JPH05236966A - ヒトインターロイキン−６レセプターに対するマウスモノクローナル抗体の可変領域をコードするｄｎａ - Google Patents
ヒトインターロイキン−６レセプターに対するマウスモノクローナル抗体の可変領域をコードするｄｎａInfo
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- JPH05236966A JPH05236966A JP3095476A JP9547691A JPH05236966A JP H05236966 A JPH05236966 A JP H05236966A JP 3095476 A JP3095476 A JP 3095476A JP 9547691 A JP9547691 A JP 9547691A JP H05236966 A JPH05236966 A JP H05236966A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ヒトインターロイキン−６レセプターに対す
るマウスモノクローナル抗体のカッパ型ライト鎖又はヘ
ビー鎖の可変領域をコードするＤＮＡが提供される。 【構成】 具体的には、ヒトインターロイキン−６レセ
プターに対する抗体を生産する４個のハイブリドーマか
ら、８種類のＤＮＡがクローン化された。これらのＤＮ
Ａはヒト型化抗体の作製のための出発材料として有用で
ある。
るマウスモノクローナル抗体のカッパ型ライト鎖又はヘ
ビー鎖の可変領域をコードするＤＮＡが提供される。 【構成】 具体的には、ヒトインターロイキン−６レセ
プターに対する抗体を生産する４個のハイブリドーマか
ら、８種類のＤＮＡがクローン化された。これらのＤＮ
Ａはヒト型化抗体の作製のための出発材料として有用で
ある。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトインターロイキン
−６レセプター（ＩＬ−６Ｒ）に対するマウスモノクロ
ーナル抗体の可変領域をコードするＤＮＡに関する。可
変領域なる語はカッパ型ライト鎖の可変領域及びヘビー
鎖の可変領域を意味する。
−６レセプター（ＩＬ−６Ｒ）に対するマウスモノクロ
ーナル抗体の可変領域をコードするＤＮＡに関する。可
変領域なる語はカッパ型ライト鎖の可変領域及びヘビー
鎖の可変領域を意味する。
【０００２】
【従来の技術】インターロイキン−６（ＩＬ−６）は一
連の細胞により生産される多機能サイトカインである。
このものは免疫応答、急性期反応及び造血を調節し、そ
して宿主防御機構において中心的役割を演ずる。このも
のは広範な組織に作用して、標的細胞の性質に応じて成
長誘導効果、成長阻害効果及び分化誘導効果を発揮す
る。
連の細胞により生産される多機能サイトカインである。
このものは免疫応答、急性期反応及び造血を調節し、そ
して宿主防御機構において中心的役割を演ずる。このも
のは広範な組織に作用して、標的細胞の性質に応じて成
長誘導効果、成長阻害効果及び分化誘導効果を発揮す
る。
【０００３】ＩＬ−６に対する特異的レセプター（ＩＬ
−６Ｒ）は、ＩＬ−６の多機能性に従ってリンパ系細胞
及び非リンパ系細胞上で発現される。ＩＬ−６遺伝子の
異常発現が種々の疾患、特に自己免疫疾患、メサンジウ
ム細胞増殖性糸球体腎炎、及び形質細胞腫／骨髄腫の発
病に関与することが示唆されている(Hirano ら、Immuno
l.Today,11,443-449,1990 の総説を参照のこと）。
−６Ｒ）は、ＩＬ−６の多機能性に従ってリンパ系細胞
及び非リンパ系細胞上で発現される。ＩＬ−６遺伝子の
異常発現が種々の疾患、特に自己免疫疾患、メサンジウ
ム細胞増殖性糸球体腎炎、及び形質細胞腫／骨髄腫の発
病に関与することが示唆されている(Hirano ら、Immuno
l.Today,11,443-449,1990 の総説を参照のこと）。
【０００４】ヒト骨髄腫細胞はＩＬ−６を生産しそして
ＩＬ−６Ｒを発現することが観察される。実験におい
て、ＩＬ−６に対する抗体が骨髄腫細胞の試験管内での
増殖を阻害し、そしてそれ故にヒト骨髄腫の発癌におい
てオートクリン調節ループが機能していることが示され
た (Kawanoら、Nature, 332 ,83,1988）。
ＩＬ−６Ｒを発現することが観察される。実験におい
て、ＩＬ−６に対する抗体が骨髄腫細胞の試験管内での
増殖を阻害し、そしてそれ故にヒト骨髄腫の発癌におい
てオートクリン調節ループが機能していることが示され
た (Kawanoら、Nature, 332 ,83,1988）。
【０００５】ＩＬ−６Ｒは種々の動物細胞の表面に存在
し、そしてＩＬ−６に特異的に結合し、そして細胞表面
上のＩＬ−６Ｒ分子の数が報告されている（Tagaら、J.
Exp.Med.196,967,1987）。さらに、ヒトＩＬ−６Ｒをコ
ードするｃＤＮＡがクローン化され、そしてＩＬ−６Ｒ
の一次構造が報告されている（Yamasakiら、Science,24
1,825,1988）。
し、そしてＩＬ−６に特異的に結合し、そして細胞表面
上のＩＬ−６Ｒ分子の数が報告されている（Tagaら、J.
Exp.Med.196,967,1987）。さらに、ヒトＩＬ−６Ｒをコ
ードするｃＤＮＡがクローン化され、そしてＩＬ−６Ｒ
の一次構造が報告されている（Yamasakiら、Science,24
1,825,1988）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】ヒトＩＬ−６Ｒに対す
るマウスモノクローナル抗体としては既にＰＭ１及びＭ
Ｔ18が作製されているが（特願平２−189420）、本発明
者らはヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗
体ＡＵＫ12−20、ＡＵＫ64−７及びＡＵＫ146 −15を調
製した。
るマウスモノクローナル抗体としては既にＰＭ１及びＭ
Ｔ18が作製されているが（特願平２−189420）、本発明
者らはヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗
体ＡＵＫ12−20、ＡＵＫ64−７及びＡＵＫ146 −15を調
製した。
【０００７】さらに、ヒト骨髄腫細胞株が移植されたヌ
ードマウスにモノクローナル抗体が注射された時腫瘍の
増殖が顕著に阻害されることを、本発明者らは見出し
た。このことは、骨髄腫の治療のための療法剤として抗
ＩＬ−６Ｒ抗体が有用であることを示唆している。
ードマウスにモノクローナル抗体が注射された時腫瘍の
増殖が顕著に阻害されることを、本発明者らは見出し
た。このことは、骨髄腫の治療のための療法剤として抗
ＩＬ−６Ｒ抗体が有用であることを示唆している。
【０００８】マウスのモノクローナル抗体はヒトにおい
て高度に免疫原性があり、そしてこの理由のため、ヒト
におけるそれらの療法的価値は制限される。ヒトにおけ
るマウス抗体の半減期は比較的短い。さらに、マウス抗
体は、予定された効果を妨害するのみならず患者におけ
る不都合なアレルギー応答の危険をもたらす免疫応答を
惹起することなくして頻回投与することはできない。
て高度に免疫原性があり、そしてこの理由のため、ヒト
におけるそれらの療法的価値は制限される。ヒトにおけ
るマウス抗体の半減期は比較的短い。さらに、マウス抗
体は、予定された効果を妨害するのみならず患者におけ
る不都合なアレルギー応答の危険をもたらす免疫応答を
惹起することなくして頻回投与することはできない。
【０００９】これらの問題を解決するため、ヒト型化
（humanized)抗体の製造方法が開発された。マウス抗体
は２つの方法でヒト型化することができる。より簡単な
方法は、可変領域がもとのマウスモノクローナル抗体に
由来しそして定常領域が適当なヒト抗体に由来するキメ
ラ抗体を作製する方法である。得られるキメラ抗体はも
とのマウス抗体の完全な可変領域を含有し、そしてもと
のマウス抗体と同一の特異性をもって抗原に結合するこ
とを期待することができる。
（humanized)抗体の製造方法が開発された。マウス抗体
は２つの方法でヒト型化することができる。より簡単な
方法は、可変領域がもとのマウスモノクローナル抗体に
由来しそして定常領域が適当なヒト抗体に由来するキメ
ラ抗体を作製する方法である。得られるキメラ抗体はも
とのマウス抗体の完全な可変領域を含有し、そしてもと
のマウス抗体と同一の特異性をもって抗原に結合するこ
とを期待することができる。
【００１０】さらに、キメラ抗体ではヒト以外に由来す
る蛋白質配列の比率が実質的に減少しており、そしてそ
れ故にもとのマウス抗体に比べて免疫原性が低いと予想
される。キメラ抗体は抗原によく結合しそして免疫原性
が低いが、マウス可変領域に対する免疫応答がなお生ず
る可能性がある（LoBuglioら、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A, 84,4220-4224,1989)。
る蛋白質配列の比率が実質的に減少しており、そしてそ
れ故にもとのマウス抗体に比べて免疫原性が低いと予想
される。キメラ抗体は抗原によく結合しそして免疫原性
が低いが、マウス可変領域に対する免疫応答がなお生ず
る可能性がある（LoBuglioら、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A, 84,4220-4224,1989)。
【００１１】マウス抗体をヒト型化するための第二の方
法は一層複雑であるが、しかしマウス抗体の潜在的な免
疫原性をさらに大幅に低下させるものである。この方法
においては、マウス抗体の可変領域からの相補性決定領
域（complementarity determining region;CDR) をヒト
可変領域に移植して「再形成された」（reshaped) ヒト
可変領域を作製する。
法は一層複雑であるが、しかしマウス抗体の潜在的な免
疫原性をさらに大幅に低下させるものである。この方法
においては、マウス抗体の可変領域からの相補性決定領
域（complementarity determining region;CDR) をヒト
可変領域に移植して「再形成された」（reshaped) ヒト
可変領域を作製する。
【００１２】次に、これらの再形成されたヒト可変領域
をヒト定常領域に連結する。最終的に再形成されたヒト
型抗体のヒト以外の蛋白質配列に由来する部分はＣＤＲ
のみである。ＣＤＲは超可変蛋白質配列により構成され
ている。これらは種特異的配列を示さない。これらの理
由のため、マウスＣＤＲを担持する再形成されたヒト抗
体はもはやヒトＣＤＲを含有する天然ヒト抗体より強い
免疫原性を有しないはずである。
をヒト定常領域に連結する。最終的に再形成されたヒト
型抗体のヒト以外の蛋白質配列に由来する部分はＣＤＲ
のみである。ＣＤＲは超可変蛋白質配列により構成され
ている。これらは種特異的配列を示さない。これらの理
由のため、マウスＣＤＲを担持する再形成されたヒト抗
体はもはやヒトＣＤＲを含有する天然ヒト抗体より強い
免疫原性を有しないはずである。
【００１３】上記のことを考慮して、本発明はマウスモ
ノクローナル抗体の可変領域をコードする遺伝子を提供
するものである。本発明はさらに、該可変領域の相補性
決定領域（CDR)、及び該ＣＤＲをコードするＤＮＡを提
供する。
ノクローナル抗体の可変領域をコードする遺伝子を提供
するものである。本発明はさらに、該可変領域の相補性
決定領域（CDR)、及び該ＣＤＲをコードするＤＮＡを提
供する。
【００１４】
【課題を解決するための手段】従って本発明は、ヒトＩ
Ｌ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体の可変領域
をコードするＤＮＡを提供する。
Ｌ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体の可変領域
