられており、その中でも特にＩＬ−
２をはじめとする免疫系に関与する因子の過剰産生、あ
るいはそれに対する過剰反応などがその大きな一因とな
っている可能性が高い。
生されるタンパク質であり、生体内においてキラーＴ細
胞の増殖や分化誘導、Ｂ細胞の分化誘導など、広汎な働
きを有している生体防御上非常に重要な因子である。臓
器移植や骨髄移植においては、移植片の生着の鍵を握る
と考えられている宿主対移植片反応（ＨＶＧ反応）、あ
るいは移植片対宿主反応（ＧＶＨ反応）に、ＩＬ−２な
どにより活性化されたキラーＴ細胞が深く関与している
ことが示されている。他方、自己免疫疾患は生体内での
免疫系のバランスがくずれ、生体自身を攻撃することに
より発症すると考えられており、その中でも特にＩＬ−
２をはじめとする免疫系に関与する因子の過剰産生、あ
るいはそれに対する過剰反応などがその大きな一因とな
っている可能性が高い。
【０００４】これらのことから、ＩＬ−２応答を選択的
かつ効果的に抑制することができれば、臓器移植時の拒
絶反応の予防や、自己免疫疾患の治療が可能となるもの
と考えられるようになった。事実、ＩＬ−２を結合する
受容体（以下ＩＬ−２レセプターと略する）を有してい
るＩＬ−２応答細胞を選択的に傷害することができる細
胞毒を結合させたＩＬ−２を、自己免疫疾患の動物モデ
ルの一つであるアジュバント関節炎ラットに投与すると
関節炎の発症が遅れ症状も軽くなり、またマウス同種心
臓移植時に投与すると移植心の拒絶が抑制されるという
報告もある（Proc. Natl.Acad.Sci.USA,８６巻、１００
８頁、1989年）。しかし、細胞毒を結合させたＩＬ−２
はその血中半減期が短く、効果をあげるためには大量に
投与する必要があり、それに伴う副作用が懸念される。
そこで、より安全でかつ有効なＩＬ−２応答を抑制でき
る薬剤の開発が望まれている。
かつ効果的に抑制することができれば、臓器移植時の拒
絶反応の予防や、自己免疫疾患の治療が可能となるもの
と考えられるようになった。事実、ＩＬ−２を結合する
受容体（以下ＩＬ−２レセプターと略する）を有してい
るＩＬ−２応答細胞を選択的に傷害することができる細
胞毒を結合させたＩＬ−２を、自己免疫疾患の動物モデ
ルの一つであるアジュバント関節炎ラットに投与すると
関節炎の発症が遅れ症状も軽くなり、またマウス同種心
臓移植時に投与すると移植心の拒絶が抑制されるという
報告もある（Proc. Natl.Acad.Sci.USA,８６巻、１００
８頁、1989年）。しかし、細胞毒を結合させたＩＬ−２
はその血中半減期が短く、効果をあげるためには大量に
投与する必要があり、それに伴う副作用が懸念される。
そこで、より安全でかつ有効なＩＬ−２応答を抑制でき
る薬剤の開発が望まれている。
【０００５】ところで、ＩＬ−２応答細胞上のＩＬ−２
レセプターは、ともにＩＬ−２との結合能を有する分子
量が約75,000のβ鎖と約55,000のα鎖の２つの糖タンパ
ク質分子からなることが知られている。それぞれの分子
とＩＬ−２との結合の解離定数は、α鎖の場合１０ー8
Ｍ、β鎖の場合１０ー9Ｍであるが、α鎖とβ鎖の両方の
分子が接してＩＬ−２との三者の会合体が形成された場
合には、解離定数が１０ー12Ｍという高親和性の結合と
なることが明らかとなっている。また、α鎖のみを発現
している細胞では、ＩＬ−２が結合してもなんら応答反
応が生じないが、β鎖、もしくはβ鎖とα鎖の両鎖を発
現している細胞では、ＩＬ−２の結合により様々な生理
活性が惹起されることから、ＩＬ−２の生理的機能が発
現されるためにはＩＬ−２レセプターのβ鎖の存在が必
須であると考えられるようになってきた。すなわち、Ｉ
Ｌ−２とβ鎖の結合を阻害できれば、ＩＬ−２に対する
応答が生じなくなるものと推定される。
レセプターは、ともにＩＬ−２との結合能を有する分子
量が約75,000のβ鎖と約55,000のα鎖の２つの糖タンパ
ク質分子からなることが知られている。それぞれの分子
とＩＬ−２との結合の解離定数は、α鎖の場合１０ー8
Ｍ、β鎖の場合１０ー9Ｍであるが、α鎖とβ鎖の両方の
分子が接してＩＬ−２との三者の会合体が形成された場
合には、解離定数が１０ー12Ｍという高親和性の結合と
なることが明らかとなっている。また、α鎖のみを発現
している細胞では、ＩＬ−２が結合してもなんら応答反
応が生じないが、β鎖、もしくはβ鎖とα鎖の両鎖を発
現している細胞では、ＩＬ−２の結合により様々な生理
活性が惹起されることから、ＩＬ−２の生理的機能が発
現されるためにはＩＬ−２レセプターのβ鎖の存在が必
須であると考えられるようになってきた。すなわち、Ｉ
Ｌ−２とβ鎖の結合を阻害できれば、ＩＬ−２に対する
応答が生じなくなるものと推定される。
【０００６】しかし、現在までＩＬ−２とＩＬ−２レセ
プターのβ鎖の結合を特異的に阻害する物質として、抗
ＩＬ−２レセプターβ鎖抗体以外には知られていない
（特開平２−１８５２７参照）。しかし、唯一知られて
いるこの抗体は、ウサギやマウスなどの異種動物を免疫
することにより得られた異種タンパク質であり、そのま
まの形でヒトに投与すると抗体に対する免疫反応が生じ
て、アナフィラキシーショックや血清病などの重篤な副
作用が起こったり、抗体の効果が減弱してしまうことが
想定され、残念ながら直ちに臨床に応用することは困難
である。このような異種動物の抗体を臨床応用する場合
の欠点を克服すべく、遺伝子工学的操作により抗原との
結合に直接関与しない抗体の定常領域（以下Ｃ領域と言
う）をヒトの抗体のＣ領域へと変換する技術が開発され
（Methods in Enzymology, 178巻, 459頁, 1989年）、
抗体の臨床応用への期待が高まってきている。
プターのβ鎖の結合を特異的に阻害する物質として、抗
ＩＬ−２レセプターβ鎖抗体以外には知られていない
（特開平２−１８５２７参照）。しかし、唯一知られて
いるこの抗体は、ウサギやマウスなどの異種動物を免疫
することにより得られた異種タンパク質であり、そのま
まの形でヒトに投与すると抗体に対する免疫反応が生じ
て、アナフィラキシーショックや血清病などの重篤な副
作用が起こったり、抗体の効果が減弱してしまうことが
想定され、残念ながら直ちに臨床に応用することは困難
である。このような異種動物の抗体を臨床応用する場合
の欠点を克服すべく、遺伝子工学的操作により抗原との
結合に直接関与しない抗体の定常領域（以下Ｃ領域と言
う）をヒトの抗体のＣ領域へと変換する技術が開発され
（Methods in Enzymology, 178巻, 459頁, 1989年）、
抗体の臨床応用への期待が高まってきている。
【０００７】一般に抗体を臨床に用いる場合、抗体に期
待する作用は大きく分けて以下の２つがある。１つは、
抗体が抗原と結合して免疫複合体となり、補体系や免疫
系細胞を動員することによる抗原の除去である。抗原が
細胞表面抗原などの場合がそれに当たる。この場合に
は、補体系などを動かすために抗体のＣ領域が不可欠
で、上記Ｃ領域をヒト型へ変換した抗体が有効である。
もう１つは、抗体の抗原への結合による抗原活性の抑
制、あるいは逆に抗原の活性化である。抗原が生理活性
物質やそのレセプターあるいは酵素などの場合がそれに
当たる。この場合には、抗体のＣ領域は必要ではない。
むしろ生体内投与した場合に血中を流れる抗原と免疫複
合体を形成して、抗原が細胞の場合には細胞の破壊が、
また抗原が可溶性抗原の場合には腎臓などにトラップさ
れて炎症が生ずる可能性があるため、Ｃ領域がない方が
好ましい訳である。。更に、可変領域（以下Ｖ領域とい
う）、Ｃ領域とも含む完全な抗体の分子量が１５０Ｋ〜
９００Ｋなのに対し、Ｖ領域のみからなる抗体の分子量
は約２７Ｋと小さく、生体内投与する場合に扱いやすい
という利点もある。
待する作用は大きく分けて以下の２つがある。１つは、
抗体が抗原と結合して免疫複合体となり、補体系や免疫
系細胞を動員することによる抗原の除去である。抗原が
細胞表面抗原などの場合がそれに当たる。この場合に
は、補体系などを動かすために抗体のＣ領域が不可欠
で、上記Ｃ領域をヒト型へ変換した抗体が有効である。
もう１つは、抗体の抗原への結合による抗原活性の抑
制、あるいは逆に抗原の活性化である。抗原が生理活性
物質やそのレセプターあるいは酵素などの場合がそれに
当たる。この場合には、抗体のＣ領域は必要ではない。
むしろ生体内投与した場合に血中を流れる抗原と免疫複
合体を形成して、抗原が細胞の場合には細胞の破壊が、
また抗原が可溶性抗原の場合には腎臓などにトラップさ
れて炎症が生ずる可能性があるため、Ｃ領域がない方が
好ましい訳である。。更に、可変領域（以下Ｖ領域とい
う）、Ｃ領域とも含む完全な抗体の分子量が１５０Ｋ〜
９００Ｋなのに対し、Ｖ領域のみからなる抗体の分子量
は約２７Ｋと小さく、生体内投与する場合に扱いやすい
という利点もある。
【０００８】抗体蛋白から抗体のＶ領域のみを製造する
には、抗体の重鎖（以下Ｈ鎖という）及び軽鎖（以下Ｌ
鎖という）のＶ領域を酵素分解によりそれぞれ得て、さ
らに何らかの方法によりそれらを結合させて機能的な抗
体Ｖ領域分子を作成しなければならないが、現在の技術
では効率よくしかも簡便に機能的な抗体Ｖ領域分子を製
造することは不可能である。
には、抗体の重鎖（以下Ｈ鎖という）及び軽鎖（以下Ｌ
鎖という）のＶ領域を酵素分解によりそれぞれ得て、さ
らに何らかの方法によりそれらを結合させて機能的な抗
体Ｖ領域分子を作成しなければならないが、現在の技術
では効率よくしかも簡便に機能的な抗体Ｖ領域分子を製
造することは不可能である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
はヒトＩＬ−２レセプターβ鎖に特異的に結合して、ヒ
トＩＬ−２レセプターβ鎖とＩＬ−２との結合を選択的
に阻害する活性を有する機能的な抗体Ｖ領域分子を含む
ポリペプチド、該ポリペプチドをコードする遺伝子、該
遺伝子を有するプラスミド、該プラスミドを有する形質
転換体、該形質転換体を培養して目的とするポリペプチ
ドを製造する方法及び該ポリペプチドを含有する免疫抑
制剤を提供することである。このポリペプチドは、臓器
移植時の拒絶反応の予防、アレルギー性疾患や自己免疫
疾患などの炎症性疾患の治療薬として有効な免疫抑制剤
として期待できる。
はヒトＩＬ−２レセプターβ鎖に特異的に結合して、ヒ
トＩＬ−２レセプターβ鎖とＩＬ−２との結合を選択的
に阻害する活性を有する機能的な抗体Ｖ領域分子を含む
ポリペプチド、該ポリペプチドをコードする遺伝子、該
遺伝子を有するプラスミド、該プラスミドを有する形質
転換体、該形質転換体を培養して目的とするポリペプチ
ドを製造する方法及び該ポリペプチドを含有する免疫抑
制剤を提供することである。このポリペプチドは、臓器
移植時の拒絶反応の予防、アレルギー性疾患や自己免疫
疾患などの炎症性疾患の治療薬として有効な免疫抑制剤
として期待できる。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意研究を重ねた結果、以下の方法によ
り、目的とするヒトＩＬ−２レセプターβ鎖とＩＬ−２
との結合を選択的に阻害する活性を有する機能的な抗体
Ｖ領域分子を含むポリペプチドを製造できることを見い
だし、本発明を完成した。即ち、本発明は（１）ＩＬ−
２レセプターβ鎖に結合活性を有し、かつ（２）ＩＬ−
２とＩＬ−２レセプターβ鎖との結合を阻害する活性を
有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードする遺伝
子、該遺伝子を有するプラスミド、該プラスミドを有す
る形質転換体、該形質転換体を培養して目的とするポリ
ペプチドを製造する方法及び該ポリペプチドを含有する
免疫抑制剤である。
解決するために鋭意研究を重ねた結果、以下の方法によ
り、目的とするヒトＩＬ−２レセプターβ鎖とＩＬ−２
との結合を選択的に阻害する活性を有する機能的な抗体
Ｖ領域分子を含むポリペプチドを製造できることを見い
だし、本発明を完成した。即ち、本発明は（１）ＩＬ−
２レセプターβ鎖に結合活性を有し、かつ（２）ＩＬ−
２とＩＬ−２レセプターβ鎖との結合を阻害する活性を
有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードする遺伝
子、該遺伝子を有するプラスミド、該プラスミドを有す
る形質転換体、該形質転換体を培養して目的とするポリ
ペプチドを製造する方法及び該ポリペプチドを含有する
免疫抑制剤である。
【００１１】本発明に従えば、ヒトＩＬ−２レセプター
β鎖とＩＬ−２との結合を選択的に阻害する機能的な抗
体Ｖ領域分子を有するポリペプチドが提供される訳であ
る。本研究者らはまずヒトＩＬ−２レセプターβ鎖に特
異的でかつヒトＩＬ−２レセプターβ鎖とヒトＩＬ−２
との結合を阻害する活性を有するマウスモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマクローンを作製した。以
下にマウス抗ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖モノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマクローンの調製法を記
す。
β鎖とＩＬ−２との結合を選択的に阻害する機能的な抗
体Ｖ領域分子を有するポリペプチドが提供される訳であ
る。本研究者らはまずヒトＩＬ−２レセプターβ鎖に特
異的でかつヒトＩＬ−２レセプターβ鎖とヒトＩＬ−２
との結合を阻害する活性を有するマウスモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマクローンを作製した。以
下にマウス抗ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖モノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマクローンの調製法を記
す。
【００１２】ハイブリドーマは骨髄腫細胞と抗体産生細
胞を融合することにより製造される。抗体産生細胞とし
ては、ＩＬ−２レセプターβ鎖分子を高発現しているヒ
ト成人Ｔ細胞白血病ウイルス感染Ｔ細胞株であるTL-Mor
細胞で免疫されたマウスやラットなどの動物からの脾臓
またはリンパ節細胞を用いればよい。なお、免疫する細
胞としては、TL-Mor細胞以外のＩＬ−２レセプターのβ
鎖分子を発現しているヒト細胞である限り、いかなる細
胞を用いてもかまわない。また、それらの細胞より精製
したβ鎖分子そのものを免疫原として用いてもさしつか
えない。
胞を融合することにより製造される。抗体産生細胞とし
ては、ＩＬ−２レセプターβ鎖分子を高発現しているヒ
ト成人Ｔ細胞白血病ウイルス感染Ｔ細胞株であるTL-Mor
細胞で免疫されたマウスやラットなどの動物からの脾臓
またはリンパ節細胞を用いればよい。なお、免疫する細
胞としては、TL-Mor細胞以外のＩＬ−２レセプターのβ
鎖分子を発現しているヒト細胞である限り、いかなる細
胞を用いてもかまわない。また、それらの細胞より精製
したβ鎖分子そのものを免疫原として用いてもさしつか
えない。
【００１３】抗体産生細胞と骨髄腫細胞の由来する動物
の種は、両細胞が融合可能な限り異なってもよいが、通
常同一種の細胞を用いた方が良い結果が得られる。本発
