DE69229482T2

DE69229482T2 - Rekombinierte humane antikörper gegen den humanen interleukin 6-rezeptor

Info

Publication number: DE69229482T2
Application number: DE69229482T
Authority: DE
Inventors: Mary Bendig; Steven Jones; Jose Saldanha; Koh Sato; Masayuki Tsuchiya
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1991-04-25
Filing date: 1992-04-24
Publication date: 1999-11-18
Anticipated expiration: 2012-04-25
Also published as: DE69229482D1; JP2001083151A; RU2139351C1; DK0628639T3; WO1992019759A1; AU692100B2; ES2134212T3; JP2008073049A; US20050142635A1; GR3031174T3; ATE181575T1; JP3913965B2; JP3616087B2; TW205553B; AU1674092A; AU5621396A; DE122009000019I1; JP2007082560A; HU218140B; NL300383I1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft variable Bereiche (V- Bereiche) eines monoclonalen Maus-Antikörpers gegen den menschlichen Interleukin-6-Rezeptor (IL-6R), einen chimären Mensch/Maus-Antikörper gegen den menschlichen IL-6R und einen neugeformten menschlichen Antikörper, der einen menschlichen Antikörper umfaßt, bei dem in die komplementaritätsbestimmenden Bereiche (CDRs) des V-Bereichs der menschlichen leichten Kette (L-Kette) und des V-Bereichs der menschlichen schweren Kette (H-Kette) die CDRs eines monoclonalen Maus-Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R übertragen sind ("grafted"). Außerdem stellt die vorliegende Erfindung eine DNA bereit, die die vorstehend erwähnten Antikörper oder einen Teil davon codiert. Die vorliegende Erfindung stellt ferner Vektoren bereit, insbesondere Expressionsvektoren, die diese DNA umfassen, und Wirtszellen, die mit einem solchen Vektor transformiert oder transfiziert sind. Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Herstellung eihes chimären Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R und ein Verfahren zur Herstellung eines neugeformten menschlichen Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R bereit.

Stand der Technik

Interleukin-6 (IL-6) ist ein multifunktionales Cytokin, das durch eine Reihe unterschiedlicher Zellen hergestellt wird. Es reguliert die Immunantworten, die Akute-Phase-Reaktionen und die Hämatopoese und kann bei den Abwehrmechnismen des Wirtes eine zentrale Rolle spielen. Es wirkt auf ein großes Spektrum von Geweben, wobei es, abhängig von der Art der Zielzellen, Wachstumsinduzierende, Wachstums-hemmende und Differenzierungsinduzierende Effekte zeigt. Der spezifische Rezeptor für IL-6 (IL-6R) wird entsprechend den multifunktionalen Eigenschaften von IL-6 sowohl auf lymphatischen als auch auf nicht-lymphatischen Zellen exprimiert. Vermutlich ist eine abnorme Expression des IL-6-Gens an der Pathogenese der verschiedensten Krankheiten beteiligt, insbesondere Autoimmunleiden, mesangioproliferative Glomerulonephritis und Plasmozytom/Myelom (vgl. den Übersichtsartikel von Hirano et al., Immunol. Today 11 (1990), 443-449). Es wurde festgestellt, daß menschliche Myelomzellen IL-6 produzieren und IL-6R exprimieren. In Experimenten hemmten Antikörper gegen IL-6 das in vitro-Wachstum von Myelomzellen, wodurch gezeigt wurde, daß bei der Onkogenese menschlicher Myelome eine autokrine regulatorische Schleife abläuft (Kawano et al., Nature 332 (1988), 83).
Der IL-6R liegt auf der Oberfläche verschiedener tierischer Zellen vor und bindet spezifisch an IL-6, außerdem wurde die Zahl der IL-6R-Moleküle auf der Zelloberfläche bestimmt (Taga et al., J. Exp. Med. 196 (1987), 967). Ferner wurde eine cDNA, die einen menschlichen IL-6R codiert, cloniert und die Primärstruktur des IL-6R beschrieben (Yamasaki et al., Science 241 (1988), 825).
Die Maus-Antikörper sind im Menschen hoch-immunogen, weshalb ihr therapeutischer Wert beim Menschen beschränkt ist. Die Halbwertszeit von Maus-Antikörpern ist in vivo im Menschen relativ kurz. Außerdem können die Maus-Antikörper nicht in mehreren Dosen verabreicht werden, ohne eine Immunantwort auszulösen, was nicht nur die geplante Wirksamkeit beeinträchtigt, sondern auch das Risiko einer nachteiligen allergischen Antwort beim Patienten in sich birgt.
Um diese Probleme zu lösen, wurden Verfahren zur Herstellung humanisierter Maus-Antikörper entwickelt. Antikörper der Maus können auf zwei Arten vermenschlicht werden. Das einfachere Verfahren besteht darin, chimäre Antikörper zu konstruieren, bei denen die V-Bereiche vom ursprünglichen monoclonalen Maus-Antikörper stammen und die C-Bereiche von geeigneten menschlichen Antikörpern hergeleitet sind. Der resultierende chimäre Antikörper enthält die vollständigen V-Domänen des ursprünglichen Maus-Antikörpers, weshalb man erwarten kann, daß er das Antigen mit der gleichen Spezifität bindet wie der ursprüngliche Maus-Antikörper. Außerdem ist bei den chimären Antikörpern der prozentuale Anteil der Proteinsequenz, die von einer nicht-menschlichen Quelle stammt, wesentliche reduziert, weshalb man davon ausgehen kann, daß sie weniger immunogen sind als der ursprüngliche Maus-Antikörper. Obwohl man voraussagen kann, daß chimäre Antikörper das Antigen gut binden·und weniger immunogen sind, kann es trotzdem noch zu einer Immunantwort gegen die V-Bereiche der Maus kommen (Loßuglio et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 4220-4224).
Das zweite Verfahren zur Vermenschlichung von Maus-Antikörpern ist komplizierter, jedoch reduziert es die mögliche Immunogenität des Maus-Antikörpers umfassender. In diesem Verfahren werden die komplementaritätsbestimmenden Bereiche (CDRs) aus den V-Bereichen des Maus-Antikörpers in menschliche V-Bereiche übertragen, wodurch "neugeformte" menschliche V-Bereiche geschaffen werden. Diese neugeformten menschlichen V- Bereiche werden sodann mit menschlichen C-Bereichen verknüpft. Die einzigen, von nicht-menschlichen Proteinsequenzen stammenden Teile des endgültigen neugeformten menschlichen Antikörpers sind die CDRs. Die CDRs bestehen aus hochvariablen Proteinsequenzen. Sie zeigen keine artspezifischen Sequenzen. Deshalb sollte ein neugeformter menschlicher Antikörper, der murine CDRs enthält, in keiner Weise immunogener sein als ein natürlicher menschlicher Antikörper, der menschliche CDRs enthält.
Chimäre Antikörper werden in GB 2188638A beschrieben. Ein veränderter Antikörper wird hergestellt, indem die komplementaritätsbestimmenden Bereiche (CDRs) eines variablen Bereichs eines Immunglobulins (Ig) durch die CDRs eines Ig mit einer anderen Spezifität ersetzt werden, wobei DNA-Rekombinations- Techniken verwendet werden. Die codierenden Gensequenzen zur Herstellung des veränderten Antikörpers können durch ortsspezifische Mutagenese unter Verwendung von langen Oligonucleotiden erzeugt werden.
Reichmann et al. beschreiben in Nature 332 (1988), 323- 327, die Übertragung der hypervariablen Bereiche aus einem Ratten- auf einen menschlichen Antikörper des IgG1-Subtyps.
Der neugeformte menschliche Antikörper ist für das CAMPATH-1- Antigen spezifisch. Reichmann berichtet, daß dieser neugeformte Antikörper zur zellvermittelten Lyse menschlicher Lymphocyten eingesetzt werden kann.
Die vorstehenden Angaben legen nahe, daß sich neugeformte menschliche Antikörper für therapeutische Zwecke nutzen lassen, jedoch sind bisher keine neugeformten menschlichen Antikörper gegen den menschlichen IL-6R bekannt. Außerdem gibt es kein Verfahren zur Konstruktion eines neugeformten menschlichen Antikörpers, das für jeden beliebigen Antikörper allgemein anwendbar wäre. Aus diesem Grund sind bei der Konstruktion eines vollständig aktiven neugeformten menschlichen Antikörpers gegen ein bestimmtes Antigen verschiedene Mechanismen erforderlich. Zwar wurden bereits monoclonale Maus-Antikörper gegen den menschlichen IL-6R hergestellt, d. h. PM-1 und MT18 (Japanische Patentanmeldung Nr. 2-189420), und die Erfinder haben monoclonale Maus-Antikörper gegen den menschlichen IL-6R erzeugt, d. h. AUK 12-20, AUK 64-7 und AUK 146-15, jedoch sind den Erfindern keine Veröffentlichungen bekannt, die auf eine Konstruktion von neugeformten menschlichen Antikörpern gegen den menschlichen IL-6R hinweisen.
Die Erfinder fanden außerdem, daß bei einer Injektion der monoclonalen Maus-Antikörper gegen den menschlichen IL-6R in Nacktmäuse, in die eine menschliche Myelomzellinie transplantiert worden war, das Wachstum des Tumors deutlich gehemmt wurde. Dies legt nahe, daß der Antikörper gegen den menschlichen IL-6-Rezeptor als Arzneimittel zur Behandlung von Myelomen eingesetzt werden kann.

Beschreibung der Erfindung

Der Umfang zum Schutz der vorliegenden Erfindung ist durch die beigefügten Patentansprüche definiert. Allgemein gesprochen soll die vorliegende Erfindung einen weniger immunogenen Antikörper gegen den menschlichen IL-6R bereitstellen. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung neugeformte menschliche Antikörper gegen den menschlichen IL-6R bereit. Außerdem stellt die vorliegende Erfindung chimäre Mensch/Maus-Antikörper bereit, die für die Konstruktion des neugeformten menschlichen Antikörpers eingesetzt werden können. Die vorliegende Erfindung stellt ferner einen Teil eines neugeformten menschlichen Antikörpers und auch die Expressionssysteme zur Herstellung des neugeformten menschlichen Antikörpers und eines Teils davon sowie des chimären Antikörpers bereit.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung einen V-Bereich einer L-Kette eines monoclonalen Maus-Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R und einen V-Bereich einer H-Kette eines monoclonalen Maus-Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem einen chimären Antikörper gegen den menschlichen IL-6R bereit, umfassend:
(1) eine L-Kette, umfassend einen C-Bereich einer menschlichen L-Kette und einen V-Bereich einer L-Kette eines monoclonalen Maus-Antikörpers gegen den IL-6R; und
(2) eine H-Kette, umfassend einen C-Bereich einer menschlichen H-Kette und einen V-Bereich einer H-Kette eines monoclonalen Maus-Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R.
Die vorliegenden Erfindung stellt ferner CDRs eines V-Bereichs einer L-Kette eines monoclonalen Maus-Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R und CDRs eines V-Bereichs einer H-Kette eines monoclonalen Maus-Antikörpers gegen den menschlichen IL- 6R bereit.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung einen neugeformten menschlichen V-Bereich einer L-Kette eines Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R bereit, umfassend:
(1) Gerüstbereiche (FRs) eines V-Bereichs einer menschlichen L-Kette und
(2) CDRs eines V-Bereichs einer L-Kette eines monoclonalen Maus-Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R; und
einen neugeformten menschlichen V-Bereich einer H-Kette eines Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R, umfassend:
(1) FRs eines V-Bereichs einer menschlichen H-Kette und
(2) CDRs eines V-Bereichs einer H-Kette eines monoclonalen Maus-Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R.
Ferner stellt die vorliegende Erfindung eine neugeformte menschliche L-Kette eines Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R bereit, umfassend:
(1) einen C-Bereich einer menschlichen L-Kette und
(2) einen V-Bereich einer L-Kette, umfassend menschliche FRs und CDRs eines monoclonalen Maus-Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R; und
eine neugeformte menschliche H-Kette eines Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R, umfassend:
(1) einen C-Bereich einer menschlichen H-Kette und
(2) einen V-Bereich einer H-Kette, umfassend menschliche FRs und CDRs eines monoclonalen Maus-Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R.
Ferner stellt die vorliegende Erfindung einen neugeformten menschlichen Antikörper gegen den menschlichen IL-6R bereit, umfassend:
(A) eine L-Kette, umfassend
(1) einen C-Bereich einer menschlichen L-Kette und
(2) einen V-Bereich einer L-Kette, umfassend FRs einer menschlichen L-Kette und CDRs einer L-Kette eines monoclonalen Maus-Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R; und
(B) eine H-Kette, umfassend
(1) einen C-Bereich einer menschlichen H-Kette und
(2) einen V-Bereich einer H-Kette, umfassend FRs einer menschlichen H-Kette und CDRs einer H-Kette eines monoclonalen Maus-Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem DNA bereit, die jedes beliebige der vorstehend erwähnten Antikörper-Polypeptide oder Teile davon codiert.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Vektoren bereit, z. B. Expressionsvektoren, die diese DNA umfassen.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Wirtszellen bereit, die mit einem solchen Vektor transformiert oder transfiziert sind.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines chimären Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R und ein Verfahren zur Herstellung eines neugeformten menschlichen Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R bereit.

Kurze Beschreibung der zeichnungen

Fig. 1 zeigt Expressionsvektoren, die das Promotor/Enhancer-System des humanen Cytomegalovirus (HCMV) umfassen und für die Expression des vorliegenden Antikörperpeptids eingesetzt werden können.
Fig. 2 zeigt das Ergebnis eines ELISA, wobei die Fähigkeit des vorliegenden chimären Antikörpers AUK 12-20 bestätigt wird, an den menschlichen IL-6R zu binden.
Fig. 3 zeigt das Ergebnis einer Messung der Fähigkeit des vorliegenden chimären Antikörpers AUK 12-20, die Bindung von IL-6 an den menschlichen IL-6R zu hemmen.
Fig. 4 zeigt das Ergebnis eines ELISA zur Bindung der vorliegenden chimären Antikörper PM1a und PM1b an den menschlichen IL-6R.
Fig. 5 zeigt das Ergebnis eines ELISA, wobei die Fähigkeit der vorliegenden chimären Antikörper PM1a und PM1b getestet wird, IL-6 daran zu hindern, an den menschlichen IL-6R zu binden.
Fig. 6 zeigt die Konstruktion der ersten Version eines neugeformten menschlichen V-Bereichs einer H-Kette von PM-1.
Fig. 7 zeigt die Konstruktion der ersten Version eines neugeformten menschlichen V-Bereichs einer L-Kette von PM-1.
Fig. 8 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion des Expressionsplasmids HEF-12 h-g-γ-1, das einen menschlichen Elongationsfaktor 1α (HEF-1α)-Promotor/Enhancer umfaßt und das für die Expression einer H-Kette eingesetzt werden kann.
Fig. 9 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion des Expressionsplasmids HEF-12k-gk, das das HEF-1α-Promotor/Enhancer- System umfaßt und das für die Expression einer L-Kette eingesetzt werden kann.
Fig. 10 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion des Expressionsplasmids DHFR-PMh-g-γ-1, umfassend den HCMV-Promotor/Enhancer und das Dihydrofolat-Reduktase (dhfr)-Gen, gekoppelt an eine defekte SV40-Promotor/Enhancer-Sequenz zur Amplifikation, das für die Expression einer H-Kette eingesetzt werden kann.
Fig. 11 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion des Expressionsplasmids DHFR-ΔE-RVh-PM1-f, umfassend den EF-1α-Pro motor/Enhancer und das dhfr-Gen, gekoppelt an eine defekte SV40-Promotor/Enhancer-Sequenz zur Amplifikation, das für die Expression einer H-Kette eingesetzt werden kann.
Fig. 12 zeigt die Fähigkeit der Version "a" und der Version "b" des neugeformten menschlichen V-Bereichs der L-Kette von PM-1, an den menschlichen IL-6R zu binden.
Fig. 13 zeigt die Fähigkeit der Version "f" des neugeformten menschlichen V-Bereichs der H-Kette von PM-1 plus der Version "a" des neugeformten menschlichen V-Bereichs der L- Kette von PM-1, an den menschlichen IL-6R zu binden.
Fig. 14 zeigt die Fähigkeit der Version "f" des neugeformten V-Bereichs der H-Kette von PM-1 plus der Version "a" des neugeformten V-Bereichs der L-Kette von PM-1, die Bindung von IL-6 an den menschlichen IL-6R zu hemmen.
Fig. 15 zeigt die Expressionsplasmide HEF-VL-gk und HEF- VH-g-γ-l, die einen menschlichen EF-1α-Promotor/Enhancer umfassen und für die Expression einer L-Kette bzw. H-Kette eingesetzt werden können.
Fig. 16 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion einer DNA, die einen neugeformten menschlichen V-Bereich der L-Kette des AUK 12-20-Antikörpers codiert.
Fig. 17 zeigt die Ergebnisse eines ELISA, wobei die Fähigkeit eines neugeformten menschlichen V-Bereichs der L-Kette des AUK 12-20-Antikörpers bestätigt wird, an den menschlichen IL-6R zu binden. In der Figur stellt "Standard AUK 12-20 (Chimäre)" das Ergebnis für den chimären AUK 12-20-Antikörper dar, der durch CHO-Zellen erzeugt wurde und sodann in großen Mengen gereinigt wurde.
Fig. 18 zeigt das Ergebnis eines ELISA, wobei die Fähigkeit eines neugeformten menschlichen AUK 12-20-Antikörpers (L- Kette Version "a" und H-Kette Version "b") bestimmt wird, an den menschlichen IL-6R zu binden.
Fig. 19 zeigt das Ergebnis eines ELISA, wobei die Fähigkeit eines neugeformten menschlichen AUK 12-20-Antikörpers (L- Kette Version "a" und H-Kette Version "d") bestimmt wird, an den menschlichen IL-6R zu binden.
Fig. 20 zeigt ein Verfahren zur chemischen Synthese eines neugeformten menschlichen V-Bereichs einer H-Kette des sle 1220 H-Antikörpers.
Fig. 21 zeigt das Ergebnis eines ELISA, wobei die Fähigkeit eines neugeformten menschlichen sle 1220-Antikörpers (L- Kette Version "a" und H-Kette Version "a") bestimmt wird, die Bindung von IL-6 an den menschlichen IL-6R zu hemmen.
Fig. 22 zeigt das Ergebnis eines ELISA, wobei die Fähigkeit eines neugeformten menschlichen sle 1220-Antikörpers (L- Kette Version "a" und H-Kette Version "b") bestimmt wird, die Bindung von IL-6 an den menschlichen IL-6R zu hemmen.
Fig. 23 zeigt das Ergebnis eines ELISA, wobei die Fähigkeit eines neugeformten menschlichen sle 1220-Antikörpers (L- Kette Version "a" und H-Kette Version "c") bestimmt wird, die Bindung von IL-6 an den menschlichen IL-6R zu hemmen.
Fig. 24 zeigt das Ergebnis eines ELISA, wobei die Fähigkeit eines neugeformten menschlichen sle 1220-Antikörpers (L- Kette Version "a" und H-Kette Version "d") bestimmt wird, die Bindung von IL-6 an den menschlichen IL-6R zu hemmen.

Beste Art und Weise zur Durchführung der Erfindung

Clonierung von DNA, die Maus-V-Bereiche codiert

Insbesondere ist zur Clonierung von DNA, die V-Bereiche eines monoclonalen Maus-Antikörpers gegen einen menschlichen IL-6R codiert, die Konstruktion eines Hybridoms als Genquelle erforderlich, das einen monoclonalen Antikörper gegen den menschlichen IL-6R erzeugt. Ein solches Hybridom, das Maushybridom PM-1, das den monoclonalen Antikörper PM-1 produziert, und dessen Eigenschaften werden in der japanischen Patentanmeldung Nr. 2-189420 beschrieben. Die Bezugsbeispiele 1 und 2 der vorliegenden Beschreibung offenbaren das Verfahren zur Konstruktion des Hybridoms PM-1. Die Erfinder haben die Hybridome AUK 12-20, AUK 64-7 und AUK 146-15 konstruiert, die jeweils einen monoclonalen Maus-Antikörper gegen den menschlichen IL-6R produzieren. Das Verfahren zur Konstruktion dieser Hybridome wird im Referenzbeispiel 3 dieser Beschreibung erläutert.
Zur Clonierung der gewünschten DNAs, die für V-Bereiche eines monoclonalen Maus-Antikörpers codieren, werden die Hy bridomzellen homogenisiert, und die Gesamt-RNA wird nach einem herkömmlichen Verfahren erhalten, das in Chirgwin et al., Biochemistry 18 (1977), 5294, beschrieben wird. Anschließend wird die Gesamt-RNA zur Synthese von einzelsträngigen cDNAs eingesetzt, wobei das von J. W. Larrick et al., Bio/Technology 7 (1989), 934, beschriebene Verfahren verwendet wird.
Sodann wird eine spezifische Amplifikation des entsprechenden Teils der cDNA durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt. Zur Amplifikation eines V-Bereichs einer κ-L-Kette eines monoclonalen Maus-Antikörpers, werden 11 Gruppen von Oligonucleotidprimern (Maus Kappa variabel; MKV), dargestellt in SEQ ID NO: 1 bis 11, und ein Oligonucleotidprimer (Maus Kappa konstant; MKC), dargestellt in SEQ ID NO: 12, als die 5'-terminalen Primer bzw. als der 3'-terminale Primer eingesetzt. Die MKV-Primer hybridisieren mit der DNA-Sequenz, die die Leader-Sequenz einer Maus-κ-L- Kette codiert, und der MKC-Primer hybridisiert mit der DNA- Sequenz, die den konstanten Bereich der Maus-κ-L-Kette codiert. Zur Amplifikation der V-Bereichs einer H-Kette eines monoclonalen Maus-Antikörpers werden zehn Gruppen von Oligonucleotidprimern (Maus schwer variabel; MHV), dargestellt in SEQ ID NO: 13 bis 22, und ein Oligonucleotidprimer (Maus schwer konstant; MHC), dargestellt in SEQ ID NO: 23, als die 5'-terminalen Primer bzw. als der 3'-terminale Primer eingesetzt.
Zu beachten ist, daß die 5'-terminalen Primer nahe bei ihrem 5'-Ende die Nucleotidsequenz GTCGAC enthalten, wobei diese Sequenz eine Spaltstelle des Restriktionsenzyms SalI darstellt, und daß der 3'-terminale Primer nahe bei seinem 5'- Ende die Nucleotidsequenz CCCGGG enthält, wobei die Sequenz eine Spaltstelle· des Restriktionsenzyms XmaI darstellt. Diese Restriktionsenzym-Spaltstellen werden für die Subclonierung der DNA-Fragmente, die einen variablen Bereich codieren, in Clonierungsvektoren genutzt.
Als nächstes wird das Amplifikationsprodukt mit den Restriktionsenzymen SalI und XmaI gespalten, wodurch ein DNA- Fragment erhalten wird, das einen gewünschten V-Bereich eines monoclonalen Maus-Antikörpers codiert. Andererseits wird ein geeigneter Clonierungsvektor, wie z. B. Plasmid pUC19, mit den gleichen Restriktionsenzymen SalI und XmaI gespalten und das vorstehende DNA-Fragment mit dem gespaltenen pUC19 ligiert, wodurch ein Plasmid erhalten wird, in dem ein DNA-Fragment enthalten ist, das einen gewünschten V-Bereich eines monoclonalen Maus-Antikörpers codiert.
Die Sequenzierung der clonierten DNA kann nach einem herkömmlichen Verfahren erfolgen.
Die Clonierung der gewünschten DNA und ihre Sequenzierung werden in den Beispielen 1 bis 3 genau beschrieben.

Komplementaritätsbestimmende Bereiche (CDRs)

Die vorliegende Erfindung stellt hypervariable oder komplementaritätsbestimmenden Bereiche (CDRs) von jedem V-Bereich der vorliegenden Erfindung bereit. Die V-Domänen von jedem Paar von L- und H-Ketten der Antigenbindungsstelle. Die Domänen auf den L- und H-Ketten haben die gleiche allgemeine Struktur, und jede Domäne umfaßt vier Gerüstbereiche (FRs), deren Sequenzen relativ konserviert sind und die durch drei CDRs verbunden sind (vgl. Kabat, E. A., Wu, T. T., Bilofsky, H., Reid-Miller, M., und Perry, H., in "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1983). Die vier FRs nehmen größtenteils eine β-Faltblatt- Konformation an, und die CDRs bilden Schleifen, welche die FRs verbinden, in einigen Fällen stellen sie einen Teil der β- Faltblattstruktur dar. Die CDRs werden durch FRs in nächster Nachbarschaft gehalten und tragen zusammen mit den CDRs der anderen Domäne zur Gestaltung der Antigenbindungsstelle bei. Die CDRs werden in Beispiel 4 beschrieben.

Konstruktion eines chimären Antikörpers

Bevor man neugeformte menschliche V-Bereiche eines Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R entwerfen kann, muß man sicherstellen, daß die CDRs, die verwendet werden sollen, tatsächlich einen wirksamen Antigen-bindenden Bereich bilden. Für diesen Zweck wurden chimäre Antikörper konstruiert. Außerdem wurden die Aminosäuresequenzen der V-Bereiche von Maus-Antikörpern gegen den menschlichen IL-6R, vorausgesagt aus den Nucleotidsequenzen clonierter DNAs der vier monoclonalen Maus- Antikörper, die in den Beispielen 1 und 2 beschrieben sind, miteinander und mit V-Bereichen aus bekannten Maus- und Mensch-Antikörpern verglichen. Für jeden der vier monoclonalen Maus-Antikörper war ein Satz typischer funktioneller V-Bereiche von Maus-L- und -H-Ketten cloniert worden. Alle vier Maus- Antikörper gegen den IL-6R hatten jedoch relativ verschiedenartige V-Bereiche. Die vier Antikörper sind nicht einfach leichte Variationen voneinander. Unter Verwendung der clonierten Maus-V-Bereiche wurden vier chimäre Anti-IL-6R-Antikörper konstruiert.
Das grundlegende Verfahren zur Konstruktion chimärer Antikörper umfaßt die Kopplung der Maus-Leader- und -V-Bereich- Sequenzen, wie in den PCRclonierten cDNAs gefunden, an die die menschlichen C-Bereiche codierende Sequenz, die bereits in Expressionsvektoren von Säugerzellen vorliegt. Mit den vier monoclonalen Antikörpern wird in Beispiel 5 die Konstruktion eines chimären Antikörpers aus dem monoclonalen Antikörper AUK 12-20 beschrieben.
Die Konstruktion eines chimären Antikörpers aus dem monoclonalen Antikörper PM-1 wird in Beispiel 6 beschrieben. Die cDNA, die den Leader- und V-Bereich der κ-L-Kette von Maus-PM- 1 codiert, wurde in einen Expressionsvektor mit Hilfe der PCR subcloniert, der eine genomische DNA enthielt, die den menschlichen κ-C-Bereich codiert. Die cDNA, die die Leader- und V-Bereiche der H-Kette von Maus-PM-1 codiert, wurde in einen Expressionsvektor mit Hilfe der PCR subcloniert, der eine genomische DNA enthielt, die den menschlichen γ-1-C- Bereich codiert. Unter Verwendung speziell entworfener PCR- Primer wurden die cDNAs, die den V-Bereich des Maus-PM-1 codieren, an ihren 5'- und 3'-Enden so verändert, daß sie (1) einfach in die Expressionsvektoren eingefügt werden konnten und (2) in diesen Expressionsvektoren richtig funktionieren konnten. Die PCR-modifizierten V-Bereiche des Maus-PM-1 wurden sodann in HCMV-Expressionsvektoren eingefügt, die bereits die gewünschten menschlichen C-Bereiche enthielten (Fig. 1). Diese Vektoren sind entweder für eine transiente oder für eine stabile Expression von gentechnisch hergestellten Antikörpern in den verschiedensten Säugerzellinien geeignet.
Zusätzlich zur Konstruktion eines chimären PM-1-Antikörpers mit V-Bereichen, die zu den im Maus-PM-1-Antikörper vorliegenden V-Bereichen identisch sind (Version a), wurde eine zweite Version eines chimären PM-1-Antikörpers konstruiert (Version b). Bei dem chimären PM-1-Antikörper (Version b) wurde der Aminosäurerest an Position 107 im V-Bereich der L-Kette von einem Aspatagin- in einen Lysinrest geändert. Beim Vergleich des V-Bereichs der L-Kette des Maus-PM-1-Antikörpers mit anderen V-Bereichen von Maus-L-Ketten wurde festgestellt, daß das Vorliegen eines Asparaginrestes an Position 107 ungewöhnlich war. In den V-Bereichen von K-L-Ketten der Maus liegt an Position 107 am typischsten der Aminosäurerest Lysin vor. Um herauszufinden, wie wichtig das Vorliegen der atypischen Aminosäure Asparagin an Position 107 im V-Bereich der L-Kette des Maus-PM-1-Antikörpers ist, wurde der Aminosäurerest an Position 107 in die für diese Position typische Aminosäure Lysin geändert. Diese Änderung wurde durch ein PCR-Mutagenese- Verfahren (M. Kamman et al., Nucl. Acids Res. 17 (1989), 5404) erreicht, wobei die erforderlichen Veränderungen in den DNA- Sequenzen, die den V-Bereich der L-Kette codieren, durchgeführt wurden.
Der chimäre PM-1-Antikörper, Version a, zeigte eine Aktivität zur Bindung an den menschlichen IL-6R. Auch der chimäre PM-1-Antikörper, Version b, bindet an den menschlichen IL-6R, genauso gut wie die Version a. Entsprechend wurden von zwei anderen monoclonalen Antikörpern, AUK 64-7 und AUK 146-15, chimäre Antikörper konstruiert. Alle vier chimären Antikörper banden gut an den menschlichen IL-6R; dies zeigt in Funktionstests, daß die korrekten Maus-V-Bereiche cloniert und sequenziert worden waren.
Aus den vier Anti-IL-6R-Antikörpern der Maus wurde der Antikörper PM-1 als erster Kandidat für die Gestaltung und die Konstruktion eines neugeformten menschlichen Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R ausgewählt. Die Auswahl des Maus-Antikörpers PM-1 beruhte hauptsächlich auf den Ergebnissen, die bei der Untersuchung der Wirkung der Anti-IL-6R-Maus-Antikörper auf menschliche Myelomtumorzellen erhalten wurden, die in Nacktmäuse transplantiert worden waren. Von den vier Maus-An tikörpern gegen IL-6R zeigte der Antikörper PM-1 die stärkste Aktivität gegen Tumorzellen.

