ES2241114T3

ES2241114T3 - Anticuerpos como remedios para tumores linfociticos (excepto mieloma).

Info

Publication number: ES2241114T3
Application number: ES98902757T
Authority: ES
Inventors: Yasuo Chugai Seiyaku K.K. KOISHIHARA; Yasushi Chugai Seiyaku K.K. YOSHIMURA
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1997-02-12
Filing date: 1998-02-12
Publication date: 2005-10-16
Anticipated expiration: 2018-02-12
Also published as: KR100655979B1; US6503510B2; US20020037288A1; BR9811094A; KR20000070989A; HUP0001136A3; CN1250381A; SK110099A3; HUP0001136A2; NO993866L; PL190065B1; TR199901949T2; CA2280875C; HK1026368A1; EP0997152A1; DE69830492T2; EP0997152B1; CN1191855C; UA65561C2; AU5956398A

Abstract

Un agente terapéutico para tumores linfáticos (excluido el meloma) que comprende como ingrediente activo un anticuerpo que se aglutina específicamente con una proteína que tiene la secuencia del aminoácido establecida en el Nº de SEC: 1 y que tiene actividad citotóxica.

Description

Anticuerpos como remedios para tumores linfocíticos (excepto mieloma).

Campo Técnico

La presente invención se refiere a agentes terapéuticos para tumores linfáticos (con exclusión de mielomas) que comprenden como un ingrediente activo anticuerpos que se unen específicamente a proteínas expresadas en dichos tumores linfáticos. La presente invención se refiere también a agentes terapéuticos para el tratamiento de tumores de células T o tumores de células B (con exclusión de mielomas), Además, la presente invención se refiere a anticuerpos que se unen específicamente a proteínas expresadas en tumores linfáticos y que poseen actividad citotóxica.

Técnica fundamental

Las células linfáticas son, principalmente, responsables de la inmunidad del cuerpo vivo. Las células linfáticas derivan todas ellas de las mismas células pluripotentes hematopoyéticas, que son liberadas a la sangre periférica después de diferenciación repetida mediante la acción de diversos factores que inducen la diferenciación o factores de crecimiento existentes en la médula ósea u otros órganos. Debido a diferencias existentes en tal diferenciación, los linfocitos se clasifican, en sentido amplio, en células B y células T. Se cree que las células B poseen la capacidad de producir anticuerpos mientras que se piensa que las células T poseen la capacidad de presentación de antígenos, citotoxicidad y semejantes. Cuando estas células sufren un cambio tumorígeno por una razón u otra durante ciertas etapas de diferenciación, y comienzan a proliferar de un modo incontrolado en la médula ósea, los tejidos linfáticos, la sangre o semejante, tal estado se denomina un tumor linfático.

Debido a la introducción de nuevas tecnologías, en particular avances tecnológicos que hacen uso de anticuerpos monoclonales contra antígenos de diferenciación existentes sobre la superficie celular, se ha hecho posible identificar el origen y/o la etapa de diferenciación de las células linfáticas. Acompañado de esto, se ha hecho posible también no solamente determinar si tales células tumorales derivan de células T ó células B, sino también identificar el grado de madurez de las células tumorales.

Los tumores linfáticos se clasifican, en sentido amplio, en los tumores de células B y los tumores de células T, basado en el origen y grado de madurez de las celulares tumorales. Basándose en el grado de madurez de las células tumorales, los tumores de las células B se clasifican en leucemia linfática B aguda (B-ALL), leucemia linfática B crónica (B-CELL), pre-linfoma B, linfoma de Burkitt, linfoma folicular, linfoma del palio folicular, linfoma difuso, y semejantes. Por otra parte, los tumores de las células T se clasifican, basándose en el grado de madurez de las células tumorales, en leucemia linfática T aguda, (T-ALL), leucemia linfática T crónica (T-CLL) y leucemia de células T del adulo (ATL), linfoma T periférico no-ATL (PNTL) y semejantes ((Zukal Rinsho [Gan](Illustrated Clinical; Cancer) serie No. 17 Leucemia y linfoma, Takashi Sugimura et al., Medical View Co., Ltd., 1987, tumores de células B, Kiyoshi Takatsuki, Nishimura Shoten, 1991).

Es cierto que, a pesar de los recientes avances en las tecnologías médicas, los tratamientos de los tumores linfáticos no son satisfactorios. El grado de curación de la leucemia linfática aguda (ALL), por ejemplo, es todavía del 20% o menor, y el de los linfomas es todavía del 50%, aproximadamente, en la etapa avanzada, aun cuando se dice que el grado de curación de los linfomas B es relativamente alto, debido al progreso de los tratamientos terapéuticos con muchos fármacos. Además, el linfoma T es más intratable y tiene un grado de curación de aproximadamente 30%, y el grado de curación está por debajo del 10% en la actualidad, para la leucemia de células T aguda (ATL).

Por otra parte, Goto, T., y al., han indicado un anticuerpo monoclonal (anticuerpo anti-HM1.24) que se obtenía inmunizando ratones con células de mieloma humano (Blood (1994) 84, 1922-1930). Cuando se administra el anticuerpo anti-HM1.24 a un ratón al que se han transplantado células de mieloma humano, el anticuerpo se acumula de un modo específico en los tejidos tumorales (Masaaki Kosaka et al., Nippon Rinsho (Japan Clinical) (1995) 53, 627-635), lo que sugiere que podría aplicarse el anticuerpo anti-HM1.24 en la diagnosis de localización de tumores por marcado radioisotópico, terapias de misil tales como radioinmunoterapia, y semejantes. No obstante, no se sabe que el anticuerpo anti-HM1.24 sea útil para el tratamiento de otros tumores linfáticos.

Ozaki S., et al., han indicado en Blood, Vol. 90, No. 8, (1997) páginas 3179-3186, el tratamiento de ratones xenografiados con líneas celulares de mieloma ARH-77 y RPMI 8226, con un anticuerpo monoclonal murino específico para HM1.24.

El documento EP 0733643 describe un polipéptido de la proteína de la membrana que posee la función de soportar el crecimiento de células pre-B. El polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ.ID.NO. 1 de la presente invención. Se describe también un anticuerpo monoclonal que reconoce al polipéptido.

El documento EP 0960936 y el documento EP 1020522, describen anticuerpos anti-HM1.24 humanos, reconfigurados.

El documento EP 1023906 proporciona un intensificador de un anticuerpo que se une específicamente a una proteína que posee la secuencia de aminoácidos de la SEQ.ID.NO. 1 de la presente invención.

El documento EP 0972524 describe un inhibidor de la activación de linfocitos que comprende el anticuerpo anti-HM1.24.

Descripción de la invención

Los métodos terapéuticos de tratamiento de tumores linfáticos que se utilizan en la actualidad, incluyen diversos tratamientos quimioterápicos, terapias con rayos X, trasplante de médula ósea, y semejantes. Sin embargo, según se ha citado anteriormente, ninguno de ellos es, todavía, satisfactorio para las enfermedades, y por tanto en la actualidad se está a la espera de agentes o métodos terapéuticos que hagan época, que puedan aliviar los tumores linfáticos y prolongar el periodo de supervivencia de los pacientes.

Por tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar un agente terapéutico nuevo para el tratamiento de los tumores linfáticos, con exclusión de los mielomas.

Con objeto de proporcionar tal agente terapéutico, se han llevado a cabo, extensamente, estudios in vitro, con inclusión de análisis por citometría de flujo (FCM), determinación de actividades citotóxicas tales como la actividad ADCC (actividad citotóxica celular dependiente de anticuerpos), la actividad CDC, (actividad citotóxica dependiente del complemento) etc., y estudios in vivo sobre efectos antitumorales usando el anticuerpo anti-HM1.24 (Goto. T. et al., Blood (1994) 84, 1922-1930), así como estudios sobre el aislamiento de la proteína del antígeno a la que se une específicamente el anticuerpo anti-HM1.24. Como resultado de ello, se ha descubierto que la proteína del antígeno reconocida por el anticuerpo anti-HM1.24 se expresa en tumores linfáticos y que el anticuerpo anti-HM1.24 posee efecto antitumoral sobre tumores linfáticos, habiéndose completado con ello la presente invención.

Por tanto, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo que se une específicamente a la proteína del antígeno HM1.24 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ.IF-NO.1 y que posee actividad citotóxica, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de tumores linfáticos, con la excepción de mielomas.

La presente invención proporciona tal uso para tratar tumores de células T o tumores de células B (con exclusión de mielomas).

Los aspectos preferidos de la invención son tal como se exponen en las reivindicaciones que se acompañan.

Descripción breve de los dibujos

La Fig. 1 muestra un histograma de análisis mediante FCM de la línea de células B indicada, por el método indirecto, usando el anticuerpo anti-HM1.24 e IgG2a de ratón como testigo.

La Fig. 2 muestra un histograma de la línea de células B indicada que se analizó mediante FCM, por el método indirecto, usando el anticuerpo anti-HM1.24 e IgG2a de ratón como testigo.

La Fig. 3 muestra un histograma de la línea de células B indicada que se analizó mediante FCM, por el método indirecto, usando el anticuerpo anti-HM1.24 e IgG2a de ratón como testigo.

La Fig. 4 muestra un histograma de la línea de células B indicada que se analizó mediante FCM, por el método indirecto, usando el anticuerpo anti-HM1.24 e IgG2a de ratón como testigo.

La Fig. 5 muestra un histograma de la línea de células B indicada, que se analizó mediante FCM, por el método indirecto, usando el anticuerpo anti-HM1.24 e IgG2a de ratón como testigo.

La Fig. 6 muestra un histograma de la línea de células B indicada, que se analizó mediante FCM, por el método indirecto, usando el anticuerpo anti-HM1.24 e IgG2a de ratón como testigo.

La Fig. 7 muestra un histograma de la línea de células B indicada, que se analizó mediante FCM, por el método indirecto, usando el anticuerpo anti-HM1.24 e IgG2a de ratón como testigo.

La Fig. 8 muestra un histograma de línea de células B indicada, que se analizó mediante FCM, por el método indirecto, usando el anticuerpo anti-HM1.24 e IgG2a de ratón como testigo.

La Fig. 9 muestra un histograma de la línea de células B indicada, que se analizó mediante FCM, por el método indirecto, usando el anticuerpo anti-HM1.24 de ratón como testigo.

La Fig. 10 muestra un histograma de la línea de células T indicada, que se analizó mediante FCM, por el método indirecto, usando el anticuerpo anti-HM1.24 e IgG2a de ratón como testigo.

La Fig. 11 muestra un histograma de la línea de células T indicada, que se analizó mediante FCM, por el método indirecto, usando el anticuerpo anti-HM1.24 e IgG2a de ratón como testigo.

\newpage

La Fig. 12 muestra un histograma de la línea de células T indicada, que se analizó mediante FCM, por el método indirecto, usando el anticuerpo anti-HM1.24 e IgG2a de ratón como testigo.

La Fig. 13 muestra un histograma de la línea de células T indicada, que se analizó mediante FCM, por el método indirecto, usando el anticuerpo anti-HM1.24 e IgG2a de ratón como testigo.

La Fig. 14 muestra un histograma de la línea de células T indicada, que se analizó mediante FCM, por el método indirecto, usando el anticuerpo anti-HM1.24 e IgG2a de ratón como testigo.

La Fig. 15 muestra un histograma de la línea de células T indicada, que se analizó mediante FCM, por el método indirecto, usando el anticuerpo anti-HM1.24 e IgG2a de ratón como testigo.

La Fig. 16 muestra un histograma de la línea de células T indicada, que se analizó mediante FCM, por el método indirecto, usando el anticuerpo anti-HM1.24 e IgG2a de ratón como testigo.