をコードするＤＮＡを提供する。
【００１５】
【具体的な説明】さらに詳しくは、ヒトＩＬ−６Ｒに対
するマウスモノクローナル抗体の可変領域をコードする
ＤＮＡをクローン化するためには、遺伝子源として、ヒ
トＩＬ−６Ｒに対するモノクローナル抗体を生産するハ
イブリドーマを作製することが必要である。この様なハ
イブリドーマとして、特願平２−189420号明細書にはモ
ノクローナル抗体ＰＭ１を生産するマウスハイブリドー
マＰＭ１及び該抗体の性質が記載されている。
するマウスモノクローナル抗体の可変領域をコードする
ＤＮＡをクローン化するためには、遺伝子源として、ヒ
トＩＬ−６Ｒに対するモノクローナル抗体を生産するハ
イブリドーマを作製することが必要である。この様なハ
イブリドーマとして、特願平２−189420号明細書にはモ
ノクローナル抗体ＰＭ１を生産するマウスハイブリドー
マＰＭ１及び該抗体の性質が記載されている。
【００１６】本明細書の参考例２にハイブリドーマＰＭ
１の作製方法を記載する。本発明者らは、それぞれがヒ
トＩＬ−６Ｒに対するモノクローナル抗体を生産するハ
イブリドーマＡＵＫ12−20，ＡＵＫ64−７及びＡＵＫ 1
46−15を作製している。これらのハイブリドーマの作製
方法は本明細書の参考例３に記載されている。
１の作製方法を記載する。本発明者らは、それぞれがヒ
トＩＬ−６Ｒに対するモノクローナル抗体を生産するハ
イブリドーマＡＵＫ12−20，ＡＵＫ64−７及びＡＵＫ 1
46−15を作製している。これらのハイブリドーマの作製
方法は本明細書の参考例３に記載されている。
【００１７】マウスモノクローナル抗体の可変領域をコ
ードする目的のＤＮＡをクローン化するためハイブリド
ーマ細胞を破壊し、そしてChirgwinら、Biochemistry 1
8 ,5294,1977に記載されている常法により全ＲＮＡを得
る。次に、この全ＲＮＡを用いて、J.W.Larrick ら、Bi
otechnology, 7,934,1989 に記載されている方法を用い
て一本鎖ｃＤＮＡを合成する。
ードする目的のＤＮＡをクローン化するためハイブリド
ーマ細胞を破壊し、そしてChirgwinら、Biochemistry 1
8 ,5294,1977に記載されている常法により全ＲＮＡを得
る。次に、この全ＲＮＡを用いて、J.W.Larrick ら、Bi
otechnology, 7,934,1989 に記載されている方法を用い
て一本鎖ｃＤＮＡを合成する。
【００１８】次に、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR)法を用
いて前記ｃＤＮＡの有意義な部分の特異的増幅を行う。
マウスモノクローナル抗体のカッパ型ライト（Ｌ）鎖可
変領域の増幅のため、配列番号：１〜11に示す11種のオ
リゴヌクレオチドプライマー（Mouse Kappa Variable;M
KV）及び配列番号：12に示すオリゴヌクレオチドプライ
マー（Mouse Kappa Constant;MKC）をそれぞれ５′−末
端プライマー及び３′−末端プライマーとして使用す
る。
いて前記ｃＤＮＡの有意義な部分の特異的増幅を行う。
マウスモノクローナル抗体のカッパ型ライト（Ｌ）鎖可
変領域の増幅のため、配列番号：１〜11に示す11種のオ
リゴヌクレオチドプライマー（Mouse Kappa Variable;M
KV）及び配列番号：12に示すオリゴヌクレオチドプライ
マー（Mouse Kappa Constant;MKC）をそれぞれ５′−末
端プライマー及び３′−末端プライマーとして使用す
る。
【００１９】前記ＭＫＶプライマーはマウスカッパ型Ｌ
鎖リーダー配列とハイブリダイズし、そして前記ＭＫＣ
プライマーはマウスカッパ型Ｌ鎖定常領域とハイブリダ
イズする。マウスモノクローナル抗体のヘビー（Ｈ）鎖
可変領域の増幅のため、配列番号：13〜22に示す10種の
オリゴヌクレオチドプライマー（Mouse Heavy Variabl
e;MHV）及び配列番号：23に示すオリゴヌクレオチドプ
ライマー（Mouse HeavyConstant;MHC）をそれぞれ５′
−末端プライマー及び３′−末端プライマーとして使用
する。
鎖リーダー配列とハイブリダイズし、そして前記ＭＫＣ
プライマーはマウスカッパ型Ｌ鎖定常領域とハイブリダ
イズする。マウスモノクローナル抗体のヘビー（Ｈ）鎖
可変領域の増幅のため、配列番号：13〜22に示す10種の
オリゴヌクレオチドプライマー（Mouse Heavy Variabl
e;MHV）及び配列番号：23に示すオリゴヌクレオチドプ
ライマー（Mouse HeavyConstant;MHC）をそれぞれ５′
−末端プライマー及び３′−末端プライマーとして使用
する。
【００２０】なお、５′−末端プライマーはその５′−
末端近傍にＳａｌＩ切断部位を提供する配列GTCGACを含
有し、そして３′−末端プライマーはその５′−末端近
傍にＸｍａＩ切断部位を提供するヌクレオチド配列CCCG
GGを含有する。これらの制限酵素切断部位は可変領域を
コードする目的のＤＮＡ断片を単離するために用いられ
る。
末端近傍にＳａｌＩ切断部位を提供する配列GTCGACを含
有し、そして３′−末端プライマーはその５′−末端近
傍にＸｍａＩ切断部位を提供するヌクレオチド配列CCCG
GGを含有する。これらの制限酵素切断部位は可変領域を
コードする目的のＤＮＡ断片を単離するために用いられ
る。
【００２１】次に増幅生成物を制限酵素ＳａｌＩ及びＸ
ｍａＩで切断させて、モノクローナル抗体の目的とする
可変領域をコードするＤＮＡ断片を得る。他方、プラス
ミドｐＵＣ19のごとき適当なクローニングベクターを同
じ制限酵素ＳａｌＩ及びＸｍａＩにより切断させ、この
ｐＵＣ19に前記ＤＮＡ断片を連結することにより、マウ
スモノクローナル抗体の目的とする可変領域をコードす
るＤＮＡ断片を含むプラスミドを得る。
ｍａＩで切断させて、モノクローナル抗体の目的とする
可変領域をコードするＤＮＡ断片を得る。他方、プラス
ミドｐＵＣ19のごとき適当なクローニングベクターを同
じ制限酵素ＳａｌＩ及びＸｍａＩにより切断させ、この
ｐＵＣ19に前記ＤＮＡ断片を連結することにより、マウ
スモノクローナル抗体の目的とする可変領域をコードす
るＤＮＡ断片を含むプラスミドを得る。
【００２２】クローン化されたＤＮＡの配列決定は任意
の常法に従って行うことができる。目的とするＤＮＡの
クローン化及びその配列決定を実施例１〜３に具体的に
記載する。本発明はさらに、本発明の各可変領域の超可
変又は相補性決定領域（CDR)を提供する。
の常法に従って行うことができる。目的とするＤＮＡの
クローン化及びその配列決定を実施例１〜３に具体的に
記載する。本発明はさらに、本発明の各可変領域の超可
変又は相補性決定領域（CDR)を提供する。
【００２３】Ｌ鎖及びＨ鎖の各対の可変領域は抗原結合
部位を形成する。Ｌ鎖及びＨ鎖上のこの領域は同様の全
般的構造を有しそして各領域は配列の比較的保存された
４個のフレームワーク領域を含み、それらは３個の超可
変領域又はＣＤＲにより連結されている（Kabat,E.A.ら
「Sequences of Proteins of Immunological Interest
」,US Dept.Health and Human Services 1983)。
部位を形成する。Ｌ鎖及びＨ鎖上のこの領域は同様の全
般的構造を有しそして各領域は配列の比較的保存された
４個のフレームワーク領域を含み、それらは３個の超可
変領域又はＣＤＲにより連結されている（Kabat,E.A.ら
「Sequences of Proteins of Immunological Interest
」,US Dept.Health and Human Services 1983)。
【００２４】前記４個のフレームワーク領域の多くの部
分はβ−シート構造をとり、ＣＤＲはループを形成す
る。ＣＤＲはある場合にはβ−シート構造の一部分を形
成することもある。ＣＤＲはフレームワーク領域によっ
て非常に近い位置に保持され、そして他の領域のＣＤＲ
と共に抗原結合部位の形成に寄与する。
分はβ−シート構造をとり、ＣＤＲはループを形成す
る。ＣＤＲはある場合にはβ−シート構造の一部分を形
成することもある。ＣＤＲはフレームワーク領域によっ
て非常に近い位置に保持され、そして他の領域のＣＤＲ
と共に抗原結合部位の形成に寄与する。
【００２５】本発明は、ヒト型化抗体の素材として有用
なこれらのＣＤＲ、及びそれをコードするＤＮＡをも提
供する。これらのＣＤＲ領域は、可変領域の既知アミノ
酸配列と照合することによって、Kabat,E.A.ら「Sequen
ces of Proteins of Immunological Interest 」の経験
則から見出すことができ、実施例４において具体的に説
明する。
なこれらのＣＤＲ、及びそれをコードするＤＮＡをも提
供する。これらのＣＤＲ領域は、可変領域の既知アミノ
酸配列と照合することによって、Kabat,E.A.ら「Sequen
ces of Proteins of Immunological Interest 」の経験
則から見出すことができ、実施例４において具体的に説
明する。
【００２６】
【実施例】次に、本発明を下記の実施例により具体的に
説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるもの
ではない。実施例１ ． ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクロー
ナル抗体の可変領域をコードするＤＮＡのクローン化 ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体の可
変領域をコードするＤＮＡを次の様にしてクローン化し
た。
説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるもの
ではない。実施例１ ． ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクロー
ナル抗体の可変領域をコードするＤＮＡのクローン化 ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体の可
変領域をコードするＤＮＡを次の様にしてクローン化し
た。
【００２７】１．全ＲＮＡの調製 ハイブリドーマＡＵＫ12−20からの全ＲＮＡを、Chirgw
inら、Biochemistry18,5294(1979) により記載されてい
る方法に従って調製した。すなわち、2.１×10 8 個のハ
イブリドーマＡＵＫ12−20の細胞を20mlの４Ｍグアニジ
ンチオシアネート（Fulka)中で完全にホモジナイズさせ
た。ホモジネートを遠心管中の5.３Ｍ塩化セシウム溶液
層上に重層し、次にこれをBeckman SW40ローター中で3
1,000rpmにて、20℃で24時間遠心分離することによりＲ
ＮＡを沈澱させた。
inら、Biochemistry18,5294(1979) により記載されてい
る方法に従って調製した。すなわち、2.１×10 8 個のハ
イブリドーマＡＵＫ12−20の細胞を20mlの４Ｍグアニジ
ンチオシアネート（Fulka)中で完全にホモジナイズさせ
た。ホモジネートを遠心管中の5.３Ｍ塩化セシウム溶液
層上に重層し、次にこれをBeckman SW40ローター中で3
1,000rpmにて、20℃で24時間遠心分離することによりＲ
ＮＡを沈澱させた。
【００２８】ＲＮＡ沈澱物を80％エタノールにより洗浄
し、そして１mM EDTA 及び0.５％ＳＤＳを含有する10mM
Tris −HCl(pH7.５）150 μｌ中に溶解し、そしてそれ
にProtenase(Bohelinger) を0.５mg／mlとなるように添
