SK110099A3

SK110099A3 - Remedies for lymphocytic tumors, an antibody, chimeric antibody and modified antibody

Info

Publication number: SK110099A3
Application number: SK1100-99A
Authority: SK
Inventors: Yasuo Koishihara; Yasushi Yoshimura
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1997-02-12
Filing date: 1998-02-12
Publication date: 2000-08-14
Also published as: IL131381A0; UA65561C2; DE69830492T2; US6503510B2; CN1250381A; CA2280875C; WO1998035698A1; DE69830492D1; EP0997152A4; TR199901949T2; US20020037288A1; CA2280875A1; ATE297219T1; KR20000070989A; ES2241114T3; NO993866L; CN1191855C; RU2177805C2; UA65561A; HUP0001136A3

Description

Predkladaný vynález sa týka liečebných činidiel pre lymfatické nádory (okrem myelómov), ktoré obsahujú ako aktívnu zložku protilátky, ktoré sa špecificky viažu k proteínom, exprimovaným týmito lymfatickými nádormi. Predkladaný vynález sa týka liečebných činidiel pre nádory T buniek alebo B buniek (okrem myelómov).

Predkladaný vynález sa týka tiež protilátok, ktoré sa špecificky viažu k proteínom, exprimovaným v lymfatických nádoroch, a ktoré majú cytotoxickú aktivitu.

Doterajší stav techniky

Lymfatické bunky sú zodpovedné hlavne za imunitu živých organizmov. Všetky lymfatické bunky sú odvodené od rovnakých krvotvorných kmeňových buniek, ktoré sú uvoľňované do periférnej krvi po opakovanej diferenciácii, ktorá sa uskutočňuje pod vplyvom pôsobenia rôznych diferenciácie indukujúcich faktorov alebo rastových faktorov v kostnej dreni alebo v iných orgánoch. Následkom rozdielov počas tejto diferenciácie sa delia lymfocyty na B bunky a T bunky. Za B bunky sa považujú tie, ktoré majú schopnosť produkovať protilátky, a za T bunky sa považujú tie, ktoré majú schopnosť prezentácie antigénu, pôsobia cytotoxicky a podobne. Keď prejdú tieto bunky nádorovými zmenami z nejakého dôvodu, alebo počas určitých štádií svojej diferenciácie, začnú nekontrolovateľným spôsobom proliferovať v kostnej dreni, v lymfatických tkanivách, v krvi a podobne, tento stav sa nazýva lymfatickým nádorom.

V dôsledku zavádzania nových technológií, hlavne novších technológií, ktoré na povrchu buniek využívajú mono2 klonálne protilátky voči diferenciačným antigénom, čo umožňuje určiť pôvod alebo diferenciačný stav lymfatických buniek a tiež určiť, či sú také nádorové bunky odvodené z T buniek alebo B buniek a určiť stupeň zrelosti nádorových buniek.

Základná klasifikácia lymfatických nádorov je pre nádory B buniek a pre nádory T buniek, čo je založené na pôvode a na stupni zrelosti nádorových buniek. Na základe stupňa zrelosti nádorových buniek sú nádory B buniek klasifikované ako akútna B lymfatická leukémia (B-ALL), chronická B lymfatická leukémia (B-CLL), pre B lymfóm, Burkittov lymfóm, folikulárny lymfóm, lymfóm folikulárneho obalu, difúzny lymfóm a podobne. Na druhej strane sú nádory T buniek na základe stupňa zrelosti nádorových buniek klasifikované pre akútnu T lymfatickú leukémiu (T-ALL), chronickú T lymfatickú leukémiu (T-CLL), leukémiu trelých T buniek (ATL), non-ATL periférny T lymfóm (PNTL) a podobne (Zukai Rinsho (GAN) (Illustrated Clinical: Cancer), séria č. 17 Leukémia and lymphoma, Takashi Sugimura a spol., Medical View, Co., Ltd., 1987, B celí tumors, Kiyioshi Takatsuki, Nishimura Shoten, 1991).

Bez ohladu na nedávne pokroky v lekárskych technikách, nie je liečenie lymfatických nádorov uspokojivé. Napríklad percento vyliečenia akútnej lymfatickej leukémie (ALL) je stále len 20 % a menej a u lymfómu je v pokročilom stave asi 50 %, i keď sa hovorí, že percento vyliečenia u B lymfómov je relatívne vysoké, vďaka pokroku v multiliekovej liečbe. Tiež T lymfóm je odolnejší a jeho percento vyliečenia je asi 30 %, percento úspešného vyliečenia u leukémie dospelých T buniek (ATL) je v súčasnosti menšie ako 10 %.

Na druhej strane Goto, T. a spol., popísali monoklonálnu protilátku (protilátka anti-HMl.24), ktorá bola získaná imunizáciou myší ľudskými myelómovými bunkami (Blood (1994) 84, 1922-1930). Keď bola táto protilátka podaná myši s transplantovanými ľudskými myleómovými bunkami, protilátka sa hromadila špecifickým spôsobom v nádorovom tkanive (Massaki Kosaka a spol., Nippon Rinsho (Japan Clinical) (1995) 53, 627-635), čo naznačuje, že protilátka antiHM1.24 môže byť používaná pri diagnóze umiestnenia nádoru pomocou rádioizotopového značenia, pri cielených terapiách ako je rádioimunoterapia a podobne. Nie je však známe, či je možné protilátku anti-HM1.24 použiť aj pre liečenie ostatných lymfatických nádorov.

Podstata vynálezu

Liečebné metódy u lymfatických nádorov, ktoré sú v súčasnosti používané, zahrňujú rôzne druhy chemoterapií, transplantáciu kostnej drene a podobne. Ako už bolo vyššie uvedené, žiadna z nich nie je úplne uspokojivá, a stále sa očakáva vznik prevratných liečebných činidiel alebo metód, ktoré budú schopné tlmiť lymfatické nádory a tým predlžovať čas prežitia pacienta.

Predmetom predkladaného vynálezu je poskytnutie nového liečebného činidla pre lymfatické nádory, okrem myelómov.

Aby bolo možné poskytnúť takéto liečebné činidlo, vynálezcovia uskutočňovali rozsiahle štúdie in vitro, vrátane analýzy pomocou prietokovej cytometrie (FCM) určovania cytotoxických aktivít, akou je ADCC aktivita, CDC aktivita atď. a in vivo štúdie protinádorových účinkov pomocou protilátok anti-HM1.24 (Goto T. a spol., Blood (1994) 84, 1922-1939) a štúdie izolácie antigénového proteínu, ku ktorému sa špecificky viaže protilátka anti-HM1.24. Výsledkom bolo zistenie, že antigénový proteín, rozlišovaný protilátkou anti-HM1.24 je exprimovaný na lymfatických nádoroch a že protilátka anti-HM1.24 má protinádorový účinok na lymfatické nádory a to tvorí materiál predkladaného vynálezu.

Predkladaný vynález teda popisuje liečebné činidlo pre lymfatické nádory (okrem myelómov), ktoré ako svoju aktívnu súčasť obsahuje protilátku, ktorá sa viaže špecificky k proteínu, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu, ako je uvedené v SEQ ID No: la ktorá má cytotoxickú aktivitu.

Predkladaný vynález tiež popisuje liečebné činidlo pre nádory T buniek alebo liečebné činidlo pre nádory B buniek (okrem myelómov), ktoré ako svoju aktívnu súčasť obsahuje protilátku, ktorá sa viaže špecificky k proteínu, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu, ako je uvedené v SEQ ID No: la ktorá má cytotoxickú aktivitu.

Predkladaný vynález tiež popisuje liečebné činidlo pre nádory T buniek alebo liečebné činidlo pre nádory B buniek (okrem myelómov), ktoré ako svoju aktívnu súčasť obsahuje monoklonálnu protilátku, ktorá sa viaže špecificky k proteínu, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu, ako je uvedené v SEQ ID No: la ktorá má cytotoxickú aktivitu.

Predkladaný vynález tiež popisuje liečebné činidlo pre nádory T buniek alebo liečebné činidlo pre nádory B buniek (okrem myelómov), ktoré ako svoju aktívnu súčasť obsahuje monoklonálnu protilátku, ktorá sa viaže špecificky k proteínu, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu, ako je uvedené v SEQ ID No: 1 a ktorá má ako svoju cytotoxickú aktivitu ADCC aktivitu alebo CDC aktivitu.

Predkladaný vynález tiež popisuje liečebné činidlo pre nádory T buniek alebo liečebné činidlo pre nádory B buniek (okrem myelómov), ktoré ako svoju aktívnu súčasť obsahuje monoklonálnu protilátku, ktorá sa viaže špecificky k proteínu, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu, ako je uvedené v SEQ ID No: 1, ktorá má cytotoxickú aktivitu a ktorá má konštantnú oblasť Cy z ľudskej protilátky.

Predkladaný vynález tiež popisuje liečebné činidlo pre nádory T buniek alebo liečebné činidlo pre nádory B buniek (okrem myelómov), ktoré ako svoju aktívnu súčasť obsahuje chimérnu protilátku alebo pozmenenú protilátku, ktorá sa viaže špecificky k proteínu, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu, ako je uvedené v SEQ ID No: la ktorá má cytotoxickú aktivitu.

Predkladaný vynález tiež popisuje liečebné činidlo pre nádory T buniek alebo liečebné činidlo pre nádory B buniek (okrem myelómov), ktoré ako svoju aktívnu súčasť obsahuje protilátku, ktorá sa viaže špecificky k epitopu, rozlišovanému protilátkou anti-HM1.24.

Predkladaný vynález tiež popisuje liečebné činidlo pre nádory T buniek alebo liečebné činidlo pre nádory B buniek (okrem myelómov), ktoré ako svoju aktívnu súčasť obsahuje monoklonálnu protilátku, ktoré ako svoju aktívnu súčasť obsahuje protilátku anti-HM1.24.

Predkladaný vynález sa vzťahuje aj k protilátke, ktorá sa viaže špecificky k proteínu, exprimovanému na lymfatických nádoroch a ktorá má cytotoxickú aktivitu.

Postupy, použité pri uskutočnení vynálezu:

1. Príprava protilátok

1-1. Príprava hybridómov

Hybridómy produkujúce protilátky, používané v predkladanom vynáleze, môžu byť v podstate vytvorené známym, nižšie popísaným postupom. Antigénový proteín HM1.24 alebo bunky, ktoré ho exprimujú môžu byť teda použité ako senzibilizujúci antigén a sú použité k imunizácii, uskutočnenej bežným imunizačným postupom. Takto získané imúnne bunky sú potom fúzované so známymi rodičovskými bunkami, použitím bežného spôsobu bunkovej fúzie, potom je uskutočnené hromadné vyšetrenie bežným vyšetrovacím postupom, aby boli selektované bunky, produkujúce monoklonálne protilátky.

Presnejšie povedané, monoklonálne protilátky môžu byť získané nasledujúcim spôsobom. Napríklad, ako buky exprimujúce HM1.24 antigén, ktorý je senzibilizujúci antigén pre získanie protilátky, môže sa použiť bunková línia KPMM2 z mnohonásobného myelómu (Japanese Unexamined patent Publication (Kokai) No. 7-236475) alebo bunková línia KPC-32 (Goto, T. a spol., Jpn. J. Clin. Hematol (1991) 3, 1400). Ako senzibilizujúci antigén sa môže použiť prípadne proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je uvedená v SEQ ID No: 1, alebo peptid či polypeptid, obsahujúci epitop rozlišovaný protilátkou anti-HM1.24.

Uskutočnilo sa to nasledovne: cDNA, kódujúca protein, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu, uvedenú v SEQ ID No:l, bola vložená do štiepiaceho miesta pre Xbal vektora pUC19, čím bol skonštruovaný plazmid pRS38-pUC19. E.coli, obsahujúca tento plazmid bola uložená pre medzinárodné použitie podlá ustanovení Budapeštianskej zmluvy ako Escherichia coli DH5a (pRS38-pUC19) 5. októbra 1993 v National Inštitúte of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan, ako FERM BP-4434 (pozri Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 7-196694) . Fragment cDNA, v plazmide pRS38-pUC19, môže byť použitý pri využití technológie genetického inžinierstva, pre prípravu peptidu alebo polypeptidu, obsahujúceho epitop rozlišovaný protilátkou anti-HM1.24. '

Pre imunizáciu senzibilizujúcim antigénom sú používané prevážne cicavce, a pri výbere sa berie do úvahy ich kompatibilita s rodičovskými bunkami pri bunkovej fúzii. Jedná sa hlavne o hlodavcov, akými sú myši, potkany a podobne.

Imunizácia cicavcov senzibilizujúcim antigénom sa uskutočňuje bežne známymi postupmi. Postup obsahuje napríklad intraperitoneálne alebo subkuntánne podanie senzibilizujú7 ceho antigénu cicavcovi. Presnejšie povedané, senzibilizujúci antigén, ktorý bol zriedený a suspendovaný vo vhodnom množstve solného roztoku pufrovaného fosfátom (PBS) alebo fyziologického solného roztoku atď., je zmiešaný tak, ako sa požaduje, s vhodným množstvom kompletného Freudovho adjuvans. Po emulgácii je výhodne podávaný cicavcom niekoľkokrát počas 4 až 21 dní. V čase imunizácie so senzibilizujúcim antigénom je možné alternatívne použiť vhodný nosič.

Po imunizácii a potvrdení, že došlo k zvýšeniu hladiny požadovaných protilátok v sére, sú imúnne bunky zo zvieraťa odobrané a je s nimi uskutočnená bunková fúzia, pri ktorej sa prednostne používajú ako imúnne bunky, bunky sleziny.

Ako cicavčie myelómové bunky a aj druhé rodičovské bunky, s ktorými je uskutočňovaná bunková fúzia s vyššie uvedenými imúnnymi bunkami, sa používajú prednostne rôzne známe bunkové línie, akými sú P3X63AG8.653) (J. Immunol.

(1979) 123: 1548-1550), P3X63AG8U.1 (Current Tropics in

Microbiology and Immunology (1978) 81: 1-7) NS-1 (Kohler, G. a Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6: 511-519),

MPC-11 (Margulies, D.H. a spol., Celí (1976) 8: 405-415),

SP2/0 (Shulman, M. a spol., Náture (1978) 276: 269-270), FO (de St. Groth, S.F. a spol., J. Immunol. Methods (1980) 35:

1-21), S194 (Trowbridge, I.S., J. Exp. Med. (1978) 148:

313-323), R210 (Galfre, G. a spol., Náture (1979) 277: 131133) a podobne.