Vergleich der V-Bereiche des monoclonalen Maus-Antikörpers PM-1 mit V-Bereichen von bekannten Maus- und Mensch- Antikörpern

Für die Konstruktion eines neugeformten menschlichen Antikörpers, bei dem die CDRs eines monoclonalen Maus-Antikörpers in einen menschlichen monoclonalen Antikörper übertragen werden, ist eine hohe Homologie zwischen den FRs des monoclonalen Maus-Antikörpers und den FRs des menschlichen monoclonalen Antikörpers wünschenswert. Deshalb wurden die Aminosäuresequenzen der V-Bereiche der L- und der H-Kette aus dem Maus-Antikörper PM-1 mit allen bekannten Maus- und Maus-V- Bereichen verglichen, die in der OWL (oder Leeds)-Datenbank der Proteinsequenzen zu finden waren.
Hinsichtlich der V-Bereiche von Maus-Antikörpern war der V-Bereich der L-Kette des Antikörpers PM-1 dem V-Bereich der L-Kette des Maus-Antikörpers musigkcko am ähnlichsten (Chen, H.-T., et al., J. Biol. Chem. 262 (1987), 13579-13583), wobei eine Identität von 93,5% vorlag. Der V-Bereich der H-Kette des Antikörpers PM-1 war dem V-Bereich der H-Kette des Maus- Antikörpers musigvhr2 am ähnlichsten (F. J. Grant et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 5496), wobei eine Identität von 84,0% vorlag. Die Maus-PM-1-V-Bereiche wiesen mit bekannten Maus-V-Bereichen einen hohen Prozentsatz an Identität auf; dies zeigt, daß die V-Bereiche des Maus-PM-1 typische Maus-V- Bereiche sind. Dies ist ein weiterer indirekter Beweis dafür, daß die clonierten DNA-Sequenzen korrekt sind. Im allgemeinen liegt zwischen den V-Bereichen der L-Ketten eine höherprozentige Identität vor als zwischen den V-Bereichen der H-Ketten. Dies ist möglicherweise auf das geringere Ausmaß an Verschiedenartigkeit bei den der V-Bereichen der L-Ketten, verglichen mit den V-Bereichen der H-Ketten, zurückzuführen.
Hinsichtlich der V-Bereiche von menschlichen Antikörpern war der V-Bereich der L-Kette des PM-1-Antikörpers dem V-Bereich der L-Kette des menschlichen Antikörpers klhure am ähnlichsten, der auch als REI bezeichnet wird (W. Palm et al., Physiol. Chem. 356 (1975), 167-191), wobei eine Identität von 72,2% vorlag. Der V-Bereich der H-Kette des PM-1-Antikörpers war dem V-Bereich der H-Kette des menschlichen Antikörpers humighvap (VAP) am ähnlichsten (H. W. Schroeder et al., Science 238 (1987), 791-793), wobei eine Identität von 71,8% vorlag. Der Vergleich mit menschlichen V-Bereichen ist sehr wichtig für die Gestaltung der neugeformten menschlichen Antikörper aus dem Maus-PM-1-Antikörper. Die Identität mit menschlichen V-Bereichen war prozentual geringer als die Identität mit Maus-V-Bereichen. Dies ist ein indirekter Beweis dafür, daß die V-Bereiche des Maus-PM-1 wie Maus-V-Bereiche und nicht wie menschliche V-Bereiche aussehen. Dieses Ergebnis macht auch deutlich, daß es am besten wäre, die V-Bereiche des Maus- PM-1 zu vermenschlichen, um die Probleme der Immunogenität bei menschlichen Patienten zu vermeiden.
Die V-Bereiche des Maus-Antikörpers PM-1 wurden auch mit den Consensus-Sequenzen für die verschiedenen Untergruppen menschlicher V-Bereiche verglichen, wie von E. A. Kabat et al. definiert ((1987), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. Aufl. US Department of Health and Human Services, US Government Printing Office). Dieser Vergleich erfolgte zwischen den FRs der V-Bereiche. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Prozentuale Identität zwischen den FRs aus den V-Bereichen von Maus-PM-1 und den FRs aus den Consensus-Sequenzen(1) für die verschiedenen Untergruppen menschlicher V-Bereiche A. FRs in den V-Bereichen der L-Kette B. FRs in den V-Bereichen der H-Kette
(1) Die Consensus-Sequenzen wurden aus den Untergruppen menschlicher V-Bereiche erhalten, wie in Kabat et al. (1987) beschrieben.
Die FRs aus dem V-Bereich der L-Kette des Maus-PM-1 sind den FRs aus der Consensus-Sequenz für die Untergruppe I (HSGI) der V-Bereiche menschlicher L-Ketten am ähnlichsten, wobei eine Identität von 70,1% vorliegt. Die FRs aus dem V-Bereich der H-Kette von Maus-PM-1 sind den FRs aus der Consensus- Sequenz für die Untergruppe 11 (HSGII) der V-Bereiche menschlicher L-Ketten am ähnlichsten, wobei eine Identität von 52,9% vorliegt. Diese Ergebnisse bestätigen die Ergebnisse, die beim Vergleich mit bekannten menschlichen Antikörpern erhalten wurden. Der V-Bereich der L-Kette des menschlichen REI gehört zur Untergruppe I der V-Bereiche menschlicher L- Ketten und der V-Bereich der H-Kette im menschlichen VAP gehört zur Untergruppe 11 der V-Bereiche menschlicher H- Ketten.
Dieser Vergleich der V-Bereiche in menschlichen Antikörpern macht es möglich, menschliche V-Bereiche zu selektieren, die sodann die Basis für die Gestaltung von neugeformten menschlichen V-Bereichen von PM-1 darstellen. Am besten wäre es, für die Gestaltung eines neugeformten menschlichen V-Bereichs einer L-Kette von PM-1 einen V-Bereich einer menschlichen L-Kette einzusetzen, der zur Untergruppe I (SGII) gehört, und für die Gestaltung eines neugeformten menschlichen V-Bereichs einer H-Kette von PM-1 einen V-Bereich einer menschlichen H-Kette einzusetzen, der zur Untergruppe 11 (SGII) gehört.

Gestaltung von neugeformten menschlichen variablen Bereichen von PM-1

Der erste Schritt bei der Gestaltung von neugeformten menschlichen V-Bereichen von PM-1 bestand darin, die menschlichen V-Bereiche zu selektieren, die die Grundlage der Gestaltung darstellen. Die FRs im Maus-V-Bereich der L-Kette von PM- 1 waren den FRs in den V-Bereichen menschlicher L-Ketten, die zur Untergruppe I gehörten, am ähnlichsten (Tabelle 1). Wie vorstehend besprochen, war der Maus-V-Bereich der L-Kette von PM-1 beim Vergleich mit bekannten V-Bereichen menschlicher L- Ketten dem V-Bereich der L-Kette des menschlichen REI am ähnlichsten, der zur Untergruppe I der V-Bereiche menschlicher L- Ketten zählt. Bei der Gestaltung von neugeformten menschlichen V-Bereichen der L-Kette von PM-1 wurden die FRs aus dem REI eingesetzt. Außerdem wurden die REI-FRs als Ausgangssubstanzen für die Konstruktion des neugeformten menschlichen V-Bereichs der L-Kette von PM-1 verwendet.
In diesen auf REI basierenden menschlichen FRs lagen fünf Unterschiede zu den FRs des ursprünglichen menschlichen REI vor (Position 39, 71, 104, 105 und 107, gemäß Kabat et al. (1987), vgl. Tabelle 2). Die drei Änderungen in FR4 (Positionen 104, 105 und 107) basieren auf einem J-Bereich aus einer anderen menschlichen K-L-Kette und sind somit keine Abweichung von der menschlichen Version (L. Riechmann et al., Nature 332 (1988), 323-327). Die zwei Änderungen an den Positionen 39 und 71 waren Änderungen zurück zu den Aminosäuren, die in den FRs des V-Bereichs der L-Kette des Ratten-CAMPATH-1 vorlagen (Riechmann et al., 1988).
Zwei Versionen des neugeformten menschlichen V-Bereichs der L-Kette von PM-1 wurden entworfen. In der ersten Version (Version "a") waren die menschlichen FRs zu den auf REI basierenden FRs identisch, die im neugeformten menschlichen CAM- PATH-1H vorlagen (Riechmann et al., 1988), und die Maus-CDRs waren zu den CDRs im Maus-V-Bereich der L-Kette von PM-1 identisch. Die zweite Version (Version "b") basierte auf der Version "a", wobei lediglich ein Aminosäurerest an Position 71 im menschlichen FR3 verändert war. Der Rest 71 ist Teil der kanonischen Struktur von CDR1 des V-Bereichs der L-Kette, wie von C. Chothia et al. definiert (J. Mol. Biol. 196 (1987), 901- 917). Man geht davon aus, daß der an dieser Stelle stehende Aminosäurerest die Struktur der CDR1-Schleife des V-Bereichs der L-Kette direkt beeinflußt und deshalb möglicherweise auch die Antigenbindung beeinflußt. Im Maus-V-Bereich der L-Kette von PM-1 steht an Position 71 ein Tyrosinrest. In den modifizierten REI-FRs, die zur Gestaltung von Version "a" des neugeformten menschlichen V-Bereichs der L-Kette von PM-1 eingesetzt wurden, stand an Position 71 ein Phenylalaninrest. In Version "b" des neugeformten menschlichen V-Bereichs der L- Kette von PM-1 wurde der Phenylalaninrest an Position 71 in einen Tyrosinrest geändert, der im Maus-V-Bereich der L-Kette von PM-1 vorliegt. Tabelle 2 zeigt die Aminosäuresequenzen des Maus-V-Bereichs der L-Kette von PM-1, der FRs von REI, wie für die Verwendung im neugeformten menschlichen CAMPATH-1H-Antikörper modifiziert (Riechmann et al., 1988), und der zwei Versionen des neugeformten menschlichen V-Bereichs der L-Kette von PM-1. Tabelle 2 Gestaltung von zwei unterschiedlichen Versionen eines neugeformten menschlichen V-Bereichs der L-Kette von PM-1
Anm.: Für REI sind diejenigen FRs angegebenen, die im neugeformten menschlichen CAMPATH-1H-Antikörper vorliegen (Riechmann et al., 1988). In den REI-FRs sind die fünf Aminosäurereste unterstrichen, die sich von der Aminosäuresequenz des menschlichen REI unterscheiden (Palm et al., 1975; O. Epp et al., Biochemistry 14 (1975), 4943-4952).
Die FRs im Maus-V-Bereich der H-Kette von PM-1 waren den FRs in den V-Bereichen der menschlichen H-Kette, die zur Untergruppe 11 gehören, am ähnlichsten (Tabelle 1). Wie vorstehend besprochen, war der Maus-V-Bereich der H-Kette von PM-1 beim Vergleich mit bekannten V-Bereichen menschlicher H-Ketten dem menschlichen V-Bereich der H-Kette von VAP am ähnlichsten, einem Mitglied der Untergruppe 11 der V-Bereiche menschlicher H-Ketten. Die DNA-Sequenzen, die für die FRs im V-Bereich der menschlichen H-Kette von NEW codieren, einem anderen Mitglied der Untergruppe 11 der V-Bereiche menschlicher H-Ketten, wurden als Ausgangssubstanzen für die Konstruktion eines neugeformten menschlichen V-Bereichs einer H-Kette von PM-1 und als Basis für die Gestaltung des neugeformten menschlichen V-Bereichs der H-Kette von PM-1 eingesetzt.
Sechs Versionen eines neugeformten menschlichen V-Bereichs der H-Kette von PM-1 wurden entworfen. In allen sechs Versionen basierten die menschlichen FRs auf den NEW-FRs, die im neugeformten menschlichen CAMPATH-1H vorlagen (Riechmann et al., 1988), und die Maus-CDRs waren mit den CDRs im Maus-V-Bereich der H-Kette von PM-1 identisch. Sieben Aminosäurereste in den menschlichen FRs (Positionen 1, 27, 28, 29, 30, 48 und 71, vgl. Tabelle 3) wurden identifiziert, die möglicherweise einen ungünstigen Einfluß auf die Antigenbindung haben könnten. Im Modell der Maus-V-Bereiche von PM-1 ist der Rest 1 im V-Bereich der H-Kette ein Oberflächenrest, der nahe bei den CDR-Schleifen liegt. Die Reste 27, 28, 29 und 30 sind entweder Teil der kanonischen Struktur für CDR1 des V-Bereichs der H- Kette, wie von ·C. Chothia et al., Nature 34 (1989), 877-883, vorausgesagt, und/oder es läßt sich im Modell der Maus-V-Bereiche von PM-1 feststellen, daß sie einen Teil der ersten strukturellen Schleife des V-Bereichs der H-Kette bilden (Chothia, 1987). Aus dem Modell der Maus-V-Bereiche von PM-1 wurde ersehen, daß der Rest 48 ein eingegrabener ("buried") Rest war. Veränderungen solcher eingegrabenen Reste können die Gesamtstruktur des V-Bereichs und seine Antigenbindungsstelle zerstören. Der Rest 71 ist Teil der kanonischen Struktur von CDR2 des V-Bereichs der H-Kette, wie von Chothia et al., 1989, vorausgesagt. Die sechs Versionen des neugeformten menschlichen PM-1-Antikörpers enthalten unterschiedliche Kombinationen der Aminosäureänderungen an diesen sieben Positionen in den menschlichen NEW-FRs (vgl. Tabelle 3). Tabelle 3 Gestaltung von sechs verschiedenen Versionen des neugeformten menschlichen V-Bereichs der H-Kette von PM-1 Tabelle
Anm.: Für NEW sind diejenigen FRs angegebenen, die in der ersten Version des neugeformten menschlichen CAM- PATH-1H-Antikörpers vorliegen (Riechmann et al., 1988).

Konstruktion von neugeformten menschlichen V-Bereichen von PM-1

Die ersten Versionen der neugeformten menschlichen V-Bereiche der L- und H-Kette von PM-1 wurden jeweils unter Einsatz eines neuen, auf PCR-basierenden Verfahrens konstruiert. Im wesentlichen wurde eine Plasmid-DNA, die einen neugeformten menschlichen V-Bereich codiert, der bereits geeignete menschliche FRs enthielt, unter Verwendung von PCR-Primern modifiziert, wodurch die CDRs, die in dem als Ausgangssubstanz verwendeten neugeformten menschlichen V-Bereich vorlagen, durch die CDRs aus dem Maus-PM-1-Antikörper ersetzt wurden. Die Ausgangssubstanz für die Konstruktion des neugeformten menschlichen V-Bereichs der L-Kette von PM-1 war eine Plasmid-DNA, die den neugeformten menschlichen V-Bereich der D1.3-L-Kette enthielt. Der neugeformte menschliche V-Bereich der D1.3-L-Kette wurde aufgrund der FRs konstruiert, die im menschlichen V-Bereich der REI-L-Kette vorliegen. Die Ausgangsverbindung für die Konstruktion des neugeformten menschlichen V-Bereichs der H-Kette von PM-1 war eine Plasmid-DNA, die den neugeformten menschlichen V-Bereich der D1.3-H-Kette enthielt. Der neuge formte menschliche V-Bereich der D1.3-H-Kette wurde aufgrund der FRs konstruiert, die im menschlichen V-Bereich der H-Kette von NEW vorliegen (M. Verhoeyen et al., Science 239 (1988), 1534-1536).
Sobald die als Ausgangsverbindungen eingesetzten Plasmid- DNAs, die die gewünschten menschlichen FRs enthielten, ausgewählt waren, wurden PCR-Primer so gestaltet, daß eine Substitution der Maus-PM-1-CDRs anstelle der Maus-D1.3-CDRs möglich war. Für jeden neugeformten menschlichen V-Bereich von PM-1 wurden drei Primer, die DNA-Sequenzen enthalten, welche die CDRs von Maus-PM-1 codieren, und zwei Primer, welche die gesamte, den neugeformten menschlichen V-Bereich codierende DNA- Sequenz flankieren, entworfen und synthetisiert. Durch Verwendung der fünf PCR-Primer in einer Serie von PCR-Reaktionen wurde ein PCR-Produkt erhalten, das aus den menschlichen FRs, die in dem als Ausgangssubstanz eingesetzten neugeformten menschlichen V-Bereich vorlagen, und aus den CDRs bestand, die im Maus-PM-1-V-Bereich vorlagen (vgl. Beispiel 7 und die Fig. 7 und 8). Die PCR-Produkte wurden cloniert und sequenziert, um sicherzustellen, daß die gesamte DNA-Sequenz der Version "a" des neugeformten menschlichen V-Bereichs der L- und der H-Kette von PM-1 die korrekte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 55) codiert.
Die restlichen Versionen der neugeformten menschlichen V- Bereiche von PM-1 wurden konstruiert, indem die veröffentlichten PCR-Mutagenesetechniken (Kamman et al., 1989) etwas modifiziert wurden. Wie für die Gestaltung der neugeformten menschlichen V-Bereiche von PM-1 beschrieben, wurden eine weitere Version (Version "b") des neugeformten menschlichen V-Bereichs der L-Kette von PM-1 und fünf weitere Versionen (Versionen "b", "c", "d", "e" und "f") des neugeformten menschlichen V-Bereichs der H-Kette von PM-1 konstruiert. Diese zusätzlichen Versionen unterscheiden sich von den ersten Versionen durch eine Reihe kleinerer Änderungen. Diese kleineren Änderungen in den Aminosäuresequenzen wurden durch PCR-Mutagenese erreicht, wodurch kleinere Änderungen in die DNA-Sequenzen eingebracht wurden. PCR-Primer wurden so gestaltet, daß sie erforderlichen Änderungen in die DNA-Sequenz einführen konn ten. Nach einer Reihe von PCR-Reaktionen wurde ein PCR-Produkt cloniert und sequenziert, um sicherzustellen, daß die Änderungen der DNA-Sequenz wie geplant erfolgt waren. Die Sequenz des neugeformten menschlichen V-Bereichs Version "f" der H-Kette des PM-1-Antikörpers ist in SEQ ID NO: 54 dargestellt.
Sobald die DNA-Sequenzen der verschiedenen Versionen der neugeformten menschlichen V-Bereiche voh PM-1 durch Sequenzierung bestätigt waren, wurden die neugeformten menschlichen V- Bereiche von PM-1 in Expressionsvektoren für Säugerzellen subcloniert, die bereits menschliche C-Bereiche enthielten. Neugeformte menschliche V-Bereiche der L-Kette von PM-1 wurden mit DNA-Sequenzen gekoppelt, die den menschlichen κ-C-Bereich codierten. Neugeformte menschliche V-Bereiche der H-Kette von PM-1 wurden mit DNA-Sequenzen gekoppelt, die den menschlichen γ-1-C-Bereich codierten. Um eine höhere Expressionsrate der neugeformten menschlichen PM-1-Antikörper zu erreichen, wurden die HCMV-Expressionvektoren, wie in Fig. 1 gezeigt, so modifiziert, daß der HCMV-Promotor/Enhancer-Bereich durch den Promotor/Enhancer-Bereich des menschlichen Elongationsfaktors (HEF-1a) ersetzt wurde (vgl. Fig. 15).
Als nächstes wurden alle Kombinationen aus den neugeformten menschlichen L-Kette-Versionen (a) und (b) mit den V-Bereichen der Versionen (a) bis (f) der H-Kette auf eine Bindung an den menschlichen IL-6R getestet, wobei das Ergebnis erhalten wurde, daß ein neugeformter menschlicher Antikörper, der die L-Kette Version (a) und die H-Kette Version (f) umfaßte, eine Fähigkeit zur Bindung an den IL-6R zeigte, die in der gleichen Größenordnung lag wie die des chimären PM-1 (a) (Fig. 13) , wie in Beispiel 11 genau beschrieben.

Modifikationen der DNA-Seauenzen, welche die neucLeformten menschlichen V-Bereiche von PM-1 codieren, zur Verbesserung der Expressionsrate

Wenn man sich die Menge der in COS-Zellen produzierten neugeformten menschlichen PM-1-Antikörper ansah, wurde deutlich, daß die Expressionsrate der neugeformten menschlichen H- Ketten immer etwa um das 10-fache niedriger war als die der neugeformten menschlichen L-Ketten oder der chimären L- oder H-Ketten. Es sah so aus, als gäbe es in der DNA, die den neu geformten menschlichen V-Bereich der H-Kette codiert, ein Problem, das die geringe Expressionsrate zur Folge hat. Um festzustellen, ob die niedrigere Proteinexpressionsrate das Ergebnis einer geringeren Transkriptionsrate war, wurde RNA aus COS-Zellen hergestellt, die mit Vektoren co-transfiziert waren, die neugeformte menschliche L- und H-Ketten von PM-1 exprimierten. Der erste Strang der cDNA wurde synthetisiert, wie bei der PCR-Clonierung der Maus-V-Bereiche von PM-1 beschrieben. Unter Verwendung von PCR-Primern, die so gestaltet wurden, daß sie die Enden der DNA flankieren, welche die neugeformten menschlichen V-Bereiche der L- oder der H-Kette codiert, wurden aus den cDNAs PCR-Produkte erzeugt, die dem neugeformten menschlichen V-Bereich der L-Kette oder dem neugeformten menschlichen V-Bereich der H-Kette entsprechen.
Für den neugeformten menschlichen V-Bereich der L-Kette gab es zwei PCR-Produkte, eines war 408 bp lang, wie erwartet, und ein kürzeres PCR-Produkt war 299 bp lang. Das PCR-Produkt mit der korrekten Größe machte etwa 90% der gesamten Ausbeute des PCR-Produktes aus, und das kürzere PCR-Produkt machte etwa 10% der gesamten Ausbeute aus. Für den neugeformten menschlichen V-Bereich der H-Kette gab es auch zwei PCR- Produkte, eines war 444 bp lang, wie erwartet, und ein kürzeres PCR-Produkt war 370 bp lang. In diesem Fall machte jedoch das falsche, kürzere PCR-Produkt den größten Teil der Gesamtausbeute des PCR-Produktes, etwa 90%, aus. Das PCR-Produkt mit der korrekten Größe machte lediglich etwa 10% der gesamten Ausbeute des PCR-Produktes aus. Diese Ergebnisse zeigten, daß einige der RNAs, welche die neugeformten menschlichen V-Bereiche codierten, Deletionen enthielten.
Um bestimmen zu können, welche Sequenzen deletiert waren, wurden die kürzeren PCR-Produkte cloniert und sequenziert. Aus den DNA-Sequenzen ging klar hervor, daß sowohl spezifische DNA-Abschnitte der V-Bereiche der L- als auch der H-Kette deletiert waren. Die Untersuchung der die deletierten Sequenzen flankierenden DNA-Sequenzen ergab, daß diese Sequenzen den Consensus-Sequenzen für Spleiß-Donor-Akzeptor-Sequenzen entsprachen (Breathnach, R., et al., Ann. Rev. Biochem. 50 (1981), 349-383). Die Erklärung für die niedrige Expressions rate der neugeformten menschlichen H-Ketten bestand darin, daß bei der Gestaltung der neugeformten menschlichen V-Bereiche der H-Kette unbeabsichtigt ein ziemlich effizienter Satz an Spleiß-Donor-Akzeptor-Stellen geschaffen worden war. Außerdem wurde deutlich, daß bei der Gestaltung der neugeformten menschlichen V-Bereiche der L-Kette unbeabsichtigt ein ziemlich ineffizienter Satz an Spleiß-Donor-Akzeptor-Stellen geschaffen worden war. Um die Spleiß-Donor-Akzeptor-Stellen zu entfernen, wurden kleinere Modifikationen in die DNA-Sequenzen eingeführt, die die Versionen "a" bzw. "f" der neugeformten menschlichen V-Bereiche der L- und der H-Kette von PM-1 codierten, wobei PCR-Mutagenese-Verfahren eingesetzt wurden, wie vorstehend beschrieben.
Eine weitere mögliche Ursache für die reduzierte Expressionsrate könnte das Vorliegen von Introns in den Leader-Sequenzen in den neugeformten menschlichen V-Bereichen von sowohl der L- und auch der H-Kette sein (SEQ ID NO: 54 und 55). Diese Introns stammten ursprünglich von einer Leader-Sequenz einer Maus mu-H-Kette (M. S. Neuberger et al., Nature 314 (1985), 268-270), die bei der Konstruktion des D1.3 und der neugeformten menschlichen V-Bereiche eingesetzt wurde (Verhoeyen et al., 1988). Da der neugeformte menschliche D1.3 in einem Säugerzellvektor exprimiert wurde, der einen Maus-Immunglobulin-Promotor einsetzte, war das Vorliegen des Maus-Leader-Introns wichtig. Das Leader-Intron enthält Sequenzen, die für die Expression von Immunglobulin-Promotoren aus wichtig sind, nicht jedoch für die von viralen Promotoren aus, wie HCMV (M. S. Neuberger et al., Nucl. Acids Res. 16 (1988), 6713-6724). Wenn die neugeformten menschlichen L- und H-Ketten von PM-1 in Vektoren exprimiert wurden, die Nicht-Immunglobulin-Promotoren einsetzen, wurden die Introns in den Leader-Sequenzen durch PCR-Clonierung der cDNAs, welche die neugeformten menschlichen V-Bereiche codierten, deletiert (vgl. Beispiel 12).
Eine weitere mögliche Ursache für die reduzierte Expressionsrate könnte das Vorliegen eines Abschnittes von etwa 190 bp einer nicht-funktionellen DNA innerhalb des Introns zwischen dem neugeformten menschlichen V-Bereich der PM-1-H- Kette und dem menschlichen γ-1-C-Bereich sein. Der neugeformte menschliche V-Bereich der PM-1-H-Kette wurde aus DNA-Sequenzen konstruiert, die ursprünglich von einem neugeformten menschlichen V-Bereich einer B1-8-H-Kette stammten (P. T. Jones et al., Nature 321 (1986), 522-525). Dieser erste neugeformte menschliche V-Bereich wurde aus dem V-Bereich einer Maus-NP-H- Kette konstruiert (M: S. Neuberger et al., Nature (1985); M. S. Neuberger et al., EMBO J. 2 (1983), 1373-1378). Dieser Abschnitt von etwa 190 bp, der im Intron zwischen dem neugeformten menschlichen V-Bereich der H-Kette und der BamHI- Stelle zur Kopplung der neugeformten menschlichen V-Bereiche mit dem Expressionsvektor vorlag, wurde während der PCR- Clonierung der die neugeformten menschlichen V-Bereiche codierenden cDNAs entfernt.
Die DNA- und Aminosäuresequenzen der endgültigen Versionen der neugeformten menschlichen V-Bereiche der L- und der H- Kette von PM-1, die zur Verbesserung der Expressionsrate verändert wurden, sind in SEQ ID NO: 57 und 56 dargestellt. Diese DNA-Sequenzen codieren die Version "a" des neugeformten menschlichen V-Bereichs der L-Kette von PM-1, wie in Tabelle 2 dargestellt, und die Version "f" des neugeformten menschlichen V-Bereichs der H-Kette von PM-1, wie in Tabelle 3 dargestellt. Nach Insertion in die HEF-1a-Expressionsvektoren (Fig. 15) erzeugen diese Vektoren in den transfizierten COS-Zellen transient etwa 2 ug/ml Antikörper. Um eine stabile Produktion von größeren Mengen des neugeformten menschlichen PM-1-Antikörpers zu erreichen, wurde ein neuer das dhfr-Gen enthaltender HEF-1α-Expressionsvektor konstruiert (vgl. Beispiel 10, Fig. 11) Das "verkrüppelte" dhfr-Gen wurde in den HEF-1α-Vektor eingeführt, der menschliche γ-1-H-Ketten exprimiert, wie für den HCMV-Vektor beschrieben, der menschliche γ-1-H-Ketten exprimiert. Der HEF-1α-Vektor, der neugeformte menschliche PM- 1-L-Ketten exprimiert, und der HEF-1α-dhfr-Vektor, der neugeformte menschliche PM-1-H-Ketten exprimiert, wurden in CHOdhfr(-)-Zellen co-transfiziert. Stabil transformierte CHO- Zellinien wurden in essentiellem Alpha-Minimalmedium (α-MEM) ohne Nucleoside und mit 10% FCS und 500 gg/ml G418 selektiert. Noch bevor Schritte zur Genamplifikation erfolgten, wurden CHO-Zellinien festgestellt, die bis zu 10 ug/106 Zellen/Tag des neugeformten menschlichen PM-1-Antikörpers produzierten.