明実施のための一つの好ましいハイブリドーマは、ヒト
成人Ｔ細胞白血病ウイルス感染Ｔ細胞株であるTL-Mor細
胞で免疫したマウスの脾臓細胞またはリンパ節細胞と、
マウス骨髄腫細胞との間のハイブリドーマである。例え
ば、生理食塩水に懸濁したTL-Mor細胞で免疫したBalb/c
マウスの脾臓細胞とBalb/cマウスの骨髄腫細胞SP2/0-Ag
14の間のハイブリドーマで後記の実施例でも示す様に優
れた結果が得られた。骨髄腫細胞としては、SP2/0-Ag14
のほかに、X63-Ag8-6.5.3, P3-X63-Ag8-U1,P3-X63-Ag8,
P3-NSI/1-Ag4-1, MPC11-4.5.6.TG.1.7, （以上マウス
細胞）、210.RCY.Ag1.2.3 （ラット細胞）、SK0-007,GH
15006TG-A12 （以上ヒト細胞）等の８アザグアニン耐性
の細胞株を用いてもよい。ハイブリドーマの作成と、更
にその中からＩＬ−２レセプターのβ鎖分子に結合し、
ＩＬ−２の生理活性を阻害できるモノクローナル抗体を
産生しているクローンの選択は、例えば次の様にして行
える。ポリエチレングリコール、あるいはセンダイウイ
ルスなどを用いて抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合さ
せる。融合したハイブリドーマのみが、ヒポキサンチ
ン、チミジン、アミノプテリンを含む培地（ＨＡＴ培
地）中で生育することができる。得られたハイブリドー
マがすべて抗体を産生しているわけではないし、抗体を
産生しているハイブリドーマがすべて目的とする抗体を
産生しているわけではないので、それらのハイブリドー
マクローンの中からＩＬ−２レセプターのβ鎖分子に結
合し、ＩＬ−２の生理活性を阻害できるモノクローナル
抗体を産生しているハイブリドーマクローンを選択しな
ければならない。
の種は、両細胞が融合可能な限り異なってもよいが、通
常同一種の細胞を用いた方が良い結果が得られる。本発
明実施のための一つの好ましいハイブリドーマは、ヒト
成人Ｔ細胞白血病ウイルス感染Ｔ細胞株であるTL-Mor細
胞で免疫したマウスの脾臓細胞またはリンパ節細胞と、
マウス骨髄腫細胞との間のハイブリドーマである。例え
ば、生理食塩水に懸濁したTL-Mor細胞で免疫したBalb/c
マウスの脾臓細胞とBalb/cマウスの骨髄腫細胞SP2/0-Ag
14の間のハイブリドーマで後記の実施例でも示す様に優
れた結果が得られた。骨髄腫細胞としては、SP2/0-Ag14
のほかに、X63-Ag8-6.5.3, P3-X63-Ag8-U1,P3-X63-Ag8,
P3-NSI/1-Ag4-1, MPC11-4.5.6.TG.1.7, （以上マウス
細胞）、210.RCY.Ag1.2.3 （ラット細胞）、SK0-007,GH
15006TG-A12 （以上ヒト細胞）等の８アザグアニン耐性
の細胞株を用いてもよい。ハイブリドーマの作成と、更
にその中からＩＬ−２レセプターのβ鎖分子に結合し、
ＩＬ−２の生理活性を阻害できるモノクローナル抗体を
産生しているクローンの選択は、例えば次の様にして行
える。ポリエチレングリコール、あるいはセンダイウイ
ルスなどを用いて抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合さ
せる。融合したハイブリドーマのみが、ヒポキサンチ
ン、チミジン、アミノプテリンを含む培地（ＨＡＴ培
地）中で生育することができる。得られたハイブリドー
マがすべて抗体を産生しているわけではないし、抗体を
産生しているハイブリドーマがすべて目的とする抗体を
産生しているわけではないので、それらのハイブリドー
マクローンの中からＩＬ−２レセプターのβ鎖分子に結
合し、ＩＬ−２の生理活性を阻害できるモノクローナル
抗体を産生しているハイブリドーマクローンを選択しな
ければならない。
【００１４】その選択は例えば以下の様な方法を用いて
行うことができる。すなわち、一次スクリーニングとし
て125Ｉ標識ヒトＩＬ−２を作成し、ハイブリドーマ培
養上清による125Ｉ標識ヒトＩＬ−２と、ＩＬ−２レセ
プターのβ鎖分子，及びα鎖分子をともに発現している
TL-Mor細胞との結合阻害を測定する。二次スクリーニン
グとして、ハイブリドーマ培養上清による125Ｉ標識ヒ
トＩＬ−２と、ＩＬ−２レセプターのα鎖のみを発現し
ているヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス感染Ｔ細胞株であ
るMT-1細胞との結合阻害活性を測定する。TL-Mor細胞と
ＩＬ−２との結合阻害活性を有しており、MT-1細胞とＩ
Ｌ−２との結合阻害活性を有していなければ、そのハイ
ブリドーマがＩＬ−２レセプターのβ鎖分子に対する抗
体を産生しているハイブリドーマとなる。
行うことができる。すなわち、一次スクリーニングとし
て125Ｉ標識ヒトＩＬ−２を作成し、ハイブリドーマ培
養上清による125Ｉ標識ヒトＩＬ−２と、ＩＬ−２レセ
プターのβ鎖分子，及びα鎖分子をともに発現している
TL-Mor細胞との結合阻害を測定する。二次スクリーニン
グとして、ハイブリドーマ培養上清による125Ｉ標識ヒ
トＩＬ−２と、ＩＬ−２レセプターのα鎖のみを発現し
ているヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス感染Ｔ細胞株であ
るMT-1細胞との結合阻害活性を測定する。TL-Mor細胞と
ＩＬ−２との結合阻害活性を有しており、MT-1細胞とＩ
Ｌ−２との結合阻害活性を有していなければ、そのハイ
ブリドーマがＩＬ−２レセプターのβ鎖分子に対する抗
体を産生しているハイブリドーマとなる。
【００１５】125Ｉ標識ヒトＩＬ−２の作成法として
は、ＩＬ−２が生理活性を有している限り、ボルトン・
ハンター法、ラクトパーオキシダーゼ法、クロラミンー
Ｔ法などいかなる方法を用いてもかまわない。また、一
次スクリーニングに用いる細胞は、β鎖、及びα鎖をと
もに発現しているヒト細胞である限り、いかなる細胞を
用いてもかまわない。また、二次スクリーニングに用い
る細胞も、β鎖、あるいはα鎖のいづれか一方を発現し
ているヒト細胞である限り、いかなる細胞を用いてもか
まわない。
は、ＩＬ−２が生理活性を有している限り、ボルトン・
ハンター法、ラクトパーオキシダーゼ法、クロラミンー
Ｔ法などいかなる方法を用いてもかまわない。また、一
次スクリーニングに用いる細胞は、β鎖、及びα鎖をと
もに発現しているヒト細胞である限り、いかなる細胞を
用いてもかまわない。また、二次スクリーニングに用い
る細胞も、β鎖、あるいはα鎖のいづれか一方を発現し
ているヒト細胞である限り、いかなる細胞を用いてもか
まわない。
【００１６】こうして得られたハイブリドーマクローン
よりtotalＲＮＡを抽出し、モノクローナル抗体のＶ領
域をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）を取得する。本発明
者らはより迅速に目的とするｃＤＮＡを取得する方法を
鋭意工夫し、以下の様な方法により抗体のＶ領域をコー
ドするｃＤＮＡを取得した。すなわち、まず既に遺伝子
の塩基配列が報告されているマウスＩｇＧのＨ鎖、及び
Ｌ鎖の塩基配列を基に、それぞれのＶ領域の遺伝子の
５'端、及び３’端に共通性の高い２０〜３０個の塩基
配列（プライマーＤＮＡ）を考案する。その際、５’側
プライマーは５’側から３’側の方向にデザインし、Ｌ
鎖Ｖ領域プライマーに、翻訳開始コドンであるＡＴＧ配
列をその５’側に付加する。３’側プライマーはＡＴＧ
配列を付加しなかった鎖、即ちＨ鎖のプライマーに翻訳
終止コドンをその３’側に付加する。３’側プライマー
の場合には、その相補的配列を３’側から５’側へ向か
ってデザインし直せばよい。もちろん、Ｈ鎖Ｖ領域プラ
イマーの５’側にＡＴＧ配列を付加し、Ｌ鎖Ｖ領域にプ
ライマーに３’側に終止コドンを付加しても良い。終止
コドンとしてはTAA,TAG,TGAのいずれを用いても良い。
尚、本発明の実施例に於いては、終止コドンとしてTGA
を用いた。次にＨ鎖及びＬ鎖のそれぞれのプライマーＤ
ＮＡの５’側（３’側プライマーはデザインし直したも
のの５’側）に、発現ベクターに挿入するための適当な
制限酵素サイトを導入しておく。 デザインしたプライ
マーＤＮＡはＤＮＡ合成機などを用いて化学合成する。
よりtotalＲＮＡを抽出し、モノクローナル抗体のＶ領
域をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）を取得する。本発明
者らはより迅速に目的とするｃＤＮＡを取得する方法を
鋭意工夫し、以下の様な方法により抗体のＶ領域をコー
ドするｃＤＮＡを取得した。すなわち、まず既に遺伝子
の塩基配列が報告されているマウスＩｇＧのＨ鎖、及び
Ｌ鎖の塩基配列を基に、それぞれのＶ領域の遺伝子の
５'端、及び３’端に共通性の高い２０〜３０個の塩基
配列（プライマーＤＮＡ）を考案する。その際、５’側
プライマーは５’側から３’側の方向にデザインし、Ｌ
鎖Ｖ領域プライマーに、翻訳開始コドンであるＡＴＧ配
列をその５’側に付加する。３’側プライマーはＡＴＧ
配列を付加しなかった鎖、即ちＨ鎖のプライマーに翻訳
終止コドンをその３’側に付加する。３’側プライマー
の場合には、その相補的配列を３’側から５’側へ向か
ってデザインし直せばよい。もちろん、Ｈ鎖Ｖ領域プラ
イマーの５’側にＡＴＧ配列を付加し、Ｌ鎖Ｖ領域にプ
ライマーに３’側に終止コドンを付加しても良い。終止
コドンとしてはTAA,TAG,TGAのいずれを用いても良い。
尚、本発明の実施例に於いては、終止コドンとしてTGA
を用いた。次にＨ鎖及びＬ鎖のそれぞれのプライマーＤ
ＮＡの５’側（３’側プライマーはデザインし直したも
のの５’側）に、発現ベクターに挿入するための適当な
制限酵素サイトを導入しておく。 デザインしたプライ
マーＤＮＡはＤＮＡ合成機などを用いて化学合成する。
【００１７】次に、得られたハイブリドーマより公知の
方法に従ってtotalＲＮＡを抽出し、逆転写酵素と３’
側プライマーＤＮＡを用いて一本鎖ｃＤＮＡを作製し、
５’側プライマーＤＮＡ及び３’側プライマーＤＮＡを
用い、TaqポリメラーゼによるPolymerase Chain Reacti
on法（ＰＣＲ法、Science, 230巻, 1350頁, 1985年）に
て抗体のＨ鎖及びＬ鎖のＶ領域をコードするＤＮＡ断片
のみをそれぞれ選択的に増幅し取得する。
方法に従ってtotalＲＮＡを抽出し、逆転写酵素と３’
側プライマーＤＮＡを用いて一本鎖ｃＤＮＡを作製し、
５’側プライマーＤＮＡ及び３’側プライマーＤＮＡを
用い、TaqポリメラーゼによるPolymerase Chain Reacti
on法（ＰＣＲ法、Science, 230巻, 1350頁, 1985年）に
て抗体のＨ鎖及びＬ鎖のＶ領域をコードするＤＮＡ断片
のみをそれぞれ選択的に増幅し取得する。
【００１８】さて、取得したこれらのＶ領域をコードす
る遺伝子を大腸菌等で発現させ、機能的な抗体Ｖ領域分
子を調製する場合、それぞれの遺伝子を単独、あるいは
１つのベクターに同時に組み込んで発現させ、その後そ
れらをアッセンブリさせてもよいが、その効率は極めて
悪いことが知られている（Science, 240巻, 1038頁,198
8年）。本来抗体は、Ｈ鎖とＬ鎖がＳＳ架橋による共有
結合で結合したものがさらにそのＨ鎖同士でＳＳ結合し
た形のダイマーを形成している。Ｈ鎖とＬ鎖のＳＳ架橋
の位置はともにＣ領域であり、Ｖ領域同士は非共有結合
で結合している。したがって、抗体Ｖ領域分子を調製す
る場合、その非共有結合のみに頼らなければならないた
め、機能的な分子の形成効率が悪いものと考えられる。
最近になって、それぞれのＶ領域をリンカーを用いて連
結させ、１本鎖の機能的な分子として大腸菌で発現させ
る技術が開発された（Science, 242巻, 423頁, 1988
年）。 そこで本発明者らはその技術を応用して、抗体
Ｖ領域のみからなる機能的な１本鎖抗ＩＬ−２レセプタ
ーβ鎖抗体のＶ領域を含有するポリペプチドを発現させ
ることに成功している。
る遺伝子を大腸菌等で発現させ、機能的な抗体Ｖ領域分
子を調製する場合、それぞれの遺伝子を単独、あるいは
１つのベクターに同時に組み込んで発現させ、その後そ
れらをアッセンブリさせてもよいが、その効率は極めて
悪いことが知られている（Science, 240巻, 1038頁,198
8年）。本来抗体は、Ｈ鎖とＬ鎖がＳＳ架橋による共有
結合で結合したものがさらにそのＨ鎖同士でＳＳ結合し
た形のダイマーを形成している。Ｈ鎖とＬ鎖のＳＳ架橋
の位置はともにＣ領域であり、Ｖ領域同士は非共有結合
で結合している。したがって、抗体Ｖ領域分子を調製す
る場合、その非共有結合のみに頼らなければならないた
め、機能的な分子の形成効率が悪いものと考えられる。
最近になって、それぞれのＶ領域をリンカーを用いて連
結させ、１本鎖の機能的な分子として大腸菌で発現させ
る技術が開発された（Science, 242巻, 423頁, 1988
年）。 そこで本発明者らはその技術を応用して、抗体
Ｖ領域のみからなる機能的な１本鎖抗ＩＬ−２レセプタ
ーβ鎖抗体のＶ領域を含有するポリペプチドを発現させ
ることに成功している。
【００１９】すなわち、まず、上流からプロモーター領
域、リボゾーム結合領域、ＡＴＧ配列を付加した５’側
プライマーに導入した制限酵素サイト、同鎖３’側プラ
イマーに導入した制限酵素サイト、抗体Ｌ鎖Ｖ領域と抗
体Ｈ鎖Ｖ領域とを繋ぐための適当な長さのリンカーペプ
チドをコードするＤＮＡ配列、ＡＴＧ配列を付加してい
ない５’側プライマーに導入した制限酵素サイト、同鎖
３’側プライマーに導入した制限酵素サイト、最後にタ
ーミネーター領域の順に含有する発現ベクターを構築す
る。この際、ＰＣＲにより増幅したそれぞれのＶ領域Ｄ
ＮＡを挿入する場合、リンカーペプチド、及びその後の
Ｖ領域ＤＮＡの翻訳がずれないように注意する。さて、
本発明においてプロモーターの由来は問うところではな
く、例えば大腸菌のtrpプロモーター、tacプロモータ
ー、trcプロモーター、lacプロモーターや、さらにはλ
ファージのλＰLプロモーター、λＰRプロモーターなど
を用いることができる。リボゾーム結合領域は、例えば
大腸菌のtrpＬやtrpＥ、lacＺのリボゾーム結合領域
や、λファージのＣＩＩ蛋白のリボゾーム結合領域を用
いることができる。あるいは化学合成したＤＮＡ配列を
用いることができる。また、目的とするポリペプチドを
大腸菌体内に顆粒状として大量に蓄積させるために、リ
ボゾーム結合領域を２つ以上としてもよい。
域、リボゾーム結合領域、ＡＴＧ配列を付加した５’側
プライマーに導入した制限酵素サイト、同鎖３’側プラ
イマーに導入した制限酵素サイト、抗体Ｌ鎖Ｖ領域と抗
体Ｈ鎖Ｖ領域とを繋ぐための適当な長さのリンカーペプ
チドをコードするＤＮＡ配列、ＡＴＧ配列を付加してい
ない５’側プライマーに導入した制限酵素サイト、同鎖
３’側プライマーに導入した制限酵素サイト、最後にタ
ーミネーター領域の順に含有する発現ベクターを構築す
る。この際、ＰＣＲにより増幅したそれぞれのＶ領域Ｄ
ＮＡを挿入する場合、リンカーペプチド、及びその後の
Ｖ領域ＤＮＡの翻訳がずれないように注意する。さて、
本発明においてプロモーターの由来は問うところではな
く、例えば大腸菌のtrpプロモーター、tacプロモータ