.· Bunková fúzia medzi vyššie uvedenými imúnnymi bunkami a myelómovými bunkami môže byť v podstate uskutočnená známym postupom, popísaným v Milstein a spol., (Kohler, G. a

Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) alebo podobne .

Presnejšie povedané, vyššie uvedená bunková fúzia je uskutočnená v bežnom živnom bujóne, za prítomnosti napríklad urýchľovača bunkovej fúzie. Ako urýchľovač bunkovej fúzie, môže byť použitý napríklad polyetylénglykol (PEG), vírus Sendai (HVJ) a tiež pre zvýšenie efektivity môže byť pridaný adjuvans, akým je dimetylsulfoxid atď.

Výhodný pomer imúnnych a myelómových buniek, ktorý sa má použiť, je napríklad jedenkrát až desaťkrát viac imúnnych buniek ako myelómových buniek. Príkladmi kultivačných médií, ktoré sa používajú pre vyššie uvedenú bunkovú fúziu, sú médium RPMI 1640 a médium MEM, vhodné pre rast vyššie uvedených myelómových bunkových línií a bežné kultivačné médium, používané pre tento typ bunkovej kultúry, okrem toho môže byť pridané ako doplnok sérum, napríklad fetálne telacie sérum (FCS).

Pri bunkovej fúzii sú zmiešavané vopred stanovené množstvá imúnnych buniek a myelómových buniek, dôkladne premiešané v uvedenom kultivačnom médii, ku ktorému bol pridaný roztok PEG, vopred zahriaty na teplotu 37 °C, napríklad roztok PEG s priemernou molekulovou hmotnosťou 1 000 až 6 000, ktorý je pridaný v koncentrácii 30 až 60 % (hmotnosť/objem) a mieša sa dovtedy, kým sa dosiahne požadovaná fúzia buniek (hybridómy) . Potom, opakovaním postupného pridávania vhodného kultivačného média a centrifugáciou, ktorou sa odstráni supernatant, môže byť odstránené činidlo, podporujúce bunkovú fúziu, ktorá je nežiadúca pre rast hybridómov.

Uvedené hybridómy sú vyberané pomocou kultivácie v bežnom selektívnom médiu, napríklad kultivačné médium HAT (kultivačný roztok obsahujúci hypoxantín, aminopterín a tymidín). Kultivácia v uvedenom kultivačnom médiu HAT sa uskutočňuje dovtedy, kým sa usmrtia iné bunky ako hybridómy (nezfúzované bunky), čo trvá niekolko dní až niekolko týždňov. Potom sa uskutoční bežná metóda koncového zriedenia, pomocou ktorej sú vybrané hybridómy, ktoré produkujú požadované protilátky, a sú ďalej monoklonálne klónované.

Vedia získaných vyššie uvedených hybridómov imunizáciou živočíchov iných ako je človek, pomocou antigénu, je možné tiež senzibilizovať ludské lymfocyty in vitro pomocou antigénu alebo pomocou buniek, exprimujúcich antigén HM1.24 a výsledné senzibilizované lymfocyty sú fúzované s ľudskými myelómovými bunkami, napríklad s U266, aby sa získala požadovaná ľudská protilátka, ktorá má schopnosť viazať sa k antigénu HM1.24 alebo k bunkám, exprimujúcim antigén HM1.24 (pozri Japanese Postexamined Patent Publication (Kohoku) No. 1-59878). Ďalšou z možností je, že transgénny živočích, ktorý má súbor všetkých ľudských protilátkových génov, je imunizovaný antigénom, t.zn. HM1.24 alebo bunkami exprimujúcimi antigén HM1.24, čím sa získa požadovaná ľudská protilátka, ako už bolo skôr popísané (pozri International Patent Applications WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 a WO 96/33735).

Takto konštruované hybridómy produkujúce monoklonálne protilátky, môžu byť kultivované v bežnom kultivačnom médiu alebo môžu byť uložené dlhý čas v kvapalnom dusíku.

Pre získanie monoklonálnych protilátok z uvedených hybridómov, je možné uviesť postup, pri ktorom je hybridóm kultivovaný bežným spôsobom a protilátky sú získané v supernatante, alebo postup, pri ktorom je hybridóm podaný a kultivovaný v tele živočícha, ktorý je kompatibilný pre uvedený hybridóm a protilátky sú získané z ascitov. Prvý uvedený postup je vhodný pre získanie vysoko čistých protilátok, zatiaľ čo druhý je vhodný pre produkciu protilátok vo veľkom množstve.

Presnejšie povedané, hybridómy produkujúce protilátky anti-HM1.24, môžu byť skonštruované spôsobom podľa Goto T. a spol., (Blood (1994) 84: 1922-1930). Môže to byť uskutočnené spôsobom, že hybridóm produkujúci protilátky antiHM1.24, ktorý bol uložený pre medzinárodné použitie za pod mienok Budapeštianskej zmluvy ako FERM BP-5233 dňa 14. septembra 1995 organizáciou National Inštitúte of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan, je intraperitoneálne podaný myši BALB/c (vypestovaná v CLEA Japan), aby sa získal ascitus, z ktorého je purifikovaná protilátka anti-HM1.24; alebo spôsobom, keď vyššie uvedený hybridom je kultivovaný vo vhodnom kultivačnom médiu, akým je médium RPMI 1640, obsahujúce 10 % fetálneho teľacieho séra a 5 % BM-Condimed Hl (vyrobené Boehringer-Mannhein), médium pre hybridómy SFM (vyrobené GIBCOBRL), médium PFHM-II (vyrobené GIBCO-BRL) alebo v podobných, a protilátky môžu byť purifikované zo supernatantu.

1-2. Rekombinantné protilátky

Rekombinantná protilátka, ktorá bola produkovaná rekombinantnou génovou technológiou, pri ktorej protilátkový gén bol klónovaný z hybridómu a bol zabudovaný do vhodného vektora, ktorý bol potom vnesený do hostiteľa, môže byť v predkladanom vynáleze použitý ako monoklonálna protilátka (pozri napríklad Carl, A.K., Borrebaeck and James, W. Larrick, Therepeutical Monoclonal Antibodies, publikované v MacMillan Publishers Ltd. 1990, Veľká Británia).

Presnejšie povedané, mRNA kódujúca variabilnú oblasť (V oblasť, V región) požadovanej protilátky je izolovaná z hybridómu, ktorý túto protilátku produkuje. Izolácia mRNA je uskutočnená tak, že sa pripraví celková mRNA známym postupom, napríklad guanidínovou ultracentrifugačnou metódou (Chirgwin, J. M. a spol., Biochemistry (1979) 18, 52945299), AGPC metódou (Chomczynski, P. a spol., Analytical Biochemistry (1987) 162, 156-159) a potom je mRNA z celkovej RNA purifikovaná súpravou mRNA Purification kit (vyrába Pharmacia) alebo podobne. Inú možnosť prípravy mRNA poskytuje súprava Quick Prep mRNA kit (vyrába Pharmacia).

cDNA pre V oblasť protilátky môže byt nasyntetizovaná z takto získanej mRNA reverznou transkriptázou. cDNA môže byť nasyntetizovaná súpravou AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit alebo podobne. Inou možnosťou pre syntézu a amplifikáciu cDNA je použitie súpravy 5'Ampli Finder Rače Kit (vyrába Clontech) a je možné použiť metódu 5'-Rače (Frohman, M. A. a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 8998-9002; Belyavski, A. a spol., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932), ktorá využíva polymerázovú reťazcovú reakciu (PCR). Požadovaný fragment DNA je zo získaného PCR produktu vyčistený a môže byť ligovaný do vektorovej DNA. Z toho je možné ďalej skonštruovať rekombinantný vektor a ten je potom vnesený do E. coli atď., a z jej vybraných kolónií je pripravený požadovaný rekombinantný vektor. Nukleotidová sekvencia požadovanej DNA môže byť potvrdená známou metódou, napríklad dideoxy metódou.

Keď je získaná DNA kódujúca V oblasť požadovanej protilátky, môže byť ligovaná do DNA kódujúcej konštantnú oblasť (C oblasť) požadovanej protilátky, ktorá je potom zabudovaná do expresného vektora, ktorý už obsahuje DNA, kódujúcu C oblasť protilátky.

Aby bolo možné produkovať protilátku, používanú v predkladanom vynáleze, je protilátkový gén zabudovaný nižšie popísaným spôsobom, do expresného vektora tak, aby bol exprimovaný pod kontrolou expresne regulačnej oblasti, napríklad zosilovača transkripcie alebo promótora. Následne môže byť expresný vektor transformovaný do hostiteľskej bunky a protilátka môže byť v nej exprimovaná.

1-3. Pozmenené protilátky

Podľa predkladaného vynálezu môže byť za účelom zníženia heterológnej antigenicity voči človeku použitá umelo pozmenená rekombinantná protilátka, ako je chimérna protilátka alebo pozmenená protilátka. Tieto pozmenené protilátky môžu byť vytvorené známymi postupmi.

Chimérnu protilátku je možné získať ligovaním získanej DNA, kódujúcej V oblasť protilátky do DNA, kódujúcu C oblasť ludskej protilátky, ktorá je potom vložená do expresného vektora a vnesená do hostitela, vhodného pre produkciu protilátok (pozri European Patent Application EP 125023 a International Patent Application WO 96/02576). Týmito známymi metódami je možné získať chimérne protilátky, použiteľné pre predkladaný vynález.

Napríklad, E. coli, nesúca plazmid, ktorý obsahuje DNA kódujúci L reťazec V oblasti alebo H reťazec V oblasti chimérnej protilátky anti-HM1.24, bola uložená pre medzinárodné použitie za podmienok Budapeštianskej zmluvy ako Escherichia coli DH5a (pUC19-l.24L-gk) a Escherichia coli DH5a (pUC19-l,24H-gyl), dňa 29. augusta 1996 organizáciou National Inštitúte of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan, ako FERM BP-5646 a FERM BP-5644 (pozri Japanese Patent Application No. 9-271536).

Pozmenená protilátka, ktorá je tiež označovaná ako pozmenená ľudská protilátka, bola vytvorená pripojením oblasti, ktorá určuje komplementaritu (CDR) v protilátke iného cicavca ako je človek, napríklad myši, do CDR ludskej proy tilátky. Všeobecne sú tiež známe DNA rekombinantné technológie pre prípravu takýchto protilátok (pozri European Patent Application EP 125023 a International Patent Application WO 96/02576).

DNA sekvencia je navrhnutá tak, aby bola spojená CDR myšej protilátky s podpornou oblasťou (FR - framework región) ludskej protilátky, je syntetizovaná metódou PCR z niekoľkých oddelených oligonukleotidových úsekov, ktoré sa vzájomne prekrývajú na svojich koncoch. Takto získaná DNA je spojená s DNA, kódujúcou C oblasť ľudskej protilátky a potom je vložená do expresného vektora, ktorý je potom vnesený do hostiteľa (pozri European Patent Application EP 239400 a International Patent Application WO 96/02576).

Podporné oblasti (FR - framework región) ľudskej protilátky, spojené oblasťami, ktoré určujú komplementaritu (CDR) sú vybrané tak, aby oblasti určujúce komplementaritu vytvorili miesto, ktoré je schopné viazať požadovaný antigén. Keď je potrebné, aminokyseliny v podporných oblastiach variabilných častí protilátok môžu byť zamenené tak, že oblasti určujúce komplementaritu v pozmenených protilátkach vytvoria miesto, ktoré je schopné viazať požadovaný antigén (Sato, K. a spol., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

Napríklad E. coli, nesúca plazmid, ktorý obsahuje DNA kódujúca verziu a (SEQ ID No:2) L reťazca V oblasti a E coli, nesúca plazmid, ktorý obsahuje DNA kódujúca verziu r (SEQ ID No:3) H reťazca V oblasti pozmenenej anti-HM1.24 protilátky boli uložené pre medzinárodné použitie za podmienok Budapeštianskej zmluvy ako Escherichia coli DH5a (pUC19-RVLa-AHM-gk) a Escherichia coli DH5a (pUC19-RVHrAHM-gyl) dňa 29. augusta 1996 organizáciou National Inštitúte of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higasfi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref.', Japan, ako FERM BP-5645 a FERM BP-5643 (pozri Japanese Patent Application No. 9-271536).

Pre chimérnu protilátku alebo pozmenenú protilátku je používaná C oblasť ľudskej protilátky, pričom je najvýhodnejšie použiť ako konštantnú oblasť ľudskej protilátky Cy ako sú Cyl, Cy2, Cy3 a Cy4. Z takto pripravených protilátok majú protilátky, ktoré obsahujú Cyl a Cy3 silnú cytotoxickú aktivitu, t.zn., ADCC aktivitu a CDC aktivitu a sú s výhodou používané v predkladanom vynáleze.

Chimérne protilátky obsahujú variabilnú oblasť protilátky odvodenú z cicavčieho druhu (nie však z človeka) a C oblasť odvodenú z ľudskej protilátky, zatiaľ čo u pozmenenej protilátky sú oblasti určujúce komplementaritu protilátky odvodené z cicavčieho druhu (nie však z človeka) a podporné oblasti (FRs) spolu s C oblasťou protilátky odvodenej z ľudskej protilátky. Ich antigenicita v ľudskom tele je redukovaná tak, že sú použiteľné ako aktívne zložky liečebných činidiel, pripravených podľa predkladaného vynálezu.

Výhodné uskutočnenie pozmenenej protilátky, vhodné pre použitie v rámci predkladaného vynálezu obsahuje pozmenené protilátky anti-HM1.24 (pozri Japanese patent Application No. 9-271536). Výhodné uskutočnenie L reťazca V oblasti pozmenenej protilátky anti HM1.24 obsahuje také, ktoré má aminokyselinovú sekvenciu kódovanú nukleotidovou sekvenciou, ktorá je uvedená v SEQ ID No: 2. Výhodné uskutočnenie H reťazca V oblasti pozmenenej protilátky anti-HM1.24 obsahuje také, ktoré má aminokyselinovú sekvenciu kódovanú sekvenciou báz, ktorá je uvedená v SEQ ID No: 2 alebo SEQ ID No: 4.

1-4. Expresia a produkcia

Protilátkové gény, skonštruované tak, ako už bolo vyššie popísané, môžu byť exprimované a tým 'sa získajú protilátky, vždy známymi postupmi. V prípade cicavčích buniek môže byť expresia docielená použitím expresného vektora, ktorý obsahuje bežne užívaný užitočný promótor, protilátkový gén, ktorý má byť exprimovaný a DNA, v ktorej je operatívne viazaný signál poly-A v smere 3' od tohoto génu (v smere transkripcie), alebo vektor, obsahujúci uvedenú DNA.