加した後、37℃にて20分間インキュベートした。混合物
をフェノール及びクロロホルムで抽出し、そしてＲＮＡ
をエタノールで沈澱させた。次に、ＲＮＡ沈澱物を１mM
EDTA を含有する10mMTris −HCl(pH7.５）200 μｌに
溶解した。
し、そして１mM EDTA 及び0.５％ＳＤＳを含有する10mM
Tris −HCl(pH7.５）150 μｌ中に溶解し、そしてそれ
にProtenase(Bohelinger) を0.５mg／mlとなるように添
加した後、37℃にて20分間インキュベートした。混合物
をフェノール及びクロロホルムで抽出し、そしてＲＮＡ
をエタノールで沈澱させた。次に、ＲＮＡ沈澱物を１mM
EDTA を含有する10mMTris −HCl(pH7.５）200 μｌに
溶解した。
【００２９】２．一本鎖ｃＤＮＡの合成 J.W.Larrick ら、 Biotechnology, 7,934(1989)により
記載されている方法に従って一本鎖ｃＤＮＡを合成する
ため、前記のようにして調製した全ＲＮＡの約５μｇ
を、40mM KCl, ６mM MgCl2,10mM ジチオスレイトール、
0.５mM dATP ，0.５mM dGTP ，0.５mM dCTP,0.５mM dTT
P ，35μＭ oligo dT プライマー(Amersham),48 ユニッ
トのＲＡＶ−２逆転写酵素（ＲＡＶ−２：Rous associa
ted virus２；Amersham）及び25ユニットのヒト胎盤リ
ボヌクレアーゼ阻害剤（Amersham）を含有する50mM Tri
s −HCl(pH8.３）緩衝液10μｌに溶解し、そしてこの反
応混合物を37℃にて60分間インキュベートしそして次の
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR)法のために直接使用した。
記載されている方法に従って一本鎖ｃＤＮＡを合成する
ため、前記のようにして調製した全ＲＮＡの約５μｇ
を、40mM KCl, ６mM MgCl2,10mM ジチオスレイトール、
0.５mM dATP ，0.５mM dGTP ，0.５mM dCTP,0.５mM dTT
P ，35μＭ oligo dT プライマー(Amersham),48 ユニッ
トのＲＡＶ−２逆転写酵素（ＲＡＶ−２：Rous associa
ted virus２；Amersham）及び25ユニットのヒト胎盤リ
ボヌクレアーゼ阻害剤（Amersham）を含有する50mM Tri
s −HCl(pH8.３）緩衝液10μｌに溶解し、そしてこの反
応混合物を37℃にて60分間インキュベートしそして次の
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR)法のために直接使用した。
【００３０】３．抗体可変領域をコードする遺伝子のＰ
ＣＲ法による増幅 Thermal Cycler Model PHC−２（Techne）を用いてＰＣ
Ｒ法を行った。
ＣＲ法による増幅 Thermal Cycler Model PHC−２（Techne）を用いてＰＣ
Ｒ法を行った。
【００３１】（１）マウスカッパ型Ｌ鎖可変領域をコー
ドする遺伝子の増幅 ＰＣＲ法に使用するプライマーは、配列番号：１〜11に
示すＭＫＶ（Mouse Kappa Variable）プライマー（マウ
スカッパ型Ｌ鎖リーダー配列とハイブリダイズする）
（S.T.Jones ら、Biotechnology,９，88，1991）、及び
配列番号：12に示すＭＫＣ（Mouse Kappa Constant）プ
ライマー（マウスカッパ型Ｌ鎖定常領域とハイブリダイ
ズする）（S.T.Jones ら、Biotechnology,９，88，199
1）であった。
ドする遺伝子の増幅 ＰＣＲ法に使用するプライマーは、配列番号：１〜11に
示すＭＫＶ（Mouse Kappa Variable）プライマー（マウ
スカッパ型Ｌ鎖リーダー配列とハイブリダイズする）
（S.T.Jones ら、Biotechnology,９，88，1991）、及び
配列番号：12に示すＭＫＣ（Mouse Kappa Constant）プ
ライマー（マウスカッパ型Ｌ鎖定常領域とハイブリダイ
ズする）（S.T.Jones ら、Biotechnology,９，88，199
1）であった。
【００３２】まず、10mM Tris −HCl(pH8.３），50mM K
Cl，0.１mM dATP ，0.１mM dGTP ，0.１mM dCTP ，0.１
mM dTTP ，1.５mM MgCl2，2.５ユニットのＤＮＡポリメ
ラーゼAmpli Taq(Perkin Elmer Cetus),0.25μＭのそれ
ぞれのＭＫＶプライマー、３μＭのＭＫＣプライマー及
び一本鎖ｃＤＮＡ合成の反応混合物１μｌを含有するＰ
ＣＲ溶液 100μｌを94℃の初期温度にて1.５分間そして
次に94℃にて１分間、50℃にて１分間及び72℃にて１分
間、この順序で加熱した。この温度サイクルを25回反復
した後、反応混合物をさらに72℃にて10分間インキュー
ベートした。
Cl，0.１mM dATP ，0.１mM dGTP ，0.１mM dCTP ，0.１
mM dTTP ，1.５mM MgCl2，2.５ユニットのＤＮＡポリメ
ラーゼAmpli Taq(Perkin Elmer Cetus),0.25μＭのそれ
ぞれのＭＫＶプライマー、３μＭのＭＫＣプライマー及
び一本鎖ｃＤＮＡ合成の反応混合物１μｌを含有するＰ
ＣＲ溶液 100μｌを94℃の初期温度にて1.５分間そして
次に94℃にて１分間、50℃にて１分間及び72℃にて１分
間、この順序で加熱した。この温度サイクルを25回反復
した後、反応混合物をさらに72℃にて10分間インキュー
ベートした。
【００３３】（２）マウスヘビー（Ｈ）鎖可変領域をコ
ードするｃＤＮＡの増幅 ＰＣＲのためのプライマーとして配列番号：13〜22に示
すＭＨＶ（Mouse Heavy Variable）プライマー１〜10
（S.T.Jones ら、Biotechnology,９，88，1991）、及び
配列番号：23に示すＭＨＣ（Mouse Heavy Constant）プ
ライマー（S.T.Jones ら、Biotechnology,９，88，199
1）を使用した。前記３．（１）においてカッパ型Ｌ鎖
可変領域遺伝子の増幅について記載したのと同じ方法に
より増幅を行った。
ードするｃＤＮＡの増幅 ＰＣＲのためのプライマーとして配列番号：13〜22に示
すＭＨＶ（Mouse Heavy Variable）プライマー１〜10
（S.T.Jones ら、Biotechnology,９，88，1991）、及び
配列番号：23に示すＭＨＣ（Mouse Heavy Constant）プ
ライマー（S.T.Jones ら、Biotechnology,９，88，199
1）を使用した。前記３．（１）においてカッパ型Ｌ鎖
可変領域遺伝子の増幅について記載したのと同じ方法に
より増幅を行った。
【００３４】４．ＰＣＲ生成物の精製および断片化 前記のようにしてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を
QIAGEN PCR生成物精製キット（QIAGEN Inc.US)を用いて
精製し、そして10mM MgCl2及び 150mM NaCl を含有する
100mM Tris −HCl(pH7.６）中で10ユニットの制限酵素
ＳａｌＩ（GIBCO BRL)を用いて37℃にて３時間消化し
た。
QIAGEN PCR生成物精製キット（QIAGEN Inc.US)を用いて
精製し、そして10mM MgCl2及び 150mM NaCl を含有する
100mM Tris −HCl(pH7.６）中で10ユニットの制限酵素
ＳａｌＩ（GIBCO BRL)を用いて37℃にて３時間消化し
た。
【００３５】この消化混合物をフェノール及びクロロホ
ルムで抽出し、そしてＤＮＡをエタノール沈澱により回
収した。次に、ＤＮＡ沈澱物を10ユニットの制限酵素Ｘ
ｍａＩ（New England Biolabs)により37℃にて２時間消
化し、そして生ずるＤＮＡ断片を、低融点アガロース
（FMC Bio.Products，米国）を用いるアガロースゲル電
気泳動により分離した。
ルムで抽出し、そしてＤＮＡをエタノール沈澱により回
収した。次に、ＤＮＡ沈澱物を10ユニットの制限酵素Ｘ
ｍａＩ（New England Biolabs)により37℃にて２時間消
化し、そして生ずるＤＮＡ断片を、低融点アガロース
（FMC Bio.Products，米国）を用いるアガロースゲル電
気泳動により分離した。
【００３６】約 450bp長のＤＮＡ断片を含有するアガロ
ース片を切り取りそして65℃にて５分間溶融せしめ、そ
してこれと同容積の２mM EDTA 及び 200mM NaCl を含有
する20mM Tris −HCl(pH7.５）を加えた。この混合物を
フェノール及びクロロホルムにより抽出し、そしてＤＮ
Ａ断片をエタノール沈澱により回収し、そして１mM EDT
A を含有する10mM Tris −HCl(pH7.５）に溶解した。
ース片を切り取りそして65℃にて５分間溶融せしめ、そ
してこれと同容積の２mM EDTA 及び 200mM NaCl を含有
する20mM Tris −HCl(pH7.５）を加えた。この混合物を
フェノール及びクロロホルムにより抽出し、そしてＤＮ
Ａ断片をエタノール沈澱により回収し、そして１mM EDT
A を含有する10mM Tris −HCl(pH7.５）に溶解した。
【００３７】こうして、マウスカッパ型Ｌ鎖可変領域を
コードする遺伝子を含んで成るＤＮＡ断片、及びマウス
Ｈ鎖可変領域をコードする遺伝子を含んで成るＤＮＡ断
片を得た。上記ＤＮＡ断片はいずれもその５′−末端に
ＳａｌＩ接着末端を有しそしてその３′−末端にＸｍａ
Ｉ接着末端を有する。
コードする遺伝子を含んで成るＤＮＡ断片、及びマウス
Ｈ鎖可変領域をコードする遺伝子を含んで成るＤＮＡ断
片を得た。上記ＤＮＡ断片はいずれもその５′−末端に
ＳａｌＩ接着末端を有しそしてその３′−末端にＸｍａ
Ｉ接着末端を有する。
【００３８】５．連結及び形質転換 上記のようにして調製したマウスカッパ型Ｌ鎖可変領域
をコードする遺伝子を含んで成るＳａｌＩ−ＸｍａＩＤ
ＮＡ断片約0.３μｇを、プラスミドｐＵＣ19をＳａｌＩ
及びＸｍａＩで消化することにより調製したｐＵＣ19ベ
クター約0.１μｇと、50mM Tris −HCl(pH7.４），10mM
MgCl2，10mMジチオスレイトール、１mMスペルミジン、
１mM ATP, 0.１μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン及び２
ユニットＴ４ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs)を
含有する反応混合物中で、16℃にて16時間反応させ連結
した。
をコードする遺伝子を含んで成るＳａｌＩ−ＸｍａＩＤ
ＮＡ断片約0.３μｇを、プラスミドｐＵＣ19をＳａｌＩ
及びＸｍａＩで消化することにより調製したｐＵＣ19ベ
クター約0.１μｇと、50mM Tris −HCl(pH7.４），10mM
MgCl2，10mMジチオスレイトール、１mMスペルミジン、
１mM ATP, 0.１μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン及び２
ユニットＴ４ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs)を
含有する反応混合物中で、16℃にて16時間反応させ連結
した。
【００３９】次に、７μｌの上記連結混合物を大腸菌Ｄ
Ｈ５αのコンピテント細胞 200μｌに加え、そしてこの
細胞を氷上で30分間、42℃にて１分間そして再び氷上で