Vergleich von V-Bereichen des monoclonalen Maus-Antikörpers AUK 12-20 mit V-Bereichen von bekannten menschlichen Antikörpern

Die Homologie von FRs des V-Bereichs der K-L-Kette des monoclonalen Maus-Antikörpers AUK 12-20 mit FRs der Untergruppen (HSG) I bis IV des V-Bereichs der menschlichen K-L- Kette und die Homologie von FRs des V-Bereichs der H-Kette des monoclonalen Maus-Antikörpers AUK 12-20 mit FRs der Untergruppen (HSG) T bis III des V-Bereichs der menschlichen H-Kette sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4 Prozentuale Identität zwischen den FRs aus den V-Bereichen von Maus-AUK 12-20 und den FRs aus der Consensus-Sequenz für die verschiedenen Untergruppen menschlicher V- Bereiche FRs in den V-Bereichen der L-Kette FRs in den V-Bereichen der H-Kette
Wie aus Tabelle 4 ersichtlich ist, ist der V-Bereich der κ-L-Kette des monoclonalen Maus-Antikörpers AUK 12-20 in einem ähnlichen Ausmaß (64 bis 68%) mit den Untergruppen (HSG) I bis IV des V-Bereichs der menschlichen κ-L-Kette homolog. Bei einer Suche in der Datenbank "LEEDS" für Protein zeigt der V- Bereich der L-Kette des menschlichen Antikörpers LEN (M. Schneider et al., Physiol. Chem. 366 (1975), 507-557), der zur HSGIV gehört, die höchste Homologie von 68%. Andererseits zeigt der menschliche Antikörper REI, der zur Konstruktion eines neugeformten menschlichen Antikörpers aus dem monoclonalen Maus-Antikörper PM-1 eingesetzt wird und zur HSG I gehört, eine Homologie von 62% mit dem V-Bereich der L-Kette des monoclonalen Maus-Antikörpers AUK 12-20. Außerdem entsprachen die CDRs im V-Bereich der L-Kette des Antikörpers AUK 12- 20, insbesondere CDR2, besser den kanonischen Strukturen der CDRs im REI als denen im LEN.
Unter Berücksichtigung der vorstehenden Ergebnisse ist es nicht erforderlich, den für die Humanisierung des V-Bereichs der L-Kette des monoclonalen Maus-Antikörpers AUK 12-20 verwendeten menschlichen Antikörper aus den Antikörpern auszuwählen, die zu HSGIV gehören. Deshalb werden, wie im Fall der Humanisierung des V-Bereichs der L-Kette des monoclonalen Maus- Antikörpers PM-1, für die Humanisierung des V-Bereichs der L- Kette des monoclonalen Maus-Antikörpers AUK 12-20 die FRs von REI eingesetzt.
Wie in Tabelle 4 dargestellt, zeigt der V-Bereich der H- Kette des Antikörpers AUK 12-20 die höchste Homologie mit HSGI. Außerdem weist bei einer Suche in der Datenbank "LEEDS" der menschliche Antikörper HAX (Stollar, B. O., et al., J. Immunol. 139 (1987), 2496-2501), der auch zu HSGI gehört, eine Homologie mit dem V-Bereich der H-Kette des Antikörpers AUK 12-20 von etwa 66% auf. Demgemäß werden für die Gestaltung eines neugeformten menschlichen V-Bereichs der H-Kette des Antikörpers AUK 12-20 die FRs des menschlichen Antikörpers HAX, gehörend zu HSGI, und die FRs des humanisierten V- Bereichs der H-Kette des Antikörpers 425, der FRs aufweist, die aus HSGI-Consensus-Sequenz bestehen (Ketteborough, C. A., et al., Protein Engineering 4 (1991), 773-783), eingesetzt. Zu beachten ist, daß der V-Bereich der H-Kette des Antikörpers AUK 12-20 eine Homologie von etwa 64% mit der Version "a" des humanisierten V-Bereichs der H-Kette des Antikörpers 425 zeigt.

Gestaltung von neucreformten menschlichen V-Bereichen der L-Kette des Antikörpers AUK 12-20

Aus den vorstehend angeführten Gründen werden neugeformte menschliche V-Bereiche der L-Kette des Antikörpers AUK 12-20 gestaltet, wie in Tabelle 5 dargestellt, wobei FRs des REI verwendet werden.
Anm.: Die fünf unterstrichenen Nucleotide sind diejenigen, die bei der Gestaltung des Antikörpers CAMPATH-1H verändert wurden (vgl. die Anmerkung von Tabelle 2).

Gestaltung von neugeformten menschlichen V-Bereichen der H-Kette des Antikörpers AUK 12-20

Aus dem vorstehend angeführten Grund werden neugeformte menschliche V-Bereiche der H-Kette des Antikörpers AUK 12-20 gestaltet, indem FRs des neugeformten menschlichen VHa 425 eingesetzt werden. Jedoch wurde gefunden, daß die Nucleotidsequenz der DNA, die den auf diese Weise gestalteten neugeformten menschlichen V-Bereich der H-Kette des Antikörpers AUK 12- 20 codiert, eine Sequenz aufweist, die mit einer Spleiß-Donor- Sequenz gut übereinstimmt. Deshalb, wie im Fall des neugeformten menschlichen PM-1-Antikörpers, besteht bei dem neugeformten menschlichen AUK 12-20-Antikörper die Möglichkeit eines abnormen Spleißens. Aus diesem Grund wurde die Nucleotidsequenz partiell modifiziert, um die Spleiß-Donor-artige Sequenz zu eliminieren. Die modifizierte Sequenz wird als Version "a" bezeichnet.
Außerdem wurden die Versionen "b" bis "d" des neugeformten menschlichen V-Bereichs der H-Kette des Antikörpers AUK 12-20 gestaltet. Die Aminosäuresequenzen der Versionen "a" bis "d" sind in Tabelle 6 dargestellt. Tabelle 6
Anm.: Die Position, an der ein herkömmlicher Aminosäurerest in den HSGI-VH-Bereichen (SGI) nicht identifiziert ist, ist mit "X" bezeichnet. Die zwei unterstrichenen Aminosäurereste sind von den Resten in der SGI-Consensus-Sequenz verschieden. Für RVHb, RVHc und RVHd sind nur Aminosäurereste dargestellt, die von den Resten von RVHa verschieden sind.
Darüberhinaus werden die Versionen "a" bis "d" des neugeformten menschlichen V-Bereichs der H-Kette des Antikörpers AUK 12-20 gestaltet, wie in Tabelle 7 gezeigt, wobei FRs des menschlichen Antikörpers HAX verwendet werden (J. Immunology 139 (1987), 2496-2501; ein Antikörper, der durch die Hybridomzellen 21/28 hergestellt wird, die aus B-Zellen eines SLE-Patienten stammen; seine Aminosäuresequenz ist in Fig. 6 dieser Veröffentlichung beschrieben, und die Nucleotidsequenz der für die Aminosäuresequenz codierenden DNA ist in den Fig. 4 und 6 dieser Veröffentlichung dargestellt.) Tabelle 7 Tabelle
Anm.: Die zwei unterstrichenen Reste in sle1220Ha stellen Änderungen zu den FRs von HAX dar. Für sle1220Hb, sle1220Hc und sle1220Hd sind nur die Aminosäuren in den FRs angegeben, die von den Resten in den HAX-FRs verschieden sind.
Für die Herstellung der vorliegenden chimären oder neugeformten menschlichen Antikörper gegen den menschlichen IL-6R kann ein beliebiges Expressionssystem verwendet werden, umfassend eukaryotische Zellen, z. B. tierische Zellen, wie z. B. eingeführte Säugerzellinien, Pilzzellen und Hefezellen, außerdem prokaryotische Zellen, z. B. Bakterienzellen, wie E. coli- Zellen. Vorzugsweise werden die vorliegenden chimären oder neugeformten menschlichen Antikörper in Säugerzellen, wie z. B. COS-Zellen oder CHO-Zellen, exprimiert.
In solchen Fällen kann ein herkömmlicher Promotor eingesetzt werden, der für die Expression in Säugerzellen geeignet ist. Z. B. wird vorzugsweise ein virales Expressionssystem, wie z. B. der sehr frühe Promotor des menschlichen Cytomegalovirus (HCMV), verwendet. Beispiele von Expressionsvektoren, die den HCMV-Promotor enthalten, umfassen HCMV-VH-HC-γ-1, HCMV-VL-HCκ, HCMV-12 h-g-γ-1, HCMV-12k-gk und dergleichen, hergeleitet von pSV2neo, wie in Fig. 1 dargestellt.
Eine weitere Ausführungsform eines Promotors, der in der vorliegenden Erfindung genutzt werden kann, ist der Promotor des menschlichen Elongationsfaktors 1α (HEF-1α).
Expressionsvektoren, die diesen Promotor enthalten, umfassen HEF-12 h-g-γ-1 und HEF-12 h-g-κ (Fig. 8 und 9), außerdem HEF- VH-g-γ-1 und HEF-VL-g-κ (Fig. 15).
Zur dhfr-Genamplifikation in einer Wirtszellinie kann ein Expressionsvektor ein dhfr-Gen enthalten. Expressionsvektoren, die das dhfr-Gen enthalten, sind z. B. DHFR-Δ-E-PMh-g-γ-1 (Fig. 10), DHFR-Δ-E-RVh-PM1-f (Fig. 11) und dergleichen.
Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die vorliegende Erfindung erstens einen V-Bereich einer L-Kette und einen V- Bereich einer H-Kette eines monoclonalen Maus-Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R bereitstellt, außerdem DNA, die den V-Bereich der L-Kette codiert, und DNA, die den V-Bereich der H-Kette codiert. Diese können für die Konstruktion eines chimären Mensch/Maus-Antikörpers und eines neugeformten menschlichen Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R genutzt werden. Die monoclonalen Antikörper sind z. B. AUK 12-20, PM-1, AUK64-7 und AUK146-15. Der V-Bereich der L-Kette hat eine Aminosäuresequenz, die z. B. in SEQ ID NO: 24, 26, 28 oder 30 dargestellt ist; und der V-Bereich der H-Kette besitzt eine Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 25, 27, 29 oder 31 wiedergegeben ist. Diese Aminosäuresequenzen werden durch Nucleotidsequenzen codiert, die z. B. in den SEQ ID NO: 24 bis 31 dargestellt sind. Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen chimären Antikörper gegen den menschlichen IL-6R, enthaltend:
(1) eine L-Kette, umfassend einen C-Bereich einer menschlichen L-Kette und einen V-Bereich einer Maus-L-Kette; und
(2) eine H-Kette, umfassend einen C-Bereich einer menschlichen H-Kette und einen V-Bereich einer Maus-H-Kette. Der V-Bereich der Maus-L-Kette und der V-Bereich der Maus-H- Kette und die sie codierende DNA werden vorstehend beschrieben. Der C-Bereich der menschlichen L-Kette kann ein beliebiger C-Bereich einer menschlichen L-Kette sein und ist z. B. ein menschlicher Cκ-Bereich. Der C-Bereich der menschlichen H- Kette kann eih beliebiger C-Bereich einer menschlichen H-Kette sein und ist z. B. ein menschlicher Cγ-1-Bereich.
Für die Herstellung des chimären Antikörpers werden zwei Expressionsvektoren konstruiert, d. h. einer, der eine DNA umfaßt, die einen V-Bereich einer Maus-L-Kette und einen C-Bereich einer menschlichen L-Kette unter der Kontrolle einer Expressionskontrollregion, wie z. B. eines Enhancer/Promotor-Systems, codiert, und ein anderer, der eine DNA umfaßt, die einen V-Bereich einer Maus-H-Kette und einen C-Bereich einer menschlichen H-Kette unter der Kontrolle einer Expressionskontrollregion, wie z. B. eines Enhancer/Promotor-Systems, codiert. Als nächstes werden die Expressionsvektoren in Wirtszellen, wie z. B. Säugerzellen, co-transfiziert und die transfizierten Zellen in vitro oder in vivo gezüchtet, so daß ein chimärer Antikörper erzeugt wird.
In einer anderen Ausführungsform werden eine DNA, die einen V-Bereich einer Maus-L-Kette und einen C-Bereich einer menschlichen L-Kette codiert, und eine DNA, die einen V-Bereich einer Maus-H-Kette und einen C-Bereich einer menschlichen H-Kette codiert, in nur einen Expressionsvektor eingeführt, und der Vektor wird zur Transfektion von Wirtszellen eingesetzt, die sodann in vivo oder in vitro gezüchtet werden, so daß ein gewünschter chimärer Antikörper produziert wird.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner einen neugeformten Antikörper gegen den menschlichen IL-6R bereit, umfassend:
(A) eine L-Kette, enthaltend
(1) einen C-Bereich einer menschlichen L-Kette und
(2) einen V-Bereich einer L-Kette, umfassend FRs einer menschlichen L-Kette und CDRs einer L-Kette eines monoclonalen Maus-Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R; und
(B) eine H-Kette, enthaltend
(1) einen C-Bereich einer menschlichen H-Kette und
(2) einen V-Bereich einer H-Kette, umfassend FRs einer menschlichen H-Kette und CDRs einer H-Kette eines monoclonalen Maus-Antikörpers gegen den IL-6R.
In einer bevorzugten Ausführungsform haben die CDRs der L-Kette Aminosäuresequenzen, die in den SEQ ID NO: 24, 26, 28 und 30 dargestellt sind, wobei die Abschnitte der Aminosäuresequenzen jeweils in Tabelle 9 definiert ist; die CDRs der L- Kette haben Aminosäuresequenzen, die in den SEQ ID NO: 25, 27, 29 und 31 dargestellt sind, wobei die Abchnitte der Aminosäuresequenzen jeweils in Tabelle 9 definiert ist; die FRs der menschliche L-Kette stammen vom REI; die FRs der menschlichen H-Kette stammen vom NEW oder vom HAX.
In der bevorzugten Ausführungsform hat der V-Bereich der L-Kette eine Aminosäuresequenz, die in Tabelle 2 als RVLa dargestellt ist; und der V-Bereich der H-Kette hat eine Aminosäuresequenz, die in Tabelle 3 als RVHa, RVHb, RVHc, RVHd, RVHe oder RVHf dargestellt ist. Die Aminosäuresequenz von RVHf ist am stärksten bevorzugt.
Für die Produktion des neugeformten menschlichen Antikörpers werden zwei Expressionsvektoren konstruiert, d. h. einer, der eine DNA umfaßt, welche die neugeformte L-Kette, wie vor stehend definiert, unter der Kontrolle einer Expressionskontrollregion, wie z. B. eines Enhancer/Promotor-Systems, codiert, und ein anderer, der eine DNA umfaßt, welche die neugeformte menschliche H-Kette, wie vorstehend definiert, unter der Kontrolle einer Expressionskontrollregion, wie z. B. eines Enhancer/Promotor-Systems, codiert. Als nächstes werden die Expressionsvektoren in Wirtszellen, wie z. B. Säugerzellen, cotransfiziert und die transfizierten Zellen in vitro oder in vivo gezüchtet, so daß ein neugeformter menschlicher Antikörper erzeugt wird.
In einer anderen Ausführungsform werden eine DNA, welche die neugeformte menschliche L-Kette codiert, und eine DNA, welche die neugeformte H-Kette codiert, in nur einen Expressionsvektor eingeführt, und der Vektor wird zur Transfektion von Wirtszellen verwendet, die sodann in vivo oder in vitro gezüchtet werden, so daß ein gewünschter neugeformter menschlicher Antikörper erzeugt wird.
Ein auf diese Weise hergestellter chimärer Antikörper oder neugeformter menschlicher Antikörper kann isoliert und gereinigt werden, wobei herkömmliche Verfahren eingesetzt werden, wie z. B. eine Protein A-Affinitäts-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie, Gel-Filtration und dergleichen.
Die vorliegende chimäre L-Kette oder die vorliegende neugeformte menschliche L-Kette kann mit einer H-Kette kombiniert werden, wodurch ein ganzer Antikörper konstruiert wird. Genauso kann die vorliegende chimäre H-Kette oder die vorliegende neugeformte menschliche H-Kette mit einer L-Kette kombiniert werden, wodurch ein ganzer Antikörper konstruiert wird.
Der vorliegende V-Bereich der Maus-L-Kette, der vorliegende neugeformte menschliche V-Bereich der L-Kette, der vorliegende V-Bereich der Maus-H-Kette und der vorliegende neugeformte menschliche V-Bereich der H-Kette sind von sich aus jeweils ein Bereich, der an ein Antigen, d. h. an den menschlichen IL-6R, bindet, und deshalb kann man davon ausgehen, daß sie als solches oder als ein mit einem anderen Protein fusioniertes Protein für die Herstellung von Arzneimitteln oder von diagnostischen Mitteln genutzt werden können.
Darüber hinaus sind die vorliegenden CDRs des V-Bereichs der L-Kette und CDRs des V-Bereichs der H-Kette von sich aus Bereiche, die an ein Antigen, d. h. an den menschlichen IL-6R, binden, und deshalb kann man davon ausgehen, daß sie als solches oder als ein mit einem anderen Protein fusioniertes Protein für die Herstellung von Arzneimitteln oder von diagnostischen Mitteln genutzt werden können.
DNA, die einen erfindungsgemäßen V-Bereich einer Maus-L- Kette codiert, kann für die Konstruktion einer DNA, die eine chimäre L-Kette codiert, oder einer DNA, die eine neugeformte menschliche L-Kette codiert, eingesetzt werden.
Genauso kann eine DNA, die einen erfindungsgemäßen V-Bereich einer Maus-H-Kette codiert, für die Konstruktion einer DNA, die eine chimäre H-Kette codiert, und einer DNA, die eine neugeformte menschliche H-Kette codiert, eingesetzt werden. Außerdem kann eine DNA, die erfindungsgemäße CDRs eines V-Bereichs einer L-Kette codiert, für die Konstruktion einer DNA, die einen neugeformten menschlichen V-Bereich einer L-Kette codiert, und einer DNA, die eine neugeformte menschliche L- Kette codiert, eingesetzt werden. Genauso kann eine DNA, die erfindungsgemäße CDRs eines V-Bereichs einer H-Kette codiert, für die Konstruktion einer DNA, die einen neugeformten menschlichen V-Bereich einer H-Kette codiert, und einer DNA, die eine neugeformte menschliche H-Kette codiert, verwendet werden.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird in den nachstehenden Beispielen erläutert, soll jedoch darauf nicht beschränkt werden.

Beispiel 1 Clonierung der DNA, die den V-Bereich des monoclonalen Maus-Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R codiert (1)

Eine DNA, die den V-Bereich eines monoclonalen Maus-Antikörpers gegen einen menschlichen IL-6R codiert, wurde wie folgt cloniert.

1. Herstellung der Gesamt-RNA

Die Gesamt-RNA aus dem Hybridom AUK12-20 wurde gemäß einem Verfahren hergestellt, das von Chirgwin et al., Biochemistry 18 (1979), 5294, beschrieben wird. Hierfür wurden 2,1 · 10&sup8; Zellen des Hybridoms AUK12-20 in 20 ml 4 M Guanidinthiocyanat (Fluka) vollständig homogenisiert. Das Homogenisat wurde über eine Schicht einer 5,3 M Cäsiumchloridlösung in einem Zentrifugenröhrchen geschichtet, das sodann in einem Beckman SW40-Rotor bei 31 000 Upm und bei 20ºC 24 Stunden zentrifugiert wurde, um die RNA abzutrennen. Der RNA-Niederschlag wurde mit 80% Ethanol gewaschen und in 150 ul von 10 mM Tris- HCl (pH 7,5), enthaltend 1 mM EDTA und 0,5% SDS, gelöst, sodann wurde Protenase (Boehringer) zu 0,5 mg/ml zugegeben und das Ganze 20 Minuten bei 37ºC inkubiert. Das Gemisch wurde mit Phenol und Chloroform extrahiert und die RNA mit Ethanol gefällt. Als nächstes wurde der RNA-Niederschlag in 200 ul 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), enthaltend 1 mM EDTA, gelöst.

2. Synthese der einzelsträngigern cDNA

Zur Synthese der einzelsträngigen cDNA gemäß dem von J. W. Larrick et al., Bio/Technology 7 (1989), 934, dargestellten Verfahren wurden etwa 5 ug der wie vorstehend beschrieben hergestellten Gesamt-RNA in 10 ul 50 mM Tris-HCl (pH 8,3)-Pufferlösung gelöst, die 40 mM KCl, 6 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreit, 0,5 mM dATP, 0,5 mM dGTP, 0,5 mM dCTP, 0,5 mM dTTP, 35 gM Oligo-dT-Primer (Amersham), 48 Einheiten RAV-2-reverse Transkriptase (RAV-2: Rous-assoziiertes Virus 2; Amersham) und 25 Einheiten Ribonuclease-Inhibitor der menschlichen Plazenta (Amersham) enthielt, und das Reaktionsgemisch wurde 60 Minuten bei 37ºC inkubiert und direkt für das anschließende Verfahren der Polymerase chain reaction (PCR) eingesetzt.

3. Amplifikation der cDNA, die den V-Bereich des Antikörpers codiert, durch das PCR-Verfahren

Das PCR-Verfahren erfolgte unter Verwendung eines Thermal-Cycler, Modell PHC-2 (Techne).

(1) Amplifikation der cDNA die den variablen Bereich der κ-leichten (κ-L-)Kette der Maus codiert

Die Primer, die für das PCR-Verfahren verwendet wurden, waren MKV (Maus Kappa variabel)-Primer, die in SEQ ID NO: 1 bis 11 dargestellt sind, die mit einer Leader-Sequenz der κ-L- Kette der Maus hybridisieren (S. T. Jones et al., Bio/Technology ·9 (1991), 88), und ein MKC (Maus Kappa konstant)-Primer, der in SEQ ID NO: 12 dargestellt ist und der mit einem C-Bereich der κ-L-Kette der Maus hybridisiert (S. T. Jones et al., Bio/Technology 9 (1991), 88).
Zuerst wurden 100 ul einer PCR-Lösung, die 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 0,1 mM dATP, 0,1 mM dGTP, 0,1 mM dCTP, 0,1 mM dTTP, 1,5 mM MgCl, 2,5 Einheiten DNA-Polymerase Ampli Taq (Perkin Eimer Cetus), 0,25 uM von jeder Gruppe der MKV- Primer und 3 uM des MKC-Primers und 1 ul des Reaktionsgemisches der einzelsträngigen cDNA-Synthese enthielt, anfangs 1,5 Minuten auf eine Temperatur von 94ºC und danach eine Minute auf 94ºC, eine Minute auf 50ºC und eine Minute auf 72ºC in dieser Reihenfolge erhitzt. Nachdem dieser Temperaturzyklus 25-mal wiederholt worden war, wurde das Reaktionsgemisch weitere zehn Minuten bei 72ºC inkubiert.

(2) Amplifikation der cDNA, die den V-Bereich der Maus-H-Kette codiert

Als Primer für die PCR wurden die MHV (Maus schwer variabel)-Primer 1 bis 10, dargestellt in SEQ ID NO: 13 bis 22 (S. T. Jones et al., Bio/Technology 9 (1991), 88), und ein MHC (Maus schwer konstant)-Primer, der in SEQ ID NO: 23 dargestellt ist (S. T. Jones et al., Bio/Technology 9 (1991), 88), eingesetzt. Die Amplifikation erfolgte gemäß dem gleichen Verfahren, wie die Amplifikation des Gens des V-Bereichs der K-L- Kette, die im Abschnitt 3. (1) beschrieben wird.

4. Reinigung und Spaltung des PCR-Produktes

Die wie vorstehend beschrieben durch die PCR amplifizierten DNA-Fragmente wurden gereinigt, wobei ein QIAGEN PCR-Product-Reinigungskit (QIAGEN Inc., US) eingesetzt wurde, und mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms Sall (GIBCO BRL) in 100 mM Tris-HCl (pH 7,6), enthaltend 10 mM MgCl&sub2; und 150 mM NaCl, drei Stunden bei 37ºC gespalten. Das Spaltungsgemisch wurde mit Phenol und Chloroform extrahiert und die DNA durch Ethanolfällung gewonnen. Als nächstes wurde der DNA-Niederschlag mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms XmaI (New England Biolabs) zwei Stunden bei 37ºC gespalten, und die resultierenden DNA-Fragmente wurden durch Agarose-Gel-Elektrophorese unter Verwendung von bei niedriger Temperatur schmelzender Agarose (FMC Bio Products USA) aufgetrennt.
Ein Agarosestückchen, das DNA-Fragmente mit einer Länge von etwa 450 bp enthielt, wurde ausgeschnitten und fünf Minuten bei 65ºC geschmolzen, dazu wurde ein gleiches Volumen von 20 mlvi Tris-HCl (pH 7,5) gegeben, das 2 mM EDTA und 200 mM NaCl enthielt. Das Gemisch wurde mit Phenol und Chloroform extrahiert und das DNA-Fragment durch Ethanolfällung gewonnen und sodann in 10 ul 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), enthaltend 1 mM EDTA, gelöst. Auf diese Weise wurden ein DNA-Fragment, umfassend ein Gen, das einen V-Bereich einer κ-L-Kette der Maus codiert, und ein DNA-Fragment, umfassend ein Gen, das einen V-Bereich einer H-Kette der Maus codiert, erhalten. Die beiden vorstehenden DNA-Fragmente wiesen an ihrem 5-Ende ein klebriges SalI-Ende und an ihrem 3'-Ende ein klebriges XmaI-Ende auf.

5. Ligierung und Transformation

Etwa 0,3 ug des SalI-XmaI-DNA-Fragments, umfassend ein Gen, das einen V-Bereich einer tc-L-Kette der Maus codiert, hergestellt wie vorstehend beschrieben, wurden mit etwa 0,1 ug eines pUC&sub1;&sub9;-Vektors, der durch die Spaltung des Plasmids pUC19 mit SalI und XmaI hergestellt worden war, in einem Reaktionsgemisch, umfassend 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreit, 1 mM Spermidin, 1 mM dATP, 0,1 ug/ml Rinderserumalbumin und 2 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs), 16 Stunden bei 16ºC ligiert.
Anschließend wurden 7 ul des vorstehenden Ligierungsgemisches zu 200 ul von kompetenten Zellen von E. coli DHSa zugegeben und die Zellen 30 Minuten auf Eis, eine Minute bei 42ºC und wieder eine Minute auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 800 ul SOC-Medium (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) wurde die Zellsuspension eine Stunde bei 37ºC inkubiert und auf eine 2xYT-Agarplatte geimpft (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), die sodann über Nacht bei 37ºC inkubiert wurde, wodurch eine E. coli-Transformante erhalten wurde. Die Transformante wurde in 5 ml 2xYT-Medium, das 50 ug/ml Ampicillin enthielt, über Nacht bei 37ºC gezüchtet und eine Plasmid-DNA aus der Kultur gemäß einem alkalischen Verfahren hergestellt (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Das auf diese Weise erhaltene Plasmid, das ein Gen enthält, welches einen V-Bereich einer κ-L-Kette der Maus codiert, hergeleitet vom Hybridom AUK12-20, wurde mit p12-k2 bezeichnet.
Gemäß dem gleichen Verfahren, wie vorstehend beschrieben, wurde aus dem SalI-XmaI-DNA-Fragment ein Plasmid konstruiert, das ein Gen enthält, welches einen V-Bereich einer Maus-H- Kette codiert, hergeleitet vom Hybridom AUK12-20, und es wurde mit p12-h2 bezeichnet.

