WO1998035698A1 - Remedes contre les tumeurs lymphocitaires - Google Patents

Description

明 細 書 リ ンパ球系腫瘍の治療剤 技術分野

本発明は、 リ ンパ球系腫瘍に発現される蛋白質に特異的に結合す る抗体を有効成分と して含有する リ ンパ球系腫瘍 （骨髄腫を除く ） 治療剤に関する。 また、 本発明は、 T細胞腫瘍または B細胞腫瘍 （ 骨髄腫を除く ） 治療剤に関する。 さ らに、 本発明は、 リ ンパ球系腫 瘍に発現される蛋白質に特異的に結合し、 細胞障害活性を有する抗 体に関する。 背景技術

リ ンパ球系細胞は、 生体において主に免疫を担当する細胞である 。 リ ンパ球系細胞は全て同 じ血液幹細胞に由来し、 骨髄中あるいは その他の器官で様々 な分化誘導因子、 または増殖因子の作用を受け て分化を繰り返した後、 末梢血中へ放出される。 この分化の違いに より リ ンパ球系細胞は B細胞と T細胞に大別される。 B細胞は抗体 産生能を、 T細胞は抗原提示能、 細胞障害能その他様々 な能力を有 していると考えられている。 この分化段階で何らかの原因により腫 瘍化し、 骨髄中、 リ ンパ組織中、 末梢血中等で異常増殖するように なったものが、 リ ンパ球系腫瘍である。

近年の新しい技術導入、 特に細胞表面の分化抗原に対するモノ ク ローナル抗体を用いた技術の進歩により、 リ ンパ球系細胞の由来や 分化段階の同定が可能になった。 それに伴い、 リ ンパ球系腫瘍につ いてもその腫瘍細胞の由来が T細胞なのか B細胞なのかだけではな く 、 成熟度の同定までもが可能になった。 リ ンパ球系腫瘍はその腫瘍細胞の起源あるいは成熟度により B細 胞腫瘍および T細胞腫瘍に大別される。 B細胞腫瘍は腫瘍細胞の成 熟度によって、 急性 B リ ンパ性白血病 （B- ALL ) 、 慢性 B リ ンパ性 白血病 （B- CLL ) 、 pre- B リ ンパ腫、 Burkitt リ ンパ腫、 濾胞性リ ンパ腫、 濾胞外套リ ンパ腫、 びまん性リ ンパ腫等に分類される。 ま た、 T細胞腫瘍はその腫瘍細胞の成熟度によ って、 急性 T リ ンパ性 白血病 （T- ALL ) 、 慢性 T リ ンパ性白血病 （T-CLL ) 、 成人 T細胞 白血病 （ATL ) 、 非 ATL 末梢性 T リ ンパ腫 （PN ) 等に分類される

(図解臨床 〔癌〕 シ リ 一ズ No.17 白血病 · リ ンパ腫、 杉村隆ら、 ME DICAL VIEW社、 1987， B細胞腫瘍、 高月清、 西村書店、 1991) 。 近年の医療技術の進歩にも関わらず、 リ ンパ球系腫瘍の治療に関 しては未だ不十分であると言わざるを得ない。 例えば、 急性リ ンパ 性白血病 （ALL ) の治癒率は 20%以下である。 また、 リ ンパ腫の場 合、 B リ ンパ腫は多剤併用療法の進歩により比較的治癒率は高いと はいう ものの、 進行期での治癒率は 50 %程度である。 さ らに T リ ン パ腫はより難治性であり、 治癒率は約 30%、 成人 T細胞白血病 （AT L ) に至っては 10%にも満たないのが現状である。

一方、 Goto, T. らは、 ヒ ト骨髄腫細胞をマウ スに免疫して得られ たモノ ク ロ ーナル抗体 （抗 HM1.24抗体） を報告している （Blood (1 994) 84， 1922-1930) 。 ヒ ト骨髄腫細胞を移植したマウスに抗 HM1. 24抗体を投与する と、 この抗体が腫瘍組織に特異的に集積したこ と

(小阪昌明ら、 日本臨床 （ 1995)53， 627- 635)から、 抗 HM1.24抗体は ラ ジオァイ ソ ト一プ標識による腫瘍局在の診断や、 ラ ジオィムノセ ラ ピ一などの ミ ザイル療法に応用するこ とが可能であるこ とが示唆 されている。 しかし、 抗 HM1.24抗体が他の リ ンパ球系腫瘍の治療に 有用であるこ とは知られていない。 発明の開示