１分間静置した。次いで 800μｌのＳＯＣ培地（Molecu
lar Cloning:A Laboratory Manual,Sambrookら、Cold S
pring Harbor Laboratory Press,1989) を加え、37℃に
て１時間インキュベートした後、２×ＹＴ寒天培地（Mo
lecular Cloning:A Laboratory Manual,Sambrookら、Co
ld Spring Harbor Laboratory Press,1989) 上にこの大
腸菌をまき、37℃にて一夜インキュベートして大腸菌形
質転換体を得た。
Ｈ５αのコンピテント細胞 200μｌに加え、そしてこの
細胞を氷上で30分間、42℃にて１分間そして再び氷上で
１分間静置した。次いで 800μｌのＳＯＣ培地（Molecu
lar Cloning:A Laboratory Manual,Sambrookら、Cold S
pring Harbor Laboratory Press,1989) を加え、37℃に
て１時間インキュベートした後、２×ＹＴ寒天培地（Mo
lecular Cloning:A Laboratory Manual,Sambrookら、Co
ld Spring Harbor Laboratory Press,1989) 上にこの大
腸菌をまき、37℃にて一夜インキュベートして大腸菌形
質転換体を得た。
【００４０】この形質転換体を、50μｇ／ｍｌのアンピ
シリンを含有する２×ＹＴ培地５ml中で37℃にて一夜培
養し、そしてこの培養物から、アルカリ法(Molecular C
loning:A Laboratory Manual,Sambrook ら、Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press,1989) に従ってプラスミド
ＤＮＡを調製した。こうして得られた、ハイブリドーマ
ＡＵＫ12−20に由来するマウスカッパ型Ｌ鎖可変領域を
コードする遺伝子を含有するプラスミドをｐ12−ｋ２と
命名した。
シリンを含有する２×ＹＴ培地５ml中で37℃にて一夜培
養し、そしてこの培養物から、アルカリ法(Molecular C
loning:A Laboratory Manual,Sambrook ら、Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press,1989) に従ってプラスミド
ＤＮＡを調製した。こうして得られた、ハイブリドーマ
ＡＵＫ12−20に由来するマウスカッパ型Ｌ鎖可変領域を
コードする遺伝子を含有するプラスミドをｐ12−ｋ２と
命名した。
【００４１】上記の同じ方法に従って、ハイブリドーマ
ＡＵＫ12−20に由来するマウスＨ鎖可変領域をコードす
る遺伝子を含有するプラスミドをＳａｌＩ−ＸｍａＩ
ＤＮＡ断片から作成し、そしてｐ12−ｈ２と命名した。
ＡＵＫ12−20に由来するマウスＨ鎖可変領域をコードす
る遺伝子を含有するプラスミドをＳａｌＩ−ＸｍａＩ
ＤＮＡ断片から作成し、そしてｐ12−ｈ２と命名した。
【００４２】実施例２．マウスモノクローナル抗体の可
変領域をコードするＤＮＡのクローン化 実施例１に記載したのと実質上同じ方法をハイブリドー
マＰＭ１，ＡＵＫ64−７及びＡＵＫ146 −15に適用して
下記のプラスミドを得た：
変領域をコードするＤＮＡのクローン化 実施例１に記載したのと実質上同じ方法をハイブリドー
マＰＭ１，ＡＵＫ64−７及びＡＵＫ146 −15に適用して
下記のプラスミドを得た：
【００４３】ハイブリドーマＰＭ１由来のカッパ型Ｌ鎖
可変領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐＰ
Ｍ−ｋ３；ハイブリドーマＰＭ１由来のＨ鎖可変領域を
コードする遺伝子を含有するプラスミドｐＰＭ−ｈ１；
ハイブリドーマＡＵＫ64−７由来のカッパ型Ｌ鎖可変領
域をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐ64−ｋ
４；ハイブリドーマＡＵＫ64−７由来のＨ鎖可変領域を
コードする遺伝子を含有するプラスミドｐ64−ｈ２；ハ
イブリドーマＡＵＫ146 −15由来のカッパ型Ｌ鎖可変領
域をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐ146 −ｋ
３；及びハイブリドーマＡＵＫ146 −15由来のＨ鎖可変
領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐ146 −
ｈ１。
可変領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐＰ
Ｍ−ｋ３；ハイブリドーマＰＭ１由来のＨ鎖可変領域を
コードする遺伝子を含有するプラスミドｐＰＭ−ｈ１；
ハイブリドーマＡＵＫ64−７由来のカッパ型Ｌ鎖可変領
域をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐ64−ｋ
４；ハイブリドーマＡＵＫ64−７由来のＨ鎖可変領域を
コードする遺伝子を含有するプラスミドｐ64−ｈ２；ハ
イブリドーマＡＵＫ146 −15由来のカッパ型Ｌ鎖可変領
域をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐ146 −ｋ
３；及びハイブリドーマＡＵＫ146 −15由来のＨ鎖可変
領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐ146 −
ｈ１。
【００４４】なお、上記プラスミドを含有する大腸菌株
は、National Collections of Industrial and Marine
Bacteria Limitedに、ブタペスト条約に基づいて、1991
年２月11日に寄託され、そして表１に示す受託番号を有
する。
は、National Collections of Industrial and Marine
Bacteria Limitedに、ブタペスト条約に基づいて、1991
年２月11日に寄託され、そして表１に示す受託番号を有
する。
【００４５】
【表１】
【００４６】実施例３．ＤＮＡの塩基配列の決定 前記のプラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列
を、Sequenase TMVersion 2. ０キット（U.S. Biochem
ical Corp,米国）を用いて決定した。まず、前記のよう
にして得られたプラスミド約３μｇを0.２N NaOHにより
変性し、配列決定用プライマーとアニールさせ、そして
キット添付の処方に従って35Ｓ−dATPにより標識した。
を、Sequenase TMVersion 2. ０キット（U.S. Biochem
ical Corp,米国）を用いて決定した。まず、前記のよう
にして得られたプラスミド約３μｇを0.２N NaOHにより
変性し、配列決定用プライマーとアニールさせ、そして
キット添付の処方に従って35Ｓ−dATPにより標識した。
【００４７】次に、標識されたＤＮＡを、８Ｍ尿素を含
有する６％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動した
後、ゲルを10％メタノール及び10％酢酸により固定し、
乾燥し、そしてオートラジオグラフィーにかけることに
より塩基配列を決定した。
有する６％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動した
後、ゲルを10％メタノール及び10％酢酸により固定し、
乾燥し、そしてオートラジオグラフィーにかけることに
より塩基配列を決定した。
【００４８】各プラスミドのｃＤＮＡコード領域の塩基
配列を配列番号：24〜31に示す。
配列を配列番号：24〜31に示す。
【００４９】実施例４．ＣＤＲの決定 Ｌ鎖及びＨ鎖の可変領域の全般的構造は、互いに類似性
を有しており、それぞれ４つのフレームワーク部分が３
つの超可変領域、即ち相補性決定領域(CDR）により連結
されている。フレームワークのアミノ酸配列は、比較的
良く保存されているが、一方、ＣＤＲ領域のアミノ酸配
列の変異性は極めて高い(Kabat, E.A.ら、「Sequences
of Proteins of Immunological Interest 」US Dept.He
alth andHuman Services, 1983)。
を有しており、それぞれ４つのフレームワーク部分が３
つの超可変領域、即ち相補性決定領域(CDR）により連結
されている。フレームワークのアミノ酸配列は、比較的
良く保存されているが、一方、ＣＤＲ領域のアミノ酸配
列の変異性は極めて高い(Kabat, E.A.ら、「Sequences
of Proteins of Immunological Interest 」US Dept.He
alth andHuman Services, 1983)。
【００５０】この様な事実に基づき、ヒトＩＬ−６Ｒに
対するモノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列
を、Kabat らにより作成された抗体のアミノ酸配列のデ
ータベースにあてはめて、相同性を調べることによりＣ
ＤＲ領域を表２に示す如く決定した。
対するモノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列
を、Kabat らにより作成された抗体のアミノ酸配列のデ
ータベースにあてはめて、相同性を調べることによりＣ
ＤＲ領域を表２に示す如く決定した。
【００５１】
【表２】
【００５２】実施例５．クローン化されたｃＤＮＡの発
現の確認 発現プラスミドの作製 ＰＣＲ法によりクローン化されたＡＵＫ12−20のカッパ
型Ｌ鎖及びＨ鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡからキ
メラＬ鎖／Ｈ鎖を作製した。マウスＡＵＫ12−20可変領
域をコードするｃＤＮＡを、ヒトサイトメガロウイルス
（HCMV）のエンハンサー及びプロモーターを含有する哺
乳類細胞発現ベクター（HCMV発現ベクターと称する）中
でヒト定常領域をコードするＤＮＡに容易に連結するた
めには、ＡＵＫ12−20可変領域をコードするマウスｃＤ
ＮＡ配列の５′−末端及び3 ′−末端に便利な制限酵素
切断部位を導入することが必要であった。
現の確認 発現プラスミドの作製 ＰＣＲ法によりクローン化されたＡＵＫ12−20のカッパ
型Ｌ鎖及びＨ鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡからキ
メラＬ鎖／Ｈ鎖を作製した。マウスＡＵＫ12−20可変領
域をコードするｃＤＮＡを、ヒトサイトメガロウイルス
（HCMV）のエンハンサー及びプロモーターを含有する哺
乳類細胞発現ベクター（HCMV発現ベクターと称する）中
でヒト定常領域をコードするＤＮＡに容易に連結するた
めには、ＡＵＫ12−20可変領域をコードするマウスｃＤ
ＮＡ配列の５′−末端及び3 ′−末端に便利な制限酵素
切断部位を導入することが必要であった。
【００５３】５′−末端及び３′−末端へのこれらの修
飾はＰＣＲ法を用いて行った。２セットのＰＣＲプライ
マーを設計しそして合成した。マウスＬ鎖可変領域及び
Ｈ鎖可変領域の両方について、リーダー配列の始めをコ
ードするＤＮＡにハイブリダイズし、効率的な翻訳のた
めに必須のＤＮＡ配列（Kozak, M., J.Mol.Biol.196：9
47-950, 1987)を維持しそしてＨＣＭＶ発現ベクターへ
のクローニングのためのＨｉｎｄIII 部位を形成するた
めに、後方ＰＣＲ−プライマーを設計した（Ｌ鎖可変領
域後方プライマー：５′−ACAAAGCTTCCACCATGGAGTCAGAC