Beispiel 2 Clonierung der DNA, die einen V-Bereich eines monoclonalen Maus-Antikörpers codiert (2)

Im wesentlichen wurde das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 1 beschrieben, auf die Hybridome PM1, AUK64-7 und AUK146-15 angewendet, wodurch die folgenden Plasmide erhalten wurden:
ein Plasmid pPM-k3, das ein Gen enthält, das einen V-Bereich einer κ-L-Kette codiert, hergeleitet aus dem Hybridom PM1;
ein Plasmid pPM-h1, das ein Gen enthält, das einen V-Bereich einer H-Kette codiert, hergeleitet aus dem Hybridom PM1;
ein Plasmid p64-k4, das ein Gen enthält, das einen V-Bereich einer κ-L-Kette codiert, hergeleitet aus dem Hybridom AUK64-7;
ein Plasmid p64-h2, das ein Gen enthält, das einen V-Bereich einer H-Kette codiert, hergeleitet aus dem Hybridom AUK64-7;
ein Plasmid p146-k3, das ein Gen enthält, das einen V-Bereich einer κ-L-Kette codiert, hergeleitet aus dem Hybridom AUK146-15; und
ein Plasmid p146-h1, das ein Gen enthält, das einen V-Bereich einer H-Kette codiert, hergeleitet aus dem Hybridom AUK146-15;
Zu beachten ist, daß die E. coli-Stämme, die die vorstehend erwähnten Plasmide enthalten, bei der "National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited" unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags am 11. Februar 1991 hinterlegt wurden und die in Tabelle 8 angegebenen Hinterlegungsnummern erhielten. Tabelle 8

Beispiel 3 Sequenzierung der DNA

Die Nucleotidsequenzen eines codierenden Bereichs der cDNA in den vorstehend erwähnten Plasmiden wurden bestimmt, indem das Kit SequenaseTM, Version 2,0 (U. S. Biochemical Corp. USA), verwendet wurde.
Zuerst wurden etwa 3 ug Plasmid-DNA, die wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, mit 0,2 N NaOH denaturiert, mit einem Sequenzier-Primer aneliert und mit 355-dATP markiert, wie in der Vorschrift des Herstellers angegeben. Als nächstes wurde die markierte DNA auf ein 6% Polyacrylamid-Gel aufgetragen, das 8 M Harnstoff enthielt, und das Gel nach der Elektrophorese mit 10% Methanol und 10% Essigsäure fixiert, getrocknet und einer Autoradiographie unterworfen, um die Nucleotidsequenz festzustellen.
Die Nucleotidsequenz des codierenden Bereichs der cDNA in jedem Plasmid ist in den SEQ ID NO: 24 bis 31 dargestellt.

Beispiel 4 Bestimmung von CDRs

Die allgemeinen Strukturen der V-Bereiche der L-Kette und der H-Kette sind sich ähnlich, wobei vier Gerüstbereiche (FRs) über drei supervariable Bereiche, d. h. komplementaritätsbestimmende Bereiche (CDRs), gekoppelt sind. Während die Aminosäuresequenzen in den FRs relativ gut konserviert sind, sind die Aminosäuresequenzen in den CDRs sehr hoch-variabel (Kabat, E. A., et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1983).
Aufgrund der vorstehend bestimmten Aminosäuresequenzen der V-Bereiche der monoclonalen Maus-Antikörper gegen den menschlichen IL-6R und gemäß Kabat, E. A., et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1983, wurden die CDRs von jedem V-Bereich der monoclonalen Maus-Antikörper gegen den menschlichen IL-6R bestimmt, wie in Tabelle 9 dargestellt. Tabelle 9

Beispiel 5 Bestätigung der Expression der clonierten cDNA (1) (Konstruktion des chimären AUK 12-20-Antikörpers)

Konstruktion des Expressionsplasmids

Ein chimäres L-Kette/H-Kette-Produkt wurde aus den PCR- clonierten cDNAs konstruiert, die V-Bereiche der K-L-Kette und der H-Kette von AUK 12-20 codieren. Um die Kopplung einer cDNA, die den V-Bereich des Maus-AUK 12-20 codiert, an eine DNA, die einen menschlichen C-Bereich codiert, in einem Säugerexpressionsvektor, der einen Enhancer und einen Promotor eines menschlichen Cytomegalovirus (HCMV)-Expressionsvektors enthält, zu erleichtern, müssen an den 5'- und 3'-Enden der Maus-cDNA passende Restriktionsenzym-Spaltstellen eingeführt werden.
Diese Modifikation der 5'- und der 3'-Enden erfolgte durch das PCR-Verfahren. Zwei Sets von Primern wurden entworfen und synthetisiert. Ein Rückwärts-Primer für den V-Bereich der L-Kette (SEQ ID NO: 32) und ein Rückwärts-Primer für den V-Bereich der H-Kette (SEQ ID NO: 33) wurden so gestaltet, daß die Primer mit einer DNA hybridisieren, die den Beginn der Leader-Sequenz codiert, eine DNA-Sequenz beibehalten, die für eine effiziente Translation essentiell ist (Kozak, M., J. Mol. Biol. 196 (1987), 947-950), und eine Hindlil-Stelle für die Clonierung in den HCMV-Expressionsvektor erzeugen. Ein Vorwärts-Primer des V-Bereichs der L-Kette (SEQ ID NO: 34) und ein Vorwärts-Primer des V-Bereichs der H-Kette (SEQ ID NO: 35) wurden so entworfen, daß die Primer mit einer DNA hybridisieren, die den terminalen Teil des J-Bereichs codiert, eine DNA- Sequenz beibehalten, die für das Spleißen im C-Bereich essentiell ist, und eine BamHI-Stelle für die Kopplung an den menschlichen C-Bereich im HCMV-Expressionsvektor erzeugen.
Nach der Amplifikation durch die PCR wurde das PCR-Produkt mit Hindill und BamHI gespalten, in den HCMV-Vektor cloniert, der die DNA der C-Bereiche der menschlichen κ- und γ-1- Kette enthält, und sodann sequenziert, um zu bestätigen, daß während der PCR-Amplifikation keine Fehler eingeführt worden waren. Die resultierenden Expressionsvektoren werden mit HCMV- 12k-gk und HCMV-12 h-g-γ-1 bezeichnet.
Die Strukturen der HCMV-Expressionsplasmide sind in Fig. 1 dargestellt. Im Plasmid HCMV-VL-HCκ kann der VL-Bereich ein beliebiger V-Bereich einer L-Kette der Maus sein, In diesem Beispiel wurde der V-Bereich der κ-L-Kette von AUK 12-20 eingefügt, wodurch HCMV-12k erhalten wurde. Im Plasmid HCMV- VH-HC-γ-1 kann der VH-Bereich ein beliebiger V-Bereich einer Maus-H-Kette der sein. In diesem Beispiel wurde der V-Bereich der H-Kette von AUK 12-20 eingefügt, wodurch HCMV-12 h-g-γ-1 erhalten wurde.

Transiente Expression in COS-Zellen

Um eine transiente Expression eines chimären AUK 12-20- Antikörpers in COS-Zellen zu erhalten, wurden die wie vorstehend beschrieben konstruierten Expressionsvektoren in den COS- Zellen getestet. Die Vektor-DNAs wurden in die COS-Zellen durch Elektroporation eingeführt, wobei eine Gene Pulsar-Apparatur (Bio-Rad) verwendet wurde. Hierzu wurden die COS-Zellen in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf eine Zellkonzentration von 1 · 10&sup7; Zellen pro ml suspendiert, sodann wurde ein 0,8 ml-Aliquot der Suspension mit 10 ugg (für jedes Plasmid) DNA versetzt. Pulse wurden bei 1900 V und 25 uF verabreicht.
Nach einer Erholungsphase von 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Zellen, bei denen eine Elektroporation durchgefüht worden war, zu 8 ml DMEM (GIBCO), enthaltend 10% fetales Rinderserum, zugegeben. Nach einer Inkubation von 72 Stunden wird der Kulturüberstand gesammelt, zur Entfernung der Zelltrümmer zentrifugiert und kurzfristig bei 4ºC oder langfristig bei -20ºC keimfrei gelagert.

Quantitative Bestimmung des chimären Antikörpers durch ELISA

Ein Kulturüberstand der transfizierten COS-Zellen wurde durch ELISA getestet, um die Produktion des chimären Antikörpers zu bestätigen. Zum Nachweis des chimären Antikörpers wurde eine Platte mit Ziegen-Anti-Mensch-IgG, ganzes Molekül, (Sigma), beschichtet. Die Platte wurde blockiert, und zu jeder Vertiefung wurde ein fortlaufend verdünnter Überstand aus der COS-Zellkultur zugegeben. Nach Inkubation und Waschen wurde zu jeder Vertiefung mit alkalischer Phosphatase gekoppeltes Ziegen-Anti-Mensch-IgG (γ-Kette-spezifisch, Sigma) zugefügt. Nach Inkubation und Waschen wurde der Substratpuffer zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde inkubiert und nach Beendigung der Reaktion die optische Dichte bei 405 nm gemessen. Als Standard wurde gereinigtes menschliches IgG (Sigma) verwendet.

ELISA zur Bestätigung der Fahigkeit an den menschlichen IL-6R zu binden

Ein Kulturüberstand der transformierten COS-Zellen wurde durch ELISA getestet, wobei festgestellt werden sollte, ob der produzierte Antikörper an das Antigen binden kann. Um die Bindung an das Antigen nachzuweisen, wurde eine Platte mit dem monoclonalen Maus-Antikörper MT18 beschichtet (Bezugsbeispiel 1) und nach der Blockierung mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) ein löslicher rekombinanter menschlicher IL-6R (SR344) zugegeben. Nach dem Waschen wurde zu jeder Vertiefung ein seriell verdünnter Kulturüberstand der COS-Zellen zugefügt. Nach Inkubation und Waschen folgte die Zugabe eines mit alkalischer Phosphatase gekoppelten Ziegen-Anti-Mensch-IgG. Das Reaktionsgemisch wurde inkubiert und nach dem Waschen mit dem Substratpuffer versetzt. Nach der Inkubation wurde die Reaktion beendet und die optische Dichte bei 405 nm gemessen.
Ein Ergebnis ist in Fig. 2 dargestellt. Die Transfektion des Gens, das einen chimären AUK 12-20-Antikörper codiert, in COS-Zellen wurde zweimal wiederholt. Die beiden Kulturüberstand-Proben zeigten eine starke Bindung an IL-ER, und die optische Dichte bei 405 nm änderte sich, abhängig von der Verdünnung der Probe (der Konzentration des monoclonalen Antikörpers), wie in Fig. 2 durch leere Kreise und gefüllte Kreise dargestellt, wodurch das Vorliegen eines Antikörpers gegen IL- 6R in der Probe nachgewiesen wird.

Bestimmung der Fähigkeit, die Bindung von IL-6 an IL-6R zu hemmen

Die Bestimmung, ob ein in einem Medium vorliegender Antikörper die Bindung von IL-6R an IL-6 hemmt, erfolgte, indem eine Platte mit dem monoclonalen Antikörper MT18 beschichtet wurde (Bezugsbeispiel 1). Nach der Blockierung wurde ein löslicher rekombinanter menschlicher IL-6R (SR344) zugegeben. Nach dem Waschen wurde eine seriell verdünnte Probe aus der COS-Zellkultur zusammen mit biotinyliertem IL-6 zu jeder Vertiefung zugefügt.
Nach dem Waschen wurde ein mit alkalischer Phosphatase gekoppeltes Streptavidin zugesetzt und nach Inkubation und Waschen ein Substratpuffer zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde inkubiert und nach Beendigung der Reaktion die optische Dichte bei 405 mm gemessen; ferner wurde der gereinigte monoclonale Maus-Antikörper AUK 12-20 als positive Kontrolle verwendet und ein Kulturmedium von COS-Zellen, die einen nicht-verwandten Antikörper exprimieren, als negative Kontrolle eingesetzt. Ein Ergebnis ist in Fig. 3 dargestellt. Der Kulturüberstand von COS-Zellen, die mit Genen transfiziert waren, die den chimären AUK 12-20-Antikörper codieren, zeigte bei der höchsten und bei der zweithöchsten Konzentration die Bindung von IL-6R an IL-6. Dabei änderte sich die optische Dichte bei 405 mm, abhängig von der Verdünnung der Probe (der Konzentration des Antikörpers), wie in Fig. 3 durch gefüllte Kreise dargestellt; dies macht deutlich, daß die Bindung von IL-6 an IL-6R durch einen Antikörper in der Probe gehemmt wird. Außerdem wird dieses Ergebnis dadurch bestätigt, daß es im wesentlichen mit der von der Antikörperkonzentration abhängigen Änderung der positiven Kontrolle (leere Kreise) übereinstimmt. Zu beachten ist, daß die negative Kontrolle keine Hemmaktivität zeigte (leere Dreiecke).

Beispiel 6 Bestätigung der Expression der clonierten cDNA (2) (Konstruktion des chimären PM-1- Antikörpers

(Konstruktion von Expressionsvektoren)

Um Vektoren zu konstruieren, die den chimären PM-1-Antikörper exprimieren, wurden die cDNA-Clone pPM-k3 und pPM-h1, welche die V-Bereiche der x-L-Kette bzw. der H-Kette des Maus- PM-1 codieren, durch eine PCR-Technik modifiziert und anschließend in die HCMV-Expressionsvektoren eingeführt (vgl. Fig. 1). Die Rückwärts-Primer pmk-s (SEQ ID NO: 38) für den V-Bereich der L-Kette und pmh-s (SEQ ID NO: 40) für den V-Bereich der H-Kette wurden so gestaltet, daß sie mit den DNA-Sequenzen hybridisieren, die für den Anfang der Leader-Sequenzen codieren, und daß sie eine Kozak-Consensus-Sequenz und eine HindIII-Restriktionsstelle aufweisen. Die Vorwärts-Primer pmka (SEQ ID NO: 36) für den V-Bereich der L-Kette und pmh-a (SEQ ID NO: 39) für den V-Bereich der H-Kette wurden so gestaltet, daß sie mit den DNA-Sequenzen hybridisieren, welche die Enden der J-Bereiche codieren, und daß sie eine Spleiß-Donnor-Sequenz und eine BamHI-Restriktionsstelle aufweisen.
Für den V-Bereich der κ-L-Kette wurden zwei Vorwärts- Primer synthetisiert. Obwohl in den meisten κ-L-Ketten der Lysinrest an Position 107 konserviert ist, steht in der κ-L- Kette des Maus-PM-1 an Position 107 ein Asparaginrest. Um die Wirkung dieses Austausches auf die Antigenbindungs-Aktivität des chimären PM-1-Antikörpers zu untersuchen, wurde der Vorwärts-Primer pmkb (SEQ NO: 37) so gestaltet, daß der Asparaginrest an Position 107 in einen Lysinrest mutiert wurde. Nach der PCR-Reaktion wurden die PCR-Produkte gereinigt, mit Hindill und BamHI gespalten und in einen pUC19-Vektor subcloniert (Yanishe-Perron et al., Gene 33 (1985), 103-109). Nach der DNA-Sequenzierung wurden die HindIII-BamHI-Fragmente ausgeschnitten und in den Expressionsvektor HCMV-VH-HCYl cloniert, wodurch HCMV-pmh-g-γ-1 für die chimäre H-Kette erhalten wurde, sowie in den Expressionsvektor HCMV-VL-HCκ cloniert, wodurch HCMV-pmka-gk und HCMV-pmkb-gk für die chimäre L-Kette erhalten wurden.

Transfektion von COS-Zellen

Die Vektoren wurden in COS-Zellen getestet, die auf eine transiente Expression der chimären menschlichen PM-1-Antikörper untersucht wurden. Der HCMV-pmh-g-γ-1 und entweder der HCMV-pmka-gk oder der HCMV-pmkb-gk wurden durch Elektroporation in die COS-Zellen co-transfiziert, wobei eine Gene Pulsar-Apparatur (Bio-Rad) eingesetzt wurde. Die DNA (10 ug von jedem Plasmid) wurde zu einem Aliquot von 0, 8 ml mit 1 · 10&sup7; Zellen pro ml in PBS zugegeben. Ein Puls wurde bei 1900 Volt mit einer Kapazität von 25 Mikrofarad abgegeben. Nach einer zehnminütigen Erholungsphase bei Raumtemperatur wurden die elektroporierten Zellen zu 20 ml Dulbecco-modifiziertem Eagle Medium (DMEM) (GIBCO) zugegeben, das 10% γ-Globulin-freies fetales Kälberserum enthielt. Nach 72 Stunden Inkubation wurde das Medium gewonnen, zur Entfernung der Zelltrümmer zentrifugiert und unter sterilen Bedingungen kurzfristig bei 4ºC oder langfristig bei -20ºC gelagert.

Expression und Analyse der chimären PM-1-Antikörper

Nach drei Tagen transienter Expression wurde das Medium von den COS-Zellen abgenommen und auf den chimären PM-1-Antikörper getestet. Das Medium wurde zuerst durch ELISA analysiert, wobei festgestellt werden konnte, ob durch die transfizierten COS-Zellen ein einem menschlichen Antikörper ähnlicher Antikörper produziert wird. Wenn in diesem Test bekannte Mengen eines gereinigten menschlichen IgG als Standard eingesetzt werden, besteht auch die Möglichkeit, hiermit die Menge des im Medium der COS-Zellen vorliegenden einem menschlichen Antikörper ähnlichen Antikörpers (in diesem Fall, des chimären PM-1-Antikörpers) abzuschätzen. Zum Nachweis des menschlichen Antikörpers wurden die Platten mit Ziegen-Anti- Mensch-IgG (ganzes Molekül, Sigma) beschichtet. Nach der Blockierung wurden die von den COS-Zellen stammenden Proben reihenweise verdünnt und zu jeder Vertiefung zugegeben. Nach Inkubation und Waschen wurde ein mit alkalischer Phosphatase konjugiertes Ziegen-Anti-Mensch-IgG (gamma-Ketten-spezifisch, Sigma) zugefügt. Nach Inkubation und Waschen erfolgte die Zugabe des Substratpuffers. Nach der Inkubation wurde die Reaktion abgestoppt und die optische Dichte bei 405 nm gemessen. Als Standard wurde gereinigtes menschliches IgG (Sigma) eingesetzt.
Das Medium von den COS-Zellen, die mit den Vektoren transfiziert waren, welche die chimären PM-1-Gene trugen, war hinsichtlich der Expression eines einem menschlichen Antikörper ähnlichen Antikörpers positiv, und die ungefähren Mengen wurden quantitativ bestimmt, wie beschrieben.
Als nächstes wurde das gleiche Medium von den COS-Zellen, die mit den die chimären PM-1-Gene enthaltenden Vektoren transfiziert waren, auf die Fähigkeit getestet, an den menschlichen IL-6R zu binden. Um die Bindung an das Antigen nachweisen zu können, wurden Platten mit dem monoclonalen Maus-Antikörper MT18 (Bezugsbeispiel 1), einem Antikörper gegen den menschlichen IL-6R, beschichtet. Nach der Blockierung wurde ein löslicher rekombinanter menschlicher IL-6R (SR344) zugegeben. Nach dem Waschen wurden die Proben reihenweise verdünnt und zu jeder Vertiefung zugesetzt. Nach Inkubation und Waschen erfolgte die Zugabe eines mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziegen-Anti-Mensch IgG (gamma-Ketten-spezifisch, Sigma). Nach Inkubation und Waschen wurde der Substratpuffer zugefügt. Nach der Inkubation wurde die Reaktion abgestoppt und die optische Dichte bei 405 nm gemessen. Für diesen Test war kein Standard verfügbar.
Zwei Proben stammten aus einer Transfektion mit Genen, die einen chimären Antikörper codieren, wobei die V-Bereiche mit denjenigen identisch waren, die im PM-1-Antikörper der Maus gefunden werden (chimärer PM-1a-Antikörper, Fig. 4). Eine Probe stammte aus einer Transfektion mit Genen, die einen chimären Antikörper mit einer einzigen Aminosäureänderung an Position 107 im V-Bereich der L-Kette codieren, wie vorstehend beschrieben (chimärer PM-1b-Antikörper, Fig. 4). Alle Proben zeigten eine starke Bindung an IL-6R, die mit der Verdünnung der Probe abnahm. Somit ist der konstruierte chimäre PM-1-Antikörper funktionell und kann an sein Antigen gut binden. Am wichtigsten ist die Tatsache, daß durch die Demonstration eines funktionellen chimären PM-1 direkt bewiesen wird, daß die korrekten V-Bereiche des Maus-PM-1 cloniert und sequenziert worden sind. Der chimäre PM-1-Antikörper mit jeder der beiden Aminosäuren in Position 107 im V-Bereich der L-Kette band gut an sein Antigen IL-6R. Dies legt nahe, daß die Position 107 im V-Bereich der L-Kette des Maus-PM-1 für die Antigen-Bindung nicht sehr kritisch ist und daß sowohl ein Asparaginrest als auch ein Lysinrest an dieser Position zufriedenstellend funktioniert. Da der Maus-PM-1-Antikörper an dieser Position im V- Bereich seiner L-Kette einen Asparaginrest besitzt, wurden alle weiteren Arbeiten mit dem chimären PM-1-Antikörper mit der Version a durchgeführt, der Version, die identische V-Bereiche wie der Maus-PM-1-Antikörper aufweist.
Um größere Mengen des chimären PM-1-Antikörpers stabil produzieren zu können, würde ein neuer HCMV-Expressionsvektor unter Einbau des dhfr-Gens konstruiert. Der erste Schritt für die Produktion einer höheren Expressionsrate des chimären PM- 1-Antikörpers bestand darin, den Vektor HCMV-VH-HCγ-1 (Fig. 1) so zu modifizieren, daß dieser Vektor ein dhfr-Gen enthielt, das durch einen "verkrüppelten" SV40-Promotor-Enhancer exprimiert wird. Die SV40-Enhancer-Elemente wurden von dem pSV2-dhfr-Vektor (S. Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1 (1981), 854-864) deletiert und das dhfr-Gen, das durch den "verkrüppelten" SV40-Promotor exprimiert wird, in den HCMV-VH- HCγ-1-Vektor anstelle des durch den SV40-Promotor-Enhancer exprimierten neo-Gens eingefügt. Der V-Bereich des Maus-PM-1 wurde sodann in diesen neuen HCMV-VH-HCγ-1-Vektor eingefügt. Die Konstruktion des verbesserten Expressionsvektors wird in Beispiel 10 genau beschrieben.
CHO-dhfr(-)-Zellen (G. Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 4216-4220) wurden mit zwei Plasmid-DNAs co-transfiziert, mit dem HCMV-VL-HCκ-Vektor für die Expression der L-Kette des chimären PM-1a (HCMV-pmka-gk) und mit dem HCMV-VH-HCγ-1-dhfr-Vektor für die Expression der H-Kette des chimären PM-1 (DHFR-Δ-E-PMh-g-γ-1; Beispiel 10). Die DNA (10 ug/ml von jedem Plasmid) wurde zu einem Aliquot von 0,8 ml mit 1 · 107 Zellen pro ml in PBS zugegeben. Ein Puls wurde bei 1900 Volt mit einer Kapazität von 25 Mikrofarad abgegeben. Nach einer zehnminütigen Erholungsphase bei Raumtemperatur wurden die elektroporierten Zellen zu 10 ml essentiellem Alpha-Minimalmedium (α-MEM) zugegeben, das Nucleoside und 10% FCS enthielt. Nach einer Inkubation über Nacht wurde das Medium gegen ein α-MEM ohne Nucleoside und mit 10% FCS und 500 ug/ml G418 (GIBCO) für die Selektion von dhfr&spplus;- und neo&spplus;transformierten Zellen ausgetauscht. Nach der Selektion wurden die selektierten Clone für die Genamplifikation eingesetzt. Nach einer Amplifikationsrunde in 2 · 10&supmin;&sup8; M Methotrexat (MTX) wurde eine Zellinie (PM1k3-7) selektiert, die etwa 3,9 ug pro 106 Zellen/Tag des chimären PM-1a-Antikörpers produzierte.

ELISA-Test auf die Fähigkeit der chimären Antikörper, die Bindung von IL-6 an den menschlichen IL-6R zu hemmen

Antikörper, die in transfizierten COS-Zellen oder in stabilen CHO-Zellinien produziert wurden, wurden getestet, wobei festgestellt wurde, ob die Antikörper mit biotinyliertem IL-6 um die Bindung an IL-6R kompetieren können. Platten wurden mit dem monoclonalen Maus-Antikörper MT18 beschichtet. Nach der Blockierung wurde ein löslicher rekombinanter menschlicher IL- 6R (SR344) zugegeben. Nach dem Waschen wurden die von den COS- Zellen stammenden Proben reihenweise verdünnt und zusammen mit dem biotinylierten IL-6 zu jeder Vertiefung zugesetzt. Nach dem Waschen erfolgte die Zugabe von mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Streptavidin. Nach Inkubation und Waschen wurde der Substratpuffer zugefügt. Nach der Inkubation wurde die Reaktion abgestoppt und die optische Dichte bei 405 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 dargestellt.