Príkladom promótora/zosiľovača transkripcie môže byť bezprostredne skorý promótor/zosilovač cytomegalovírusu.

Ako promótor/zosiľovač pre expresiu protilátky pre využitie v predkladanom vynáleze je možné využiť vírusové promótory/zosilovače akými sú retrovírus, polyomavírus, adenovírus a opičí vírus 40 (SV40), ďalej promótory/zosiľovače odvodené z cicavčích buniek, akým je napríklad ľudský elongačný faktor la (HEFla).

Expresia môže byť napríklad docielená metódou Mulligan a spol., (Náture (1979) 277, 108), kde je použitý promótor/zosiľovač z SV40, alebo metóda Mizushima a spol., (Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), kde je použitý promótor/zosilovač HEFla.

V prípade E. coli je možné dosiahnuť expresiu operatívnym pripojením bežne používaného promótora, signálnej sekvencie pre sekvenciu protilátky a génu pre protilátku, ktorá má byť exprimovaná, po čom nasleduje vlastná expresia tohoto génu. Ako príklad promótora je možné menovať lacz promótor a araB promótor. Metódu podľa Ward a spol., (Náture (1098) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427) je možné uplatniť použitím promótora lacz, zatiaľ čo metódu podľa Better a spol., (Science (1988) 240, 1041-1043) je možné uplatniť použitím promótora araB.

Ako signálnu sekvenciu pre sekréciu protilátky, keď je produkovaná do periplazmatického priestoru Έ. 'coli, je možné použiť signálnu sekvenciu pelB (Lei, S. P. a spol., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379). Po oddelení protilátky, produkovanej do periplazmatického priestoru, je štruktúra protilátky pred použitím upravená vhodným spôsobom (pozri napríklad WO 96/30394).

Ako začiatok replikácie je možné použiť začiatok replikácie odvodený z SV40, polyomavírusu, adenovírusu, hovädzieho papillomavírusu (BPV) a podobne. Pre namnoženie poč tu kópii génu v hostiteľskom bunkovom systéme, môže expresný vektor obsahovať ako selektívny markér gén pre aminoglykozid transferázu (APH), gén pre tymidín kinázu, gén pre xantín guanínfosforyl transferázu (Ecogpt) E. coli a podobne.

Pre produkciu protilátok, používaných v predkladanom vynáleze, je možné použiť akýkoľvek produkčný systém. Produkčný systém pre prípravu protilátok obsahuje in vitro a in vi vo produkčný systém. Ako in vitro je možné menovať produkčný systém, ktorý využíva eukaryotické bunky a produkčný systém, ktorý využíva prokaryotické bunky.

Keď sú používané eukaryotické bunky, jedná sa o produkčné systémy, ktoré využívajú živočíšne bunky, rastlinné bunky alebo bunky húb. Známe živočíšne bunky zahrňujú (1) cicavčie bunky akými sú bunky CHO, COS bunky, myelómové bunky, bunky z novonarodených škrečkov (baby hamster cells - BHK), HeLa bunky a Vero bunky, (2) bunky obojživelníkov, akými sú oocyty druhu Xenopus alebo (3) bunky hmyzu, akými sú sf9, sf21 a Tn5. Medzi známe rastlinné bunky je možné zahrnúť napríklad tie, ktoré sú odvodené z rodu Nicotiana, presnejšie bunky odvodené z Nicotiana tabacum. Medzi známe bunky z húb patria kvasinky, napríklad rod Saccharomyces cereviceae, alebo vláknité huby, napríklad rod Aspergillus, presnejšie Aspergillus niger.

Keď sú používané prokaryotické bunky, jedná sa o produkčné systémy, ktoré využívajú bakteriálne bunky. Patrí, sem Eschrichia coli (E. coli) a Bacillus subtilis.

Tým, že je gén požadovanej protilátky transformáciou vnesený do týchto buniek a takto transformované bunky sú kultivované in vitro, je možné dosiahnuť produkciu protilátok. Kultivovanie je uskutočňované známymi metódami. Ako kultivačné média môžu byť použité DMEM, MEM, RPMI1640 a IMDM, ako sérový doplnok média je možné použiť fetálne teľacie sérum (FCS). Protilátky môžu byť produkované tiež in vivo tak, že bunky, do ktorých bol vnesený gén pre protilátku, sú implantované do brušnej dutiny živočícha.

Ako ďalšie in vivo produkčné systémy je možné uviesť tie, ktoré využívajú živočíchy a tie, ktoré využívajú rastliny. Pokial sú využívané živočíchy, jedná sa o produkčné systémy, ktoré využívajú cicavce a hmyz.

Z cicavcov môžu byť využité kozy, prasatá, ovce, myši a hovädzí dobytok (Vicki Glaser, Spectrum Biotechnology Applications, 1993). Pokial sa týka hmyzu, je možné využiť priadku morušovú.

Z rastlín sa využíva napríklad tabak.

Gény pre protilátku sú vnesené do týchto živočíchov alebo rastlín, protilátky sú produkované v týchto živočíchoch alebo rastlinách a sú z nich získavané. Napríklad gén pre protilátku je vnesený doprostred génu kódujúceho proteín, ktorý je prirodzene prítomný v mlieku, napríklad kozí β kaseín, a týmto spôsobom je vytvorený fúzny gén. Fragmenty DNA, ktoré obsahujú fúzny gén, do ktorého bol vložený gén pre protilátku, sú injikované do kozích embrií, a tieto embria sú vložené do kozy. Požadovaná protilátka je získaná z mlieka, produkovaného transgénnou kozou, ktorá sa narodila koze, ktorá obdržala toto embryo, alebo z mlieka jeho potomka. Aby sa zvýšilo množstvo mlieka obsahujúceho požadovanú protilátku, produkovaného transgénnou kozou, pokial je to vhodné, je možné transgénnej koze podávať hormóny. (Ebert, K. M. a spol., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

Keď je použitá priadka morušová, potom bakulovírusom, do ktorého bol vložený gén pre požadovanú protilátku, je infikovaná priadka morušová a požadovanú protilátku je možné získať z telovej kvapaliny priadky morušovej (Susumu, M. a spol., Náture (1985) 315 592-594). Keď je použitý tabak, gén pre požadovanú protilátku je vložený do expresného vektora pre rastliny, napríklad do pMON 530 a potom je vektor vnesený do baktérie ako je Agrobacterium tumefaciens. Touto baktériou je ďalej infikovaný tabak, ako je Nicotiana tabacum, aby bolo možné ziskať požadovanú protilátku z tabakových listov (Julian, K.-C. Ma a spol., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).

Keď je látka produkovaná in vitro či in vivo produkčnými systémami, ako je už vyššie popísané, DNA kódujúca ťažký reťazec (H reťazec) alebo ľahký reťazec (L reťazec) protilátky, môže byť vložená do expresných vektorov oddelene ale hostiteľské bunky sú nimi transformované súčasne, alebo DNA kódujúca H reťazec a L reťazec môže byť spojená v jednom expresnom vektore a hostiteľské bunky sú ním transformované (pozri International patent Application WO 94/11523).

Protilátka, produkovaná vyššie popísaným spôsobom, môže byť viazaná k rôznym molekulám ako je polyetylénglykol (PEG) a použitá ako modifikovaná protilátka. Výraz protilátka, ako je tu použitý, zahrňuje i tieto modifikované protilátky. Aby bola získaná takáto modifikovaná protilátka, získaná protilátka môže byť modifikovaná chemicky. Takéto metódy už boli zavedené.

2. Oddelenie a čistenie protilátky.

2-1. Oddelenie a čistenie protilátky.

Protilátky ktoré sú produkované a exprimované, vyššie i uvedeným spôsobom, môžu byť oddelené zvnútra bunky, od bunky alebo z hostiteľa a potom vyčistené do homogénneho stavu. Oddelenie a čistenie protilátky pre použitie v rámci tohoto vynálezu je možné uskutočniť afinitnou chromatografiou. Vhodné stĺpce pre takúto afinitnú chromatografiu sú stĺpec s Proteínom A a stĺpec s Proteínom G. Príklady nosičov, použité pre stĺpec s Proteínom A, sú Hyper A, POROS, Sepharosa F.F. a podobne.

Bez obmedzenia je možné použiť pre oddelenie a čistenie aj ostatné metódy/ bežne používané pre proteíny. Oddelenie a čistenie protilátky pre použitie v rámci tohoto vynálezu je možné uskutočňovať rôznym kombinovaním aj iných vhodných chromátografických postupov ako je vyššie uvedená afinitná chromatografia, potom filtráciou, ultrafiltráciou, vysolovaním, dialýzou a podobne. Chromatografia zahrňuje napríklad ionomeničovú chromatografiu, hydrofóbnu chromatografiu, filtráciu na géli a podobne. Tieto chromatografické postupy môžu byť uskutočnené na HPLC. Ďalšou z možnosti je chromatografia na reverznej fáze.

2-2. Určenie koncentrácie protilátok

Koncentrácia protilátok získaných vo vyššie uvedenom bode 2-1 môže byť určená meraním absorbancie, alebo ELISA testom (enzyme-linked imunosorbent assay) a podobne. Keď sa použije meranie absorbancie, je protilátka, pre použitie v tomto vynáleze, alebo vzorka, obsahujúca protilátku, vhodne zriedená PBS(-), potom je pri 280 nm meraná absorbancia a nasleduje výpočet pomocou absorbčného koeficientu, ktorý uvádza 1,35 OD pri koncentrácii 1 mg/ml. Keď je pre meranie koncentrácie protilátok použitá metóda ELISA, postup je takýto: 100 μΐ kozieho protiludského IgG (vyrába Bio Source) zriedeného na koncentráciu 1 gg/ml v 0,1 M pufri kyslého uhličitanu sodného, pH 9,6, je nakvapkaných na 96jamkovú doštičku (vyrába NUNC) a je inkubované cez noc pri teplote 4 °C, aby sa uskutočnilo naviazanie protilátok.

Pre blokovanie je pridaných 100 μΐ vhodne zriedenej protilátky, pripravenej podlá tohoto vynálezu, alebo vzorky obsahujúcej protilátky, alebo 100 μΐ ľudského IgG známej koncentrácie (štandarda) a inkubuje sa 1 hodinu pri izbovej teplote. Po premytí je pridaných 100 μΐ 5 000-krát zriede nej protiludskej IgG protilátky, označenej alkalickou fosfatázou (vyrába Bio Source) a inkubuje sa 1 hodinu pri izbovej teplote. Po premytí je pridaný roztok substrátu, nasleduje inkubácia a meranie absorbancie pri 405 nm na prístroji Microplate Reader Model 3550 (vyrába Bio-Rad), na ktorého základe bola vypočítaná koncentrácia požadovanej protilátky.

3. FCM analýza

Reaktivita protilátky, vhodnej pre použitie v predkladanom vynáleze pre reakciu s lymfatickými nádorovými bunkami, môže byť zisťovaná metódou prietokovej cytometrickej analýzy (FCM-fow cytometry analysis). Použiť je možné buď bunky z už existujúcich bunkových línií, ale aj bunky čerstvo izolované. Z existujúcich bunkových línii je možné použiť T bunkovú líniu, napríklad RPMI 8402 (ATCC CRL-1994), CCRF-CEM (ATCC CCL-119) odvodené z akútnej lymfoblastickej leukémie, HPB-ALL (FCCH1018) odvodené z akútnej lymfatickej leukémie, HPB-MLT (FCCH1019) odvodené z T lymfómu, JM (FCCH1023) odvodené z akútnej lymfatickej leukémie, MOLT-4 (ATCC CRL-1582) odvodené z akútnej lymfoblastickej leukémie, Jurkat (FCCH1024) odvodené z akútnej lymfatickej leukémie, CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1) odvodené z akútnej lymfoblastickej leukémie, MT-1 (FCCH1043) odvodené z leukémie zrelých T buniek, KT-3 odvodené z Lennertovho lymfómu (Shimizu, S. a spol., Blood (1988) 71, 196-203) a podobne, a tiež B bunkovú líniu, napríklad bunky CESS, transformované EB vírusom (ATCC TIB-190), na EB vírus pozitívne B bunky SKW 6.4 (ATCC TIB-215), MC116 (ATCC CRL-1649) odvodené z B lymfómu, CCRF-SB (ATCC CCL-120) odvodené z akútnej lymfoblastickej leukémie, B bunky RPMI 6410 (FCCH6047) odvodené z pacienta s akútnou myelotickou leukémiou, Daudi (ATCC CCL-213) odvodené z Burkittovho lymfómu, Jijoye (ATCC CCL21

87) odvodené z Burkittovho lymfómu, Raji (ATCC CCL-86 odvodené z Burkittovho lymfómu, tiež non-T, non-B bunkovú liniu HL-60 (ATCC CCL-240) odvodené z akútnej myleocystickej leukémie, THP-1 (ATCC TIB-202) odvodené z akútnej monocytickej leukémie, U-937 (ATCC CRL-1593) odvodené z väzivového lymfómu, K-562 (ATCC CCL-243) odvodené z chronickej myelocytickej leukémie a podobne.

Po premytí vyššie uvedených buniek v PBS(-) je k ním pridaných 10 μΐ protilátok alebo kontrolných protilátok, zriedených na 25 gg/ml v pufri FACS (PBS(-) obsahujúci 2 % fetálneho hovädzieho séra a 0,1 % azidu sodného) a inkubuje sa na ľade 30 minút. Po premytí pufrom FACS je pridaných 100 μΐ 25 μς/ιηΐ kozej myšej protilátky označenej FITC (GAM, vyrába Becton Dickinson) a inkubuje sa na lade 30 minút. Po premytí pufrom FACS sú bunky suspendované v 600 μΐ alebo v 1 ml purfa FACS a u každej bunky môže byť zmeraná intenzita fluorescencie skenovacím prístrojom (FACScan, vyrába Becton Dickinson).

Z nameranej hodnoty intenzity fluorescencie u každej bunky, je možné zistiť reaktivitu protilátky, používanej v predkladanom vynáleze, s každou jednotlivou bunkou. Teda z nameranej hodnoty intenzity fluorescencie u každej bunky, je možné zistiť, či antigén HM1.24 je exprimovaný na jednotlivých bunkách (bunka je pozitívna alebo negatívna) a tiež stupeň tejto expresie. Prítomnosť a intenzita expresie antigénu HM1.24 v bunkách lymfatického nádoru je popísaná v príklade 2.2. FCM analýza, uvedenom ďalej.