ー、trcプロモーター、lacプロモーターや、さらにはλ
ファージのλＰLプロモーター、λＰRプロモーターなど
を用いることができる。リボゾーム結合領域は、例えば
大腸菌のtrpＬやtrpＥ、lacＺのリボゾーム結合領域
や、λファージのＣＩＩ蛋白のリボゾーム結合領域を用
いることができる。あるいは化学合成したＤＮＡ配列を
用いることができる。また、目的とするポリペプチドを
大腸菌体内に顆粒状として大量に蓄積させるために、リ
ボゾーム結合領域を２つ以上としてもよい。
【００２０】それぞれの抗体Ｖ領域を繋ぐためのリンカ
ーペプチドの配列は、調製した抗体Ｖ領域分子が機能的
である限りいかなる配列でもよいが、生体内投与時の副
作用を最小限とするためになるべく短く、独自の構造を
有しないような配列とした方が望ましい。ターミネータ
ーとしては、例えば大腸菌のtrpＡターミネーター、rrn
Bターミネーター、recAターミネーターなどを用いるこ
とができる。また、発現プラスミドのコピー数は一般的
に多い方が好ましく、複製起点としてpBR系の複製起点
よりpUC系の方が望ましい。構築した発現プラスミドＤ
ＮＡにＰＣＲにて増幅したＨ鎖、及びＬ鎖Ｖ領域ＤＮＡ
をそれぞれ挿入する。挿入後、この発現プラスミドを通
常の方法で宿主に形質転換させ、そして発現させれば良
い。発現させる生物としては、原核生物及び真核生物の
何れであってもよい。原核生物の例としては、大腸菌、
枯草菌などを挙げることができる。真核細胞は例えば酵
母、ＣＨＯ細胞などを用いれば良い。好ましくは原核細
胞、更に好ましくは大腸菌を宿主として用いるのが良
い。発現ベクターをこれらの生物に組み込む方法も公知
の方法を利用すればよく、例えば大腸菌では、対数増殖
期の細胞を50mMの塩化カルシウムで氷中約３０分処理す
ることにより、大腸菌の細胞壁の構造が変化し、続いて
プラスミドＤＮＡを注入し約１０分後３０℃〜４２℃で
２分間の熱処理を施した後、培地を加え３０℃〜３７℃
で約６０分培養することにより、発現プラスミドＤＮＡ
を生物に組み込むことができる。
ーペプチドの配列は、調製した抗体Ｖ領域分子が機能的
である限りいかなる配列でもよいが、生体内投与時の副
作用を最小限とするためになるべく短く、独自の構造を
有しないような配列とした方が望ましい。ターミネータ
ーとしては、例えば大腸菌のtrpＡターミネーター、rrn
Bターミネーター、recAターミネーターなどを用いるこ
とができる。また、発現プラスミドのコピー数は一般的
に多い方が好ましく、複製起点としてpBR系の複製起点
よりpUC系の方が望ましい。構築した発現プラスミドＤ
ＮＡにＰＣＲにて増幅したＨ鎖、及びＬ鎖Ｖ領域ＤＮＡ
をそれぞれ挿入する。挿入後、この発現プラスミドを通
常の方法で宿主に形質転換させ、そして発現させれば良
い。発現させる生物としては、原核生物及び真核生物の
何れであってもよい。原核生物の例としては、大腸菌、
枯草菌などを挙げることができる。真核細胞は例えば酵
母、ＣＨＯ細胞などを用いれば良い。好ましくは原核細
胞、更に好ましくは大腸菌を宿主として用いるのが良
い。発現ベクターをこれらの生物に組み込む方法も公知
の方法を利用すればよく、例えば大腸菌では、対数増殖
期の細胞を50mMの塩化カルシウムで氷中約３０分処理す
ることにより、大腸菌の細胞壁の構造が変化し、続いて
プラスミドＤＮＡを注入し約１０分後３０℃〜４２℃で
２分間の熱処理を施した後、培地を加え３０℃〜３７℃
で約６０分培養することにより、発現プラスミドＤＮＡ
を生物に組み込むことができる。
【００２１】目的とする機能的な抗体Ｖ領域を有するポ
リペプチドは、このような生物を培養することによって
当該生物の体内あるいは培地中に蓄積させることができ
る。培地は各生物を培養しうるそれぞれの公知の培地を
利用すればよく、培養条件も公知の条件でよい。培養後
は、目的とする機能的な抗体Ｖ領域分子を公知の方法で
取得すればよい。さて、本発明のポリペプチドは、ＩＬ
−２レセプターβ鎖に結合してＩＬ−２とＩＬ−２レセ
プターβ鎖との結合を選択的に阻害する活性を有してお
り、臓器移植時の拒絶反応の予防などに対して有効なも
のである。また、本発明のポリペプチドの構造は配列表
の配列番号１叉は２記載の配列に限定されるものではな
く、ＩＬ−２レセプターβ鎖に結合し、かつＩＬ−２と
ＩＬ−２とＩＬ−２レセプターβ鎖との結合を阻害する
活性を有する限り本発明のポリペプチドに含まれる。例
えば、（１）配列番号１叉は２記載のポリペプチド構造
中の１若しくは複数個のアミノ酸を他のアミノ酸に置換
した構造を有するポリペプチド、（２）配列番号１叉は
２記載のポリペプチド構造中のＮ末端及び／叉はＣ末端
より１若しくは複数個のアミノ酸が欠損し、かつ連続し
ているアミノ酸配列を有するポリペプチド、（３）配列
番号１叉は２記載のポリペプチドのＮ末端及び／叉はＣ
末端に１若しくは複数個のアミノ酸が付加された構造を
有するポリペプチド及び（４）配列番号１叉は２記載の
ポリペプチド構造中の１若しくは複数個のアミノ酸がア
セチル化、アミド化叉はポリエチレン付加された構造を
有するポリペプチド、等もＩＬ−２レセプターβ鎖に結
合し、かつＩＬ−２とＩＬ−２とＩＬ−２レセプターβ
鎖との結合を阻害する活性を有する限り本発明のポリペ
プチドに含まれる。特に、配列表の配列番号１及び２記
載のポリペプチドのＮ末端のMetは微生物を用いて発現
する過程又は精製過程において切断され、その結果Ｎ末
端がAspとなる場合がある。このポリペプチドも上記活
性、即ち(1)ヒトＩＬ−２受容体重鎖に結合活性を有
し、(2)ＩＬ−２とＩＬ−２受容体重鎖との結合を阻害
する活性を有する。また、Ｍｅｔが結合した形で生産さ
せた後、アミノペプチダーゼ等の酵素でＮ末端Ｍｅｔを
はずしたものも上記活性を有する。更に、必要により本
発明のポリペプチドに毒素を付加したものを用いても良
い。
リペプチドは、このような生物を培養することによって
当該生物の体内あるいは培地中に蓄積させることができ
る。培地は各生物を培養しうるそれぞれの公知の培地を
利用すればよく、培養条件も公知の条件でよい。培養後
は、目的とする機能的な抗体Ｖ領域分子を公知の方法で
取得すればよい。さて、本発明のポリペプチドは、ＩＬ
−２レセプターβ鎖に結合してＩＬ−２とＩＬ−２レセ
プターβ鎖との結合を選択的に阻害する活性を有してお
り、臓器移植時の拒絶反応の予防などに対して有効なも
のである。また、本発明のポリペプチドの構造は配列表
の配列番号１叉は２記載の配列に限定されるものではな
く、ＩＬ−２レセプターβ鎖に結合し、かつＩＬ−２と
ＩＬ−２とＩＬ−２レセプターβ鎖との結合を阻害する
活性を有する限り本発明のポリペプチドに含まれる。例
えば、（１）配列番号１叉は２記載のポリペプチド構造
中の１若しくは複数個のアミノ酸を他のアミノ酸に置換
した構造を有するポリペプチド、（２）配列番号１叉は
２記載のポリペプチド構造中のＮ末端及び／叉はＣ末端
より１若しくは複数個のアミノ酸が欠損し、かつ連続し
ているアミノ酸配列を有するポリペプチド、（３）配列
番号１叉は２記載のポリペプチドのＮ末端及び／叉はＣ
末端に１若しくは複数個のアミノ酸が付加された構造を
有するポリペプチド及び（４）配列番号１叉は２記載の
ポリペプチド構造中の１若しくは複数個のアミノ酸がア
セチル化、アミド化叉はポリエチレン付加された構造を
有するポリペプチド、等もＩＬ−２レセプターβ鎖に結
合し、かつＩＬ−２とＩＬ−２とＩＬ−２レセプターβ
鎖との結合を阻害する活性を有する限り本発明のポリペ
プチドに含まれる。特に、配列表の配列番号１及び２記
載のポリペプチドのＮ末端のMetは微生物を用いて発現
する過程又は精製過程において切断され、その結果Ｎ末
端がAspとなる場合がある。このポリペプチドも上記活
性、即ち(1)ヒトＩＬ−２受容体重鎖に結合活性を有
し、(2)ＩＬ−２とＩＬ−２受容体重鎖との結合を阻害
する活性を有する。また、Ｍｅｔが結合した形で生産さ
せた後、アミノペプチダーゼ等の酵素でＮ末端Ｍｅｔを
はずしたものも上記活性を有する。更に、必要により本
発明のポリペプチドに毒素を付加したものを用いても良
い。
【００２２】本発明に係る免疫抑制剤は上記ポリペプチ
ドを0.1重量％〜100重量％、好ましくは0.5重量％〜70
重量％の割合で含有すればよい。したがって、本発明の
ポリペプチドをそのまま投与してもよいし、また通常製
剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与される。製
剤用担体としては、製剤分野において常用され、かつ本
発明のポリペプチドと反応しない物質が用いられる。注
射剤の場合には、本発明のポリペプチドを水に溶解させ
て調製されるが、必要に応じて生理食塩水、ぶどう糖溶
液に溶解させてもよく、また緩衝剤、保存剤、安定化剤
あるいは賦形剤を含有させてもよい。また、これらの製
剤は治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。
ドを0.1重量％〜100重量％、好ましくは0.5重量％〜70
重量％の割合で含有すればよい。したがって、本発明の
ポリペプチドをそのまま投与してもよいし、また通常製
剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与される。製
剤用担体としては、製剤分野において常用され、かつ本
発明のポリペプチドと反応しない物質が用いられる。注
射剤の場合には、本発明のポリペプチドを水に溶解させ
て調製されるが、必要に応じて生理食塩水、ぶどう糖溶
液に溶解させてもよく、また緩衝剤、保存剤、安定化剤
あるいは賦形剤を含有させてもよい。また、これらの製
剤は治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。
【００２３】本発明に係る免疫抑制剤の投与方法として
は、経口、注射、直腸内などいずれの方法を用いてもか
まわないが、注射による投与が好ましい。投与量は、投
与方法、患者の症状、年齢などにより異なるが、通常１
回0.001〜1000ｍｇ、好ましくは0.01〜10ｍｇを１日当
り１〜３回投与すればよい。
は、経口、注射、直腸内などいずれの方法を用いてもか
まわないが、注射による投与が好ましい。投与量は、投
与方法、患者の症状、年齢などにより異なるが、通常１
回0.001〜1000ｍｇ、好ましくは0.01〜10ｍｇを１日当
り１〜３回投与すればよい。
【００２４】以下本発明を実施例に基づいて更に詳細に
説明する。尚、本発明は実施例に限定されるものではな
い。
説明する。尚、本発明は実施例に限定されるものではな
い。
【００２５】
（実施例１、ハイブリドーマの調製）６〜８週令の雌の
BALB/cマウスに、生理食塩水に懸濁したTL-Mor細胞を１
匹あたり１Ｘ１０個7腹腔内投与することにより免疫し
た。その１０日後、同様の操作により追加免疫し、更に
その５日後、マウスの眼窩静脈より採血して、後に述べ
る参考例に示す方法に従って125Ｉ標識ＩＬ−２のTL-Mo
r細胞に対する結合阻害活性を調べることにより抗体価
を測定した。抗体価の高かったマウスを更に同様の操作
にて最終免疫し、その３日後、脾臓を摘出して脾臓細胞
とマウス骨髄腫細胞（SP2/0-Ag14）とを、５０％ポリエ
チレングリコール＃４０００（半井化学社製）存在下に
て細胞数で１０：１の割合で混合し、細胞融合させた。
融合細胞を、１０％牛胎児血清（ギブコ社製）を含むRP
MI1640培地（ギブコ社製）にて５Ｘ１０6個／ｍｌとな
るように懸濁し、１穴あたり５Ｘ１０5個のマウス胸腺
細胞を含有する９６穴平底プレート（コーニング社製）
に１００μｌずつ分注した。１日、２日、３日、６日後
に培地の半量をヒポキサンチン、アミノプテリン、チミ
ジンを含む培地（ＨＡＴ培地）と交換し、以後３日ごと
に同様の操作を繰り返した。融合より約２週間後、融合
した細胞（ハイブリドーマ）の増殖してきた各穴の培養
上清について、125Ｉ標識ＩＬ−２のTL-Mor細胞に対す
る結合阻害活性、及びMT-1細胞に対する結合阻害活性を
測定し、TL-Mor細胞に対する結合阻害活性を有してお
り、MT-1細胞に対する結合阻害活性を有していない穴に
含まれるハイブリドーマを、限界希釈法にてクローン化
した。
BALB/cマウスに、生理食塩水に懸濁したTL-Mor細胞を１
匹あたり１Ｘ１０個7腹腔内投与することにより免疫し
た。その１０日後、同様の操作により追加免疫し、更に
その５日後、マウスの眼窩静脈より採血して、後に述べ
る参考例に示す方法に従って125Ｉ標識ＩＬ−２のTL-Mo
r細胞に対する結合阻害活性を調べることにより抗体価
を測定した。抗体価の高かったマウスを更に同様の操作
にて最終免疫し、その３日後、脾臓を摘出して脾臓細胞
とマウス骨髄腫細胞（SP2/0-Ag14）とを、５０％ポリエ
チレングリコール＃４０００（半井化学社製）存在下に
て細胞数で１０：１の割合で混合し、細胞融合させた。
融合細胞を、１０％牛胎児血清（ギブコ社製）を含むRP
MI1640培地（ギブコ社製）にて５Ｘ１０6個／ｍｌとな
るように懸濁し、１穴あたり５Ｘ１０5個のマウス胸腺
細胞を含有する９６穴平底プレート（コーニング社製）
に１００μｌずつ分注した。１日、２日、３日、６日後
に培地の半量をヒポキサンチン、アミノプテリン、チミ
ジンを含む培地（ＨＡＴ培地）と交換し、以後３日ごと
に同様の操作を繰り返した。融合より約２週間後、融合
した細胞（ハイブリドーマ）の増殖してきた各穴の培養
上清について、125Ｉ標識ＩＬ−２のTL-Mor細胞に対す
る結合阻害活性、及びMT-1細胞に対する結合阻害活性を
測定し、TL-Mor細胞に対する結合阻害活性を有してお
り、MT-1細胞に対する結合阻害活性を有していない穴に
含まれるハイブリドーマを、限界希釈法にてクローン化
した。
【００２６】更にそれぞれのハイブリドーマクローンの
培養上清中の阻害活性を測定して、抗ＩＬ−２レセプタ
ーβ鎖抗体産生ハイブリドーマを得た。更に、得られた
抗ＩＬ−２レセプターβ鎖抗体産生ハイブリドーマの培
養上清について、以下の方法にてＩＬ−２の生理活性の
抑制能を調べた。１０％牛胎児血清を含むRPMI1640培地
にて２Ｘ１０5個／ｍｌの濃度となるように懸濁したILT
-Mat細胞液を１穴あたり１００μｌずつ９６穴平底マイ
クロプレートに分注して、サンプルの培養上清を５０μ
ｌ加え、３７℃、３０分間インキュベートした。更に、
１０％牛胎児血清を含むRPMI1640培地にて２００ｕ／ｍ
ｌに調製したヒトリコンビナントＩＬ−２溶液を５０μ
ｌずつ加えて、５％ＣＯ2存在下３７℃にて４８時間培
養した。最後の４時間は１μＣｉの3Ｈ−チミジン（デ
ュポン社製）を加えて培養し、細胞内に取り込まれた放
射活性量をシンチレーシンカウンター（パッカード社
製）にて測定することにより、培養上清によるＩＬ−２
の生理活性の阻害能を調べた。このような方法にて抗Ｉ
Ｌ−２レセプターβ鎖に対する抗体を産生するハイブリ
ドーマを調製した。こうして得られたハイブリドーマと
してＴＵ２７（FERM BP-2510）、ＴＵ２５（FERM BP-35
29）がある。
培養上清中の阻害活性を測定して、抗ＩＬ−２レセプタ
ーβ鎖抗体産生ハイブリドーマを得た。更に、得られた
抗ＩＬ−２レセプターβ鎖抗体産生ハイブリドーマの培
養上清について、以下の方法にてＩＬ−２の生理活性の