La Fig. 17 muestra un histograma de la línea de células T indicada, que se analizó mediante FCM, por el método indirecto, usando el anticuerpo anti-HM1.24 e IgG2a de ratón como testigo.

La Fig. 18 muestra un histograma de la línea de células T indicada que se analizó mediante FCM, por el método indirecto, usando el anticuerpo anti-HM1.24 e IgG2a de ratón como testigo.

La Fig. 19 muestra un histograma de la línea de células T indicada, que se analizó mediante FCM, por el método indirecto, usando el anticuerpo anti-HM1.24 e IgG2a de ratón como testigo.

La Fig. 20 muestra un histograma de la línea de células no B, no T indicada, que se analizó mediante FCM, por el método indirecto, usando el anticuerpo anti- HM1.24 e IgG2a de ratón como testigo.

La Fig. 21 muestra un histograma de la línea de células no B, no T indicada, que se analizó mediante FCM, por el método indirecto, usando el anticuerpo anti- HM1.24 e IgG2a como testigo.

La Fig. 22 muestra un histograma de la línea de células no B, no T indicada, que se analizó mediante FCM, por el método indirecto, usando el anticuerpo anti-HM1.24 e IgG2a de ratón como testigo.

La Fig. 23 muestra un histograma de la línea de células no B, no T indicada, que se analizó mediante FCM, por el método indirecto, usando el anticuerpo anti- HM1.24 e IgG2a de ratón como testigo.

La Fig. 24 es una gráfica que muestra que el anticuerpo anti-HM1.24 ejerce un efecto citotóxico sobre las líneas de células tumorales de las células T CCRF- CEM, CCRF-HSB-2 y HPB-MLT de un modo dependiente de la dosis.

La Fig. 25 es una gráfica que muestra que el anticuerpo anti-HM1.24 ejerce un efecto citotóxico sobre la líneas de células tumorales de las células B EB-3, MC116 y CCRF-SB de un modo dependiente de la dosis.

La Fig. 26 es una gráfica que muestra que el aumento de volumen de tumores ha sido suprimido en el grupo al que se ha administrado el anticuerpo anti-HM1.24 en comparación con el grupo al que se ha administrado IgG2a de ratón, como testigo, en ratones a los que se ha trasplantado un tumor linfático humano.

La Fig. 27 es una gráfica que muestra que el período de supervivencia ha sido ampliado en el grupo al que se ha administrado el anticuerpo anti-HM1.24 en comparación con el grupo al que se ha administrado IgG2a de ratón como testigo, en ratones a los que se ha trasplantado un tumor linfático humano.

Realización para llevar a cabo la invención 1. Preparación de anticuerpos 1-1. Preparación de hibridomas

Los hibridomas que producen anticuerpos de uso en la ppresente invención, pueden se construidos básicamente usando un procedimiento conocido, que se describe seguidamente. Así, puede usarse la proteína del antígeno HM1.24 o células que expresan el antígeno HM1.24, como antígeno de sensibilización y emplearse para llevar a cabo inmunización por el método convencional de inmunización. Las células inmunes obtenidas de este modo son fusionadas con células parentales conocidas por el procedimiento de fusión celular convencional, y luego se rastrea mediante el método convencional de rastreo para seleccionar células que producen anticuerpos monoclonales.

Específicamente, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales del modo siguiente. Por ejemplo, como célula que expresa el antígeno HM1.24, que es el antígeno de sensibilización para obtener el anticuerpo, puede usarse la línea celular de mieloma múltiple humano KPMM2 (publicación de la patente japonesa sin examinar (Kokai) No. 7-236475) ó KPC-32 (Goto T., et al., Jpn. Clin. Hematol. (1991) 32, 1400). Alternativamente, como agente de sensibilización puede usarse una proteína que tenga la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO.1 o un péptido o un polipéptido que contenga un epítopo reconocido por el anticuerpo anti-HM1.24.

Tal como se usa en esta memoria, cDNA que codifica una proteína que posee la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:1, ha sido insertado en el sitio de segmentación XbaI del vector pUC19 para construir el plásmido pRS38-pUC19. E. coli que tiene este plásmido ha sido depositado internacionalmente bajo las estipulaciones del Tratado de Budapesto, como Escherichia coli DH5\alpha (pRS38-pUC19) el 5 de Octubre de 1993, en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, de 1-3, Higashi 1-chome, ciudad de Tsukuba, pref. de Ibaraki, Japón, como FERM BP-4434 (véase la publicación de la patente japonesa sin examinar (Kokai) No. 7-196694). El fragmento de cDNA contenido en este plásmido pRS38-pUC19, puede ser utilizado para preparar un péptido o un polipéptido que contiene un epítopo reconocido por el anticuerpo anti-HM1.24, mediante tecnología de ingeniería genética.

De preferencia, los mamíferos que han de ser inmunizados con el antígeno de sensibilización se seleccionan teniendo en cuenta su compatibilidad con la célula parental que ha de usarse en la fusión celular. En general, estos mamíferos incluyen, aun cuando no se limitan a ellos, roedores tales como ratones, ratas, hámsters y semejantes.

La inmunización de animales con un agente de sensibilización se lleva a cabo usando un método conocido. Un método general lleva consigo, por ejemplo, la administración por vía intraperitoneal o subcutánea de un agente de sensibilización para el mamífero. Específicamente, un agente de sensibilización que ha sido diluido y suspendido en una cantidad apropiada de solución salina tamponada con fosfato (PBS) o solución salina fisiológica, se mezcla, según se desee, con la cantidad apropiada de adyuvante de Freund completo. Después de ser emulsionado, se administra preferiblemente a un mamífero, varias veces cada 4 a 21 días. Alternativamente, puede usarse un vehículo adecuado en el momento de realizar la inmunización con el antígeno de sensibilización.

Después de la inmunización y de la confirmación del aumento del nivel deseado de anticuerpos en el suero, las células inmunes son extraídas del animal y sometidas a fusión celular, en la que las células inmunes preferidas incluyen, en particular, células de bazo.

Las células de mieloma de mamífero, como las otras células parentales que son sometidas a fusión celular con las células inmunes antes citadas, incluyen, de preferencia, diversas líneas celulares conocidas tales como P3X63Ag8.653 (J. Immunol. (1079) 123: 1548-1550); P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Mucrobiology and Immunology (1978) 81:1-7), NS-1 (Kohler, G., y Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6:511-519), MPC-11 (Margulles, D.H. et al., Cell (1976) 8: 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276-269-270), FO (de St. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35:1-21), 5194 (Trowbridge, I.S., J. Exp. Med. (1978) 148:313-323), R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277: 131-133) y semejantes.

La fusión celular entre las células inmunes anteriores y las células de mieloma, puede llevarse a cabo esencialmente según el método conocido tal como ha sido descrito por Milstein et al., Kohler, G., y Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) y semejantes.

Más específicamente, la fusión celular anterior se lleva a cabo en el seno de un caldo nutriente convencional, en presencia de, por ejemplo, un acelerador de la fusión celular. Como acelerador de la fusión celular puede utilizarse polietilenglicol (PEG), virus Sendai (HVJ) y semejantes, y, además, puede añadirse un coadyuvante tal como sulfóxido de dimetilo, etc, si se desea, para intensificar la eficacia de la fusión.

La relación preferida de las células inmunes y las células de mieloma que se han de usar, es, por ejemplo, 1 a 10 veces más células inmunes que células de mieloma. Como ejemplos de medios de cultivo a usar para la fusión celular anterior, se incluyen el medio RPMI1640 y el medio de cultivo MEM adecuado para el crecimiento de las líneas celulares de mieloma anteriores, y el medio de cultivo convencional usado para este tipo de cultivo celular y además puede añadirse un suplemento de suero tal como suero fetal de ternera (FCS).

En la fusión celular, cantidades previamente determinadas de las células inmunes anteriores y de las células de mieloma, se mezclan a fondo en el medio de cultivo anterior, al que se ha añadido una solución de PEG previamente calentada a 37ºC aproximadamente, por ejemplo una solución de PEG de un peso molecular medio de aproximadamente 1000 a 6000, en una concentración de 30 a 60% (p/v) y se mezcla para obtener las células de fusión deseadas (hibridomas). Luego, repitiendo la adición sucesiva de un medio de cultivo adecuado y centrifugación para separar el sobrenadante, pueden separarse los agentes de la fusión celular, etc, que son indeseables para el crecimiento del hibridoma.

Dicho hibridoma se selecciona por cultivo en un medio de selección convencional, por ejemplo, el medio de cultivo HAT (un líquido de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). El cultivo en dicho medio de cultivo HAT se continúa, por lo general, durante un período de tiempo suficiente para llevar a efecto la muerte de las células distintas de las del hibridoma deseado (células sin fusionar), en general desde varios días a varias semanas. Se lleva a cabo el método convencional de dilución de limitación, en el que los hibridomas que producen el anticuerpo deseado son seleccionados y clonados monoclonalmente.

Además de obtener el hibridoma anterior mediante inmunización con un antígeno de un animal distinto de un ser humano, es posible también sensibilizar linfocitos humanos, in vitro, con el antígeno HM1.24 o con células que expresan el antígeno HM1.24, y los linfocitos sensibilizados que resultan se fusionan con células de mieloma humano, por ejemplo U266, obteniendo el anticuerpo humano deseado que posee la actividad de unirse al antígeno HM1.24 o a las células que expresan el antígeno HM1.24 (véase la publicación de patente japonesa examinada posteriormente (Kokoku) No. 1-59878). Además, un animal transgénico que tenga un repertorio de todos los genes de anticuerpo humanos es inmunizado con el antígeno, es decir, el antígeno HM1.24 o las células que expresan el antígeno HM1.24, obteniendo el anticuerpo humanizado deseado por el método anteriormente descrito (véanse las solicitudes de patente internacional WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 y WO 96/
33735).

Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales, construidos de este modo, pueden ser subcultivados en un medio de cultivo convencional, o pueden ser mantenidos en nitrógeno líquido, durante un período de tiempo prolongado.

Con objeto de obtener el anticuerpo monoclonal partiendo de dicho hibridoma, puede citarse un método en el que dicho hibridoma se cultiva por un método convencional y se obtienen los anticuerpos en el sobrenadante, o un método en el que el hibridoma se administra y se hace crecer en un mamífero compatible con dicho hibridoma, y los anticuerpos se obtienen en la ascitis. El primer método es adecuado para obtener anticuerpos de alta pureza, mientras que el último es adecuado para la producción a gran escala de anticuerpos.

Específicamente, el hibridoma que produce el anticuerpo anti-HM1.24 puede ser construido usando el método de Goto, T. et al., (Blood (1994) 84: 1922- 1930). Puede ser construido mediante un método en el que el hibridoma que produce el anticuerpo anti-HM1.24 que ha sido depositado internacionalmente bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest como FERM BP-5233, el 14 de Septiembre de 1995, en el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, de 1-3, Higashi 1-chome, ciudad de Tsukuba, pref. de Ibaraki, Japón, se inyecta por vía intraperitoneal a ratones BALB/c (fabricados por CLEA Japan) obteniendo la ascitis partiendo de la cual el anticuerpo anti-HM1.24 es purificado, o un método en el que dicho hibridoma se cultiva en un medio de cultivo adecuado tal como el medio RPMI1640 que contiene suero fetal bovino al 10% y BM-Condimed H1 al 5% (fabricado por Boehringer Mannheim), el medio SFM de hibridoma (fabricado por GIBCO-BRL, el medio PFHM-Il (fabricado por GIBCO-BRL) y semejantes, y el anticuerpo anti-HM1.24 puede ser purificado a partir del sobrenadante.

