UA65561C2

UA65561C2 - Лікарський засіб для лікування лімфатичних пухлин

Info

Publication number: UA65561C2
Application number: UA99095052A
Authority: UA
Inventors: Ясуо Коісіхара; Ясусі Есімура
Original assignee: Чугаї Сейяку Кабусікі Кайся; Чугаи Сейяку Кабусики Кайся
Priority date: 1997-02-12
Filing date: 1998-12-02
Publication date: 2004-04-15
Also published as: US20020037288A1; PL335140A1; US6503510B2; ES2241114T3; HUP0001136A3; TR199901949T2; BR9811094A; SK110099A3; CN1250381A; NO993866L; CN1191855C; NO993866D0; RU2177805C2; UA65561A; DE69830492D1; CA2280875C; KR20030097614A; CA2280875A1; PL190065B1; AU724133B2

Abstract

Запропоновано лікарський засіб, що застосовується при лікуванні пухлин лімфатичної тканини (за винятком мієломи), який включає як активний інгредієнт антитіло, яке специфічно зв'язується з білком, що має амінокислотну послідовність, зазначену в SEQ ID NO: 1, і яке має цитотоксичну активність.

Description

Даний винахід стосується засобів, застосовуваних при лікуванні пухлин лімфатичних тканин (за винятком мієломи), що включає в якості активного інгредієнта антитіла, які специфічно зв'язуються з білками, що експресуються у зазначених пухлинах лімфатичної тканини. Даний винахід стосується також засобів, застосовуваних при лікуванні пухлин Т-клітин або пухлин В-клітин (за винятком мієломи). Крім того, даний винахід стосується антитіл, що специфічно зв'язуються з білками, що експресуються у пухлинах лімфатичних тканин і які мають цитотоксичну активність.

Передумови створення винаходу

За імунітет живих істот відповідають насамперед лімфатичні клітини. До лімфатичних клітин відносяться всі клітини, що походять з тих самих гемопоетичних стовбурних клітин, які вивільняються в периферичний кровотік після повторних стадій диференціації під дією різних факторів, що індуціюють диференціацію, включаючи фактори, називані інакше ростовими фактором, які є наявними в кістковому мозку або інших органах. На підставі різниць у диференціації, лімфоцити класифікуються на дві великі групи В-клітин і Т-клітин.

Вважається, що В-клітини мають здатність продуціювати антитіла, тоді як Т-клітин мають відношення до прояву антигенності, цитотоксичності й ін. властивостей. При цьому, стан, коли такі клітини за тих або інших причин піддаються змінам, зв'язаним з утворенням пухлин, на тих або інших стадіях диференціації і починають безконтрольно проліферувати у кістковому мозку, лімфатичній тканині, крові або т.п., відносять до пухлин лімфатичної тканини.

Завдяки використанню нової технологи, зокрема тих переваг, що дає метод застосування моноклональних антитіл проти поверхневих антигенів диференціації, стало можливим ідентифікувати початок і/або стадію диференціювання лімфатичних клітин. У цьому випадку стало можливо не тільки визначити, із яких: Т-клітин або В-клітин, походять такі пухлинні клітини, але також ідентифікувати ступінь зрілості пухлинних клітин.

Пухлини лімфатичної тканини на основі походження і ступеня зрілості пухлинних клітин підрозділяють на два великих класи: пухлини В-клітин і пухлини Т-клітин. В залежності від ступеня зрілості пухлинних клітин пухлини В-клітин далі класифікують на гострий В-лімфолейкоз (В-ГЛЛ), хронічний В-лімфолейкоз (В-ХЛЛ), лре-

В-лімфому, лімфому Буркітта, фолікулярну лімфому, фолікулярну лімфому кори головного мозку, дифузійну лімфому й ін. З іншого боку, пухлини Т-клітин, у залежності від ступеня зрілості пухлинних клітин, класифікують на гострий В-лімфолейкоз (В-ГЛЛ), хронічний В-лімфолейкоз (В-ХЛЛ), захворювання, пов'язане з людським вірусом Т-клітин (АТЛ), лімфому периферичних Т-клітин не АТЛ-типу (ПНТЛ) і ін. (2иКаї Віпзо |Сап) (Шивігагей Сіїпіса!: Сапсег), зегпв Мо. 17 І едкетіа апа Іутрпота, ТаКкавзпі Зидітига єї аї., Медіса! Міем/ Со., ца., 1987, В сеї ШшШтогв, Кіуозпі Такаїзикі, Мізпітига Зпоїеп, 1991).

Однак, незважаючи на останні досягнення медичної технології, лікування пухлин лімфатичних тканин не досягло задовільних результатів. Ступінь вилікування гострого лімфолейкозу (ГЛЛ), наприклад, усе ще складає 2095 або нижче, а лімфоми на стадії розвитого захворювання - біля 5095, при цьому відносно високий ступінь вилікування В-лімфоми пов'язаний із прогресом множинної терапії. Крім того, Т-лімфома більш схильна до проникнення в інші тканини і характеризується ступенем вилікування біля 3095, тоді як ступінь вилікування захворювання, пов'язаного з людським вірусом Т-клітин (АТЛ), у даний час складає 10905.

Крім того, Гото із співав. (сою, А. єї аІ.) повідомили про одержання моноклонального антитіла (антитіла до

НМІ.24) при імунізації мишей мієломними клітинами людини (Віоса, 1994, 84, 1922-1930). При введенні миші із трансплантованими клітинами мієломи людини антитіла до НМІ1.24, антитіло специфічно накопичується в пухлинних тканинах (Магзаакаї Козака еї а!., Мірроп Віпепо (Чарап Сіїпіса!) 1995, 53, 627-635), що дає підставу припустити можливість застосування антитіла до НМ'1.24 для діагностики локалізації пухлини при радіоізотопному міченні, при терапії частками, такої як радіоімунотерапія й ін. Однак, не були відомі дані про те, що антитіло до НМ1.24 використовується для лікування пухлин лімфатичних тканин.

Сутність винаходу

Застосовуваний у даний час метод лікування пухлин лімфатичних тканин включає різні види хіміотерапії, рентгенотерапію, трансплантацію кісткового мозку й ін. Однак, як відзначалося вище, жодний із цих методів не дає задовільних результатів при лікуванні зазначених захворювань і, у цьому зв'язку, усе ще є потреба в прориві по створенню лікарських засобів і розробці методів, що могли б полегшити хід пухлин лімфатичних тканин і подовжити тривалість життя пацієнтів.

У зв'язку з вищесказаним, метою даного винаходу є розробка лікарського засобу для застосування у випадку пухлин лімфатичних тканин, за винятком мієломи.

Для створення такого лікарського засобу автори винаходу провели великі дослідження іп мйго, що включали аналіз методом проточної цитометрії, визначення цитотоксичної активності, такої як антитіло - обумовленої клітиннозалежної цитотоксичності (АОСС/АОКЦ активності), комплементзалежної цитотоксичності (СОС/КЗЦ цитотоксичності) і ін., дослідження іп мімо по визначенню протипухлинного ефекту з використанням антитіла до НМ1.24 (Сою еї аї. Віоса, 1994, 84, 1922-1930), а також роботи з виділення білкового антигену, із яким специфічно зв'язується антитіло до НМІ1.24. У результаті проведених досліджень автори показали, що на лімфатичних пухлинах експресується білковий антиген, специфічно розпізнаваний антитілом до НМ1.24, при цьому зазначене антитіло до НМ1.24 має протипухлинну дію у відношенні пухлин лімфатичних тканин, що і склало предмет даного винаходу.

У зв'язку з цим, даний винахід стосується лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах лімфатичних тканин (за винятком мієломи), що включає в якості активного інгредієнта антитіло, що специфічно зв'язується з білком, що має амінокислотну послідовність, зазначену в послідовності «ЕО ІЮ МО: 1, і що має цитотоксичну активність.

Даний винахід також стосується лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах Т-клітин, або лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах В-клітин (за винятком мієломи), що включає в якості активного" інгредієнта антитіло, що специфічно зв'язується з білюьом, що має амінокислотну послідовність, зазначену в послідовності ЗЕО ІЮ МО 1, і що має цитотоксичну активність.

Даний винахід також стосується лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах Т-клітин, або лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах В-клітин (за винятком мієломи), що включає в якості активного інгредієнта моноклональне антитіло, що специфічно зв'язується з білюом, що має амінокислотну послідовність, зазначену в послідовності ФЕО ІО МО:1, і що має цитотоксичну активність.

Даний винахід також стосується лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах Т-клітин, або лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах В-клітин (за винятком мієломи), що включає в якості активного інгредієнта антитіло, що специфічно зв'язується з білююм, що має амінокислотну послідовність, зазначену в послідовності ФЕО ІЮ МО:1, і що має АОКЦ або КЗЦ активність в якості цитотоксичної активності.

Даний винахід також стосується лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах Т-клітин, або лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах В-клітин (за винятком мієломи), що включає в якості активного інгредієнта антитіло, що специфічно зв'язується з білююом, що має амінокислотну послідовність, зазначену в послідовності ЖЕО ІЮ МО 1, і що в якості константної області містить Су людського антитіла.

Даний винахід також стосується лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах Т-клітин, або лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах В-клітин (за винятком мієломи), що включає в якості активного інгредієнта химерне антитіло або гуманізоване антитіло, що специфічно зв'язується з білком, що має амінокислотну послідовність, зазначену в послідовності ФЕО ІЮ МО:1, і що має цитотоксичну активність.

Даний винахід також стосується лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах Т-клітин, або лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах В-клітин (за винятком мієломи), що включає в якості активного інгредієнта антитіло, що специфічно зв'язується з епітопом, розпізнаваним антитілом до НМ1.24.

Даний винахід також стосується лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах Т-клітин, або лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах В-клітин (за винятком мієломи), що включає в якості активного інгредієнта антитіло до НМІ1.24.

Крім того, даний винахід стосується антитіла, що специфічно зв'язується з білком, експресує у пухлинах лімфатичних тканин, і що має цитотоксичну активність.

Короткий опис малюнків

На фіг.1 показана гістограма, одержана в результаті аналізу методом проточної цитометрії зазначеної В- клітинної лінії непрямим методом із використанням антитіла до НМІ1.24 і контрольного мишачого Ідага.

На фіг.2 показана гістограма зазначеної В-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого Ідага.

На фіг.3 показана гістограма зазначеної В-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого Ідага.

На фіг.4 показана гістограма зазначеної В-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ'1.24 і контрольного мишачого Ідага.

На фіг.5 показана гістограма зазначеної В-клітинної лінії що була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого Ідага.

На фіг.6 показана гістограма зазначеної В-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого Ідага.

На фіг.7 показана гістограма зазначеної В-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого Ідага.

На фіг.8 показана гістограма зазначеної В-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМІ.24 і контрольного мишачого Ідсга.

На фіг.9 показана гістограма зазначеної В-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого Ідага.

На фіг.10 показана гістограма зазначеної Т-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого Ідага.

На фіг.11 показана гістограма зазначеної Т-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого Ідага.

На фіг.12 показана гістограма зазначеної Т-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого Ідсга.

На фіг.13 показана гістограма зазначеної Т-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 ХМ контрольного мишачого ідсга.

На фіг.14 показана гістограма зазначеної Т-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого Ідага.

На фіг.15 показана гістограма зазначеної Т-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого Ідага.

На фіг.16 показана гістограма зазначеної Т-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого Ідага.

На фіг.17 показана гістограма зазначеної Т-клітинної ліни, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМІ..24 і контрольного мишачого Ідага.

На фіг.18 показана гістограма зазначеної Т-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого Ідага.

На фіг.19 показана гістограма зазначеної Т-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого Ідага.

На фіг.20 показана гістограма зазначеної клітинної лінії, яка не відноситься ні до Т-, ні до В-типу, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМІ.24 і контрольного мишачого Ідага.

На фіг.21 показана гістограма зазначеної клітинної лінії, яка не відноситься ні до Т-, ні до В-типу, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМІ.24 і контрольного мишачого Ідага.

На фіг.22 показана гістограма зазначеної клітинної лінії, яка не відноситься ні до Т-, ні до В-типу, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМІ.24 і контрольного мишачого Ідага.

На фіг.23 показана гістограма зазначеної клітинної лінії, яка не відноситься ні до Т-, ні до В-типу, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМІ.24 і контрольного мишачого Ідага.

На фіг.24 приведений графік, який показує, що антитіло до НМ1.24 надає цитотоксичний ефект на клітинні лінії пухлин Т-клітин ССАЕ-СЕМ, ССАБЕ-Н5В-2 і НРВ-МІ Т залежним від дози способом.

На фіг.25 приведений графік, що показує, що антитіло до НМІ1.24 надає цитотоксичний ефект на клітинні лінії пухлин В-клітин ЕВ-3, МС116 ії ССАЕ-58 залежним від дози способом.

На фіг.26 приведений графік, що показує, що при введенні антитіла до НМ1.24 дослідній групі мишей із трансплантованою лімфатичною пухлиною людини, спостерігається приглушення збільшення ш об'єму пухлини в порівнянні з контрольною групою тварин, яким уводили Ідсга.

На фіг.27 приведений графік, що показує, що при введенні антитіла до НМІ1.24 дослідній групі мишей із трансплантованою лімфатичною пухлиною людини, відбувається подовження періоду виживання в порівнянні з контрольною групою тварин, яким уводили Ідсга.

Варіанти реалізації винаходу 1. Одержання антитіл 1-1. Одержання гібридоми

Гібридоми, що продукують антитіла, використовувані згідно з даним винаходом, можуть бути сконструйовані, в основному, із використанням відомих процедур, приведених нижче. Так, білковий антиген

НМ'І1.24 або клітини, що експресують антиген НМІ1.24, можуть використовуватися в якості антигену, що сенсибілізує, і далі застосовуватися для імунізації в рамках традиційного методу імунізації. Одержані імунні клітини зливають із відомими батьківськими клітинами в ході звичайного процесу злиття клітин і потім проводять скринінг за допомогою традиційного методу скринінгу для відбору клітин, які продукують моноклонапьні антитіла.

Конкретно, моноклональні антитіла можуть бути одержані в такий спосіб. Так, наприклад, в якості клітин, що експресують антиген НМ1.24, який представляє собою антиген для одержання антитіла, що сенсибілізує, може використовуватися множинна мієломна клітинна лінія лодини КРММАІ (заявка на патент Японії, що не розглядається, (Кокаї) Мо. 7-236475) або КРО-32 (бою Т. еї. аї., Орп.9У.СіІйп.Нетаї!йо!., 1991, 32, 1400).

Альтернативно, в якості антигену, що сенсибілізує, може бути використаний білок, що має амінокислотну послідовність, зазначену нижче в 5ЕО ІЮ МО, або пентид або поліпептед, що містять епітоп, розпізнаваний антитілом проти НМ'1.24.

В рамках даного опису кКДНК, яка кодує білок, що має амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ

МО: 1, була вставлена в сайт розщеплення Хвраї! вектори риС19 з одержанням плазміди рА538-рисСт19. Есоїї, що несе цю плазміду, депонована в Міжнародній Колекції згідно з положенням Будапештського Договору як

Езспегпісніа сої ОНба (рА538-рОС19) 5 жовтня 1993 року Національним Інститутом біологічних наук і гуманітарних технологій (Маїйопаї! Іпвійше ої Віозсіеєпсе апа Нитап-Тесппоіоду, Адепсу ої Іпаивіпа! Зсієпсе апа

Тесппоіоду, ої 1-3, Нідавні І-споте, ТзиКкиба сіїу, Ібагакі ргеї., Японія) як РЕВМ ВР-4434) (див. заявку на патент

Японії, що не розглядається, (КоКкаї) Мо. 7-196694). Фрагмент кКДНК, що міститься в плазміді рА538-рисСт19, може бути використаний для одержання пептиду або поліпептиду, що містять епітоп, розпізнаваний антитілом проти НМІ.24, із використанням методів генної інженерії.

Переважно, ссавці, які імунізують антигеном, що сенсибілізує, відбирають з урахуванням сумісності їх із батьківською клітиною в процедурі клітинного злиття. В основному вони включають, не обмежуючись ними, гризунів, таких як миші, пацюки, хом'ячки й ін.

Імунізація тварин антигеном, що сенсибілізує, проводиться з використанням відомого методу. Загальний метод включає, наприклад, внутрішньочеревне або підшкірне введення антигену, що сенсибілізує, ссавцю.

Специфічно, антиген, що сенсибілізує, який був розведений і суспендований у відповідній кількості фосфатно- буферного розчину (ФБР) або фізіологічного розчину й ін., змішують, за бажанням, із відповідною кількістю ад'юванта Фрейнда. Після емульгування його переважно вводять ссавцю декілька разів, кожні 4-21 день.

Альтернативно може використовуватися відповідний носій для введення його в момент імунізації антигеном, що сенсибілізує.

Після проведення імунізації і підтвердження підвищення рівня потрібного антитіла в сироватці імунної клітини відбирають з організму ссавця і проводять клітинне злиття, в якому переважні імунні клітини включають, зокрема, клітини селезінки.