抑制能を調べた。１０％牛胎児血清を含むRPMI1640培地
にて２Ｘ１０5個／ｍｌの濃度となるように懸濁したILT
-Mat細胞液を１穴あたり１００μｌずつ９６穴平底マイ
クロプレートに分注して、サンプルの培養上清を５０μ
ｌ加え、３７℃、３０分間インキュベートした。更に、
１０％牛胎児血清を含むRPMI1640培地にて２００ｕ／ｍ
ｌに調製したヒトリコンビナントＩＬ−２溶液を５０μ
ｌずつ加えて、５％ＣＯ2存在下３７℃にて４８時間培
養した。最後の４時間は１μＣｉの3Ｈ−チミジン（デ
ュポン社製）を加えて培養し、細胞内に取り込まれた放
射活性量をシンチレーシンカウンター（パッカード社
製）にて測定することにより、培養上清によるＩＬ−２
の生理活性の阻害能を調べた。このような方法にて抗Ｉ
Ｌ−２レセプターβ鎖に対する抗体を産生するハイブリ
ドーマを調製した。こうして得られたハイブリドーマと
してＴＵ２７（FERM BP-2510）、ＴＵ２５（FERM BP-35
29）がある。
【００２７】（実施例２、ハイブリドーマより抗体のＶ
領域ｃＤＮＡの調製）５Ｘ１０6個のハイブリドーマＴ
Ｕ２７、あるいはＴＵ２５をPBSにて洗浄後、guanidine
thiocyanate, N-lauryl sarcosine, EDTAを含むＲＮＡ
抽出用緩衝液（ファルマシア社製）を加えて懸濁した
後、あらかじめ等容量のCesium Cloride溶液（ρ=1.51g
/ml,ファルマシア社製）を入れたチューブ重層し、１２
５，０００ｘｇにて１６時間遠心した。上清を吸い取っ
たのち、１ｍＭEDTAを含む１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液
（ｐＨ７．５）を加えて懸濁し、新しいチューブに入
れ、６５℃で５分間インキュベートした。更に、２Ｍ P
otassium Acetate（ｐＨ５．０）（ファルマシア社製）
を１／１０容量とエタノール（ナカライテスク社製）を
３倍容量加えて、−２０℃に一晩放置した。５，０００
ｘｇにて２０分間遠心して、上清を捨てた後、８０％エ
タノールにて遠心洗浄し、沈澱を乾燥させた。沈澱を１
ｍＭEDTAを含む１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．
５）にて溶解してtotalＲＮＡ画分とした。
領域ｃＤＮＡの調製）５Ｘ１０6個のハイブリドーマＴ
Ｕ２７、あるいはＴＵ２５をPBSにて洗浄後、guanidine
thiocyanate, N-lauryl sarcosine, EDTAを含むＲＮＡ
抽出用緩衝液（ファルマシア社製）を加えて懸濁した
後、あらかじめ等容量のCesium Cloride溶液（ρ=1.51g
/ml,ファルマシア社製）を入れたチューブ重層し、１２
５，０００ｘｇにて１６時間遠心した。上清を吸い取っ
たのち、１ｍＭEDTAを含む１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液
（ｐＨ７．５）を加えて懸濁し、新しいチューブに入
れ、６５℃で５分間インキュベートした。更に、２Ｍ P
otassium Acetate（ｐＨ５．０）（ファルマシア社製）
を１／１０容量とエタノール（ナカライテスク社製）を
３倍容量加えて、−２０℃に一晩放置した。５，０００
ｘｇにて２０分間遠心して、上清を捨てた後、８０％エ
タノールにて遠心洗浄し、沈澱を乾燥させた。沈澱を１
ｍＭEDTAを含む１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．
５）にて溶解してtotalＲＮＡ画分とした。
【００２８】次に、totalＲＮＡ画分溶液に、あらかじ
めデザインした抗体のＨ鎖、Ｌ鎖のＶ領域の３’側に相
補的なプライマー溶液（最終濃度で１μＭ）、deoxyNTP
混合液、ｃＤＮＡ合成用緩衝液（アマシャム社製）、RN
Aase Inhibitor（宝酒造社製）、及びReverse Transcri
ptase（宝酒造社製）を加えて４２℃にて１時間反応さ
せｃＤＮＡを合成した。更に、ＰＣＲ用緩衝液（シータ
ス社製）、deoxyNTP混合液、抗体Ｈ鎖、及び抗体Ｌ鎖Ｖ
領域ｃＤＮＡ増幅用５’側プライマー、及び３’側プラ
イマー（それぞれ最終濃度１μＭ）、及びTaq Polymera
se（宝酒造社製）を加えＰＣＲ（シータス社、サーマル
サイクラー）を行った。反応は変性３０秒（９４℃）、
アニール３０秒（５５℃）、プライマーイクステンショ
ン１分（７２℃）にて３０サイクル行い、各サイクル毎
にプライマーイクステンションの時間を１５秒ずつ延長
させた。反応後、１ｍＭEDTAを含む４０ｍＭトリス酢酸
緩衝液（ｐＨ８．０）にてアガロースゲル電気泳動を行
い、該当するｃＤＮＡフラグメントを切り出し、ジーン
クリーンキット（バイオ１０１社製）を用いて抽出・精
製した。なお、ｃＤＮＡの合成、及びＰＣＲに用いたプ
ライマーの配列を図１に示した。
めデザインした抗体のＨ鎖、Ｌ鎖のＶ領域の３’側に相
補的なプライマー溶液（最終濃度で１μＭ）、deoxyNTP
混合液、ｃＤＮＡ合成用緩衝液（アマシャム社製）、RN
Aase Inhibitor（宝酒造社製）、及びReverse Transcri
ptase（宝酒造社製）を加えて４２℃にて１時間反応さ
せｃＤＮＡを合成した。更に、ＰＣＲ用緩衝液（シータ
ス社製）、deoxyNTP混合液、抗体Ｈ鎖、及び抗体Ｌ鎖Ｖ
領域ｃＤＮＡ増幅用５’側プライマー、及び３’側プラ
イマー（それぞれ最終濃度１μＭ）、及びTaq Polymera
se（宝酒造社製）を加えＰＣＲ（シータス社、サーマル
サイクラー）を行った。反応は変性３０秒（９４℃）、
アニール３０秒（５５℃）、プライマーイクステンショ
ン１分（７２℃）にて３０サイクル行い、各サイクル毎
にプライマーイクステンションの時間を１５秒ずつ延長
させた。反応後、１ｍＭEDTAを含む４０ｍＭトリス酢酸
緩衝液（ｐＨ８．０）にてアガロースゲル電気泳動を行
い、該当するｃＤＮＡフラグメントを切り出し、ジーン
クリーンキット（バイオ１０１社製）を用いて抽出・精
製した。なお、ｃＤＮＡの合成、及びＰＣＲに用いたプ
ライマーの配列を図１に示した。
【００２９】（実施例３、発現ベクターの構築）図３に
示すように、まずpT13SNco（本プラスミドを含有する
E. coli AJ-12447は、FERM P-10757 として寄託されて
いる。）［J. Biochem.,104巻, 30-34頁,1988年に記
載］を制限酵素ClaI、BamHI（いずれも宝酒造社製）に
て切断して得られる大きいＤＮＡ断片と、通常の方法で
作成した図２に示された配列を有する合成ＤＮＡ断片
（リンカー）とをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を
用いて連結した。
示すように、まずpT13SNco（本プラスミドを含有する
E. coli AJ-12447は、FERM P-10757 として寄託されて
いる。）［J. Biochem.,104巻, 30-34頁,1988年に記
載］を制限酵素ClaI、BamHI（いずれも宝酒造社製）に
て切断して得られる大きいＤＮＡ断片と、通常の方法で
作成した図２に示された配列を有する合成ＤＮＡ断片
（リンカー）とをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を
用いて連結した。
【００３０】次に、同じく図３に示す通り、合成ＤＮＡ
断片とプラスミドpT13SNcoを制限酵素ClaIとBamHIで切
断して得られる大きい断片を連結する。この連結したプ
ラスミドを制限酵素EcoRI、PvuII（いずれも宝酒造社
製）にて切断して得られる小さいＤＮＡ断片と、pUC18
（Messing J., Methods in Enzymology, 101巻, 20-78
頁, 1983年）のHindIIIサイトとNdeIサイトを、制限酵
素で切断後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）で平
滑化し、更にＴ４リガーゼを用いて連結することにより
消失させたものを、EcoRI、HincII（宝酒造社製）にて
切断して得られる大きいＤＮＡ断片とをＴ４リガーゼに
て連結することにより、複製起点をpUC系とするpFv-DE
を得た。
断片とプラスミドpT13SNcoを制限酵素ClaIとBamHIで切
断して得られる大きい断片を連結する。この連結したプ
ラスミドを制限酵素EcoRI、PvuII（いずれも宝酒造社
製）にて切断して得られる小さいＤＮＡ断片と、pUC18
（Messing J., Methods in Enzymology, 101巻, 20-78
頁, 1983年）のHindIIIサイトとNdeIサイトを、制限酵
素で切断後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）で平
滑化し、更にＴ４リガーゼを用いて連結することにより
消失させたものを、EcoRI、HincII（宝酒造社製）にて
切断して得られる大きいＤＮＡ断片とをＴ４リガーゼに
て連結することにより、複製起点をpUC系とするpFv-DE
を得た。
【００３１】（実施例４、pFv-DEへの抗体Ｖ領域ｃＤＮ
Ａの組み込み、及びＶ領域のみからなる抗体生産菌の調
製）図４に示すように、まずpFv-DEを制限酵素NdeI、Sa
lI（宝酒造社製）で切断して得られる大きいＤＮＡ断片
と、ＰＣＲを行った後回収したＴＵ２５及びＴＵ２７の
Ｌ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡを同じくNdeI、SalIで切断した断片
をＴ４リガーゼにて連結した。ＴＵ２５のＬ鎖Ｖ領域は
配列表の配列番号２に示される塩基配列中の４−３２４
番目に当たる。またＴＵ２７のＬ鎖Ｖ領域は配列表の配
列番号１に示される塩基配列中の４−３２４番目に当た
る。尚、両配列に於いて塩基配列中の１−３番目は翻訳
開始コドンＡＴＧである。次に、その連結したプラスミ
ドを更に制限酵素XhoI、HindIII（宝酒造社製）で切断
して得られる大きいＤＮＡ断片と、ＰＣＲ後回収したＴ
Ｕ２７及びＴＵ２５のＨ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡを同様にXho
I、HindIIIで切断した断片をＴ４リガーゼにて連結する
ことにより、Ｖ領域のみからなる抗体を発現するpFv(TU
27)-DE、及びpFv(TU25)-DEを構築、取得した。続いてそ
れぞれのプラスミドを大腸菌HB101株に形質転換し、Ｖ
領域のみからなる抗体を生産する菌（E. Coli pFv(TU2
7)-DE/HB101 AJ-12646, FERM P-12490）、及び（E. Col
i pFv(TU25)-DE/HB101 AJ-12647,FERM P-12491）を得
た。尚、ＰＵ２７のＨ鎖Ｖ領域は配列表の配列番号１に
示される塩基配列中の３６７−７２０番目にあたる。ま
た、ＰＵ２５のＨ鎖Ｖ領域は配列表の配列番号２に示さ
れる塩基配列中の３６７−７１７番目に該当する。
Ａの組み込み、及びＶ領域のみからなる抗体生産菌の調
製）図４に示すように、まずpFv-DEを制限酵素NdeI、Sa
lI（宝酒造社製）で切断して得られる大きいＤＮＡ断片
と、ＰＣＲを行った後回収したＴＵ２５及びＴＵ２７の
Ｌ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡを同じくNdeI、SalIで切断した断片
をＴ４リガーゼにて連結した。ＴＵ２５のＬ鎖Ｖ領域は
配列表の配列番号２に示される塩基配列中の４−３２４
番目に当たる。またＴＵ２７のＬ鎖Ｖ領域は配列表の配
列番号１に示される塩基配列中の４−３２４番目に当た
る。尚、両配列に於いて塩基配列中の１−３番目は翻訳
開始コドンＡＴＧである。次に、その連結したプラスミ
ドを更に制限酵素XhoI、HindIII（宝酒造社製）で切断
して得られる大きいＤＮＡ断片と、ＰＣＲ後回収したＴ
Ｕ２７及びＴＵ２５のＨ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡを同様にXho
I、HindIIIで切断した断片をＴ４リガーゼにて連結する
ことにより、Ｖ領域のみからなる抗体を発現するpFv(TU
27)-DE、及びpFv(TU25)-DEを構築、取得した。続いてそ
れぞれのプラスミドを大腸菌HB101株に形質転換し、Ｖ
領域のみからなる抗体を生産する菌（E. Coli pFv(TU2
7)-DE/HB101 AJ-12646, FERM P-12490）、及び（E. Col
i pFv(TU25)-DE/HB101 AJ-12647,FERM P-12491）を得
た。尚、ＰＵ２７のＨ鎖Ｖ領域は配列表の配列番号１に
示される塩基配列中の３６７−７２０番目にあたる。ま
た、ＰＵ２５のＨ鎖Ｖ領域は配列表の配列番号２に示さ
れる塩基配列中の３６７−７１７番目に該当する。
【００３２】（実施例５、Ｖ領域のみからなる抗体生産
菌より、生産物の取得）得られた形質転換株 E. Coli
pFv(TU27)-DE/HB101（FERM P-12490）、及びE. Coli pF
v(TU25)-DE/HB101（FERM P-12491）を５０μｇ／ｍｌの
アンピシリンを含む２ｘＴＹ［１．６％トリプトン、１
％酵母エキス、（以上バクト社製）、０．５％NaOH、ｐ
Ｈ７．０］5ml中で３７℃一晩生育させた。ついで、そ
の培養懸濁液５ｍｌを１００ｍｌのＭ９−カザミノ酸培
地（０．６％Na2HPO4・12H2O、０．３％KH2PO4、０．０
５％NaCl、０．１％NH4Cl、０．０５％MgSO4・7H20、
０．００１４７％CaCl2、０．２％グルコース、０．２
％カザミノ酸、０．０２％L-ロイシン、０．０２％L-プ
ロリン、０．０００２％チアミン塩酸塩、１００μｇ／
ｍｌアンピシリン、ｐＨ６．９）へ接種し、３７℃にて
３時間培養した。その後、２５μｇ／ｍｌとなるように
3-インドールアクリル酸（IAA）を添加し、更に３７℃
にて２０時間誘導培養した。この一部の菌体懸濁液を位
相差顕微鏡により約１５００倍にて観察すると、大腸菌
体内の顆粒形成が認められた。
菌より、生産物の取得）得られた形質転換株 E. Coli
pFv(TU27)-DE/HB101（FERM P-12490）、及びE. Coli pF
v(TU25)-DE/HB101（FERM P-12491）を５０μｇ／ｍｌの
アンピシリンを含む２ｘＴＹ［１．６％トリプトン、１
％酵母エキス、（以上バクト社製）、０．５％NaOH、ｐ
Ｈ７．０］5ml中で３７℃一晩生育させた。ついで、そ
の培養懸濁液５ｍｌを１００ｍｌのＭ９−カザミノ酸培
地（０．６％Na2HPO4・12H2O、０．３％KH2PO4、０．０
５％NaCl、０．１％NH4Cl、０．０５％MgSO4・7H20、
０．００１４７％CaCl2、０．２％グルコース、０．２
％カザミノ酸、０．０２％L-ロイシン、０．０２％L-プ
ロリン、０．０００２％チアミン塩酸塩、１００μｇ／
ｍｌアンピシリン、ｐＨ６．９）へ接種し、３７℃にて
３時間培養した。その後、２５μｇ／ｍｌとなるように
3-インドールアクリル酸（IAA）を添加し、更に３７℃
にて２０時間誘導培養した。この一部の菌体懸濁液を位