ACACTCCTG；Ｈ鎖可変領域後方プライマー：５′−GGCTA
AGCTTCCACCATGGGATGGAGCGGGATCTTT）。
飾はＰＣＲ法を用いて行った。２セットのＰＣＲプライ
マーを設計しそして合成した。マウスＬ鎖可変領域及び
Ｈ鎖可変領域の両方について、リーダー配列の始めをコ
ードするＤＮＡにハイブリダイズし、効率的な翻訳のた
めに必須のＤＮＡ配列（Kozak, M., J.Mol.Biol.196：9
47-950, 1987)を維持しそしてＨＣＭＶ発現ベクターへ
のクローニングのためのＨｉｎｄIII 部位を形成するた
めに、後方ＰＣＲ−プライマーを設計した（Ｌ鎖可変領
域後方プライマー：５′−ACAAAGCTTCCACCATGGAGTCAGAC
ACACTCCTG；Ｈ鎖可変領域後方プライマー：５′−GGCTA
AGCTTCCACCATGGGATGGAGCGGGATCTTT）。
【００５４】前方ＰＣＲ−プライマーは、Ｊ領域の末端
をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、定常領域への
スプライシングのために必須のＤＮＡ配列を維持しそし
てＨＣＭＶ発現ベクターでのヒト定常領域への連結のた
めのＢａｍＨＩ部位を形成するように設計した（Ｌ鎖可
変領域前方プライマー：５′−CTTGGATCCACTCACGTTTTAT
TTCCAGCTTGGTC ；Ｈ鎖可変領域前方プライマー；５′−
GTTGGATCCACTCACCTGCAGAGACAGTTACCAGAG）。
をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、定常領域への
スプライシングのために必須のＤＮＡ配列を維持しそし
てＨＣＭＶ発現ベクターでのヒト定常領域への連結のた
めのＢａｍＨＩ部位を形成するように設計した（Ｌ鎖可
変領域前方プライマー：５′−CTTGGATCCACTCACGTTTTAT
TTCCAGCTTGGTC ；Ｈ鎖可変領域前方プライマー；５′−
GTTGGATCCACTCACCTGCAGAGACAGTTACCAGAG）。
【００５５】ＰＣＲによる増幅に続き、ＰＣＲ生成物を
ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩにより消化し、ヒトκ鎖又
はγ−１鎖定常領域ＤＮＡを含有するＨＣＭＶベクター
にクローン化し、そして塩基配列を決定してＰＣＲ法に
よる増幅中にエラーが生じなかったことを確認した。な
お、こうして作製した発現ベクターの構造を図１に示
す。
ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩにより消化し、ヒトκ鎖又
はγ−１鎖定常領域ＤＮＡを含有するＨＣＭＶベクター
にクローン化し、そして塩基配列を決定してＰＣＲ法に
よる増幅中にエラーが生じなかったことを確認した。な
お、こうして作製した発現ベクターの構造を図１に示
す。
【００５６】ＣＯＳ細胞での一過性（transient)発現 キメラＡＵＫ12−20抗体のＣＯＳ細胞での一過性発現を
見るため、前記発現ベクターをＣＯＳ細胞において試験
した。Gene Pulsar 装置(BioRad)を用いる電気穿孔法
（electroporation)によりＤＮＡをＣＯＳ細胞に導入し
た。すなわち、ＣＯＳ細胞を１×107 個／mlになるよう
にphosphate-bufferd saline(PBS) に懸濁し、この細胞
浮遊液0.８mlにＤＮＡ（各プラスミドにつき10μｇ）を
加えた。 1,900ボルト（Ｖ）、25マイクロファラッド
（μＦ）の電気容量にてパルスを与えた。
見るため、前記発現ベクターをＣＯＳ細胞において試験
した。Gene Pulsar 装置(BioRad)を用いる電気穿孔法
（electroporation)によりＤＮＡをＣＯＳ細胞に導入し
た。すなわち、ＣＯＳ細胞を１×107 個／mlになるよう
にphosphate-bufferd saline(PBS) に懸濁し、この細胞
浮遊液0.８mlにＤＮＡ（各プラスミドにつき10μｇ）を
加えた。 1,900ボルト（Ｖ）、25マイクロファラッド
（μＦ）の電気容量にてパルスを与えた。
【００５７】室温にて10分間の回復期間の後、エレクト
ロポレーションした細胞を、10％のウシ胎児血清を含有
するＤＭＥＭ培地（GIBCO)８mlに加えた。72時間のイン
キュベーションの後、培養上清を集め、遠心分離して細
胞破片を除去し、そして無菌条件下で４℃にて短時間、
又は−20℃にて長時間貯蔵した。
ロポレーションした細胞を、10％のウシ胎児血清を含有
するＤＭＥＭ培地（GIBCO)８mlに加えた。72時間のイン
キュベーションの後、培養上清を集め、遠心分離して細
胞破片を除去し、そして無菌条件下で４℃にて短時間、
又は−20℃にて長時間貯蔵した。
【００５８】酵素免疫測定法（ELISA)によるキメラ抗体
の定量 トランスフェクトされたＣＯＳ細胞の培養上清をＥＬＩ
ＳＡにより測定して、キメラ抗体が生産されていること
を確認した。キメラ抗体を検出するため、プレートを抗
−ヒトＩｇＧ（Sigma)によりコートした。ブロックした
後、ＣＯＳ細胞からの培養上清を段階希釈しそして各ウ
エルに加えた。
の定量 トランスフェクトされたＣＯＳ細胞の培養上清をＥＬＩ
ＳＡにより測定して、キメラ抗体が生産されていること
を確認した。キメラ抗体を検出するため、プレートを抗
−ヒトＩｇＧ（Sigma)によりコートした。ブロックした
後、ＣＯＳ細胞からの培養上清を段階希釈しそして各ウ
エルに加えた。
【００５９】インキュベーション及び洗浄の後、アルカ
リホスファターゼ−結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（γ鎖特異
的、Sigma)を加えた。インキュベーション及び洗浄の
後、基質緩衝液を加えた。インキュベーションの後、反
応を停止しそして 405nmにおける吸光度を測定した。標
準として精製ヒトＩｇＧ（Sigma)を用いた。
リホスファターゼ−結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（γ鎖特異
的、Sigma)を加えた。インキュベーション及び洗浄の
後、基質緩衝液を加えた。インキュベーションの後、反
応を停止しそして 405nmにおける吸光度を測定した。標
準として精製ヒトＩｇＧ（Sigma)を用いた。
【００６０】ヒトＩＬ−６Ｒへの結合能を確認するため
の酵素免疫測定（ELISA) トランスフェクトされたＣＯＳ細胞からの培地をＥＬＩ
ＳＡにより測定して、生産されたキメラ抗体が抗原に結
合し得るか否かを決定した。抗原への結合の検出のた
め、プレートをＭＴ18マウスモノクローナル抗体（参考
例１）でコートした。１％ＢＳＡでブロックした後、可
溶性組換えヒトＩＬ−６Ｒ（ＳＲ344)を加えた。
の酵素免疫測定（ELISA) トランスフェクトされたＣＯＳ細胞からの培地をＥＬＩ
ＳＡにより測定して、生産されたキメラ抗体が抗原に結
合し得るか否かを決定した。抗原への結合の検出のた
め、プレートをＭＴ18マウスモノクローナル抗体（参考
例１）でコートした。１％ＢＳＡでブロックした後、可
溶性組換えヒトＩＬ−６Ｒ（ＳＲ344)を加えた。
【００６１】洗浄した後、ＣＯＳ細胞からの培養上清を
段階希釈し、そして各ウエルに加えた。インキュベーシ
ョン及び洗浄の後、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗
−ヒトＩｇＧを加えた。インキュベーション及び洗浄の
後、基質緩衝液を加えた。インキュベーションの後、反
応を停止し、そして 405nmにおける吸光度を測定した。
段階希釈し、そして各ウエルに加えた。インキュベーシ
ョン及び洗浄の後、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗
−ヒトＩｇＧを加えた。インキュベーション及び洗浄の
後、基質緩衝液を加えた。インキュベーションの後、反
応を停止し、そして 405nmにおける吸光度を測定した。
【００６２】この結果を図２に示した。キメラ抗体ＡＵ
Ｋ12−20をコードする遺伝子のＣＯＳ細胞へのトランス
フェクションを２回繰り返し実施した。この双方のＣＯ
Ｓ細胞の培養上清サンプルは、いずれもＩＬ−６Ｒに対
する強い結合能を示し、図２にＯ（オープンサークル）
並びに●（クローズドサークル）で示す如く、サンプル
の希釈度（抗体の濃度）依存的に 405nmにおける吸光度
が変化し、サンプル中にＩＬ−６Ｒレセプターに対する
抗体が含まれていることが確認された。
Ｋ12−20をコードする遺伝子のＣＯＳ細胞へのトランス
フェクションを２回繰り返し実施した。この双方のＣＯ
Ｓ細胞の培養上清サンプルは、いずれもＩＬ−６Ｒに対
する強い結合能を示し、図２にＯ（オープンサークル）
並びに●（クローズドサークル）で示す如く、サンプル
の希釈度（抗体の濃度）依存的に 405nmにおける吸光度
が変化し、サンプル中にＩＬ−６Ｒレセプターに対する
抗体が含まれていることが確認された。
【００６３】ヒトＩＬ−６ＲとＩＬ−６の結合を阻害す
る能力の測定 トランスフェクトされたＣＯＳ細胞からの培養上清を測
定して培地中に存在する抗体が、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６
との結合を阻害するか否かを調べるために、ビオチン化
ＩＬ−６との競合的結合阻害能を調べた。プレートをＭ
Ｔ18マウスモノクローナル抗体（参考例１）でコートし
た。ブロッキングの後、可溶性組換ヒトＩＬ−６Ｒ（Ｓ
Ｒ344)を加えた。洗浄した後、ＣＯＳ細胞からのサンプ
ルを段階希釈し、そしてビオチン化ＩＬ−６と共に各ウ
エルに加えた。
る能力の測定 トランスフェクトされたＣＯＳ細胞からの培養上清を測
定して培地中に存在する抗体が、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６
との結合を阻害するか否かを調べるために、ビオチン化
ＩＬ−６との競合的結合阻害能を調べた。プレートをＭ
Ｔ18マウスモノクローナル抗体（参考例１）でコートし
た。ブロッキングの後、可溶性組換ヒトＩＬ−６Ｒ（Ｓ
Ｒ344)を加えた。洗浄した後、ＣＯＳ細胞からのサンプ
ルを段階希釈し、そしてビオチン化ＩＬ−６と共に各ウ
エルに加えた。
【００６４】洗浄した後、アルカリホスファターゼ結合
ストレプトアビジンを加えた。インキュベーション及び
洗浄の後基質緩衝液を加えた。インキュベーションの
後、反応を停止し、そして吸光度を 405nmにて測定し
た。精製マウスＡＵＫ12−20モノクローナル抗体を陽性
対照として用いた。無関係の抗体を発現するＣＯＳ細胞
からの培地を陰性対照として用いた。
ストレプトアビジンを加えた。インキュベーション及び
洗浄の後基質緩衝液を加えた。インキュベーションの
後、反応を停止し、そして吸光度を 405nmにて測定し
た。精製マウスＡＵＫ12−20モノクローナル抗体を陽性
対照として用いた。無関係の抗体を発現するＣＯＳ細胞
からの培地を陰性対照として用いた。
【００６５】この結果を図３に示した。キメラ抗体ＡＵ
Ｋ12−20をコードする遺伝子でトランスフェクトしたＣ
ＯＳ細胞の培養上清は、最高、及び２番目に高いサンプ
ル濃度でＩＬ−６ＲとＩＬ−６の結合を阻害した。すな
わち、図３に●で示す如く、サンプルの希釈度（抗体の
濃度）依存的に 405nmにおける吸光度が変化し、サンプ
ル中の抗体がＩＬ−６ＲとＩＬ−６の結合を阻害してい
ることが認められた。これは陽性対照の吸光度の抗体濃
度依存的変化（Ｏ）にほぼ一致することからも確認出来
た。なお、陰性対照（Δ）は阻害活性が全く認められな
かった。
Ｋ12−20をコードする遺伝子でトランスフェクトしたＣ
ＯＳ細胞の培養上清は、最高、及び２番目に高いサンプ