Nádorové bunky lymfatických nádorov, ktoré môžu byť liečebným cieľom predkladaného vynálezu, exprimujú antigén

HM1.24. Presnejšie povedané, nádorové bunky lymfatických nádorov sú prednostne tie, v ktorých percento pozitivity na antigén HM1.24 nie je nižší ako 5 %. Teda, nádorové bunky lymfatických nádorov sú prednostne tie, v ktorých percento pozitivity na antigén HM1.24 je 20 % alebo vyššie presnejšie povedané, nádorové bunky lymfatických nádorov sú prednostne tie, v ktorých percento pozitivity na antigén HM1.24 je 50 % alebo vyššie, prípadne také, v ktorých percento pozitivity na antigén HM1.24 je 80 % alebo vyššie.

4. Cytotoxická aktivita

4-1. Meranie CDC aktivity

Protilátka vhodná pre použitie v predkladanom vynáleze je napríklad taká, ktorá má CDC aktivitu ako cytotoxickú aktivitu.

CDC aktivita liečebného činidla proti lymfatickým nádorom, pripraveného podlá predkladaného vynálezu, môže byť meraná nasledujúcim spôsobom.

1) Vo vhodnom médiu, napríklad v médiu RPMI1640, obsahujúcom 10 % fetálneho hovädzieho séra (vyrába GIBCO-BRL) sú pripravené cieľové bunky s koncentráciou 4 x 10⁵ buniek/ml. Ako cieľové bunky je možné použiť CCRF-CEM (ATCC CCL-119), CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1) , HPB-MLT (FCCH1019), EB-3 (ATCC CCL-85), M116 (ATCC CRL-1649), CCRF-SB (ATCC CCL-120), K562 (ATCC CCL-243) a podobné. 50 μΐ týchto buniek je pridaných do 96-jamkovéj doštičky (s rovným dnom) (vyrába FALCON) a doštička je inkubovaná cez noc v CO₂ inkubátore pri 37 °C.

Potom je pridaná protilátka, ktorej CDC aktivita je meraná, inkubácia pokračuje 60 minút a potom je pridaný vhodne zriedený komplement, napríklad Baby Rabitt Complenent (vyrába CEDERLANE) a inkubovaný 2 hodiny. Do každej jamky je pridaných 10 μΐ Alamar Bule (vyrába Bio Source), inkubované 4 hodiny a potom je meraná intenzita fluorescencie (exitačná vlnová dĺžka 530 nm, emisná vlnová dĺžka 590 nm) použitím meracieho systému CytoFluor 2350 (vyrába MILLIPORE). Cytotoxickú aktivitu (%) je možné vypočítať ako (A-C) / (B-C) x 100, kde A je intenzita fluorescencie pri inkubácii v prítomnosti protilátky, B je intenzita fluorescencie pri inkubácii samotného média bez protilátok a C je intenzita fluorescencie v jamke bez buniek.

4-2. Meranie ADCC aktivity

Protilátka vhodná pre použitie v predkladanom vynáleze je napríklad taká, ktorá má ADCC aktivitu ako cytotoxickú aktivitu.

ADCC aktivita liečebného činidla proti lymfatickým nádorom, pripraveného podlá predkladaného vynálezu, môže byť meraná nasledujúcim spôsobom. Po prvé sú centrifugačnou metódou z ľudskej periférnej krvi alebo z kostnej drene izolované mononukleárne bunky, ktoré budú v teste použité ako efektorové bunky. Ako cieľové bunky sú CCRF-CEM (ATCC CCL-

119) , CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1) , HPB-MLT (FCCH1019), EB-3 (ATCC CCL-85), M116 (ATCC CRL-1649) , CCRF-SB (ATCC CCL-

120) , K-562 (ATCC CCL-243) alebo podobne, označené ⁵¹Cr. Potom je k značeným cieľovým bunkám pridaná protilátka, u ktorej je meraná ADCC aktivita a inkubované. K cielovým bunkám sú potom vo vhodnom pomere pridané efektorové bunky a pokračuje sa v inkubácii.

Po inkubácii je supernatant zozbieraný a je meraná jeho aktivita meračom γ žiarenia, pričom 1 % NP-40 je možné použiť pre zmeranie maximálnej volnej rádioaktivity. Cytotoxickú aktivitu (%) je možné vypočítať ako (A-C) / (B-C) x 100, kde A je rádioaktivita (cpm) uvoľnená v prítomnosti protilátky, B je rádioaktivita (cpm) uvolnená NP-40 a C je rádioaktivita (cpn) uvolnená samotným médiom bez protilátok.

4-3. Zosilnenie cytotoxickej aktivity

Aby sa prejavila cytotoxická aktivita, ako je ADCC aktivita a CDC aktivita, je výhodné použiť ako konštantnú ob lasť (C oblasť) protilátok u ludi Cy, hlavne Cyl a Cy3. Ďalej je možné indukovať silnejšiu ADCC aktivitu alebo CDC aktivitu pridaním, zámenou alebo modifikáciou časti aminokyselín v C oblasti protilátky.

Ako príklad je možné uviesť konštrukciu polyméru IgG, napodobňujúceho IgM (IgM-like) substitúciou aminokyselín (Smith, R. I. F. and Morrison, S. L. Bio/Technology (1994) 12, 683-688), konštrukciu polyméru z IgG, napodobňujúceho IgM (IgM-like) pridaním aminokyselín (Smith, R. I. F. a spol., J. Immunology (1995) 154, 2226-2236), expresie tandémovo viazaného génu, kódujúceho L reťazec (Shuford, W. a spol., Science (1991) 252, 724-727), dimerizáciu IgG substitúciou aminokyselín (Caron P. C. a spol._z J. Exp. Med. (1992) 176, 1191-1195, Shopes, B., J. Immunology (1992) 148, 2918-2922), dimerizáciu IgG chemickou modifikáciou (Wolff, E. A. a spol., Cancer Res. (1993) 53, 2560-2565) a zavedenie efektorovej funkcie zmenou aminokyseliny (aminokyselín) v kĺbovej oblasti protilátky (Norderhaug, L. a spol., Eur. J. Immunol. (1991) 21, 2379-2384) a podobne. Tieto prístupy môžu byť uskutočnené využitím miestnešpecifickej mutagenézy pomoci priméru, pridaním sekvencie báz pomocou reštrikčného štiepneho miesta, použitím chemického modifikujúceho činidla, ktoré vytvára kovalentnú väzbu.

5. Potvrdenie liečebných účinkov.

Účinky liečebného činidla, používaného tu, v predkladanom vynáleze pre lymfatické nádory, môžu byť potvrdené tým, že je zvieratám, ktorým boli transplantované lymfatické nádorové buky podaná protilátka, používaná v predloženom vynáleze, a je hodnotený jej protinádorový účinok na tieto zvieratá.

Ako lymfatické nádorové buky podávané zvieratám môžu byť použité buď bunky z už existujúcich bunkových línií, ale aj bunky čerstvo izolované. Z existujúcich bunkových línií je možné použiť bunky CCRF-CEM (ATCC CCL-119), HPBMLT (FCCH1019), MOLT-4 (ATCC CRL-1582), CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1) a podobné, ako aj T bunkové línie a CESS (ATCC TIB-190), SKW6.4 (ATCC TIB-215), CCRF-SB (ATCC CCL-120), RPMI 6410 (FCCH6047), EB-3 (ATCC CCL-85) a podobné, ako aj B bunkové línie.

U zvierat, ktoré sa podrobili transplantácii, sú imunologické funkcie prevážne redukované, alebo úplne chýbajú. Použiť je možné holé myši, myši SCID, béžové myši, holé potkany a podobne. Protinádorové účinky, ktoré majú byť hodnotené, môžu byť potvrdené meraním objemu a hmotnosti nádoru alebo časom prežitia zvieraťa a podobne.

Tak, ako je uvedené ďalej v príkladoch, podanie protilátky anti-HMl.24 má za dôsledok potlačenie zväčšovanie objemu nádoru a tiež predĺženie času prežitia u myší s transplantovaným nádorom. Tieto skutočnosti ukazujú, že protilátka anti-HMl.24 má protinádorový účinok na lymfatické nádory.

6. Spôsob podávania a farmaceutická príprava

Liečebné činidlá pre lymfatické nádory, pripravené podlá predkladaného vynálezu, môžu byť podávané buď systémovo alebo miestne, parenterálnou cestou, napríklad intravenóznou injekciou ako je kvapková infúzia, intramuskulárnou injekciou, intraperitoneálnou injekciou a subkutánnou injekciou. Spôsob podávania môže byť zvolený v závislosti na veku a stave pacienta. Účinné dávkovanie je v oblasti 0,01 mg až 100 mg na kg telesnej hmotnosti na jednu dávku. Tiež je možné zvoliť dávkovanie v rozsahu 1 až 1 000 mg, výhodnejšie 5 až 50 mg na pacienta.

Liečebné činidlá pre lymfatické nádory, pripravené podlá predkladaného vynálezu, môžu obsahovať farmaceutický prijateľné nosiče alebo aditíva v závislosti na spôsobe podávania. Príkladmi takýchto nosičov alebo aditívov sú voda, farmaceutický prijateľné organické rozpúšťadlá, kolagén, polyvinylalkohol, polyvinylpyrolidon, karboxyvinylový polymér, sodná soľ karboxymetylcelulózy, sodná soľ polyakrylovej kyseliny, alginát sodný, vo vode rozpustný dextran, karboxymetylový škrob, pektín, karboxymetylcelulóza, etylcelulóza, xantanová želatína, arabská želatína, kazeín, agar, diglycerín, propylénglykol, polyetylénglykol, vazelína, parafín, stearylalkohol, kyselina steárová, ľudský sérumalbumín (HSA), manitol, sorbitol, laktóza a farmaceutický prijateľné povrchovo aktívne látky a podobne. Použité aditíva sú vybrané okrem iných, z vyššie uvedených látok alebo ich kombináciou v závislosti na dávkovacej forme.

Choroby liečené podľa predloženého vynálezu, sú lymfatické nádory (okrem myelomov), ktoré majú na nádorových bunkách antigény, ku ktorým sa viažu protilátky, používané v predkladanom vynáleze. Uviesť je možné akútnu B lymfatickú leukémiu (B-ALL), chronickú B lymfatickú leukémiu (BCLL) , pre B-lymfóm, Burkittov lymfóm, folikulárny lymfóm, lymfóm folikulárneho obalu, difúzny lymfóm, akútnu T-lymfatickú leukémiu (T-ALL), chronickú T-lymfatickú leukémiu (T-CLL), leukémiu zrelých T buniek (ATL), non-ATL, periférny T lymfóm (PNTL) a podobne. Liečebné činidlá, pripravené podľa predkladaného vynálezy, sú užitočné ako liečebné činidlá pre tieto lymfatické nádory.

Popis obrázkov

Obrázok 1 znázorňuje histogram uvedenej B bunkovej línie, ktorá bola analyzovaná nepriamou metódou FCM použitím protilátky anti-HM1.24 a kontrolného myšieho IgG2a.

Obrázok 2 znázorňuje histogram uvedenej B bunkovej línie, ktorá bola analyzovaná FCM nepriamou metódou použitím protilátky anti-HM1.24 a kontrolného myšieho IgG2a.

Obrázok 3 znázorňuje histogram uvedenej B bunkovej línie, ktorá bola analyzovaná nepriamou metódou FCM použitím protilátky anti-HM1.24 a kontrolného myšieho IgG2a.

Obrázok 4 znázorňuje histogram uvedenej B bunkovej línie, ktorá bola analyzovaná nepriamou metódou FCM použitím protilátky anti-HM1.24 a kontrolného myšieho IgG2a.

Obrázok 5 znázorňuje histogram uvedenej B bunkovej línie, ktorá bola analyzovaná nepriamou metódou FCM použitím protilátky anti-HM1.24 a kontrolného myšieho IgG2a.

Obrázok 6 znázorňuje histogram uvedenej B bunkovej línie, ktorá bola analyzovaná nepriamou metódou FCM použitím protilátky anti-HM1.24 a kontrolného myšieho IgG2a.

Obrázok 7 znázorňuje histogram uvedenej B bunkovej línie, ktorá bola analyzovaná nepriamou metódou FCM použitím protilátky anti-HM1.24 a kontrolného myšieho IgG2a.

Obrázok 8 znázorňuje histogram uvedenej B bunkovej línie, ktorá bola analyzovaná nepriamou metódou FCM použitím protilátky anti-HM1.24 a kontrolného myšieho IgG2a.

Obrázok 9 znázorňuje histogram uvedenej B bunkovej línie, ktorá bola analyzovaná nepriamou metódou FCM použitím protilátky anti-HM1.24 a kontrolného myšieho IgG2a.

Obrázok 10 znázorňuje histogram uvedenej T bunkovej

I línie, ktorá bola analyzovaná nepriamou metódou FCM použitím protilátky anti-HM1.24 a kontrolného myšieho IgG2a.

Obrázok 11 znázorňuje histogram uvedenej T bunkovej línie, ktorá bola analyzovaná nepriamou metódou FCM použitím protilátky anti-HM1.24 a kontrolného myšieho IgG2a.

Obrázok 12 znázorňuje histogram uvedenej T bunkovej línie, ktorá bola analyzovaná nepriamou metódou FCM použitím protilátky anti-HM1.24 a kontrolného myšieho IgG2a.

Obrázok 13 znázorňuje histogram uvedenej T bunkovej línie, ktorá bola analyzovaná nepriamou metódou FCM použitím protilátky anti-HM1.24 a kontrolného myšieho IgG2a.

Obrázok 14 znázorňuje histogram uvedenej T bunkovej línie, ktorá bola analyzovaná nepriamou metódou FCM použitím protilátky anti-HM1.24 a kontrolného myšieho IgG2a.

Obrázok 15 znázorňuje histogram uvedenej T bunkovej línie, ktorá bola analyzovaná nepriamou metódou FCM použitím protilátky anti-HM1.24 a kontrolného myšieho IgG2a.

Obrázok 16 znázorňuje histogram uvedenej T bunkovej línie, ktorá bola analyzovaná nepriamou metódou FCM použitím protilátky anti-HM1.24 a kontrolného myšieho IgG2a.

Obrázok 17 znázorňuje histogram uvedenej T bunkovej línie, ktorá bola analyzovaná nepriamou metódou FCM použitím protilátky anti-HM1.24 a kontrolného myšieho IgG2a.