Beispiel 7 Konstruktion von neugeformten menschlichen PM-1-Antikörpern

Um die CDR-Übertragung schneller und, effizienter zu machen, wurde ein Verfahren zur sequentiellen CDR-Übertragung durch PCR entwickelt. Dieses Verfahren basiert auf PCR- Mutageneseverfahren (Kamman et al., 1989).
Zur Herstellung der Matrizen-DNAs, welche die ausgewählten menschlichen FRs für die CDR-Übertragung enthielten, mußten geeignete neugeformte menschliche V-Bereiche in passende Vektoren erneut cloniert werden. Die Plasmid-DNAs alysll und F10 codieren die neugeformten menschlichen D1.3-L- und -H-Ketten und enthalten die FRs aus dem menschlichen REI bzw. NEW. Ein etwa 500 bp großes NcoI-BamHI-Fragment, das eine DNA-Sequenz enthielt, welche den neugeformten menschlichen V-Bereich der D1.3-L-Kette codierte, wurde aus alysll ausgeschnitten und in den mit HindIII-BamHI gespaltenen pBR327 subcloniert, wodurch der Vektor Vl-lys-pBR327 erhalten wurde. Das HindIII- BamHI-Fragment aus dem V1-lys-pBR327 wurde in den mit HindIII- BamHI gespaltenen pUC19 eingefügt, wodurch der Vektor V1-lyspUC19 erhalten wurde. Ein etwa 700 bp großes NcoI-BamHI-Fragment, das eine DNA-Sequenz enthielt, die den neugeformten menschlichen V-Bereich der D1.3-H-Kette codierte, wurde aus F10 ausgeschnitten und in die HindIII-BamHI-Stelle des pBR327- Vektors subcloniert, wobei ein HindIII-NcoI-Adapter verwendet wurde, wodurch Vh-lys-pBR327 erhalten wurde. Anschließend wurde ein HindIII-BamHI-Fragment aus diesem Vektor ausgeschnitten und in einen mit HindIII-BamHI gespaltenen pUC19- Vektor subcloniert, wodurch Vh-lyspUC19 erhalten wurde.
Zu beachten ist, daß die Konstruktion des Plasmids alysll und die DNA-Sequenz, die den neugeformten menschlichen V-Bereich der D1.3-L-Kette codiert und in einer Matrize eingesetzt wird, beschrieben wird. Die DNA-Sequenz, die den neugeformten menschlichen V-Bereich der D1.3-H-Kette im Plasmid F10 codiert und als Matrize eingesetzt wird, wird in V. Verhoey et al., Science 237 (1988), 1534-1536, Fig. 2, beschrieben.
In Fig. 6 sind die Primer und die PCR-Reaktionen dargestellt, die bei der Konstruktion der ersten Version des neugeformten menschlichen V-Bereichs der PM-1-H-Kette verwendet werden. Der Rückwärts-Primer A (APCR1; SEQ ID NO: 41) und der Vorwärts-Primer E (APCR4; SEQ ID NO: 42) hybridisieren mit DNA-Sequenzen auf dem Vektor. Zwar waren APCR1 und APCR4 spezifisch für den Vektor pUC19 gestaltet, jedoch konnten auch universelle M13-Sequenz-Primer eingesetzt werden.
Der CDR1-übertragende/mutagene Primer B (phv-1; SEQ NO: 43), der CDR2-übertragende Primer C (phv-2; SEQ NO: 44) und der CDR3-übertragende Primer D (phv-3; SEQ NO: 45) wiesen eine Länge von 40 bis 60 bp auf und bestanden aus DNA-Sequenzen, welche die CDRs aus dem V-Bereich der H-Kette des Maus-PM-1 und die menschlichen FRs in der Matrizen-DNA, welche die CDR- Bereiche flankieren, codierten. In der ersten PCR-Reaktion wurden der Vorwärts-Primer APCR4 und der Rückwärts-Primer D eingesetzt. Das erste PCR-Produkt, das die CDR3-Sequenz des Maus-PM-1 enthält, wurde gereinigt und in der zweiten PCR- Reaktion als Vorwärts-Primer eingesetzt, wobei Primer C als Rückwärts-Primer verwendet wurde. Genauso wurden das zweite und das dritte PCR-Produkt, die Maus-PM-1-CDR2 und -CDR3 bzw. alle drei Maus-PM-1-CDRs enthalten, im folgenden PCR-Schritt als Primer eingesetzt. Das vierte PCR-Produkt, das den vollständigen neugeformten menschlichen V-Bereich der PM-1-H-Kette aufweist, wurde gereinigt, mit Hindlil und BamHI gespalten und für die weitere Analyse in den pUC19-Vektor subcloniert.
Die drei mutagenen Primer phv-1, phv-2 und phv-3 wurden für die Konstruktion des neugeformten menschlichen V-Bereichs der PM-1-H-Kette synthetisiert. Sie wurden auf 12% Polyacrylamid-Gelen, die 8 M Harnstoff enthielten, gereinigt. Der mutagene Primer phv-1 wurde nicht nur für die Übertragung von Maus-PM-1-CDR1, sondern auch für die Mutationen an den Positionen 27 und 30 im menschlichen FR1 von Ser zu Tyr bzw. von Ser zu Thr gestaltet. Jedes PCR-Reaktionsgemisch von 100 ul enthielt typicherweise 10 mM Tris HCl (ph 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 250 uM dNTPs, 50 ng der Matrizen-DNA (Vh-lyspUC19), 2,5 U AmpliTaq (Perkin Eimer Cetus) und die Primer. Die erste PCR-Reaktion, die 1 uM von jedem der Primer phv-3 und APCR4 enthielt, wurde nach einer anfänglichen Denaturierung von 1,5 Minuten bei 94ºC durchgeführt, wobei 30 Zyklen mit einer Minute bei 94ºC, einer Minute bei 37ºC und einer Minute bei 72ºC wiederholt wurden. Die Zeit der Temperaturerhöhung zwischen den Anelierungs- und Syntheseschritten betrug 2,5 Minuten. Nach vollständigem Ablauf des letzten Zyklus folgte eine endgültige Verlängerung von 10 Minuten bei 72ºC. Ein 523 bp großes PCR-Produkt wurde gereinigt, wobei ein bei niedriger Temperatur schmelzendes 1,6 % Agarose-Gel verwendet wurde, und sodann in der zweiten PCR- Reaktion als Primer eingesetzt.
In der zweiten PCR-Reaktion wurden etwa 1 ug des gereinigten ersten PCR-Produktes und 25 pMol des mutagenen Primers phv-2 als Primer eingesetzt. Die PCR-Bedingungen waren die gleichen, wie für die erste PCR-Reaktion beschrieben. Genauso wurden ein 665 bp großes PCR-Produkt aus der zweiten PCR-Reaktion und ein 737 bp großes PCR-Produkt aus der dritten Reaktion als Primer in der dritten PCR-Reaktion zusammen mit dem Primer phv-1 bzw. in der vierten PCR-Reaktion zusammen mit dem Primer APCR1 eingesetzt. Ein 1172 kbgroßes PCR-Produkt aus der vierten PCR-Reaktion wurde gereinigt, mit Hindill und BamHI gespalten und anschließend ein etwa 700 bp großes Fragment, das den neugeformten menschlichen V-Bereich der PM-1-H-Kette enthielt, in den pUC19-Vektor subcloniert. Zwei von vier sequenzierten Clonen besaßen die DNA-Sequenz, welche die korrekte Aminosäuresequenz codiert, und wurden mit pUC-RVh-PM1a bezeichnet.
Um andere Versionen des neugeformten V-Bereichs der PM-1- H-Kette zu konstruieren, wurden fünf mutagene PCR-Primer synthetisiert. Jede PCR-Reaktion wurde im wesentlichen unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, wie vorstehend beschrieben. Für die Version "b" wurden in der ersten PCR-Reaktion der mutagene Primer phv-m4 (Val-71 zu Arg-71; die Numerierung erfolgt gemäß Kabat et al.; vgl. Tabelle 3) (SEQ ID NO: 46) und ARCR4 zusammen mit der Matrizen-DNA pUC-RVh-PM1a eingesetzt. Das PCR-Produkt aus dieser ersten PCR-Reaktion wurde gereinigt und als Vorwärts-Primer in der zweiten PCR-Reaktion zusammen mit dem Primer APCR1 eingesetzt. Das PCR-Produkt aus der zweiten PCR-Reaktion wurde unter Verwendung eines bei niedriger Temperatur schmelzenden 1,6% Agarose-Gels gereinigt, mit HindIII und BamHI gespalten und in den pUC19-Vektor subcloniert, wodurch pUC-RVh-PM1b erhalten wurde. In gleicher Weise wurde die Version "c" (pUC-RVh-PM1c) erhalten, indem der mutagene Primer phv-nm (Asp-1 zu Gln-1) (SEQ ID NO: 47) und die Matrize pUC-RVh-PM1b verwendet wurden; die Version "d" (pUC- RVh-PM1d) wurde erhalten, indem der mutagene Primer phv-m6 (Ile-48 zu Met-48) (SEQ ID NO: 48) und die Matrize pUC-RVh- PM1b eingesetzt wurden; die Version "e" (pUC-RVh-PM1e) wurde erhalten, indem der mutagene Primer phv-m6 und die Matrize pVC-RVh-PM1c eingesetzt wurden; und die Version "f" (pUC-RVh- PM1f) wurde erhalten, indem der mutagene Primer phv-m7 (Thr-28 zu Ser-28 und Phe-29 zu Ile-29) (SEQ ID NO: 49) und die Matrize pUC-RVh-PM1b eingesetzt wurden. Die Aminosäuresequenz der Version "f" des neugeformten menschlichen V-Bereichs der H-Kette und die dafür codierende Nucleotidsequenz ist in SEQ ID NO: 54 dargestellt.
In Fig. 7 sind die Primer und die PCR-Reaktionen aufgeführt, die bei der Konstruktion der ersten Version eines neugeformten menschlichen V-Bereichs der PM-1-L-Kette verwendet wurden. Für die Konstruktion der ersten Version des neugeformten menschlichen V-Bereichs der PM-1-L-Kette wurden der CDR1- übertragende Primer pkv-1 (SEQ ID NO: 50), der CDR2-übertragende Primer pkv-2 (SEQ ID NO: 51) und der CDR3-übertragende Primer pkv-3 (SEQ ID NO: 52) synthetisiert und auf einem 12% Polyacrylamid-Gel, das 8 M Harnstoff enthielt, gereinigt. Die PCR-Reaktionen wurden durchgeführt, wie vorstehend beschrieben. Die erste PCR-Reaktion enthielt jeweils 1 uM der Primer pkv-3 und APCR4. Ein 350 bp großes PCR-Produkt aus der ersten PCR-Reaktion wurde gereinigt, wobei ein bei niedriger Temperatur schmelzendes 1,5% Agarose-Gel eingesetzt wurde, und sodann in der zweiten PCR-Reaktion als Vorwärts-Primer verwendet. Das PCR-Produkt aus der zweiten PCR-Reaktion wurde gerei nigt, mit BamHI und HindIII gespalten und das 500 bp-Fragment, das die DNA mit dem ausgetauschten CDR3 enthielt, für die DNA- Sequenzierung in den pUC19-Vektor subcloniert. Eine Plasmid- DNA mit der korrekten Sequenz wurde identifiziert und in der folgenden PCR-Reaktion als Matrizen-DNA eingesetzt. In der dritten PCR-Reaktion wurden 25 pMol der mutagenen Primer pkv-2 und APCR4 eingesetzt. Das PCR-Produkt aus der dritten PCR-Reaktion wurde gereinigt und in der vierten PCR-Reaktion zusammen mit dem Primer pkv-1 als Primer eingesetzt. Genauso wurde das PCR-Produkt aus der vierten PCR-Reaktion zusammen mit dem Primer APCR1 als Primer in der fünften PCR-Reaktion eingesetzt.
Ein 972 bp-großes PCR-Produkt aus der fünften PCR-Reaktion wurde gereinigt, mit BamHI und Hindlil gespalten und für die DNA-Sequenzierung in den pUC19-Vektor subcloniert. Ein Problem wurde im CDR2-Bereich identifiziert. Zwei weitere PCR- Reaktionen waren erforderlich. In der sechsten und in der siebenten PCR-Reaktion wurde das PCR-Produkt aus der fünften PCR- Reaktion, wie in den pUC19-Vektor cloniert, als Matrizen-DNA eingesetzt. In der sechsten PCR-Reaktion wurden die Primer pkv-2 und APCR4 verwendet. Das PCR-Produkt aus der sechsten PCR-Reaktion wurde gereinigt und in der siebenten PCR-Reaktion zusammen mit dem Primer APCR1 als Primer eingesetzt. Das PCR- Produkt aus der siebenten PCR-Reaktion wurde gereinigt, mit BamHI und Hindlil gespalten und ein 500 bp-großes DNA-Fragment für die DNA-Sequenzierung in den pUC19-Vektor subcloniert. Zwei der fünf sequenzierten Clone wiesen die korrekte DNA-Sequenz auf. Der Klon wurde mit pUC-RV1-PM1a bezeichnet. Die Sequenz ist in SEQ ID NO: 55 dargestellt.
Für die Konstruktion der anderen Version des neugeformten menschlichen V-Bereichs der PM-1-L-Kette wurde der mutagene Primer pvk-ml (SEQ ID NO: 53) synthetisiert. Die PCR-Reaktionen wurden im wesentlich wie vorstehend beschrieben durchgeführt. In der ersten PCR-Reaktion wurden der mutagene Primer pkv-ml (Phe-71 zu Tyr-71) und der Primer APCR4 zusammen mit der Matrizen-DNA pUC-RV1-PM1a eingesetzt. Das PCR-Produkt aus der ersten PCR-Reaktion wurde gereinigt und in der zweiten PCR-Reaktion zusammen mit dem Primer APCR1 als Primer einge setzt. Das PCR Produkt aus der zweiten PCR Reaktion wurde gereinigt, mit BamHI und Hindill gespalten und für die DNA-Sequenzierung in den pUC19-Vektor subcloniert. Der Clon wurde mit pUC-RVl-PM1b bezeichnet.

Beispiel 8 Konstruktion der Vektoren, die den sehr frühen Promotor des menschlichen Cytomeaalovirus (HCMV) zur Expression von gentechnisch veränderten Antikörpern in Säugerzellen verwenden (Fig. 1)

Die DNA-Fragmente, welche die V-Bereiche der L- und der H-Kette des chimären PM-1 codieren, wurden zuerst in HCMV-Vektoren (HCMV-VL-HCκ und HCMV-VH-HCγ-1) eingefügt, die so gestaltet waren, daß sie in Säugerzellen entweder menschliche κ-L-Ketten oder menschliche y-1-H-Ketten exprimierten (vgl. Fig. 1). Eine genaue Beschreibung der Konstruktion der HCMV- Expressionsvektoren ist veröffentlicht in Maeda et al., Human Antibodies and Hybridomas 2 (1991), 124-134; C. A. Kettleborough et al., Protein Engeneering 4 (1991), 773-783. Die beiden Vektoren basieren auf pSV2neo (P. J. Southern et al., J. Mol. Appln. Genet. 1 (1982), 327-341) und enthalten den Promotor und Enhancer des menschlichen Cytomegalovirus (HCMV) (M. Boshart et al., Cell 41 (1985), 521-530) für eine Transkription auf hohem Niveau der Immunglobulin-L- und H- Ketten. Der Expressionsvektor der L-Kette enthält genomische DNA, die den menschlichen κ-C-Bereich codiert (T. H. Rabbitts et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 113 (1984), 166-171), und der Expressionsvektor der H-Kette enthält genomische DNA, die den menschlichen γ-1-C-Bereich codiert (N. Takahashi et al., Cell 29 (1982), 671-679). Die HCMV-Expressionsvektoren sind vielseitig und können in verschiedenen Säugerzelltypen sowohl für eine transiente als auch für eine stabile Expression eingesetzt werden.

Beispiel 9 Konstruktion der Vektoren, die den Promotor des menschlichen Elongationsfaktors 1α (HEF-1a) zur Expression von gentechnisch veränderten Antikörpern in Säugerzellen verwenden (Fig. 8 und Fig. 9)

Der menschliche Polypeptidketten-Elongationsfaktor 1α (HEF-1α) ist eines der häufigsten Proteine. Er wird in den meisten Zellen exprimiert. Die transkriptionale Aktivität des menschlichen EF-1a-Promotors-Enhancers ist etwa 100-mal stärker als die des frühen SV40-Promotors-Enhancers (D. W. Kim et al., Gene 91 (1990), 217-223, und T. Uetsuki et al., J. Biol. Chem. 264 (1989), 5791-5798). Der etwa 2,5 kb große HEF-1α-Promotor-Enhancer-Bereich besteht aus etwa 1,5 kb DNA, welche das 5'-Ende des Gens flankiert, 33 bp im ersten Exon, 943 bp im ersten Intron und 10 bp des ersten Teils des zweiten Exons. Das etwa 2,5 kb große HindIII-EcoRI-Fragment wurde aus der Plasmid-DNA pEF321-CAT (D. W. Kim et al., Gene 91 (1990), 217-223, und T. Uetsuki et al., J. Biol. Chem. 264 (1989), 5791-5798) ausgeschnitten und in die pdKCR-Vektor-DNA (M. Tsuchiya et al., EMBO J. 6 (1987), 611-616) (K. O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 Nr. 3, (1981), 1527-1531) cloniert, wobei ein etwa 300 bp großes HindIII-EcoRI-Fragment, enthaltend die frühe SV40-Promotor-Enhancer-Sequenz, ersetzt wurde, hierdurch wurde pTEF-1 erhalten. pTEF-1 wurde mit EcoRI gespalten, mit Klenow-Polymerase aufgefüllt und an Hindill- Linker ligiert. Sodann wurde ein etwa 1,6 kb-großes Hindlil- SamI-Fragment aus der modifizierten pTEF-1-Vektor-DNA ausgeschnitten.
Die Plasmid-DNA HCMV-12 h-g-7-1 (Δ-E2) wurde aus dem in Beispiel 5 konstruierten HCMV-12 h-g-γ-1 konstruiert, indem HCMV-12 h-g-γ-1 mit EcoRI partiell gespalten, mit Klenow- Polymerase aufgefüllt und selbstligiert wurde.
Das Plasmid HCMV-12 h-g-γ-1 (Δ-E2) wurde mit EcoRI gespalten, mit Klenow-Polymerase aufgefüllt und mit Hindlil gespalten. Das resultierende etwa 7 kb große Fragment, das die den menschlichen γ-1-C-Bereich codierende DNA-Sequenz enthielt, wurde an das vorstehend hergestellte 1,6 kb große HindIII-SmaI-Fragment, das den HEF-1α-Promotor-Enhancer ent hielt, ligiert, wodurch HEF 12 h g-γ-1 erhalten wurde. Der HEF 1a-Promotor-Enhancer-Bereich in diesem Vektor war der gleiche wie der in pTEF-1, mit der Ausnahme eines 380 bp-DNA- Abschnitts, der den 5'-Bereich flankierte. Der V-Bereich der H-Kette, der als ein HindIII-BamHI-Fragment vorlag, konnte einfach gegen andere V-Bereiche von H-Ketten ausgetauscht werden.
Die HindIII-BamHI-DNA-Fragmente, die den neugeformten V- Bereich der H-Kette enthielten, wurden aus dem pUC-RVh-PM1a, pUC-RVh-PM1b, pUC-RVh-PM1c, pUC-RVh-PM1d, pUC-RVh-PM1e und pUC-RVh-PM1f (Beispiel 7) ausgeschnitten und in den HindIII- BamHI-Teil des HEF-12 h-g-γ-1 eingefügt, wodurch die Expressionsvektoren RVh-PM1a, RVh-PM1b, RVh-PM1c, RVh-PM1d, RVh- PM1e bzw. RVh-PMhferhalten wurden. Die Expressionsvektoren RVh-PM1a, RVh-PM1b, RVh-PM1c, RVh-PM1d, RVh-PM1e und RVh-PM1f und außerdem HEF-PMh-g-γ-1 weisen die neugeformten menschlichen V-Bereiche der PM-1-H-Kette der Versionen "a", "b", "c", "d", "e" und "f" bzw. den V-Bereich der Maus-PM-1-H-Kette auf.
Zur Konstruktion des Expressionsvektors der L-Kette, HEF- 12k-gk, wurde ein etwa 3,0 kb großes PvuI-HindIII-Fragment, das den HEF-1α-Promotor-Enhancer-Bereich enthielt, aus dem HEF-12 h-g-·y-1 ausgeschnitten und an ein etwa 7,7 kb großes PvuI-HindIII-Fragment aus dem in Beispiel 5 konstruierten HCMV-Expressionsvektors der L-Kette, HCMV-12k-gk, ligiert, wodurch HEF-12k-gk erhalten wurde. Wie beim Expressionsvektor der H-Kette, HEF-12 h-g-γ-1, kann der V-Bereich der L-Kette in HEF-12k-gk, der als ein HindIII-BamHI-Fragment vorliegt, einfach gegen andere V-Bereiche von L-Ketten ausgetauscht werden.
Die HindIII-BamHI-DNA-Fragmente, die den neugeformten menschlichen V-Bereich der L-Kette enthielten, wurden aus dem pUC-RV1-PM1a und dem pUC-RV1-RM1b (Beispiel 7) ausgeschnitten und in den HindIII-BamHI-Teil des HEF-12k-gk eingefügt, wodurch die Expressionsvektoren RV1-PM1a bzw. PV1-PM1b erhalten wurden. Die Expressionsvektoren RV1-PM1a, PV1-PM1b und HEF- PMk-gk weisen die neugeformten menschlichen L-Kette-V-Bereiche "a" und "b" bzw. den V-Bereich der Maus-PM-1-L-Kette auf.

Beispiel 10 Konstruktion der Vektoren, die das Bihydrofolatreduktase (dhfr)-Gen, gekoppelt an eine defekte SV40-Promotor-Enhancer-Sequenz, verwenden, um eine hohe Expressionsrate der gentechnisch veränderten Antikörper in CHO-Zellen zu erhalten (Fig. 10 und Fig. 11)

Um die Enhancer-Sequenz von dem frühen SV40-Promotor zu entfernen, wurde die Plasmid-DNA pSV2-dhfr (S. Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1 (1981), 854-864) (ATCC 33694) mit SphI und PvuII gespalten, mit Klenow-Polymerase aufgefüllt und selbstligiert, wodurch pSV2-dhfr-Δ-E erhalten wurde (vgl. Fig. 10). Ein etwa 3,7 kb großes EcoRI-Fragment, das den HCMV-Promotor, den V-Bereich der H-Kette und den menschlichen γ-1-C-Bereich enthielt, wurde aus HCMV-PMh-g-γ-1 durch partielle Spaltung mit EcoRI ausgeschnitten. Dieses Fragment wurde an den mit EcoRI gespaltenen pSV2-dhfr-γ-E ligiert, wodurch DHFR-γ-E-PMh-g-γ-1 erhalten wurde.
Ein ähnlicher Vektor wurde konstruiert, basierend auf dem Expressionsvektor der H-Kette, der den HEF-1α-Promotor-Enhancer verwendet (vgl. Fig. 11). Ein etwa 3,7 kb großes EcoRI- Fragment, das vom HCMV-12 h-g-γ-1 stammte, wurde mit dem EcoRIgespaltenen pSV2-dhfr-Δ-E ligiert, wodurch DHFR-γ-E-12 h-g-γ-1 erhalten wurde. Die BamHI-Stelle, die auf die dhfr-cDNA- Sequenz in DHFR-γ-E-12 h-g-γ-1 folgte, wurde durch partielle Spaltung mit BamHI, Auffüllen mit Klenow-Polymerase und Selbstligierung entfernt. Ein etwa 4 kb-großes PvuI-BamHI- Fragment, das die dhfr-cDNA enthielt, wurde aus der modifizierten DHFR-γ-E-12 h-g-γ-1-DNA ausgeschnitten und an ein etwa 3 kb großes PvuI-BamHI-Fragment aus dem RVh-PM1f-4 (konstruiert in Beispiel 12) ligiert, wodurch DHFR-γ-E-RVh- PM1ferhalten wurde.
Die wie vorstehend hergestellten verbesserten Expressionsplasmide können für die Produktion der neugeformten menschlichen PH-1-Antikörper der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.

Beispiel 11 Expression und Analyse von verschiedenen Versionen des neugeformten menschlichen PM-1-Antikörpers

Die HEF-1α-Vektoren, die neugeformte menschliche PM-1-L- und H-Ketten exprimierten, wurden in COS-Zellen co-transfiziert. Als Standardkontrolle wurden die HEF-1α-Vektoren, welche die L- und H-Ketten des chimären PM-1 exprimierten, auch in COS-Zellen co-transfiziert. Nach drei Tagen wurde das Medium von den transfizierten COS-Zellen abgenommen und durch ELISA (1) auf die Menge des im Überstand vorliegenden menschlichen IgG-Antikörpers und (2) auf die Fähigkeit dieses menschlichen IgG, an den IL-6R zu binden, analysiert. Später wurden die gleichen Proben auch durch ELISA auf die Fähigkeit des Antikörpers getestet, die Bindung des menschlichen IL-6 an den menschlichen IL-6R zu hemmen.
Die Untersuchung der zwei Versionen des neugeformten menschlichen V-Bereichs der PM-1-L-Kette erfolgte durch Co- Transfektion von COS-Zellen mit einem der beiden Vektoren, die die neugeformten menschlichen PM-1-L-Ketten exprimierten (RV1- PM1a oder RV1-PM1b), und mit dem Vektor, der die H-Kette des chimären PM-1 exprimierte (HCMV-PMh-g-γ-1). Außerdem wurden Zellen mit Vektoren co-transfiziert, welche die L- und H- Ketten des chimären PM-1 exprimierten (HCMV-PMka-gk und HCMV- PMh-g-γ-1). Die Daten unter Verwendung von nichtgereinigten COS-Zellüberständen zeigten, daß die Version "a" der neugeformten menschlichen PM-1-L-Kette in den Tests auf Bindung an den IL-6R gleichwertig war wie die L-Kette des chimären PM- 1. Dagegen war bei der Version "b" der neugeformten menschlichen PM-1-L-Kette die Bindung an IL-6R praktisch aufgehoben (Fig. 12). Aus diesen Ergebnissen wurde gefolgert, daß die Änderung an Position 71 beim FR3 von einem Phenylalaninrest (wie er im menschlichen REI vorliegt, das für CAMPATH-1H modifiziert wurde) zu einem Tyrosinrest (wie er im natürlichen menschlichen REI und im Maus-PM-1 vorliegt) für die Erzeugung einer funktionellen Antigenbindungsstelle sehr ungünstig war. Die Version "a" des neugeformten menschlichen V-Bereichs der PM-1-L-Kette wurde als die beste Version ausgewählt. In den anschließenden Experimenten zur Untersuchung der verschie denen Version der neugefomten menschlichen V-Bereiche der PM-1-H-Kette wurde immer die Version "a" des neugeformten menschlichen V-Bereichs der PM-1-L-Kette eingesetzt.
Die Untersuchung der sechs Versionen des neugeformten menschlichen V-Bereichs der PM-1-H-Kette erfolgte durch Co- Transfektion von COS-Zellen mit einem der sechs Vektoren, die die neugeformten menschlichen PM-1-H-Ketten exprimierten (RVh- PM1a, PVh-PM1b, RVh-PM1c, PVh-PM1d, RVh-PM1e oder PVh-PM1f), und mit dem Vektor, der die Version "a" der neugeformten menschlichen PM-1-L-Kette exprimierte (RVl-PM1a). Außerdem wurden Zellen mit Vektoren co-transfiziert, welche die L- und H-Ketten des chimären PM-1 exprimierten (HEF-PMK-gk und HEF- PMh-g-γ-1). Vorläufige Daten unter Verwendung von nichtgereinigten COS-Zellüberständen zeigten, daß die Version "a" der neugeformten menschlichen PM-1-L-Kette und die Version "f" der neugeformten menschlichen PM-1-H-Kette in den Tests auf Bindung an den IL-6R gleichwertig waren wie die L- und H-Ketten des chimären PM-1.
Zur Bestätigung dieser vorläufigen Daten wurden der chimäre und die neugeformten menschlichen PM-1-Antikörper eingeengt und aus den COS-Zellüberständen unter Verwendung von Protein A gereinigt. Hierzu wurden die Medien von den COS-Zellen unter Einsatz einer Apparatur zur Ultrafiltration mit 100 kd- Ausschluß (Amicon) eingeengt. Die eingeengten Medien wurden unter Verwendung einer Protein A-Agarose (Afft-Gel Protein A MAPSII Kit, Bio-Rad) gereinigt. Kurz gesagt wurde das konzentrierte Medium auf eine Säule mit Protein A-Agarose aufgetragen, die mit fünf Bettvolumina Bindungspuffer äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 15 Bettvolumina des Bindungspuffers gewaschen, gefolgt von fünf Bettvolumina des Elutionspuffers. Das Eluat wurde eingeengt und der Puffer gegen PBS ausgetauscht, wobei ein Mikrokonzentrator (Centricon 10, Amicon) eingesetzt wurde. Die gereinigten Antikörper wurden für die weitere Analyse verwendet.
Sodann erfolgte die Analyse der gereinigten Proben des chimären PM-1-Antikörpers und der neugeformten menschlichen PM-1-Antikörper mit der Version "a" des V-Bereichs der L-Kette und mit den Versionen "a" "b" "c" "d" "e" und "f" des neu geformten menschlichen V-Bereiche der H-Kette. Die Version "a" der L-Kette plus die Version "f" der H-Kette ist deutlich der beste neugeformte menschliche PM-1-Antikörper. Er bindet genauso gut an den IL-6R wie der chimäre PM-1-Antikörper (Fig. 13). Auch hemmt er die Bindung des menschlichen IL-6 an den IL-6R genauso gut wie sowohl der Maus- als auch der chimäre PM-1-Antikörper (Fig. 14).