現在行われている リ ンパ球系腫瘍の治療には、 種々の化学療法、

X線療法、 骨髄移植等が挙げられるが、 上記のごと く 、 いずれの治 療法も未だ完全ではなく 、 リ ンパ球系腫瘍を寛解に導き、 患者の生 存期間を延長させる画期的な治療剤あるいは治療法が待たれている o

従って、 本発明の目的は、 骨髄腫を除く リ ンパ球系腫瘍に対する 新しい治療剤を提供することである。

本発明者らは、 かかる治療剤を提供すべく 、 抗 HM1.24抗体 （Goto ， T. ら Blood (1994) 84. 1922-1930) を用いて、 FCM (フローサ ィ トメ ト リ —） 解析、 ADCC活性、 CDC 活性のような細胞障害活性の 測定等のイ ン · ビ ト ロでの研究、 イ ン ' ビボでの抗腫瘍効果の検討 、 さ らには抗 HM1.24抗体が特異的に結合する抗原蛋白質単離の研究 を重ねた結果、 抗 HM1.24抗体が認識する抗原タ ンパク質がリ ンパ球 系腫瘍に発現しているこ と、 および抗 HM1.24抗体がリ ンパ球系腫瘍 に対し抗腫瘍効果を有するこ とを見出 し、 本発明を完成するに至つ た。

すなわち、 本発明は配列番号 1 に示されるア ミ ノ酸配列を有する 蛋白質に特異的に結合し、 かつ細胞障害活性を有する抗体を有効成 分と して含有する、 リ ンパ球系腫瘍 （骨髄腫を除く ） 治療剤を提供 する。

また、 本発明は配列番号 1 に示されるア ミ ノ酸配列を有する蛋白 質に特異的に結合し、 かつ細胞障害活性を有する抗体を有効成分と して含有する、 T細胞腫瘍治療剤、 または B細胞腫瘍 （骨髄腫を除 く ） 治療剤を提供する。

また、 本発明は配列番号 1 に示されるァ ミ ノ酸配列を有する蛋白 質に特異的に結合し、 かつ細胞障害活性を有するモノ ク ローナル抗 - 体を有効成分と して含有する、 T細胞腫瘍治療剤、 または B細胞腫 瘍 （骨髄腫を除く ） 治療剤を提供する—。

また、 本発明は配列番号 1 に示されるァ ミ ノ酸配列を有する蛋白 質に特異的に結合し、 かつ細胞障害活性と して A D C C活性または C D C活性を有する抗体を有効成分と して含有する、 T細胞腫瘍治 療剤、 または B細胞腫瘍 （骨髄腫を除く ） 治療剤を提供する。

また、 本発明は配列番号 1 に示されるア ミ ノ酸配列を有する蛋白 質に特異的に結合し、 かつ細胞障害活性を有し、 定常領域と してヒ ト抗体の C rを有する抗体を有効成分と して含有する、 T細胞腫瘍 治療剤、 または B細胞腫瘍 （骨髄腫を除く ） 治療剤を提供する。

また、 本発明は配列番号 1 に示されるァ ミ ノ酸配列を有する蛋白 質に特異的に結合し、 かつ細胞障害活性を有するキメ ラ抗体または ヒ ト型化抗体を有効成分と して含有する、 T細胞腫瘍治療剤、 また は B細胞腫瘍 （骨髄腫を除く ） 治療剤を提供する。

また、 本発明は抗 HM1. 24抗体が認識するェピ トープと特異的に結 合する抗体を有効成分とする、 T細胞腫瘍治療剤、 または B細胞腫 瘍 （骨髄腫を除く ） 治療剤を提供する。

また、 本発明は抗 HM 1 . 24抗体を有効成分と して含有する T細胞腫 瘍治療剤、 または B細胞腫瘍 （骨髄腫を除く ） 治療剤を提供する。

さ らに、 本発明はリ ンパ球系腫瘍に発現される蛋白質に特異的に 結合し、 細胞障害活性を有する抗体に関する。 図面の簡単な説明

図 1 は、 抗 HM1. 24抗体およびコ ン ト ロールマウ ス I gG2a で、 間接 法により図に示す B細胞株を FCM 解析したときのヒ ス トグラムを示 す。