相差顕微鏡により約１５００倍にて観察すると、大腸菌
体内の顆粒形成が認められた。
【００３３】続いて上記の如く培養した菌体懸濁液を遠
心分離機にかけ菌体を集め、２倍濃縮となるように、３
０ｍＭNaClを含む２０ｍＭTris-HCl緩衝液（ｐＨ７．
５）を添加し、懸濁後、０．５ＭEDTA（ｐＨ８．０）で
１ｍｇ／ｍｌになるように溶かしたリゾチーム溶液３
７．５ｍｌを添加し、撹はんした後、氷中にて１時間放
置した。ついで超音波破砕で菌体を破壊し、６０００ｒ
ｐｍ，５分間の遠心分離で顆粒を回収した。この顆粒を
６Ｍ塩酸グアニジンで可溶化し、目的ポリペプチド濃度
が２５０μｇ／ｍｌ、及び２Ｍ塩酸グアニジン溶液とな
るように調製した後、これに酸化型グルタチオン１ｍＭ
と還元型グルタチオン１０ｍＭとなるように添加し、ｐ
Ｈ８．０で室温で１０〜１６時間放置した。次に、５％
グリセロール、１００ｍＭKCl、０．０５ｍＭEDTAを含
む５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１
０．０）に対して透析を行い目的とするポリペプチドFv
(TU27)、及びポリペプチドFv(TU25)得た。本物質はＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動により、その分子量
は実施例６に従って推定されたアミノ酸配列から計算さ
れた値とそれぞれほぼ一致し、また、プロテインシーク
エンサーにてＮ末端側のアミノ酸配列を検定した結果、
予想されたアミノ酸配列のＮ末端にメチオニンが付加し
た配列を有することが確認された。配列表の配列番号１
及び２参照。
心分離機にかけ菌体を集め、２倍濃縮となるように、３
０ｍＭNaClを含む２０ｍＭTris-HCl緩衝液（ｐＨ７．
５）を添加し、懸濁後、０．５ＭEDTA（ｐＨ８．０）で
１ｍｇ／ｍｌになるように溶かしたリゾチーム溶液３
７．５ｍｌを添加し、撹はんした後、氷中にて１時間放
置した。ついで超音波破砕で菌体を破壊し、６０００ｒ
ｐｍ，５分間の遠心分離で顆粒を回収した。この顆粒を
６Ｍ塩酸グアニジンで可溶化し、目的ポリペプチド濃度
が２５０μｇ／ｍｌ、及び２Ｍ塩酸グアニジン溶液とな
るように調製した後、これに酸化型グルタチオン１ｍＭ
と還元型グルタチオン１０ｍＭとなるように添加し、ｐ
Ｈ８．０で室温で１０〜１６時間放置した。次に、５％
グリセロール、１００ｍＭKCl、０．０５ｍＭEDTAを含
む５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１
０．０）に対して透析を行い目的とするポリペプチドFv
(TU27)、及びポリペプチドFv(TU25)得た。本物質はＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動により、その分子量
は実施例６に従って推定されたアミノ酸配列から計算さ
れた値とそれぞれほぼ一致し、また、プロテインシーク
エンサーにてＮ末端側のアミノ酸配列を検定した結果、
予想されたアミノ酸配列のＮ末端にメチオニンが付加し
た配列を有することが確認された。配列表の配列番号１
及び２参照。
【００３４】（実施例６、塩基配列の決定、及びアミノ
酸配列の推定）構築したＶ領域のみからなるポリペプチ
ドを発現するプラスミドpFv(TU27)-DE、及びpFv（TU25)
-DEをアルカリＳＤＳ法にて精製し、市販されているシ
ークエンス用プライマーＭ４、あるいはＲＶ（宝酒造社
製）を用い、7-DEAZAシークエンスキット（宝酒造社
製）にて塩基配列を決定した。得られた塩基配列よりア
ミノ酸配列配列を推定した。なお、配列表の配列番号１
にポリペプチドFv(TU27)をコードする塩基配列とそれに
対応するアミノ酸配列、配列表の配列番号２にポリペプ
チドFv(TU25)をコードする塩基配列とそれに対応するア
ミノ酸配列を示した。即ち、配列表の配列番号１に示さ
れるように、ポリペプチドFv(TU27)はＮ末端にMet,Ｃ末
端にSerを有する２４０個のアミノ酸からなるポリペプ
チドである。また、ポリペプチドFv(TU25)はＮ末端にMe
t、Ｃ末端にSerを有する２３９個のアミノ酸からなるポ
リペプチドである。両配列のホモロジーを計算するとＬ
鎖においては９４、２％、Ｈ鎖においては６０、４％で
あった。また、Ｌ鎖及びＨ鎖を併せたトータルにおいて
は７６、８％である。このことは、若干構造が異なって
もＩＬ−２レセプターβ鎖に結合活性を有し、かつＩＬ
−２とＩＬ−２レセプターβ鎖との結合を阻害する活性
を有するポリペプチドの存在を立証している。
酸配列の推定）構築したＶ領域のみからなるポリペプチ
ドを発現するプラスミドpFv(TU27)-DE、及びpFv（TU25)
-DEをアルカリＳＤＳ法にて精製し、市販されているシ
ークエンス用プライマーＭ４、あるいはＲＶ（宝酒造社
製）を用い、7-DEAZAシークエンスキット（宝酒造社
製）にて塩基配列を決定した。得られた塩基配列よりア
ミノ酸配列配列を推定した。なお、配列表の配列番号１
にポリペプチドFv(TU27)をコードする塩基配列とそれに
対応するアミノ酸配列、配列表の配列番号２にポリペプ
チドFv(TU25)をコードする塩基配列とそれに対応するア
ミノ酸配列を示した。即ち、配列表の配列番号１に示さ
れるように、ポリペプチドFv(TU27)はＮ末端にMet,Ｃ末
端にSerを有する２４０個のアミノ酸からなるポリペプ
チドである。また、ポリペプチドFv(TU25)はＮ末端にMe
t、Ｃ末端にSerを有する２３９個のアミノ酸からなるポ
リペプチドである。両配列のホモロジーを計算するとＬ
鎖においては９４、２％、Ｈ鎖においては６０、４％で
あった。また、Ｌ鎖及びＨ鎖を併せたトータルにおいて
は７６、８％である。このことは、若干構造が異なって
もＩＬ−２レセプターβ鎖に結合活性を有し、かつＩＬ
−２とＩＬ−２レセプターβ鎖との結合を阻害する活性
を有するポリペプチドの存在を立証している。
【００３５】（実施例７、ポリペプチドFv(TU27)、及び
Fv(TU25)の抗体活性の検定）０．５％BSA、０．０２％N
aN3を含むRPMI-1640培地に懸濁した５Ｘ１０5個のＹＴ
細胞に、同培地にて適当な濃度に希釈したポリペプチド
Fv(TU27)、TU27抗体、ポリペプチドFv(TU25)及びTU25抗
体を添加し、４℃にて１時間反応した。次に、クロラミ
ンＴ法により125Ｉ標識したTU27抗体、あるいはTU25抗
体を添加し、４°Ｃにて２時間反応させた後、細胞に結
合した放射活性を測定した。図５に示す通り、ポリペプ
チドFv(TU27)、及びポリペプチドFv(TU25)はそれぞれTU
27モノクローナル抗体（ハイブリドーマ FERM BP-2510
由来）、TU25モノクローナル抗体（ハイブリドーマ、FE
RM BP-3529由来）のＹＴ細胞表面上にあるＩＬ−２レセ
プターβ鎖への結合を阻害する活性を有していることが
明らかとなった。次に、０．５％BSA、０．０２％NaN3
を含むRPMI-1640培地に懸濁した５Ｘ１０5個のＩＬ−２
レセプターβ鎖のｃＤＮＡを導入したMOLT4細胞に、同
培地にて適当な濃度に希釈したポリペプチドFv(TU27)、
TU27モノクローナル抗体（ハイブリドーマ FERM BP-251
0由来）、ポリペプチドFv(TU25)及びTU25モノクローナ
ル抗体（ハイブリドーマ、FERM BP-3529由来）を添加
し、４°Ｃにて１時間反応した。次に、ボルトンハンタ
ー法により125Ｉ標識したＩＬ−２を添加し、４°Ｃに
て２時間反応させた後、細胞に結合した放射活性を測定
した。図６に示す通り、ポリペプチドFv(TU27)及びFv(T
U25)はいづれもＩＬ−２のＩＬ−２レセプターβ鎖への
結合を阻害する活性を有していることが明らかとなっ
た。
Fv(TU25)の抗体活性の検定）０．５％BSA、０．０２％N
aN3を含むRPMI-1640培地に懸濁した５Ｘ１０5個のＹＴ
細胞に、同培地にて適当な濃度に希釈したポリペプチド
Fv(TU27)、TU27抗体、ポリペプチドFv(TU25)及びTU25抗
体を添加し、４℃にて１時間反応した。次に、クロラミ
ンＴ法により125Ｉ標識したTU27抗体、あるいはTU25抗
体を添加し、４°Ｃにて２時間反応させた後、細胞に結
合した放射活性を測定した。図５に示す通り、ポリペプ
チドFv(TU27)、及びポリペプチドFv(TU25)はそれぞれTU
27モノクローナル抗体（ハイブリドーマ FERM BP-2510
由来）、TU25モノクローナル抗体（ハイブリドーマ、FE
RM BP-3529由来）のＹＴ細胞表面上にあるＩＬ−２レセ
プターβ鎖への結合を阻害する活性を有していることが
明らかとなった。次に、０．５％BSA、０．０２％NaN3
を含むRPMI-1640培地に懸濁した５Ｘ１０5個のＩＬ−２
レセプターβ鎖のｃＤＮＡを導入したMOLT4細胞に、同
培地にて適当な濃度に希釈したポリペプチドFv(TU27)、
TU27モノクローナル抗体（ハイブリドーマ FERM BP-251
0由来）、ポリペプチドFv(TU25)及びTU25モノクローナ
ル抗体（ハイブリドーマ、FERM BP-3529由来）を添加
し、４°Ｃにて１時間反応した。次に、ボルトンハンタ
ー法により125Ｉ標識したＩＬ−２を添加し、４°Ｃに
て２時間反応させた後、細胞に結合した放射活性を測定
した。図６に示す通り、ポリペプチドFv(TU27)及びFv(T
U25)はいづれもＩＬ−２のＩＬ−２レセプターβ鎖への
結合を阻害する活性を有していることが明らかとなっ
た。
【００３６】
【発明の効果】本発明のＩＬ−２レセプターβ鎖に結合
して、ＩＬ−２のレセプターへの結合を阻害する活性を
有する抗体のＶ領域のみからなるポリペプチドは、臓器
移植時の拒絶反応の予防や自己免疫疾患の治療に有用で
かつ安全性の高い免疫抑制剤として利用できる。
して、ＩＬ−２のレセプターへの結合を阻害する活性を
有する抗体のＶ領域のみからなるポリペプチドは、臓器
移植時の拒絶反応の予防や自己免疫疾患の治療に有用で
かつ安全性の高い免疫抑制剤として利用できる。
【００３７】
【図１】プライマーの配列を示す。
【図２】Ｌ鎖Ｖ領域とＨ鎖Ｖ領域をつなぐ為のリンカー
のＤＮＡ配列を示す。
のＤＮＡ配列を示す。
【図３】プラスミドpFv-DEの構築工程を示す図面であ
る。
る。
【図４】プラスミドpFv(TU25)-DE、及びpFv(TU27)-DEの
構築工程を示す図面である。
構築工程を示す図面である。
【図５】Ｆｖ（ＴＵ２７）、及びＦｖ（ＴＵ２５）が、
それぞれ125Ｉ標識ＴＵ２７、125Ｉ標識ＴＵ２５抗体の
ＹＴ細胞への結合を阻害する活性を有することを示す図
面である。
それぞれ125Ｉ標識ＴＵ２７、125Ｉ標識ＴＵ２５抗体の
ＹＴ細胞への結合を阻害する活性を有することを示す図
面である。
【図６】Ｆｖ（ＴＵ２７）、及びＦｖ（ＴＵ２５）が、
125Ｉ標識ＩＬ−２のＩＬ−２レセプターβ鎖ｃＤＮＡ
導入ＭＯＬＴ４細胞への結合を阻害する活性を有するこ
とを示す図面である。
125Ｉ標識ＩＬ−２のＩＬ−２レセプターβ鎖ｃＤＮＡ
導入ＭＯＬＴ４細胞への結合を阻害する活性を有するこ
とを示す図面である。
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：７２０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 細胞の種類：ハイブリドーマ クローン名：FERM BP-2510 配列 ATG GAT ATT CTG CTG ACC CAG TCT CCA GCC ATC CTG TCT GTG AGT CCG 48 Met Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro 1 5 10 15 GGA GAA AGA GTC AGT TTC TCC TGC AGG GCC AGT CAG AGC ATT GGC ACA 96 Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr 20 25 30 AGC ATA CAC TGG TAT CAG CAA AGA ACA AAT GGT TCT CCA AGG CTT CTC 144 Ser Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu 35 40 45 ATT AAA TAT GCT TCT GAG TCT CTC TCT GGG ATC CCT TCC AGG TTT AGT 192 Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Leu Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTT ACT CTT AGC ATC ACC AGT GTG GAT 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Thr Ser Val Asp 65 70 75 80 TCT GAA GAT ATT GCA GAT TAT TAC TGT CAA CAA ACT AAT AGC TGG CCA 288 Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Ser Trp Pro 85 90 95 ACG ACG TTC GGT GGA GGG ACC AAG CTG GAG CTC AAA GTC GAC AAA TCC 336 Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Val Asp Lys Ser 100 105 110 TCA GGA TCT GGC TCC GAA TCC AAA AGC ACG CAG GTC AAA CTC GAG GAG 384 Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gln Val Lys Leu Glu Glu 115 120 125 TCT GGA CCT GGC CTG GTG AAA CCT TCT CAG TCT CTG TCC CTC ACC TGC 432 Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys 130 135 140 ACT GTC ACT GGC TAC CCA ATC ACC AGT GAT TAT GCC TGG GAC TGG ATC 480 Thr Val Thr Gly Tyr Pro Ile Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asp Trp Ile 145 150 155 160 CGG CAG TTT CCA GGA AAC AAA CTG GAG TGG ATG GGC TAC GTA AGC TAC 528 Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Val Ser Tyr 165 170 175 AGT GGT AGC ACT GAC TAC AAC CCA TCT CTC AAA AGT CGA ATC TCT ATC 576 Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile 180 185 190 AGT CGA GAC ACA TCC AAG AAC CAG TTC TTC CTG CAG TTG AAT TCT GTG 624 Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val 195 200 205 ACT ACT GAG GAC ACA GCC ACA TAT TAC TGT GCA AGA GGT GGT TTC CCC 672 Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Phe Pro 210 215 220 TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA 720 Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 240 配列番号：２ 配列の長さ：７１７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源： 細胞の種類：ハイブリドーマ クローン名：FERM BP-3529 配列 ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＴＴ ＣＡＧ ＣＴＧ ＡＣＣ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＣＡ
ＧＣＣ ＡＴＣ ＣＴＧ ＴＣＴ ＧＴＧ ＡＧＴ ＣＣＡ ４８ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ
Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｒｏ １ ５
１０ １５ ＧＧＡ ＧＡＡ ＡＧＡ ＧＴＣ ＡＧＴ ＴＴＣ ＴＣＣ ＴＧＣ ＡＧＧ
ＧＣＣ ＡＧＴ ＣＡＧ ＡＣＣ ＡＴＴ ＧＧＣ ＡＣＡ ９６ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ
Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｔｈｒ ２０ ２５
３０ ＡＧＣ ＡＴＡ ＣＡＣ ＴＧＧ ＴＡＴ ＣＡＧ ＣＡＡ ＡＧＡ ＡＣＡ
ＡＡＴ ＧＧＴ ＴＣＴ ＣＣＡ ＡＧＧ ＣＴＴ ＣＴＣ １４４ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｔｈｒ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｅｕ ３５ ４０
４５ ＡＴＡ ＡＡＧ ＴＡＴ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＡＧ ＴＣＴ ＡＴＣ ＴＣＴ
ＧＧＧ ＡＴＣ ＣＣＴ ＴＣＣ ＡＧＧ ＴＴＴ ＡＧＴ １９２ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｓｅｒ ５０ ５５
６０ ＧＧＣ ＡＧＴ ＧＧＡ ＴＣＡ ＧＧＧ ＡＣＡ ＧＡＴ ＴＴＴ ＡＣＴ
ＣＴＴ ＡＧＣ ＡＴＣ ＡＡＣ ＡＡＴ ＧＴＧ ＧＡＧ ２４０ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｔｈｒ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｇｌｕ ６５ ７０
７５ ８０ ＴＣＴ ＧＡＡ ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＣＡ ＧＡＴ ＴＡＴ ＴＡＣ ＴＧＴ
ＣＡＡ ＣＡＡ ＡＣＴ ＡＡＴ ＡＣＣ ＴＧＧ ＣＣＡ ２８８ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｃｙｓ
Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ｐｒｏ ８５
９０ ９５ ＡＣＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＧＧＣ ＴＣＧ ＧＧＧ ＡＣＣ ＡＡＧ ＣＴＧ
ＧＡＧ ＣＴＣ ＡＡＡ ＧＴＣ ＧＡＣ ＡＡＡ ＴＣＣ ３３６ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ １００ １０５
１１０ ＴＣＡ ＧＧＡ ＴＣＴ ＧＧＣ ＴＣＣ ＧＡＡ ＴＣＣ ＡＡＡ ＡＧＣ
ＡＣＧ ＣＡＧ ＧＴＣ ＡＡＡ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＡＧ ３８４ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ １１５ １２０
１２５ ＴＣＡ ＧＧＧ ＧＧＡ ＧＧＣ ＴＴＡ ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＣＴ ＧＧＡ
ＧＧＧ ＴＣＣ ＣＴＧ ＡＡＡ ＣＴＣ ＴＣＣ ＴＧＴ ４３２ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｃｙｓ １３０ １３５
１４０ ＧＣＡ ＧＣＣ ＴＣＴ ＧＧＡ ＴＴＣ ＧＣＴ ＴＴＣ ＡＧＴ ＡＧＴ
ＴＡＴ ＧＡＣ ＡＴＧ ＴＣＴ ＴＧＧ ＧＴＴ ＣＧＣ ４８０ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｒｇ １４５ １５０
１５５ １６０ ＣＡＧ ＡＣＴ ＣＣＧ ＧＡＧ ＡＡＧ ＡＧＧ ＣＴＧ ＡＡＧ ＴＧＧ
ＧＴＣ ＧＣＡ ＡＣＣ ＴＴＴ ＡＧＴ ＡＧＴ ＧＡＴ ５２８ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｔｒｐ
Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ １６５
１７０ １７５ ＧＧＴ ＡＧＴ ＧＡＣ ＡＣＣ ＧＡＣ ＴＡＴ ＣＣＡ ＧＡＣ ＡＧＴ
ＧＴＧ ＡＡＧ ＧＧＣ ＣＧＡ ＴＴＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ５７６ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ
Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｉｌｅ １８０ １８５
１９０ ＴＣＣ ＡＧＡ ＧＡＣ ＡＡＴ ＧＣＣ ＡＧＧ ＡＡＣ ＡＣＣ ＣＴＧ
ＴＡＣ ＣＴＧ ＣＡＡ ＡＴＧ ＡＧＣ ＡＧＴ ＣＴＧ ６２４ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ １９５ ２００
２０５ ＡＧＧ ＴＣＴ ＧＡＧ ＧＡＣ ＡＣＧ ＧＣＣ ＴＴＧ ＴＡＴ ＴＡＣ
ＴＧＴ ＧＣＡ ＡＧＧ ＧＧＧ ＴＡＣ ＣＣＣ ＴＡＴ ６７２ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｔｙｒ
Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｔｙｒ ２１０ ２１５
２２０ ＧＣＴ ＡＴＧ ＧＡＣ ＴＡＣ ＴＧＧ ＧＧＴ ＣＡＡ ＧＧＧ ＡＣＣ
ＡＣＧ ＧＴＣ ＡＣＣ ＧＴＣ ＴＣＣ ＴＣＡ ７１７ Ａｌａ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ ２１５ ２２０
２２５
ＧＣＣ ＡＴＣ ＣＴＧ ＴＣＴ ＧＴＧ ＡＧＴ ＣＣＡ ４８ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ
Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｒｏ １ ５
１０ １５ ＧＧＡ ＧＡＡ ＡＧＡ ＧＴＣ ＡＧＴ ＴＴＣ ＴＣＣ ＴＧＣ ＡＧＧ
ＧＣＣ ＡＧＴ ＣＡＧ ＡＣＣ ＡＴＴ ＧＧＣ ＡＣＡ ９６ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ
Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｔｈｒ ２０ ２５
３０ ＡＧＣ ＡＴＡ ＣＡＣ ＴＧＧ ＴＡＴ ＣＡＧ ＣＡＡ ＡＧＡ ＡＣＡ
ＡＡＴ ＧＧＴ ＴＣＴ ＣＣＡ ＡＧＧ ＣＴＴ ＣＴＣ １４４ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｔｈｒ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｅｕ ３５ ４０
４５ ＡＴＡ ＡＡＧ ＴＡＴ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＡＧ ＴＣＴ ＡＴＣ ＴＣＴ
ＧＧＧ ＡＴＣ ＣＣＴ ＴＣＣ ＡＧＧ ＴＴＴ ＡＧＴ １９２ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｓｅｒ ５０ ５５
６０ ＧＧＣ ＡＧＴ ＧＧＡ ＴＣＡ ＧＧＧ ＡＣＡ ＧＡＴ ＴＴＴ ＡＣＴ
ＣＴＴ ＡＧＣ ＡＴＣ ＡＡＣ ＡＡＴ ＧＴＧ ＧＡＧ ２４０ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｔｈｒ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｇｌｕ ６５ ７０
７５ ８０ ＴＣＴ ＧＡＡ ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＣＡ ＧＡＴ ＴＡＴ ＴＡＣ ＴＧＴ
ＣＡＡ ＣＡＡ ＡＣＴ ＡＡＴ ＡＣＣ ＴＧＧ ＣＣＡ ２８８ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｃｙｓ
Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ｐｒｏ ８５
９０ ９５ ＡＣＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＧＧＣ ＴＣＧ ＧＧＧ ＡＣＣ ＡＡＧ ＣＴＧ
ＧＡＧ ＣＴＣ ＡＡＡ ＧＴＣ ＧＡＣ ＡＡＡ ＴＣＣ ３３６ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ １００ １０５
１１０ ＴＣＡ ＧＧＡ ＴＣＴ ＧＧＣ ＴＣＣ ＧＡＡ ＴＣＣ ＡＡＡ ＡＧＣ
ＡＣＧ ＣＡＧ ＧＴＣ ＡＡＡ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＡＧ ３８４ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ １１５ １２０
１２５ ＴＣＡ ＧＧＧ ＧＧＡ ＧＧＣ ＴＴＡ ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＣＴ ＧＧＡ
ＧＧＧ ＴＣＣ ＣＴＧ ＡＡＡ ＣＴＣ ＴＣＣ ＴＧＴ ４３２ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｃｙｓ １３０ １３５
１４０ ＧＣＡ ＧＣＣ ＴＣＴ ＧＧＡ ＴＴＣ ＧＣＴ ＴＴＣ ＡＧＴ ＡＧＴ
ＴＡＴ ＧＡＣ ＡＴＧ ＴＣＴ ＴＧＧ ＧＴＴ ＣＧＣ ４８０ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｒｇ １４５ １５０
１５５ １６０ ＣＡＧ ＡＣＴ ＣＣＧ ＧＡＧ ＡＡＧ ＡＧＧ ＣＴＧ ＡＡＧ ＴＧＧ
ＧＴＣ ＧＣＡ ＡＣＣ ＴＴＴ ＡＧＴ ＡＧＴ ＧＡＴ ５２８ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｔｒｐ
Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ １６５
１７０ １７５ ＧＧＴ ＡＧＴ ＧＡＣ ＡＣＣ ＧＡＣ ＴＡＴ ＣＣＡ ＧＡＣ ＡＧＴ
ＧＴＧ ＡＡＧ ＧＧＣ ＣＧＡ ＴＴＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ５７６ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ
Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｉｌｅ １８０ １８５
１９０ ＴＣＣ ＡＧＡ ＧＡＣ ＡＡＴ ＧＣＣ ＡＧＧ ＡＡＣ ＡＣＣ ＣＴＧ
ＴＡＣ ＣＴＧ ＣＡＡ ＡＴＧ ＡＧＣ ＡＧＴ ＣＴＧ ６２４ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ １９５ ２００
２０５ ＡＧＧ ＴＣＴ ＧＡＧ ＧＡＣ ＡＣＧ ＧＣＣ ＴＴＧ ＴＡＴ ＴＡＣ
ＴＧＴ ＧＣＡ ＡＧＧ ＧＧＧ ＴＡＣ ＣＣＣ ＴＡＴ ６７２ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｔｙｒ
Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｔｙｒ ２１０ ２１５
２２０ ＧＣＴ ＡＴＧ ＧＡＣ ＴＡＣ ＴＧＧ ＧＧＴ ＣＡＡ ＧＧＧ ＡＣＣ
ＡＣＧ ＧＴＣ ＡＣＣ ＧＴＣ ＴＣＣ ＴＣＡ ７１７ Ａｌａ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ ２１５ ２２０
２２５
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年８月２１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００５】ところで、ＩＬ−２応答細胞上のＩＬ−２
レセプターは、ともにＩＬ−２との結合能を有する分子
量が約75,000のβ鎖と約55,000のα鎖の２つの糖タンパ
ク質分子からなることが知られている。それぞれの分子
とＩＬ−２との結合の解離定数は、α鎖の場合１０
ー8 Ｍ、β鎖の場合１０ ー9 Ｍであるが、α鎖とβ鎖の両方
の分子が接してＩＬ−２との三者の会合体が形成された
場合には、解離定数が１０ ー12 Ｍという高親和性の結合
となることが明らかとなっている。また、α鎖のみを発
現している細胞では、ＩＬ−２が結合してもなんら応答
反応が生じないが、β鎖、もしくはβ鎖とα鎖の両鎖を
発現している細胞では、ＩＬ−２の結合により様々な生
理活性が惹起されることから、ＩＬ−２の生理的機能が
発現されるためにはＩＬ−２レセプターのβ鎖の存在が
必須であると考えられるようになってきた。すなわち、
ＩＬ−２とβ鎖の結合を阻害できれば、ＩＬ−２に対す
る応答が生じなくなるものと推定される。
レセプターは、ともにＩＬ−２との結合能を有する分子
量が約75,000のβ鎖と約55,000のα鎖の２つの糖タンパ
ク質分子からなることが知られている。それぞれの分子
とＩＬ−２との結合の解離定数は、α鎖の場合１０
ー8 Ｍ、β鎖の場合１０ ー9 Ｍであるが、α鎖とβ鎖の両方
の分子が接してＩＬ−２との三者の会合体が形成された
場合には、解離定数が１０ ー12 Ｍという高親和性の結合