1-2. Anticuerpo recombinante

Un anticuerpo recombinante obtenido mediante la tecnología del gen recombinante en la que un gen del anticuerpo fue clonado partiendo del hibridoma e integrado en un vector adecuado que luego se introdujo en un hospedante, puede utilizarse en la presente invención como anticuerpo monoclonal (véase, por ejemplo, el trabajo de Carl, A.K., Borrebaeck y James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, publicado en el Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD. 1990).

Específicamente, mRNA que codifica la región variable (región V) del anticuerpo deseado, se aísla desde el hibridoma que produce el anticuerpo. El aislamiento de mRNA se lleva a cabo preparando RNA total usando, por ejemplo, un método conocido tal como el método de ultracentrifugación con guanidina (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), el método AGPC (Chomczynski, P. et al., Analytical Biochemistry (1987) 162, 156.159) luego se purifica mRNA a partir del RNA total usando el kit de purificación de mRNA (fabricado por Pharmacia) y semejantes. Alternativamente, puede prepararse directamente mRNA usando el kit de purificación de mRNA Quick Prep (fabricado por Pharmacia).

El cDNA de la región V del anticuerpo puede ser sintetizado a partir del mRNA obtenido de este modo usando una transcriptasa inversa. Puede sintetizarse cDNA usando el Kit de síntesis de cDNA de primera cadena, de transcriptasa inversa AMV y semejante. Alternativamente, para la síntesis y amplificación de cDNA, pueden usarse el kit FINDER RACE de 5'-Ampli (fabricado por Clontech) y el método 5'-RACE (Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) que emplea la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El fragmento de DNA deseado se purifica a partir del producto de la PCR obtenido, y puede ligarse a un DNA vector. Además, un vector recombinante se construye a partir de él y luego se introduce en E. coli, etc., a partir del cual se seleccionan colonias para preparar el vector recombinante deseado. La secuencia de nucleótidos del DNA deseado puede confirmarse mediante un método conocido tal como el método dideso-
xi.

Una vez obtenido el DNA que codifica la región V del anticuerpo deseado, puede ser ligado a DNA que codifica la región constante (región C) del anticuerpo deseado, que después es integrado en un vector de expresión. Alternativamente, el DNA que codifica la región V del anticuerpo puede ser integrado en un vector de expresión que contenga ya DNA que codifique la región C del anticuerpo.

Con objeto de producir el anticuerpo para usar en la presente invención, el gen del anticuerpo se integra según se describe más adelante en un vector de expresión de modo de ser expresado bajo el control de la región reguladora de la expresión, por ejemplo, un intensificador y/o un promotor. Seguidamente, el vector de expresión puede ser transformado en una célula huésped y el anticuerpo puede luego expresarse en ella.

1-3. Anticuerpo alterado

Según la presente invención puede usarse un anticuerpo recombinante alterado artificialmente tal como un anticuerpo quimérico y un anticuerpo humanizado, con el fin de hacer disminuir la antigenicidad heteróloga frente a los seres humanos. Estos anticuerpos alterados pueden ser producidos empleando métodos conocidos.

Pueden obtenerse anticuerpos quiméricos ligando el DNA así obtenido que codifica la región V del anticuerpo, a DNA que codifica la región C de anticuerpo humano, que luego se inserta en un vector de expresión y se introduce en un hospedante para producir el anticuerpo en éste (véase la solicitud de patente europea EP 125023 y la solicitud de patente internacional WO 96/02576). Utilizando este método conocido puede obtenerse un anticuerpo quimérico útil en la presente invención.

Por ejemplo, E. coli que posee el plásmido que contiene que codifica la región V de la cadena L o la región V de la cadena H de un anticuerpo quimérico anti-HM1.24, ha sido depositado internacionalmente bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest como Escherichia coli DH5\alpha (pUC19-1.24L-g\kappa) y Escherichia coli DH5\alpha (pUC19-1.24H-g\gamma1), respectivamente, el 29 de Agosto de 1996, en el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, de 1-3, Higashi 1-chome, ciudad de Tsukuba city, pref. de Ibarski, Japón, como FERM BP-5646 y FERM BP-5644, respectivamente (véase la solicitud de patente japonesa No. 9-271536).

Se ha preparado un anticuerpo humanizado, denominado también anticuerpo humano reconfigurado, injertando la región de determinación de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo de un mamífero distinto de un ser humano, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, en la CDR de un anticuerpo humano. También es conocida la tecnología general del DNA recombinante para la preparación de tales anticuerpos (Solicitud de patente europea EP 125023 y la solicitud de patente internacional WO 96/02576).

Específicamente, una secuencia de DNA designada para ligar la CDR de anticuerpo de ratón con la región del marco de lectura (FR) de un anticuerpo humano, es sintetizada mediante el método de PCR a partir de varios oligonucleótidos divididos que poseen secciones que se solapan unas con otras, en sus extremos. El DNA obtenido de este modo es ligado al DNA que codifica la región C del anticuerpo humano y luego se inserta en un vector de expresión, que después se introduce en un hospedante para la producción de anticuerpos. (véase la solicitud de patente europea EP 239400 y la solicitud de patente internacional WO 96/02576).

Se seleccionan FRs del anticuerpo humano enlazados a través de CDRs de modo que las regiones de determinación de la complementariedad formen un sitio de unión antigénica favorable. Cuando se desea, aminoácidos de las regiones del marco de lectura de la región variable del anticuerpo, pueden ser sustituidos, de modo que la región determinante de la complementariedad del anticuerpo humano reconfigurado puede formar un sitio de unión antigénica apropiado (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

Por ejemplo, E. coli que posee el plásmido que contiene un DNA que codifica la versión a (SEQ ID NO. 2) de la región V de la cadena L y el que codifica la versión r (SEQ ID NO. 3) de la región V de la cadena H del anticuerpo anti- HM1.24 humanizado, ha sido depositado internacionalmente bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest como Escherichia coli DH5\alpha (pUC19-RV-La-AHM-gK) y Escherichia coli DH5\alpha (pUC19-RVHr-AHM-g\gamma1), respectivamente, el 29 de Agosto de 1996, en el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, de 1-3, Higashi 1-chome, ciudad de Tsukuba, pref. de Ibaraki, Japón, como FERM BP-5645 y FERM BP-5643, respectivamente, (solicitud de patente japonesa No. 9-271536). Además, E. coli que posee el plásmido que contiene un DNA que codifica la versión s (SEQ ID NO: 4) de la región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado, ha sido depositado internacionalmente bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest como Escherichia coli DH5\alpha (pUC19-RVHs-AHM-g\gamma1) el 29 de Septiembre de 1997 en el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, de 1-3, Higashi 1-chome, ciudad de Tsukuba, pref. de Ibaraki, Japón, como FERM BP-6127 (solicitud de patente japonesa No. 9-271536).

Para el anticuerpo quimérico o el anticuerpo humanizado, se usa la región C del anticuerpo humano, y, lo más preferible puede usarse una C\gamma humana tal como la C\gamma1, C\gamma2, C\gamma3 y C\gamma4, como la región constante del anticuerpo humano. Entre estos, los anticuerpos que contienen la C\gamma1 y la C\gamma3 poseen fuerte actividad citotóxica, es decir, actividad ADCC y actividad CDC, y por tanto se utilizan preferiblemente en la presente invención.

El anticuerpo quimérico comprende la región variable de un anticuerpo derivado de un mamífero distinto del ser humano y la región C que deriva de un anticuerpo humano, mientras que el anticuerpo humanizado comprende las regiones de determinación de la complementariedad de un anticuerpo que deriva de un mamífero distinto del ser humano y las regiones del marco de lectura (FRs) y la región C de un anticuerpo que deriva de un anticuerpo humano. Por consiguiente, su antigenicidad en el cuerpo humano ha sido reducida de modo que son útiles como ingrediente activo de los agentes terapéuticos de la presente invención.

Una realización preferida de un anticuerpo humanizado para usar en la presente invención, incluye el anticuerpo anti-HM1.24 humanizado (véase la solicitud de patente japonesa No. 9-271536). Una realización preferida de la región V de la cadena L del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado incluye una que posee la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:2. Una realización preferida de la región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado, incluye una que posee la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de bases que se expone en la SEQ ID. NO: 3 ó 4.

1-4. Expresión y producción

Los genes de anticuerpos construidos como se ha descrito anteriormente, pueden ser expresados y el anticuerpo puede ser obtenido según un método conocido. En el caso de células de mamífero, la expresión puede ser conseguida usando un vector de expresión que contiene un promotor útil, utilizado comúnmente, un gen del anticuerpo que ha de ser expresado y DNA en el que la señal de poli A ha sido ligada operablemente en 3' aguas abajo de la misma o un vector que contiene dicho DNA. Ejemplo del promotor/intensificador incluyen el promotor/intensificador precoz inmediato de citomegalovirus humano.

Adicionalmente como el promotor/intensificador que puede ser usado para la expresión de un anticuerpo para usar en la presente invención, pueden usarse promotores/intensificadores tales como retrovirus, poliomavirus, adenovirus y virus 40 de simios (SV40) y promotores/intensificadores que derivan de células de mamífero tal como el factor del alargamiento humano 1\alpha (HEF1\alpha).

Por ejemplo, la expresión puede conseguirse con facilidad mediante el método de Mulligan et al., (Nature (1979) 277, 108) cuando se usa el promotor/intensificador SV40, o mediante el método de Mizushima et al., (Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) cuando se usa el promotor/intensificador HEF1\alpha.

En el caso del E. coli, la expresión puede efectuarse ligando operablemente un promotor útil usado comúnmente, una secuencia señal para la secreción del anticuerpo, y el gen del anticuerpo que ha de ser expresado, seguido de su expresión. En cuanto al promotor, por ejemplo, pueden citarse el promotor lacz y el promotor araB. El método de Ward et al., (Nature (1098) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427) puede ser utilizado cuando se usa el promotor lacz, y puede usarse el método de Better et al. (Science (1988) 240, 1041-1043) cuando se usa el promotor araB.

Como la secuencia señal para la secreción del anticuerpo, cuando se produce en el periplasma de E. coli, puede usarse la secuencia señal pelB (Lei, S.P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379). Después de separar el anticuerpo producido en el periplasma, la estructura del anticuerpo es apropiadamente replegada antes del uso (véase, por ejemplo, el documento WO 96/30394).

Como el origen de la replicación, pueden usarse los derivados de SV40, polyomavirus, adenovirus, virus del papiloma bovino (BPV) y semejantes. Además, para la amplificación del número de copias del gen en el sistema de la célula huésped, el vector de expresión puede incluir como marcador seleccionable un gen de aminoiglicósido-transferasa (APH), un gen de timidina-quinasa (TK) un gen de xantina-guaninafosforribosil-transferasa de E. coli (Ecogpt), un gen de dihidrofolato-reductasa (dhfr), y semejantes.

Para la producción del anticuerpo para usar en la presente invención, puede usarse cualquier sistema de producción. El sistema de producción de preparación de anticuerpos comprende el sistema de producción in vitro o in vivo. En cuanto al sistema de producción in vitro, puede citarse un sistema de producción que emplea células eucarióticas y el sistema de producción que emplea células procarióticas.

Cuando se usan las células eucarióticas, los sistemas de producción son los que emplean células animales, células vegetales y células de hongos. Las células animales conocidas incluyen (1) células de mamífero tales como células CHO, células COS, células de mieloma, células de riñón de hámster joven (BHK), células HeLa y células Vero, (2) células de anfibio tales como Xenopus oocytes, ó (3) células de insecto tales como sf9, sf21 y Tn5. Las células vegetales conocidas incluyen, por ejemplo, las derivadas del género Nicotiana, más especialmente, las células derivadas de Nicotiana tabacum, que es sometido a cultivo del callo. Las células de hongos conocidas incluyen levaduras tales como del género Saccharomyces, más específicamente, Saccharomyces cerevisiae, u hongos filamentosos tales como los del género Aspergillus, mas específicamente Aspergillus niger.