Obrázok 18 znázorňuje histogram uvedenej T bunkovej línie, ktorá bola analyzovaná nepriamou metódou FCM použitím protilátky anti-HM1.24 a kontrolného myšieho IgG2a.

Obrázok 19 znázorňuje histogram uvedenej T bunkovej línie, ktorá bola analyzovaná nepriamou metódou FCM použitím protilátky anti-HM1.24 a kontrolného myšieho IgG2a.

Obrázok 20 znázorňuje histogram uvedenej non-T, non-B bunkovej línie, ktorá bola analyzovaná nepriamou metódou FCM použitím protilátky anti-HM1.24 a kontrolného myšieho IgG2a.

Obrázok 21 znázorňuje histogram uvedenej non-T, non-B bunkovej línie, ktorá bola analyzovaná nepriamou metódou FCM použitím protilátky anti-HM1.24 a kontrolného myšieho IgG2a.

Obrázok 22 znázorňuje histogram uvedenej non-T, non-B bunkovej línie, ktorá bola analyzovaná nepriamou metódou FCM použitím protilátky anti-HM1.24 a kontrolného myšieho IgG2a.

Obrázok 23 znázorňuje histogram uvedenej non-T, non-B bunkovej línie, ktorá bola analyzovaná nepriamou metódou

FCM použitím protilátky anti-HM1.24 a kontrolného myšieho

IgG2a.

Obrázok 24 je graf, znázorňujúci, že protilátka antiHM1.24 pôsobí cytotoxicky na T bunkové nádorové línie CCRFCEM, CCRF-HSB-2 a HPB-MLT, pričom účinok závisí na podanej dávke.

Obrázok 25 je graf, znázorňujúci, že protilátka antiHM1.24 pôsobí cytotoxicky na B bunkové nádorové línie EB-3, MC116 a CCRF-SB, pričom účinok závisí na podanej dávke.

Obrázok 26 je graf, znázorňujúci, že zväčšovanie objemu nádoru u myší s transplantovaným ľudským lymfatickým nádorom je potlačené v skupine, ktorej boli podávané protilátky v porovnaní so skupinou, ktorej bol podávaný kontrolný myší IgG2a.

Obrázok 27 je graf, znázorňujúci, že čas prežívania myši s transplantovaným ľudským lymfatickým nádorom sa predĺžil v skupine, ktorej boli podávané protilátky antiHM1.24 v porovnaní so skupinou, ktorej bol podávaný kontrolný myší IgG2a.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Predkladaný vynález bude ďalej podrobnejšie vysvetlený na nasledujúcich príkladoch. Zdôrazňujeme, že predkladaný vynález nie je žiadnym spôsobom obmedzený na tieto príklady.

Príklad 1. Konštrukcia protilátky anti-HM1.24.

1. Príprava myších ascitov, obsahujúcich protilátku anti-HMl.24

Hybridómy, produkujúce protilátku anti-HM1.24, boli získané metódou Goto, T. a spol., (Blood (1994) 84, 19221930).

Myšiam BALB/c (vypestované CLEA Japan), ktoré dostali 3 a 11 dní vopred intraperitoneálne vždy 500 μΐ 2,6,10,14tetrametylpentadekanu (vyrába Waco Pure Chemical Industries, Ltd.), bolo intraperitoneálne injikovaných 5 x 10⁶hybridómových buniek. Od desiatého dňa po injekcii hybridómových buniek boli ascity, ktoré sa hromadili v brušnej dutine myší, odoberané ihlou Happycas č.19 (vyrába Medikit), zavedenej dlhší čas. Odobraté ascity boli dvakrát centrifugované pri rýchlosti 1 000 a 3 000 otáčok za minútu na nízkootáčkovej centrifúge RLX-131 (vyrába Tomy Seiko), aby boli odstránené hybridómy a kontamináty, ako sú krvné bunky a podobne.

2. Čistenie protilátok anti-HM1.24 z myších ascitov

Čistenie protilátky anti-HM1.24 z vyššie uvedených myších ascitov sa uskutočnilo nasledujúcim spôsobom. Po pridaní rovnakého množstva PBS(-) k myším ascitom, bola zmes prefiltrovaná na filtri Mediaprep z dutých vlákien (vyrába MILLIPORE) a potom sa uskutočnilo afinitné čistenie zariadením ConSep LC1000 na vysokorýchlostné čistenie protilátok (vyrába MILLIPORE) s stĺpce Hyper D Protein A (objem stĺpca 20 ml, vyrába Nihon Gaisi) použitím PBS(-) absorbčného pufra a 0,1 M pufra citrátu sodného (pH 4) ako elučného pufru podlá priloženého návodu. Eluované frakcie boli okamžite upravené na pH 7,4 pridaním 1 M Tris-HCl pufra (pH 8,0), potom zahustené a súčasne bol zamenený pufer za PBS(-) centrifugačným ultrafiltračným koncentrátorom Centriprep 10, potom sterilizované filtráciou na membránovom filtri MILLEX-GV (vyrába MILLIPORE) s veľkosťou pórov 0,22 pm a tým sa získala čistená protilátka anti-HM1.24.

3. Určenie koncentrácie protilátky

Koncentrácia čistenej protilátky bola určená meraním absorbancie. Čistená protilátka bola teda zriedená v PBS(-), bola zmeraná absorbancia pri 280 nm a koncentrácia bola vypočítaná za predpokladu, že 1,35 OD zodpovedá 1 mg/ml.

Príklad 2. Štúdium reaktivity protilátky anti-HM1.24 s bunkami lymfatických nádorov.

1. Čistenie kontrolného myšieho IgG2a

Kontrolný myší IgG2a bol čistený nasledujúcim spôsobom. Komerčne dostupné IgG2a (KAPPA) (UPC 10) ascity (vyrába CAPPEL) boli rozpustené v čistenej vode a PBS(-). Roztok bol prefiltrovaný na membránovom filtri Acrodisc (vyrába Gelman Sciences) s veľkosťou pórov 0,2 μπι) a potom sa uskutočnilo afinitné čistenie na zariadení ConSep LC1000 na vysokorýchlostné čistenie protilátok (vyrába MILLIPORE) a stĺpci Hyper D Protein A (objem stĺpca 20 ml, vyrába Nihin Gaisi) použitín PBS(-) ako absorbčného pufra a 0,1 M pufra citrátu sodného (pH 4) ako elučného pufra podía priloženého návodu. Eluované frakcie boli okamžite upravené na pH 7,4 pridaním 1 M Tris-HCl pufra (pH 8,0), potom zahustené a súčasne bol zamenený pufer za PBS(-) centrifugačným ultrafiltračným koncentrátorom Centriprep 10, potom sterilizované filtráciou na membránovom filtri MILLEX-GV (vyrába MILLIPORE) s veľkosťou pórov Q, 22 μπι a tým sa získal čisI I téný kontrolný myší IgG2a.

Určenie koncentrácie myšieho IgG2a sa uskutočnila podľa vyššie uvedeného bodu 3. Určenie koncentrácie protilátky.

2. FCM analýza

Reaktivita anti-HM1.24 protilátky s bunkami lymfatického nádoru bola skúmaná prietokovou cytometrickou analýzou (FCM). Po premytí T buniek bunkovej línie RPMI 8402 (ATCC CRL-1195), CCRF-CEM (ATCC CCL-119) odvodených z akútnej lymfoblastickej leukémie, HPB-ALL (FCCH1018), HPB-MLT (FCCH1019) odvodených z T lymfómu, JM (FCCH1023) odvodených z akútnej lymfatickej leukémie, MOLT-4 (ATCC CRL-1582) odvodených z akútnej lymfoblastickej leukémie, Jurkat (FCCH1024) odvodených z akútnej lymfatickej leukémie, CCRFHSB-2 (ATCC CCL-120.1) odvodených z akútnej lymfoblastickej leukémie, MT-1 (FCCH1043) odvodených z leukémie zrelých T buniek a KT-3 odvodených z Lennertovho lymfómu (Shimizu, S. a spol., Blood (1988) 71, 196-203), ako aj B bunkovej línie je možné použiť EB vírusom transformovanú líniu CESS (ATCC TIB-190), na EB vírus pozitívne B bunky SKW 6.4 (ATCC TIB215), MC116 (ATCC CRL-1649) odvodené z B lymfómu, CCRF-SB (ATCC CCL-120) odvodené z akútnej lymfoblastickej leukémie, B bunky RPMI 6410 (FCCH6047) odvodené z pacienta s akútnou myelocystickou leukémiou, Daudi (ATCC CCL-213) odvodené z Burkittovho lymfómu, Jijoye (ATCC CCL-87) odvodené z Burkittovho lymfómu, Raji (ATCC CCL-86) odvodené z Burkittovho lymfómu, a aj non-T , non B bunkovú líniu HL-60 (ATCC CCL-240) odvodenú z akútnej myelocystickej leukémie, THP-1 (ATCC TIB-202) odvodené z akútnej monocystickej leukémie, U-937 (ATCC CRL-1593) odvodené z väzivového lymfómu a K-562 (ATCC CCL-243) odvodené z chronickej myelocystickej leukémie v PBS(-), .je k ním pridaných 100 μΐ protilátok zriedených na 25 gg/ml v pufri FACS (PBS(-) obsahujúcom 2 % fetálneho hovädzieho séra a 0,1 % azidu sodného) a inkubuje sa 30 minút na lade.

Po premytí pufrom FACS je pridaných 100 gg/ml kozej myšej protilátky označenej FITC (GAM) a inkubuje sa na lade 30 minút. Po premytí pufrom FACS boli bunky suspendované v 600 μΐ alebo v 1 ml pufru FACS a u každej bunkovej suspenzie bola zmeraná intenzita fluorescencie prístrojom FACScan (vyrába Becton Dickinson). Výsledky uvedené na obrázkoch 1 až 23 potvrdzujú, že všetky T bunkové línie a všetky B bunkové línie (okrem Dauda a Raju, ktoré nereagujú), reagovali s anti-HM1.24 protilátkou a silne exprimovali antigén HM1-

24. Na druhej strane žiadna non-T, non-B bunková línia nereagovala s anti-HM1.24 protilátkou a v žiadnej z nich nebola zistená expresia antigénu HM1.24.

V histogramoch uvedených na obrázkoch 1 až 23 boli histogramové podmienky nastavené tak, že negatívne bunky tvoria 98 % a pozitívne bunky 2 % pri farbení kontrolným myším IgG2a. Podlá týchto podmienok bolo vypočítané percento *buniek pozitívnych na antigén HM1.24 v prípade, že bola použitá anti-HM1.24 protilátka a výsledok je uvedený v Tabuľke 1. Podľa percenta buniek pozitívnych na antigén HM1.24, bola sila expresie rozlíšená do piatich stavov: -, +/-, +, ++ a +++. Bolo potvrdené, že všetky T bunkové línie a B bunkové línie (okrem Dauda a Raju) silne exprimovali antigén HM1.24, podobne ako je uvedené vo výsledkoch na obrázkoch 1 až 23. Tiež vo všetkých prípadoch non-T, non-B bunkových línii bolo percento buniek pozitívnych na antigén HM1.24 nulové alebo menšie ako 5 %, čo naznačuje, že sa neuskutočňuje expresia antigénu, alebo je veľmi malá.

Tabuľka 1

	Názov buniek	Úroveň	expresie
B bunkové línie	CESS	+++	94,5
	SKW 6.4	+++	92,8
	MC116	++	65, 0
	CCRF-SB	+++	98,4
	RPMI 6410	+++	94,5
	EB-3	+++	88,3
	Jijoye	+++	92,3

	Daudi Raj i	—	2,8 2,0
T bunkové línie	RPMI 8402	+++	94, 0
	CCRF-CEM	+++	97, 8
	HPB-ALL	++	63, 8
	HPB-MLT	+++	94, 6
	JM	+++	99, 6
	MOLT-4	+++	84,1
	Jurkat	++	70,9
	CCRF-HSB-2	+++	100, 0
	MT-1	+++	95,9
	KT-3	+++	96, 0
non-T, non-B	HL-60	-	2,9
bunkové línie	THP-1	-	1,5
	U-297	-	1,1
	K-562	-	3,9
-, <5 %; +/-, 5-20	% ,* +, 20-50 %; ++,	50-80 %;	+++, >80

Príklad 3. Určovanie CDC aktivity

CDC aktivita anti-HM1.24 protilátky voči bunkám lymfatického nádoru bola určovaná nasledujúcim spôsobom.

Príprava cieľových buniek

Ako cieľové bunky boli pripravené CCRF-CEM (ATCC CCL119) odvodené z akútnej lymfoblastickej leukémie, CCRF-HSB2 (ATCC CCL-120.1) odvodené z akútnej lymfoblastickej leukémie, HPB-MLT (FCCH1019) odvodené z T lymfómu, EB-3 (ATCC CCL-85) odvodené z Burkittovho lymfómu, MC116 (ATCC CRL1649) odvodené z B lymfómu, CCRF-SB (ATCC CCL-120) odvodené z akútnej lymfoblastickej leukémie a K-562 (ATCC CCL-243) odvodené z akútnek myleocystickej leukémie v koncentrácii 4 x 10⁵ buniek/ml v médiu RPMI1640, obsahujúcom 10 % fetálne ho hovädzieho séra (vyrába GIBCO-BRL) . 50μ1 suspenzie každých týchto buniek bolo pridaných do 96-jamkovéj doštičky (s rovným dnom) (vyrába FALCON) a inkubovaných v 5 % CO₂inkubátore s vysokou vlhkosťou vzduchu (vyrába TABAI) cez noc pri teplote 37 °C.

2. Príprava anti-HM1.24 protilátky

Čistená anti-HM1.24 protilátka získaná vo vyššie uvedenom príklade 1, bola pripravená v koncentrácii 0, 0,2, 2 a 20 gg/ml v médiu RPMI1640, obsahujúcom 10 % fetálneho hovädzieho séra (vyrába GIBCO-BRL) a 50 μΐ týchto protilátok bolo pridaných do 96-jamkovej doštičky (s rovným dnom), pripravenej vo vyššie uvedenom odstavci 1. Po inkubácii doštičky v 5 % CO₂ v inkubátore s vysokou vlhkosťou vzduchu (vyrába TABAI) pri teplote 37 °C počas 60 minút, bola centrifugovaná v nízkootáčkovej centrifúge 05PR-22 (vyrába Hitachi) pri 1 000 otáčkach za minútu počas 5 minút a potom bolo odstránených 50 μΐ supernatantu.