ル濃度でＩＬ−６ＲとＩＬ−６の結合を阻害した。すな
わち、図３に●で示す如く、サンプルの希釈度（抗体の
濃度）依存的に 405nmにおける吸光度が変化し、サンプ
ル中の抗体がＩＬ−６ＲとＩＬ−６の結合を阻害してい
ることが認められた。これは陽性対照の吸光度の抗体濃
度依存的変化（Ｏ）にほぼ一致することからも確認出来
た。なお、陰性対照（Δ）は阻害活性が全く認められな
かった。
【００６６】
【参考例】本発明において使用される出発ハイブリドー
マは次の様にして作製された。
マは次の様にして作製された。
【００６７】参考例１．ハイブリドーマ ＭＴ１８の作
製 ヒトＩＬ−６Ｒに対するモノクローナル抗体を生産する
ハイブリドーマを作製するため、免疫原として、細胞表
面上にヒトＩＬ−６Ｒを発現するマウスＴ細胞を次の様
にして作製した。すなわち、特願平１−9774明細書に開
示されているプラスミドpBSF2R.236及びpSV2neo を常法
に従ってマウスＴ細胞系ＣＴＬＬ−２（ATCC TIB214)に
トランスフェクトし、生ずる形質転換体を常法に従って
Ｇ418 を用いてスクリーニングすることにより細胞あた
り約30,000個のＩＬ−６Ｒを発現する細胞系を得た。こ
の細胞系をＣＴＢＣ３と称する。
製 ヒトＩＬ−６Ｒに対するモノクローナル抗体を生産する
ハイブリドーマを作製するため、免疫原として、細胞表
面上にヒトＩＬ−６Ｒを発現するマウスＴ細胞を次の様
にして作製した。すなわち、特願平１−9774明細書に開
示されているプラスミドpBSF2R.236及びpSV2neo を常法
に従ってマウスＴ細胞系ＣＴＬＬ−２（ATCC TIB214)に
トランスフェクトし、生ずる形質転換体を常法に従って
Ｇ418 を用いてスクリーニングすることにより細胞あた
り約30,000個のＩＬ−６Ｒを発現する細胞系を得た。こ
の細胞系をＣＴＢＣ３と称する。
【００６８】ＣＴＢＣ３細胞を常法に従ってＲＰＭＩ16
40中で培養し、そして培養細胞をＰＢＳ緩衝液により４
回洗浄し、そして１×107 個の細胞をＣ57ＢＬ／６マウ
スに腹腔内注射して免疫感作した。この免疫感作は１週
間に１回６週間にわたって行った。
40中で培養し、そして培養細胞をＰＢＳ緩衝液により４
回洗浄し、そして１×107 個の細胞をＣ57ＢＬ／６マウ
スに腹腔内注射して免疫感作した。この免疫感作は１週
間に１回６週間にわたって行った。
【００６９】この免疫感作されたマウスから脾臓細胞を
得、そして常法に従ってポリエチレングリコールを用い
て骨髄腫Ｐ３ＵＩ細胞と融合せしめ、そして融合した細
胞を次の様にしてスクリーニングした。ＩＬ−６Ｒ陰性
ヒトＴ細胞系ＪＵＲＫＡＴ（ATCC CRL 8163)を、プラス
ミドpBSF2R．236 及びpSVneoにより同時トランスフェク
トし、そして形質転換された細胞をスクリーニングし
て、細胞当り約 100,000個のＩＬ−６Ｒを発現する細胞
系を得た。この細胞系をＮＪＢＣ８と命名した。
得、そして常法に従ってポリエチレングリコールを用い
て骨髄腫Ｐ３ＵＩ細胞と融合せしめ、そして融合した細
胞を次の様にしてスクリーニングした。ＩＬ−６Ｒ陰性
ヒトＴ細胞系ＪＵＲＫＡＴ（ATCC CRL 8163)を、プラス
ミドpBSF2R．236 及びpSVneoにより同時トランスフェク
トし、そして形質転換された細胞をスクリーニングし
て、細胞当り約 100,000個のＩＬ−６Ｒを発現する細胞
系を得た。この細胞系をＮＪＢＣ８と命名した。
【００７０】ＮＰ−40で細胞溶解したＮＪＢＣ８を認識
するがしかしＮＰ−40で細胞溶解したＪＵＲＫＡＴを認
識しない抗体を生産するハイブリドーマ細胞系をクロー
ン化しそしてＭＴ18と命名した。ハイブリドーマＭＴ18
は、工業技術院微生物工業技術研究所にブダペスト条約
のもとに1990年７月10日に微工研条寄第2999号（FERMBP
-2999）として寄託された。
するがしかしＮＰ−40で細胞溶解したＪＵＲＫＡＴを認
識しない抗体を生産するハイブリドーマ細胞系をクロー
ン化しそしてＭＴ18と命名した。ハイブリドーマＭＴ18
は、工業技術院微生物工業技術研究所にブダペスト条約
のもとに1990年７月10日に微工研条寄第2999号（FERMBP
-2999）として寄託された。
【００７１】参考例２．ハイブリドーマＰＭ１の作製 ヒトＩＬ−６Ｒに対するモノクローナル抗体を生産する
ハイブリドーマを作製するため、抗原として、ヒトＩＬ
−６Ｒを次の様にして抽出した。３×109 個のヒト骨髄
腫細胞（ＩＬ−６Ｒ生産細胞）を１mlの１％ジギトニ
ン、10mMトリエタノールアミン緩衝液（pH7.４）、0.15
M NaCl及び１mM PMSF （フェニルメチルスルホニルフル
オリド；和光純薬）中で溶解した。他方、参考例１にお
いて調製したハイブリドーマＭＴ18により生産されたＭ
Ｔ18抗体を、ブロムシアンで活性化されたセファロース
４Ｂ（Pharmacia)に常法に従って結合させた。
ハイブリドーマを作製するため、抗原として、ヒトＩＬ
−６Ｒを次の様にして抽出した。３×109 個のヒト骨髄
腫細胞（ＩＬ−６Ｒ生産細胞）を１mlの１％ジギトニ
ン、10mMトリエタノールアミン緩衝液（pH7.４）、0.15
M NaCl及び１mM PMSF （フェニルメチルスルホニルフル
オリド；和光純薬）中で溶解した。他方、参考例１にお
いて調製したハイブリドーマＭＴ18により生産されたＭ
Ｔ18抗体を、ブロムシアンで活性化されたセファロース
４Ｂ（Pharmacia)に常法に従って結合させた。
【００７２】このＭＴ18抗体結合セファロース４Ｂを前
記の細胞溶解物と混合することにより、セファロース４
Ｂ上のＭＴ18抗体に前記可溶化したＩＬ−６Ｒを結合さ
せた。セファロース４Ｂに非特異的に結合した物質を洗
浄除去し、そしてSepharose４ＢにＭＴ18抗体を介して
結合したＩＬ−６Ｒを免疫原として使用した。
記の細胞溶解物と混合することにより、セファロース４
Ｂ上のＭＴ18抗体に前記可溶化したＩＬ−６Ｒを結合さ
せた。セファロース４Ｂに非特異的に結合した物質を洗
浄除去し、そしてSepharose４ＢにＭＴ18抗体を介して
結合したＩＬ−６Ｒを免疫原として使用した。
【００７３】前記の免疫原を用いてＢＡＬＢ／ｃマウス
を１週間に１回４週間にわたり腹腔内に免疫感作した。
次に、この免疫感作されたマウスから脾臓細胞を得、そ
して常法に従ってポリエチレングリコールを用いて骨髄
腫細胞Ｐ３Ｕ１と融合せしめた。融合した細胞を次のよ
うにしてスクリーニングした。まず、培養上清及び0.01
mlのProtein G セファロース（Pharmacia)を混合して上
清中の免疫グロブリンをProtein G セファロースに吸着
せしめた。
を１週間に１回４週間にわたり腹腔内に免疫感作した。
次に、この免疫感作されたマウスから脾臓細胞を得、そ
して常法に従ってポリエチレングリコールを用いて骨髄
腫細胞Ｐ３Ｕ１と融合せしめた。融合した細胞を次のよ
うにしてスクリーニングした。まず、培養上清及び0.01
mlのProtein G セファロース（Pharmacia)を混合して上
清中の免疫グロブリンをProtein G セファロースに吸着
せしめた。
【００７４】他方、35Ｓ−メチオニンにより内部標識さ
れた1011個のＵ266 細胞を溶解し、そしてＭＴ18結合セ
ファロース４Ｂを用いてＩＬ−６Ｒをアフィニティー精
製した。次に、35Ｓ−メチオニンで標識されたＩＬ−６
Ｒを、免疫グロブリンが結合している上記のProtein G
セファロースにより免疫沈降せしめ、そして沈澱をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより分析した。
れた1011個のＵ266 細胞を溶解し、そしてＭＴ18結合セ
ファロース４Ｂを用いてＩＬ−６Ｒをアフィニティー精
製した。次に、35Ｓ−メチオニンで標識されたＩＬ−６
Ｒを、免疫グロブリンが結合している上記のProtein G
セファロースにより免疫沈降せしめ、そして沈澱をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより分析した。
【００７５】その結果、ＩＬ−６Ｒに特異的に結合する
抗体を生産する１個のハイブリドーマクローンを単離
し、そしてＰＭ１と命名した。ハイブリドーマＰＭ１は
工業技術院微生物工業技術研究所にブダペスト条約のも
とに1990年７月10日に、微工研条寄第2998号（FERM BP-
2998）として寄託された。
抗体を生産する１個のハイブリドーマクローンを単離
し、そしてＰＭ１と命名した。ハイブリドーマＰＭ１は
工業技術院微生物工業技術研究所にブダペスト条約のも
とに1990年７月10日に、微工研条寄第2998号（FERM BP-
2998）として寄託された。
【００７６】参考例３．ハイブリドーマＡＵＫ12−20，
ＡＵＫ64−７及びＡＵＫ146 −15の作製 免疫原として可溶性ＩＬ−６Ｒ（SR 344) を、Yasukaw
a,K. らの、J.Biochem. 108 ,673-676,1990 、に記載さ
れている方法に従って調製した。
ＡＵＫ64−７及びＡＵＫ146 −15の作製 免疫原として可溶性ＩＬ−６Ｒ（SR 344) を、Yasukaw
a,K. らの、J.Biochem. 108 ,673-676,1990 、に記載さ
れている方法に従って調製した。
【００７７】すなわち、Ｎ−末端から 345番目のコドン
が終止コドンにより置換されているＩＬ−６Ｒをコード
するｃＤＮＡを含有するプラスミドpECEdhfr344 をＣＨ
Ｏ（5E27) 細胞にトランスフェクトし、このトランスフ
ェクトされた細胞を無血清培地（SF-O培地、三光純薬)
中で培養し、そして得られる上清をHF−Labl系（東ソ
ー）により濃縮しそしてBlue−５PWカラム及びPhenyl−
５PWカラムにより精製した。精製された可溶性ＩＬ−６
ＲはＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを示した。
が終止コドンにより置換されているＩＬ−６Ｒをコード
するｃＤＮＡを含有するプラスミドpECEdhfr344 をＣＨ
Ｏ（5E27) 細胞にトランスフェクトし、このトランスフ
ェクトされた細胞を無血清培地（SF-O培地、三光純薬)
中で培養し、そして得られる上清をHF−Labl系（東ソ
ー）により濃縮しそしてBlue−５PWカラム及びPhenyl−
５PWカラムにより精製した。精製された可溶性ＩＬ−６
ＲはＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを示した。
【００７８】雌性BALB／cAnNCrj マウス（日本クレア）
に、１回の免疫原量を10μｇ／マウスとしてFreundの完
全アジュバント（Bacto Adjuvant Complete H 37Ra,Dif
co)と共に皮下注射し、そしてそれぞれ最初の注射の２
週間及び３週間後に、Freundの不完全アジュバント（Ba
cto Adjuvant Incomplete Freund,Difco) と共に同量の
免疫原を第二回及び第三回追加免疫として皮下注射し
た。
に、１回の免疫原量を10μｇ／マウスとしてFreundの完
全アジュバント（Bacto Adjuvant Complete H 37Ra,Dif
co)と共に皮下注射し、そしてそれぞれ最初の注射の２
週間及び３週間後に、Freundの不完全アジュバント（Ba
cto Adjuvant Incomplete Freund,Difco) と共に同量の
免疫原を第二回及び第三回追加免疫として皮下注射し
た。
【００７９】最終免疫感作（第四回注射）は第三回注射
の１週間後に、アジュバントを使わないで尾静脈内に行
った。免疫感作されたマウスから血清試料を採取し、希
釈緩衝液により段階的に希釈し、そしてGoldsmith,P.