図 2 は、 抗 HM 1. 24抗体およびコ ン ト ロールマウ ス l gG2 a で、 間接 - 法により図に示す B細胞株を FCM 解析したときのヒ ス トグラムを示 す。

図 3 は、 抗 HM1.24抗体およびコ ン ト 口ールマゥ ス IgG2a で、 間接 法により図に示す B細胞株を FCM 解析したときのヒ ス 卜グラムを示 す。

図 4 は、 抗 HM1.24抗体およびコ ン ト ロールマウス IgG2a で、 間接 法により図に示す B細胞株を FCM 解析したときのヒ ス トグラムを示 す。

図 5 は、 抗 HM1.24抗体およびコ ン ト ロールマウ ス IgG2a で、 間接 法により図に示す B細胞株を FCM 解析したときのヒ ス 卜グラムを示 す。

図 6 は、 抗 HM1.24抗体およびコ ン ト ロールマウ ス IgG2a で、 間接 法により図に示す B細胞株を FCM 解析したときのヒ ス トグラムを示 す。

図 7 は、 抗 HM1.24抗体およびコン トロールマウス IgG2a で、 間接 法により図に示す B細胞株を FCM 解析したときのヒ ス トグラムを示 す。

図 8 は、 抗 HM1.24抗体およびコ ン ト ロールマウス lgG2a で、 間接 法により図に示す B細胞株を FCM 解析したときのヒ ス トグラムを示 す。

図 9 は、 抗 HM1.24抗体およびコ ン ト ロールマウ ス lgG2a で、 間接 法により図に示す B細胞株を FCM 解析したときのヒ ス トグラムを示 す。

図 1 0 は、 抗 HM1.24抗体およびコ ン ト ロ ールマウ ス IgG2a で、 間 接法により図に示す T細胞株を FCM 解析したときのヒ ス トグラムを 示す。

図 1 1 は、 抗 HM1.24抗体およびコン トロールマウス IgG2a で、 間 - 接法により図に示す T細胞株を FCM 解析したときのヒ ス トグラムを 示す。

図 1 2 は、 抗 HM1.24抗体およびコ ン ト ロールマウ ス IgG2a で、 間 接法により図に示す T細胞株を FCM 解析したときのヒ ス トグラムを 示す。

図 1 3 は、 抗 HM1.24抗体およびコ ン ト ロールマウ ス IgG2a で、 間 接法により図に示す T細胞株を FCM 解析したときのヒ ス トグラムを

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図 1 4 は、 抗 HM1.24抗体およびコ ン ト ロールマウ ス IgG2a で、 間 接法により図に示す T細胞株を FCM 解析したときのヒ ス トグラムを 示す。

図 1 5 は、 抗 HM1.24抗体およびコ ン ト ロールマウ ス IgG2a で、 間 接法により図に示す T細胞株を FCM 解析したときのヒ ス トグラムを 示す。

図 1 6 は、 抗 HM1.24抗体およびコ ン ト ロールマウ ス IgG2a で、 間 接法により図に示す T細胞株を FCM 解析したときのヒ ス トグラムを 示す。

図 1 7 は、 抗 HM1.24抗体およびコ ン ト ロールマウ ス IgG2a で、 間 接法により図に示す T細胞株を FCM 解析したときのヒ ス トグラムを 示す。

図 1 8 は、 抗 HM1.24抗体およびコ ン ト ロ ールマウ ス lgG2a で、 間 接法により図に示す T細胞株を FCM 解析したときのヒ ス トグラムを 示す。

図 1 9 は、 抗 HM1.24抗体およびコ ン ト ロールマウ ス IgG2a で、 間 接法により図に示す T細胞株を FCM 解析したときのヒ ス トグラムを 示す。

図 2 0 は、 抗 HM1.24抗体およびコ ン ト ロールマウ ス IgG2a で、 間 ' 接法によ り図に示す非 T非 B細胞株を FCM 解析したときのヒ ス トグ ラ ムを示す。

図 2 1 は、 抗 HM1. 24抗体およびコ ン ト ロールマウ ス I gG2a で、 間 接法により図に示す非 T非 B細胞株を FCM 解析したときの ヒ ス トグ ラ ム ¾ 不す。

図 2 2 は、 抗 HM1. 24抗体およびコ ン ト ロ ールマウ ス I gG2a で、 間 接法によ り図に示す非 T非 B細胞株を FCM 解析したときのヒ ス トグ ラムを示す。