3. Príprava komplementu

Baby Rabbit Complement (vyrába CEDARLANE) bol rozpustený v čistenej vode po 1 ml na fľašku, ktorá bola ďalej zriedená 5 ml médiom RPMI1640 (vyrába GIBCO-BRL), ktoré neobsahovalo fetálne teľacie sérum (FCS). 50 μΐ tohoto roztoku bolo rozdelených do 96-jamkovej doštičky (s rovným dnom), pripravenej vo vyššie uvedenom odstavci 2 a inkubovaných v 5 % CO₂ v inkubátore s vysokou vlhkosťou vzduchu (vyrába TABAI) pri teplote 37 °C počas 2 hodín.

4. Určenie CDC aktivity *

Po skončení inkubácie bolo ku každej jamke 96-jamkovej doštičky (s rovným dnom) pridaných 10 μΐ Alamar Bule (vyrába ΒΙΟ SOURCE), pripravenej vo vyššie uvedenom odstavci 3 a inkubovalo sa v 5 % C0₂ v inkubátore s vysokou vlhkosťou vzduchu (vyrába TABAI) pri teplote 37 °C počas 4 hodín. V každej jamke bola potom zmeraná intenzita fluorescencie (exitačná vlnová dĺžka 530 nm, emisná vlnová dĺžka 590 nm) meracím systémom CytoFluor 2350 (vyrába MILLIPORE). Cytotoxickú aktivitu (%) je možné vypočítať ako (A-C) / (BC) x 100, kde A je intenzita fluorescencie pri inkubácii v prítomnosti protilátky, B je intenzita fluorescencie pri inkubácii samého média bez protilátok a C intenzita fluorescencie v jamke bez buniek.

Výsledky ukázali, ako je uvedené na obrázkoch 24 a 25, že bunky K562, ktoré nereagujú pri FCM analýze s antiHM1.24 protilátkou, nevykazujú žiadnu cytotoxickú aktivitu ani po pridaní anti-HM1.24 protilátky, zatiaľ čo CCRF-CEM, CCRF-HSB-2, HPB-MLT, EB-3, MC116 a CCRF-SB, ktoré reagujú s anti-HM1.24 protilátkou, vykazujú cytotoxickú aktivitu, ktorej rozsah závisí na koncentrácii anti-HM1.24 protilátky. Dokazuje to, že anti-HM1.24 protilátka vykazuje CDC aktivitu voči lymfatickým nádorom, ktoré majú na povrchu svojich buniek antigénny protein, ku ktorému sa anti-HM1.24 protilátka špecificky viaže.

Príklad 4. Protinádorové účinky anti-HM1.24 protilátky u myší s transplantovaným ľudským lymfatickým nádorom

1. Príprava protilátky pre podávanie

1-1. Príprava anti-HM1.24 protilátky

Čistená anti-HM1.24 protilátka, bola získaná vo vyššie uvedenom príklade 1.

1-2. Príprava kontrolného myšieho IgG2a

Čistená protilátka, získaná vo vyššie uvedenom príklade 2, bola pripravená v koncentrácii 1 mg/ml v PBS(-) ste rilizovanom filtráciou a bola použitá v nasledujúcich pokusoch.

2. Protinádorové účinky anti-HM1.24 protilátky u myší s transplantovaným ľudským lymfatickým nádorom

2-1. Príprava myši s transplantovaným ľudským lymfatickým nádorom

Myši s transplantovaným ľudským lymfatickým nádorom boli pripravené nasledujúcim postupom. Bunky CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1), odvodené z akútnej lymfoblastickej leukémie, ktoré boli pestované in vivo na myšiach SCID (CLEA Japan) boli zriedené na koncentráciu 1 x 10⁸ buniek/ml v médiu RPMI1640, obsahujúcom 10 % fetálneho hovädzieho séra (vyrába GIBCO-BRL). Takto pripravené bunkové suspenzie boli subkutánne podané do brucha myší SCID (samčí, vo veku 6 týždňov), z ktorých každému bolo predchádzajúci deň intraperitoneálne podaných 100 μΐ anti-asialo GM1 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

2-2. Podávanie protilátok

Siedmy deň po transplantácii nádoru bol posúvnym meradlom meraný priemer nádoru v nieste, kde boli transplantované bunky CCRF-HSB-2. Po odmeraní objemu nádoru boli zvieratá zoskupené tak, že priemerný objem nádoru bol v každej skupine takmer rovnaký (8 zvierat v skupine, 3 skupiny). Od toho dňa bolo každej skupine intraperitoneálne podávaných 100 μΐ anti-HM1.24 protilátky v koncentrácii 1 mg/ml alebo 200 μg/ml, alebo 1 mg/ml kontrolného myšieho IgG2a, ktoré boli pripravené, ako je uvedené vo vyššie uvedenom odstavci 1. Protilátky boli podávané 2 x v týždni, celkove 19 x, vždy podobným spôsobom. Počas tohoto obdobia bol 2 x týždenne posuvným meradlom meraný priemer nádoru a vypočítaný jeho objem.

2-3. Hodnotenie protinádorového účinku anti-HM1.24 protilátky u myší s transplantovaným ľudským lymfatickým nádorom

Protinádorový účinok anti-HM1.24 protilátky bol hodnotený podľa zmien v objeme nádoru a podlá času prežitia myší. Výsledkom bolo to, ako je ukázané na obrázku 26, že zvyšovanie objemu nádoru bolo potlačené v skupine, ktorej bola podávaná anti-HM1.24 protilátka, v porovnaní so skupinou, ktorej bol podávaný kontrolný myší IgG2a. Tak ako je ukázané na obrázku 27, bolo^- pozorované predĺženie času prežívania v skupine, ktorej bola podávaná anti-HM1.24 protilátka, v porovnaní so skupinou, ktorej bol podávaný kontrolný myší IgG2a. Tieto skutočnosti ukazujú, že antiHM1.24 protilátka má protinádorový účinok u myší s transplantovaným ľudským lymfatickým nádorom.

Referenčný príklad 1. Príprava hybridómov, ktoré produkujú myšiu anti-HM1.24 monoklonálnu protilátku

Hybridómy produkujúce myšiu anti-HM1.24 protilátku boli pripravené metódou Goto, T. a spol., Blood (1994) 84, 1992-1930.

Bunková línia plazmatických buniek KPC-32 (1 x 10⁷), odvodená z kostnej drene pacienta s mnohonásobným ľudským myelómom (Goto, T. a spol., Jpn. J. Clin. Hematol (1991) 32 1400), bola každých šesť týždňov dvakrát injekčné podaná do brušnej dutiny myši BALB/c (vyrába Charles River).

Tri dni pred usmrtením zvierat im bolo injekčné podané do sleziny 1,5 x 10⁶ buniek KPC-32, aby sa zväčšila schopnosť produkcie protilátky (Goto, T. a spol., Tokushima J. Exp. Med. (1990) 37, 89). Po usmrtení zvierat im bola odobretá slezina a s odobratým orgánom bola vykonaná bunková fúzia s myelomovými bunkami SP2/0 metódou Groth, de St. and Schreidegger (Cancer Research (1981) 41, 3465).

Testom ELISA, využívajúceho bunky KPC-32 (Posner, M. R. a spol·., J. Immunol. Methods (1982) 48, 23), bol supernatant hybridómových kultúr testovaný na prítomnosť protilátok. 5 x 10⁴ buniek KPC-32 bolo suspendovaných v 50 ml PBS a potom rozdelených do 96-jamkovéj doštičky (dno tvaru U, Corning, vyrába Iwaki), ktorá bola potom vysušená cez noc na vzduchu pri teplote 37 °C. Po blokovaní pomocou PBS, obsahujúceho 1 % fetálneho hovädzieho sérumalbumínu (BSA), bol pridaný supernatant hybridómových kultúr a inkubovalo sa dve hodiny pri teplote 4 °C. Potom počas 1 hodiny pri teplote 4 °C sa uskutočnila reakcia s kozou protilátkou voči myšiemu IgG (vyrába ZYMED), ktorá bola označená peroxidázou. Po premytí bol pridaný roztok o-fenylenendiamínu (vyrába Sumimoto Bakelite) a reakcia sa uskutočňovala pri izbovej teplote 30 minút.

Reakcia bola zastavená pridaním 2 N kyseliny sírovej a absorbancia bola meraná pri 492 nm na odpočítavacom zariadení pre doštičky ELISA reader (vyrába Bio-Rad). Aby bol odstránený hybridom, ktorý vytvára protilátky voči ludskému imunoglobulínu, supernatant pozitívneho hydridómu bol vopred absorbovaný s ludským sérom a reaktivita s inými bunkovými líniami bola zisťovaná ELISA testom. Vybraté boli pozitívne hybridómy a ich· reaktivita s rôznymi bunkovými 11I hiami bola zisťovaná prietokovou cytometriou. Posledný vybratý hybridómový klón bol dvakrát klónovaný a injekčné vložený do brušnej dutiny myši BALB/c liečených pristanom, z ktorých boli získané ascity.

Monoklonálne protilátky z myších ascitov boli čistené zrážaním síranom amónnym a súpravou Protein A affinity chromatography kit (Ampure PA, vyrába Amersham) . Čistené protilátky boli označené FITC súpravou Quick Tag FITC biding kit (vyrába Boehringer Mannheim).

Výsledkom bolo, že monoklonálne protilátky, produkované 30 hybridómovými klónmi, reagovali s bunkami KPC-32 a RPMI 8226.

Po klónovaní bola zisťovaná reaktivita supernatantu týchto hybridómov s inými bunkovými líniami alebo mononukleárnymi bunkami periférnej krvi.

Tri z týchto klónov produkovali monoklonálne protilátky, ktoré špecificky reagovali s plazmatickými bunkami. Z týchto troch klónov bol vybratý klón, ktorý bol najužitočnejší pre prietokovú cytometrickú analýzu a mal CDC aktivitu voči RPMI 8226. Bol označený ako HM1.24. Podtrieda monoklonálnej protilátky produkovanej týmto hybridómom, bola určená testom ELISA použitím králičích antimyších protilátok, špecifických pre jednotlivé podtriedy (vyrába Zymed). Anti-HM1.24 protilátka bola podtriedy IgG2a k. Hybridom HNI.24, ktorý produkuje anti-HM1.24 protilátky bol uložený pre medzinárodné použitie podľa ustanovení Budapeštianskej zmluvy ako FERM BP-5233 14. septembra 1995 v National Inštitúte of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan.

Referenčný príklad 2. Príprava pozmenenej anti-HM1.24 protilátky ¹

Pozmenená anti-HM1.24 protilátka bola získaná nasledujúcim spôsobom. Z hybridómu HM1.24, pripraveného v referenčnom príklade 1, bola bežným postupom pripravená celková RNA. Podľa nej bola syntetizovaná cDNA, kódujúca V oblasť myšej protilátky, amplifikovaná polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) a metódou 5'-RAČE. Bol získaný fragment DNA, ktorý obsahuje gén, kódujúci myšiu V oblasť, ten bol ligo vaný do klónovacieho vektoru pUC a potom bol vnesený do kompetentných buniek E. coli, čím sa získali transformanty E. coli. Z transformantov bol získaný vyššie uvedený plazmid. Nukleotidová sekvencia cDNA kódujúca oblasti v plazmide bola zistená bežným postupom a pre každú V oblasť bola určená oblasť určujúca komplementaritu (CDR).

Aby bolo možné skonštruovať vektor exprimujúci chimérnu anti-HM1.24 protilátku, cDNA kódujúca V oblasť každého L reťazca a H reťazca myšej anti-HM1.24 protilátky bola vložená do vektora HEF. Ďalej, aby bola skonštruovaná pozmenená anti-HM1.24 protilátka, V oblasť CDR myšej antiHM1.24 protilátky bola pripojená k ludskej protilátke. L reťazec ludskej protilátky REI bol použitý ako L reťazec ludskej protilátky, FR 1 až 3 ludskej protilátky HG3 boli použité ako podporné oblasti (FRs) 1 až 3 H reťazca ludskej protilátky a FR4 ludskej protilátky JH6 bol použitý pre FR4. Niektoré aminokyseliny vo FR V oblasti H reťazca boli zamenené tak, že CDR pozmenenej protilátky môže vytvárať vhodné miesto pre väzbu antigénu.

Aby bolo možné exprimovať gény pre L reťazec a H reťazec a tak skonštruovať pozmenenú anti-HM1.24 protilátku v bunke cicavca, bol každý gén zvlášť vnesený do vektoru HEF, čím boli vytvorené vektory exprimujúce buď L reťazec alebo H reťazec pozmenenej anti-HM1.24 protilátky.

Súčasným vnesením týchto dvoch exprimujúcich vektorov do CHO buniek, bola vytvorená' bunková línia, ktorá produkuje pozmenenú anti-HM1.24 protilátku. Väzobná aktivita k antigénu a väzobné inhibičná aktivita pozmenenej antiHM1.24 protilátky, získanej pestovaním tejto bunkovej línie, pre ľudskú amnionovú bunkovú líniu WISH, bola zisťovaná testom ELISA, použitím buniek. Výsledky ukázali, že pozmenená anti-HM1.24 protilátka má rovnakú väzobnú aktivitu k antigénu ako chimérna protilátka a použitím biotinylova nej myšej anti-HM1.24 protilátky bola zistená tiež väzobné inhibičná aktivita, ako u chimérnej protilátky alebo myšej protilátky.

E. coli, nesúca plazmid, ktorý obsahuje DNA, kódujúci

V oblasť L reťazca chimérnej protilátky a E. coli nesúca plazmid, ktorý obsahuje DNA, kódujúci V oblasť H reťazca chimérnej protilátky boli uložené pre medzinárodné použitie podľa ustanovení Budapeštianskej zmluvy ako Escherichia coli DH5a (pUC19-l.24L-gk) a Escherichia coli DH5a (pUC191.24L-gyl) 29. augusta 1966 v National Inštitúte of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan, ako FERM BP-5646 a FERM BP-5644. Ďalej E. coli, nesúca plazmid, ktorý obsahuje DNA, kódujúci verziu a (SEQ ID No: 2) V oblasti L reťazca a E. coli nesúca plazmid, ktorý obsahuje DNA, kódujúci verziu z (SEQ ID No: 3)

V oblasti H reťazca pozmenenej anti-HM1.24 protilátky boli uložené pre medzinárodné použitie podľa ustanovení Budapeštianskej zmluvy ako Escherichia coli DH5a (pUC19-RVLa-AHMgk) a Escherichia coli DH5<x (pUC19-RVHr-AHM-gyl) 29. augusta 1966 v National Inštitúte of Bioscience and HumanTechnology, Agency of Industrial Science and Technology, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan, ako FERM BP-5645 a FERM BP-5643. Ďalej E. coli, nesúca plazmid, ktorý obsahuje DNA, kódujúci verziu s (SEQ ID No: 4)

V oblasti L reťazca pozmenenej anti-HM1.24 protilátky bola uložená pre medzinárodné použitie podľa ustanovení Budapeštianskej zmluvy ako Escherichia coli DH5oc (pUC19-RVHs-AHMgyl) 29. septembra 1977 v National Inštitúte of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan, ako FERM BP-6127.