Cuando se utilizan las células procarióticas, los sistemas de producción son los que emplean células bacterianas. Las células bacterianas conocidas incluyen Escherichia coli (E. coli) y Bacillus subtilis.

Por introducción vía transformación del gen del anticuerpo deseado en estas células y cultivando las células transformadas in vitro, puede ser obtenido el anticuerpo. El cultivo se lleva a cabo según los métodos conocidos. Por ejemplo, como el medio de cultivo pueden usarse, DMEM, MEM, RPMI1640 e IMDM, y pueden usarse, en combinación, suplementos de sueros tales como el suero fetal de ternera (FCS). Además, pueden producirse anticuerpos in vivo implantando células, en las que ha sido introducido el gen del anticuerpo, en la cavidad abdominal de un animal, y semejante.

Como otros sistemas de producción in vivo, pueden citarse aquellos que emplean animales y los que emplean plantas. Cuando se usan animales, los sistemas de producción son los que emplean mamíferos e insectos.

En cuanto a mamíferos pueden usarse cabras, cerdos, ovejas, ratones y ganado vacuno (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Asimismo, como insectos, puede usarse el gusano de seda.

Cuando se usan vegetales, puede usarse, por ejemplo, el tabaco.

Los genes de los anticuerpos se introducen en estos animales o vegetales, y los anticuerpos son producidos en tales animales o vegetales, y recuperados. Por ejemplo un gen de un anticuerpo se inserta en la parte media del gen que codifica la proteína que es intrínsecamente producida en la leche, tal como caseína \beta de cabra, para preparar genes de fusión. Los fragmentos de DNA que contienen el gen de fusión en el que ha sido insertado el gen del anticuerpo son inyectados en un embrión de cabra, y el embrión es introducido en una cabra hembra. El anticuerpo deseado se obtiene a partir de la leche producida por la cabra transgénica nacida de la cabra que recibió el embrión o su descendencia. Con objeto de aumentar la cantidad de leche que contiene el anticuerpo deseado producido por la cabra transgénica, pueden administrarse hormonas a la cabra transgénica, según sea apropiado. (Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

Cuando se usan gusanos de seda, se infecta el gusano de seda con baculovirus, en los que ha sido insertado el gen de un anticuerpo deseado, y el anticuerpo deseado puede ser obtenido desde el fluido corporal del gusano de seda (Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594). Además, cuando se usa el tabaco, el gen del anticuerpo deseado se inserta en un vector de expresión para plantas, por ejemplo el pMON 530, y después el vector se introduce en una bacteria tal como Agrobacterium tumefaciens. El tabaco tal como Nicotina tabacum es infectado luego con la bacteria obteniendo el anticuerpo deseado desde las hojas del tabaco (Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).

Cuando se produce un anticuerpo en sistemas de producción in vitro o in vivo, según se ha descrito anteriormente, el DNA que codifica la cadena pesada (cadena H) o la cadena ligera (cadena L) del anticuerpo, puede ser insertado por separado en un vector de expresión y los hospedantes son transformados simultáneamente, o el DNA que codifica la cadena H y la cadena L puede ser integrado en un único vector de expresión y el hospedante es transformado con él (véase la solicitud de patente internacional WO 94-11523).

El anticuerpo producido tal como se ha descrito anteriormente puede ser unido a moléculas diversas tales como polietilenglicol (PEG) para usar como un anticuerpo modificado. "Anticuerpo" tal como se usa en esta memoria, incluye estos anticuerpos modificados. Con objeto de obtener un anticuerpo modificado tal, el anticuerpo obtenido puede ser modificado químicamente. Estos métodos han sido establecidos ya en el campo de la técnica.

2. Separación y purificación de los anticuerpos 2-1. Separación y purificación de los anticuerpos

Los anticuerpos producidos y expresados según se ha descrito anteriormente, pueden ser separados desde el interior o el exterior de la célula o desde el hospedante, y luego pueden ser purificados hasta obtener homogeneidad. La separación y purificación del anticuerpo para usar en la presente invención, puede ser llevada a cabo mediante cromatografía de afinidad. En cuanto a la columna usada para tal cromatografía de afinidad pueden citarse la columna de Proteína A y la columna de Proteína G. Son ejemplos de los vehículos para la columna de Proteína A Hyper D, POROS, Sepharose F.F. y semejantes.

Alternativamente, pueden usarse los métodos de separación y purificación convencionalmente usados para proteínas, sin limitación alguna. La separación y purificación de un anticuerpo para usar en la presente invención, puede efectuarse combinando, según sea apropiado, cromatografía distinta de la cromatografía de afinidad antes citada, filtración, ultrafiltración, saladura, diálisis y semejante. La cromatografía incluye, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, filtración en gel, y semejantes. Estas cromatografías pueden aplicarse a HPLC. Alternativamente, puede usarse cromatografía de fase invertida.

2-2. Determinación de la concentración de anticuerpos

La concentración del anticuerpo obtenido en 2-1 anterior, puede determinarse mediante la medida de la absorbancia o mediante el ensayo inmunoabsorbente con enzimas ligadas (ELISA), y semejante. Por tanto, cuando se emplea la medida de la absorbancia, el anticuerpo para usar en la presente invención o una muestra que contiene el anticuerpo, es diluida apropiadamente con PBS (-) y después se mide la absorbancia en 280 nm, seguido de calculo usando el coeficiente de absorción de 1,35 DO a 1 mg/ml. Cuando se usa el método ELISA, la medida se lleva a cabo del modo siguiente. 100 \mul de IgG de cabra anti-humano (fabricada por BIO SOURCE) diluida a 1 \mug/ml en el seno de solución tampón de bicarbonato 0,1 M, pH 9,6. se añade a una placa de 96 pocillos (fabricada por Nunc) y se incuba durante la noche a 4ºC para inmovilizar el anticuerpo.

Después de bloquear, se añaden 100 \mul de un anticuerpo de la presente invención o de una muestra que contiene el anticuerpo, apropiadamente diluidos, o 100 \mul de IgG humana de concentración conocida, como patrón, y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar, se añaden 100 \mul de anticuerpo anti-IgG humana marcado con fosfatasa alcalina (fabricado por BIO SOURCE), diluido 5000 veces, y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar, la solución de sustrato se añade y se incuba, seguido de la medida de la absorbancia en 405 nm, usando el lector de placas MICROPLATE READER Modelo 3550 (fabricado por Bio-Rad) para calcular la concentración del anticuerpo deseado.

3. Análisis de FCM

La reactividad del anticuerpo para usar en la presente invención con células tumorales linfáticas, puede ser investigada mediante el análisis de citometría de flujo (FCM). Las células utilizadas pueden ser líneas celulares establecidas o células recién aisladas. En cuanto a las líneas celulares establecidas, pueden emplearse, por ejemplo, como una línea de células T, RPMI 8402 (ATCC CRL-1994), CCRF-CEM (ATCC CCL-119) derivada de leucemia linfoblástica aguda, HPB-ALL (FCCH1018) derivada de leucemia linfática aguda, HPB-MLT (FCCH1019) derivada de linfoma T, JM (FCCH1023) derivada de leucemia linfática aguda, MOLT-4 (ATCC CRL-1582) derivada de leucemia linfoblástica aguda, Jurkat (FCCH1024) derivada de leucemia linfática aguda, CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1) derivada de leucemia linfoblástica aguda, MT-1 (FCCH1043) derivada de la leucemia de células T del adulto, KT-3, derivada del linfoma de Lennert (Shimizu, S. et al., Blood (1988) 71, 196-203), y semejantes; en cuanto a la línea de células B la CESS de células transformadas con virus EB (ATCC TIB-190), la SKW 6.4 de células B positivas de virus EB (ATCC TIB-215), MC116 (ATCC CRL-1649) derivada de linfoma B, CCRF-SB (ATCC CCL-120) derivada de la leucemia linfoblástica aguda, células B RPMI 6410 (FCCH6047) derivada de un paciente con leucemia mielocítica aguda, Daudi (ATCC CCL-213) derivada del linfoma de Burkitt, EB-3 (ATCC CCL-85) derivada del linfoma de Burkitt, Jijoye (ATCC CCL-87) derivada del linfoma de Burkitt, Raji (ATCC CCL-86) derivada del linfoma de Burkitt, y; en cuanto a la línea de células no T, no B, HL-60 (ATCC CCL-240) derivada de leucemia mielocítica aguda, THP-1 (ATCC TIB-202) derivada de leucemia monocítica aguda, U-937 (ATCC CRL-1593) derivada de linfoma histiocítico, K-562 (ATCC CCL-243) derivada de leucemia mielocítica crónica, y semejantes.

Después de lavar las células anteriores con PBS(-), se añaden 100 \mul de un anticuerpo o de un anticuerpo testigo, diluido a 25 \mug/ml con la solución tampón FACS (PBS(-) que contiene suero fetal bovino al 2% y azida de sodio al 0,1%), y luego se incuba sobre hielo durante 30 minutos. Después de lavar con la solución tampón FACS, se añaden 100 \mul de una solución de 25 \mug/ml de anticuerpo de cabra anti-ratón marcado con FITC, (GAM, fabricado por Becton Dickinson) y luego se incuba sobre hielo durante 30 minutos. Después de lavar con la solución tampón FACS, las células se suspenden en 600 \mul ó 1 ml de la solución tampón FACS y puede medirse la intensidad de la fluorescencia de cada célula usando el FACScan (fabricado por Becton Dickinson).

Partiendo del valor medido de la intensidad de la fluorescencia de cada una de las células, puede conocerse la reactividad del anticuerpo para usar en la presente invención con cada una de las células. Por tanto, del valor de la intensidad de la fluorescencia medida para cada una de las células, puede saberse si el antígeno HM1.24 es expresado en cada una de las células (positivo o negativo) o puede conocerse el grado de expresión. La presencia y la intensidad de la expresión del antígeno HM1.24 en células de tumores linfáticos se describe en el Ejemplo 2.2. El análisis por FCM figura más adelante.

Las células tumorales de tumores linfáticos que pueden ser el objetivo del tratamiento de la presente invención, expresan el antígeno HM1.24. Más específicamente, las células tumorales de tumores linfáticos son, de preferencia, aquellas en las que el porcentaje de positividad del antígeno HM1.24 es no inferior al 5%. Más específicamente, las células tumorales de tumores linfáticos son, de preferencia, aquellas en las que el porcentaje de positividad del antígeno HM1.24 es 20% o mayor. Más específicamente, las células tumorales de tumores linfáticos son, de preferencia, aquellas en las que el porcentaje de positividad del antígeno HM1.24 es 50% o mayor. Más específicamente, las células tumorales de tumores linfáticos son, de preferencia, aquellas en las que el porcentaje de positividad del antígeno HM1.24 es 80 % o mayor.

4. Actividad citotóxica 4-1. Medida de la actividad citotóxica dependiente del complemento, CDC

El anticuerpo para usar en la presente invención es uno que posee, por ejemplo, actividad CDC como la actividad citotóxica.

La actividad CDC de un agente terapéutico para tumores linfáticos, de la presente invención, puede medirse del modo siguiente. En primer lugar, se preparan las células diana a 4 x 10^{5} células/ml en un medio adecuado, por ejemplo, un medio RPMI1640 que contiene suero fetal bovino al 10% (fabricado por GIBCO-BRL). Como células diana pueden usarse las CCRF-CEM (ATCC CCL-119), CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1), HPB-MLT (FCCH1019), EB-3 (ATCC CCL-85), MC116 (ATCC CRL-1649), CCRF-SB (ATCC CCL-120), K-562 (ATCC CCL-243), y semejante. Cincuenta \mul de estas células se añaden a una placa de fondo plano, de 96 pocillos (placas fabricadas por FALCON) y la placa se incuba en un incubador de CO_{2} a 37ºC, durante la noche.