図 2 3 は、 抗 HM1. 24抗体およびコ ン ト ロ ールマウス I gG2a で、 間 接法によ り図に示す非 T非 B細胞株を FCM 解析したときのヒ ス トグ ラ ムを示す。

図 2 4 は、 抗 HM1. 24抗体が T細胞腫瘍株である CCRF - CEM， CCRF-H SB -2および HPB - MLT に対して、 濃度依存的に細胞障害を引き起こ し ているこ とを示すグラフである。

図 2 5 は、 抗 HM1. 24抗体が B細胞腫瘍株である EB - 3， MC 1 16 およ び CCRF- SBに対して、 濃度依存的に細胞障害を引き起こ しているこ とを示すグラフである。

図 2 6 は、 ヒ ト リ ンパ球系腫瘍移植マウスにおいて、 抗 HM1. 24抗 体投与群は、 コ ン ト ロールマウ ス I gG2a 投与群に比べ、 腫瘍体積の 増加が抑制されている こ とを示すグラフである。

図 2 7 は、 ヒ ト リ ンパ球系腫瘍移植マウスにおいて、 抗 HM1. 24抗 体投与群は、 コ ン ト ロ ールマウ ス I gG2a 投与群に比べ、 生存期間が 延長している こ とを示すグラフである。 発明の実施の形態

1. 抗体の作製

1 - 1. ハイプリ ドーマの作製 本発明で使用される抗体を産生するハイプリ ドー マは、 基本的に は公知技術を使用 し、 以下のよう にして作製できる。 すなわち、 HM 1.24抗原蛋白質や題 1.24抗原を発現する細胞を感作抗原と して使用 して、 これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、 得られる免疫細 胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、 通常のス ク リ 一ニング法により、 モノ ク ロ一ナルな抗体産生細胞をスク リ ー ニングする こ とによつて作製できる。

具体的には、 モノ ク ロ一ナル抗体を作製するには次のよう にすれ ばよい。 例えば、 抗体取得の感作抗原である HM1.24抗原発現細胞と しては、 ヒ ト多発性骨髄腫細胞株である KP匪 2 (特開平 7-236475) や KPC- 32 (Goto, T. et al.， Jpn. J. Cl in. Hematol. (1991) 32, 1400 ) を用いるこ とができる。 また、 感作抗原と して配列番号 1 に示すア ミ ノ酸配列を有する蛋白質、 あるいは抗題 1.24抗体が認識 するェピ ト一プを含むぺプチ ドまたはポ リべプチ ドを使用するこ と ができる。

なお、 感作抗原と して使用される、 配列番号 1 に示すア ミ ノ酸配 列を有する蛋白質の cDNAは pUC19 ベク タ一の Xbal切断部位の間に揷 入されて、 プラス ミ ド pRS38 pUC19 と して調製されている。 このプ ラス ミ ド pRS38- pUC19 を含む大腸菌 （E. coli) は、 平成 5 年 （1993 年） 10月 5 日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に、 Escheric hia coli DH5a (pRS38-pUC19 ) と して、 受託番号 FERM BP- 4434と してブダぺス ト条約に基づき国際寄託されている （特開平 7 196694 参照） 。 このプラス ミ ド pRS38 pUC19 に含まれる cDNA断片を用いて 遺伝子工学的手法により、 抗 HM1.24抗体が認識するェピ トープを含 むべプチ ドまたはポ リぺプチ ドを作製するこ とができる。

感作抗原で免疫される哺乳動物と しては、 特に限定される もので はないが、 細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択す — るのが好ま し く 、 一般的にはげつ歯類の動物、 例えば、 マウス、 ラ ッ ト、 ハムスタ ー等が使用される。

感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法にしたがって行われ る。 例えば、 一般的方法と して、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内また は、 皮下に注射する こ とによ り行われる。 具体的には、 感作抗原を

PBS (Phosphate-Buffered Saline ) や生理食塩水等で適当量に希 釈、 懸濁したものを所望によ り通常のアジュバン ト、 例えば、 フ ロ イ ン ト完全アジュバン トを適量混合し、 乳化後、 哺乳動物に 4-21日 毎に数回投与するのが好ま しい。 また、 感作抗原免疫時に適当な担 体を使用する こ とができる。

このよ う に免疫し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確 認した後に、 哺乳動物から免疫細胞が取り 出され、 細胞融合に付さ れる。 細胞融合に付される好ま しい免疫細胞と しては、 特に脾細胞 が挙げられる。