Referenčný príklad 3. Klónovanie cDNA kódujúcej proteín antigénu HM1.24 cDNA kódujúca proteín antigénu HM1.24, ktorý je špecificky rozlišovaný anti-HM1.24 protilátkou bol klónovaný.

1. Konštrukcia cDNA knihžnice

1) Príprava celkovej RNA

Z bunkovej línie KPMM2, pochádzajúcej z ľudského mnohopočetného myelómu, bola získaná celková RNA metódou Chirgwin a spol., (Biochemistry, 18, 5294 (1979)). 2 x 10⁸ buniek KPMM2 bolo kompletne homogenizovaných v 20 ml 4 M guanidín izotiokyanátu (vyrába Nacalai Tesque Inc.). Homogenát bol navrstvený na 5,3 M chlorid cézny v centrifugačnej skúmavke, ktorá bola potom centrifugovaná v rotore Backman SW40 pri 31 000 otáčkach/minúta/ počas 24 hodín pri teplote 20 ^eC, aby došlo k vyzrážaniu RNA. Zrazenina RNA bola premytá 70 % etanolom a rozpustená v 300 μΐ 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), ktorý obsahoval 1 mM EDTA a 0,5 % SDS. Potom bola pridaná pronáza (vyrába Boehringer) do koncentrácie 0,5 mg/ml a uskutočnila sa inkubácia počas 30 minút pri teplote 37 °C. Zmes bola extrahovaná zmesou fenolu s chloroformom a RNA bola vyzrážaná etanolom. Zrazenina RNA bola potom rozpustená v 200 μΐ 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) obsahujúcom 1 mM EDTA.

i

2) Príprava poly(A)+RNA

Poly(A)+RNA bola čistená použitím 500 μg materiálu celkovej RNA, pripravenej ako už bolo vyššie popísané, pomocou súpravavy Fast Track 2.0 mRNA Isolation kit (vyrába Invitrogen) podľa návodu priloženého k súprave.

3) Konštrukcia knižnice cDNA

Dvojreťazcová cDNA bola syntetizovaná a ako materiál bolo použitých 10 gg vyššie uvedenej poly(A)+RNA pomocou súpravy pre syntézu cDNA TimeSaver cDNA Synthesis Kit (vyrába Pharmacia) podľa návodu priloženého k súprave, potom bola ligovaná k EcoRI adaptéru, ktorý sa nachádza v súprave, súpravou Directional Cloning Toolbox (vyrába Pharmacia) podľa návodu priloženého k súprave. Kinázovanie a štiepenie AcoRI adaptéra reštrikčným enzýmom Notl bolo uskutočnené podľa návodu priloženého k súprave. Ďalej bola dvojreťazcová cDNA s pripojeným adaptérom, veľkosti 500 párov báz alebo viac, oddelená a čistená použitím 1,5 % nízkotopiaceho agarózového gélu (vyrába Sigma) a získalo sa 40 μΐ dvojreťazcovej cDNA s pripojeným adaptérom.

Takto konštruovaná dvojreťazcová cDNA s pripojeným adaptérom bola ligovaná pomocou T4 ligázy (vyrába GIBCO-BRL) do vektoru pCOSl (Japanese Patent Application 8-255196), ktorý bol predtým opracovaný reštrikčnými enzýmami EcoRI a Notl a alkalickou fosfatázou (vyrába Takara Shuzo) a tým bola skonštruovaná cDNA knižnica. Konštruovaná cDNA knižnica bola vnesená do E. coli kmeňa DH5a (vyrába GIBCO-BRL) a následne bola ustanovená ako nezávislý klón, ktorý má celkovú veľkosť 2,5 x 10⁶.

2. Klónovanie priamou expresnou metódou

1) Transfekcia buniek COS-7

Približne 5 x 10⁵ klónov vyššie uvedenej transdukovanej E. coli bolo pestovaných v médiu 2-YT (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook a spol., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), obsahujúcom 50 gg/ml ampicilinu, aby došlo k amplifikácii cDNA, potom boli spracované alkalickou metódou (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook a spol., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), aby bola získaná plazmidová DNA z E. coli. Takto získaná plazmidová DNA bola elektroporačnou metódou vpravená do buniek COS-7 pomocou zariadenia Gene Pulser (vyrába Bio-Rad).

gg čistenej plazmidovej DNA bolo pridaných do 0,8 ml roztoku buniek COS-7, v ktorom boli bunky suspendované v PBS na koncentráciu 1 x 10^{3 * * * 7} buniek/ml a zmes bola podrobená pulzom s napätím 1 500 V a kapacite 24 gFD. Po 10minútovej zotavovacej perióde pri izbovej teplote, boli elektroporézované bunky pestované v kultivačnom médiu DMEM (vyrába GIBCO-BRL), obsahujúcom 10 % fetálneho hovädzieho séra (vyrába GIBCO-BRL) počas troch dní pri teplote 37 °C v 5 % CO₂.

2) Príprava adsorbčnej platne

Adsorbčná platňa pokrytá myšou anti-HM1.24 protilátkou bola pripravená metódou podlá B. Seed a spol., (Proc. Natl. Sci. USA, 84, 3365-3369 (1987)). Myšia anti-HM1.24 protilátka bola pridaná do 50 mM Tris-HCl, pH 9,5 s koncentráciou 10 gg/ml. 3 ml takto pripraveného roztoku protilátok bolo pridaných na platňu pre tkanivovú kultiváciu s priemerom 60 mm a bolo inkubovaných 2 hodiny pri izbovej teplote. Potom bola platňa trikrát premytá roztokom 0,15 M NaCl a bol pridaný PBS, obsahujúci 5 % fetálneho hovädzieho séra, 1 mM EDTA, 0,02 % NaN₃. Po blokovaní bola takto pripravená platňa použitá pre nasledujúce klónovanie.

3) Klónovanie cDNA knižnice

Bunky COS-7 transfekované tak, ako už bolo vyššie popísané, boli rozptýlené v PBS, obsahujúcom 5 mM EDTA. Po jednom premytí PBS, obsahujúcom 5 % fetálneho hovädzieho séra, boli bunky suspendované v PBS obsahujúcom 5 % fetálneho hovädzieho séra a 0,02 % NaN₃ na koncentráciul a 10⁶buniek/ml. Suspenzia bola potom pridaná na adsorbčnú plat46 ňu, pripravenú ako je vyššie popísané, a inkubovalo sa 2 hodiny pri izbovej teplote. Po trojnásobnom opatrnom premytí s PBS obsahujúcom 5 % fetálneho hovädzieho séra a 0,02 % NaN₃, bola plazmidová DNA izolovaná z buniek viazaných na adsorbčnú platňu, použitím roztoku obsahujúceho 0,6 % SDS a 10 mM EDTA.

Získaná plazmidová DNA bola transdukovaná do buniek Escherichia coli DH5oc. Po amplifikácii plazmidovej DNA, ako je vyššie uvedené, bola DNA izolovaná alkalickou metódou. Získaná plazmidová DNA bola transfekovaná elektroporačnou metódou do buniek COS-7 a plazmidová DNA izolovaná z adsorbovaných buniek, ako je popísané už vyššie. Podobný postup bol opakovaný ešte raz, a získaná plazmidová DNA bola štiepená reštrikčnými enzýmami EcoRI a Notl. Na záver bola potvrdená koncentrácia inzertu s veľkosťou 0,9 kbp. Bunky E. coli boli ďalej transdukované časťou získanej plazmidovej DNA a naočkované na platne s agarom 2-YT, obsahujúcim ampilcilín v koncentrácii 50 gg/ml. Po kultivácii cez noc bola z jednej kolónie izolovaná DNA, tá bola potom štiepená reštrikčnými enzýmami EcoRI a Notl, čím sa získal klón p3.19, nesúci inzert 0,9 kbp.

Sekvencie báz tohoto klónu boli určené sekvenčnou súpravou PRISM, Dye Terminátor Cycle Sequencing Kit (vyrába Perkin Elmer) podía návodu, priloženého k súprave a DNA sekvenátora ABI 373A (vyrába Perkin Elmer). Jeho nukleotidová sekvencia a zodpovedajúce sekvencie aminokyselín sú ukázané v SEQ ID No: 1.

Priemyselné využite

Výsledky FCM analýzy ukázali, že anti-HM1.24 protilátka silne reaguje s väčšinou buniek, odvodených z ľudských lymfatických nádorov, čo naznačuje, že v mnohých lymfatických nádoroch je silne exprimovaný polypeptid obsahujúci epitop, rozlišovaný anti-HM1.24 protilátkou. U myší s transplantovaným ľudským nádorom, ktorý reaguje s anti-HM1.24 protilátkou, podávanie anti-HM1.24 protilátky má za následok potlačenie zväčšovania objemu nádoru a tiež predĺženie času prežitia zvieraťa. Tieto skutočnosti ukazujú, že antiHM1.24 protilátka alebo protilátky rozlišujúce polypeptid, ktorý obsahuje epitop rozlišovaný anti-HM1.24 protilátkou, majú cytotoxickú aktivitu pre mnohé lymfatické nádory. Naznačuje to, že protilátka môže byť užitočná pre liečenie pacientov s lymfatickými nádormi.

Zoznam organizmov, uložených podľa Zmluvy o patentovej spolupráci, Pravidlo 13-2 a názov ukladajúceho inštitútu

Názov: The National Inštitúte of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI Adresa: Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibalaki pref., Japan

Mikroorganizmus (1)

Meno: Escherichia coli DH5a (pRS38-pUC19)

Prístupové č.: FERM BP-4434

Dátum uloženia: 5. október 1993

Mikroorganizmus (2)

Meno: Hybridom HM1.24

Prístupové č.: FERM BP-5233

Dátum uloženia: 14. september 1995

Mikroorganizmus (3)

Meno: Escherichia coli DH5a (pUC19-RVHr-AHM-gyl) Prístupové č.: FERM BP-5643

Dátum uloženia: 29. august 1996

Mikroorganizmus (4)

Meno: Escherichia coli DH5a (pUC19-l.24H-gyl) Prístupové č.: FERM BP-5644

Dátum uloženia: 29. august 1996

Mikroorganizmus (5)

Meno: Escherichia coli DH5a (pUC19-RVLa-AHM-gk)

Prístupové č.: FERM BP-5645

Dátum uloženia: 29. august 1996

Mikroorganizmus (6)

Meno: Escherichia coli DH5a (pUC19-l.24L-gk)

Prístupové č.: FERM BP-5646

Dátum uloženia: 29. august 1996

Mikroorganizmus (7)

Meno: Escherichia coli DH5a (pUC19-RVHs-AHM-gyl)

Prístupové č.: FERM BP-6127

Dátum uloženia: 29. september 1997

	ZOZNAM SEKVENCIÍ
<110>	CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA
<120>	Liečebné činidlo pre lymfatické nádory
<130>	E908
<140>	PCT/JP98/00568
<141>	198-02-12
<150>	JP 9-41410
<151>	1997-02-02
<160>	8
<210>	1
<211> <212> <213> <223>	1013 DNA Homo sapiens Nukleotidová sekvencia kódujúca HM1.24 antigén
<400>	1

gaattcggca cgagggatct gg atg Met gca tct act Ala Ser Thr tcg tat gac tat tgc

Ser Tyr Asp Tyr Cys 5

aga Arg 10

gtg Val

ccc atg

gaa gac ggg

gat aag aga tgt aag ctt ctg ctg ggg

97

Pro

Met

Glu

Asp Gly 15

Asp

Lys Arg

Cys 20

Lys

Leu

Leu Gly 25

ata

gga

att

ctg

gtg

ctc

ctg

atc

gtg

att

ctg

ggg

gtg

ccc

ttg

145

íle

Gly

íle

Leu

Val

Leu

íle

Val

íle

Leu

Gly

Val

Pro

Leu

30

35

40

att

atc

ttc

acc

atc

aag

gcc

aac

agc

gag

gcc

tgc

cgg

gac

ggc

ctt

193

íle

Phe

Thr

íle

Lys

Ala

Asn

Ser

Glu

Ala

Cys

Arg

Asp

Gly

Leu

45

50

55

cgg

gca

gtg

atg

gag

tgt

cgc

aat

gtc

acc

cat

ctc

ctg

caa

gag

241

Arg

Ala

Val

Met

Glu

Cys

Arg

Asn

Val

Thr

His

Leu

Gin

Glu

60

65

70

ctg

a cc

gag

gcc

cag

aag

ggc

ttt

cag

gat

gtg

gag

gcc

cag

gcc

289

Leu

Thr

Glu

Ala

Gin

Lys

Gly

Phe

Gin

Asp

Val

Glu

Ala

Gin

Ala

75

80

85

acc tgc

aac Asn

cac act gtg

atg gcc Met Ala

cta atg get tcc ctg gat gca gag

337

Thr 90

Cys

His

Thr Val 95

Leu Met

Ala 100

Ser

Leu

Asp Ala Glu 105

aag

gcc

caa

gga

caa

aag

aaa

gtg

gag

ctt

gag

gga

gag

atc

act

385

Lys

Aka

Gin

Gly

Gin

Lys

Val

Glu

Leu

Glu

Gly

Glu

íle

Thr

110

115

120

aca

tta

aac

cat

aag

ctt

cag

gac

gcg

tet

gca

gag

gtg

gag

ega

ctg

433

Thr

Leu

Asn

His

Lys

Leu

Gin

Asp

Ala

Ser

Ala

Glu

Val

Glu

Arg

Leu

125

130

135

aga

gaa

aac

cag

gtc

tta

agc

gtg

aga

atc

gcg

gac

aag

tac

481

Arg

Glu

Asn

Gin

Val

Leu

Ser

Val

Arg

íle

Ala

Asp

Lys

Tyr

140

145

150

ta c

ccc

agc

tcc

cag

gac

tcc

agc

tcc

get

gcg

ccc

cag

stg

ctg

029

Tyr

Pro

Ser

Gin

Asp

Ser

Ala

Pro

Gin

Leu

155

160

165

att

gtg

ctg

ggc

ctc

agc

get

ctg

cag

tga

gatcccagga

575

íle

Val

Leu

Gly

Leu

Ser

Ala

Leu

Gin

170

175

180

agctggcaca tcatcagttc gagaagggcc agtcgggttg tcttgtctcc tgttatgggt aataaacact aaaattcggg tcttggaagg tgagcgggtc tctggagcag acccagggct caccctgaga tttttttgcg tcctttgagg cggccgcc tccgtcctgc atggggcaac gtctggaggg gtctccctcc ttgggcatgg gggggggttg gagagcacac tcggcttttc acggttagcg gccatggggc agagcctccc ggtgcggtgt cttttttctg cttaaaaaaa gcttgaacat gggagagcac agtcctgggt tccggacaat ggggggcatg ggggggcatg aaaaaaaaaa tcccttgatc ggggtagccg ctggggacac gagtcccccc tgctgcctgt tgctgcctgt aaaaaaaaaa