Beispiel 12 Rekonstruktion der neugeformten menschlichen PM-1-V-Bereiche zur Verbesserung der Expressionsrate

Um die Introns innerhalb der DNA-Sequenzen, welche die Leader-Sequenzen der neugeformten menschlichen V-Bereiche der PM-1-L- und -H-Kette codieren (vgl. SEQ ID NO: 54 und 55), zu entfernen, wurden die V-Bereiche-codierenden cDNAs unter Verwendung der PCR-Primer wiedercloniert. Die Expressionsvektoren der L- und der H-Kette, PV1-PM1a und PVh-PM1f, wurden in COS- Zellen co-transfiziert. Nach 48 Stunden wurde die Gesamt-RNA hergestellt (Chirgwin et al., Biochemistry 18 (1979), 5294- 5299) und 5 ug der Gesamt-RNA für die Synthese des ersten Strangs der cDNA eingesetzt, wie für die PCR-Clonierung der V- Bereiche des Maus-Antikörpers beschrieben. Drei PCR-Primer wurden entworfen und synthetisiert. LEV-P1 (SEQ ID NO: 60) und HEV-P1 (SEQ ID NO: 58) enthalten die Spleiß-Donor-Sequenz und die BamHI-Stelle und wurden als Vorwärts-Primer für die V-Bereiche der L- bzw. der H-Kette verwendet. HEV-P2 (SEQ ID NO: 59) enthält die Kozak-Consensus-Sequenz vor dem ATG-Initiations-Codon und der Hindlil-Stelle und wurde als Rückwärts-Primer für die V-Bereiche von sowohl L- als auch H-Kette eingesetzt. Jedes PCR-Reaktiongemisch zu 100 ul enthielt 20 mM Tris-HCl (pH 8, 8), 10 mM KCl, 10 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 2 mM MgSO&sub4;, 0,1 % Triton X-100, 0,1 ug BSA, 250 uM dNTPs, 2,5 U Vent DNA-Polymerase (Biolabs, UK), 50% der Synthesereaktion des ersten Strangs der cDNA und 100 pMol von jedem der Vorwärts- und Rückwärts-Primer. Jedes PCR-Röhrchen wurde mit 50 ul Mineralöl überschichtet und anschließend dem Zyklus unterworfen, nach einem anfänglichem Schmelzen von 1,5 Minuten bei 94ºC, mit einer Minute bei 94ºC, einer Minute bei 50ºC und einer Minute bei 72ºC, und anschließend 10 Minuten bei 72ºC. Das 408 bp große PCR Produkt, das den V-Bereich der L-Kette enthielt, und das 444 bp große PCR-Produkt, das den V-Bereich der H-Kette enthielt, wurden unter Verwendung von bei niedriger Temperatur schmelzenden 2,0% Agarose-Gelen gereinigt, mit BamHI und Hindlil gespalten und in den pUC19-Vektor subcloniert, wodurch pUC-RV1-PM1a-3 bzw. pUC-RVh-PM1f-3 erhalten wurde.
Es wurde gezeigt, daß die DNA-Sequenzen der neugeformten menschlichen V-Bereiche der PM-1-L- und -H-Kette unpassende Spleiß-Donor- und -Akzeptorstellen enthalten (vgl. SEQ ID NO: 54 und 55). Die Stellen innerhalb des V-Bereichs der L-Kette werden nicht häufig verwendet (etwa 10% der mRNA), dagegen werden die Stellen innerhalb des V-Bereichs der H-Kette häufig eingesetzt (etwa 90% der mRNA). Dieses abnormale Spleißen führte zu einer niedrigen Expressionsrate des neugeformten menschlichen PM-1-Antikörpers. Um ein abnormales Spleißen in den V-Bereichen zu vermeiden, wurden die Speiß-Donorstellen anhand eines PCR-basierten Verfahrens entfernt. Für den V-Bereich der H-Kette wurden der Rückwärts-Primer NEW-SP1 (SEQ ID NO: 61) und der Vorwärts-Primer NEW-SP2 (SEQ ID NO: 62) synthetisiert, wobei die DNA-Sequenz TGG GTG AGA zu der DNA-Sequenz TGG GTT CGC geändert wurde. Die Bedingungen für die PCR- Reaktionen waren genauso, wie vorstehend für die cDNA-Clonierung beschrieben, mit der Ausnahme, daß die Matrizen-DNA 50 ng pUC-RVh-PM1f-3 und die Primer entweder HEV-P2 und NEW-SP2 oder HEV-P1 und NEW-SP1 waren.
Die PCR-Produkte aus den zwei PCR-Reaktionen wurden gereinigt, wobei ein bei niedriger Temperatur schmelzendes 2% Agarose-Gel verwendet wurde, und in einer PCR-Kopplungsreaktion eingesetzt. Ein PCR-Reaktionsgemisch von 98 ul, das jeweils 0,5 ug der ersten PCR-Produkte und 5 U Vent DNA-Polymerase enthielt, wurde zwei Minuten bei 94ºC, zwei Minuten bei 50ºC und fünf Minuten bei 72ºC inkubiert und anschließend mit jeweils 100 pMol der Primer HEV-P1 und HEV-P2 versetzt. Das PCR-Röhrchen wurde mit 30 ul Mineralöl überschichtet und 25 PCR-Zyklen mit einer Minute bei 94ºC, einer Minute bei 50ºC und einer Minute bei 72ºC unterworfen und anschließend zehn Minuten bei 72ºC inkubiert.
Genauso wurde die Spleiß-Donnorstelle im neugeformten menschlichen V-Bereich der PM-1-L-Kette entfernt, wobei die PCR-Primer REI-SP1 (SEQ ID NO: 63) und REI-SP2 (SEQ ID NO: 64) eingesetzt wurden, wodurch die DNA-Sequenz CAG GTA AGG in die DNA-Sequenz CAG GAA AGG geändert wurde (vgl.). Die beiden PCR- Produkte, ein 408 bp großes DNA-Fragment für den V-Bereich der L-Kette und ein 444 bp großes DNA-Fragment für den V-Bereich der H-Kette, wurden unter Verwendung eines bei niedriger Temperatur schmelzenden 2,0% Agarose-Gels gereinigt, mit HindIII und BamHI gespalten und in den pUC19-Vektor subcloniert, wodurch pUC-RV1-PM1a-4 bzw. pUC-RVh-RM1f-4 erhalten wurden.
RVh-PM1f-4 wurde konstruiert, indem das HindIII-BamHI- Fragment von RVh-PM1f durch das aus pUC-RVh-PM1f-4 ausgeschnittene HindIII-BamHI-Fragment ersetzt wurde. Die Sequenz des neugeformten menschlichen V-Bereichs, Version "a", der L- Kette des PM-1-Antikörpers, wobei Introns deletiert wurden, ist in SEQ ID NO: 57 dargestellt, und die Sequenz, des neugeformten menschlichen V-Bereichs, Version "f", der H-Kette des PM-1-Antikörpers, wobei deletiert wurden, ist in SEQ ID NO: 56 dargestellt.

Beispiel 13 Konstruktion von DNA, die einen neugeformten menschlichen V-Bereich der L-Kette des AUK 12-20-Antikörpers codiert

Ein Verfahren zur Konstruktion von DNA, die einen neugeformten menschlichen V-Bereich der L-Kette des AUK 12-20-Antikörpers codiert, ist in Fig. 16 dargestellt. Ein Gen, das einen menschlichen V-Bereich einer Antikörper-L-Kette codiert, wird unter Verwendung der Restriktionsenzyme Hindill und BamHI in den pUC19-Vektor eingebaut. Acht PCR-Primer (A bis H) werden hergestellt, und in der ersten PCR werden vier Bereiche amplifiziert, die ein den V-Bereich codierendes Gen bilden. Die Primer A bis H zeigen eine Homologie zu DNA-Sequenzen auf dem pUC19-Vektor. Die Primer B, C und D sind Primer mit einer Länge von 40 bis 60 bp, die jeweils eine Gensequenz des entsprechenden, zu übertragenden CDR aufweisen. Die Primer E, F und G zeigen eine Homologie zu einer DNA-Sequenz mit einer Länge von 15 bis 20 bp des 5'-Terminus der Primer B, C bzw. D.
Bei vier ersten PCRs werden die Primer-Paare A und E, B und F, C und G bzw. D und H eingesetzt.
Das PCR-Produkt A-E codiert FR1, und das PCR-Produkt B-F codiert CDR1 und FR2. Der 3'-terminale Teil des A-E-Fragmentes und der 5'-terminale Teil des B-F-Fragmentes weisen in ihrem Bereich mit der Länge von 15 bis 20 bp eine Homologie auf, die dort ein Zusammenfügen von Fragmenten in einem späteren Stadium ermöglicht. Genauso hat das B-F-Fragment eine Homologie zu dem C-G-Fragment, das CDR2 und FR3 codiert. Das C-G-Fragment hat ferner eine Homologie zu dem D-H-Fragment, das CDR3 und FR4 codiert. Somit können diese vier Fragmente anhand ihrer gegenseitigen Homologie zusammengefügt werden. Nach dem Zusammenfügen dieser vier Fragmente in einem PCR-Reaktionsgemisch werden die Primer A und H in der zweiten PCR zugegeben, um ein durch korrektes Zusammenfügen der vier Fragmente gebildetes Produkt zu amplifizieren. Das auf diese Weise erhaltene zweite PCR-Produkt besitzt drei übertragene CDRs und wird nach der Spaltung mit Hindlil und BamHI in den pUC19-Vektor subcloniert.
Genauer gesagt wurde als Matrize das Plasmid pUC-RV1- PM1a-4 eingesetzt, das durch Einfügen einer DNA, die den neugeformten menschlichen V-Bereich, Version "a", der L-Kette des PM-1-Antikörpers codierte, in das Plasmid pUC19 konstruiert wurde.
Die vorstehend erwähnten Primer A bis H weisen die folgenden Sequenzen auf.
Die Rückwärts-Primer 1220-L1, 1220-L2 und 1220L3 für die CDR-Übertragung wurden vor der Verwendung mit einem 12% Polyacrylamid-Gel, das 8 M Harnstoff enthielt, gereinigt.
Ein PCR Reaktionsgemisch von 100 2ul enthielt 20 mM Tris HCl (pH 8,8), 10 mM KCl, 10 mlvi (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 2 mM MgSO&sub4;, 0,1% Triton X-100, 1 ug BSA, 250 uM dNTPs, 5 Einheiten Vent DNA-Polymerase (BioLabs, UK), 50 ng pUC-RV1--PM1a-4-DNA und jeweils 100 pMol der Vorwärts- und Rückwärts-Primer. Jedes PCR-Röhrchen wurde mit 50 ul Mineralöl überschichtet, und nach einer anfänglichen Denaturierung von 1,5 Minuten bei 94ºC erfolgten 30 Reaktionszyklen von einer Minute bei 94ºC, einer Minute bei 50ºC und einer Minute bei 72ºC, anschließend folgte eine zehnminütige Inkubation bei 72ºC.
Jedes der PCR-Produkte, 252 bp (A-E), 96 bp (B-F), 130 bp (C-G) und 123 bp (D-H) wurde mit einer bei niedriger Temperatur schmelzenden 2,0% Agarose (FMC, Bio. Products, USA) gereinigt. Hierbei wurde ein Agarosestückchen, das ein DNA-Fragment enthielt, ausgeschnitten, fünf Minuten bei 65ºC geschmolzen und zu einem gleichen Volumen von 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), enthaltend 2 mM EDTA und 200 mlvi NaCl, zugegeben. Das Gemisch wurde mit Phenol und Chloroform extrahiert. Das DNA-Fragment wurde durch eine Ethanolfällung gewonnen, in 10 mlvi Tris-HCl (pH 7,5), enthaltend 1 mlvi EDTA, gelöst und für die PCR-Kopplungsreaktion eingesetzt.
Als nächstes wurde ein PCR-Reaktionsgemisch von 98 ul, das jeweils 0,2 ug der ersten PCR-Produkte und 5 Einheiten Vent DNA-Polymerase enthielt, für die Kopplungsreaktion zwei Minuten bei 94ºC, zwei Minuten bei 50ºC und fünf Minuten bei 72ºC inkubiert. Danach wurden jeweils 100 pMol der Primer A (REVERS) und H (UNIVERSAL) zum Reaktionsgemisch zugefügt, so daß es auf ein Volumen von 100 ul kam, sodann wurde das Reaktionsgemisch mit 50 ul Mineralöl überschichtet und 30 Reaktionszyklen von einer Minute bei 94ºC, einer Minute bei 50ºC und einer Minute bei 72ºC unterworfen, anschließend folgte eine zehnminütige Inkubation bei 72ºC.
Das zweite PCR-Produkt mit einer Länge von 558 bp, das einen V-Bereich einer L-Kette enthielt, in den die CDRs der L- Kette des monoclonalen Maus-Antikörpers AUK 12-20 übertragen worden waren, wurde durch ein bei niedriger Temperatur schmelzendes 2,0% Agarose-Gel gereinigt und nach Spaltung mit BamHI und Hindill in den pUC19-Vektor subcloniert, wodurch pUC-RLL- 1220a erhalten wurde, und sequensiert. Die resultierende Aminosäuresequenz des V-Bereichs der L-Kette und die Nucleotidsequenz, welche die Aminosäuresequenz codiert, sind in SEQ ID NO: 71 dargestellt.
Als nächstes wurde für die Konstruktion eines Expressionsvektors der L-Kette ein HindIII-BamHI-DNA-Fragment, das einen neugeformten menschlichen V-Bereich der L-Kette des AUK 12-20-Antikörpers enthielt, aus dem vorstehend erwähnten Plasmid pUC-RVL-1220a ausgeschnitten und in die HindIII-BamHI- Stelle des L-Kette-Expressionsvektors HEF-12k-gk eingefügt, wodurch der Expressionsvektor RVL-1220a für einen neugeformten menschlichen V-Bereich, Version "a", der L-Kette des AUK 12- 20-Antikörpers erhalten wurde.

Beispiel 14 Expression und Analyse einer neugeformten menschlichen L-Kette des AUK 12-20-Antikörpers

Transiente Expression in COS-Zellen

Der Expressionsvektor RVL-1220a für die neugeformte menschliche L-Kette des AUK 12-20-Antikörpers und der Expressionsvektor HEF-12 h-g-y-1 für die H-Kette des chimären 12-20- Antikörpers (Beispiel 5) wurden in COS-Zellen co-transfiziert, um die neugeformte menschliche L-Kette, Version "a", des AUK 12-20-Antikörpers zu testen. Hierfür wurden die COS-Zellen in einer Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung (PBS) bei einer Konzentration von 1 · 10&sup7; Zellen pro ml suspendiert, und zu 0,8 ml der Suspension wurden die Plasmid-DNAs (10 ug von jedem Plasmid) zugefügt. Sodann wurde die Suspension unter Verwendung einer Gene Pulser-Apparatur (Bio-Rad) mit Pulsen bei einer elektrischen Kapazität von 1900 V, 25 uF, bearbeitet.
Nach einer zehnminütigen Erholungsphase bei Raumtemperatur wurden die Zellen, bei denen eine Elektroporation durchgeführt worden war, zu 8 ml DMEM-Medium (GIBCO), das 10% Rinderserumalbumin enthielt, zugefügt. Nach 72 Stunden Inkubation wurde der Überstand abgenommen, zur Entfernung der Zelltrümmer zentrifugiert und unter keimfreien Bedingungen kurzfristig bei 4ºC oder langfristig bei -20ºC gelagert.

Bestimmung eines einem menschlichen Antikörper ähnlichen Antikörpers durch ELISA

Der Überstand der transfizierten COS-Zellen wurde durch ELISA getestet und die Produktion eines chimären Antikörpers bestätigt. Zum Nachweis eines einem menschlichen Antikörper ähnlichen Antikörpers wurde eine Platte mit einem Ziegen-Anti- Mensch-IgG (ganzes Molekül) (Sigma) beschichtet. Nach der Blockierung wurde der Überstand von den COS-Zellen sequentiell verdünnt und zu jeder Vertiefung zugefügt.
Die Platte wurde inkubiert und gewaschen und ein mit alkalischer Phosphatase konjugiertes Ziegen-Anti-Mensch-IgG (α- Kette-spezifisch, Sigma) zugefügt. Nach Inkubation und Waschen wurde eine Substratlösung zugegeben. Nach einer weiteren Inkubation wurde die Reaktion beendet und die optische Dichte bei 405 nm gemessen. Als Standard wurde gereinigtes IgG (Sigma) eingesetzt.

ELISA zur Bestätigung der Fähigkeit, an den menschlichen IL-6R zu binden

Der Überstand von den transfizierten COS-Zellen wurde durch ELISA getestet, wobei bestimmt wurde, ob der produzierte einem menschlichen Antikörper ähnliche Antikörper an das Antigen, den menschlichen IL-6R, binden kann. Eine Platte wurde mit dem monoclonalen Maus-Antikörper MT18 (Bezugsbeispiel 1) beschichtet. Nach der Blockierung mit 1% BSA wurde zu der Platte ein löslicher rekombinanter menschlicher IL-6R (SR344) zugegeben. Nach dem Waschen der Platte wurde der Überstand von den COS-Zellen sequentiell verdünnt und zu jeder Vertiefung der Platte zugefügt. Nach Inkubation und Waschen wurde ein mit alkalischer Phosphatase konjugiertes Ziegen-Anti-Mensch-IgG zu den Vertiefungen zugegeben und nach einer weiteren Inkubation und Waschen eine Substratlösung zugefügt. Nach der Inkubation wurde die Reaktion beendet und die optische Dichte bei 405 nm gemessen.
Ein Ergebnis ist in Fig. 17 dargestellt. Der einem menschlichen Antikörper ähnliche Antikörper, der eine Kombination einer neugeformten menschlichen L-Kette, Version "a", des AUK 12-20-Antikörpers und einer H-Kette des chimären 12-20-Antikörpers enthielt, zeigte die Fähigkeit, an den IL-6R zu binden, die genauso stark war wie die des chimären 12-20- Antikörpers. Die optische Dichte bei 405 nm änderte sich, abhängig von der Verdünnungsrate; dies bestätigt, daß die Probe einen Antikörper gegen IL-6R enthält. Außerdem zeigt dieses Ergebnis, daß die neugeformte menschliche L-Kette, Version "a", des AUK 12-20-Antikörpers eine Antigenbindungsaktivität besitzt, die genauso hoch ist wie die der L-Kette des chimären AUK 12-20-Antikörpers.

Beispiel 15 Konstruktion des Gens, das die neugeformte menschliche H-Kette des AUK 12-20-Antikörpers codiert, unter Verwendung der HSGI- Consensus-Sequenz

Nach dem gleichen Verfahren, wie in Beispiel 13 beschrieben, wurden die CDRs des V-Bereichs der H-Kette des AUK 12-20- Antikörpers in den neugeformten menschlichen VHa425 übertragen, der als FRs die HSGI-Consensus-Sequenzen enthielt (Kettleborough et al., Protein Engineering 4 (1991), 773-783). Zuerst wurde ein HindIII-BamHI-DNA-Fragment, das den neugeformten menschlichen VHa425 codierte (Fig. 3 in der Literatur), aus dem Plasmid HCMV-RVHa-425γ-γ-1 ausgeschnitten und an den HindIII-BamHI-Stellen in den pUC19-Vektor subcloniert, wodurch pUC-RVH-425a erhalten wurde, das sodann als Matrize eingesetzt wurde. Acht PCR-Primer (A1 bis H1) wurden synthetisiert. Der Primer 1220-H&sub1; wurde so gestaltet, daß er CDR1 überträgt und eine Mutation von T-28 zu S-28 induziert, und der Primer 1220-H3 wurde so gestaltet, daß er CDR3 überträgt und eine Mutation von S-94 zu R-94 induziert. Die Primer 1220- H1, 1220-H2 und 1220-H3 wurden vor der Verwendung unter Einsatz eines 12% Polyacrylamid-Gels, das 8 M Harnstoff enthielt, gereinigt. Die Nucleotidsequenzen der jeweiligen Primer sind wie folgt.
Die Bedingungen der PCR waren wie in Beispiel 13 beschrieben, mit der Ausnahme, daß pUC-RVH-425a als Matrizen-DNA und die vorstehend erwähnten Primer für die Übertragung der CDRs der H-Kette verwendet wurden. Die Primerpaare A1 und E1, B1 und F1, C1 und G1 sowie D1 und H1 wurden in den ersten PCR- Reaktionen eingesetzt, und die entsprechenden ersten PCR-Produkte, 186 bp (Al-E1), 75 bp (B1-F1), 173 bp (C1-G1) und 105 bp (D1-H1) wurden mit einem bei niedriger Temperatur schmelzenden 2,0% Agarose-Gel gereinigt und in der folgenden zweiten PCR-Kopplungsreaktion eingesetzt. Gemäß den in Beispiel 13 beschriebenen Bedingungen wurden zur Durchführung der zweiten PCR-Reaktion (einschließlich PCR-Kopplungsreaktion) jeweils 0,2 ug der ersten PCR-Produkte verwendet, wodurch ein PCR-Produkt mit 495 bp erhalten wurde, das DNA enthielt, die einen menschlichen V-Bereich einer H-Kette codierte, in den CDRs des V-Bereichs der H-Kette des Maus-AUK 12-20-Antikörpers übertragen worden waren, und das PCR-Produkt wurde unter Verwendung eines bei niedriger Temperatur schmelzenden 2,5% Agarose-Gels gereinigt. Nach Spaltung des PCR-Produktes mit BamHI und HindIII wurde das resultierende BamHI-HindIII-DNA-Fragment in den pUC19 subcloniert und sequenziert, wodurch pUC-RVH-1220a erhalten wurde.
Es wurde gefunden, daß die DNA-Sequenz, die den neugeformten menschlichen V-Bereich der H-Kette des AUK 12-20-Antikörpers codiert, eine Sequenz enthält, die gut mit einer Spleiß-Donor-Sequenz übereinstimmt, die das abnormale Spleißen bewirken könnte, das bei der Herstellung des neugeformten menschlichen PM-1-Antikörpers Probleme bereitete. Aus diesem Grund wurde diese DNA-Sequenz durch PCR modifiziert. Die mutagenen Primer SGI-SP1 (SEQ ID NO: 97) und SGI-SP2 (SEQ ID NO: 98) wurden synthetisiert. Diese Primer wandeln die DNA-Sequenz AAG GTG AGC in die DNA-Sequenz AAA GTC AGC um. Die Bedingungen der PCR-Reaktion waren wie vorstehend beschrieben, mit der Ausnahme, daß 50 ng von pUC-RVH-1220a als Matrizen-DNA und der SGI-SP1 und UNIVERSAL (SEQ ID NO: 82) oder der SGI-SP2 und RE- VERS (SEQ ID NO: 83) als Primer eingesetzt wurden.
Die PCR-Produkte aus zwei PCR-Reaktion wurden unter Verwendung eines bei niedriger Temperatur schmelzenden 2% Agarose-Gels gereinigt und in einer PCR-Kopplungsreaktion eingesetzt. Das PCR-Reaktionsgemisch von 98 jil, das jeweils 0,2 ug der ersten PCR-Produkte und 5 Einheiten Vent DNA-Polymerase enthielt, wurde für die Kopplungsreaktion zwei Minuten bei 94ºC, zwei Minuten bei 55ºC und fünf Minuten bei 72ºC inkubiert. Danach wurden jeweils 100 pMol der Primer UNIVERSAL und REVERS zum Reaktionsgemisch zugefügt, das sodann mit 50 ul Mineralöl überschichtet und 30 Zyklen der zweiten PCR-Reaktion unterworfen wurde, die aus Inkubationen von einer Minute bei 94ºC, einer Minute bei 50ºC und einer Minute bei 72ºC bestanden, anschließend folgte eine zehnminütige Inkubation bei 72ºC. Das in der zweiten PCR-Reaktion erhaltene DNA- Fragment mit 495 bp wurde unter Verwendung eines bei niedriger Temperatur schmelzenden 2,0% Agarose-Gels gereinigt, in den pUC19-Vektor subcloniert und sequenziert, wodurch pUC-RVH- 1220a-2 erhalten wurde.
Als nächstes wurde ein HindIII-BamHI-DNA-Fragment, das DNA enthielt, die den neugeformten menschlichen V-Bereich der H-Kette des AUK 12-20-Antikörpers codierte, aus dem pUC-RVH- 1220a-2 ausgeschnitten und in die HindII-BamHI-Stellen des Expressionsvektors der H-Kette HEF-12 h-g-γ-1 eingefügt, wodurch der Expressionsvektor RVH-1220a für die neugeformte menschliche H-Kette, Version "a", des AUK 12-20-Antikörpers erhalten wurde.
Für die Konstruktion der Gene, die den neugeformten menschlichen V-Bereich, Versionen "b" bis "d", der H-Kette des AUK 12-20-Antikörpers codieren, wurden zwei Paare von mutagenen Primern synthetisiert. Jede PCR-Reaktion wurde im wesentlichen unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, wie vorstehend beschrieben. Für die Konstruktion der Version "b" wurden in zwei ersten PCR-Reaktionen entweder der Primer UNIVERSAL (SEQ ID NO: 82) und der mutagene Primer 120H-ml (SEQ ID NO: 78) oder der Primer REVERS (SEQ ID NO: 83) und der mutagene Primer 1220H-m1b (SEQ ID NO: 79) und außerdem pUC-RVH-1220a als Matrize eingesetzt. Die ersten PCR-Produkte mit 202 bp und 323 bp wurden unter Verwendung eines bei niedriger Temperatur schmelzenden 2,0% Agarese Cele gereinigt und in der zweiten PCR (einschließlich PCR-Kopplungsreaktion) unter den gleichen Bedingungen eingesetzt, wie vorstehend beschrieben, wodurch ein 495 bp-Produkt (Version "b") erhalten wurde. Das Produkt wurde mit Hindlil und BamHI gespalten und in den pUC19-Vektor subcloniert, wodurch pUC-RVH-1220b erhalten wurde.
Genauso wurden die mutagenen Primer 1220H-m2 (SEQ ID NO: 80) und 1220H-m2b (SEQ ID NO: 81) sowie die Matrize pUC-RVH- 1220a in einer PCR eingesetzt, wodurch das PCR-Produkt (Version "c") erhalten wurde. Das Produkt wurde mit HindIII-BamHI gespalten und in die HindIII-BamHI-Stellen des pUCIS-Vektors eingefügt, wodurch pUC-RVH-1220c erhalten wurde. Außerdem wurden die mutagenen Primer 1220H-m1a (SEQ ID NO: 78) und 1220Hm1b (SEQ ID NO: 79) sowie die Matrize pUC-RVH-1220c eingesetzt, wodurch das PCR-Produkt (Version "d") erhalten wurde, das anschließend mit Hindlil und BamHI gespalten und in die Hindlnl-BamHI-Stellen des pUC19-Vektors eingefügt wurde, wodurch pUC-RVH-1220d erhalten wurde.
Zu beachten ist, daß die Aminosäuresequenz des neugeformten menschlichen V-Bereichs, Version "b", der H-Kette des AUK 12-20-Antikörpers und die hierfür codierende Nucleotidsequenz im Plasmid pUC-RVH-1220b in SEQ ID NO: 84 dargestellt sind; und daß die Aminosäuresequenz des neugeformten menschlichen V- Bereichs, Version "d", der H-Kette des AUK 12-20-Antikörpers und die hierfür codierende Nucleotidsequenz im Plasmid pUC- RVH-1220d in SEQ ID NO: 85 dargestellt sind.
Als nächstes wurden für die Konstruktion der Expressionsvektoren HindIII-BamHI-Fragmente, die einen neugeformten menschlichen V-Bereich der H-Kette des AUK 12-20-Antikörpers enthielten, aus dem pUC-RVH-1220b, pUC-RVH-1220c und pUC-RVH- 1220d ausgeschnitten und in die HindIII-BamHI-Stellen des Expressionsvektors der H-Kette HEF-12 h-g-γ-1 eingefügt, wodurch RVH-1220b, RVH-1220c bzw. RVH-1220d erhalten wurde.

Beispiel 16 Expression und Anal se von verschiedenen Versionen des neucreformten menschlichen AUK 12-20-Antikörpers

COS-Zellen wurden mit einem der vier Expressionvektoren für eine neugeformte menschliche H-Kette des AUK 12-20-Anti körpers (RVH-1220a, RVH-1220b, RVC-1220c oder RVH-1220d) und mit dem Expressionsvektor VRL-1220a co-transfiziert, um die vier Versionen des neugeformten menschlichen V-Bereichs der H- Kette des AUK 12-20-Antikörpers zu testen. Als Kontrolle wurden COS-Zellen mit Expressionsvektoren für die L-Kette und die H-Kette des chimären 12-20-Antikörpers (HEF-12 h-g-γ-1 und FEF- 12-gk) co-transfiziert. In dem Test auf Bindung an den menschlichen IL-6R zeigen ein neugeformter menschlicher AUK 12-20- Antikörper, der aus einer neugeformten menschlichen L-Kette des AUK 12-20-Antikörpers und einer neugeformten menschlichen H-Kette, Version "b", des AUK 12-20-Antikörpers besteht, und ein neugeformter menschlicher AUK 12-20-Antikörper, der aus einer neugeformten menschlichen L-Kette des AUK 12-20- Antikörpers und einer neugeformten menschlichen H-Kette, Version "d", des AUK 12-20-Antikörpers besteht, eine genauso gute Bindung wie der chimäre 12-20-Antikörper. Diese Ergebnisse sind in den Fig. 18 und 19 dargestellt.