Мієломні клітини ссавців, як приклад інших батьківських клітин, що піддають процедурі клітинного злиття з зазначеними імунними клітинами, включають переважно інші різні клітинні лінії, такі як РЗХбЗАд8.653 (У-Іттипої. 1979, 123: 1548-1550), Р3УХбЗА980.1 (Ситепі Торісв іп Місторіоіоду апа Іттипоіоду, 1978, 81:1-7),

М5-1 (Копіег, с. апа Міівієїп, С, Еиг.У.Іттипо)!., 1976, 6: 511-519), МРО-11 (Магоціев, О.Н. еї. а!., СеїІ, 1976, 8: 405-415), 5Р2/О (5НМйіІтап, М. еї. аї., Майшге, 1978, 276: 269-270), РО (де 5ЦСгоїй, 5.Р. еї. аї., У. Іттипої! -Мештоав, 1980, 35: 1-21), 5194 (ТгомоОгідде, 1.5., У.Ехр.Мед., 1978, 148: 313-323), 210 (Сайге, а. єї. аі.. Машге, 1979, 277: 131-133) і ін.

Процедура клітинного злиття між зазначеними імунними клітинами і мієломними клітинами може бути проведена, власне кажучи, згідно з відомим методом, таким як описано Мільштейном із співавт. (Копіег, Сх. апа

Міївгеїп, С, Меїподз Епгутої., 1981, 73: 3-46) і ін.

Більш конкретно зазначена процедура злиття клітин проводиться в звичайному живильному бульйоні в присутності, наприклад, прискорювача злиття клітин. В якості прискорювача злиття клітин використовують, наприклад, поліетиленгліколь (ПЕГ), Сендаї вірус (НМУ) і, крім того, може бути, за бажанням, доданий ад'ювант, такий як диметилсульфоксид і ін., для підвищення активності процесу злиття.

Переважно, співвідношення використаних імунних клітин і мієломних клітин відповідає, наприклад, 1-10- кратній кількості імунних клітин у порівнянні з мієломними.

Прикладом культуральних середовищ, які можуть використовуватися для здійснення вищевказаного процесу злиття клітин є середовище НАРМІ1640 і культуральне середовище МЕМ, придатні для росту зазначених мієломних клітинних ліній, і традиційне культуральне середовище, які використовуються для культивування зазначеного типу клітин, крім того, у них можуть бути внесені сироваткові добавки, такі як навколоплідна сироватка теляти (НСТ, Е5С).

В процесі злиття клітин задана кількість зазначених імунних клітин і мієломних клітин ретельно перемішують у культуральному середовищі, в яке добавляють розчин ПЕГ, попередньо нагрітий приблизно до 37"С, наприклад розчин ПЕГ із середньою молекулярною вагою від приблизно 1000 до 6000, у концентрації від 30 до 6095 (вага/об'єм) і перемішують з одержанням потрібних клітин злиття (гібридом). Потім, за допомогою повторного послідовного додавання відповідного культурального середовища і центрифугування з видаленням супернатанта, агенти, необхідні для злиття клітин і ін., які небажані для росту гібридом, можуть бути віддалені.

Селекцію зазначених гібридом проводять при культивуванні в традиційному селекційному середовищі, наприклад у культуральному середовищі НАТ (рідка культура, що містить гіпоксантин, аміноптерин і тимідин).

Культивування в зазначеному культурапьному середовищі продовжують, в основному, протягом часу, достатнього для загибелі клітин, відмінних від бажаних гібридом (які не є клітинами злиття), і, як правило, це складає від декількох днів до декількох тижнів. Звичайно застосовують традиційний метод серійних розведень, у рамках якого сгібридоми, які продукують бажане антитіло, відбирають і піддають моноклональному клонуванню.

Крім одержання зазначеної гібридоми за допомогою імунізації антигеном тварину відмінного від людини, можна також сенсибілізувати людські лімфоцити іп міго антигеном НМ'1.24 або клітинами, що експресують антиген НМІ11.24, а потім одержані сенсибілізовані лімфоцити зливають із мієломними клітинами людини, наприклад 0266, з одержанням бажаного людського антитіла, що має активність по зв'язуванню з антигеном

НМ'!І.24 або клітинами, що експресують антиген НМІ.24 (див. публікацію за заявкою на патент Японії (Кококи)

Мо. 1-59878). Крім того, трансгенну тварину, що несе спектр усіх генів антитіл людини, имунізують антигеном, наприклад антигеном НМІ1.24, або клітинами, що еспресують антиген НМ1.24, з одержанням бажаного гуманізованого антитіла за описаним вище методом (див. заявки на Міжнародний патент УУО 93/12227, МО 92/03918, МО 94/02602, МО 94/25585, УМО 96/34096 і МО 96/33735).

Сконструйовані в такий спосіб гібридоми, що продукують моноклональне антитіло, можуть бути піддані субкультивуванню в традиційному культуральному середовищі або можуть зберігатися протягом тривалого періоду часу в рідкому азоті.

Для одержання моноклонального антитіла від зазначеної гібридоми використовують метод, у рамках якого зазначену гібридому культивують традиційним способом і одержують антитіла в супернатанті, або метод, згідно з яким гібридому вводять для подальшого росту в організм ссавця, сумісного з зазначеною гібридомою, і потім антитіла одержують з асцитів. Перший спосіб підходить для одержання антитіл високого ступеня чистоти, тоді як останній придатний для великомасштабного процесу одержання антитіл.

Зокрема, гібридома, що продукує антитіло проти НМ1.24, може бути одержана з використанням методу

Гото (Со, Т., еї.аі!., Віоса, 1994, 84: 1922-1930). Вона також може бути одержана за допомогою методу, у рамках якого гібридому, що продукує антитіло проти НМ1.24, яка була депонована в Міжнародній Колекції згідно з положеннями Будапештського Договору як РЕНМ ВР-5233 14 вересня 1995 року Національним

Інститутом біологічних наук і гуманітарних технологій (Майопаї! Іпвійше ої Віозсіеєпсе апа Нитап-Тесппоіоду,

Адепсу ої ІпдивійанІ Зсіепсе апа Тесппоіоду, ої 1-3, Нідазпі Іспоте, Тзикира спу, Ірагакі ргеї., Японія) ін'єкціюють внутрішньочеревно мишам лінії ВАГ В/С (виробництво СІ ЕА, Японія) з одержанням асцитів, із яких виділяють і очищують антитіла, проти НМІ1.24, або використовується метод, згідно з яким зазначену гібридому культивують у відповідному культуральному середовищі, такому як АРМІ1640, що містить 1095 навколоплідної сироватки і 595 ВМ-Сопаїтей НІ (виробництво Воеєпгіпдег Мапппеїт), середовищі 5ЕМ для вирощування гібридом (виробництво СІВСО-ВНАІ), середовищі РЕНМ-Н (виробництво СІВСО-ВНАЇ) і ін., і в цьому випадку антитіло проти НМІ1.24 може бути виділене й очищене із супернатанту. 1-2. Рекомбінантне антитіло

Рекомбінантне антитіло, одержуване згідно з технологією маніпулювання рекомбінантними генами, у рамках якої ген для антитіла клонують із гібридоми й інтегрують у відповідний вектор, який потім вводять в організм хазяїна, може використовуватися згідно з даним винаходом як моноклональне антитіло (див., наприклад, Саїї, А.К., Воггенаєеск, Чатев, МУ. Іатптіск, Тнегареціїс Мопосіопа! Апіїрбодієз, опублікована у

Великобританії, МастіМап РибіїєНегз І ТО. 1990).

Зокрема, мРНК, що кодує варіабельну область (М-область) бажаного антитіла, виділяють із гібридоми, що продукує антитіло. Для виділення мРНК одержують загальну РНК із використанням, наприклад, відомого методу, такого як метод ультрацентрифугування в гуанідині (Спігум/п, 9., Апауїса! Віоспетівігу, 1987, 162: 156-159) і потім виділяють мРНК із загальної маси РНК із використанням набору для обчищення мРНК (виробництво РПаптасіа) і ін. Альтернативно, мРНК можна безпосередньо одержати з використанням набору

Оціск Ргер для обчищення мРНК виробництва РНаптасіа.

КДНК до М-області антитіла може бути синтезована з одержаної зазначеним способом мРНК із використанням зворотної траскриптази. КДНК може бути синтезована з використанням набору, що включає зворотну транскриптазу, для синтезу КДНК АММ Немегзе Тгапзсгіріазе Рігзі-зіїгапа сОМА Зупіпевів Кії і ін.

Альтернативно, для синтезу й ампліфікації КДНК може бути використаний набір 5'-Агпрі! Ріпдег Васе Кії (виробництво Сіопіесі) і метод 5-Насе (Егоптап, МА еї аї., Ргос. Май). Асад. 5сі. ОБА, 1988, 85:8998-9002;

ВеїуамеКу, А. Еї аї., Мисієїс Асій5 Нез., 1989, 17:2919-2932), у рамках якої використовується полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). Бажаний фрагмент ДНК очищують з одержаного продукту ПЛР і далі він може бути лігований із векторної ДНК. Крім того, на його основі конструюють рекомбінантний вектор і вводять його в

Е.соіїї і далі до відбору колоній для одержання бажаного рекомбінантного вектора. Нуклеотидна послідовність заданої ДНК може бути підтверджена за допомогою відомого методу, такого як дидезоксиметод.

При одержанні ДНК, що кодує М-область бажаного антитіла, її можна лігувати із ДНК, що кодує константну область (С-область) бажаного антитіла, і потім одержаний продукт інтегрують у вектор експресії.

Альтернативно, ДНК, що кодує М-область антитіла, може бути інтегрована у вектор експресії, який вже містить

ДНК, що кодує С-область антитіла.

Для продукування антитіла, застосовуваного згідно з даним винаходом, ген антитіла інтегрують, як буде описано нижче, у вектор експресії так, щоб експресія проходила під контролем регуляторної області експресії, наприклад енхансера і/або промотора. Згодом вектор експресії може бути принесений трансформацією в клітину хазяїна, де антитіло може експресуватися. 1-3. Змінене антитіло

Згідно з даним винаходом, штучно змінене рекомбінантне антитіло, таке як химерне антитіло і гуманізоване антитіло, може використовуватися для цілі зниження гетерологічної антигенності щодо людини.

Такі змінені антитіла можуть бути одержані з використанням відомих методів.

Химерне антитіло може бути одержане при лігуванні одержаної описаним вище способом ДНК, що кодує

М-область антитіла, із ДНК, що кодує С-область антитіла людини, і потім одержаний продукт вбудовують у вектор експресії і вводять в організм хазяїна для продукування в ньому антитіла (див. заявку на Європейський патент ЕР 125023 і заявку на Міжнародний патент УУО 96/02576). Химерне антитіло, застосовуване згідно з даним винаходом, може бути одержане з використанням відомого методу.

Наприклад, Е..соїї, що несе плазміду, яка містить ДНК, що кодує І-ланцюг М-області або Н-ланцюг М- області химерного антитіла проти НМ1.24, була депонована в Міжнародній Колекції згідно з положеннями

Будапештського Договору як ЕзсПетгіспіа соїї ОН5ба (рОС19-1.241 -дк) ї Евспепісніа соїї ОНба (рОС19-1.2 4Н-дуї), відповідно, 29 серпня 1996 року Національним Інститутом біологічних наук і гуманітарних технологій (Майопаї!

ІпеїШшіе ої Віозсіеєпсе апа Нитап-Тесппоіоду, Адепсу ої ІпдивійаІ Зсіепсе апа ТесппоіІоду, ої 1-3, Нідавні І- споте, Тзикиба сіїу, Ібагакі ргеї., Японія) як ЕЕВМ ВР-5646 і РЕВМ ВР-5644, відповідно (див. заявку на патент

Японії Мо.9-271536).

Гуманізоване антитіло, яке також називають відновленим людським антитілом, одержують при трансплантації гіперваріабельної ділянки (ГВД) антитіла ссавця, відмінної від людини, наприклад антитіла миші, у ГВД людського антитіла. У цілому, технологія, заснована на одержанні рекомбінантної ДНК, для продукування таких антитіл також відома (див. заявку на Європейський патент ЕР 125023 і заявку на

Міжнародний патент УХО 96/02576).

Конкретно, методом ПЛР синтезують послідовність ДНК, яка повинна підходити для лігування ГВД мишачого антитіла з каркасною областю (КО) людського антитіла з використанням декількох роздільних олігонуклеотидів, що несуть на кінцях розрізи, що перекриваються один з іншим. Одержану в такий спосіб ДНК лігують із ДНК, що кодує С-область людського антитіла, і потім вбудовують одержаний продукт у вектор експресії, який потім вводять в організм хазяїна для продукування антитіл (див. заявку на Європейський патент ЕР 239400 і заявку на Міжнародний патент УУО 96/02576).

Відбирають КО людських антитіл, що зшиті через ГВД так, щоб ділянки, що визначають комплементарність, утворювали сайт, сприятливий для зв'язування з антигеном. При бажанні, амінокислоти в каркасних областях варіабельної області антитіла можуть бути заміщені так, щоб гіперваріабельна ділянка відновленого людського антитіла могла утворювати відповідний сайт для зв'язування з антигеном (зай, К. єї а!І., Сапсег Вез., 1993, 53:851-856).

Наприклад, Е.соїї, що несе плазміду, яка містить ДНК, що кодує варіант а (5ЕО ІЮ МО:2) І -ланцюга М- області і варіант г (ЗЕО ІЮ МО:3) Н-ланцюга М-області гуманізованого антитіла проти НМІ1.24, була депонована в Міжнародній Колекції згідно з положеннями Будапештського Договору як ЕвзсПепіспіа соїї ОнН5ба (рОС19-ВМІ а-

АНМ-ОК) і Езспепіспіа соїї ОНза. (рОС19-АУНІ-АНМ-ду) відповідно, 29 серпня 1996 року Національним

Інститутом біологічних наук і гуманітарних технологій (Майопаї! Іпвійціе ої Віозсієпсе апа Нитап-Тесппоіоду,

Адепсу ої Іпдивійа! Зсіеєпсе апа ТесНпоіоду, ої 1-3, Нідавзпі І-споте, Т5иКиба су, Ібагакі ргеї., Японія) як РЕВМ

ВР-5645 і РЕНМ ВР-5643, відповідно (див. заявку на патент Японії Мо.9-271536). Крім того, Есоїї, що несе плазміду, яка містить ДНК, що кодує варіант 5 (ЗЕО ІЮ МО:4) Н-ланцюга М-області гуманізованого антитіла проти НМІ1.24, була депонована в Міжнародній Колекції згідно з положеннями Будапештського Договору як

Езспетісніа соїї ОН5е: (р)С19-АМНь-АНМ-дуі) 29 вересня 1997 року Національним Інститутом біологічних наук і гуманітарних технологій (Маїйопаї! Іпвійше ої Віозсіеєпсе апа Нитап-Тесппоіоду, Адепсу ої Іпаивіпа! Зсієпсе апа

Тесппоіоду, ої 1-3, Нідавнпі І-споте, Т5икиба сіу, Ібагакі ргеї., Японія) як ЕЕВМ ВР-6127 (заявка на патент

Японії Мо.9-271536).

У випадку химерного або гуманізованого антитіла використовують С-область людського антитіла і найбільш переважно в якості константної ділянки людського антитіла може бути використана Су, така як СУТ,

Суг, СузЗ і Суд. Серед них антитіла, що містять Су! і СуЗ, мають потужну цитотоксичну активність, тобто АОКЦ і

КЗЦ активність, і в цьому зв'язку вони переважно використовуються згідно з даним винаходом.

Химерне антитіло включає варіабельну ділянку антитіла, що походить із ссавця, відмінного від людини, і

С-область, що походить з людського антитіла, при цьому гуманізоване антитіло включає гіперваріабельні ділянки антитіла, що походить із ссавця, відмінного від людини, каркасні ділянки (КД) і С-область антитіла, що походить з людського антитіла. Згідно з цим, їх антигенність в організмі людини знижується, так що вони можуть бути використані в якості активного інгредієнта лікарських засобів згідно з даним винаходом.

Переважний варіант гуманізованого антитіла для використання згідно з даним винаходом включає гуманізоване антитіло проти НМІ1.24 (див. заявку на патент Японії Мо.9-271536). Переважний варіант І1- ланцюга У-області гуманізованого антитіла проти НМ1.24 включає той, у якому є амінокислотна послідовність, що кодується нуклеотидною послідовністю, зазначеною в 5ЕОЛО МО: 2. Переважний варіант Н-ланцюга У- області гуманізованого антитіла проти НМ1.24 включає той із них, що має амінокислотну послідовність, що кодується послідовністю основ, зазначеною в 5ЕО ІЮ МО:З або 4. 1-4. Експресія і продукування

Гени для антитіл, сконструйованих як зазначено вище, можуть експресуватися, у результаті чого з використанням відомого методу може бути отримане антитіло. У випадку використання клітин ссавців експресія може проводитися з використанням вектора експресії, що містить звичайно застосовуваний промотор, ген антитіла, який повинний експресуватися, і ДНК, в якій полі А сигнал був оперативно зшитий на 3! кінці в напрямку реплікації, або вектор, що містить зазначену ДНК. Приклади промотору/енхансера включають ранній промотор/енхансер цитомегаловірусу людини.

Крім того, в якості промотору/енхансера, які можуть використовуватися для експресії антитіла згідно з даним винаходом, можуть знайти застосування вірусні промотори/енхансери, такі як промотори/енхансери ретровірусу, вірусу поліоми, аденовірусу і вакуолізуючого мавпячого вірусу 40 (5440) а також промотори/енхансери, одержані з клітин ссавців, такі як людський фактор елонгації Іа (НЕРІсо).