前記免疫細胞と融合される他方の親細胞と しての哺乳動物の ミ エ ローマ細胞は、 すでに、 公知の種々の細胞株、 例えば、 P3X63Ag8.6 53 (J. Immnol. (1979) 123: 1548-1550) , P3X63Ag8U.1 (Curren t Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81: 1-7) ， NS 1 (Kohler. G. and Mi lstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6： 5 11-519) ， MPC-11 (Margul ies. D. H. et al. , Cell (1976) 8: 40 5-415 ) ， SP2/0 (Shulman, M. et al. , Nature (1978) 276: 269 -270) ， F0 (de St. Groth, S. F. et al. , J. Immunol. Methods (1980) 35: 1-21 ) ， S194 (Trowbridge, 1. S. J. Exp. Med. (19 78) 148: 313-323) ， R210 (Galf re, G. et al. , Nature (1979) 2 77: 131-133 ) 等が適宜使用される。

前記免疫細胞と ミ エローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方 法、 たとえば、 ミ ルスティ ンらの方法 （Kohler. G. and Milstein, C.， Me t hods Enz ymo l . ( 1981 ) 73 : 3 -46 ) 等に準じて行う こ とが できる。

より具体的には、 前記細胞融合は例えば、 細胞融合促進剤の存在 下に通常の栄養培養液中で実施される。 融合促進剤と しては例えば 、 ポ リ エチレングリ コール （ PEG ) 、 センダイ ウ ィ ルス （ HV J ) 等 が使用され、 更に所望により融合効率を高めるためにジメ チルスル ホキシ ド等の補助剤を添加使用するこ と もできる。

免疫細胞と ミ エ口一マ細胞との使用割合は、 例えば、 ミ エローマ 細胞に対して免疫細胞を 1 - 10倍とするのが好ま しい。 前記細胞融合 に用いる培養液と しては、 例えば、 前記ミ エローマ細胞株の増殖に 好適な RPM I 1640培養液、 MEM 培養液、 その他、 この種の細胞培養に 用いられる通常の培養液が使用可能であり、 さ らに、 牛胎児血清 （ FCS ) 等の血清補液を併用するこ と もできる。

細胞融合は、 前記免疫細胞と ミ エローマ細胞との所定量を前記培 養液中でよ く 混合し、 予め、 37°C程度に加温した PEG 溶液、 例えば 、 平均分子量 1000 - 6000 程度の PEG 溶液を通常、 30 - 60 % ( w/v ) の濃度で添加し、 混合するこ とによって目的とする融合細胞 （ハイ プリ ドーマ） が形成される。 続いて、 適当な培養液を逐次添加し、 遠心して上清を除去する操作を繰り返すこ とによりハイプリ ドーマ の生育に好ま し く ない細胞融合剤等を除去できる。

当該ハイプリ ドーマは、 通常の選択培養液、 例えば、 HAT 培養液 (ヒポキサンチン、 ァ ミ ノ ブテ リ ンおよびチ ミ ジンを含む培養液） で培養する こ とにより選択される。 当該 HAT 培養液での培養は、 目 的とするハイプリ ドーマ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅するのに 十分な時間、 通常数日〜数週間継続する。 ついで、 通常の限界希釈 法を実施し、 目的とする抗体を産生するハィブリ ドーマのスク リ ー ニングおよび単一ク ローニングが行われる。 また、 ヒ ト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリ ド一マを得 る他に、 ヒ ト リ ンパ球を in vi troで HM1.24抗原または HM1.24抗原発 現細胞で感作し、 感作リ ンパ球をヒ ト ミ エローマ細胞、 例えば U266 と融合させ、 HM1.24抗原または HM1.24抗原発現細胞への結合活性を 有する所望のヒ ト抗体を得るこ と もできる （特公平 1-59878 参照） 。 さ らに、 ヒ ト抗体遺伝子の全てのレバー ト リ 一を有する ト ラ ンス ジエニッ ク動物に抗原となる HM1.24抗原または HM1.24抗原発現細胞 を投与し、 前述の方法に従い所望のヒ ト抗体を取得してもよい （国 際特許出願公開番号 W0 93/12227, W0 92/03918, W0 94/02602, W0 94/25585， W0 96/34096， W0 96/33735参照） 。