となることが明らかとなっている。また、α鎖のみを発
現している細胞では、ＩＬ−２が結合してもなんら応答
反応が生じないが、β鎖、もしくはβ鎖とα鎖の両鎖を
発現している細胞では、ＩＬ−２の結合により様々な生
理活性が惹起されることから、ＩＬ−２の生理的機能が
発現されるためにはＩＬ−２レセプターのβ鎖の存在が
必須であると考えられるようになってきた。すなわち、
ＩＬ−２とβ鎖の結合を阻害できれば、ＩＬ−２に対す
る応答が生じなくなるものと推定される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１４】その選択は例えば以下の様な方法を用いて
行うことができる。すなわち、一次スクリーニングとし
て 125Ｉ標識ヒトＩＬ−２を作成し、ハイブリドーマ培
養上清による 125Ｉ標識ヒトＩＬ−２と、ＩＬ−２レセ
プターのβ鎖分子，及びα鎖分子をともに発現している
TL-Mor細胞との結合阻害を測定する。二次スクリーニン
グとして、ハイブリドーマ培養上清による 125Ｉ標識ヒ
トＩＬ−２と、ＩＬ−２レセプターのα鎖のみを発現し
ているヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス感染Ｔ細胞株であ
るMT-1細胞との結合阻害活性を測定する。TL-Mor細胞と
ＩＬ−２との結合阻害活性を有しており、MT-1細胞とＩ
Ｌ−２との結合阻害活性を有していなければ、そのハイ
ブリドーマがＩＬ−２レセプターのβ鎖分子に対する抗
体を産生しているハイブリドーマとなる。
行うことができる。すなわち、一次スクリーニングとし
て 125Ｉ標識ヒトＩＬ−２を作成し、ハイブリドーマ培
養上清による 125Ｉ標識ヒトＩＬ−２と、ＩＬ−２レセ
プターのβ鎖分子，及びα鎖分子をともに発現している
TL-Mor細胞との結合阻害を測定する。二次スクリーニン
グとして、ハイブリドーマ培養上清による 125Ｉ標識ヒ
トＩＬ−２と、ＩＬ−２レセプターのα鎖のみを発現し
ているヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス感染Ｔ細胞株であ
るMT-1細胞との結合阻害活性を測定する。TL-Mor細胞と
ＩＬ−２との結合阻害活性を有しており、MT-1細胞とＩ
Ｌ−２との結合阻害活性を有していなければ、そのハイ
ブリドーマがＩＬ−２レセプターのβ鎖分子に対する抗
体を産生しているハイブリドーマとなる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１５】 125Ｉ標識ヒトＩＬ−２の作成法として
は、ＩＬ−２が生理活性を有している限り、ボルトン・
ハンター法、ラクトパーオキシダーゼ法、クロラミンー
Ｔ法などいかなる方法を用いてもかまわない。また、一
次スクリーニングに用いる細胞は、β鎖、及びα鎖をと
もに発現しているヒト細胞である限り、いかなる細胞を
用いてもかまわない。また、二次スクリーニングに用い
る細胞も、β鎖、あるいはα鎖のいづれか一方を発現し
ているヒト細胞である限り、いかなる細胞を用いてもか
まわない。
は、ＩＬ−２が生理活性を有している限り、ボルトン・
ハンター法、ラクトパーオキシダーゼ法、クロラミンー
Ｔ法などいかなる方法を用いてもかまわない。また、一
次スクリーニングに用いる細胞は、β鎖、及びα鎖をと
もに発現しているヒト細胞である限り、いかなる細胞を
用いてもかまわない。また、二次スクリーニングに用い
る細胞も、β鎖、あるいはα鎖のいづれか一方を発現し
ているヒト細胞である限り、いかなる細胞を用いてもか
まわない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２５】
【実施例】 （実施例１、ハイブリドーマの調製）６〜８週令の雌の
BALB/cマウスに、生理食塩水に懸濁したTL-Mor細胞を１
匹あたり１ｘ１０個 7 腹腔内投与することにより免疫し
た。その１０日後、同様の操作により追加免疫し、更に
その５日後、マウスの眼窩静脈より採血して、後に述べ
る参考例に示す方法に従って 125Ｉ標識ＩＬ−２のTL-Mo
r細胞に対する結合阻害活性を調べることにより抗体価
を測定した。抗体価の高かったマウスを更に同様の操作
にて最終免疫し、その３日後、脾臓を摘出して脾臓細胞
とマウス骨髄腫細胞（SP2/0-Ag14）とを、５０％ポリエ
チレングリコール＃４０００（半井化学社製）存在下に
て細胞数で１０：１の割合で混合し、細胞融合させた。
融合細胞を、１０％牛胎児血清（ギブコ社製）を含むRP
MI1640培地（ギブコ社製）にて５ｘ１０ 6 個／ｍｌとな
るように懸濁し、１穴あたり５ｘ１０ 5 個のマウス胸腺
細胞を含有する９６穴平底プレート（コーニング社製）
に１００μｌずつ分注した。１日、２日、３日、６日後
に培地の半量をヒポキサンチン、アミノプテリン、チミ
ジンを含む培地（ＨＡＴ培地）と交換し、以後３日ごと
に同様の操作を繰り返した。融合より約２週間後、融合
した細胞（ハイブリドーマ）の増殖してきた各穴の培養
上清について、 125Ｉ標識ＩＬ−２のTL-Mor細胞に対す
る結合阻害活性、及びMT-1細胞に対する結合阻害活性を
測定し、TL-Mor細胞に対する結合阻害活性を有してお
り、MT-1細胞に対する結合阻害活性を有していない穴に
含まれるハイブリドーマを、限界希釈法にてクローン化
した。
BALB/cマウスに、生理食塩水に懸濁したTL-Mor細胞を１
匹あたり１ｘ１０個 7 腹腔内投与することにより免疫し
た。その１０日後、同様の操作により追加免疫し、更に
その５日後、マウスの眼窩静脈より採血して、後に述べ
る参考例に示す方法に従って 125Ｉ標識ＩＬ−２のTL-Mo
r細胞に対する結合阻害活性を調べることにより抗体価
を測定した。抗体価の高かったマウスを更に同様の操作
にて最終免疫し、その３日後、脾臓を摘出して脾臓細胞
とマウス骨髄腫細胞（SP2/0-Ag14）とを、５０％ポリエ
チレングリコール＃４０００（半井化学社製）存在下に
て細胞数で１０：１の割合で混合し、細胞融合させた。
融合細胞を、１０％牛胎児血清（ギブコ社製）を含むRP
MI1640培地（ギブコ社製）にて５ｘ１０ 6 個／ｍｌとな
るように懸濁し、１穴あたり５ｘ１０ 5 個のマウス胸腺
細胞を含有する９６穴平底プレート（コーニング社製）
に１００μｌずつ分注した。１日、２日、３日、６日後
に培地の半量をヒポキサンチン、アミノプテリン、チミ
ジンを含む培地（ＨＡＴ培地）と交換し、以後３日ごと
に同様の操作を繰り返した。融合より約２週間後、融合
した細胞（ハイブリドーマ）の増殖してきた各穴の培養
上清について、 125Ｉ標識ＩＬ−２のTL-Mor細胞に対す
る結合阻害活性、及びMT-1細胞に対する結合阻害活性を
測定し、TL-Mor細胞に対する結合阻害活性を有してお
り、MT-1細胞に対する結合阻害活性を有していない穴に
含まれるハイブリドーマを、限界希釈法にてクローン化
した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２６】更にそれぞれのハイブリドーマクローンの
培養上清中の阻害活性を測定して、抗ＩＬ−２レセプタ
ーβ鎖抗体産生ハイブリドーマを得た。更に、得られた
抗ＩＬ−２レセプターβ鎖抗体産生ハイブリドーマの培
養上清について、以下の方法にてＩＬ−２の生理活性の
抑制能を調べた。１０％牛胎児血清を含むRPMI1640培地
にて２ｘ１０ 5 個／ｍｌの濃度となるように懸濁したILT
-Mat細胞液を１穴あたり１００μｌずつ９６穴平底マイ
クロプレートに分注して、サンプルの培養上清を５０μ
ｌ加え、３７℃、３０分間インキュベートした。更に、
１０％牛胎児血清を含むRPMI1640培地にて２００ｕ／ｍ
ｌに調製したヒトリコンビナントＩＬ−２溶液を５０μ
ｌずつ加えて、５％ＣＯ2存在下３７℃にて４８時間培
養した。最後の４時間は１μＣｉの3Ｈ−チミジン（デ
ュポン社製）を加えて培養し、細胞内に取り込まれた放
射活性量をシンチレーシンカウンター（パッカード社
製）にて測定することにより、培養上清によるＩＬ−２
の生理活性の阻害能を調べた。このような方法にて抗Ｉ
Ｌ−２レセプターβ鎖に対する抗体を産生するハイブリ
ドーマを調製した。こうして得られたハイブリドーマと
してＴＵ２７（FERM BP-2510）、ＴＵ２５（FERM BP-35
29）がある。
培養上清中の阻害活性を測定して、抗ＩＬ−２レセプタ
ーβ鎖抗体産生ハイブリドーマを得た。更に、得られた
抗ＩＬ−２レセプターβ鎖抗体産生ハイブリドーマの培
養上清について、以下の方法にてＩＬ−２の生理活性の
抑制能を調べた。１０％牛胎児血清を含むRPMI1640培地
にて２ｘ１０ 5 個／ｍｌの濃度となるように懸濁したILT
-Mat細胞液を１穴あたり１００μｌずつ９６穴平底マイ
クロプレートに分注して、サンプルの培養上清を５０μ
ｌ加え、３７℃、３０分間インキュベートした。更に、
１０％牛胎児血清を含むRPMI1640培地にて２００ｕ／ｍ
ｌに調製したヒトリコンビナントＩＬ−２溶液を５０μ
ｌずつ加えて、５％ＣＯ2存在下３７℃にて４８時間培
養した。最後の４時間は１μＣｉの3Ｈ−チミジン（デ
ュポン社製）を加えて培養し、細胞内に取り込まれた放
射活性量をシンチレーシンカウンター（パッカード社
製）にて測定することにより、培養上清によるＩＬ−２
の生理活性の阻害能を調べた。このような方法にて抗Ｉ
Ｌ−２レセプターβ鎖に対する抗体を産生するハイブリ
ドーマを調製した。こうして得られたハイブリドーマと
してＴＵ２７（FERM BP-2510）、ＴＵ２５（FERM BP-35
29）がある。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２７】（実施例２、ハイブリドーマより抗体のＶ
領域ｃＤＮＡの調製）５ｘ１０ 6 個のハイブリドーマＴ
Ｕ２７、あるいはＴＵ２５をPBSにて洗浄後、guanidine
thiocyanate, N-lauryl sarcosine, EDTAを含むＲＮＡ
抽出用緩衝液（ファルマシア社製）を加えて懸濁した
後、あらかじめ等容量のCesium Cloride溶液（ρ=1.51g
/ml,ファルマシア社製）を入れたチューブ重層し、１２
５，０００Ｘｇにて１６時間遠心した。上清を吸い取っ
たのち、１ｍＭEDTAを含む１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液
（ｐＨ７．５）を加えて懸濁し、新しいチューブに入
れ、６５℃で５分間インキュベートした。更に、２Ｍ P
otassium Acetate（ｐＨ５．０）（ファルマシア社製）
を１／１０容量とエタノール（ナカライテスク社製）を
３倍容量加えて、−２０℃に一晩放置した。５，０００
Ｘｇにて２０分間遠心して、上清を捨てた後、８０％エ
タノールにて遠心洗浄し、沈澱を乾燥させた。沈澱を１
ｍＭEDTAを含む１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．
５）にて溶解してtotalＲＮＡ画分とした。
領域ｃＤＮＡの調製）５ｘ１０ 6 個のハイブリドーマＴ
Ｕ２７、あるいはＴＵ２５をPBSにて洗浄後、guanidine
thiocyanate, N-lauryl sarcosine, EDTAを含むＲＮＡ
抽出用緩衝液（ファルマシア社製）を加えて懸濁した
後、あらかじめ等容量のCesium Cloride溶液（ρ=1.51g
/ml,ファルマシア社製）を入れたチューブ重層し、１２
５，０００Ｘｇにて１６時間遠心した。上清を吸い取っ
たのち、１ｍＭEDTAを含む１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液
（ｐＨ７．５）を加えて懸濁し、新しいチューブに入
れ、６５℃で５分間インキュベートした。更に、２Ｍ P
otassium Acetate（ｐＨ５．０）（ファルマシア社製）
を１／１０容量とエタノール（ナカライテスク社製）を
３倍容量加えて、−２０℃に一晩放置した。５，０００
Ｘｇにて２０分間遠心して、上清を捨てた後、８０％エ
タノールにて遠心洗浄し、沈澱を乾燥させた。沈澱を１
ｍＭEDTAを含む１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．
５）にて溶解してtotalＲＮＡ画分とした。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２８】次に、totalＲＮＡ画分溶液に、あらかじ
めデザインした抗体のＨ鎖、Ｌ鎖のＶ領域の３’側に相
補的なプライマー溶液（最終濃度で１μＭ）、deoxyNTP
混合液、ｃＤＮＡ合成用緩衝液（アマシャム社製）、RN
Aase Inhibitor（宝酒造社製）、及びReverse Transcri
ptase（宝酒造社製）を加えて４２℃にて１時間反応さ
せｃＤＮＡを合成した。更に、ＰＣＲ用緩衝液（シータ
ス社製）、deoxyNTP混合液、抗体Ｈ鎖、及び抗体Ｌ鎖Ｖ
領域ｃＤＮＡ増幅用５’側プライマー、及び３’側プラ
イマー（それぞれ最終濃度１μＭ）、及びTaq Polymera
se（宝酒造社製）を加えＰＣＲ（シータス社、サーマル
サイクラー）を行った。反応は変性３０秒（９４℃）、
アニール３０秒（５５℃）、プライマーイクステンショ
ン１分（７２℃）にて３０サイクル行い、各サイクル毎
にプライマーイクステンションの時間を１５秒ずつ延長
させた。反応後、１ｍＭEDTAを含む４０ｍＭトリス酢酸
緩衝液（ｐＨ８．０）にてアガロースゲル電気泳動を行
い、該当するｃＤＮＡフラグメントを切り出し、ジーン
クリーンキット（バイオ１０１社製）を用いて抽出・精
製した。なお、ＰＣＲに用いたプライマーの配列を図１
に示した。
めデザインした抗体のＨ鎖、Ｌ鎖のＶ領域の３’側に相
補的なプライマー溶液（最終濃度で１μＭ）、deoxyNTP
混合液、ｃＤＮＡ合成用緩衝液（アマシャム社製）、RN
Aase Inhibitor（宝酒造社製）、及びReverse Transcri
ptase（宝酒造社製）を加えて４２℃にて１時間反応さ
せｃＤＮＡを合成した。更に、ＰＣＲ用緩衝液（シータ
ス社製）、deoxyNTP混合液、抗体Ｈ鎖、及び抗体Ｌ鎖Ｖ
領域ｃＤＮＡ増幅用５’側プライマー、及び３’側プラ
イマー（それぞれ最終濃度１μＭ）、及びTaq Polymera
se（宝酒造社製）を加えＰＣＲ（シータス社、サーマル
サイクラー）を行った。反応は変性３０秒（９４℃）、
アニール３０秒（５５℃）、プライマーイクステンショ
ン１分（７２℃）にて３０サイクル行い、各サイクル毎
にプライマーイクステンションの時間を１５秒ずつ延長
させた。反応後、１ｍＭEDTAを含む４０ｍＭトリス酢酸
緩衝液（ｐＨ８．０）にてアガロースゲル電気泳動を行
い、該当するｃＤＮＡフラグメントを切り出し、ジーン
クリーンキット（バイオ１０１社製）を用いて抽出・精
製した。なお、ＰＣＲに用いたプライマーの配列を図１
に示した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３０】次に、同じく図３に示す通り、合成ＤＮＡ
断片とプラスミドpT13SNcoを制限酵素ClaIとBamHIで切
断して得られる大きい断片を連結して得たプラスミドを
制限酵素EcoRI、PvuII（いずれも宝酒造社製）にて切断