Luego, se añade el anticuerpo cuya actividad CDC ha de ser medida, se incuba durante 60 minutos, y después se añade el complemento apropiadamente diluido, por ejemplo el Baby Rabbit Complement (fabricado por CEDARLANE), y se incuba durante 2 horas. A cada uno de los pocillos se añaden 10 \mul de Alamar Bule /fabricado por BIO SOURCE) y se incuba durante 4 horas, midiéndose luego la intensidad de su fluorescencia (longitud de onda de excitación 530 nm, longitud de onda de emisión 590 nm) usando el sistema de medida de la fluorescencia CytoFluor 2350 (fabricado por MILLIPORE). La actividad citotóxica (%) puede calcularse según la expresión (A-C)/(B-C) x 100, en la que A es la intensidad de la fluorescencia cuando se incuba en presencia del anticuerpo, B es la intensidad de la fluorescencia cuando se incuba en el medio aislado que no contiene anticuerpo y C es la intensidad de la fluorescencia del pocillo que no contiene células.

4-2. Medida de la actividad citotóxica celular dependiente de anticuerpos, ADCC

El anticuerpo para usar en la presente invención es uno que posee, por ejemplo, una actividad ADCC como la actividad citotóxica.

La actividad ADCC de un agente terapéutico para tumores linfáticos se la presente invención, puede medirse del modo siguiente. En primer lugar, se aíslan células mononucleares como las células efectoras, procedentes de sangre periférica humana o médula ósea mediante el método de centrifugación de gravedad. Como células diana, células CCRF-CEM (ATCC CCL-119), CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1), HPB-MLT (FCCH1019), EB-3 (ATCC CCL-85), MC116 (ATCC CRL-1649), CCRF-SB (ATCC CCL-120), K-562 (ATCC CCL-243), o semejantes, se marcan con ^{51}Cr para ser preparadas como las células diana. Seguidamente, se añade a las células diana marcadas el anticuerpo cuya actividad ADCC ha de ser medida y se incuba. Se añaden después las células efectoras en una proporción adecuada respecto a las células diana y se incuba.

Después de realizada la incubación se recoge el sobrenadante y se mide la radiactividad usando un contador de radiaciones gamma en el que puede emplearse NP-40 al 1% para medir el máximo de radiactividad libre. La actividad citotóxica (%) puede calcularse según la expresión (A-C)/(B-C) x 100, en la que A es la radiactividad (cpm) liberada en presencia del anticuerpo, B es la radiactividad (cpm) liberada por NP-40, y C es la radiactividad (cpm) liberada por el medio aislado, que no contiene anticuerpo.

4-3. Intensificación de la actividad citotóxica

Con objeto de poner de manifiesto una actividad citotóxica tal como una actividad ADCC y una actividad CDC, se ha preferido usar C\gamma, en particular C\gamma1 y C\gamma3, como la región constante (región C) del anticuerpo en los seres humanos. Además, puede inducirse una actividad ADCC o una actividad CDC a añadiendo, alterando o modificando parte de los aminoácidos de la región C del anticuerpo.

A título de ejemplo, puede citarse la construcción de un polímero semejante a IgM de la IgG mediante sustitución de aminoácidos (Smith, R.I.F and Morrison, S.L. BIO/TECHNOLOGY (1994) 12, 683-688), la construcción de un polímero semejante a IgM de la IgG mediante adición de aminoácidos (Smith, R.I.F. et al., J. Immunology (1995) 154, 2226-2236), la expresión de un gen ligado en tándem, que codifica la cadena L (Shuford, W. et al., Science (1991) 252, 724-727), la dimerización de IgG mediante sustitución de aminoácidos (Caron, P.C. et al., J. Exp. Med. (1992) 176, 1191-1195, Shopes, B., J. Immunology (1992) 148, 2918-2922), la dimerización de IgG por modificación química (Wolff, E. A. et al., Cancer Res. (1993) 53, 2560-2565), y la introducción de la función efectora por alteración de un aminoácido o de aminoácidos de la región de la rótula del anticuerpo (Norderhaug, L. et al., Eur. J. Immunol. (1991) 21, 2379-2384), y semejantes. Esto puede conseguirse por medio de mutagénesis de oligómero específica del sitio, usando un cebador, la adición de una secuencia de bases usando un sitio de segmentación de una enzima de restricción, o el uso de un modificador químico que crea un enlace covalente.

5. Confirmación de los efectos terapéuticos

Los efectos terapéuticos de un agente terapéutico para usar en la presente invención para tumores linfáticos, pueden confirmarse administrando el anticuerpo de uso en la presente invención, a animales que ha siso sometidos a trasplante con células de tumores linfáticos, y evaluando luego el efecto antitumoral en los animales.

Como células de tumores linfáticos a administrar al animal, puede usarse una línea celular establecida o células recién aisladas. Como línea celular establecida pueden usarse las células CCRF-CEM (ATCC CCL-119), HPB-MLT (FCCH1019), MOLT-4 (ATCC CRL-1582), CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1) y semejantes, como la línea de células T, y las células CESS (ATCC TIB-190), SKW 6.4 (ATCC TIB-215), CCRF-SB (ATCC CCL-120), RPMI 6410 (FCCH6047), EB-3 (ATCC CCL-85), y semejantes, como la línea de células B.

Los animales que reciben el trasplante son, preferiblemente, aquellos en los que las funciones inmunológicas han sido reducidas o están ausentes. Por ejemplo, puede emplearse un ratón desprovisto de sistema inmunitario, un ratón SCID, un ratón beige, una rata desprovista de sistema inmunitario, y semejante. Los efectos antitumorales que han de ser evaluados pueden confirmarse mediante la medida del volumen y el peso del tumor, o del período de supervivencia de los animales, y semejante.

Como se expone en los Ejemplos que figuran seguidamente, la administración del anticuerpo anti-HM1.24 dio por resultado la supresión del aumento del volumen del tumor y, además, la prolongación del período de supervivencia de los ratones a los que se había trasplantado el tumor. Estos hechos indicaron que el anticuerpo anti-HM1.24 posee efecto antitumoral sobre los tumores linfáticos.

6. Vía de administración y preparación farmacéutica

Los agentes terapéuticos para el tratamiento de tumores linfáticos, de la presente invención, pueden administrarse, o bien sistémicamente o bien localmente, por vía parenteral, por ejemplo inyección intravenosa tal como infusión gota a gota, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, e inyección subcutánea. El método de administración puede ser escogido según sea apropiado, dependiendo de la edad y de las condiciones del paciente. La dosis efectiva se escoge entre el intervalo de 0,01 mg a 100 mg por kg de peso, por administración. Alternativamente, puede escogerse la dosis en el intervalo de 1 a 1000 mg, de preferencia 5 a 50 mg, por paciente.

Los agentes terapéuticos para el tratamiento de tumores linfáticos, de la presente invención, pueden contener excipientes o aditivos farmacéuticamente aceptables, dependiendo de la vía de administración. Ejemplos de tales excipientes o aditivos incluyen agua, un disolvente orgánico farmacéutico aceptable, colágeno, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, un polímero carboxivinílico, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilato sódico, alginato sódico, dextrano hidrosoluble, carboximetilalmidón sódico, pectina, metilcelulosa, etilcelulosa, goma de xantano, goma arábiga, caseína, gelatina, agar, diglicerina, propilenglicol, polietilenglicol, vaselina, parafina, alcohol estearílico, ácido esteárico, albúmina de suero humano (HSA), manitol, sorbitol, lactosa, un tensioactivo farmacéuticamente aceptable, y semejante. Los aditivos usados se escogen, aun cuando no se limitan a ellos, entre los anteriores o sus mezclas, dependiendo de la forma farmacéutica de administración.

Las enfermedades a tratar según la presente invención, son tumores linfáticos (con exclusión de mielomas) que tienen un antígeno sobre las células tumorales, a las que se une el anticuerpo para usar en la presente invención. Específicamente, pueden citarse, leucemia linfática B aguda (B-ALL), leucemia linfática B crónica (B-CLL), linfoma pre-B, linfoma de Burkitt, linfoma folicular, linfoma del palio folicular, linfoma difuso, leucemia linfático T agudo (T-ALL), leucemia linfático T crónico (T-CLL), leucemia de células T del adulto (ATL), linfoma T periférico no ATL (PNTL), y semejantes. Los agentes terapéuticos de la presente invención son útiles como agentes terapéuticos para el tratamiento de estos tumores linfáticos.

Ejemplos

La presente invención será explicada ahora en esta memoria con más detalle, con referencia a los Ejemplos que siguen. Hay que hacer notar que la presente invención no se limita, en modo alguno, a estos Ejemplos.

Ejemplo 1 Construcción del anticuerpo anti-HM1.24 1. Preparación de ascitis de ratón que contiene el anticuerpo anti-HM1.24

Se obtuvieron hibridomas que producen el anticuerpo anti-HM1.24 según el método de Goto, T. et al. (Blood (1994) 84, 1922-1930).

A un ratón BALB/c (criado por CLEA, Japón), que había recibido previamente una administración intraperitoneal de 500 \mul de 2,6,10,14-tetrametilpentadecano (fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 11 y 3 días antes, se inyectaron por vía intraperitoneal 5 x 10^{6} células de hibridoma. Desde el día 10 después de la inyección de las células de hibridoma, se recogió la ascitis que se acumuló en la cavidad abdominal del ratón, mediante un Happycas (fabricado por Medikit) con aguja del calibre 19. La ascitis recogida se sometió a centrifugación, dos veces, con una velocidad de 1000 y 3000 rpm usando una centrífuga de velocidad baja RLX-131 (fabricada por Tomy Seiko) para separar el hibridoma y contaminantes tales como células sanguíneas y semejantes.

2. Purificación de anticuerpo anti-HM1.24 procedente de la ascitis del ratón

La purificación del anticuerpo anti-HM1.24 procedente de la ascitis del ratón, se llevó a cabo según el método siguiente. Después de añadir una cantidad igual de PBS(-) a la ascitis del ratón, la mezcla se filtró usando un filtro de filtra hueca Mediaprep (fabricado por MILLIPORE) y luego se purificó por afinidad usando un instrumento de purificación de anticuerpos, de alta velocidad, ConSepLC100 (fabricado por MILIPORE) y la columna de Proteína A Hyper D (volumen de la columna, 20 ml, fabricada por Nihon Gais), y PBS(-) como la solución tampón de adsorción y tampón de citrato sódico 0,1 M (pH 4) como solución tampón de elución, según las indicaciones marcadas. Las fracciones eluídas fueron ajustadas inmediatamente a pH 7,4, aproximadamente, añadiendo Tris.HCl 1 M (pH 8,0), luego fueron sometidas a concentración y reemplazo del tampón a PBS(-) usando un concentrador de ultrafiltración centrífugo Centriprep 10, y después fue esterilizado por filtración con un filtro de membrana MILLEX-GV (fabricado por MILLIPORE) que tenía un tamaño de poro de 0,22 \mum, obteniendo el anticuerpo anti-HM1.24 purificado.

3. Determinación de la concentración del anticuerpo

La concentración del anticuerpo purificado se determinó por medida de la absorbancia. Así, el anticuerpo purificado se diluyó con PBS(-), se midió la absorbancia en 280 nm y se calculó la concentración utilizando la DO de 1,35 en 1 mg/ml.