Так наприклад, експресія може бути легко здійснена за методом Міллігана із співавт. (Міїїдап еї а!., Майшге, 1979, 277,108) у рамках якого використовується промотор/енхансер 5М40, або за методом Міцушима із співавт. (МігивНпіта еї аї., Мисієїс Асіайз Нев., 1990, 18, 5322), в якому використовується промотор/енхансер

НЕРІ»є.

У випадку Е.соїї експресія може бути здійснена при оперативному зв'язуванні звичайно використовуваного промотору, сигнальної послідовності для секреції антитіла і гена антитіла, який підлягає експресії, із подальшою його експресією. В якості промотору можна, наприклад, згадати промотор Іасг і промотор агав. У випадку використання, промотору Іас можна використовувати метод Варда із співавт., (УУага еї а! Машге, 1996, 341, 544-546; Разер 9. 1992, 6, 2422-2427), а у випадку використання промотору агав може знайти застосування метод Беттера із співавт., (Вейцег єї а! бсієпсе, 1988, 240, 1041-1043).

В якості сигнальної послідовності для секреції антитіла при продукуванні його в периплазмі Е.соїї може використовуватися сигнальна послідовність реїІВ (І єї, 5.Р. еї аї., У.Васієепо!., 1987, 169, 4379). Після відділення продукованого в периплазмі антитіла структура антитіла піддається складанню перед використанням (див., наприклад, УУО 96/30394).

В якості сайта початку реплікації можуть бути використані такі ділянки, які одержують Із 5М40, вірусу поліоми, аденовірусу, вірусу бичачої папіломи (ВРУ) і ін. Крім того, для ампліфікації генних копій у хазяйській клітинній системі вектор експресії може включати в якості маркера ген, що селектується, аміноглікозидтрансферази (АРН), ген тимідинкінази (ТК) і ген ксантингуанінфосфорибозилтрансферази Е.соїї (Есоодрі), ген дигідрофолатредуктази (анг) і ін.

Для продукування антитіла, використовуваного згідно з даним винаходом, можна застосовувати будь-яку систему продукування. Система продукування антитіла може грунтуватися на системі продукування іп міс і іп мімо. В якості системи продукування іп міо може бути згадана система продукування, в якій використовуються еукаріотичні клітини, і система продукування, в якій використовуються прокаріотичні клітини.

Системи продукування на основі еукаріотичних клітин включають клітини тварин, рослинні клітини і грибні клітини. Відомі клітини тварин включають (1) клітини ссавців, такі як клітини СНО, клітини СО5, мієломної клітини, ниркові клітини дитинчат хом'ячків (ВНК), Неїга клітини і Мего клітини, (2) клітини земноводних, такі, як социти Хепориз або (3) клітини комах, такі як 519, 8121 і Тп5. Відомі рослинні клітини включають, наприклад, ті з них, які походять з роду Місоїйапа і, більш конкретно, клітини, що походять з Місоїйапа гарасит, що утворюють капусні культури. Відомі грибні культури включають дріжджі, такі як представники роду Засспаготусев, більш конкретно Засспаготусев, сегемісеає або ниткоподібні гриби, такі як представники роду Азрегойив і, більш конкретно, АзрегойШив підег.

Системи продукування на основі прокаріотичних клітин включають бактеріальні клітини. Відомі бактеріальні клітини включають Езспегісніа сої! (Е.сої!ї) і Васі вив.

Антитіло може бути одержане при введенні через процес трансформації гена бажаного антитіла в ці клітини і подальшого культивування трансформованих клітин іп міо. Культивування здійснюють відомими методами. Так наприклад, можуть використовуватися культуральні середовища, такі як ЮОМЕМ, МЕМ,

АРМІ1640, в які можуть вноситися сироваткові добавки, такі як навколоплідна сироватка теляти (НСТ). Крім того, антитіла можуть продукуватися іп мімо при імплантуванні клітин, в які був уведений ген антитіла, у черевній порожнині тварин й ін.

В якості інших систем продукування можна відзначити ті з них, в яких використовуються тварини, і ті з них, в яких використовуються рослини. Системи продукування на основі тваринних організмів включають клітини ссавців і комах.

В якості ссавців можуть використовуватися кози, свині, вівці, миші і велика рогата худоба (Міскі Спазег,

Зресігшт Віоїесппоіоду Арріїсайоп, 1993). В якості комах може використовуватися тутовий шовкопряд.

У випадку використання рослин може знайти застосування рослина тютюну.

Ген антитіла вводять в організм зазначених тварин і рослин, і в таких тваринах і рослинах продукуються антитіла. Так наприклад, ген антитіла вводять у середину гена, що кодує білок, який продукується в молоці, такий як козячий рВ-казеїн, для одержання злитих генів. Фрагменти ДНК, що містять злитий ген, в який був вставлений ген антитіла, ін'єктгують у козячий ембріон і потім ембріон вводять в організм кози. Бажане антитіло одержують із молока, продукованого трансгенною козою, якою стала та коза, якій ввели зазначений ембріон, або її потомство. Для того, щоб підвищити кількість молока, що містить бажане антитіло, що продукується трансгенною козою, такій трансгенній козі, у випадку прийнятності, можуть уводитися гормони (Ебеті К.М. еї а!., Віо/Тесппоіоду, 1994, 12,699-702).

У випадку використання тутового шовкопряда для інфікування його використовують бакуловірус, в який вбудований ген бажаного антитіла, при цьому бажане антитіло може бути одержане з рідин тіла тутового шовкопряда (Зизити, М.еї аїЇ., Майте, 1985, 315, 592-594). А у випадку використання рослин тютюну ген бажаного антитіла вставляють у відповідний для рослин вектор експресії, наприклад РМОМ 530, і потім вектор вводять у бактерію, таку як Адгорасієгит Шптеїасієпе. Зазначену бактерію потім використовують для інфікування рослин тютюну, таких як Місойапа їарбасит, з одержанням бажаного антитіла з листів тютюну (Чиїап, К.-С. Ма еї аї., Еиг.).Іттипо)!., 1994, 24, 131-138).При продукуванні антитіла в системах продукції іп мито і іп мімо, як зазначено вище, ДНК, що кодує важкий ланцюг (Н-ланцюг) або легкий ланцюг (І -ланцюг) антитіла, може бути роздільно введена у вектор експресії, якими потім одночасно трансформують хазяйські клітини, в іншому випадку ДНК, що кодують Н-ланцюг і І -ланцюг, можуть бути інтегровані в єдиному векторі експресії і використані для трансформації хазяйського організму (див. заявку на Міжнародний патент МО 94/11523).

Антитіло, що продукується за описаним вище методом, може бути зв'язане з різними молекулами, такими як полі етиленгліколь (ПЕГ), для одержання з метою подальшого використання модифікованого антитіла. «Антитіло» у контексті даного опису включає такі модифіковані антитіла. Для того, щоб одержати таке модифіковане антитіло, антитіло піддають хімічній модифікації. Такі методи вже є на досягнутому рівні техніки. 2. Поділ і очищення антитіл 2-1. Поділ і очищення антитіла

Антитіла, що продукуються і експресуються, як було описано вище, можуть бути відділені від внутрішнього або зовнішнього середовища клітини або виділені з організму хазяїна і далі вони можуть бути очищені до гомогенності. Виділення й очищення антитіла з метою подальшого використання згідно з даним винаходом можуть бути здійснені з використанням афінної хроматографії. В якості колонки, використовуваної в такій афінній хроматографії, може застосовуватися колонка з білком А і колонка з білком с. Прикладами носіїв, застосовуваних у колонці А, є Нурег 0, Рогов,.Зерпаговзе Е.РЕ. і ін.

Альтернативно, без всяких обмежень можуть використовуватися традиційні методи виділення й очищення білків. Виділення й очищення антитіла для використання його далі згідно з даним винаходом можуть бути проведені при зв'язуванні належним способом у процесі хроматографування, відмінного від зазначеної вище афінної хроматографії, при фільтруванні, ультрафільтруванні, висолюванні, діалізі й. ін. Хроматографія включає, наприклад, іонообміну хроматографію, гідрофобну хроматографію, гель-фільтрацію й ін. Такі види хроматофафії можуть бути введені в систему ВЕЖХ. Альтернативно, може бути використана хроматографія з обертанням фаз. 2-2. Визначення концентрації антитіла

Концентрація антитіла, одержаного в зазначеному вище поділі 2-1, може бути визначена вимірюванням поглинання або за допомогою імуноферментного твердофазного аналізу (ІФТФА) і ін. Так, при використанні для вимірювання рівня поглинання, антитіло згідно з даним винаходом або зразок, що містить антитіло, розбавляють відповідним чином ФБР(-) і потім вимірюють поглинання при 280нм, після чого проводять розрахунок із використанням коефіцієнта поглинання (оптичної густини), рівного 1,35, при концентрації 1мг/мол. При використанні методу ІФТФА вимірювання проводять таким способом. 100мкл козячого проти людського Іде (виробництво Віо 5ошгсе) розбавляють до концентрації 1мкг/мл у 0,1М бікарбонатному буфері, рН 9, 6, вносять на 96-лунковий мікротитрувальний планшет (виробництво Мипс) і інкубують протягом ночі при температурі 4"С для імобілізації антитіла.

Після блокування 100мкл кожного, розведеного відповідним чином антитіла згідно з даним винаходом або зразок, що містить антитіло, або 100мкл людського ІдС:ї відомої концентрації, узятого в якості стандарту, добавляють в лунку і проводять інкубування при кімнатній температурі протягом 1 години. Після промивання добавляють 100мкл, розведеного в 5000 разів антитіла проти ДС. людини, мічене лужною фосфатазою (виробництво Віо боцгсє) і проводять інкубацію при кімнатній температурі протягом 71 години. Після промивання добавляють субстратний розчин і інкубують і потім, після вимірювання поглинання при 405нм, із використанням Місгоріаїє геадег, модель 3550 (виробництво Віо-Най) проводять підрахунок концентрації бажаного антитіла. 3. Аналіз методом проточної цитометрії

Реакційна здатність антитіл, використовуваних згідно з даним винаходом у відношенні пухлинних клітин лімфатичної тканини може бути досліджувана методом проточної цитометрії.

Використовувані клітини можуть являти собою встановлені клітинні лінії або свіжовиділені клітини. В якості встановлених клітинних ліній може використовуватися, наприклад, лінія Т-клітин АВРМІ 8402 (АТСС СВІ -1994),

ССАЕ-СЕМ (АТСС ССІ-119), одержана з клітин при гострому лімфобластичному лейкозі, НРВ-АЇ. (ЕССНІ018), одержана з клітин при гострому лімфолейкозі, НРВ-МІ Т (ЕССНІ019), одержана з клітин при Т- лімфомі, УМ (ЕССНІ1023), одержана з клітин при гострому лімфолейкозі, МОЇ Т-4 (АТСС СВІ -1582), одержаний із клітин при гострому лімфобластичному лейкозі, Ушкаї (ЕССНІТ024), одержана з клітин при гострому лімфолейкозі, ССАР-Н5ЗВ-2 (АТСС СС -120.1), одержана з клітин при гострому лімфобластичному лейкозі,

МТ-1 (ЕССНІ043), одержана з клітин при захворюванні, зв'язаному з людським вірусом Т-клітин, КТ-3, одержана з клітин при лімфомі Леннерта (5Пітіи, 95. єї аї., Віоса, 1988, 71,196-203) і ін.; а в якості лінії В- клітин лінія (АТСОС ТІВ-190), трансформована вірусом ЕВ, позитивна на вірус ЕВ лінія В-клітин 5КМУ 6.4 (АТОС

ТІВ-215), МС116 (АТОС СВІ -1649), одержана з клітин із В-лімфомою, ССАБЕ-58 (АТСС СС -120), одержана з клітин при гострому лімфобластичному лейкозі, лінія В-клітин ВРМІ 6410 (ЕССНбО47), одержана від пацієнта з гострою мієлоцитарною лейкемією, Юацаї (АТОС ССІ-213), одержана з клітин при лімф омі Буркітта, ЕВ-3 (АТСС СС -85), одержана з клітин при лімфомі Буркітта, У|іоує (АТОС СС -87), одержана з клітин при лімфомі

Буркітта, На) (АТОС ССІ-86), одержана з клітин при лімфомі Буркітта, і в якості клітинної лінії, що не відноситься ні до Т-, ні до В-типу, лінія НІ-60 (АТОС СС -240), одержана з клітин при гострій мієлоцитарній лейкемії, ТНР-1 (АТОС ТІВ-202), одержана з клітин при гострій моноцитарній лейкемії, 0О-937 (АТОС СВІ- 1593), одержана з клітин при гістіоцитарній лімфомі, К-562 (АТОСС СС -243), одержана з клітин при хронічній мієлоцитарній лейкемії й ін.

Після промивання вищевказаних клітин у ФБР(-) до них добавляють 100мкл антитіла або контрольного антитіла, розведеного до концентрації 25мкг/мл у БАС буфері (ФБРІ(-), що містить 295 навколоплідної сироватки теляти і 0,195 азиду натрію) і потім інкубують одержану суміш на льоду протягом 30 хвилин. Після промивання в РАСО5 буфері добавляють 100мкл протимишачого козячого антитіла, міченого ФІТЦ (САМ, виробництво Весіоп Оіскіпзоп), у концентрації 25мкг/мл і потім інкубують суміш на льоду протягом 30 хвилин.

Після промивання у БАС буфері клітини суспендують у бОбмкл або їмл РАС5 буфера і вимірюють інтенсивність флуоресценції всіх клітин за допомогою приладу ЕАС5сап (виробництво Весіоп Оіскіпвоп).

На основі одержаного для кожного типу клітин значення інтенсивності флуоресценції, обчислюється реакційна здатність антитіла, із погляду використання згідно з даним винаходом, із кожним видом клітин. Так, на основі значення інтенсивності флуоресценції для кожного типу клітин" можна визначити, чи експресується антиген НМ1.24 на клітинах кожного виду (позитивних або негативних) або може бути визначений ступінь експресії. Дані по наявності й інтенсивності експресії антигену НМ1.24 у пухлинних клітинах лімфатичної тканини приведені нижче в прикладі 2.2., присвяченому аналізу методу проточної цитометрії.

Пухлинні клітини при пухлинах лімфатичної тканини, які можуть стати мішенню для лікування згідно з даним винаходом, експресують антиген НМ1.24. Більш конкретно, пухлинні клітини в пухлині лімфатичної тканини переважно відносяться до тих клітин, що є позитивними по відношенню до антигену НМІ.24 і в яких відсоток прояву зазначеного антигену не нижче 595. Більш конкретно, пухлинні клітини в пухлинах лімфатичної тканини переважно являють собою ті з них, в яких позитивний відсоток прояву антигену НМ1.24 складає 2095 або вище. Більш конкретно, пухлинні клітини в пухлинах лімфатичної тканини являють собою переважно ті з них, в яких позитивний відсоток прояву антигену НМ1.24 складає 5095 або вище. Більш конкретно, пухлинні клітини в пухлинах лімфатичної тканини переважно являють собою ті з них, в яких позитивний відсоток прояву антигену НМІ1.24 складає 8095 або вище. 4. Цитотоксична активність 4-1. Вимірювання КЗЦ активності

Антитіло, застосовуване згідно з даним винаходом, являє собою таке антитіло, яке має, наприклад, КЗЦ активність в якості цитотоксичної активності.

КЗЦ активність лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах лімфатичних тканин згідно з даним винаходом, може бути вимірювана в такий спосіб. Спочатку готують клітини-мішені в концентрації 4х105 клітин/мл у відповідному середовищі, наприклад у середовищі АРМІ1640, що містить 1095 навколоплідної сироватки теляти (виробництво Сірсо-ВАГ). В якості клітин-мішеней можуть бути використані ССАБ-СЕМ (АТС СС -119), ССАБ-Н5В-2 (АТС СС -120.1), НРВ-МІ Т (ЕССНІТ019), ЕВ-3 (АТОС ССІ -85), МС116 (АТОС

СВАІ-1649), ССАБ-58 (АТСС СС -120), К-562 (АТСС СО -243) і ін. П'ятдесят мкл зазначених клітин вносять на 9б-лунковий мікротитрувальний планшет з плоским дном (виробництво Раісоп) і планшет інкубують в інкубаторі з подачею СО» при температурі 37"С протягом ночі.

Потім добавляють антитіло, КЗЦ активність якого має бути вимірювана, інкубують все протягом 60 хвилин і потім добавляють відповідним чином розведений комплемент, наприклад комплемент дитинчати кролика (Вабу Варбрії Сотріеєтепі, виробництво Седапапе) і проводять інкубацію протягом 2 годин. Потім до кожної лунки добавляють 10мкл АІатаг Вше (виробництво Віо бошгсеє) і проводять інкубацію протягом 4-х годин і потім вимірюють інтенсивність флуоресценції (довжина хвилі збудження 53Онм, довжина хвилі емісії 59Онм) із використанням системи вимірювання флуоресценції СуїбБіног 2350 (виробництво МіПірог). Цитотоксична активність (965) може бути обчислена згідно з формулою (А-С)/(8-С)Х100, де А позначає інтенсивність флуоресценції при інкубації в присутності антитіла, В позначає інтенсивність флуоресценції при інкубації в середовищі,, що не містить антитіло, і С являє собою інтенсивність флуоресценції лунки, що не містить клітин. 4-2. Вимірювання АОКЦ активності

Антитіло, використовуване згідно з даному винаходом, являє собою таке антитіло, що має, наприклад,

АОКЦ активність в якості цитотоксичної активності.