Beispiel 17 Konstruktion eines Gens, das die neugeformte menschliche H-Kette des sle 1220- Antikörpers codiert, unter Verwendung des menschlichen Antikörpers HAX

Ein menschlicher Antikörper, der zu dem V-Bereich der H- Kette des monoclonalen Maus-Antikörpers AUK 12-20 die höchste Homologie aufweist, ist I-IAX (J. Immunology 139 (1987), 2496- 2501; ein Antikörper, der durch das von B-Zellen eines SLE-Patienten hergeleitete Hybridom 21/28 hergestellt wird; seine Aminosäuresequenz ist in Fig. 6 dargestellt, und die Nucleotidsequenz davon ist in den Fig. 4 und 5 der Literatur angegeben) gemäß der Protein-Datenbank "Leeds". Der neugeformte menschliche V-Bereich der H-Kette des sle 1220 H-Antikörpers wurde konstruiert, indem FRs des Antikörpers HAX und CDRs des V-Bereichs der H-Kette des monoclonalen Maus-Antikörpers AUK 12-20 verwendet wurden.
Die gesamte DNA, die den neugeformten menschlichen V-Bereich, Version "a", der H-Kette des sle 1220 H-Antikörpers codiert, wurde chemisch synthetisiert. Die DNA, die den V-Bereich der H-Kette des sle 1220 H-Antikörpers codiert und eine Gesamtlänge von 439 bp aufweist, wurde gestaltet, indem die DNA in sechs Oligonucleotidea mit einer Länge von 90 bis 94 bp aufgeteilt wurde, die sich gegenseitig mit 21 bp überlappten (sle 1220 h 1 bis 6; SEQ ID NO: 86 bis 91). Bei der Gestaltung der Oligonucleotide wurde die Sekundärstruktur getestet und bei Stellen, die strukturelle Probleme zeigten, das dritte Nucleotid in einem Codon so verändert, daß die dadurch codierte Aminosäure nicht verändert wurde. Die Beziehung dieser Oligonucleotide zueinander und das Verfahren zur Konstruktion der doppelsträngigen synthetischen DNA sind in Fig. 20 dargestellt.
Die in Fig. 20 dargestellte Reaktion wird unter Einsatz der PCR-Technik durchgeführt. Hierfür werden zur Durchführung der ersten PCR-Reaktion sechs synthetische Oligonucleotide in ein einziges PCR-Reaktionsröhrchen zugegeben, wodurch zwei Oligonucleotide aneliert und verlängert werden, und zusätzlich werden vier Oligonucleotide oder ein gesamtes Oligonucleotid erhalten.
Als nächstes werden zur Durchführung der zweiten PCR die terminalen Primer A (SEQ ID NO: 92) und B (SEQ ID NO: 93) zugegeben, wobei lediglich ein korrektes Oligonucleotid mit der gesamten Länge amplifiziert werden kann. Das resultierende Produkt wird mit BamHI und Hindlil gespalten und in den pUC19- Vektor subcloniert, anschließend folgte die Sequenzierung.
Genauer gesagt wurde ein Reaktionsgemisch von 98 ul, enthaltend 100 mM Tris-HCl (pH 8,5), 50 mM KCl, 0,1 mM dATP, 0,1 mM dGTP, 0,1 mM dCTP, 0,1 mM dTTP, 1,5 mM MgCl&sub2; und 2,5 U DNA- Polymerase AmpliTaq· (Perkin Eimer Cetus) und außerdem jeweils 5 pMol der Oligonucleotide, 1,5 Minuten bei 94ºC denaturiert und sodann drei Reaktionszyklen mit einer Inkubation von drei Minuten bei 92ºC, zwei Minuten bei 50ºC und fünf Minuten bei 72ºC unterworfen, hierauf folgte eine zehnminütige Inkubation bei 72ºC. Jeweils ein ul 50 mM terminalen Primer A und B wurde zum Reaktionsgemisch zugegeben, das sodann mit 80 ul Mineralöl überschichtet wurde, und das nach einer Denaturierung von 1,5 Minuten bei 94ºC 30 Reaktionszyklen mit einer Inkubation von einer Minute bei 94ºC, einer Minute bei 50ºC und einer Minute bei 72ºC unterworfen wurde, anschließend folgte eine zehnminütige Inkubation bei 72ºC. Das PCR-Produkt mit 439 bp wurde unter Verwendung eines bei niedriger Temperatur schmelzenden 1,5% Agarose-Gels gereinigt, mit den Restriktionsenzymen BamHI und Hindlil gespalten und in den pUC19-Vektor subcloniert, hierauf folgte die Bestätigung der Sequenz. Ein auf diese Weise erhaltener Clon wurde mit pUC-RVH-sle 1220Ha bezeichnet. Die Aminosäuresequenz des neugeformten menschlichen V-Bereichs, Version "a", der H-Kette des sle 1220 H-Antikörpers und das hierfür codierende Nucleotid im Plasmid pUC-RVH-sle 1220Ha, sind in SEQ ID NO: 94 dargestellt.
Danach wurde das HindIII-BamHI-DNA-Fragment, das ein Gen enthielt, das den neugeformten menschlichen V-Bereich der H- Kette des 12-20 (sel 1220H)-Antikörpers codierte, aus dem pUC- RVH-sle 1220Ha ausgeschnitten und in die HindIII-BamHI-Stellen des Expressionsvektors der H-Kette HEF-12 h-g-γ-1 eingefügt, wodurch RVH-sle 122011a erhalten wurde.
Für die Konstruktion der Versionen "b" bis "d" des neugeformten menschlichen V-Bereichs der H-Kette des sle 1220H-Antikörpers wurden die zwei mutagenen Primer sle 122011 ml (SEQ ID NO: 95) und sle 1220Hm² (SEQ ID NO: 96) synthetisiert. In jeder PCR-Reaktion wurden Vent DNA-Polymerase und die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches eingesetzt, wie in Beispiel 13 beschrieben. In jeder PCR-Reaktion wurde ein Reaktionsgemisch, das den pUC-RVH-sle 1220Ha als Matrize, 50 pMol des mutagenen Primers sle 1220Hml oder sle 1220Hm² und 50 pMol des terminalen Primers B enthielt, 1,5 Minuten bei 94ºC denaturiert und 30 Reaktionszyklen durch Inkubation von einer Minute bei 94ºC, einer Minute bei 50ºC und einer Minute bei 72ºC unterworfen, anschließend folgte eine zehnminütige Inkubation bei 72ºC. Das Produkt mit 235 bp oder 178 bp wurde unter Verwendung eines bei niedriger Temperatur schmelzenden 1,5% Agarose-Gels gereinigt, so daß es als Primer in der zweiten PCR-Reaktion eingesetzt werden konnte. Die zweite PCR-Reaktion erfolgte unter Verwendung von 50 pMol des terminalen Primers A, 0,2 ug des PCR-Produktes und pUC-RVH-sle 1220Ha als Matrize, und das resultierende Produkt von 439 bp wurde unter Verwendung eines bei niedriger Temperatur schmelzenden 1,5% Agarose-Gels gereinigt, mit BamHI und HindIII gespalten und in den pUC19-Vektor subcloniert, wodurch pUC-RVH-sle 122011b oder pUC-RVH-sle 1220Hc erhalten wurde, das den neugeformten menschlichen V-Bereich, Version "b" bzw. "c", der H-Kette des sle 1220-Antikörpers codiert.
Eine DNA, die den neugeformten menschlichen V-Bereich, Version "d", der H-Kette des sle 1220 H-Antikörpers codiert, wurde folgendermaßen konstruiert. Als Matrize wurde pUC-RVhsle 1220Hb eingesetzt. Jeweils 50 pMol des mutagenen Primers sle 1220Hb m² und des terminalen Primers B wurden eingesetzt und 30 Zyklen der ersten PCR-Reaktion durchgeführt. Das resultierende PCR-Produkt mit 176 bp wurde unter Verwendung eines bei niedriger Temperatur schmelzenden 1,6% Agarose-Gels gereinigt, so daß es als Primer in der zweiten PCR-Reaktion eingesetzt werden konnte. Dieser Primer und 50 pMol des terminalen Primers A wurden in der zweiten PCR eingesetzt, wodurch ein DNA-Fragment mit 439 bp erhalten wurde. Das auf diese Weise erhaltene PCR-Produkt wurde gereinigt, mit BamHI und HindIII gespalten und in den pUC19-Vektor subcloniert, wodurch pUC- RVH-sle 1220Hd erhalten wurde.
Als nächstes wurden zur Konstruktion der Expressionsvektoren für verschiedene Versionen des neugeformten menschlichen V-Bereichs der H-Kette des sle 1220H-Antikörpers BamHI- HindIII-Fragmente, die eine DNA enthielten, die den neugeformten menschlichen V-Bereich der H-Kette des sle 1220-Antikörpers codierte, aus pUC-RVH-sle 1220Hb, pUC-RVH-sle 122Hc und pUC-RVH-sle 1220Hd ausgeschnitten und in die HindIII-BamHI- Stellen auf dem Expressionsvektor der H-Kette HEF-12 h-g-γ-1 eingefügt, wodurch die Expressionsvektoren RVH-sle 1220Hb, RVH-sle 1220Hc bzw. RVH-sle 1220Hd erhalten wurde.
Jeweils einer der vier Vektoren, die die neugeformte menschliche H-Kette des sle 1220H-Antikörpers exprimieren (RVH-sle 1220Ha, RVH-sle 1220Hb, RVH-sle 1220Hc oder RVH-sle 1220Hd), und der Vektor RVL-1220a, der die neugeformte menschliche L-Kette des AUK 12-20-Antikörpers exprimiert, wurden in COS-Zellen co-transfiziert, um die vier Versionen des neugeformten menschlichen V-Bereichs der H-Kette des sle 1220H-Antikörpers auf die Fähigkeit zu testen, die Bindung von IL-6 an IL-6R zu hemmen. Die Ergebnisse sind in den Fig. 21 bis 24 dargestellt. Zu beachten ist, daß diese Ergebnisse nach einer Reinigung der produzierten Antikörper durch Protein A erhalten wurden.
Wie aus dem Vorstehenden ersichtlich ist, kann gemäß der vorliegenden Erfindung in einer chimären L-Kette oder in einer neugeformten menschlichen L-Kette oder in einer chimären H- Kette oder in einer neugeformten menschlichen H-Kette und insbesondere in RF eine oder mehr als eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure ersetzt werden, wobei die Fähigkeit zur Bindung an den menschlichen IL-6R erhalten bleibt. Aus diesem Grund umfaßt die vorliegende Erfindung einen chimären Antikörper und einen neugeformten menschlichen Antikörper, eine chimäre L-Kette und eine neugeformte menschliche L-Kette, eine chimäre H-Kette und eine neugeformte menschliche H-Kette, einen neugeformten V-Bereich einer L-Kette und einen neugeformten V-Bereich einer H-Kette, wobei eine oder mehr als eine Aminosäure durch eine andere ersetzt ist, und außerdem DNA, die hierfür codiert, soweit sie ihre natürlichen Eigenschaft beibehalten.
Die in der vorliegenden Erfindung als Ausgangsmaterial eingesetzten Hybridome wurden folgendermaßen konstruiert.

Bezugsbeispiel 1 Konstruktion des Hvbridoms MT18

Zur Konstruktion eines Hybridoms, das einen monoclonalen Antikörper gegen den menschlichen IL-6R herstellt, wurde als Immunogen eine Maus-T-Zellinie, die auf der Zelloberfläche den menschlichen IL-6R exprimiert, folgendermaßen konstruiert. Hierfür wurden das Plasmid pBSF2R.236, das in der Japanischen Patentanmeldung Nr. H1-9774 beschrieben wird, und pSV2neo in eine Maus-T-Zellinie CTLL-2 (ATCC TIB214) nach einem herkömmlichen Verfahren transfiziert und die resultierende Transformante unter Verwendung von G418 nach einem herkömmlichen Verfahren abgesucht, wodurch eine Zellinie erhalten wurde, die etwa 30000 IL-6Rs pro Zelle exprimierte. Diese Zellinie wurde mit CTBC3 bezeichnet.
Die CTBC3-Zellen wurden in RPMI 1640 nach einem herkömmlichen Verfahren gezüchtet, die gezüchteten Zellen wurden viermal mit PBS-Puffer gewaschen, und 1 · 10&sup7; Zellen wurden in C57BL/6-Mäuse zur Immunisierung intraperitoneal injiziert. Die Immunisierung erfolgte einmal pro Woche sechs Wochen lang.
Milzzellen wurden aus den immunisierten Mäusen entnommen und mit Myelom P3U1-Zellen fusioniert, wobei Polyethylenglykol gemäß einem herkömmlichen Verfahren eingesetzt wurde, und die fusionierten Zellen wurden folgendermaßen abgesucht. Die IL- 6R-negative menschliche T-Zellinie JURKAT (ATCC CRL 8163) wurde mit den Plasmiden pBSF2R.236 und pSV2neo co-transfiziert, und die transformierten Zellen wurden abgesucht, wodurch eine Zellinie erhalten wurde, die etwa 100000 IL-6Rs pro Zelle exprimierte. Die Zellinie wurde mit NJBC8 bezeichnet. Ein Hybridom-Zellclon, der einen Antikörper produzierte, der NP40- lysierte NJBC8 erkannte, der jedoch NP40-lysierte JURKAT nicht erkannte, wurde cloniert und mit MT18 bezeichnet. Das Hybridom MT18 wurde beim Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology (FR1) unter dem Budapester Vertrag am 10. Juli 1990 als FERM BP-2999 hinterlegt.

Bezugsbeisniel 2 Konstruktion des Hybridoms PM1

Zur Konstruktion eines Hybridoms, das einen monoclonalen Antikörper gegen den als Antigen eingesetzten IL-6R herstellt, wurde der menschliche IL-6R folgendermaßen extrahiert. 3 · 109 menschliche Myelom U266-Zellen (IL-6R-produzierende Zellen) wurden in 1 ml von 1% Digitonin, 10 mM Triethanolamin-Puffer (pH 7,4), 0,15 M NaCl und 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid; Wako Pure Chemicals) lysiert. Andererseits wurde der durch das im Bezugsbeispiel 1 hergestellte Hybridom MT18 produzierte Antikörper MT18 nach einem herkömmlichen Verfahren an Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia) gebunden. Diese MT18-Antikörperkonjugierte Sepharose 4B wurde mit dem vorstehend hergestellten Zellysat gemischt, wodurch der solubilisierte IL-6R an den MT18-Antikörper auf der Sepharose 4B gebunden wurde. Substanzen, die nicht-spezifisch an die Sepharose 4B gebunden waren, wurden abgewaschen, und der IL-6R, der über den MT18-Antikörper an die Sepharose 4B gebunden war, wurde als Immunogen eingesetzt.
BALB/c-Mäuse wurden mit dem vorstehend hergestellten Immunogen einmal die Woche vier Wochen lang intraperitoneal immunisiert. Als nächstes wurden die Milzzellen aus den immunisierten Mäusen entnommen und mit den Myelomzellen P3U1 gemäß einem herkömmlichen Verfahren fusioniert, wobei Polyethylen glykol eingesetzt wurde. Die fusionierten Zellen wurden folgendermaßen abgesucht. Zuerst wurden ein Kulturüberstand und 0,01 ml Protein G-Sepharose (Pharmacia) gemischt, um das Immunglobulin im Überstand an die Protein G-Sepharose zu adsorbieren. Andererseits wurden 107 U266-Zellen, die mit 355-Methionin innerlich markiert waren, lysiert, und der IL-6R wurde unter Verwendung der MT18-konjugierten Sepharose 4B affinitätegereinigt. Danach wurde der mit 355-Methionin markierte IL-6R mit der vorstehend hergestellten Protein G-Sepharose, an die ein Immunglobulin gebunden worden war, immungefällt und der Niederschlag durch SDS/PAGE analysiert. Als Ergebnis wurde ein Hybridomclon isoliert, der einen Antikörper produzierte, der spezifisch an den IL-6R band, und er wurde mit PM1 bezeichnet. Das Hybridom PM1 wurde beim FR1 unter dem Budapester Vertrag am 10. Juli 1990 als FERM BP-2998 hinterlegt.

Bezugsbeispiel 3 Konstruktion der Hybridome AUK12-20, AUK64-7 und AUK146-15

Als Immunogen wurde ein löslicher IL-6R (SR344) gemäß dem Verfahren hergestellt, das von Yasukawa, K., et al., J. Biochem. 108 (1990), 673-676, beschrieben wird. Hierfür wurde das Plasmid pECEdhfr 344, das eine den IL-6R codierende cDNA enthielt, wobei das 345. Codon vom N-Terminus aus durch ein Stop- Codon ersetzt worden war, in CHO (5E27)-Zellen transfiziert, die transfizierten Zellen wurden in einem serumfreien Medium (SF-O-Medium, Sanko Junyaku) gezüchtet, und der resultierende Überstand wurde mit einem HF-Labl-System (Tosoh) eingeengt und anschließend durch eine Blue-5PW-Säule und eine Phenyl-5PW- Säule gereinigt. Der gereinigte lösliche IL-6R ergab in der SDS-PAGE eine einzelne Bande.
Eine weibliche BALB/cAnNCrj-Maus (Nippon CREA) erhielt eine subkutane Injektion mit 10 ug/Maus des Immunogens in komplettem Freundschem Adjuvans (Bacto Adjuvant Complete H 37 Ra, Difco), anschließend folgten die zweite und die dritte Injektion der gleichen Menge des Immunogens in inkomplettem Freundschem Adjuvans (Bacto Adjuvant Incomplete Freund, Difco) zwei bzw. drei Wochen nach der ersten Injektion. Eine letzte Immunisierung (die vierte Injektion) erfolgte ohne Adjuvans in die Schwanzvene eine Woche nach der dritten Injektion. Aus der im munisierten Maus wurde eine Serumprobe hergestellt, seriell mit einem Verdünnungspuffer verdünnt und durch ELISA gemäß dem von Goldsmith, P. K., Analytical Biochemistry 117 (1981), 53- 60, beschriebenen Verfahren getestet. Hierzu wurde eine mit SR344 (0,1 u/ml) beschichtete Platte mit 1% BSA blockiert und die verdünnte Probe zugegeben. Das an den 5R344 gebundene Maus-IgG wurde gemessen, indem Ziegen-Anti-Maus-IgG/alkalische Phosphatase (A/P) (ZYMED) und ein Substrat für alkalische Phosphatase (Sigma-104) eingesetzt wurden.
Nachdem ein Anstieg des Anti-SR344-Antikörpers im Serum bestätigt worden war, wurden aus fünf BALB/c-Mäusen drei Tage nach der letzten Immunisierung Milzzellen entnommen. Die Milzzellen und die Myelomzellen (P3U1) wurden in einem Verhältnis von 25 : 1 gemischt, unter Verwendung von PEG1500 fusioniert und in 2000 Vertiefungen bei einer Zellkonzentration von 0,7 bis 1, 1 · 10&sup6; Zellen pro Vertiefung gezüchtet. Die Überstände aus den Vertiefungen wurden abgesucht auf die Fähigkeit, den SR344 zu binden (das erste Absuchen wurde als R344-Erkennungstest bezeichnet), und auf die Fähigkeit, eine Bindung von 5R344 an Interleukin-6 zu hemmen, wobei ein IL-6/sIL-6R-Bindungs-Hemm- Test (RBIA) eingesetzt wurde. Das erste Absuchen ergab 240 positive Vertiefungen, und das zweite Absuchen stellte 36 positive Vertiefungen bereit.
Der vorstehend erwähnte R344-Erkennungstest wurde folgendermaßen durchgeführt. Eine mit Ziegen-Anti-Maus-Ig (Cappel) (1 ug/ml) beschichtete Platte (MaxiSorp, Nung) wurde mit 1% BSA blockiert, und 100 pl/Vertiefung des Hybridomkulturüberstandes wurden zugegeben, anschließend folgte eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur. Nach dem Waschen der Platte wurden zu jeder Vertiefung 20 gg/ml SR344 zugefügt und die Platte eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Menge des 5R344, die durch den aus dem Überstand stammenden, immobilisierten Antikörper festgehalten wurde, wurde bestimmt, indem Kaninchen-Anti-SR344-IgG (#2, 5,ug/ml), Ziegen-Anti-Kaninchen- IgG-alkalische Phosphatase (A/P) (1 : 3000, Tago) und das Substrat (1 mg/ml, Sigma-104) zugegeben und anschließend die optische Dichte bei 405 bis 600 nm gemessen wurde.
Der vorstehend erwähnte RBIA wurde folgendermaßen durchgeführt. Die mit dem MT18-Antikörper beschichtete Platte wurde mit 100 ug/ml SR344 (100 ul/Vertiefung) gefüllt und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen der Platte wurden zu jeder Vertiefung gleichzeitig 50 ul/Vertiefung des Hybridomüberstandes und 50 ug/Vertiefung des Biotin-Interleukin-6-Konjugates (20 ug/ml) zugefügt und die Vertiefungen eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Menge des an SR344 gebundenen Biotin-IL-6 wurde gemessen, indem Streptavidin-A/P (1 : 7000, PIERCE) und das entsprechende Substrat (Sigma-104) zugegeben und anschließend die optische Dichte bei 405 bis 600 nm gemessen wurde.
Schließlich wurden die positiven Clone durch ein zweimal wiederholtes limitierendes Verdünnungsverfahren gereinigt und drei Hybridomclone erhalten, d. h. AUK12-20, AUK145-15 und AUK64-7, welche die Bindung von SR344 an IL-6 hemmen, und ein Hybridomclon, AUK181-6, welcher die Bindung von SR344 an IL-6 nicht hemmt.

Industrielle Anwendbarkeit

Die vorliegende Erfindung stellt einen neugeformten menschlichen Antikörper gegen den menschlichen IL-6R bereit, umfassend einen menschlichen Antikörper, wobei die CDRs der menschlichen V-Bereiche durch die CDRs eines monoclonalen Maus-Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R ersetzt sind, wie in den Patentansprüchen definiert. Da der Hauptteil des neugeformten menschlichen Antikörpers von einem menschlichen Antikörper den Maus-CDRs stammt, die weniger antigen sind, ist der vorliegende neugeformte menschliche Antikörper für den Menschen weniger immunogen und deshalb für einen therapeutischen Einsatz vielversprechend.
Bezugnahme auf hinterlegte Mikroorganismen nach der Bestimmung 13-2 des Budapester Vertrags
Hinterlegungsstelle: National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited
Adresse: 23 St Macher Drive, Aberdeen AB2 IRY, Großbritannien
Hinterlegungsstelle: Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology Adresse: 103, Higashi 1-chome Tsukuba-shi Ibaraki, Japan