Ejemplo 2 Estudio de la reactividad del anticuerpo anti HM1.24 con células de tumores linfáticos 1. Purificación de IG2a de ratón, testigo

Se purificó IgG2a de ratón, testigo, del modo siguiente. Ascitis (UPC10) de IgG2a, obtenible en el comercio, (KAPPA), (fabricada por CAPPEL) se disolvió en agua purificada y PBS(-). La solución se filtró usando un filtro de membrana Acrodisc (fabricado por Gelman Sciences) que tenía un tamaño de poro de 0,2 \mum, y luego se purificó por afinidad usando un instrumento de purificación de anticuerpos, de alta velocidad, ConSep LC100 (fabricado por MILLIPORE), y la columna de Proteína A Hyper D (volumen de la columna, 20 ml, fabricada por Nihon Gaisi), y PBS(-) como el tampón de adsorción, y solución tampón de citrato sódico 0,1 M (pH 4) como tampón de elución, según las indicaciones adjuntas.

Las fracciones eluídas fueron ajustadas inmediatamente a pH 7,4 aproximadamente, añadiendo Tris-HCl 1 M (pH 8,0), luego se sometieron a concentración y reemplazo de tampón a PBS(-) usando un concentrador de ultrafiltración centrífugo Centriprep 10, y luego se esterilizó por filtración con un filtro de membrana MILLEX-GV (fabricado por MILLIPORE) que tenía un tamaño de poro de 0,22 \mum, obteniendo la IgG2a del ratón, testigo, purificada.

La determinación de la concentración de la IgG2a del ratón, testigo, se llevó a cabo según el apartado 3 anterior.

Determinación de la concentración del anticuerpo 2. Análisis por FCM

La reactividad del anticuerpo anti-HM1.24 con células de tumores linfáticos, se investigó por análisis por citometría de flujo (FCM). Después de lavar una línea de células T RPMI 8402 (ATCC CRL-1995), CCRF-CEM (ATCC CRL-119) derivada de leucemia linfoblástica aguda, HPB-ALL(FCCH1018) derivada de leucemia linfática aguda, HPB-MLT (FCCH1019) derivada de linfoma T, JM (FCCH1023) derivada de leucemia linfática aguda, MOLT-4 (ATCC CRL-1582) derivada de leucemia linfoblástica aguda, Jurkat (FCCH1024) derivada de leucemia linfática aguda, CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1) derivada de leucemia linfoblástica aguda, MT-1 (FCCH1043) derivada de leucemia de células T del adulto, y KT-3 derivada de linfoma de Lennert (Shimizu, S. et al., Blood (1988) 71, 196-203); como la línea de células B una célula CESS tranformada con virus EB (ATCC TIB-190), una célula B positiva al virus de EB, SKW 6.4 (ATCC TIB-215), MC116 (ATCC CRL-1649) derivado de linfoma B, CCRF-SB (ATCC CCL-120) derivada de leucemia linfoblástica aguda, células B RPMI6410 (FCCH6047) derivada de un paciente con leucemia mielocítica aguda, Daudi (ATCC CCL-213) derivada de linfoma de Burkitt, EB-3 (ATCC CCL-85) derivada de linfoma de Burkitt, Jijoye (ATCC CCL-87) derivado de linfoma de Burkitt, Raji (ATCC CCL-86) derivada de linfoma de Burkitt, y como línea de células no T, no B, HL-60 (ATCC CCL-240) derivada de leucemia mielocítica aguada, THP-1 (ATCC TIB-202) derivada de leucemia monocítica aguda, U-937 (ATCC CRL-1593) derivada de linfoma histiocítico, y K-562 (ATCC CCL-243) derivada de leucemia mielocítica crónica, en el seno de PBS(-),se añadió a ellas 100 \mul del anticuerpo anti-HM1.24 o un anticuerpo de IgG2a de ratón, testigo, purificado, diluido a 25 \mug/ml en la solución tampón FACS (PBS(-) que contenía suero fetal bovino al 2% y azida de sodio al 0,1%), incubándose luego sobre hielo durante 30 minutos.

Después de lavar con la solución tampón FACS se añadieron 100 \mul de anticuerpo de cabra anti-ratón (GAM) marcado con FITC, de 25 \mug/ml, incubándose luego sobre hielo durante 30 minutos. Después de lavar con la solución tampón FACS, las células fueron suspendidas en 600 \mul ó 1 ml de la solución tampón de FACS, y se midió la intensidad de la fluorescencia de cada una de las suspensiones de células usando el FACScan (fabricado por Becton Dickinson). Los resultados, expuestos en las Figuras 1-23, confirmaron que todas las líneas de células T y todas las líneas de células B (excepto las Daudi y Raji que no reaccionaron) reaccionaban con el anticuerpo anti-HM1.24 y expresaban fuertemente el antígeno HM1.24. Por otra parte, ninguna de las líneas de células no T, no B, reaccionó con el anticuerpo anti-HM1.24, y no se detectó la expresión del antígeno en ninguna de ellas.

En los histogramas de las Figuras 1 a 23, se han establecido marcadores de histogramas, de modo que las células negativas representan el 98% y las células positivas el 2%, en la tinción con la IgG2a del ratón, testigo. Entonces, según los marcadores de los histogramas, se ha calculado el porcentaje de las células positivas al antígeno HM1.24 al usar el anticuerpo anti-HM1.24 y el resultado se expone en la Tabla 1. Según el porcentaje de células positivas al antígeno HM1.24, el grado de expresión del antígeno HM1.24 se dividió en 5 estados: -, +/-, +, ++ y +++. Como resultado de ello, se confirmó que todas las líneas de células T y todas las líneas de células B (con excepción de las Daudi y Raji) expresaban fuertemente el antígeno HM1.24 de un modo similar a los resultados expuestos en las Figuras 1 a 23. Asimismo, en todos los casos de las líneas no T, no B, el porcentaje de células positivas al antígeno HM1.24 fue negativo o menor que el 5%, lo que indica que la expresión del antígeno está ausente o es muy pequeña.

TABLA 1

1

Ejemplo 3 Determinación de la actividad CDC

La actividad CDC del anticuerpo anti-HM1.24 para las células de tumores linfáticos, se determinó del modo siguiente:

1. Preparación de las células diana

Como células diana se prepararon las CCRF-CEM (ATCC CCL-119) derivadas de leucemia linfática aguda, CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1) derivadas de leucemia linfoblástica aguda, HPB-MLT (FCCH1019) derivadas de linfoma T, EB-3 (ATCC CCL-85) derivadas de linfoma de Burkitt, MC 116 (ATCC CRL-1649) derivadas de linfoma de Burkitt, CCRF-SB (ATCC CCL-120) derivadas de leucemia linfática aguda y K562 (ATCC CCL-243) derivadas de leucemia mielocítica crónica, a 4 x 10^{5} células/ml, en un medio RPMI 1640 (fabricado por GIBCO-BRL) que contenía suero fetal bovino (GIBCO-BRL) al 10%. Cincuenta \mul de cada una de estas suspensiones de células se añadió a una placa de fondo plano de 96 pocillos (fabricada por FALCON) y se incubó en un incubador de humedad alta con CO_{2} al 5% (Fabricado por TABA) a 37ºC, durante la noche.

2. Preparación del anticuerpo anti-HM1.24

Se preparó el anticuerpo anti-HM1.24 purificado, obtenido en el Ejemplo 1 anterior a 0, 0,2, 2 y 20 \mug/ml en un medio RPMI 1640 que contenía suero fetal bovino (fabricado por GIBCO-BRL), al 10%, y se añadieron 50 \mul de ellos a la placa de fondo plano de 96 pocillos preparada en el apartado 1 anterior. Después de incubar la placa en un incubador de alta humedad, con CO_{2} al 5% (fabricado por TABA1), a 37ºC, durante 60 minutos, se sometió a centrifugación en una centrífuga de velocidad baja 05PR-22 (fabricada por Hitachi), a 1000 rpm, durante 5 minutos, y se separaron 50 \mul del sobrenadante.

3. Preparación del complemento

Complemento de conejo joven (Baby Rabbit Complement) (fabricado por CEDARLANE), se disolvió en agua purificada a 1 ml por vial, y se diluyó después en 5 ml de medio RPMI 1640 (fabricado por GIBCO-BRL) que no contenía FCS. Cincuenta \mul de éste se distribuyeron a la placa de fondo plano de 96 pocillos preparada en la sección 2 anterior y se incubó en un incubador de alta humedad, con CO_{2} al 5% (fabricado por TABA1), a 37ºC, durante 2 horas.

4. Determinación de la actividad CDC

Una vez concluida la incubación, se añadieron a cada pocillo de la placa de fondo plano de 96 pocillos de la sección 3 anterior, 10 \mul de Alamar Bule (fabricado por BIO SOURCE) y se incubó en un incubador (fabricado por TABA1), con humedad alta, y CO_{2} al 5%, a 37ºC, durante 4 horas. Se determinó luego en cada uno de los pocillos la intensidad de la fluorescencia (longitud de onda de excitación 530 nm, longitud de onda de emisión 590 nm) utilizando un sistema de medida de la fluorescencia CytoFluor 2350 (fabricado por MILLIPORE). Se calculó la actividad citotóxica (%) según la expresión (A-C)/(B-C) x 100, en la que A es la intensidad de la fluorescencia cuando se incuba en presencia del anticuerpo, B es la intensidad de la fluorescencia cuando se incuba en el medio aislado que no contiene anticuerpo, y C es la intensidad de la fluorescencia del pocillo que no contiene células.

El resultado obtenido reveló, como se indica en las Figuras 24 y 25, que la K562, que no reaccionaba con el anticuerpo anti-HM1.24, en el análisis de FCM, no ponía de manifiesto citotoxicidad ni incluso cuando se había añadido anticuerpo anti-HM1.24, mientras que las CCRF-CEM, CCRF-HSB-2, HPB-MLT, EB-3, MC116 y CCRF-SB, que habían reaccionado con el anticuerpo anti-HM1.24, ponían de manifiesto citotoxicidad de un modo que dependía de la concentración del anticuerpo anti-HM1.24. Esto aclaró que el anticuerpo anti-HM1.24 exhibe actividad CDC respecto a un tumor linfático que tiene sobre la superficie celular una proteína antigénica a la que se une, específicamente, el anticuerpo anti-HM1.24.

Ejemplo 4 Efectos antitumorales del anticuerpo anti-HM1.24 sobre ratones a los que se ha trasplantado un tumor linfático humano 1. Preparación del anticuerpo que ha de administrarse 1-1. Preparación del anticuerpo anti-HM1.24

El anticuerpo anti-HM1.24 purificado, obtenido en el Ejemplo 1 anterior, se preparó a 1 mg/ml y 200 \mug/ml en PBS(-) esterilizado por filtración, y se usó para los experimentos que siguen.

1-2. Preparación de IgG2a de ratón, testigo

El anticuerpo purificado obtenido en el Ejemplo 2 anterior, se preparó a 1 mg/ml en PBS(-) esterilizado por filtración, y se usó para los experimentos que siguen.

2. Efectos antitumorales del anticuerpo anti-HM1.24 sobre ratones a los que se ha trasplantado un tumor linfático humano 2-1. Preparación de ratones a los que se ha trasplantado un tumor linfático humano

Ratones a los que se había trasplantado un tumor linfático humano, se prepararon del modo siguiente. Células CCRF-HSB-2 (ATCC CCL 120.1) derivadas de leucemia linfoblástica aguda que habían sido subcultivadas in vivo usando ratones SCID (CLEA, Japón) fueron preparadas a 1 x 10^{8} células/ml en un medio RPMI1640 que contenía suero fetal bovino (fabricado por GIBCO-BRL) al 10%. Las suspensiones de células preparadas según se ha descrito antes, fueron inyectadas por vía subcutánea en el abdomen de ratones SCID (machos, de 6 semanas) cada uno de los cuales había recibido el día anterior una administración intraperitoneal de 100 \mul de GM1 anti-asialo (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

2-2. Administración del anticuerpo

El día 7 después del trasplante del tumor, se midió, usando calibres, el diámetro del tumor en el sitio en que se había trasplantado a los ratone las células CCRF-HSB-2 de un tumor linfático humano, Después de calcular el volumen del tumor, los animales fueron agrupados de modo que el volumen tumoral medio de cada uno de los grupos fuera casi igual, unos a otros (8 animales por grupo, 3 grupos). Partiendo del mismo día, 100 \mul de 1 mg/ml ó 200 \mug/ml del anticuerpo anti-HM1.24 ó 1 mg/ml de la IgG2a de ratón, testigo, preparada en el apartado 1 anterior, fueron administrados por vía intraperitoneal a cada uno de los grupos. La administración se llevó a cabo dos veces por semana con un total de 19 veces, de un modo similar. Durante este período, se midió dos veces por semana el diámetro de los tumores, usando calibres, y se calculó el volumen de los tumores.