АОКЦ активність лікарського засобу, використовуваного при лікуванні пухлин лімфатичних тканин згідно з даним винаходом, може бути виміряна в такий спосіб. Спочатку, моноядерні клітини виділяють в якості ефекторних клітин із периферичної крові людини або з кісткового мозку при гравітаційному центрифугуванні. В якості клітин-мішеней беруть ССВАЕ-СЕМ (АТСС ССІ-119).1), НРВ-МІ.Т (ЕССНІТО019), ЕВ-3 (АТС СС -85),

МС116 (АТС СВІ-1649), ССВЕ-5В (АТСС ССІ-120), К-562 (АТС ССІ-243) або ін., що мітять 91Сг з одержанням препаратів В-клітин-мішеней. Потім до мічених кпітин-мішеней добавляють антитіло, активність якого має бути виміряна, і проводять інкубацію. Ефекторні клітини у відповідному співвідношенні добавляють потім до клітин-мішеней і проводять інкубацію.

Після інкубації збирають супернатант і вимірюють радіоактивність за допомогою гамма-лічильника, при цьому для вимірювання максимуму вивільненої радіоактивності може бути використаний 195 МР-40.

Цитотоксичну активність (95) обчислюють згідно з формулою (А-С)/(8-С)х100, де А позначає радіоактивність (імп/хв), що вивільняється в присутності антитіла, В позначає радіоактивність (імп/хв), що вивільняється при наявності МР-40, і С позначає радіоактивність (імп/хв), що вивільняється в середовищі, що не містить антитіло. 4-3. Підвищення цитотоксичної активності

Для досягнення цитотоксичної активності, такої як АОКЦ активність і КЗЦ активність, краще використовувати Су, зокрема Су! і СуЗ, в якості константної області (С-області) антитіла людини. Крім того, посилена АОКЦ активність або КЗЦ активність може бути, індукована при додаванні, зміні або модифікації частини амінокислот у С-області антитіла.

Як приклад можна зазначити на конструювання ІдДМ-подібного полімеру ДС при заміщенні амінокислот (Зтій, А.І.Р. апа Могтізоп, 5.1, Віо/Тесппоіоду, 199412, 683-688), конструювання ІдМ-подібного полімеру дах при додаванні амінокислот (Зті, В.І.Р. еї. аї., дУ.ІпипипоіІоду, 1995, 154, 2226-2236), експресію тандемно- лігованого гена, що кодує І-ланцюг (ЗНпийїтога, МУ, еї аїІ.. Зсієпсе, 1991, 252, 724-727), димеризацію Ідса при заміщенні амінокислот (Сагоп, Р.С. еї аї., У.Ехр.Мей., 1992, 176, 1191-1195; Зпорев5. В., 9. Іттипоіоду, 1992,148, 2918-2922), димеризацію да при хімічній модифікації (Усій, Е.А. єї аі!., Сапсег Нез., 1993, 53, 2560- 2565) і введення ефекторної функції при зміні амінокислот(и) у шарнірній області антитіла (Могаегтацао, Ї, єї а, Ешиг. У. Іттипої., 1991, 21, 2379-2384) і ін. Усі ці процедури можуть бути здійснені з застосуванням сайт- специфічного мутагенезу з використанням праймера, при додаванні нуклеотидної послідовності в сайті розщеплення рестрикційних ферментів при використанні хімічних модифікуючих речовин, які створюють ковалентний зв'язок. 5. Підтвердження терапевтичного ефекту

Терапевтичний ефект лікарського засобу використовуваного згідно з даним винаходом, при пухлинах лімфатичних тканин, може бути підтверджений при введенні антитіла, використовуваного згідно з даним винаходом, тваринам, яким трансплантували клітини пухлини лімфатичних тканин із подальшою оцінкою протипухлинного ефекту засобу на тваринах.

В якості лімфатичних пухлинних клітин, що вводяться тварині, можуть використовуватися встановлені клітинні лінії або свіжовиділені клітини. В якості встановленої клітинної лінії може бути використана ССВАЕ-

СЕМ (АТС СОЇ -119), НРВ-МІ Т (ЕССНІ019), МОЇ Т-4 (АТС СВІ -1582), ССАЕ-Н5ЗВ-2 (АТОС СС -120.1) і ін. в якості Т-клітинної лінп Її СЕ55 (АТСС ТІВ-190), БКМУ 6.4 (АТС ТІВ-215), ССАЕ-58 (АТСС ССІ-120), АВРМІ 6410 (ЕССНбО47), ЕВ-3 (АТОС СС -85) і ін. в якості В-клітинної лінії.

Тварини, яким провели трансплантацію, переважно відносяться до тих, у яких імунологічні функції знижені або відсутні. Наприклад, можуть використовуватися миші, позбавлені волосяного покриву, миші СІЮ, бежеві миші, пацюки, позбавлені волосяного покриву, і ін. Визначений протипухлинний ефект може бути підтверджений вимірюванням об'єму і ваги пухлин або на підставі тривалості виживання тварин і ін.

Як показано в приведених нижче прикладах, введення антитіла проти НМ1.24 приводить до придушення росту об'єму пухлини і, крім того, до збільшення періоду виживаності мишей із трансплантованою пухлиною.

Ці факти вказують на те, що антитіло проти НМ1.24 має протипухлнний вплив на пухлини лімфатичної тканини. 6. Спосіб введення і фармацевтичні препарати

Лікарські засоби для лікування пухлин лімфатичних тканин згідно з даним винаходом можуть бути введені або системно, або місцево, парентеральним способом, наприклад шляхом внутрішньовенної ін'єкції, такої як краплинна інфузія, внутрішньом'язової ін'єкції, внутрішньочеревної ін'єкції і підшкірної ін'єкції. Метод уведення може бути обраний за показанням в залежності від віку і стану пацієнта. Ефективне, дозування вибирають у діапазоні від 0,01мг до 10Омг на кілограм ваги тіла на введення. Альтернативно, може бути обране дозування, у діапазоні від 1 до 100Омг, переважно від 5 до 5Омг на пацієнта.

Лікарські засоби для лікування пухлин лімфатичної тканини згідно з даним винаходом можуть містити фармацевтично прийнятні носії або добавки, в залежності від застосовуваного способу введення. Приклади таких носіїв або добавок включають воду, фармацевтично прийнятний органічний розчинник, колаген, полівініловий спирт, полівінілпіролідон, карбоксивініловий полімер, натрій-карбоксиметил-целюлозу, натрієву сіль поліакрилової кислоти, альгінат натрію, водорозчинний декстран, натрій-карбоксиметиловий крохмаль, пектин, метилцелюлозу, етилцелюлозу, ксантанову камідь, аравійску камідь, казеїн, желатин, агар, дигліцерин, пропіленгліколь, поліетиленгліколь, вазелін, парафін, стеариловий спирт, стеаринову кислоту, людський сироватковий альбумін (ПСА), маніт, сорбіт, лактозу, фармацевтично прийнятна поверхнево- активна речовина й ін. Використовувані добавки вибирають із зазначених засобів або їх сполучень, не обмежуючись ними, в залежності від форми застосовуваного дозування.

Захворювання, що підлягають лікуванню згідно із способом даного винаходу, являють собою пухлини лімфатичної тканини (за винятком мієломи), які несуть антиген на пухлинних клітинах і з яким зв'язується антитіло, застосовуване згідно з даним винаходом. В якості конкретних захворювань такого роду можна відзначити гострий В-лімфолейкоз (В-ГЛЛ). хронічний В-лімфолейкоз (В-ХЛЛ), пре-В-лімфому, лімфому

Буркітта, фолікулярну лімфому, фолікулярну лімфому кори головного мозку, дифузійну лімфому, гострий Т- лімфолейкоз (Т-ГЛЛ), хронічний Т-лімфолейкоз (Т-ХЛЛ), захворювання, зв'язане з людським вірусом Т-клітин (АТЛ), периферичну Т-лімфому, не зв'язану з людським вірусом Т-клітин (ПНТЛ) і ін. Лікарські засоби згідно з даним винаходом використовуються в якості лікарських засобів при лікуванні пухлин лімфатичних тканин.

Приклади

Приведені нижче приклади служать для більш детального опису даного винаходу. Слід зазначити, що даний винахід не обмежується зазначеними прикладами ніяким чином.

Приклад 1. Конструювання антитіла проти Н М 1.24 1. Одержання мишачих асцитів, що містять антитіло проти НМ1.24 Одержують гібридоми, що продукують антитіла проти НМІ. 24 згідно з методом Гото із співавт. (Сс0о0, Т. єї а!., Віоса, 1994, 84, 1922-1930).

Мишам лінії ВАЇІ В/с (одержувані від фірми СІЕА, Японія), яким попередньо увели внутрішньочеревно 500мкл 2,6,10,14-тетраметилпентадекан (виробництво У/ако Риге Спетісаї! Іпаивілевз, Ц.), за 11 ії за З дні до експерименту ін'єкціюють внутрішньочеревно 5х106 гібридомних клітин. Починаючи з 10 дня після ін'єкції гібридомних клітин, збирають асцити, які накопичилися в черевній порожнині миші, за допомогою постійної голки 19 розміру Наррусаз (виробництво Меаікі). Зібрані асцити центрифугують двічі зі швидкістю 1000 і 3З000боб/хв із використанням низькошвидкісної центрифуги ВІ Х-131 (виробництво Тату беїко) для видалення гібридом і контамінантів, таких як клітини крові й ін. 2. Очищення антитіла проти НМІ1.24 Із мишачих асцитів

Очищення антитіла проти НМІ.24 із зазначених вище мишачих асцитів проводять таким способом. Після додавання рівної кількості ФБР(-з до мишачих асцитів суміш фільтрують із використанням волокнистого фільтра Меаіаргер (виробництво МіПіроге) і потім піддають афінному очищенню з використанням високошвидкісного приладу для очищення антитіл Сопбер І С100 (виробництво МіПірогге) і колонки Нурег Ю

Ргоївїп А (колонка об'ємом 20мл виробництва Міпоп Саїві), ФБР'(-) в якості адсорбційного буфера і 0,1М натрій- цитратного буфера (рН 4) в якості буфера, що елюює, у відповідності з інструкціями, що додаються. Фракції, що елююються, відразу ж доводять до значення рН 7,4 при додаванні 1М Трис-НСЇІ (рН 8,0), і потім піддають концентруванню і заміщають буфер на ФБР'/(-) із використанням ультрафільтраційного концетратора Сепігіргер 10, із подальшим стерильним фільтруванням через мембранний фільтр МіПіроге (виробництво МіПроге) із розміром пор 0,22мкм з одержанням очищеного антитіла проти НМ1.24. 3. Визначення концентрації антитіла

Концентрацію очищеного антитіла визначають при вимірюванні поглинання. Так, очищене антитіло розбавляють у ФБР(-), вимірюють поглинання при 280нм і обчислюють концентрацію з використанням коефіцієнта перерахування, що складає: 1,35 одиниць оптичної густини - 1мг/мол.

Приклад 2. Вивчення реакційної здатності антитіла проти НМІ1.24 із лімфатичними пухлинними клітинами 1. Очищення контрольного мишачого Ідсга.

Контрольний мишачий ІдСга очищають у такий спосіб. Комерційно доступний Ідсга (КАРРА) (Орс 10) з асцитів (виробництво Сарре!) розчиняють в очищеній воді і ФБР(-). Розчин фільтрують із використанням мембранного фільтра Аего-дізс (виробництво Сіїтап Осієпсев5) із розміром пор 0,2мкм, і потім очищують афінним способом за допомогою високошвидкісного приладу для очищення антитіл Сопбер ІС 100 (виробництво МШіроге), колонки Нурег О Ргоївїп А (колонка об'ємом 20мл, виробництво Міпоп Саїві), ФБР (-) в якості адсорбційного буфера і 0,1М натрій-цитратного буфера (рН 4) в якості буфера, що елюює, у відповідності з інструкціями, що додаються.

Фракції, що елюються, відразу ж доводять до значення рН 7,4 при додаванні 1М Трис-НСЇІ (рН 8,0) і потім піддають концентруванню і заміщають буфером ФБР(-Х із використанням центрифужного ультрафільтраційного концентратора Сепійргер 10 із подальшим стерильним фільтруванням через мембранний фільтр МіПех СМ (виробництво МіПіроге) із розміром пор. 0,22мкм з одержанням очищеного контрольного мишачого Ідага.

Визначення концентрації контрольного мишачого ІдСбега проводять згідно з процедурою, приведеною раніше в розділі "3. Визначення концентрації антитіла. 2. Аналіз згідно з методом проточної цитометрії

Реакційну здатність антитіла проти НМ1.24 із лімфатичними пухлинними клітинами досліджують методом проточної цитометрії. Після промивання у ФБР'(-) Т-клітинної лінії ВРМІ 8402 (АТСС СВІ-1995), ССВЕ-СЕМ (АТС СВІ -119), одержаної з клітин при гострому лімфобластичному лейкозі НРВ-АЇІ І. (ЕССНІ1018), одержаної з клітин при гострому лімфолейкозі, НРВ-МІ Т (ЕССНІ1019), одержаної з клітин при Т-лімфомі, УМ (ЕССНІО23), одержаної з клітин при гострому лімфолейкозі, МОЇ Т-4 (АТСС СВІ -1582), одержаної з клітин при гострому лімфобластичному лейкозі, диїкаї (ЕССНІ1024), одержаної з клітин при гострому лімфолейкозі, ССАЕ-НОВ-2 (АТС СОЇ -120.1), одержаної з клітин при гострому лімфобластичному лейкозі, МТ-1 (ЕССНІ1043), одержаної з клітин при захворюванні, зв'язаному з людським вірусом Т-клітин, Її КТ-3, одержаної з клітин при лімфомі

Леннерта (5Пітіги, 5.6ї а!.. Віоса, 1988, 71, 196-203), а в якості В-клітинної лінії клітин СЕ55 (АТСС ТІВ-190), трансформованих вірусом ЕВ, позитивних на ЕВ вірус В-клітин КМУ 6.4 (АТСС ТІВ-215), МС116 (АТСС СВІ - 1649), одержаних при В-лімфомі, ССАБ-5В (АТСС СбС1І-120), одержаної з клітин при гострому лімфобластичному лейкозі, В-клітин ВРМІ 6410 (ЕССНбО47), одержаних від пацієнта з гострою мієлоцитарною лейкемією, Юацаї (АТС СС -213), одержаної з клітин при лімфомі Буркітта, ЕВ-3 (АТОС ССІ -85), одержаної з клітин при лімфомі Буркітта, У|оує (АТОС СС -87), одержаної з клітин при лімфомі Буркітта, На)і (АТОС СС - 86), одержаної з клітин при лімфомі Буркітта й в якості клітинної лінії, що не відноситься ні до Т-, ні до В-типів,

НІ-60 (АТСС ССІ-240), одержаної з клітин при гострій мієлоцитарній лейкемії, ТНР-1 (АТСС ТІВ-202), одержаної з клітин при гострій моноцитарній лейкемії, 0О-937 (АТС СВАІ-1593), одержаної з клітин при гістіоцитарній лімфомі і К-562 (АТСС ССІ-243), одержаної з клітин при хронічній мієлоцитарній лейкемії, добавляють 100мкл антитіла проти НМ1.24 або очищене контрольне мишаче антитіло дс2, розведене до концентрації 25мкг/мл у ЕАС5 буфері (ФБР'(-), що містить 295 навколоплідної сироватки теляти і 0,195 азиду натрію), після чого усе інкубують на льоду протягом ЗОхвилин.

Після промивання в ЕАС5 буфері добавляють 100мкл козячого протимишачого антитіла (САМ), міченого

ФІТЦ у концентрації 25мкг/мл і потім інкубують суміш на льоду протягом 30 хвилин. Після промивання в ЕАС5 буфері клітини суспендують у ббОмкл або їмл РАС5 буфера й у кожній клітинній суспензії вимірюють інтенсивність флуоресценції за допомогою приладу ЕАСбсап (виробництво Весіоп Оіскіпзоп). Результати, подані на фігурах 1-23, підтверджують, що усі Т-клітинні лінії і усі В-клітинні лінії (за винятком Вацаї і Ра), які не реагують), реагують з антитілом проти НМІ.24 і у високому ступені експресують антиген НМІ. 24. З іншого боку, жодна з клітинних ліній, що не відносяться до Т- або В-типу, не реагує з антитілом проти НМІ1.24 ії не експресує антиген.

На гістограмах, приведених на фігурах 1-23, маркери показують, що при фарбуванні контрольним мишачим ІдСга негативні клітини складають 9895 і позитивні клітини складають 295. На підставі картини, одержаної з зазначеними гістограмними маркерами, був обчислений відсоток позитивних по антигену НМ1.24 клітин при використанні антитіла проти НМІ.24, і результат поданий у Таблиці 1. По відсотку позитивних по антигену НМІ1.24 клітин рівень експреси антигену НМ1.24 підрозділили на 5 рівнів: -, -/-, ж, кі вк, У результаті було підтверджено, що усі Т-клітинні лінії і В-клітинні лінії (за винятком Юацаї і Ва)ї) у високому ступені експресують антиген НМ1.24, що аналогічно результатам, показаним на фігурах 1-23. При цьому, в усіх випадках використання клітинних ліній, що не відносяться до Т- і В-типів, відсоток позитивних по антигену

НМІ.24 клітин, був негативним або складав менше 595, що вказує на те, що експресія антигену відсутня або знаходиться на дуже низькому рівні.