Sequenznrotokoll

SEQ ID NO: 1
SEQUENZLÄNGE: 40
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ACTACTCGAC ATCAAGTTGC CTGTTAGGCT GTTGGTGCTG 40
SEQ ID NO: 2
SEQUENZLÄNGE: 39
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ACTAGTCGAC ATCGAGWCAG ACACACTCCT GYTATGGGT 39
SEQ ID NO: 3
SEQUENZLÄNGE: 40
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ACTAGTCGAC ATGAGTGTGC TCACTCAGGT CCTGGSGTTG 40
SEQ ID NO: 4
SEQUENZLÄNGE: 43
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ACTAGTCGAC ATGAGGRCCC CTGCTCAGWT TYTTGGMWTC TTG 43
SEQ ID NO: 5
SEQUENZLÄNGE: 40
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ACTAGTCGAC ATGGATTTWC AGGTGCAGAT TWTCAGCTTC 40
SEQ ID NO: 6
SEQUENZLÄNGE: 37
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ACTAGTCCAC ATCAGGTKCY YTGYTSAGYT YCTGRGG 37
SEQ ID NO: 7
SEQUENZLÄNGE: 41
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ACTAGTCGAC ATGGGCWTCA ACATGGAGTC ACAKWYYCWG G 41
SEQ ID NO: 8
SEQUENZLÄNGE: 41
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ACTAGTCGAC ATGTGGGGAY CTKTTTYCMM TTTTTCAATT G 41
SEQ ID NO: 9
SEQUENZLÄNGE: 35
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ACTAGTCGAC ATGGTRTCCW CASCTCAGTT CCTTG 35
SEQ ID NO: 10
SEQUENZLÄNGE: 37
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ACTAGTCGAC ATGTATATAT GTTTGTTGTC TATTTCT 37
SEQ ID NO: 11
SEQUENZLÄNGE: 38
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ACTAGTCGAC ATGGAAGCCC CAGCTCAGCT TCTCTTCC 38
SEQ ID NO: 12
SEQUENZLÄNGE: 27
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
GGATCCCGGC TGGATGGTGG GAAGATG 27
SEQ ID NO: 13
SEQUENZLÄNGE: 37
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ACTAGTCGAC ATGAAATGCA GCTGGGTCAT STTCTTC 37
SEQ ID NO: 14
SEQUENZLÄNGE: 36
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ACTAGTCGAC ATGGGATGGA GCTRTATCAT SYTCTT 36
SEQ ID NO: 15
SEQUENZLÄNGE: 37
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ACTACTCGAC ATGAAGWTGT GGTTAAACTG GGTTTTT 37
SEQ ID NO: 16
SEQUENZLÄNGE: 35
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ACTAGTCGAC ATGRACTTTG GGYTCAGCTT GRTTT 35
SEQ ID NO: 17
SEQUENZLÄNGE: 40
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ACTAGTCGAC ATGGACTCCA GCCTCAATTT AGTTTTCCTT 40
SEQ ID NO: 18
SEQUENZLÄNGE: 37
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ACTAGTCGAC ATGGCTGTCY TRGSGCTRCT CTTCTGC 37
SEQ ID NO: 19
SEQUENZLÄNGE: 36
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ACTAGTCGAC ATGGRATGGA GCKGGRTCTT TMTCTT 36
SEQ ID NO: 20
SEQUENZLÄNGE: 33
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ACTAGTCGAC ATGAGAGTGC TGATTCTTTT GTG 33
SEQ ID NO: 21
SEQUENZLÄNGE: 40
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ACTAGTCGAC ATGGMTTGGG TGTGGAMCTT GCTATTCCTG 40
SEQ ID NO: 22
SEQUENZLÄNGE: 37
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ACTAGTCGAC ATGGGCAGAC TTACATTCTC ATTCCTG 37
SEQ ID NO: 23
SEQUENZLÄNGE: 28
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
GGATCCCGGG CCAGTCGATA GACAGATG 28
SEQ ID NO: 24
SEQUENZLÄNGE: 393
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Doppelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: cDNA
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
ORGANISMUS: Maus
UNMITTELBARE HERKUNFT:
CLON: p12-k2
MERKMALE: 1 bis 60 Signalpeptid 61 bis 393 reifes Peptid SEQUENZ:
SEQ ID NO: 25
SEQUENZLÄNGE: 405
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Doppelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: cDNA
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
ORGANISMUS: Maus
UNMITTELBARE HERKUNFT:
CLON: p12-h2
MERKMALE: 1 bis 57 Signalpeptid 58 bis 405 reifes Peptid SEQUENZ:
SEQ ID NO: 26
SEQUENZLÄNGE: 381
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Doppelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: cDNA
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
ORGANISMUS: Maus
UNMITTELBARE HERKUNFT:
CLON: pPM-k3
MERKMALE: 1 bis 60 Signalpeptid 61 bis 381 reifes Peptid SEQUENZ:
SEQ ID NO: 27
SEQUENZLÄNGE: 411
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Doppelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: cDNA
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
ORGANISMUS: Maus
UNMITTELBARE HERKUNFT:
CLON: pPM-h1
MERKMALE: 1 bis 54 Signalpeptid 55 bis 411 reifes Peptid SEQUENZ:
SEQ ID NO: 28
SEQUENZLÄNGE: 393
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Doppelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: cDNA
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
ORGANISMUS: Maus
UNMITTELBARE HERKUNFT:
CLON: p64-k4
MERKMALE: 1 bis 60 Signalpeptid 61 bis 393 reifes Peptid SEQUENZ:
SEQ ID NO: 29
SEQUENZLÄNGE: 417
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Doppelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: cDNA
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
ORGANISMUS: Maus
UNMITTELBARE HERKUNFT:
CLON: p64-h2
MERKMALE: 1 bis 57 Signalpeptid 58 bis 417 reifes Peptid SEQUENZ:
SEQ ID NO: 30
SEQUENZLÄNGE: 381
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Doppelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: cDNA
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
ORGANISMUS: Maus
UNMITTELBARE HERKUNFT:
CLON: p146-k3
MERKMALE: 1 bis 60 Signalpeptid 61 bis 381 reifes Peptid SEQUENZ:
SEQ ID NO: 31
SEQUENZLÄNGE: 402
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Doppelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: cDNA
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
ORGANISMUS: Maus
UNMITTELBARE HERKUNFT:
CLON: p146-h1
MERKMALE: 1 bis 51 Signalpeptid 52 bis 402 reifes Peptid SEQUENZ:
SEQ ID NO: 32
SEQUENZLÄNGE: 35
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ: 35
ACAAAGCTTC CACCATGGAG TCAGACACAC TCCTG 35
SEQ ID NO: 33
SEQUENZLÄNGE: 36
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
GCCTAAGCTT CCACCATGGG ATGGAGCGGG ATCTTT 36
SEQ ID NO: 34
SEQUENZLÄNGE: 35
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
CTTGGATCCA CTCACGTTTT ATTTCCAGCT TGGTC 35
SEQ ID NO: 35
SEQUENZLÄNGE: 36
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
GTTGGATCCA CTCACCTGCA GAGACAGTTA CCAGAG 36
SEQ ID NO: 36
SEQUENZLÄNGE: 35
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
CTGGATCCA CTCACGAT TT ATTTCCAGCT TGGTC 35
SEQ ID NO: 37
SEQUENZLÄNGE: 35
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
CTTGGATCCA CTCACGTTTT ATTTCCAGCT TGGTC 35
SEQ ID NO: 38
SEQUENZLÄNGE: 36
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ACAAAGCTTC CACCATGGTG TCCTCAGCTC AGTTCC 36
SEQ ID NO: 39
SEQUENZLÄNGE: 39
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
TGTTAGATCT ACTCACCTGA GGAGACAGTG ACTGAGGTT 39
SEQ ID NO: 40
SEQUENZLÄNGE: 36
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
CTCTAAGCTT CCACCATGAG AGTGCTGATT CTTTTG 36
SEQ ID NO: 41
SEQUENZLÄNGE: 17
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
TACGCAAACC GCCTCTC 17
SEQ ID NO: 42
SEQUENZLÄNGE: 18
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
GAGTGCACCA TATGCGGT 18
SEQ ID NO: 43
SEQUENZLÄNGE: 55
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ACCGTGTCTG GCTACACCTT CACCAGCGAT CATGCCTGGA GCTGGGTGAG ACAGC 55
SEQ ID NO: 44
SEQUENZLÄNGE: 63
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
TGAGTGGATT GGATACATTA GTTATAGTGG AATCACAACC TATAATCCAT 50
CTCTCAAATC CAG 63
SEQ ID NO: 45
SEQUENZLÄNGE: 54
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
TATTATTGTG CAAGATCCCT AGCTCGGACT ACGGCTATGG ACTACTGGGG TCAA 54
SEQ ID NO: 46
SEQUENZLÄNGE: 27
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
GTGACAATGC TGACAGACAC CAGCAAG 27
SEQ ID NO: 47
SEQUENZLÄNGE: 24
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
GGTGTCCACT CCGATGTCCA ACTG 24
SEQ ID NO: 48
SEQUENZLÄNGE: 27
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
GGTCTTGAGT GGATGGGATA CATTAGT 27
SEQ ID NO: 49
SEQUENZLÄNGE: 29
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA
SEQUENZ: 29
GTGTCTGGCT ACTCAATTAC CAGCATCAT 29
SEQ ID NO: 50
SEQUENZLÄNGE: 48
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
TGTAGAGCCA GCCAGGACAT CAGCAGTTAC CTGAACTGGT ACCAGCAG 48
SEQ ID NO: 51
SEQUENZLÄNGE: 42
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ATCTACTACA CCTCCAGACT GCACTCTGGT GTGCCAAGCA GA 42
SEQ ID NO: 52
SEQUENZLÄNGE: 50
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ACCTACTACT GCCAACAGGG TAACACGCTT CCATACACGT TCGGCCAAGG 50
SEQ ID NO: 53
SEQUENZLÄNGE: 27
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ: 27
AGCGGTACCG ACTACACCTT CACCATC 27
SEQ ID NO: 54
SEQUENZLÄNGE: 706
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Doppelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
ORGANISMUS: Maus und Mensch
UNMITTELBARE HERKUNFT:
CLON: pUC-RVh-PM1f
MERKMALE: Gen, das den V-Bereich, Version (f), der H-Kette des neugeformten menschlichen PM-1-Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R codiert
Aminosäure -20 bis -1 Leader Aminosäure 1 bis 30 FR1 Aminosäure 31 bis 36 CDR1 Aminosäure 37 bis 50 FR2 Aminosäure 51 bis 66 CDR2 Aminosäure 67 bis 98 FR3 Aminosäure 99 bis 108 CDR3 Aminosäure 109 bis 119 FR4 Nucleotid 1 bis 6 HindIII-Stelle Nucleotid 54 bis 135 Intron Nucleotid 258 bis 348 Intron/anomales Spleißen Nucleotid 505 bis 706 Intron Nucleotid 701 bis 706 BamHI-Stelle SEQUENZ:
SEQ ID NO: 55
SEQUENZLÄNGE: 506
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Doppelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
ORGANISMUS: Maus und Mensch
UNMITTELBARE HERKUNFT:
CLON: pUC-RV1-PM1a
MERKMALE: Gen, das den V-Bereich, Version (a), der L-Kette des neugeformten menschlichen PM-1-Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R codiert
Aminosäure -20 bis -1 Leader Aminosäure 1 bis 23 FR1 Aminosäure 24 bis 34 CDR1 Aminosäure 35 bis 49 FR2 Aminosäure 50 bis 56 CDR2 Aminosäure 57 bis 88 FR3 Aminosäure 89 bis 97 CDR3 Aminosäure 98 bis 117 FR4 Nucleotid 1 bis 6 HindIII-Stelle Nucleotid 54 bis 135 Intron Nucleotid 268 bis 376 Intron/anomales Spleißen Nucleotid 469 bis 506 Intron Nucleotid 501 bis 506 BamHI-Stelle SEQUENZ:
SEQ ID NO: 56
SEQUENZLÄNGE: 438
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Doppelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
ORGANISMUS: Maus und Mensch
UNMITTELBARE HERKUNFT:
CLON: pUC-RVh-PM1f-4
MERKMALE: Gen, ausschließlich Introns, das den V-Bereich, Version (f), der H-Kette des neugeformten menschlichen PM-1-Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R codiert
Aminosäure -20 bis -1 Leader Aminosäure 1 bis 30 FR1 Aminosäure 31 bis 36 CDR1 Aminosäure 37 bis 50 FR2 Aminosäure 51 bis 66 CDR2 Aminosäure 67 bis 98 FR3 Aminosäure 99 bis 108 CDR3 Aminosäure 109 bis 119 FR4 Nucleotid 1 bis 6 HindIII-Stelle Nucleotid 432 bis 438 BamHI-Stelle SEQUENZ:
SEQ ID NO: 57
SEQUENZLÄNGE: 402
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Doppelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
ORGANISMUS: Maus und Mensch
UNMITTELBARE HERKUNFT:
CLON: pUC-RV1-PM1a
MERKMALE: Gen, ausschließlich Introns, das den V-Bereich, Version (a), der L-Kette des neugeformten menschlichen PM-1-Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R codiert
Aminosäure -1 bis -19 Leader Aminosäure 1 bis 23 FR1 Aminosäure 24 bis 34 CDR1 Aminosäure 35 bis 49 FR2 Aminosäure 50 bis 56 CDR2 Aminosäure 57 bis 88 FR3 Aminosäure 89 bis 97 CDR3 Aminosäure 98 bis 107 FR4 Nucleotid 1 bis 6 HindIll-Stelle Nucleotid 397 bis 402 BamHI-Stelle SEQUENZ:
SEQ ID NO: 58
SEQUENZLÄNGE: 36
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
TAAGGATCCA CTCACCTGAG GACACTGTGA CGAGGC 36
SEQ ID NO: 59
SEQUENZLÄNGE: 32
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ATCAAGCTTC CACCATGCGA TGGAGCTGTA TC 32
SEQ ID NO: 60
SEQUENZLÄNGE: 30
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
AATGGATCCA CTCACGTTTG ATTTCCACCT 30
SEQ ID NO: 61
SEQUENZLÄNGE: 33
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
CATGCCTGGA GCTGGGTTCG CCAGCCACCT GGA 33
SEQ ID NO: 62
SEQUENZLÄNGE: 33
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
TCCAGGTGGC TGGCGAACCC AGCTCCAGGC ATG 33
SEQ ID NO: 63
SEQUENZLÄNGE: 30
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
CAGCAGAAGC CAGGAAAGGC TCCAAAGCTC 30
SEQ ID NO: 64
SEQUENZLÄNGE: 30
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
CAGCTTTGGA GCCTTTCCTG GCTTCTGCTG 30
SEQ ID NO: 65
SEQUENZLÄNGE: 66
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ACCTGTAGAG CCAGCAAGAG TGTTACTACA TCTGGCTATA GTTATATGCA 50
CTGGTACCAG CAGAAG 66
SEQ ID NO: 66
SEQUENZLÄNGE: 15
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
GCTGGCTCTA CAGGT 15
SEQ ID NO: 67
SEQUENZLÄNGE: 48
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
AAGCTCCTGA TCTACCTTCC ATCCACCCTG GAATCTGGTG TGCCAAGC 48
SEQ ID NO: 68
SEQUENZLÄNGE: 15
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
GTAGATCAGC AGCTT 15
SEQ ID NO: 69
SEQUENZLÄNGE: 48
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
GCTACCTACT ACTGCCAGCA CAGTAGGGAG ACCCCATACA CGTTCGGC 48
SEQ ID NO: 70
SEQUENZLÄNGE: 15
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
CTGGCAGTAG GTAGC 15
SEQ ID NO: 71
SEQUENZLÄNGE: 414
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Doppelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
ORGANISMUS: Maus und Mensch
UNMITTELBARE HERKUNFT:
CLON: pUC-RV1-1220a
MERKMALE: Gen, ausschließlich Introns, das den V-Bereich, Version (a), der L-Kette des neugeformten menschlichen AUK 12-20-Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R codiert
Aminosäure -19 bis -1 Leader Aminosäure 1 bis 23 FR1 Aminosäure 24 bis 38 CDR1 Aminosäure 39 bis 53 FR2 Aminosäure 54 bis 60 CDR2 Aminosäure 61 bis 92 FR3 Aminosäure 93 bis 101 CDR3 Aminosäure 102 bis 111 FR4 Nucleotid 1 bis 6 HindIII-Stelle Nucleotid 408 bis 414 BamHI-Stelle SEQUENZ:
SEQ ID NO: 72
SEQUENZLÄNGE: 45
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
GGTTATTCAT TCACTAGTTA TTACATACAC TCGGTTAGAC AGGCC 45
SEQ ID NO: 73
SEQUENZLÄNGE: 27
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
AGTGAATGAA TAACCGCTAG CTTTACA 27
SEQ ID NO: 74
SEQUENZLÄNGE: 69
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
GAGTGGGTGG GCTATATTGA TCCTTTCAAT GGTGGTACTA GCTATAATCA 50
GAAGTTCAAG GGCAGGGTT 69
SEQ ID NO: 75
SEQUENZLÄNGE: 15
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ATAGCCCACC CACTC 15
SEQ ID NO: 76
SEQUENZLÄNGE: 36
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
GGGGGTAACC GCTTTGCTTA CTGGGGACAG GGTACC 36
SEQ ID NO: 77
SEQUENZLÄNGE: 36
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
AGCAAAGCGG TTACCCCCTC TGGCGCAGTA GTAGAC 36
SEQ ID NO: 78
SEQUENZLÄNGE: 30
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
CAAGGTTACC ATGACCGTGG ACACCTCTAC 30
SEQ ID NO: 79
SEQUENZLÄNGE: 30
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
CACGGTCATG GTAACCTTGC CCTTGAACTT 30
SEQ ID NO: 80
SEQUENZLÄNGE: 30
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
GGGCTCGAAT GGATTGGCTA TATTGATCCT 30
SEQ ID NO: 81
SEQUENZLÄNGE: 30
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ACGATCAATA TAGCCAATCC ATTCGAGCCC 30
SEQ ID NO: 82
SEQUENZLÄNGE: 16
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
GTAAAACGAG GCCAGT 16
SEQ ID NO: 83
SEQUENZLÄNGE: 17
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
AACAGCTATG ACCATGA 17
SEQ ID NO: 84
SEQUENZLÄNGE: 433
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Doppelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
ORGANISMUS: Maus und Mensch
UNMITTELBARE HERKUNFT:
CLON: pUC-RVh-1220b
MERKMALE: Gen, ausschließlich Intron, das den V-Bereich, Version (b), der H-Kette des neugeformten menschlichen AUK 12-20-Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R codiert
Aminosäure -19 bis -1 Leader Aminosäure 1 bis 35 FR1 Aminosäure 31 bis 35 CDR1 Aminosäure 36 bis 49 FR2 Aminosäure 50 bis 66 CDR2 Aminosäure 67 bis 98 FR3 Aminosäure 99 bis 105 CDR3 Aminosäure 106 bis 116 FR4 Nucleotid 1 bis 6 HindIII-Stelle Nucleotid 427 bis 433 BamHI-Stelle SEQUENZ:
SEQ ID NO: 85
SEQUENZLÄNGE: 433
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Doppelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
ORGANISMUS: Maus und Mensch
UNMITTELBARE HERKUNFT:
CLON: pUC-RVh-1220d
MERKMALE: Gen, ausschließlich Intron, das den V-Bereich, Version (d), der H-Kette des neugeformten menschlichen AUK 12-20-Antikörpers gegen den menschlichen IL-6R codiert
Aminosäure -19 bis -1 Leader Aminosäure 1 bis 30 FR1 Aminosäure 31 bis 35 CDR1 Aminosäure 36 bis 49 FR2 Aminosäure 50 bis 66 CDR2 Aminosäure 67 bis 98 FR3 Aminosäure 99 bis 105 CDR3 Aminosäure 106 bis 116 FR4 Nucleotid 1 bis 6 HindIII-Stelle Nucleotid 427 bis 433 BamHI-Stelle SEQUENZ:
SEQ ID NO: 86
SEQUENZLÄNGE: 90
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA
SEQUENZ:
GATAAGCTTG CCGCCACCAT GGACTGGACC TGGAGGGTCT TCTTCTTGCT 50
GGCTGTAGCT CCAGGTGCTC ACTCCCAGGT GCAGCTTGTG 90
SEQ ID NO: 87
SEQUENZLÄNGE: 90
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
CACTCCCAGG TGCAGCTTGT GCAGTCTGGA GCTGAGGTGA AGAAGCCTGG 50
GGCCTCAGTG AAGGTTTCCT CCAACGCTTC TGGATACTCA 90
SEQ ID NO: 88
SEQUENZLÄNGE: 90
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
TGCAAGGCTT CTGGATACTC ATTCACTAGT TATTACATAC ACTGGGTGCG 50
CCAGGCCCCC GGACAAAGGC TTGAGTGGAT GGGATATATT 90
SEQ ID NO: 89
SEQUENZLÄNGE: 90
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear.
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
CTTGAGTGGA TGGGATATAT TGACCCTTTC AATGGTGGTA CTAGCTATAA 50
TCAGAAGTTC AAGGGCAGAG TCACCATTAC CGTAGACACA 90
SEQ ID NO: 90
SEQUENZLÄNGE: 90
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
GTCACCATTA CCGTAGACAC ATCCGCGAGC ACAGCCTACA TGGAGCTGAG 50
CAGCCTGACA TCTGAAGACA CGGCTGTCTA TTACTGTGCG 90
SEQ ID NO: 91
SEQUENZLÄNGE: 94
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
ACGGCTGTGT ATTACTGTGC GAGAGGGGGT AACCGCTTTG CTTACTGGGG 50
CCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCCTCAGG TGAGTGGATC CGAC 94
SEQ ID NO: 92
SEQUENZLÄNGE: 15
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
GATAAGCTTG CCGCC 15
SEQ ID NO: 93
SEQUENZLÄNGE: 15
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
GTCGGATCCA CTCAC 15
SEQ ID NO: 94
SEQUENZLÄNGE: 433
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Doppelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
ORGANISMUS: Maus und Mensch
UNMITTELBARE HERKUNFT:
CLON: pUC-RVH-sle 1220 Ha
MERKMALE: Gen, ausschließlich Intron, das den V-Bereich, Version (a), der H-Kette des neugeformten menschlichen sle AUK 1220-Antikörpers gegen den menschlichen IL- 6R codiert
Aminosäure -19 bis -1 Leader Aminosäure 1 bis 30 FR1 Aminosäure 31 bis 35 CDR1 Aminosäure 36 bis 49 FR2 Aminosäure 50 bis 66 CDR2 Aminosäure 67bis 98 FR3 Aminosäure 99 bis 105 CDR3 Aminosäure 1D9 bis 116 FR4 Nucleotid 1 bis 6 HindIII-Stelle Nucleotid 427 bis 433 BamHI-Stelle SEQUENZ:
SEQ ID NO: 95
SEQUENZLÄNGE: 27
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
AGGCTTGAGT GGATTGGATA TATTGAC 27
SEQ ID NO: 96
SEQUENZLÄNGE: 27
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA SEQUENZ:
AAGTTCAAGG GCAAGGTCAC CATTACC 27
SEQ ID NO: 97
SEQUENZLÄNGE: 30
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA
SEQUENZ:
GGTGCTTCCG TGAAAGTCAG CTGTAAAGCT 30
SEQ ID NO: 98
SEQUENZLÄNGE: 30
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA
SEQUENZ:
AGCTTTACAG CTGACTTTCA CGGAAGCACC 30

Claims

1. Variabler (V) Bereich einer leichten (L) Kette eines Antikörpers gegen menschlichen Interleukin-6 (IL-6)-Rezeptor mit der folgenden Struktur:

FR¹-CDR1¹-FR2²-CDRZ¹-FR3¹-CDR3¹-FR4¹

in der CDR1¹, CDR2¹ und CDR3¹ einen Satz von drei komplementaritätsbestimmenden Bereichen (CDR1s) mit den folgenden Aminosäuresequenzen darstellen:

oder ein funktionelles Äquivalent davon; und in der FR1¹, FR2¹, FR3¹ und FR4¹ einen Satz von vier Gerüstbereichen (FR1s) darstellen, die von dem V-Bereich der L-Kette eines menschlichen Antikörpers der Untergruppe I (HSGI) stammen, oder ein funktionelles Äquivalent davon, wobei der HSGI ein REI-Antikörper ist.

2. V-Bereich einer L-Kette nach Anspruch 1, in dem FR1¹, FR2¹, FR3¹ und FR4¹ in dem REI-Antikörper oder ein funktionelles Äquivalent davon die folgenden Aminosäuresequenzen aufweisen, die durch (i) oder (ii) nachstehend gezeigt sind:

oder ein funktionelles Äquivalent davon.

3. V-Bereich einer L-Kette nach Anspruch 1, der die als SEQ ID No. 57 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.

4. L-Kette eines Antikörpers gegen den menschlichen IL-6- Rezeptor, die umfaßt:

(1) einen variablen (V) Bereich einer leichten (L) Kette eines Antikörpers gegen den menschlichen Interleukin-6 (IL-6)-Rezeptor nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und

(2) einen konstanten (C) Bereich, der von einem menschlichen Antikörper stammt.

5. L-Kette nach Anspruch 4, wobei der C-Bereich Cκ ist.

6. V-Bereich einer schweren (H)-Kette eines Antikörpers gegen den menschlichen IL-6-Rezeptor mit der folgenden Struktur:

FR²-CDR²-FR2²-CDR2²-FR3²-CDR3²-Fr4²,

in der CDR1², CDR2² und CDR3² einen Satz von drei komplementaritätsbestimmenden Bereichen (CDR²s) mit den folgenden Aminosäuresequenzen darstellen:

oder ein funktionelles Äquivalent davon; und in der FR1², FR2², FR3² und FR4² einen Satz von vier Gerüstbereichen (FR²s) darstellen, die von dem V-Bereich der H-Kette eines menschlichen Antikörpers der Untergruppe II (HSGII) stammen, oder ein funktionelles Äquivalent davon, wobei HSGII ein NEW-Antikörper ist.

7. V-Bereich einer H-Kette nach Anspruch 6, wobei FR1², FR2², FR3² und FR4² in dem NEW-Antikörper oder ein funktionelles Äquivalent davon die folgenden Aminosäuresequenzen aufweisen, die nachstehend durch (iii) bis (viii) gezeigt sind:

oder ein funktionelles Äquivalent davon.

8. V-Bereich einer H-Kette nach Anspruch 7, der die als SEQ ID No. 56 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.

9. H-Kette eines Antikörpers gegen den menschlichen IL-6- Rezeptor, die umfaßt:

(1) einen V-Bereich einer schweren (H) Kette eines Antikörpers gegen den menschlichen IL-6-Rezeptor nach einem der Ansprüche 6 bis 8 und

(2) einen von einem menschlichen Antikörper stammenden C-Bereich.

10. H-Kette nach Anspruch 9, in der der C-Bereich Cγ ist.

11. Neugeformter menschlicher Antikörper gegen den menschlichen Interleukin-6 (IL-6)-Rezeptor, der umfaßt:

(A) L-Ketten eines Antikörpers gegen den menschlichen IL-6-Rezeptor nach einem der Ansprüche 4 oder 5 und

(B) H-Ketten eines Antikörpers gegen den menschlichen IL-6-Rezeptor nach einem der Ansprüche 9 oder 10.

12. Variabler (V) Bereich einer leichten (L) Kette eines Antikörpers gegen den menschlichen Interleukin-6 (IL-6)- Rezeptor mit der folgenden Struktur:

FR³-CDR³-cF³-CDRZ³-FR3³-CDR3³-Fr4³,

in der CDR1³, CDR2³ und CDR3³ einen Satz von drei komplementaritätsbestimmenden Bereichen (CDR³s) mit den folgenden Aminosäuresequenzen darstellen:

oder ein funktionelles Äquivalent davon; und in der FR1³, FR2³, FR3³ und FR4³ einen Satz von vier Gerüstbereichen (FR³s) darstellen, die von dem V-Bereich einer L-Kette eines menschlichen Antikörpers der Untergruppe I (HSGI) stammen, oder ein funktionelles Äquivalent davon, wobei HSGI ein REl-Antikörper ist.

13. V-Bereich einer L-Kette nach Anspruch 12, wobei FR1³, FR2³, FR3³ und FR4³ in dem REI-Antikörper oder ein funktionelles Äquivalent davon die folgenden Aminosäuresequenzen aufweisen:

in der FR1&sup4;, FR2&sup4;, FR3&sup4; und FR4&sup4; einen Satz von vier Gerüstbereichen (FR&sup4;s) darstellen, die von dem V-Bereich einer H-Kette eines menschlichen Antikörpers der Untergruppe I (HSGI) stammen, oder ein funktionelles Äquivalent davon, wobei HSGI ein 425-Antikörper oder ein HAX- Antikörper ist.

18. V-Bereich einer H-Kette nach Anspruch 17, wobei der HSGI der 425-Antikörper ist und FR1&sup4;, FR2&sup4;, FR3&sup4; und FR4&sup4; in dem 425-Antikörper oder ein funktionelles Äquivalent davon einen Satz der folgenden Aminosäuresequenzen umfaßt, die nachstehend durch (ix) bis (xii) gezeigt sind:

oder ein funktionelles Äquivalent davon.

14. V-Bereich einer L-Kette nach Anspruch 12, der die als SEQ ID No. 71 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.

15. L-Kette eines Antikörpers gegen den menschlichen IL-6- Rezeptor, die umfaßt:

(1) einen variablen (V) Bereich einer leichten (L)' Kette eines Antikörpers gegen den menschlichen Interleukin-6 (IL-6)-Rezeptor nach einem der Ansprüche 12 bis 14 und

(2) einen von einem menschlichen Antikörper stammenden konstanten (C) Bereich.

16. L-Kette nach Anspruch 15, in der der C-Bereich Cκ ist.

17. V-Bereich einer schweren (H) Kette eines Antikörpers gegen den menschlichen IL-6-Rezeptor mit der folgenden Struktur:

FR&sup4;-CDR&sup4;-cF&sup4;-CDRZ&sup4;-FR3&sup4;-CDR3&sup4;-Fr4&sup4;,

in der CDR1&sup4;, CDR2&sup4; und CDR3&sup4; einen Satz von drei komplementaritätsbestimmenden Bereichen (CDR&sup4;s) mit den folgenden Aminosäuresequenzen darstellen:

oder ein funktionelles Äquivalent davon; und

oder ein funktionelles Äquivalent davon.

19. V-Bereich einer H-Kette nach Anspruch 17, wobei der HSGI der HAX-Antikörper ist und

wobei FR1&sup4;, FR2&sup4;, FR3&sup4; und FR4&sup4; in dem HAX-Antikörper oder ein funktionelles Äquivalent davon einen Satz der folgenden Aminosäuresequenzen umfassen, die nachstehend durch (xiii) bis (xvi) gezeigt sind:

oder ein funktionelles Äquivalent davon.

20. V-Bereich einer H-Kette nach Anspruch 17, der die als SEQ ID No. 84 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.

21. V-Bereich einer H-Kette nach Anspruch 17, der die als SEQ ID No. 85 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.

22. H-Kette eines Antikörpers gegen den menschlichen IL-6- Rezeptor, die umfaßt:

(1) einen V-Bereich einer schweren (H) Kette eines Antikörpers gegen den menschlichen IL-6-Rezeptor nach einem der Ansprüche 17 bis 21; und

(2) einen von einem menschlichen Antikörper stammenden C-Bereich.

23. H-Kette nach Anspruch 22, in der der C-Bereich Cγ ist.

24. Neugeformter menschlicher Antikörper gegen den menschlichen Interleukin-6 (IL-6)-Rezeptor, der umfaßt:

(A) L-Ketten eines Antikörpers gegen den menschlichen IL-6-Rezeptor nach einem der Ansprüche 15 oder 16 und

(B) H-Ketten eines Antikörpers gegen den menschlichen IL-6-Rezeptor nach einem der Ansprüche 22 oder 23.

25. Chimäre L-Kette, die einen C-Bereich einer menschlichen L-Kette und einen V-Bereich einer L-Kette eines monoclonalen Maus-Antikörpers gegen menschlichen IL-6R umfaßt, wobei der V-Bereich der L-Kette eine Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID No. 24, 26, 28 oder 30 gezeigt ist.

26. Chimäre L-Kette nach Anspruch 25, wobei der C-Bereich 5 der menschlichen L-Kette ein menschlicher Cκ-Bereich ist.

27. Chimäre H-Kette, die einen C-Bereich einer menschlichen H-Kette und einen V-Bereich einer H-Kette eines monoclonalen Maus-Antikörpers gegen IL-6R umfaßt, wobei der V- Bereich der H-Kette eine Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID No. 25, 27, 29 oder 31 gezeigt ist.

28. Chimäre H-Kette nach Anspruch 27, wobei der C-Bereich 5 der menschlichen H-Kette ein menschlicher Cγ-Bereich ist.

29. Chimärer Antikörper gegen den menschlichen Interleukin-6 (IL-6)-Rezeptor, der umfaßt:

(A) chimäre L-Ketten nach einem der Ansprüche 25 oder 26 und

(B) chimäre H-Ketten nach einem der Ansprüche 27 oder 28.

30. DNA, die einen V-Bereich einer L-Kette nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 12 bis 14 codiert.

31. DNA, die eine L-Kette nach einem der Ansprüche 4, 5, 15 oder 16 codiert.

32. DNA, die einen V-Bereich einer H-Kette nach einem der Ansprüche 6 bis 8 oder 17 bis 21 codiert.

33. DNA, die eine H-Kette nach einem der Ansprüche 9, 10, 22 oder 23 codiert.

34. DNA, die eine chimäre L-Kette nach Anspruch 25 oder 26 codiert.

35. DNA, die eine chimäre H-Kette nach Anspruch 27 oder 28 codiert.

36. Vektor, der eine DNA nach Anspruch 30 umfaßt.

37. Vektor, der eine DNA nach. Anspruch 31 umfaßt.

38. Vektor, der eine DNA nach Anspruch 32 umfaßt.

39. Vektor, der eine DNA nach Anspruch 33 umfaßt.

40. Vektor, der eine DNA nach Anspruch 34 umfaßt.

41. Vektor, der eine DNA nach Anspruch 35 umfaßt.

42. Vektor, der eine DNA nach Anspruch 31 und eine DNA nach Anspruch 33 umfaßt.

43. Vektor, der eine DNA nach Anspruch 34 und eine DNA nach Anspruch 35 umfaßt.

44. Wirtszellen, die gemeinsam mit einem Vektor nach Anspruch 37 und einem Vektor nach Anspruch 39 transformiert sind.

45. Wirtszellen, die mit einem Vektor nach Ansprüch 42 transformiert sind.

46. Wirtszellen, die gemeinsam mit einem Vektor nach Anspruch 40 und einem Vektor nach Anspruch 41 transformiert sind.

47. Wirtszellen, die mit einem Vektor nach Anspruch 43 transformiert sind.

48. Verfahren zur Herstellung eines neugeformten menschlichen Antikörpers gegen den menschlichen IL-6-Rezeptor, das die folgenden Schritte umfaßt: Züchtung der Wirtszellen nach Anspruch 44 oder 45 und Gewinnung des neugeformten menschlichen Antikörpers.

49. Verfahren zur Herstellung eines chimären Antikörpers gegen den menschlichen IL-6-Rezeptor, das die folgenden Schritte umfaßt: Züchtung der Wirtszellen nach Anspruch 46 oder 47 und Gewinnung des chimären Antikörpers.