2-3. Evaluación del efecto antitumoral del anticuerpo anti-HM1.24 sobre ratones a los que se había trasplantado un tumor linfático humano

El efecto antitumoral del anticuerpo anti-HM1.24 se evaluó mediante los cambios del volumen del tumor y el período de supervivencia de los ratones. Como resultado, según se indica en la Figura 26, el aumento de volumen del tumor había sido suprimido en el grupo al que se había administrado el anticuerpo anti-HM1.24 en comparación con el grupo al que se había administrado la IgG2a de ratón, testigo. Asimismo, como se muestra en la Figura 27, se observó un aumento del período de supervivencia en el grupo al que se había administrado el anticuerpo anti-HM1.24 en comparación con el grupo al que se había administrado la IgG2a de ratón, testigo. Estos hechos indicaban que el anticuerpo anti-HM1.24 posee un efecto antitumoral sobre los ratones a los que se ha trasplantado un tumor linfático humano.

Ejemplo de Referencia 1

Preparación de hibridomas que producen el anticuerpo monoclonal anti-HM1.24

De conformidad con el método de Goto, T. et al., Blood (1994) 84, 1992-1930, se prepararon hibridomas que producen el anticuerpo monoclonal anti-HM1.24.

Una línea de células plasmáticas KPC-32 (1 x 10^{7}) derivada de la médula ósea de un paciente con mieloma múltiple humano (Goto, T. et al., Jpn. J. Clin. Hematol. (1991) 32, 1400) se inyectó dos veces en la cavidad abdominal de un ratón BALB/c (fabricado por Charles River) cada seis semanas.

Tres días antes de sacrificar el animal, se inyectaron en el bazo del ratón 1,5 x 10^{6} KPC-32, con objeto de intensificar aun más la aptitud del ratón para producir el anticuerpo (Goto, T. et al., Tokushima, J. Exp. Med. (1990) 37, 89). Después de sacrificar el animal, se extrajo el bazo y el órgano extraído se sometió a fusión celular con las células de mieloma SP2/0 según el método de Groth, de St and Schreidegger (Cancer Research (1981) 41, 3465).

Mediante el Cell ELISA (Posner, M.R. et al., J. Immunol. Methods (1982) 48, 23) usando KPC-32, el sobrenadante del cultivo del hibridoma fue rastreado para determinar el anticuerpo. 5 x 10^{4} KPC-32 fueron suspendidas en 50 ml de PBS y luego se distribuyeron en parte alícuotas en una placa de 96 pocillos (fondo en U, Corning, fabricada por Iwaki), y después se secó al aire a 37ºC, durante la noche. Después de bloquear con PBS que contenía seroalbúmina bovina (BSA) al 1%, se añadió el sobrenadante del cultivo del hibridoma y se incubó a 4ºC durante 2 horas. Luego, se hizo reaccionar a 4ºC, durante 1 hora, anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón, marcado con peroxidasa (fabricado por Zymed). Después de lavar se hizo reaccionar a temperatura ambiente, durante 30 minutos, solución de o-fenilenodiamina (fabricada por Sumitomo Bakelite).

La reacción se detuvo añadiendo ácido sulfúrico 2 N y se midió la absorbancia en 492 nm usando el lector de ELISA (fabricado por Bio-Rad). Con objeto de separar el hibridoma que produce anticuerpos frente a inmunoglobulina humana, el sobrenadante del cultivo del hibridoma positivo había sido adsorbido previamente en suero humano, y la reactividad respecto a otras líneas celulares fue rastreada mediante el método ELISA. Se seleccionaron los hibridomas positivos y se investigó su reactividad con respecto a diversas células mediante citometría de flujo. El último clon del hibridoma seleccionado se clonó dos veces y se inyectó en la cavidad abdominal de ratones BALB/c tratados con pristano, obteniéndose las ascitis de ellos.

Partiendo de la ascitis del ratón, se purificaron los anticuerpos monoclonales mediante precipitación con sulfato amónico y un kit de cromatografía de afinidad de Proteína A (Ampure PA, fabricado por Amersham). Los anticuerpos purificados fueron marcados con FITC usando el kit de unión de FITC Quick Tag (fabricado por Boehringer Mannheim).

Como resultado, los anticuerpos monoclonales producidos por 30 clones del hibridoma reaccionaron con KPC-32 y RPMI 8226. Después de la clonación se investigó la reactividad del sobrenadante del cultivo de estos hibridomas con otras líneas celulares o células mononucleares de sangre periférica.

De ellos, 3 clones produjeron anticuerpos monoclonales que reaccionaron específicamente con la célula plasmática. De entre los 3 clones, un clon de hibridoma que fue el más útil para el análisis por citometría de flujo y que tenía actividad CDC para RPMI 8226, fue seleccionado y designado como HM1.24. La subclase del anticuerpo monoclonal producido por este hibridoma se determinó mediante un ensayo ELISA usando un anticuerpo de conejo anti-ratón, específico de la subclase, (fabricado por Zymed). El anticuerpo anti-HM1.24 tenía una subclase de IgG2a\kappa. El hibridoma HM1.24 que produce el anticuerpo anti- HM1.24 fue depositado internacionalmente bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest como FERM BP-5233 el 14 de Septiembre de 1995, en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, de 1-3, Higashi 1-chome, ciudad de Tsukuba, pref. de Ibaraki, Japón.

Ejemplo de Referencia 2

Preparación del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado

Se obtuvo el anticuerpo anti-HM1.24 humanizado del modo siguiente.

Partiendo del hibridoma HM1.24 preparado en el Ejemplo de Referencia 1, se preparó RNA total por el método convencional. A partir de éste se sintetizó cDNA que codifica la región V del anticuerpo de ratón, y se amplificó por el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y el método 5'-RACE. Se obtuvo un fragmento de DNA que contenía el gen que codifica la región V de ratón, que se ligó a cada vector de clonación pUC plasmídico y luego se introdujo en células competentes de E. coli obteniendo un transformante de E. coli. El plásmido anterior se obtuvo a partir del transformante. La secuencia de nucleótidos de la región de codificación del cDNA del plásmido se determinó por el método convencional y se determinó la región de determinación de la complementariedad (CDR) de cada región V.

Con objeto de construir un vector que expresara anticuerpo anti-HM1.24 quimérico, cDNA que codifica la región V de la cadena L y la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 del ratón, se insertó en el vector HEF. Además, con objeto de construir el anticuerpo anti-HM1.24 humanizado, una CDR de la región V de un anticuerpo anti-HM1.24 del ratón se injertó en un anticuerpo humano mediante el método de injerto de CDR. La cadena L del anticuerpo humano REI se usó como la cadena L del anticuerpo humano. FRs 1 a 3 del anticuerpo humano HG3 fueron usadas para las regiones del marco de lectura (FRs) 1 a 3 de la cadena H del anticuerpo humano, y se usó el FR4 del anticuerpo humano JH6 para FR4. Algunos aminoácidos del FR de la región V de la cadena H fueron reemplazados, por lo que el anticuerpo trasplantado con la CDR pudo formar un sitio de unión antigénico adecuado.

Con objeto de expresar en una célula de mamífero el gen de la cadena L y la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado construido, cada gen fue introducido por separado en el vector HEF construyendo un vector que expresa la cadena L o la cadena H, respectivamente, del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado.

Por introducción simultánea de estos dos vectores de expresión en las células CHO, se estableció una línea celular que produce el anticuerpo anti-HM1.24 humanizado. La actividad de unión antigénica y la actividad de inhibición de la unión para la línea celular amniónica humana WISH del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado, que se obtuvo por cultivo de esta línea celular, fueron investigadas mediante el método Cell ELISA. El resultado obtenido indicó que el anticuerpo anti-HM1.24 humanizado posee una actividad de unión antigénica igual a la del anticuerpo quimérico, y para la actividad de inhibición de la unión usando un anticuerpo anti-HM1.24 de ratón biotinilado también, tenía una actividad igual a la del anticuerpo quimérico o anticuerpo del ratón.

Circunstancialmente, E. coli que posee el plásmido que contiene el DNA que codifica la región V de la cadena L y el de la región V de la cadena H del anticuerpo quimérico anti-HM1.24 han sido depositados internacionalmente bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest como Escherichia coli DH5\alpha (pUC19-1.24L-g\kappa) y Escherichia coli DH5\alpha (pUC19-1.24H-g\gamma1) el 29 de Agosto de 1996 en el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, de 1-3 Higashi 1-chome, ciudad de Tsukuba, Pref. de Ibaraki, Japón, como FERM BP-5646 y FERM BP-5644, respectivamente. Además, E. coli que posee el plásmido que contiene el DNA que codifica la versión a (SEQ ID NO:2) de la región V de la cadena L o el de la versión r (SEQ ID NO: 3) de la región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado, han sido depositados internacionalmente bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest como Escherichia coli DH5\alpha (pUC19-RV-La-AHM-g\kappa) y Escherichia coli DH5\alpha (pUC19-RVHr-AHM-g\gamma1)1.24H-g\gamma1), respectivamente, el 29 de Agosto de 1996 en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, de 1-3 Higashi 1-chome, ciudad de Tsukuba, Pref. de Ibaraki, Japón, como FERM BP-5645 y FERM BP-5643, respectivamente. Además, E. coli que posee el plásmido que contiene el DNA que codifica la versión s (SEQ ID NO:4) de la región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado, ha sido depositado internacionalmente bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest como Escherichia coli DH5\alpha (pUC19-RVHs-AHM-g\gamma1) el 29 de Septiembre de 1997 en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, de 1-3 Higashi 1-chome, ciudad de Tsukuba, Pref. de Ibaraki, Japón, como FERM BP-6127.

Ejemplo de Referencia 3

Clonación de cDNA que codifica la proteína del antígeno HM1.24

Se clonó el cDNA que codifica la proteína del antígeno HM1.24, reconocida específicamente por el anticuerpo anti-HM1.24.

1. Construcción de una biblioteca de cDNA 1) Preparación de RNA total

A partir de la línea celular de mieloma múltiple humano KPMM2, se preparó RNA total según el método de Chirgwin et al., (Biochemistry, 18, 5294 (1979)). Así, 2,2 x 10^{8} KPMM2 se homogeneizaron completamente en 20 ml de tiocianato de guanidina 4 M (fabricado por Nacalai Tesque Inc.) El homogeneizado se distribuyó en capas sobre una solución de cloruro de cesio 5,3 M, en un tubo de centrífuga, que luego se sometió a centrifugación en un rotor SW40 de Beckman, a 31.000 rpm y 20ºC, durante 24 horas para precipitar el RNA. El precipitado de RNA se lavó con etanol de 70% y después se disolvió en 300 \mul de Tris-HCl 10 mM (pH 7,4) que contenía EDTA 1 mM y SDS al 0,5%. Se añadió a esto pronasa (fabricada por Boehringer) hasta una concentración de 0,5 mg/ml y después se incubó a 37ºC durante 30 minutos. La mezcla se extrajo con fenol y cloroformo y se precipitó el RNA con etanol. El precipitado de RNA se disolvió luego en 200 \mul de Tris-HCl 10 mM (pH 7,4) que contenía EDTA 1 mM.