635

695

755

815

875

935

995 1013 <210> 2 <211> 379 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvencia <220>

<221>

<222>

<223> Nukleotidová sekvencia DNA kódujúca L reťazec

V oblasti verzie a pôzmenenej anti HM1.24 protilátky <400> ²

atg

gga

tgg agc

tgt

atc

ctc

tcc

ttg

gta

gca

aca

get

aca

ggt

48

Met

Gly

Trp Ser

Cys

íle

Leu

Ser

Leu

Val

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly

-15

-10

-5

gtc

cac

tcc gac

atc

cag

atg

acc

cag

agc

cca

agc

ctg

agc

gcc

96

Val

His

Ser Asp

íle

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Leu

Ser

Ala

-1

1

5

10

agc gtg ggt gac

aga gtg acc atc acc tgt aag get agt

cag gat Gin Asp

gtg Val

144

Ser Val

Gly

Asp

Arg Val Thr 20

íle

Thr

Cys

Lys

Ala 25

Ser

15

aat

act

get

gta

gcc

tgg

tac

cag

aag

cca

gga

aag

get

cca

aag

192

Asn

Thr

Ala

Val

Ala

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

30

35

40

45

ctg

atc

ta c

tcg

gca

tcc

aac

cgg

tac

act

ggt

gtg

caa

agc

aga

240

Leu

íle

Tyr

Ser

Ala

Ser

Asn

Arg

Tyr

Thr

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

50

55

60

ttc

agc

ggt

agt

ggt

agc

ggt

acc

gac

ttc

acc

ttc

acc

atc

agc

288

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Phe

Thr

íle

Ser

65

70

75

ctc

cag

cca

gag

gac

atc

get

acc

tac

tgc

cag

caa

cat

tat

agt

336

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

íle

Ala

Thr

Tyr

cys

Gin

His

Tyr

Ser

80

85

90

act

cca

ttc

acg

ttc

ggc

caa

ggg

acc

aag

gtg

gaa

atc

aaa

c

379

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

íle

Lys

95

100

105

<210> <211> <212> <213> <22 0> <221> <222> <223>	3 418 DNA Umelo pripravená sekvencia Nukleotidová sekvencia DNA kódujúca H reťazec V oblasti verzie r pozmenenej anti HM1.24 protilátky
<400>	3

atg gac tgg acc tgg Met Asp Trp Thr Trp

agg gtc

ttc ttc

ttg ctg gtc gta get cca ggt

48

Arg

Val

Phe

Leu Leu Ala Val Ala Pro

Gly

-15

-10

-5

get

cac

tcc

cag

gtg

cag

ctg

gtg

cag

tet

ggg

get

gag

gtg

aag

96

Ala

His

Ser

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

-1

L 1

10

cct

ggg

gcc

tca

gtg

aag

gtt

tcc

tgc

aag

gca

tet

gga

tac

acc

ttc

144

Pro

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

15

20

25

act

ccc

tac

tgg

atg

cag

tgg

gtg

ega

cag

gcc

cct

gga

caa

ggg

ctt

192

Thr

Pro

Tyr

Trp

Met

Gin

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

30

35

40

45

gag tgg atg gga Glu Trp Met Gly 50

tct att ttt cct gga gat ggt gat act agg tac agt

240

Ser

íle Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr

Ser

55

60

cag

aag

ttc

aag

ggc

aga

gtc

acc

atg

acc

gca

gac

aag

tcc

acg

agc

288

Gin

Lys

Phe

Lys

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Ala

Asp

Lys

Ser

Thr

Ser

65

70

75

aca

gcc

tac

atg

gag

ctg

agc

ctg

aga

tct

gag

gac

acg

gcc

gtg

336

Thr

Ala

Tyr

Met

Glu

Leu

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

•

80

85

90

tat

tac

tgt

gcg

aga

gga

tta

ega

ggg

tac

ttt

gac

tac

384

•

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Leu

Arg

Gly

Tyr

Phe

Asp

Tyr

95

100

105

tgg

ggg

caa

ggg

acc

acg

gtc

acc

gtc

tcc

tca

g

418

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ser

110 115 120 <210> ⁴ <211> 418 <212> ^DNA <213> Umelo pripravená sekvencia <220>

<221>

<222>

<223> Nukleotidová sekvencia DNA kódujúca H reťazec

V oblasti verzie s anti HM1.24 protilátkou <400> ⁴

atg Met

gac tgg acc Asp Trp Thr -15

tgg agg gtc ttc ttc ttg

ctg gtc Leu Ala

gta get Val Ala -5

cca Pro

ggt Gly

48

Trp

Arg

Val

Phe Phe -10

Leu

get

cac

tcc

cag

gtg

cag

ctg

gtg

cag

tct

ggg

get

gag

gtg

aag

96

Ala

His

Ser

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

L

5

10

cct

ggg

gcc

tca

gtg

aag

gtt

tcc

tgc

aag

gca

tct

gga

tac

acc

ttc

144

Pro

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

15

20

25

act

ccc

tac

tgg

atg

cag

tgg

gtg

ega

cag

gcc

cct

gga

caa

ggg

ctt

192

Thr

Pro

Tyr

Trp

Met

Gin

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

30

35

40

45

gag

tgg

atg

gga

tct

att

ttt

cct

gga

gat

ggt

gat

act

agg

tac

agt

240

Glu

Trp

Met

Gly

Ser

íle

Phe

Pro

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Arg

Tyr

Ser

55 60

cag aag ttc aag ggc aga gtc acc atc acc gca gac aag tcc

acg agc Thr Ser

288

Gin

Lys Phe Lys 65

Gly Arg Val Thr 70

íle Thr Ala

Asp Lys 75

Ser

aca

gcc

tac

atg

gag

ctg

agc

ctg

aga

tet

gag

gac

acg

gcc

gtg

336

Thr

Ala

Tyr

Met

Glu

Leu

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

80

85

90

tat

tac

tgt

gcg

aga

gga

tta

ega

ggg

tac

ttt

gac

tac

384

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Leu

Arg

Gly

Tyr

Phe

Asp

Tyr

95

100

105

tgg

999

caa

ggg

acc

acg

gtc

acc

gtc

tcc

tca

g

418

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ser

110

115

120

<210> <211> <212> <213> <223> <400>

5 108 PRT Homo sapiens Aminokyselinová sekvencia HM1.24 antigénu 5

Met Ala Ser Thr Ser

Tyr Asp Tyr Cys

1

5

Arg

Val

Pro

Met

Glu

Asp

Gly

Asp

Lys

Arg

Cys

Lys

Leu

Gly

10

15

20

25

íle

Gly

íle

Leu

Val

Leu

íle

Val

íle

Leu

Gly

Val

Pro

Leu

30

35

40

íle

Phe

Thr

íle

Lys

Ala

Asn

Ser

Glu

Ala

Cys

Arg

Asp

Gly

Leu

45

50

55

Arg

Ala

Val

Met

Glu

Cys

Arg

Asn

Val

Thr

His

Leu

Gin

Glu

60

65

70

Leu

Thr

Glu

Ala

Gin

Lys

Gly

Phe

Gin

Asp

Val

Glu

Ala

Gin

Ala

75

80

85 '

Thr

Cys

Asn

His

Thr

Val

Met

Ala

Leu

Met

Ala

Ser

Leu

Asp

Ala

Glu

90

95

105

Lys

Ala

Gin

Gly

Gin

Lys

Val

Glu

Leu

Glu

Gly

Glu

íle

Thr

110

115

120

Thr

Leu

Asn

His

Lys

Leu

Gin

Asp

Ala

Ser

Ala

Glu

Val

Glu

Arg

Leu

125

130

135

Arg

Glu

Asn

Gin

Val

Leu

Ser

Val

Arg

íle

Ala

Asp

Lys

Tyr

140

145

150

Tyr

Pro

Ser

Gin

Asp

Ser

Ala

Pro

Gin

Leu

155

160

165

íle Val Leu Leu Gly Leu Ser Ala Leu Leu Gin
170	175	180
<210>	6
<211>	126
<212>	PRT
<213>	Umelo pripravená	sekvencia

<220>

<221>

<222>

<223> Aminokyselinová sekvencia L reťazca V oblasti verzie a pozmenené anti-HMl.24 protilátky <400> ⁶

Met

Gly

Trp

Ser Cys -15

íle íle Leu Ser

Leu Val Ala Thr Ala The Gly

-10

-5

Val

His

Ser

Asp

íle

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Leu

Ser

Ala

1

5

10

Ser

Val

Gly Asp

Arg

Val

Thr

íle

Thr

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Asp

Val

15

20

25

Asn

Thr

Ala

Val

Ala

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

30

35

40

45

Leu

íle

Tyr

Ser

Ala

Ser

Asn

Arg

Tyr

Thr

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

50

55

60

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Phe

Thr

íle

Ser

65

70

75

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

íle

Ala

Thr

Tyr

cys

Gin

His

Tyr

Ser

80

85

90

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

íle

Lys

95	100	105
<210> <211> <212> <213>	7 139 PRT Umelo pripravená	1 sekvencia

<220>

<221>

<222>

<223> Aminokyselinová sekvencia H reťazca V oblasti verzie r pozmenené anti-HM1.24 protilátky <400> 7

Met Asp

Trp Thr Trp Arg Val Phe

Phe Leu Leu Ala Val Ala -10

Pro -5 Lys

Gly Lys

Ala

His -1

-15

Val 5

Ser Gin Val 1

Gin Leu

Gin

Ser

Gly Ala

Glu 10

Val

Pro

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

15

20

25

Thr

Pro

Tyr

Trp

Met

Gin

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

30

35

40

45

Glu

Trp

Met

Gly

Ser

íle

Phe

Pro

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Arg

Tyr

Ser

50

55

60

Gin

Lys

Phe

Lys

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Ala

Asp

Lys

Ser

Thr

Ser

65

70

75

Thr

Ala

Tyr

Met

Glu

Leu

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

80

85

90

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Leu

Arg Arg

Gly

Tyr

Phe

Asp

Tyr

95

100

105

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ser

110

115

120

<210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<221>

<222>

<223>

<400>

139

PRT

Umelo pripravená sekvencia

Aminokyselinová sekvencia H reťazca V oblasti verzie s pozmenené anti-HM1.24 protilátky 8

Met

Asp

Trp Thr

Trp

Arg

Val

Phe

Leu

Ala

Val

Ala

Pro

Gly

-15

-10

-5

Ala

His

Ser Gin

Val

Gin

Leu

Val

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

-1

1

5

10

Pro

Gly

Ala Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

15

20

25

Thr

Pro

Tyr Trp

Met

Gin

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

30

35

40

45

Glu

Trp

Met Gly

Ser

íle

Phe

Pro

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Arg

Tyr

Ser

50

55

60

Gin Lys Phe 65

Lys Gly Arg Val Thr íle 70

Thr Ala Asp Lys 75

Ser Thr

Ser

Thr

Ala Tyr

Met

Glu

Leu

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

80

85

90

Tyr

Tyr Cys

Ala

Arg

Gly

Leu

Arg

Gly

Tyr

Phe

Asp

Tyr

95

100

105

Trp

Gly Gin

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ser

110

115

120

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Liečebné činidlo pre lymfatické nádory (okrem myelómov) vyznačujúce sa tým, že obsahuje ako aktívnu zložku protilátku, ktorá sa špecificky viaže na proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu ako je uvedené v SEQ ID No: 1 a ktorá má cytotoxickú aktivitu.
2. Liečebné činidlo podlá patentového nároku č.l, vyznačujúce sa tým, že lymfatický nádor je nádor T buniek.
3. Liečebné činidlo podlá patentového nároku č.l, vyznačujúce sa tým, že lymfatický nádor je nádor B buniek (okrem myelómov).
4. Liečebné činidlo podlá patentového nároku č.l, vyznačujúce sa tým, že protilátka je monoklonálna protilátka.
5. Liečebné činidlo podlá patentového nároku č.l, vyznačujúce sa tým, že cytotoxická aktivita je ADCC aktivita.

I I ₍
6. Liečebné'činidlo podlá patentového nároku č.l, vyznačujúce sa tým, že cytotoxická aktivita je CDC aktivita.
7. Liečebné činidlo podlá patentového nároku č.4, vyznačujúce sa tým, že protilátka má konštantnú oblasť Cy ludskej protilátky.
8. Liečebné činidlo podľa patentového nároku č.7, vyznačujúce sa tým, že konštantná oblasť ľudskej protilátky Cy je Cyl alebo Cy3.
9. Liečebné činidlo podľa patentového nároku č.4, vyznačujúce sa tým, že protilátka je antiHM1.24 protilátka.
10. Liečebné činidlo podľa patentového nároku č.4, vyznačujúce sa tým, že protilátka je chimérna protilátka alebo pozmenená protilátka.
11. Liečebné činidlo podľa patentového nároku č.9, vyznačujúce sa tým, že protilátka chimérna anti-HM1.24 protilátka.
12. Liečebné činidlo podľa patentového nároku č.9, vyznačujúce sa tým, že protilátka je pozmenená anti-HM1.24 protilátka.
13. Liečebné činidlo podľa patentového nároku č.9, vyznačujúce sa tým, že protilátka sa špecificky viaže k epitopu rozlišovaného anti-HM1.24 protilátkou.
14. Protilátka, vyznačujúce sa tým, že sa špecificky viaže k proteínu, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID No: la ktorá má cytotoxickú aktivitu.
15. Protilátka podľa patentového nároku č.13, vyznačujúce sa tým, že cytotoxická aktivita je ADCC aktivita.
16. Protilátka podlá patentového nároku č.13, vyznačujúce sa tým, že cytotoxická aktivita je CDC aktivita.