K.,Analytical Biochemistry，117,53-60,1981 、に記
載されている方法に従ってＥＬＩＳＡ法により分析し
た。
の１週間後に、アジュバントを使わないで尾静脈内に行
った。免疫感作されたマウスから血清試料を採取し、希
釈緩衝液により段階的に希釈し、そしてGoldsmith,P.
K.,Analytical Biochemistry，117,53-60,1981 、に記
載されている方法に従ってＥＬＩＳＡ法により分析し
た。
【００８０】すなわち、ＳＲ344 （0.１μｇ／ml）によ
りコートされたプレートを１％ＢＳＡによりブロック
し、そして前記の希釈された試料をそれに加えた。ＳＲ
344 に結合したマウスＩｇＧをヤギの抗−マウスＩｇＧ
／アルカリホスファターゼ(A／P)（ZYMED)及びアルカリ
ホスファターゼ用基質（Sigma-104)を用いて測定した。
りコートされたプレートを１％ＢＳＡによりブロック
し、そして前記の希釈された試料をそれに加えた。ＳＲ
344 に結合したマウスＩｇＧをヤギの抗−マウスＩｇＧ
／アルカリホスファターゼ(A／P)（ZYMED)及びアルカリ
ホスファターゼ用基質（Sigma-104)を用いて測定した。
【００８１】血清中の抗−ＳＲ344 抗体の増加を確認し
た後、最終免疫感作から３日後に、５匹のＢＡＬＢ／ｃ
マウスから脾臓細胞を得た。脾臓細胞及び骨髄腫細胞株
（P3UI）を25：１の比率で混合し、ＰＥＧ1500を用いて
融合し、そして2000個のウエル中で0.７〜1.１×106 細
胞／ウエルの細胞濃度で培養した。
た後、最終免疫感作から３日後に、５匹のＢＡＬＢ／ｃ
マウスから脾臓細胞を得た。脾臓細胞及び骨髄腫細胞株
（P3UI）を25：１の比率で混合し、ＰＥＧ1500を用いて
融合し、そして2000個のウエル中で0.７〜1.１×106 細
胞／ウエルの細胞濃度で培養した。
【００８２】ウエルからの上清を、ＳＲ344 に結合する
それらの能力について（R344認識アッセイと称する第一
次スクリーニング）、及びＳＲ344 と１Ｌ−６との結合
を阻害するそれらの能力について（１Ｌ−６／ｓ１Ｌ−
６Ｒ結合阻害アッセイ（RBIA）による）スクリーニング
した。第一次スクリーニングが 240個の陽性ウエルをも
たらし、そして第二次スクリーニングが36個の陽性ウエ
ルをもたらした。
それらの能力について（R344認識アッセイと称する第一
次スクリーニング）、及びＳＲ344 と１Ｌ−６との結合
を阻害するそれらの能力について（１Ｌ−６／ｓ１Ｌ−
６Ｒ結合阻害アッセイ（RBIA）による）スクリーニング
した。第一次スクリーニングが 240個の陽性ウエルをも
たらし、そして第二次スクリーニングが36個の陽性ウエ
ルをもたらした。
【００８３】上記のＲ344 認識アッセイは次の様にして
行った。ヤギの抗マウスＩｇ（Cappe1）（１μｇ／ml）
によりコートされたプレート（MaxiSorp,Nunc)を１％Ｂ
ＳＡによりブロックし、そして 100μｌ／ウエルのハイ
ブリドーマ培養上清をそれに添加し、次に室温にて１時
間インキュベートした。プレートを洗浄した後、20ng／
mlのＳＲ344 をウエルに加え、そして室温にて１時間イ
ンキュベーションを行った。
行った。ヤギの抗マウスＩｇ（Cappe1）（１μｇ／ml）
によりコートされたプレート（MaxiSorp,Nunc)を１％Ｂ
ＳＡによりブロックし、そして 100μｌ／ウエルのハイ
ブリドーマ培養上清をそれに添加し、次に室温にて１時
間インキュベートした。プレートを洗浄した後、20ng／
mlのＳＲ344 をウエルに加え、そして室温にて１時間イ
ンキュベーションを行った。
【００８４】上清に由来する固定化された抗体により捕
捉されたＳＲ344 の量を、ラビット抗ＳＲ344 ＩｇＧ
（＃２，５μｇ／ｍｌ）、ヤギの抗ラビットＩｇＧ−ア
ルカリホスファターゼ（Ａ／Ｐ）（１：3000，Tago）及
び基質（１mg／ml,Sigma−104)の添加、並びにそれに続
く 405−600nm での吸光度の測定により定量した。
捉されたＳＲ344 の量を、ラビット抗ＳＲ344 ＩｇＧ
（＃２，５μｇ／ｍｌ）、ヤギの抗ラビットＩｇＧ−ア
ルカリホスファターゼ（Ａ／Ｐ）（１：3000，Tago）及
び基質（１mg／ml,Sigma−104)の添加、並びにそれに続
く 405−600nm での吸光度の測定により定量した。
【００８５】前記のRBIAは次の様にして行った。ＭＴ18
抗体でコートしたプレートを 100ng／mlのＳＲ344 (100
μｌ／ウエル）で満たし、そして室温にて１時間インキ
ュベーションを行った。プレートを洗浄した後、50μｌ
／ウエルのハイブリドーマ培養上清及び50μｌ／ウエル
のビオチン−ＩＬ−６結合体（20ng／ml）をそれぞれの
ウエルに同時に加え、そしてウエルを室温にて１時間イ
ンキュベートした。
抗体でコートしたプレートを 100ng／mlのＳＲ344 (100
μｌ／ウエル）で満たし、そして室温にて１時間インキ
ュベーションを行った。プレートを洗浄した後、50μｌ
／ウエルのハイブリドーマ培養上清及び50μｌ／ウエル
のビオチン−ＩＬ−６結合体（20ng／ml）をそれぞれの
ウエルに同時に加え、そしてウエルを室温にて１時間イ
ンキュベートした。
【００８６】ストレプトアビジン−Ａ／Ｐ（１：7000，
PIERCE) 及び対応する基質（Sigma-104)を添加し、 405
−600nm での吸光度を測定することにより、ＳＲ344 に
結合したビオチン−ＩＬ−６の量を測定した。
PIERCE) 及び対応する基質（Sigma-104)を添加し、 405
−600nm での吸光度を測定することにより、ＳＲ344 に
結合したビオチン−ＩＬ−６の量を測定した。
【００８７】最後に、限界希釈法を２回反復することに
より陽性クローンを純化し、そしてＳＲ344 とＩＬ−６
との結合を阻害する３個のハイブリドーマクローン、す
なわちＡＵＫ12−20，ＡＵＫ146 −15及びＡＵＫ64−
７；並びにＳＲ344 とＩＬ−６との結合を阻害しないハ
イブリドーマクローンＡＵＫ181 −６を得た。
より陽性クローンを純化し、そしてＳＲ344 とＩＬ−６
との結合を阻害する３個のハイブリドーマクローン、す
なわちＡＵＫ12−20，ＡＵＫ146 −15及びＡＵＫ64−
７；並びにＳＲ344 とＩＬ−６との結合を阻害しないハ
イブリドーマクローンＡＵＫ181 −６を得た。
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：40 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGAAGTTGC CTGTTAGGCT GTTGGTGCTG 40 配列番号：2 配列の長さ：39 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGAGWCAG ACACACTCCT GYTATGGGT 39 配列番号：３ 配列の長さ：40 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGAGTGTGC TCACTCAGGT CCTGGSGTTG 40 配列番号：４ 配列の長さ：43 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGAGGRCCC CTGCTCAGWT TYTTGGMWTC TTG 43 配列番号：５ 配列の長さ：40 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGATTTWC AGGTGCAGAT TWTCAGCTTC 40 配列番号：６ 配列の長さ：37 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGAGGTKCY YTGYTSAGYT YCTGRGG 37 配列番号：７ 配列の長さ：41 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGGCWTCA AGATGGAGTC ACAKWYYCWG G 41 配列番号：８ 配列の長さ：41 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGTGGGGAY CTKTTTYCMM TTTTTCAATT G 41 配列番号：９ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGTRTCCW CASCTCAGTT CCTTG 35 配列番号：10 配列の長さ：37 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGTATATAT GTTTGTTGTC TATTTCT 37 配列番号：11 配列の長さ：38 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGAAGCCC CAGCTCAGCT TCTCTTCC 38 配列番号：12 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGATCCCGGG TGGATGGTGG GAAGATG 27 配列番号：13 配列の長さ：37 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGAAATGCA GCTGGGTCAT STTCTTC 37 配列番号：14 配列の長さ：36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGGATGGA GCTRTATCAT SYTCTT 36 配列番号：15 配列の長さ：37 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGAAGWTGT GGTTAAACTG GGTTTTT 37 配列番号：16 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGRACTTTG GGYTCAGCTT GRTTT 35 配列番号：17 配列の長さ：40 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGACTCCA GGCTCAATTT AGTTTTCCTT 40 配列番号：18 配列の長さ：37 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGCTGTCY TRGSGCTRCT CTTCTGC 37 配列番号：19 配列の長さ：36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGRATGGA GCKGGRTCTT TMTCTT 36 配列番号：20 配列の長さ：33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGAGAGTGC TGATTCTTTT GTG 33 配列番号：21 配列の長さ：40 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGMTTGGG TGTGGAMCTT GCTATTCCTG 40 配列番号：22 配列の長さ：37 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGGCAGAC TTACATTCTC ATTCCTG 37 配列番号：23 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGATCCCGGG CCAGTGGATA GACAGATG 28 配列番号：24 配列の長さ：399 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：マウス 直接の起源 クローン：p12-k2 特徴： 1..60 sig peptide 61..399 mat peptide 配列 ATG GAG TCA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG CTG CTC TGG GTT CCA 48 Met Glu Ser Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro -20 -15 -10 -5 GGT TCC ACT GGT GAC ATT GTG CTG ACA CAG TCT CCT GCT TCC TTA GGT 96 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Gly 1 5 10 GTA TCT CTG GGG CAG AGG GCC ACC ATC TCA TGC AGG GCC AGC AAA AGT 144 Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser 15 20 25 GTC AGT ACA TCT GGC TAT AGT TAT ATG CAC TGG TAC CAA CAG AAA CCA 192 Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 30 35 40 GGA CAG ACA CCC AAA CTC CTC ATC TAT CTT GCA TCC AAC CTA GAA TCT 240 Gly Gln Thr Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 45 50 55 60 GGG GTC CCT GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC 288 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 75 CTC AAC ATC CAT CCT GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT 336 Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 80 85 90 CAG CAC AGT AGG GAG AAT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG 384 Gln His Ser Arg Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 95 100 105 GAA ATA AAA CGG GCT 399 Glu Ile Lys Arg Ala 110 配列番号：25 配列の長さ：405 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：マウス 直接の起源 クローン：p12-h2 特徴： 1..57 sig peptide 58..405 mat peptide 配列 ATG GGA TGG AGC GGG ATC TTT CTC TTC CTT CTG TCA GGA ACT GCA GGT 48 Met Gly Trp Ser Gly Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly -15 -10 -5 GTC CAC TCT GAG ATC CAG CTG CAG CAG TCT GGA CCT GAG CTG ATG AAG 96 Val His Ser Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys -1 5 10 CCT GGG GCT TCA GTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGT TAC TCA TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 15 20 25 ACT AGC TAT TAC ATA CAC TGG GTG AAG CAG AGC CAT GGA AAG AGC CTT 192 Thr Ser Tyr Tyr Tle His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 30 35 40 45 GAG TGG ATT GGA TAT ATT GAT CCT TTC AAT GGT GGT ACT AGC TAC AAC 240 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asp Pro Phe Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn 50 55 60 CAG AAA TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT GTT GAC AAA TCT TCC AGC 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 65 70 75 ACA GCC TAC ATG CAT CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCA GTC 336 Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCA AGG GGG GGT AAC CGC TTT GCT TAC TGG GGC CAA GGG 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asn Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 95 100 105 ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA 405 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 110 115 配列番号：26 配列の長さ：387 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：マウス 直接の起源 クローン：pPM-k3 特徴： 1..60 sig peptide 61..387 mat peptide 配列 ATG GTG TCC TCA GCT CAG TTC CTT GGT CTC CTG TTG CTC TGT TTT CAA 48 Met Val Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln -20 -15 -10 -5 GGT ACC AGA TGT GAT ATC CAG ATG ACA CAG ACT ACA TCC TCC CTG TCT 96 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser 1 5 10 GCC TCT CTG GGA GAC AGA GTC ACC ATC AGT TGC AGG GCA AGT CAG GAC 144 Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp 15 20 25 ATT AGC AGT TAT