2) Preparación de poli(A)+RNA

Se purificó poli(A)+RNA usando como material 500 \mug del RNA total preparado según se ha descrito antes, mediante el kit de aislamiento de mRNA Fast Track 2.0 (fabricado por Invitrogen) según el régimen incorporado al kit.

3) Construcción de una biblioteca de cDNA

Se sintetizó cDNA de doble cadena usando como material 10 \mug del poli(A)+RNA anterior mediante el kit de síntesis de cDNA TimeSaver cDNA Synthesis (fabricado por Pharmacia) según las indicaciones unidas al kit, y después se ligó al adaptador de EcoRI suministrado en el kit, usando el Directional Cloning Toolbox (fabricado por Pharmacia) según las indicaciones unidas al kit. El tratamiento de quinación y el de la enzima de restricción Notl del adaptador de EcoRI fueron llevados a cabo según las indicaciones unidas al kit. Además, el cDNA de doble cadena añadido al adaptador, que posee un tamaño de aproximadamente, 500 bp o más, fue separado y purificado usando un gel de agarosa de punto de fusión bajo (fabricado por Sigma) al 1,5% obteniendo, aproximadamente, 40 \mul de cDNA de doble cadena añadido al adaptador.

El cDNA de doble cadena añadido al adaptador construido de este modo, fue ligado usando el vector pCOS1 (solicitud de patente japonesa 8-255196) y DNA ligasa T4 (fabricada por GIBCO-BRL) que había sido tratada con las enzimas de restricción EcoRI y Notl y fosfatasa alcalina (fabricada por Takara Shuzo) para construir una biblioteca de cDNA. La biblioteca de cDNA construida fue transducida a una cepa de E. coli DH5\alpha (fabricada por GIBCO-BRL) y consiguientemente se estimó que era un clon independiente que tenía un tamaño total de 2,5 x 10^{6}, aproximadamente.

2. Clonación mediante el método de expresión directa 1) Transfección a células COS-7

5 x 10^{5} clones, aproximadamente, del E. coli transducido anterior, fueron cultivados en un medio 2-YT (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) que contenía ampicilina, 50 \mug/ml, para amplificar el cDNA, que fue sometido al método del álcali (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) para recuperar desde el E. coli DNA plasmídico. El DNA plasmídico obtenido de este modo fue transfectado a células XOS-7 mediante el método de la electroporación usando el Gene Pulser Instrument (fabricado por Bio-Rad).

Así, 10 \mug del DNA plasmídico purificado se añadieron a 0,8 ml de la solución de células COS-7 en que las células habían sido suspendidas en PBS a 1 x 10^{7} células/ml, y la mezcla se sometió a impulsos de 1500 V y una capacidad de 25 \muFD. Al cabo de un período de recuperación de 10 minutos, a temperatura ambiente, las células electroporadas fueron cultivadas en un medio de cultivo DMEM (fabricado por GIBCO-BRL) que contenía suero fetal bovino (fabricado por GIBCO-BRL) al 10%, a 37ºC y CO_{2} al 5%, durante 3 días.

2) Preparación de una placa de separación (panning dish)

Se preparó una placa de separación que había sido revestida con anticuerpo anti- HM1.24, mediante el método de B. Seed et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3365-3369 (1987)). Así, se añadió anticuerpo anti-HM1.24 de ratón a Tris-HCl 50 mM (pH 9,5) hasta una concentración de 10 \mug/ml. Tres mililitros de la solución del anticuerpo preparada de este modo se añadieron a una placa de cultivos celulares de 60 mm de diámetro y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de lavar tres veces con solución de NaCl 0,15 M, se añadieron a la placa PBS que contenía suero fetal bovino al 5%, EDTA 1 mM y NaN_{3} al 0,02%. Después de bloquear, ésta se usó para la clonación que
sigue.

3) Clonación de una biblioteca de cDNA

Las células COS-7, transfectadas como se ha descrito anteriormente, fueron separadas con PBS que contenía EDTA 5 mM. Después de lavar las células una vez con PBS que contenía suero fetal bovino al 5%, fueron suspendidas en PBS que contenía suero fetal bovino al 5% y NaN_{3} al 0,02% hasta una concentración de 1 x 10^{6} células/ml. La suspensión se añadió a la placa de separación preparada según se ha descrito, y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas aproximadamente. Después de lavar suavemente tres veces con PBS que contenía suero fetal bovino al 5% y NaN_{3} al 0,02%, se recuperó el DNA plasmídico a partir de las células unidas a la placa de separación, usando una solución que contenía SDS al 0,6% y EDTA 10 mM.

El DNA plasmídico recuperado fue transducido a E. coli DH5\alpha. Después de amplificar como se ha descrito anteriormente, se recuperó el DNA plasmídico mediante el método del álcali. El DNA plasmídico recuperado se transfectó en células COS-7 mediante el método de electroporación y se recuperó el DNA plasmídico desde las células unidas, según se ha descrito antes. Un procedimiento operatorio similar se repitió una vez y el DNA plasmídico recuperado se sometió a digestión con las enzimas de restricción EcoRI y Notl, confirmando con ello la concentración de una inserción que tenía un tamaño de 0,9 kbp, aproximadamente. Además, células de E. coli en las que una parte del DNA plasmídico recuperado había sido transducido, fueron inoculadas a una placa de agar 2-Yt que contenía 50 \mug/ml de ampicilina. Después de cultivar durante la noche, se recuperó DNA plasmídico partiendo de una colonia única. Se sometió a digestión con las enzimas de restricción EcoRI y Notl obteniendo un clon p3.19 en el que el tamaño de la inserción era 0,9 kpb, aproximadamente.

Este clon se hizo reaccionar usando el kit de secuenciación cíclico, terminador, con colorante PRISM (fabricado por Perkin Elmer) según las indicaciones unidas al kit, y se determinó la secuencia de nucleótidos usando el Secuenciador de DNA ABI 373 A (fabricado por Perkin Elmer). La secuencia de nucleótidos y las secuencia de aminoácidos correspondiente, se indican en SEQ ID NO: 1.

Aplicabilidad industrial

Los resultados del análisis por FCM revelaron que el anticuerpo anti-HM1.24 reaccionaba fuertemente con la mayor parte de las células derivadas de tumores linfáticos humanos, indicando que en muchos de los tumores linfáticos, se expresa fuertemente un polipéptido que posee un epítopo reconocido por el anticuerpo anti-HM1.24. Además, en ratones trasplantados con un tumor linfático humano que reacciona con el anticuerpo anti-HM1.24, la administración del anticuerpo anti-HM1.24 dio por resultado la supresión del aumento del volumen tumoral y además la ampliación del período de supervivencia. Estos hechos indican que el anticuerpo anti-HM1.24 o anticuerpos reconocidos por un polipéptido que posee un epítopo reconocido por el anticuerpo anti-HM1.24 poseen actividad citotóxica respecto a muchos tumores linfáticos, sugiriendo con ello que el anticuerpo puede ser útil para el tratamiento de pacientes con tumores linfáticos.

Referencia a los microorganismos depositados bajo el Tratado de Cooperación de Patentes, Regla 13-2 y el nombre del Instituto Depositario.

Instituto depositario

Nombre: National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology.

Dirección:1-3, Higashi 1-chome, ciudad de Tsukuba, pref. de Ibaraki, Japón.

Microorganismo (1)

Nombre: Escherichia coli DH5\alpha (pRS38-pUC19)

Número de catálogo: FERM BP-4434

Fecha de depósito: 5 de Octubre de 1993.

Microorganismo (2)

Nombre: Hibridoma HM1.24

Número de catálogo: FERM BP-5233

Fecha de depósito: 14 de Septiembre de 1995.

Microorganismo (3)

Nombre: Escherichia coli DH5\alpha (pUC19-RVHr-AHN-g\gamma1)

Número de catálogo: FERM BP-5643

Fecha de depósito: 29 de Agosto de 1996.

Microorganismo (4)

Nombre: Escherichia coli DH5\alpha (pUC19-1,24H-g\gamma1)

Número de catálogo: FERM BP-5644

Fecha de depósito: 29 de Agosto de 1996

Microorganismo (5)

Nombre: Escherichia coli DH5\alpha (pUC19-RVLa-AHM-g\kappa)

Número de catálogo: FERM BP-5845

Fecha de depósito: 29 de Agosto de 1996

Microorganismo (6)

Nombre: Escherichia coli DH5\alpha (pUC19-1.24L-g\kappa)

Número de catálogo: FERM BP-5646

Fecha de depósito: 29 de Agosto de 1996

Microorganismo (7)

Nombre: Escherichia coli DH5\alpha (pUC19-RVHs-AHM-g\gamma1)

Número de catálogo: FERM BP-6127

Fecha de depósito: 29 de Septiembre de 1997.

SEQ ID NO: 1

Longitud de la secuencia: 1013

Tipo de secuencia: Ácido nucleico

Nos. de cadenas: Una sola

Topología: Lineal

Tipo molecular: cDNA

2

SEQ ID NO: 2

Longitud de la secuencia: 379

Tipo de secuencia: Ácido nucleico

Topología: Lineal

Tipo molecular: cDNA

Secuencia

3

SEQ ID NO: 3

Longitud de la secuencia: 418

Tipo de secuencia: Ácido nucleico

Topología: Lineal

Tipo molecular: cDNA

Secuencia

4

5

SEQ ID NO: 4

Longitud de la secuencia: 418

Tipo de secuencia: Ácido nucleico

Topología: Lineal

Tipo molecular: cDNA

Secuencia

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA

\vskip0.400000\baselineskip

<120> REMEDIOS PARA TUMORES LINFOCÍTICOS

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 41088

\vskip0.400000\baselineskip

<140> PCT/JP98/00568

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 1998-02-12

\vskip0.400000\baselineskip

<150> JP 9-41410

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1997-02-12

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1013

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de nucleótidos de DNA que codifica el antígeno HM1.24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210>

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 379

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de nucleótidos de DNA que codifica la región V de la cadena L, versión a, del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 418

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de nucleótidos de DNA que codifica la región V de la cadena H, versión r, del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 418

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de nucleótidos de DNA que codifica la región V de la cadena H, versión s, del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 180

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos del antígeno HM1.24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena H, versión a, del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 139

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena H, versión r, del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 139

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena H, versión s, del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado

\vskip1.000000\baselineskip

16

Claims

1. Uso de un anticuerpo que se une específicamente a una proteína del antígeno HM1.24 que posee la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:1 y que tiene actividad citotóxica, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de tumores linfáticos, con excepción de mielomas.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que el tumor linfático es un tumor de células T.

3. El uso según la reivindicación 1, en el que el tumor linfático es un tumor de células B, con excepción de mielomas.

4. El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

5. El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la actividad citotóxica es una actividad ADCC.

6. El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la actividad citotóxica es una actividad CDC.

7. El uso según la reivindicación 4, en el que el anticuerpo tiene una región constante C\gamma de anticuerpo humano.

8. El uso según la reivindicación 7, en el que la región constante C\gamma de anticuerpo humano, es C\gamma1 ó C\gamma3.

9. El uso según la reivindicación 4, en el que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.

10. El uso según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo anti-HM1.24 quimérico.

11. El uso según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo anti-HM1.24 humanizado.

12. El uso según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo se une específicamente a un epítopo reconocido por el anticuerpo anti-HM1.24 producido por el hibridoma depositado como FERM BP-5233.