Таблиця 1 яння Тр експресії

В-клітинна лінія

Саші | - (28)

Вай | - |20

Т-клітинна лінія

79М 1 лк 1998)

КТЗ | ля 196.0)

Клітинналінія,щоне, НІ-бО | - /28 відноситьсядо В-іТ-| ТНР-ЯЇ | - /15) типів щ-837 1-1

Іква | - 15.8) -. «590; 77-, 5-20; -, 20-5090; 50-8090; -----, »809о

Приклад 3. Визначення КЗЦ активності

КЗЦ активність антитіла проти НМ1.24 стосовно лімфатичних пухлинних клітин визначається в такий спосіб: 1. Одержання кліток-мішеней

У якості кліток-мішеней готують завись ССАБ-СЕМ (АТС ССІ-119), одержану з клітин при гострому лімфолейкозі, ССАР-НЗВ-2 (АТС ССІ-120.1), одержану з клітин при гострому лімфобластичному лейкозі,

НРВ-МІ Т (ЕССНІ019), одержану з клітин при Т-лімфомі, ЕВ-3 (АТСС СС -85), одержану з клітин при лімфомі

Буркітта, МС 116 (АТСС СВАІ-1649), одержану з клітин при лімфомі Буркітта, ССАБ-5В (АТСС ССІ-120), одержану з клітин при гострому лімфолейкозі, і К-562 (АТСС ССІ-243), одержану з клітин при хронічній мієлоцитарній лейкемії, у концентрації 4х105 клітин/мл у середовищ АРМІ1640 (виробництво Сірсо ВАГ), що містить 1095 навколоплідної сироватки теляти (Сірсо ВАІ). П'ятдесят мкл кожної з цих клітинних суспензій вносять на 96б-лунковий мікротитрувальний планшет з плоским дном (виробництво ЕаЇсоп) і проводять інкубацію в інкубаторі з високою вологістю в атмосфері 595 СО» (виробництво Табаї) протягом ночі при 3770. 2. Одержання антитіла проти НМ1.24

Очищене антитіло проти НМ1.24, одержане в зазначеному вище Прикладі 1, готують у концентраціях 0, 0,2, 2 і 20мкг/мл у середовищі АРМІ1640, що містить 1095 навколоплідної сироватки теляти (виробництво

Сірсо ВА) і 5Омкл суміші добавляють до 96-лункового мікротитрувального планшету, підготовленому, як зазначено вище в Розділі 1. Після інкубування планшети в інкубаторі з високою вологістю в атмосфері 595 СО2 (виробництво Тараї) при температурі 37"С протягом 60 хвилин, проводять центрифугування на низькошвидкісній центрифузі О5РА-22 (виробництво Нігасні) при 1000об/хв протягом 5 хвилин і відбирають 5Омкл супернатанту. 3. Приготування комплементу

Комплемент дитинчат кролика (Вабу Наррі) (виробництво Седагпапе) розчиняють в очищеній воді з розрахунку 1 мл на ампулу, і далі розбавляють у зхмл середовища АРМІ1640 (виробництво Сірбсо-ВАЇ), що не містить навколоплідної сироватки теляти. П'ятдесят мкл зазначеної суміші розподіляють по 96-лунковому мікро титрувальному планшету з плоским дном, підготовленому, як зазначено вище в Розділі 2, і проводять інкубацію в інкубаторі з високою вологістю в атмосфері 595 СО» (виробництво Тавбаї) протягом 2-х годин при 3776. 4. Визначення КЗЦ активності

Після завершення інкубації добавляють 1О0мкл Аіатаг Виїе (виробництво Віо бошцгсе) до кожної лунки 96- лункового мікротитрувального планшету з плоским дном, описаного в Розділі 3, і проводять інкубацію в інкубаторі з високою вологістю в атмосфері 595 СО» (виробництво Табаї) протягом 4-х годин при 37"С. Потім кожну лунку проміряють на інтенсивність флуоресценції (довжина хвилі збудження 53Онм, довжина хвилі емісії 59О0нм) із використанням системи вимірювання флуоресценції СуїобБіпог 2350 (виробництво МиПіроге).

Цитотоксичну активність (у відсотках) обчислюють за формулою (А-С)/(В-С)х100, де А позначає інтенсивність флуоресценції при інкубуванні в присутності антитіла, В позначає інтенсивність флуоресценції при інкубуванні тільки в середовищі без додавання антитіла, С позначає інтенсивність флуоресценції лунки, що не містить клітин.

Результати показали, як видно з фігур 24 і 25, що К-562, яка не реагує з антитілом проти НМ1.24 за результатами аналізу методом проточної цитометрії не продемонструвала цитотоксичність навіть при додаванні антитіла проти НМ1.24, тоді як ССАЕ-СЕМ, ССАЕ-Н5ОВ-2, НРВ-МІТ, ЕВ-3, МО-116 і ССАБЕ-558, які взаємодіють з антитілом проти НМ1.24, демонструють цитотоксичність способом, залежним від концентрації антитіла проти НМІ. 24. Цей результат указує, що антитіло проти НМ1.24 виявляє КЗЦ активність у відношенні лімфатичної пухлини, що несе на клітинній поверхні білковий антиген, із яким антитіло проти НМ1.24 специфічно зв'язується.

Приклад 4. Протипухлинна дія антитіла проти НМІ.24 у відношенні мишей із трансплантованою лімфатичною пухлиною людини 1. Одержання антитіла для введення 1-1. Одержання антитіла проти НМ1.24

Очищене антитіло проти НМ1.24, одержане в приведеному вище Прикладі 1, готують у концентрації 1мг/мл і 200мкг/мл у стерильно відфільтрованому ФБР'(-) і використовують у наступних експериментах. 1-2.Одержання контрольного мишачого ІдДсга

Очищене антитіло, одержане в зазначеному вище Прикладі 2, готують у концентрації 1 мг/мл у стерильно відфільтрованому ФБР'-) і використовують у наступних експериментах.

2. Протипухлинний ефект антитіла проти НМ1.24 на мишах із трансплантованою лімфатичною пухлиною людини 2-1. Одержання мишей із трансплантованою лімфатичною пухлиною людини

Мишей із трансплантованою лімфатичною пухлиною людини одержують таким способом. Клітини ССАЕ-

НеВв-2 (АТСС СС -120.1), одержані при гострому лімфобластичному лейкозі і які субкультивували іп мімо із використанням мишей 5СІЮ (СіІеа, Японія), готують у вигляді зависі в концентрації 1х1Овклітин/мл у середовищі АВРМ11640, що містить 1095 навколоплідної сироватки теляти (виробництво Ссірсо-ВА). Клітинні суспензії, одержані як зазначено вище, ін'єктують підшкірно в черевну порожнину мишей 5СІЮ (б-тижневі самці), наступного дня після введення їм внутрішньочеревно 100мкл антиасіального препарату СМІ (У/асо

Риге Спетісаї! Іпаивігієв). 2-2. Введення антитіла

На 7 день після трансплантації пухлини вимірюють циркулем діаметр пухлини, що утворилася в тому місці, куди зазначеним мишам трансплантували ССАР-Н5ОВ-2 із лімфатичною пухлиною людини. Після визначення об'єму пухлини тварин групують так, щоб у кожній групі середнє значення об'єму пухлини було приблизно однаковим (по 8 тварин на групу, усього З групи). Починаючи з того самого дня, тваринам у кожній групі уводять внутрішньочеревно 100 мкл антитіла проти НМ1.24 у концентрації Імг/мл або 200мкг/мл, або 1мкг/мл контрольного мишачого Ідсга, підготовленого як зазначено вище в Розділі 1. Уведення проводять двічі на тиждень, усього 19 разів аналогічним способом. Протягом цього періоду вимірюють циркулем діаметр пухлини двічі на тиждень і підраховують об'єм пухлини. 2-3. Оцінка протипухлинного ефекту антитіла проти НМ1.24 на мишей із трансплантованою лімфатичною пухлиною людини

Протипухлинний ефект антитіла проти НМ1.24 оцінюють по зміні об'єму пухлини і періоду виживаності мишей. У результаті, як показано на фігурі 26, було встановлено, що збільшення об'єму пухлини придушується при уведенні тваринам антитіла проти НМ1.24 у порівнянні з контрольною групою тварин, яким уводили мишачий Ідсга. При цьому, що також видно з фігури 27, при введенні групі тварин антитіла проти

НМ'І1.24 спостерігається збільшення періоду виживаності тварин у порівнянні з контрольною групою тварин, яким уводять мишачий Ідсга. Ці факти вказують на те, що антитіло проти НМ1.24 приховують протипухлинну дію на мишей із трансплантованою лімфатичною пухлиною людини.

Посилальний Приклад 1. Одержання гібридом, які продукують мишаче моноклональне антитіло проти

НМ1.24

За методом Гото із співавт. (0, Т. єї аї., Віоса, 1994, 84, 1922-1930) одержують гібридоми, що продукують мишаче моноклональне антитіло проти НМ'1.24.

Плазмову клітинну лінію КРО-32 (1Хх107), одержану з кісткового мозку пацієнта з множинною мієломою людини (Со, Т. вї а!., Урп. у. Сіїп. Нетайі., 1991, 32, 1400) ін'єктують двічі в черевну порожнину мишей лінії

ВАЇ В/с (виробництво Спапез Вімег) кожні шість тижнів.

За З дні до умертвіння тварини в селезінку миші ін'єктують 1,5х106 клітин КРО-32 для посилення антитілоутворювальної здатності миші (Со, Т. єї аї., Токизпіта У.Ехр. Мед., 1990, 37, 89). Після умертвіння тварини екстрагують селезінку, і в екстрагованому органі проводять процедуру клітинного злиття з мієломною клітиною 5Р2/0 (за методом Стгоїй, де 5. апа 5снгеідеддег, Сапсег Везеагси, 1981, 41, 3465).

За методом ІФТФА на клітинах (Розпег, М.В. еї аї., у). Іттипої. Меїйоаз, 1982,48, 23) із використанням

КРО-32 проводять скринінг культурального супернатанту гібридом на наявність антитіла. 5х104 клітин КРО-32 суспендують у 5бмл ФБР, аліквоту переносять на 96б-лунковий мікротитрувальний планшет (О-образне фанульоване дно, виробництво макі) і потім висушують на повітрі при температурі 37"С протягом ночі. Після блокування реакції додаванням ФБР, що містить 195 бичачого сироваткового альбуміну (БСА), вносять культуральний супернатант гібридом і проводять інкубацію при 4"С протягом 2-х годин. Потім проводять реакцію при 4"С протягом 1 години козячого антитіла проти мишачого Ідс, міченого пероксидазою (виробництво 7утей). Після промивання проводять реакцію з розчином о-фенілендіаміну (виробництво

Зитіюто Вакеїїе) при кімнатній температурі протягом 30 хвилин.

Реакцію зупиняють додаванням 2н сірчаної кислоти і вимірюють поглинання при 492мм із використанням лічильника ІФТФА (виробництво Віо-Най). Для добору гібридом, які продукують антитіла проти людського імуноглобуліну, культуральний супернатант позитивних гібридом спочатку адсорбують на людську сироватку, після чого проводять скринінг реакційної здатності по відношенню до інших клітинних ліній за допомогою методу ІФТФА. Відбирають позитивні гібридоми і їх реакційну здатність до різних клітин визначають за допомогою методу проточної цитометрії. Останній відібраний гібридомний клон клонують двічі і ін'єктують у черевну порожнину мишей лінії ВАГ В/с, оброблених пристаном, і далі збирають із них асцити.

З асцитів миші одержують моноклональні антитіла й очищають їх осадженням сульфатом амонію і з використанням набору для афінної хроматофафії білка А (Атриге РА, виробництво Атегезпат). Очищені антитіла мітять ФІТЦ із використанням набору Опціск Тад РІТС бБідіпо Кії (виробництво Воеєпгіпдег Маппеїт).

В результаті досліджень показано, що моноклональні антитіла, що продукуються 30 гібридомними клонами, реагують із КРО-3 і АРМІ 8226. Після клонування досліджують реакційну здатність клітинного супернатанту від зазначених гібридом з іншими клітинними лініями або моноядерними клітинами периферичної крові.

З них З клону продукують моноклональні антитіла, які специфічно реагують із плазмовою клітиною. із зазначених 3-х клонів був відібраний і позначений як НМ'1.24 гібридомний клон, який найбільш придатний для аналізу методом проточної цитометрії і який має КЗЦ активність до ВРМІ 8226.

Підклас моноклональних антитіл, що продукуються зазначеними гібридомами, ідентифікують методом

ІФТФА з використанням протимишачого антитіла кролика, специфічного до даного підкласу (виробництво 7утедй). Антитіло проти НМ1.24 відноситься до підкласу Ідсга. Гібридома НМІ1.24, яка продукує антитіло проти НМІ1.24, була депонована в Міжнародній Колекції згідно з положеннями Будапештського Договору як

РЕВМ ВР-5233 14 вересня 1995 року Національним Інститутом біологічних наук і гуманітарних технологій

(Майопа! Іпзійше ої Віозсієпсе апа Нитап-Тесппоіоду, Адепсу ої Іпдивійа! Зсіепсе апа Тесппоіоду, ої 1-3,

Нідавні І-споте, Т5иКиба сіїу, Ібагакі ргеї., Японія).

Посилальний приклад 2. Одержання гуманізованого антитіла проти НМ1.24

Гуманізоване антитіло проти НМ1.24 одержують у відповідності з наступним методом.

З гібридоми НМ'1.24, одержаної в посилальному Прикладі 1, одержують загальну РНК із використанням традиційного методу. На її основі синтезують КДНК, що кодує М-область мишачого антитіла, і ампліфікують за методом з використанням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) і за методом 5-ВАСЕ. Одержують фрагмент

ДНК, що містить ген, що кодує мишачу М-область, який лігують із вектором клонування на основі плазміни рус і потім вводять у компетентні клітини Е.соїї із повчанням трансформанта Е.соїї. Зазначену плазміду одержують із трансформанта. Визначають традиційним методом нуклеотидну послідовність кодуйочої ділянки кКДНК у плазміді й ідентифікують гіперваріабельну ділянку (ГВД) у кожній М-області.

Для конструювання вектора, що експресує химерне антитіло проти НМІ1.24, у НЕЕ вектор уставляють

КДНК, що кодує М-область кожного з І-ланцюга і Н-ланцюга мишачого антитіла проти НМІ. 24. Далі для конструювання гуманізованого антитіла проти НМ1.24 ГВД М-області мишачого антитіла проти НМ1.24 пересаджують на людське антитіло за методом пересадки ГВД. І-ланцюг людського антитіла ВЕЇ використовують в якості І -ланцюга антитіла людини, для каркасних областей (КО) 1-3 Н-ланцюга людського антитіла використовують КО 1-3 людського антитіла НОЗ і КО4 із людського антитіла /Нб використовують для

КО4. Деякі амінокислоти в КО із М-області Н-ланцюга заміщають так, щоб ГВД-трансплантоване антитіло могло сформувати відповідний сайт для зв'язування антигену.

Для експресії гена І-ланцюга і Н-ланцюга сконструйованого таким способом гуманізованого антитіла проти НМІ1.24 у клітини ссавця кожний ген окремо вводять у вектор НЕЕ для конструювання вектора, який буде експресувати І -ланцюг або Н-ланцюг гуманізованого антитіла проти НМ1.24, відповідно.

При одночасному введенні зазначених 2-х векторів експреси в СНО клітини встановлюється клітинна лінія, що продукує гуманізоване антитіло проти НМ1.24. Активність, що зв'язує антиген, і інгібування активності, що зв'язує, щодо клітинної лінії М/ІЗН клітин амніону людини гуманізованого антитіла проти НМ1.24, одержаного при культивуванні зазначеної клітинної лінії, були досліджувані клітинним методом ІФТФА. Одержаний результат показує, що гуманізоване антитіло проти НМ1.24 має антиген-зв'язуючу активність, що дорівнює такій у химерного антитіла, і в тому, що стосується активності по інгібуванню зв'язування з використанням біотинвмісного мишачого антитіла проти НМ1.24, воно також виявляє активність, яка дорівнює активності химерного антитіла або мишачого антитіла.