TTA AAC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GAT GGA ACT ATT 192 Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile 30 35 40 AAA CTC CTG ATC TAC TAC ACA TCA AGA TTA CAC TCA GGA GTC CCA TCA 240 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser 45 50 55 60 AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGA ACA GAT TAT TCT CTC ACC ATT AAC 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn 65 70 75 AAC CTG GAG CAA GAA GAC ATT GCC ACT TAC TTT TGC CAA CAG GGT AAC 336 Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn 80 85 90 ACG CTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATA AAT CGG 384 Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg 95 100 105 GCT 387 Ala 配列番号：27 配列の長さ：411 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖鎖 鎖の数：二本鎖 配列の種類：cDNA 起源 生物名：マウス 直接の起源 クローン：pPM-h1 特徴： 1..54 sig peptide 55..411 mat peptide 配列 ATG AGA GTG CTG ATT CTT TTG TGG CTG TTC ACA GCC TTT CCT GGT ATC 48 Met Arg Val Leu Ile Leu Leu Trp Leu Phe Thr Ala Phe Pro Gly Ile -15 -10 -5 CTG TCT GAT GTG CAG CTT CAG GAG TCG GGA CCT GTC CTG GTG AAG CCT 96 Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro -1 5 10 TCT CAG TCT CTG TCC CTC ACC TGC ACT GTC ACT GGC TAC TCA ATC ACC 144 Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr 15 20 25 30 AGT GAT CAT GCC TGG AGC TGG ATC CGG CAG TTT CCA GGA AAC AAA CTG 192 Ser Asp His Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu 35 40 45 GAG TGG ATG GGC TAC ATA AGT TAC AGT GGT ATC ACT ACC TAC AAC CCA 240 Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro 50 55 60 TCT CTC AAA AGT CGA ATC TCT ATC ACT CGA GAC ACA TCC AAG AAC CAG 288 Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln 65 70 75 TTC TTC CTA CAG TTG AAT TCT GTG ACT ACT GGG GAC ACG TCC ACA TAT 336 Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Gly Asp Thr Ser Thr Tyr 80 85 90 TAC TGT GCA AGA TCC CTA GCT CGG ACT ACG GCT ATG GAC TAC TGG GGT 384 Tyr Cys Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 95 100 105 110 CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA 411 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 配列番号：28 配列の長さ：399 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：マウス 直接の起源 クローン：p64-k4 特徴： 1..60 sig peptide 61..399 mat peptide 配列 ATG GAG TCA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTG CTG CTG CTC TGG GTT CCA 48 Met Glu Ser Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro -20 -15 -10 -5 GGT TCC ACA GGT GAC ATT GTG TTG ATC CAA TCT CCA GCT TCT TTG GCT 96 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Ile Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala -1 5 10 GTG TCT CTA GGG CAG AGG GCC ACC ATA TCC TGC AGA GCC AGT GAA AGT 144 Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser 15 20 25 GTT GAT AGT TAT GGC AAT AGT TTT ATG CAC TGG TAC CAG CAG AAA CCA 192 Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 30 35 40 GGA CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATC TAT CGT GCA TCC AAC CTA GAA TCT 240 Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser 45 50 55 60 GGG ATC CCT GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT AGG ACA GAC TTC ACC 288 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr 65 70 75 CTC ACC ATT AAT CCT GTG GAG GCT GAT GAT GTT GCA ACC TAT TAC TGT 336 Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys 80 85 90 CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG 384 Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 95 100 105 GAG CTG AAA CGG GCT 399 Glu Leu Lys Arg Ala 110 配列の番号：29 配列の長さ：417 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：マウス 直接の起源 クローン：p64-h2 特徴： 1..57 sig peptide 58..417 mat peptide 配列 ATG GGA TGG AGC GGG GTC TTT ATC TTC CTC CTG TCA GTA ACT GCA GGT 48 Met Gly Trp Ser Gly Val Phe Ile Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly -15 -10 -5 GTC CAC TCC CAG GTT CAA TTG CAG CAG TCT GGA GCT GAG TTG ATG AAG 96 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys -1 5 10 CCT GGG GCC TCA GTG AAG ATC TCC TGC AAG GCT ACT GGC TAC ACA TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 AGT AGT TAT TGG ATA GTG TGG ATA AAG CAG AGG CCT GGA CAT GGC CTT 192 Ser Ser Tyr Trp Ile Val Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG ATT GGA GAG ATT TTA CCT GGA ACC GGT AGT ACT AAC TAC AAT 240 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly Ser Thr Asn Tyr Asn 50 55 60 GAG AAA TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTC ACT GCA GAT ACA TCT TCC AAC 288 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn 65 70 75 ACA GCC TAC ATG CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCC GTC 336 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCA AGT CTA GAC AGC TCG GGC TAC TAT GCT ATG GAC TAT 384 Tyr Tyr Cys Ala Ser Leu Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 95 100 105 TGG GGT CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA 417 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 110 115 120 配列の番号：30 配列の長さ：387 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：マウス 直接の起源 クローン：p146-k3 特徴： 1..60 sig peptide 61..387 mat peptide 配列 ATG GTG TCC ACA CCT CAG TTC CTT GGT CTC CTG TTG ATC TGT TTT CAA 48 Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Ile Cys Phe Gln -20 -15 -10 -5 GGT ACC AGA TGT GAT ATC CAG ATG ACA CAG ACT ACA TCC TCC CTG TCT 96 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser -1 5 10 GCC TCT CTG GGA GAC AGA GTC ACC ATC AGT TGC AGG GCA AGT CAG GAC 144 Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp 15 20 25 ATT AGT AAT TAT TTA AAC TGG TAT CAA CAG AAA CCA GAT GGA ACT GTT 192 Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val 30 35 40 AAA CTC CTG ATC TAC TAT ACA TCA AGA TTA CAC TCA GGA GTC CCA TCA 240 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser 45 50 55 60 AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGA ACA GAT TAT TCT CTC ACC ATT AGC 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 65 70 75 AAC CTG GAG CAA GAA GAT ATT GCC AGT TAC TTT TGC CAA CAG GGT TAT 336 Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Ser Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr 80 85 90 ACG CCT CCG TGG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AAG TTG GAA ATC AAA CGG 384 Thr Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 95 100 105 GCT 387 Ala 配列番号：31 配列の長さ：402 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：マウス 直接の起源 クローン：p146-h1 特徴： 1..51 sig peptide 52..402 mat peptide 配列 ATG GAG CTG GAT CTT TAT CTT ATT CTG TCA GTA ACT TCA GGT GTC TAC 48 Met Glu Leu Asp Leu Tyr Leu Ile Leu Ser Val Thr Ser Gly Val Tyr -15 -10 -5 TCA CAG GTT CAG CTC CAG CAG TCT GGG GCT GAG CTG GCA AGA CCT GGG 96 Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly -1 5 10 15 GCT TCA GTG AAG TTG TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTT ACT AAC 144 Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn 20 25 30 TAC TGG GTG CAG TGG GTA AAA CAG AGG CCT GGA CAG GGT CTG GAA TGG 192 Tyr Trp Val Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 35 40 45 ATT GGG TCT ATT TAT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG AAC ACT CAG AAG 240 Ile Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Asn Thr Gln Lys 50 55 60 TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT GCA GAT AAA TCC TCC ATC ACA GCC 288 Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ile Thr Ala 65 70 75 TAC ATG CAA CTC ACC AGC TTG GCA TCT GAG GAC TCT GCG GTC TAT TAC 336 Tyr Met Gln Leu Thr Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 80 85 90 95 TGT GCA AGA TCG ACT GGT AAC CAC TTT GAC TAC TGG GGC CAA GGC ACC 384 Cys Ala Arg Ser Thr Gly Asn His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 ACT CTC ACA GTC TCC TCA 402 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115
【図１】図１は、キメラ抗体の一過性発現のために用い
た発現ベクターの構造を示す。
た発現ベクターの構造を示す。
【図２】図２は、ヒトＩＬ−６Ｒへのキメラ抗体の結合
能を確認するためのＥＬＩＳＡの結果を示す。
能を確認するためのＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図３】図３は、ヒトＩＬ−６ＲへのＩＬ−６の結合を
阻害するキメラ抗体の能力を測定した結果を示す。
阻害するキメラ抗体の能力を測定した結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 メアリー マーガレット ベンディッグ イギリス国，ロンドン エヌダブリュ６ １ティーエックス，ウエスト ハンプステ ッド，ソレント ロード 64 (72)発明者 スティーブン タレン ジョーンズ イギリス国，ハートフォードシャイヤー ダブリュディー７ ８エイチエー，ラッド レット，ザ クローズ 10
Claims (5)
- 【請求項１】 ヒトインターロイキン−６レセプターに
対するマウスモノクローナル抗体の可変領域をコードす
るＤＮＡ。 - 【請求項２】 配列番号：24〜31に示されるアミノ酸配
列のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列を有す
る、請求項１に記載のＤＮＡ。 - 【請求項３】 配列番号：24〜31のいずれかに示される
ヌクレオチド配列を有する、請求項２に記載のＤＮＡ。 - 【請求項４】 ヒトインターロイキン−６レセプターに
対するマウスモノクローナル抗体の可変領域中の相補性
決定領域をコードするＤＮＡ。 - 【請求項５】 配列番号：24〜31中に示されるアミノ酸
配列の表２に示される部分である相補性決定領域をコー
ドするＤＮＡ。
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