して得られる小さいＤＮＡ断片と、pUC18（Messing J.,
Methods in Enzymology, 101巻, 20-78頁, 1983年）の
HindIIIサイトとNdeIサイトを、制限酵素で切断後Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）で平滑化し、更にＴ
４リガーゼを用いて連結することにより消失させたもの
を、EcoRI、HincII（宝酒造社製）にて切断して得られ
る大きいＤＮＡ断片とをＴ４リガーゼにて連結すること
により、複製起点をpUC系とするpFv-DEを得た。
断片とプラスミドpT13SNcoを制限酵素ClaIとBamHIで切
断して得られる大きい断片を連結して得たプラスミドを
制限酵素EcoRI、PvuII（いずれも宝酒造社製）にて切断
して得られる小さいＤＮＡ断片と、pUC18（Messing J.,
Methods in Enzymology, 101巻, 20-78頁, 1983年）の
HindIIIサイトとNdeIサイトを、制限酵素で切断後Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）で平滑化し、更にＴ
４リガーゼを用いて連結することにより消失させたもの
を、EcoRI、HincII（宝酒造社製）にて切断して得られ
る大きいＤＮＡ断片とをＴ４リガーゼにて連結すること
により、複製起点をpUC系とするpFv-DEを得た。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３５】（実施例７、ポリペプチドFv(TU27)、及び
Fv(TU25)の抗体活性の検定）０．５％BSA、０．０２％N
aN3を含むRPMI-1640培地に懸濁した５ｘ１０ 5 個のＹＴ
細胞に、同培地にて適当な濃度に希釈したポリペプチド
Fv(TU27)、TU27抗体、ポリペプチドFv(TU25)及びTU25抗
体を添加し、４℃にて１時間反応した。次に、クロラミ
ンＴ法により 125Ｉ標識したTU27抗体、あるいはTU25抗
体を添加し、４°Ｃにて２時間反応させた後、細胞に結
合した放射活性を測定した。図５に示す通り、ポリペプ
チドFv(TU27)、及びポリペプチドFv(TU25)はそれぞれTU
27モノクローナル抗体（ハイブリドーマ FERM BP-2510
由来）、TU25モノクローナル抗体（ハイブリドーマ、FE
RM BP-3529由来）のＹＴ細胞表面上にあるＩＬ−２レセ
プターβ鎖への結合を阻害する活性を有していることが
明らかとなった。次に、０．５％BSA、０．０２％NaN3
を含むRPMI-1640培地に懸濁した５ｘ１０ 5 個のＩＬ−２
レセプターβ鎖のｃＤＮＡを導入したMOLT4細胞に、同
培地にて適当な濃度に希釈したポリペプチドFv(TU27)、
TU27モノクローナル抗体（ハイブリドーマ FERM BP-251
0由来）、ポリペプチドFv(TU25)及びTU25モノクローナ
ル抗体（ハイブリドーマ、FERM BP-3529由来）を添加
し、４°Ｃにて１時間反応した。次に、ボルトンハンタ
ー法により 125Ｉ標識したＩＬ−２を添加し、４°Ｃに
て２時間反応させた後、細胞に結合した放射活性を測定
した。図６に示す通り、ポリペプチドFv(TU27)及びFv(T
U25)はいづれもＩＬ−２のＩＬ−２レセプターβ鎖への
結合を阻害する活性を有していることが明らかとなっ
た。
Fv(TU25)の抗体活性の検定）０．５％BSA、０．０２％N
aN3を含むRPMI-1640培地に懸濁した５ｘ１０ 5 個のＹＴ
細胞に、同培地にて適当な濃度に希釈したポリペプチド
Fv(TU27)、TU27抗体、ポリペプチドFv(TU25)及びTU25抗
体を添加し、４℃にて１時間反応した。次に、クロラミ
ンＴ法により 125Ｉ標識したTU27抗体、あるいはTU25抗
体を添加し、４°Ｃにて２時間反応させた後、細胞に結
合した放射活性を測定した。図５に示す通り、ポリペプ
チドFv(TU27)、及びポリペプチドFv(TU25)はそれぞれTU
27モノクローナル抗体（ハイブリドーマ FERM BP-2510
由来）、TU25モノクローナル抗体（ハイブリドーマ、FE
RM BP-3529由来）のＹＴ細胞表面上にあるＩＬ−２レセ
プターβ鎖への結合を阻害する活性を有していることが
明らかとなった。次に、０．５％BSA、０．０２％NaN3
を含むRPMI-1640培地に懸濁した５ｘ１０ 5 個のＩＬ−２
レセプターβ鎖のｃＤＮＡを導入したMOLT4細胞に、同
培地にて適当な濃度に希釈したポリペプチドFv(TU27)、
TU27モノクローナル抗体（ハイブリドーマ FERM BP-251
0由来）、ポリペプチドFv(TU25)及びTU25モノクローナ
ル抗体（ハイブリドーマ、FERM BP-3529由来）を添加
し、４°Ｃにて１時間反応した。次に、ボルトンハンタ
ー法により 125Ｉ標識したＩＬ−２を添加し、４°Ｃに
て２時間反応させた後、細胞に結合した放射活性を測定
した。図６に示す通り、ポリペプチドFv(TU27)及びFv(T
U25)はいづれもＩＬ−２のＩＬ−２レセプターβ鎖への
結合を阻害する活性を有していることが明らかとなっ
た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ 15/13 15/70 // Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＣ 8314−4Ｃ 39/395 Ｕ 9284−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/20 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） 8931−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ
Claims (14)
- 【請求項１】（１）ヒトインターロイキン２（以下ＩＬ
−２と略する）受容体重鎖に結合活性を有し、かつ
（２）ＩＬ−２とＩＬ−２受容体重鎖との結合を阻害す
る活性を有するポリペプチド。 - 【請求項２】 ポリペプチドがＩＬ−２受容体重鎖に対
するモノクローナル抗体のＨ鎖及びＬ鎖可変領域（以
下、Ｖ領域と略する）を含む請求項１記載のポリペプチ
ド。 - 【請求項３】 ポリペプチドが配列表の配列番号１記載
のアミノ酸配列を有する請求項１叉は２記載のポリペプ
チド。 - 【請求項４】 ポリペプチドが配列表の配列番号２記載
のアミノ酸配列を有する請求項１叉は２記載のポリペプ
チド。 - 【請求項５】 ポリペプチドが配列表の配列番号１記載
のアミノ酸配列のＮ末端Ｍｅｔが除かれたものである請
求項１又は２記載のポリペプチド。 - 【請求項６】 ポリペプチドが配列表の配列番号２記載
のアミノ酸配列のＮ末端Ｍｅｔが除かれたものである請
求項１又は２記載のポリペプチド。 - 【請求項７】 請求項１、２、３、４、５又は６記載の
ポリペプチドをコードする遺伝子。 - 【請求項８】 遺伝子が配列表の配列番号１記載のＤＮ
Ａ配列を有する請求項７記載の遺伝子。 - 【請求項９】 遺伝子が配列表の配列番号２記載のＤＮ
Ａ配列を有する請求項７記載の遺伝子。 - 【請求項１０】 請求項７、８叉は９記載の遺伝子を有
するプラスミド。 - 【請求項１１】 請求項１０記載のプラスミドを有する
形質転換体。 - 【請求項１２】 形質転換体が大腸菌である請求項１１
記載の形質転換体。 - 【請求項１３】 請求項１１叉は１２記載の形質転換体
を培養することにより、目的とする（１）ヒトＩＬ−２
受容体重鎖に結合活性を有し、かつ（２）ＩＬ−２とＩ
Ｌ−２受容体重鎖との結合を阻害する活性を有するポリ
ペプチドを生産させた後、該ポリペプチドを取得するこ
とを特徴とする該ポリペプチドの製造法。 - 【請求項１４】 請求項１、２、３、４、５又は６記載
のポリペプチドを含有してなる免疫抑制剤。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3256335A JP3024311B2 (ja) | 1991-10-03 | 1991-10-03 | Ｉｌ−２受容体重鎖に結合するポリペプチド |
| DE69230659T DE69230659T2 (de) | 1991-10-03 | 1992-09-30 | Polypeptide, die an die schweren Ketten von IL-2-Rezeptoren binden können |
| EP92116746A EP0539748B1 (en) | 1991-10-03 | 1992-09-30 | Polypeptides capable of binding to heavy chains of IL-2 receptors |
| US07/956,399 US5876717A (en) | 1991-10-03 | 1992-10-05 | Polypeptides capable of binding to heavy chains of IL-2 receptors |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3256335A JP3024311B2 (ja) | 1991-10-03 | 1991-10-03 | Ｉｌ−２受容体重鎖に結合するポリペプチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05304991A true JPH05304991A (ja) | 1993-11-19 |
| JP3024311B2 JP3024311B2 (ja) | 2000-03-21 |
Family
ID=17291246
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3256335A Expired - Fee Related JP3024311B2 (ja) | 1991-10-03 | 1991-10-03 | Ｉｌ−２受容体重鎖に結合するポリペプチド |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5876717A (ja) |
| EP (1) | EP0539748B1 (ja) |
| JP (1) | JP3024311B2 (ja) |
| DE (1) | DE69230659T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US5635597A (en) * | 1994-05-27 | 1997-06-03 | Affymax Technologies, N.V. | Peptides that bind IL-2 receptors |
| ATE459715T1 (de) | 1995-09-29 | 2010-03-15 | Univ Siena | Regulierte gene und ihre verwendungen |
| ES2251740T3 (es) | 1996-08-23 | 2006-05-01 | Ludwig Institute For Cancer Research | Factor de crecimiento de celulas de endotelio vascular d recombinante (vegf-d). |
| EP2499256A4 (en) * | 2009-11-10 | 2013-09-11 | Amgen Inc | ANTI-C-MPL ANTIBODIES |
| CU23734A1 (es) | 2009-11-27 | 2011-11-15 | Centro Inmunologia Molecular | Polipéptidos inmunomoduladores derivados de la il-2 con actividad antagonista de esta citocina útiles en la terapia del cáncer y enfermedades infecciosas crónicas |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE296964C (ja) * | ||||
| JPH02500329A (ja) * | 1987-05-21 | 1990-02-08 | クリエイテイブ・バイオマリキユールズ・インコーポレーテツド | ターゲット化多機能蛋白質 |
| IL162181A (en) * | 1988-12-28 | 2006-04-10 | Pdl Biopharma Inc | A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same |
| CA2011450C (en) * | 1989-03-07 | 2002-06-04 | Tadatsugu Taniguchi | Recombinant b-chain of the il-2 receptor |
| EP0386289A1 (en) * | 1989-03-07 | 1990-09-12 | Taniguchi, Tadatsugu, Dr. | Recombinant interleukin-2 receptor |
| CA2053911C (en) | 1989-04-21 | 1999-11-02 | Ira H. Pastan | Recombinant antibody-toxin fusion protein |
| DE4028955A1 (de) * | 1990-09-12 | 1992-03-19 | Boehringer Mannheim Gmbh | Monoklonale antikoerper gegen den interleukin 2-rezeptor |
-
1991
- 1991-10-03 JP JP3256335A patent/JP3024311B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-09-30 EP EP92116746A patent/EP0539748B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-30 DE DE69230659T patent/DE69230659T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-05 US US07/956,399 patent/US5876717A/en not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3024311B2 (ja) | 2000-03-21 |
| DE69230659T2 (de) | 2000-09-21 |
| EP0539748B1 (en) | 2000-02-09 |
| US5876717A (en) | 1999-03-02 |
| EP0539748A1 (en) | 1993-05-05 |
| DE69230659D1 (de) | 2000-03-16 |
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