Е.соїї, що несе плазміду, яка містить ДНК, що кодує М-область І -ланцюга, і ДНК, що кодує М-область Н- ланцюга химерного антитіла проти НМ1.24, була депонована в Міжнародній Колекції згідно з положеннями

Будапештського Договору як ЕзсПепсніа сої! ОН5ех (рОС19-І,241 -дк) ії Евзспегіспіа соїї ОН5о; (рОсС19-1І.24Н-ду|) 29 серпня 1996р. Національним Інститутом біологічних наук і гуманітарних технологій (Майопа! Іпвійше ої

Віозсіепсе апа Нитап-Тесппоіоду, Адепсу ої Іпдивійа! бсієпсе апа Тесппоіоду, ої 1-3, Нідавпі І-споте, Твикиба сікгу, Ібагакі ргеї., Японія) як РЕВМ ВР-5646 і РЕЕНМ ВР-5644, відповідно. Крім того, Е.соїї, що несе плазміду, яка містить ДНК, що кодує варіант а (ЗЕО ІЮ МО:2) М-області І -ланцюга або варіант г (ЗЕО ІО МО:3) М-області Н- ланцюга гуманізованого антитіла проти НМ'І1.24, була депонована в Міжнародній Колекції згідно з положеннями Будапештського Договору як ЕзсПепспіа соїї ОНБбо (рОС19-А8МІ а-АНМ-ЯкК) і ЕзсПпетісніа соїї ОНБо; (рОС19-АМНІ-ду), відповідно, 29 серпня 1996р. Національним Інститутом біологічних наук і гуманітарних технологій (Майопаї! Іпзійше ої Віозсієпсе апа Нитап-Тесппоіоду, Адепсу ої Іпаивійа! Зсієпсе апа Тесппоіоду, ої 1-3, Нідавні І-споте, Тзикиба сіїу, Ібагакі ргеї., Японія) як РЕВМ ВР-5645 і РЕЕВМ ВР-5643, відповідно. Далі,

Е.соїї, що несе плазміду, яка містить ДНК, що кодує варіант 5 (5ЕО ІЮ МО0:4) М-області Н-ланцюга гуманізованого антитіла проти НМІ1.24, була депонована в Міжнародній Колекції згідно з положеннями

Будапештського Договору як ЕзсПпегісніа сої ОН5о (рОС19-АМНьі-АНМ-дуІ) 29 вересня 1997р. Національним

Адепсу ої Іпдивійа! Зсіеєпсе апа ТесНнпоіоду, ої 1-3, Нідавзпі І-споте, Т5иКиба су, Ібагакі ргеї., Японія) як РЕВМ

ВР-6127.

Посилальний приклад 3. Клонування кДНК, що кодує білковий антиген НМІ1.24.

Клонують кДНК, що кодує білковий антиген НМ'1.24, специфічно розпізнаваний антитілом проти НМІ.24. 1. Конструювання бібліотеки КДНК 1) Одержання загальної РНК

З клітинної лінії множинної мієломи людини КРММ2 одержують загальну методом Чиргвіна із співавт. (Спігміп еї а!., Віоспетівігу, 18, 5294, 1979). Згідно із зазначеним методом, 2,2х108 клітин КРММ2 цілком гомогенізують у 20мл 4М гуанідінотіоцианату (виробництво Масаїаї Тездиеє Іпс.). Гомогенат нашаровують на 5,

ЗМ розчин хлориду цезію в центрифужній пробірці, яку потім центрифугують із використанням ротора

Весктап 5УУ40 із швидкістю З31000об/хв при 20"С протягом 24 годин для осадження РНК. Осад РНК промивають 7095 етанолом і потім розчиняють у З0О0мкл 10мм Трис-НСЇ (рН 7,4), що містить ТМ ЕДТА і 0,595

ДСН. Добавляють проназу (виробництво Воепгіпдег) до концентрації 0,5мг/мл і потім проводять інкубацію при температурі 37"С протягом 30 хвилин. Суміш екстрагують фенолом і хлороформом і РНК осаджують етанолом. Осад РНК розчиняють у 200мкл 10мм Трис-НСЇІ (рН 7,4), що містить їмм ЕДТА. 2) Одержання полі(А)їРНК

Полі(А)їРНК очищають із використанням в якості вихідного матеріалу 500мкг загальної РНК, одержаної згідно з описаним вище методом за допомогою набору для виділення мРНК Раві Тгаск 2,0 тАМА Ізоїайоп Кії (виробництво Іпмігодеп) згідно з інструкцією, що додається до набору. 3. Конструювання бібліотеки ДНК

Синтезують дволанцюгову кКДНК із використанням в якості вихідного матеріалу 1Омкг зазначеної вище полі--А)-ЕНК за допомогою набору для синтезу КДНК ТітебЗамег СОМА Зупіпевів Кії (виробництво Рпаптасіа), згідно з інструкцією, що додається до набору, і потім проводять лігування з ЕсоВІ адаптером, що поставляється в наборі, із використанням Оігесіопа! Сіопіпд Тооірох (виробництво РНаптасіа), згідно з інструкцією, що додається до набору. Кінування й обробку рестрикційним ферментом Мої адаптеру Есові проводять згідно з інструкцією, що додається до набору. Далі дволанцюгову кДНК, що додається до адаптеру, що має розмір 500нп або більше, відокремлюють і очищають із використанням 1,590 низькоплавкого агарозного гелю (виробництво бідта) з одержанням 40мкл доданої до адаптеру ланцюгової кКДНК.

Одержану в такий спосіб додану до адаптеру дволанцюгову кКДНК лігують із використанням вектора рСОБ51 (заявка на патент Японії 8-255196) і ДНК-лігази ТА (виробництво Сірсо-ВВІ), яка була попередньо оброблена рестриктазами ЕсойВі і Мої і лужною фосфатазою (виробництво Такага 5Ппи20о) для створення бібліотеки КДНК. Сконструйовану бібліотеку КДНК за допомогою трансдукції вводять у штам Е соїї ОН5Бо. (виробництво Сірбсо-ВАГ), при цьому згодом було встановлено, що це незалежний клон, що має загальний розмір біля 2,5Хх106. 2. Клонування методом прямої експресії 1) Трансфекція СО5-7 клітин

Приблизно 5х105 клонів зазначеного вище штаму трансдукованої Е.соїї культивують у середовищі 2-їТ (МоІесшаг Сіопіпд: А І арогаюгу Мапиаї, Затьгоок еї а!., Соїа ргіпд Нагсог І арогайгу Ргезв, 1989), що містить 5Омкг/мл ампіциліну, для ампліфікації КДНК, яку піддають обробці за лужним методом (МоіІесшаг Сіопіпд: А

І арогаїогу Мапиаї, Затргоок еї а!ї., Соїа бргіпд Нагтбог І арогаїгу Ргезв, 1989), із відновленням плазмідної ДНК з Е.соїї. Одержану в такий спосіб плазмідну ДНК переносять методом трансфекції в СО5-7 клітини методом електропорації з використанням приладу Сепе Риїзег (виробництво Віо-Над).

Згідно з зазначеним методом, 10мкг очищеною плазмідною ДНК добавляють до 0,8мл розчину СО5-7 клітин, в якому клітини були суспендовані у ФБР у концентрації 1х107клітин/мл, і одержану суміш піддають впливу імпульсів у 1500 М при ємності 25мкф. По закінченні 10-хвилинного відновлювального періоду при кімнатній температурі клітини після електропорації культивують у культуральному середовищі ОМЕМ (виробництво Сірсо-ВАЇ), що містить 1095 навколоплідної сироватки теляти (виробництво Сірсо-ВАЇ) при температурі 37"С в атмосфері 595 СО» протягом 3-х днів. 2) Підготовка кювети

Кювету, на якій наносять мишаче антитіло проти НМІ1.24, готують за методом Сіда із співавт. (В.5еє еї а.

Ргос.Маї.Асайа.5сі. ОБА; 84, 3365-3369, 1987). Згідно із зазначеним методом, мишаче антитіло проти НМ1.24 добавляють до 50мм Трис-НСЇ (рн 9,5) до концентрації 1Омкг/мол. Три мілілітри приготовленого в такий спосіб розчину антитіла добавляють до чашки з клітинною культурою діаметром бОмм і інкубують при кімнатній температурі протягом 2-х годин. Після промивання З рази 0,15М розчином Масі до чашки добавляють ФБР, що містить 595 навколоплідної сироватки теляти, їмм ЕДТА і 0,0295 МамМ»з. Суміш після блокування використовують для подальшого клонування. 3) Клонування бібліотеки КДНК

СО5-7 клітини, що піддавалися трансфекції за описаним вище методом, обробляють ФБР, що містить 5мм

ЕДТА. Після однократного промивання клітин ФБР, що містять 590 навколоплідної сироватки теляти, їх суспендують у ФБР, що містить 595 навколоплідної сироватки теляти і 0,0295 МамМз до концентрації приблизно 1х106клітин/мол. Суспензію вносять у кювету, підготовлену як зазначено вище, і проводять інкубацію при кімнатній температурі протягом приблизно 2-х годин. Після обережного триразового промивання ФБР, що містить 595 навколоплідної сироватки теляти і 0,0295 МамМз, виділяють плазмідну ДНК із клітин, зв'язаних із кюветою, із використанням розчину, що містить 0,695 ДСН і 10мм ЕДТА.

Відновлену плазмідну ДНК переносять методом трансдукції в Е.соїї ОН5се. Після ампліфікації за описаним вище методом плазмідну ДНК відновлюють лужним методом. Відновлену плазмідну ДНК переносять шляхом трансфекції в СО5-7 клітини за допомогою електропорації і відновлену з клітин плазмідну ДНК зв'язують, як описано вище. Повторюють один раз аналогічну процедуру і відновлену плазмідну ДНК розщеплюють рестриктазами ЕсоВіІ і Мої, що підтверджує факт наявності вставки, що має розмір приблизно 0,9 тис.нм.

Клітини Е.соїї, в яких частина відновленої плазмідної ДНК була перенесена шляхом трансдукції, інокулюють на чашку з 2-ХТ агаром, що містить 50мкг/мл ампіциліну. Після культивування протягом ночі виділяють з однієї колонії плазмідну ДНК. її розщеплюють рестриктазами ЕсоВі і Мої з одержанням клону р3.19, в якому розмір вставки складає приблизно 0,9тис.нп.

Проводять реакцію зазначеного клону з використанням набору для секвенування РАВІЗМ, бує Тептіпайг

Сусіє Зедиєпсіпд Кії (виробництво РеїкКкіп ЕІтег/г), згідно з інструкцією, що додається до набору, і визначають нуклеотидну послідовність із використанням секвенатора ДНК АВІ 37 ЗА ОМА Зедпепсег (виробництво Регкіп

ЕІтег). Зазначена нуклеотидна послідовність і відповідна амінокислотна послідовність подані в ЗЕОІЮМО:1.

Промислова застосовність

Результати аналізу методом проточної цитометрії показали, що антитіло проти НМІ1.24 активно взаємодіє з більшістю клітин, одержаних із пухлин лімфатичних тканин, указуючи на те, що у випадку багатьох пухлин лімфатичних тканин поліпептид, що має епітоп, розпізнаваний антитілом проти НМІ1.24, експресується значною мірою. Крім того, уведення мишам із трансплантованою лімфатичною пухлиною людини, що реагує з антитілом НМ'1.24, антитіла проти НМ1.24 приводить до придушення росту об'єму пухлини, а також до збільшення періоду виживання. Зазначені факти показують, що антитіло проти НМІ1.24 або антитіла, розпізнавані поліпептидом, що має епітоп, розпізнаваний антитілом проти НМІ1.24, мають цитотоксичну активність проти багатьох пухлин лімфатичних тканин і це дає підставу припускати, що зазначене антитіло може використовуватися для лікування хворих із пухлинами лімфатичних тканин.

Посилання на мікроорганізми, депоновані згідно з договором по Патентному співробітництву (Раїепі

Соорегаїйоп Тгеєайїу), Положення 13-2 і найменування Інституту, що депонує.

Інститут, що депонує

Найменування: Національний Інститут біологічних наук і гуманітарних технологій. Агентство промислової науки і технології (Майопа! Іпвійше ої Віозсієпсе апа Нитап-Тесппоіоду, Адепсу ої Іпаивійа! 5сієпсе апа

Тесппоіоду)

Адреса: 1-3, Нідазпі І-споте, Т5икиба сіїу, Ібагакі ргеї., Японія

Мікроорганізм (1)

Найменування: Езспегіснпіа соїї ОН5о (ри538-риС19)

Номер збереження: РЕВМ ВР-4434

Дата депонування: 5 жовтня 1993 року

Мікроорганізм (2)

Найменування: Гібридома НМ1.24

Номер збереження: РЕВМ ВР-5233

Дата депонування: 14 вересня 1995р.

Мікроорганізм (3)

Найменування: Езспетгісніа соїї ОнБодриОС19-АМНІ-АНМ-дТУі)

Номер збереження: РЕВМ ВР-5643

Дата депонування: 29 серпня 1996р.

Мікроорганізм (4)

Найменування: Езспегісніа соїї ОНБо (рИОсС19-І.24Н-оду)

Номер збереження: РЕВМ ВР-5644

Дата депонування: 29 серпня 1996р.

Мікроорганізм (5)

Найменування: Езспегісніа соїї ОН5о; (рОС19-8МІ а-АНМ-ОоК)

Номер збереження: РЕВМ ВР-5645

Дата депонування: 29 серпня 1996р.

Мікроорганізм (6)

Найменування: Езспегісніа соїї ОНБо (рОсС19-1,241 -дК)

Номер збереження: РЕВМ ВР-5646

Дата депонування: 29 серпня 1996р.

Мікроорганізм (7)

Найменування: Езспегісніа соїї ОНБ5о (рОС19-АМНьі-АНМ-дті)

Номер збереження: РЕВМ ВР-6127

Дата депонування: 29 вересня 1997р.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

ЗЕОІЮО МО: 1

Довжина послідовності: 1913

Тип послідовності: нуклеїнова кислота

Число ланцюгів: одноланцюгова

Топологія: лінійна

Молекулярний тип: К«ДНК

СЛАТТСООСА СОАСОСАТСТ Об АТО СА ТСТ АСТ ТСС ТАТ САС ТАТ ТОС 49

Мес Ала Зак ТВг Зепг Тух Азв Тус Суз 1 З

АСА СТО СОС АТО САЛА САС СОС САТ ЛА СОС тот ААС СТІ СІ Сто бо 91

Ап Ма) Вго Має бі Азр о біу Азр Туз Акту Суз Гуз Газ ес Пез С1У 270 25

АТА СОЛО АТІ СТО СТО СТ СТО АТС АТО СТО АТ сто соб сто ССС То 155

Ії С1у І1ю Пец Узі Пай Се І1 ІЗ3е Уаї Ї16є їез б1іу Маї1ї Рто Цеч

Зо 25 40

АТТ АТС ІТС АСС АТС ААб ССС ВАС ОАСо САС осо То Сб сс сос ст 193

Іїа І16 Рва ТйхІ І16 Пуз Аа Азп бех біш Аза Суз Ал Азр Сім баз

СОС ССА СТО АШО САС ТОЇ ФС ААТ Сто АС САТ СТО СТО СЛА САА САС 241

Аху Аіа Мзі Мет б3)и Суз Аху Азп Уаї тТпш Нуз Іі Без бій біп бі 0 51 70

СТО АСС ОСАб СОС САС АС ПОС ТТ САС БАХ СТО сАб обо САС боб ос 289 во тс; су з1іа бій Туз біу Раз біп о АзвоУаз біз Аза біп Аза Ма 73 во 85

АС ОТО ААС САС АСТ СТО АТС СОС СТА АТО СТ ТОС СТО САТ ССА САС 337

ТвлоСуз Аза Ніз Тпг Чаї Меє Аза Тач Маб А1їа Зехї Пец Азр Аіа бі 90 535 105

Алс ССС САЛА ССА САА ААС ААА СТО САС САС СТІ САС о СОА САС АТО АСТ 385

Куз йїа біп біу сіп уз Муз Чаї сій біб Пез бі Сіу біб І)Зе ТЕ ' 110 115 120

АСА ТТА ААС САТ ААб ОСТІ САС САС ССО ТСТ бСА пло СТО бАб СА СТО 433

ТІ ач Азп Ні Пу5 це бів Аср Аза Заш Аза біз Маї біз Ах ей 125 130 135

АСА АСА САА ААС САС СТО ТТА АСС СІТб. АБСА АТС ССС САС ААб ААб ТАС «81

Агпа Апу біз Азп біп Уа! Цей бас Уа1і Аху ІТ Ала Азо Пуз уз Тут 150 115 1ї50

ТАС ССС АСС То САС САС ТОС АСс тос сст о ссс бос соб сс сто сто 529

Туш Вто Зех бЗеп Сіп Азр Бех беї бЗесг Аза Ліза Аїа Рхз біп без Тви 155 160 165

АТттТ сто ста Сто сб Сто АЕС ОСТ СТО СТО САС ТСА БАТЕССАБСА 375

Ії Маї Пай Ім Сіу цей Заг 513 Па та біп чих 170 175 180

АССТОСССАСА ТСТІССААСО ТССбТІССТОС ТОСССТТІТТС ССТТСААСАТ ТОСССТТСАТЕ 635

ТСАТСАСТТС ТСАСССССТС АТССОССААС АСССТТАССС СОПАСАССАС СОСОТАСОСО 695

САБЛАСОССС ТСТССАССАС СТСТССАСО; СОСАТОсОоссС АоТССІСОСТ СТОСОЗАСАЄ 755

АсСТСОССТТО АСОСАСОССТ СТСТСССТОС АСЬьСССТССС ТОССОСАСЛАТ бАСТСССССС 815

ТСтТТоТСТСС САСССТСАСА ТТООССАТСО ССТОоСОсТоТ СОСОСОСАТО ТОоСТОССТСТ 875

ТСТІАТООССІ ТІТІТТТТОСо бОБОСосСТІсС СІТТІТТСІС СООТСТТІСА ССТОСАААЛА 933

ААЛАЛАСАСТ ТССТІТСАСО САБАССАСАС СТТААААВАА АААААААААА ААААААВАлЛА 995

ААААТІССВОЮ СО5СО0С 5013

ЗЕОЮ МО 2:

Довжина послідовності: 379

Тип послідовності: нуклеїнова кислота

Топологія: лінійна

Молекулярний тип: кДНК

Послідовність

АТС бСА ТСо СС ОТстТ АТС АТС СТО ТСС ТТ СТА бСА АСА бСТ АСА сот 48

Меє бСіу Тх:р баг Суз І10 Іза Пац Бак Пец Маї Аза Тпх Р1а Тк СіУ

Й -15 й -10 -5

ПТС САС ТОС САС АТС САб АТС АСС САС АС ССА АСо АСС сте дсС оосе зб

Уаї Низ бек Ар Ії1з Сіп Мас ТВ біп Зет Рхо Баг Зах цем бак Ліз -1 і З 10 сс ст СТ САС ДСА СТО АСС АТС АСС ТОТ ААб ОСТ АСТІ САб САТ сто 144

Зепш уаї Сіу Ар хг УМаї Тпх І1в ТІ Суз Пуз Аза Заг біп Азрв Чаї 29 25 -

ААТ АСТ ССТ СТА бос Тай ТАС САС САС АС ССА ССА АКА бСУ ССА ААб 192

Азп Таж Ала Маї Аза Тдюв Туп біп біб Цуз Рго Сіу уз Аїа вхо Шу за 35 40 45

СстС Сто АТС ТАС То ССА ТСС АС СО ТАС АСТ СОТ СТ ССА АБС АбБА 252

Бац оцез І1їа Тут Бех Аза беп Азп Агу Тут ТВк обіу Маї Рхо Зах АкФ ва ттс дос сот дос ост Ас сот АСО САС ОТТО АСОС ТТ АСС АТС Або АС 288 не Зап біу Зег біу баг С1у Тпг Азр о Впе Тпх Ре Тпх Ї1е Бех бех 65 70 75

СТ САБО СсА САС САС АТС СОТ АС ТАС ТАС ТС САб САА САТ ТАТ АСТ 336

Беч обіп Рхо бій Авзр о І1ів Аза ТІ Туї Тут Суз біп біл Ніз Тух Зег зо 85 за

АСТ ССА ТТС АСо ТТ бос СА СОС АС ААС СТО САА АТС ААА с 379

Тих орто Ра ТВЕІ Рпе бі" біп 21у Тпх2 Туз Уаї Мі Ї1е уз 95 00 й 105 . 5ЕО ТО МО, З | .

Довжина послідовності: 418

Тип послідовності: нуклеїнова кислота

Топологія: лінійна

Молекулярний тип: «ДНК

Послідовність

АТ САС тоб АСС ТСб АСС Сто ТІС ТТС ТТ сто бСТ ста ост ССА СОТ 48 меш Азр ТІр ТВх Тгр Агу Маії Рпе Рпе Бас без Ала чаї д1а тт 1Уу -15 -10 Щі

ССТ САС ТС САС сто САб Сто Сто САС о ТСТ бо СТ САС СТО АС ААб 96 да нів 5еп біп Ма! біп їви узі біп бах біу Аїа бій Уаї Гуз Гуз -1 1 З 10

ОСТ ссп осо тТсА СТ ААС СТІ ТОС ТоС ААб бСА ТСТ бСА ТАС АСС ТІС 144

Рго біу А1їа бак Маії Цуз Маї Зех Суз Був Аїа Бех біу Тут ТІ Рпе

Ст ССС ТАС То АТо САС тоб сто СА САС СС ССТ бСА САА Со СТІ 192

Лв Рго Тусг Тгр Мес Сіп Ттр Уа) Агу біп А1а Рго біу бій сіу цеч зо 35 40 45

АТС ОСАС Той АС Тос Або сто ТС ТТо ТІ СТ бсСт СТА бСТ ССА бот

Ме Азр Тигр Тпг Тгр Ахд Уа1 Ре Рбе Їївпи Ге Аза Уаї Аза Рко біу -15 -10 -5

ССТ САС ТОС САС СТО САС СТО СТО САС ТСТ боб ост САС СТО ААб АС

Аїа Ніз бетг біп Чаї біп Пац Маї біп бах сіу Аїа біз Уаї цуз Гуз -і 1 5 10

Ссст осбо бос ТСА СТО АХ СТІ ТоС Тос ААб о СсА ТСТ СС ТАС СС ТС

Ртго біу А1їа Зег Уаї Буз Уаії 5ек Суз буз Аїа Бех біу Тух ТНБ Рі. 15 2а 25

АСТ СОС ТАС ТО АТО СЛ ТСОо СТО ССА САС ССО ССТ СА САЛА соб СсТТ

ТЕ РІз Тук ТІвр Мас бій Тгр чаї Ах сіп Аіа Ро Сіу Сіп біу цей 0 15 40 45

САС ТОЗ АТО ООА ТСТ АТІ ТТТ ССТ ббА САТ ОСТ САТ АСТ Або ТАС АСТ біц Тлр Мес піу бек І) Рпа Рхо біу Азр біу Авр ТБп Аг Тут Зег 5О 58 бо

САБО ААСОТТС АБ бос АСА СТО АСС АТС АСС ССА САС ААс То АС Або біп цув Рра пуз с1іу Аху Чаї ТпхоТ1е ТВх А1їа Азр оПуз Зек ТІг Бех 85 70 75

АСА ОСС ТАС АТО САС СТО АбС АС СТО АБА ТСТ САС бас АС бос ото

ТАх Алла тут Мас Сі пес бот Зеб Гез Атгу Баб Сі Азр Твлодла тУаї 80 85 30

ТАЖ ТАС ТОТ ССЗ АбА СОА ТТА СБА СА сб бос ТАС ТАС ТТТ САС ТАС

Туп Тухп Суз А1з Агу біу Бач Агу Аху б1іу біу Тут Тухк Ра Азр Тут 95 100 105

ТОБ бо САА соб АС АСо СІС АСС Сто ТоС тТсА о

ТІВ СІіу біпосіу Тах Тйхп Уаі Тпк Уа1і Бех Бес 110 115 120

ЗЕОО МО: 4

Довжина послідовності: 418

Тип лослідовності: нуклеїнова кислота

Топологія: лінійна

Молекулярний тип: КДНК

Послідовність

АХхС САС тоб дос тос дсо стс ТТ ТІС ТТОо СТО ОСТ СТА ССТ сССА ССТ 48 мес Ар Тгр ТП Тир Ахо Маі Ре Рпе Гец Пец Аза Уаі КМ1а Рхо б1У -15 -50 -5

ССт САС ТСС САС СТО САС Сто сто САС ТСТ боб ОСТ САС СТ ААС Адо 96

Ала Ніз Баш біп уаї біп Пец Уаї Сіл беж біу Аза біз Маз пцуз Цуз -і 1 5 10

Ссст ссо СсС ТсА СТО ААб СІТ Тос ТОС Аа бСА ТТ СА ТАС АС ТС 144

Рго біу Аїа Зег Маї Цуз Ча) Заг Суз йЦуз А1їа бЗес: біу Тухк Тпг РБа 15 20 25

АСТ ССС ТАС ОТОС АТО САЛО То СТО ССА САС осс ССТ ОСА САА соб СТ 192 твх Рто тут ТІр Меб бів Тхр Узі Абу піп А1а Рхо сіу біп сіу Бай о 35 40 45

САС ТОб АТО бОА ТС АТІ ТТТ СОТ бСА ПАТ СОТ САТ АСТ АС ТАС АСТ 240

Сі ТІр Меє біу бех І1е Рна Рго біу Азр Сіу Азр ТБл Аку Туг 5а:

Й 50 55 бо

САС ОААС ОТТО АЛО СОС АБА СТС АСС АТС АС ОСА САС ААС ТОСС АС Лос 288 сіп цуз Рпе пух Су Ак Уві ТБлос1ю ІпЕ Аза Азр Цуз Зек ТВЕ 5ег 65 70 .7в

АСА ССС ТАС АТО САб Сто АОС АСО СТО АСА ТСТ бАС САС Со осо б 336

ТнІ Аїа Тут Мес біз Газ Зег бег їєп Агу Зех біз Азр ТПг Аза Маї ва 85 90

ТАТ ТАС ТСТ боб АСА СОА ТТА ССА ССА бос 00 ТАС ТАС ТТТ САС ТАС з94 туп Тут Суз А1з Аг Сіу Паз Агу Ах Сбі1у 51іу Тук Туш Ре Азр Тук 95 100 105 - тос боб САА боб Асс Асо сто асо ото ТОос ІС с 418

Тев бСіу біп Сіу ТВх о Тбх Уаї Трх Уаї Баг Зех 110 115 120

Перелік послідовностей «1105 СНОСАЇ БЕЇМАКИ КАВИЗНІКІ КАІЗНА «120» Лікарський засіб, застосовуваний при лікуванні пухлин лімфатичних тканин «1302Е908 «1405РСТ/)РО8/00568 «14151998-02-12 «-1505УР 9-41410 «15151997-02-12 -16058 «21051 «21151013 «2122ДНК «213»Нотозаріеп5 «223»Нуклеотидна послідовність ДНК, що кодує антиген НМ1.24 «40051 чзатссодса суадудаєст уд асо дса соб асб сс бас дас тає дес 49

Мес А1ів Зек ТБПг о Зек Тут Авзвр Туп Суз 1 5 . ада дід ссс аб даа дас дозу чаї зад сос бат аадф ств сс сто 994 97 йгЧ оУаї Ркго Меє біз Азр біу Азр Гуз Агд Су ПЦуз Сей печ'ївї 1У 0-20 25 ата дса абїх сс дб сес сту абсоаїс дод ат сто од осуд ссс сс 145

Іїа сіу ї1е йей Уаї Пай Пез Г1е І18 Маії І1їа Це) сбіу Чаї Рго Гвш айхт асс с:с о дссоасс азу дос зас здс здад дсс бус соб сас 9д9с с 193

Іїе І1а Рле ТЕ І1е Цуз Ала Аяп Зап бі Аза Суз Ало Ар біу Сей - су уса ду асд чад бус сус ває дес асс саб сес соту сла саа дад 241

Ах Аїа Маї Мей бі Суз Аго АзпоУуаї ТвВх Ніз Пец Тва бій біп біч

БО 65 т7о собу асо дад дос сад азу дус бос сад бас до ад дес сад со дес 289

Печ Тпг біз Аза бСіп Гуз С1у Рпе біп Азр Маї Сі Ала іп Аза ліз 75 во в5

. асс сдс аас сат ас усу аб дес стаз аху дет сс сб дає дса даФ 337

ТпІ Сув Авп Нів Тіт Маї Мас Азіа Сви мес Аза баг Ге; Ар діа Сі за 35 105 105 аа дсс саа да саа аау ааа доб сад дад ст дад дса да абс асо 385 цуз АМа біп біу біп Гуз Пуз Уа) біц біш йез біз біу біч ї16 Те 19 115 120 аса ста аас сає зад ссЕ сад сас дсу їсЕ дфса дзд де дад ста сс 433

ТпЕ Пез Азп Нів пуз КТацч бій Абв Аза бек Аїа біц Чаї Сій Акуд Тей 125 і30 135 . ачЧа ада даа аас сау дос ста асс детд здз абс дсу дас авФ азад гас 451 ще

Ата Аха біп'Азп бій Уаї Пе Баг Ма1ї Аху І1е Аза Азв Гуз Пуз Тук 140 "115 150 . ас ссс задо сс сад дає ссо адс бсо дос дсу дея сес осад сод сод 529

Туш Рго Зак Зак Сіп Авзр Зах Зег бЗех Аїа А1а Ала Рко біп Пвц пей 155 160 165 ас чЕзЧ се суд дос о сес адс деї ссу сбд сад са давсссасоа - 8

ІТ1е Чаї Печ Бей сіу Пем о Зес Аза Бес Теч бій ї70 175 180 ' адстудсаса ссобасааду сссуссстдс бсодессстс дсвсдаасає сосстбдаєс 635 ксаєсадесс сдЧадсоууєс асосодсаас асочссадсо дудачацесас дододвадссЯя 695 . чадазддусс Ессудадсау дЕстосаося дуссасодудс здссстооас дсодддасаєс 7585» ачтсчЧдевд асссасоуст удбсоссстос ададссіссс сссоддасаає дадтсссссс 815 сстсчтстсс сассессттауа седоссабсоу зЧс9дст9б9с додЧа5савсд сдссдсссдє 875 . «дисасхосат стжессвусу дсодсооусту сте сту додЕсІсбца дессесаааза 935 засзаасась ссст:їс9399 Засассасаєсє сттазааааа зазаазаадаа аазааазаза 995 ззавсстсоду сддссцес 1013 21022 «211» 379 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність к«220» «221» «2225 «223» Нукпеотидна послідовність ДНК, що кодує М-область Ї ланцюга варіанта а гуманізованого антитіла проти НМ1.24 «40052 ах дуа суд аус бує абсо асо стос ссс бу да дса аса чес аса дос 48

Мес Сіу тов бек Суз І1в І18 Та: баг Пем Уаї Аіа Твх Аза Тпх б1у -15 -10 Й -3 цес сас бес дас аїс сад ас асо сад здо сса адс здс сеч адс дес 96

Ууаї Ніз бБеш Авр оІЇІ1їю біп Маїс Тгобіп Зег Рго Зех Зак Пес Зех АМ1а -1 1 5 . 10 засе до дує дас вда уд зссоабс асс бді зад дес ат сач дає 955 144

Зап Чаї біу Азр Агу Маї ТБІ 16 Твх Суз уз Аіа бак Сіп Авр Уаї 22 25 аз асі дсо уїта дос буд стас сад сад зад сса дова аадФ де сса зад 192 двпотпх Аза Узі Аза Ттр бук Зап біп Пуз Рхо біу цуз Аа Ркго цу зо 35 40 45 сбд со айс тас Ббед дса бос вас суд Хас асо дує усу сса адс ада 246 їеж печ І1е Туг бвп Аїа Заг Асп' Агу Тук ТВх Сіу Ма1 Рго бех Аг 50 55 БО сс адс сдЕ адс дуб адс дує асо дас сс асс сто асс абс задо аде 288

Ра Зах Сіу бепг біу Бех СІ1у Тпп Азр Рпе ТБк Рке ТНЕ Іза Зег 5ег 65 70 15 спос осад сса узд дас абс сс асс бас тас бус сад саа сах бас адб 336

Те бій Рхо біц Азр І1е Аза Тпт Тук Тут Суз Сіп Сіп Наз Туг бек во 85 . 90 . аст сса стстсоасу сто дос осза ду асс аву дб даа або заз с 379 -

ТвЕ орто Рпе Тіг Ре Сіу Сіп біу Тпл уз Уаї Січ 19 Цуз 95 100 105 «910» 3 «2112 41 «212» ДНК «213» Штучна послідовність у «220» | Й «221» «222» «223» Нуклеотидна послідовність ДНК, що кодує М-область Н-ланцюга варіанта г гуманізованого антитіла проти НМ1.24 «АО01» З ас Час сдч асс соду ауд дос бо ссс о сбд сод дст дфта дес сса дох 48

Мет Аво Тур Тс ТІр Агу Уаї Ве Ре Пес Печ А1а Маї діз хо біу -ї5 -0 -5

Чдсї сас бсо сау усу сад сот 459 сад їсс суд дсї дад сс вад ааФф зв

Аза Ніз бег бСіп Уаії Сіл Пец Уа1ї біп Баг Сіу Аіа біз Уаї цЦуз Пуз кі 1 5 10 : ссе дод дсс о їса дБд о аау с ссс бус зад дфса шсСї дса бас оасс сс 144

Рго б1у Аза бЗеш Чаї Пуз Уаї Зап Суз цуз А1а Зепк біу Тух Тах Ріє ше 25 аст сос сас суд асд са; боб ду суа сад дос сої ода сай дод ст 192

ТппоРго Туп ТхпроМес бій Тгр Уаї АкгЯ бій Аза Рго б1у біп біу Бей 3а - 35 40 45 чад су ау дда хо асо 5 ссс уза здає дує да ас зуу тасоаче 240 біз ТгвоМеєсє біу Зес Ї16 РНе Ро б3іу Азр біу АБр ТВ Агу Тух баг во 55 о са аву Ес вад удс аца дес асс абд асс са дас сзад сс асу здо 2858 біп 1уз Ре цу 01у Агу Чаї ТБх Мес ТБпжх Ата Азроцуз Бас Таг бЗег 85 70 75 аса усс бас аб дад ссд адс адс ско зба со дад дас асу дес 454 336

ТвІ А1ї1а Тус Мес Сіс Пец бЗахс Заг о бей Агу Зег о біа Авзр о Тато Аїа Уаї во 85 зо таї їтас су: су ада дса ї5а са суда дод буду бас сас сс дає бас 384

Тух Тут Суз Аіа Агу біу маш Ах Ага біу біу Тут Тух Ре Авр Тук 100 . 105 с5у 999 саа ч39д асо асо дос асо усо бос о сса с ч418

Тр біу бів Сіу Твш ТЕ хаї ТБІ Уаії Беї Бех: 110 115 129

«10» 4 211» 418 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «2215 7 «222» «223» Нуклестидна послідовність ДНК, що кодує М-область Н-панцюга варіанта 5 антитіла проти НМ1.24 «00» 4 а Е 48 -5 е асс єс асу дїс стоп со 689 сбд 9дсе дса дсе сса од

Має м тер Таг ТЕ Ах5 та Рга Ба паш цей Мча чаї Аїа Рго б1іу -15 -10 -5 т 9 аа з39 96 стосас бос сад дод сас собу зб сад сб 999 сс Чадо

Аза Нів Бег біп Маї сСіп ле Уаї біп Бех б1у Аї1а бій Чаї Туз Туз

Щ 1 5 10 -1 (1 5 , іх то жсо Є са сб дда бас вос сс 34 сст д99у дсс сса до ааб обо бсо бос азу б є зас вто сі; А1а Зех Маї Пуз Ма! Зеї Суз Пуз Аїа бег Сіу Тук Тк Ра

Й 25 15 20 се да саз дод се 152 ас ссс бас сб асу сас 539 555 стра саду дес с тах Рго Туп ТЕр Ме Сіп ТЕр Уаі аку сіп Аза Рхо сіу сіп сіу теп

УНН 2 40 4 33 3: чач п99 ас зуа сот аст сЕїІ сс дуа дає дує дає асе аду Бдс аде 240 біч ТІр Має біу бек ІЛе Ре Різ біу Агро Сіу Аз ТБкх АкФ ту Зеї

Ії 5 55 - се с кс асд зас 2885 «бс азу дус зда дос асо абс асо дса дай заф 2 са гу Ввпе гув с1у АгтоМаї ЇВІ І18 ТБг Азїа Або Буз Зект Тпг Зег біл Ц Е у у се 5 70 с а сс чу 336 сс отас асу дад сс адс ас ссу аса їсс дФад час асу 9 те ма Тут Мест біц Бай бе Зех Пез Ага Бех біш АзвоТвІ Аза хаї й 5 30 во 85 Й ба пас сб дсу зада дса Еба ссоа суда 999 999 Бас Бас сБЕ дас бас, 384

Тух Туп Суз Аїз Агт біу цеш Аху Агу біу б1у Тут Тут Рпе Азр Тут 95 100 6. 105 ав «-« «т г се ссз 4

Ії ду саа уд асо асу дис зсс дїс псе Й те су біп о біу Тпс тах Уа) Тнх Маї бек бЗетг 110 115 120 «210» 5 «2112 180 «212» білок «213» Нотозарівпе «223» Амінокислотна послідовність антигену НМ1.24 «а0О» 5

Ме Аза бетг Тих беш Тук Аво Туг Сув 1 Е!

Агу Уаї Рго Мес бій Авр б1іу Ар оцуз Аху Суз пЦуз Без пеш бе біу - 20 25

Ії біу Іїе реш Маї Цап Тео Ї18 І1а Чаї Ії Пе Сіу Маї Рго Гей

Т19 Ії Ріе Тс Ї1в Гуз Аза Ап о Зак Січ Аза Суз Алу Азр С1у Баш зо 35

Аху Аїа Чаї Мес біз Суз Аду Азп чаї ТІ Ні йецз Ге біп біп бі -. бо 65 70 пач Тато бій Аза біп Був біу Рве біп Азр Уаї Сі Аїз біл Аза Аза 175 во 85

ТвІ Суз Азп Нів Тпт Чаї Мес Аіа Газ Мет Аза Зек ГПем Авзр Аза сій 90 95 й 105 пуз Аза бСіп біу Сіп уз Цуз Маї бій бій Бей Січ біу біц І1є6є тах

Ії 110 115 120 тТви Теш Азп Ніз був цес біп А5роАїа Бех Аза Січ Маї біз Ак пе -125 130 135

Аг Агд Січ Ап біп Уаї Пес бек Ма! Агу І1є А1а Азр Буз Цуз Тук 140 145 150

ТУШ Ржо Баг Заг біп Азр бек бЗег Зег Аза Аза Аза Рхо біп бач Пе 155 150 165

Іїе Ууаї Печ бач Сіу Пец бек Аза ем Пец біп 170 175 180 «210» 6 «2112» 126 «212» білок «213» Штучна послідовність «220» «221» «222? х223» Амінокислотна послідовністьм-області І-панцюга варіанта а гуманізованого антитіла проти НМ1.24 шк «00» 6

Ме сіу Тлвр Бап Суз І18 ГТ1а їец бас Пцац Уаї Аза Тк Аза Твг сіу -15 -10 -5

Маї Кіз Зес Азр І1а Сіп Месє Тих біп Зес Рко баг Зет Пец Бах АІ1з -1 1. 5 10

Зах Чаї біу Авр Ах Маї ТЕ ІЇїа Тпшх Суз Гуз Аза Зег біп Азр Маї 15 29 ав 3.

АвпоТнтІ Аза Маї Аза Тор Тут біп Сіп їуз Рко біу цуз Аїа Рхо Гуз 30 35 40 45 їез Газ І1їа Тук Заг Аїа баг Азп Алу Тут Тс біу Маї хо Бек Ах4 5О 55 БО

Впе беп Сіу Зек сіу Зек біу ТІ: Азр Рпе ТАх Ре ТБх І16 бах баг 65 70 75 їПем біп Рхо бій Азр о І1а Аїа Тс о Туг Тук о Суз біп Сіп Ні Туп Зеї о 85 50

Тахорко РБе Хвг о Рпа біу сід Сіу Тйс о Ппуз Маї біч 11є6 цуз з5 1050 105

«21025 7 «2112 139 «2122 білок -213» Шкучна послідовність , «220» «2212

ШУ дух «223» Амінокиспотна послідовність У-області Н-ланцюга варіанта г гуманізованого антитіла проти НМ1.24 «4005 7 с.

Мет Азв о Тгр о Тпт Тир Агд чаї РБа Рпе Пес Цей Аза Уаї Аза Рго сіу й -5 -10 -5 ліа Ніз Зах сСіп Маї біп печ Уа1ї біп Зак Сіу А1а біч Маї уз Буз -4 1 5 10

Вта сіу Аїа бас Уа! Пуз Ма) бех Суз уз Аза Зеш б1у Тук Тих Рпе 24 28 тах Ро Тут Тгр Маб біп ТР Маї Агд біп Аза Ркго біу біп б1у Пец зо й з5 чо 45 біб Ттів Метї Сіу Баг Ї1з Рбе 8го б1у Авр Сіу Азв ТЕ Адб ту Бак кд 55 сіп пуз бле уз біу Ах Мах тах Має ТвпЕ А1іа Ар Муз Зак ТЕ Зег

Й 55 та 75 тпх Аза Тух Меї біз Пес Бас бег ем Ах Зеп біп Азвр ТБг Аїа Чаї во 85 зо тТух Туш Сув Аза Алло біу лез Ахо Асд сіу сіу Тут Тут Ре Ачзр Ту, вв 100 105

Тпв біу біп біу Тк ТвжІ Ма)! ЇІпк Уаї бех 5е: 110 115 120 «2105 8 «2112 139 що «212» білок «213» Штучна поспідовність «220» «221» «229» «223» Амінокиспотна послідовність М-області Н-ланцюга варіанта 5 гуманізованого антитіла проти НМ1.24

«400» 8

Мет Азр ТЕр Тпт Тер Ак Уаї Рбе Рне Іво без Аза Уаї Аза рго біу -15 -15 -З

Аіїа нів Бех Сіп Уаї Сіп цец Маї біл о бехт біу Аїіз бій Уа) буз уз -ії і 5 10

Вго біу Аїа Бес Маї Цуз Чаї Зех Суз Гуз А1з Зак Сіу Тук ТБх Рпе 24 25

Твг Рго Тут Тер Мас біп Тхр Маї Акд біп Аза рко біу біп сіу Цец зо 35 - 40 45 біз ТЕв Мес біу Зех І1а Рпе Рго с1у Азр о Сіу Азр Таг Асу Тух Зекг

Бо

Сіп Цуз вне уз б1іу Агд Маї ТБ ЇТа ТВг Аїа Азр о цуз бек ТЬг бек

Й 65 70 15

ТвЕ Аза Ту Меє бій Бецп Заг бас Пез Ах бег біз Азр ТпЕ Аза маї во 85 зо

Тут Туп Суз А1їа Аху біу ПЦез Агу Аху б1у біу Тух Туп Ре Азр Тут 95 100 105 7:

Тхтр сіу сСіп сту Твпх Тах Уаї ТІВе Чаї бек баг 110 115 - 120

Фіг. 1 й

Тл

Мей - СЕ55 с Н

М ря 1 г Я ш Ж

Ми ш і Ко,

І 7 в - 2 де - Щі ї ї ц

Е І: Бо о ї Е оте о хх х се ї т и - Е ї жк ща що и т І. у дО Ї ІН й щ- павтттитвня ооо Кт т аінннвнитнаннн 1п 1п 1 1 п? 1 ої

Р-Н

Фіг2 іт

Пи

Нр

З ЗК У6.А п - . тп цик) ю

Ж - вс : с о «1 - Я вв - ЗМЕН

Гикі ї ВЕ щу ї М

З Го пд я песен інет реле М ПИВА СИ 107. 10 Інн) 10 | пе

ЕС1-Н

Фіг

Й в-3 й МУ116 в | ! ре х. їе т ши чи за! т1д2 зд їде

ОРСТО бАМА-КРІТС

Фіг4 в-4 ц з ССКЕ-5В че М Її й о їт Н Й и НЕ ШЕ й Ї ї хи 205 ша - реле ЧИ яд аеозазздй

Р-Н

Фіг.5 в-5

В с о ЕРМІ 6410 чі 5 8.1 984 5 їз с шин чи бої 1д2 зд їде

Е1-Н

Фіг.б в-6

В й ЕВ 8 511 ) ог ї ї жі . 4 1 т сао ди свинину

Я зо! зд оз095 чо?

ЧРСТО БАМА-НІТС

Фіг7 в-7

З 0000 Доує ве) кВ З - п 2 їх 1 у, ї і г я за! то? озо8 ой

ПРСТО САМ-РІТС .

Фіг.8 в-8

М Бацці

Пп ш чай « т. с ше жк я "- заїзд? зо8 той

СРСТО бАМАРІТС

Фіг8 в-8 м Вацаї те -

В що

ЕЕ! зо! їо2озо5 ой

ПОРС1О бАМ-РЇТС

Фігло т-

З

Пищ| ї КРМІ 5402

РЕж ШЕ

ЕН ЩЕ сн не г зейдлий тля 10 н 1 т 1 п? |! п |! до 1-8

Фіглі т-2 тк з ССЕВЕ-СЕМ

Еї

Ог- 2 їх ! 57 й НВ. - Бе щі пк чи тд о5 їде

ОРСТО САМА

Фіг12 т-3

ІЗ о НРВ-АЦ, 8 / г в чи за! тд? ої д50з:дй г -Н

Фігл3 т-4

Ти п й НР В -МІ.Т 81 бе1 ае3і : -1: М ї- син, ій НО зРиимт ит бло! то2оз05 зо

ЕСТ1-Н

Фігл14

Т-5 в ія) м шо м 84 їв : і її жк - ее чаш б чої 5о2озо5 чо? г1-Н

Фіг15 т-6 яд) и 7

Гр

ЩЕ ШЕ МОЇ п її я с

ПИ Е т т, У Я - г Га НИ З - й

МІ 1 ю Пи і й Є й з ев во 5 ДІ що -й - 1а- | о 105 і по 1 ої и 1-н

Фіг16

Т-7 -

Гуд їй о 0 Ликаї - я

Го аз ша СП СЕ -

ЕВ 1 я щш і ! о З гі я її й т 1 і Де я

Пи т іа ЩІ

С -е ес и, жи иа зо іп 1д! 1 п 105 тд?

К1-Н

Фіг17 1-8,

Пи щш гг 51, ССВЕ-Н5В-2

Ж я

Ти 1

ЕК І й 8531 бо ЕЕ 1 с ; Я : : ; дв ви Кен терте зо! ядер

Е1-Н

Фіг.18 т-9 пи щ м 1 з Мт-1 3

Б щі ! ! - З а (ва; 15 7 м З ;

ЕО і Н м б-1 11 о ощ4А 51 9, щи - і з д ї о тА нн вва б за! за2оздячай

Е1-Н

Фіг. 19 т-10

Гищ щ рт 1 Кт-3 р ю Її щ" і ЕІ!

Ех | . г. 5-1 за! за? оз-о9 де

Е1-Н

Фіг20

М-1 рн в т , НІ-60 « Пе,

СЯ с сл З ж ФО й що юю На

Шк НН т се Є

ІЙ пи с б Зої то? 405 зо

Фіг21

М-2 т сх іти «0 ТНР-Ї с ск ю ї, с щи т ЕЕ : ще -

В с,

Ган де Синя тил й ол і од вто

Я зо! 302 000305 00106

Фіг.22

М-3 їі

З ю ід І . 937

В !

См ой оо у

О'я ЛВ.

З Б

Й о на оо й. с А ото рот нення з заїзд за 0стой

Е1-Н

Фіг23

М-а іп це й о К-562

Гі см я, ї- в .

Кс пн

Ге пошу не що - з щ Б в з В

Й ДЗ В т ВІН. - них сс

Іран сія ДИВАН о М нот

Ід / їй і їй 1017 Ів! 1 п і о? |! пт

Т-Н

Фіг24 125 рен я т тя я т и о дн а шотоо чі тетррнннтттт

Е с -Щж- СсСВЕ-сСЕМ ча

Во75р че стен ССВЕ-НЯВ-?

Е те в Ват, -е-- НРВ-МІт т 50 ПА .

В Шо -йа-- 7 К-5б2 8 УА - 25 . о на повин и о 04 1 10

Концентрація антитіл проти НМ1.24 (мкг/мл)

Фіг25 195 р-н ос «5 ЄЮ - ро, нд

Ж 100 |- вами Ша ща

І о о пер ї2 з Е -- ЕВ-3

ГІ Ко

В 75 їх Й

Е Й їх снноденя МС116 « м

ЕЗ но ЧИ х БО Я -- севе-ЗВ 5 ци -й-- К-562

У, .

Е 25 ран

Х тА Д сш

Ас. с о нин пн пн о 9.1 1 10

Концентрація антитіп проти НМ1.24 (мкг/мл)

Фіг?в 20000 - а 15000 !

І | т 0 -- Антитіпо проти НМ1.24 100 мкг

Е Те 5 10000 т заг і тА Антитіла проти НМ/.24 20 мкг

З 73 и ри ОД» й піно 0 Контрольний мишачий щО2а а Ж 1 5обо |. ал

В, А м о пткя влшш - о 10 20 зо 40 50 . Дні після трансплантації клітин

Фіг27 100 Г---------1--ї

ПК ня г що 75 НИ :

Е я 1

Е . НД фо07-3о Антитіло проти НМ1.24 100 мкг й ї І 5 5о й яння Антитіло проти НМ1.24 20 мкг

ІЗ І І в Н Ш

З ' ------ Контрольний мишачий Ідсга 5 25 ї

Е ! о Пд . ве у . о 20 40 во во

Дні після трансплантації клітин

Claims

1. Лікарський засіб для лікування пухлин лімфатичної тканини (за винятком мієломи), що включає як активний інгредієнт антитіло, яке специфічно зв'язується з білюом, що має амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 1, і яке має цитотоксичну активність.

2. Лікарський засіб згідно з п. 1, який відрізняється тим, що зазначена пухлина лімфатичної тканини являє собою пухлину Т-клітин.

3. Лікарський засіб згідно з п. 1, який відрізняється тим, що зазначена пухлина лімфатичної тканини являє собою пухлину В-клітин (за винятком мієломи).

4. Лікарський засіб згідно з п. 1, який відрізняється тим, що зазначене антитіло являє собою моноклональне антитіло.

5. Лікарський засіб згідно з п. 1, який відрізняється тим, що зазначена цитотоксична активність являє собою антитіло-обумовлену клітинозалежну цитотоксичність (АОСС/АОКЦ активність).

6. Лікарський засіб згідно з п. 1, який відрізняється тим, що зазначена цитотоксична активність являє собою комплементзалежну цитотоксичність (СОС/КЗЦ активність). с

7. Лікарський засіб згідно з п. 4, який відрізняється тим, що зазначене антитіло містить константну зону 7 з людського антитіла. с

8. Лікарський засіб згідно з п. 7, який відрізняється тим, що зазначена константна зона /" з людського антитіла являє собою би або С.

9. Лікарський засіб згідно з п. 4, який відрізняється тим, що зазначене антитіло являє собою антитіло проти НМ!І1.24.

10. Лікарський засіб згідно з п. 4, який відрізняється тим, що зазначене антитіло являє собою химерне антитіло або гуманізоване антитіло.

11. Лікарський засіб згідно з п. 9, який відрізняється тим, що зазначене антитіло являє собою химерне антитіло проти НМ1.24.

12. Лікарський засіб згідно з п. 9, який відрізняється тим, що зазначене антитіло являє собою гуманізоване антитіло проти НМ1.24.

13. Лікарський засіб згідно з п. 1, який відрізняється тим, що зазначене антитіло специфічно зв'язується з епітопом, що розпізнається антитілом проти НМІ1.24.

14. Антитіло, що специфічно зв'язується з білком, що має амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 1, і яке має цитотоксичну активність.

15. Антитіло згідно з п. 14, яке відрізняється тим, що зазначена цитотоксична активність являє собою антитіло- обумовлену клітинозалежну цитотоксичність (АОСС/АОКЦ активність).

16. Антитіло згідно з п. 14, яке відрізняється тим, що зазначена цитотоксична активність являє собою комплементзалежну цитотоксичність (СОС/КЗЦ активність).