このよう に して作製されるモノ ク ローナル抗体を産生するハイブ リ ドーマは、 通常の培養液中で継代培養する こ とが可能であり、 ま た、 液体窒素中で長期保存するこ とが可能である。

当該ハイブリ ド一マからモノ ク ロ ーナル抗体を取得するには、 当 該ハイプリ ドーマを通常の方法に したがい培養し、 その培養上清と して得る方法、 あるいはハイプリ ドーマをこれと適合性がある哺乳 動物に投与して増殖させ、 その腹水と して得る方法などが採用され る。 前者の方法は、 高純度の抗体を得るのに適しており、 一方、 後 者の方法は、 抗体の大量生産に適している。

具体的には、 抗 HM1.24抗体産生ハイプリ ドーマの作製は、 Goto, T. らの方法 （Blood (1994) 84. 1922-1930) により行う こ とができ る。 工業技術院生命工学工業技術研究所 （茨城県つく ば巿東 1 丁目 1 番 3 号） に、 平成 7 年 9 月 14日に FERM BP-5233と してブタぺス ト 条約に基づき国際寄託された抗 HM1.24抗体産生ハィブリ ドーマを BA LB/cマウ ス （日本ク レア製） の腹腔内に注入して腹水を得、 この腹 水から抗 HM1.24抗体を精製する方法や、 本ハイプリ ドーマを適当な 培地、 例えば、 10%ゥ シ胎児血清、 5 % BM-Condimed HI (Boehring - er Mannheim 製） 含有 RPM 11640培地、 ハイブリ ド—マ SFM 培地 （GI BC0-BRL 製） 、 PFHM- II 培地 （GIBCO- BRL 製） 等で培養し、 その培 養上清から抗 HM1.24抗体を精製する方法で行う こ とができる。

1-2. 組換え型抗体

本発明では、 モノ ク ローナル抗体と して、 抗体遺伝子をハイプリ ドーマからク ロ一ニ ングし、 適当なベク ターに組み込んで、 これを 宿主に導入し、 遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体 を用いる こ とができる （例えば、 Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 参照） 具体的には、 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマから、 抗 体の可変 （V ) 領域をコ一 ドする mRNAを単離する。 mRNAの単離は、 公知の方法、 例えば、 グァニジ ン超遠心法 （Chirgwin, J. M. ら、 Biochemistry (1979) 18, 5294-5299 ) 、 AGPC法 （ Chomczynsk i , P . ら、 Analytical Biochemistry, (1987) 162, 156-159) 等により 全 RNA を調製し、 mRNA Purif ication Kit (Pharmacia 製） 等を使 用 して mRNAを調製する。 また、 QuickPrep mRNA Purif ication Kit (Pharmacia 製） を用いる こ とにより mRNAを直接調製する こ とがで き 。

得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V 領域の cDNAを合成す る。 cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcri tase First - strand cDN A Synthesis i t 等を用いて行う ことができる。 また、 cDNAの合成 および増幅を行う には 5' -Ampl i FINDER RACE Kit (Clontech製） および PCR を用いた 5 RACE 法 （Frohman, M. A. ら、 Pro Natl . Acad. Sci. USA (1988) 85， 8998 - 9002 ； Belyavsky, A. ら、 Nu cleic Acids Res. (1989) 17， 2919-2932 ) を使用する こ とができ る。 得られた PCR 産物から目的とする DNA 断片を精製し、 ベク ター

DNA と連結する。 さ らに、 これより組換えべク タ一を作成し、 大腸 菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えべク タ一を調製す る。 目的とする DNA の塩基配列を公知の方法、 例えば、 デォキシ法 により確認する。

目的とする抗体の V 領域をコ一 ドする DNA が得られれば、 これを 所望の抗体定常領域 （C 領域） をコー ドする DNA と連結し、 これを 発現ベク ターへ組み込む。 または、 抗体の V 領域をコー ドする DNA を、 抗体 C 領域の DNA を含む発現ベク ターへ組み込んでもよい。 本発明で使用される抗体を製造するには、 後述のよう に抗体遺伝 子を発現制御領域、 例えば、 ェンハ ンサ一、 プロモーターの制御の もとで発現するよう発現ベク ターに組み込む。 次に、 この発現べク ターにより宿主細胞を形質転換し、 抗体を発現させるこ とができる

1 - 3. 改変抗体

本発明では、 ヒ トに対する異種抗原性を低下させるこ と等を目的 と して人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、 例えば、 キメ ラ （Ch i me r i c) 抗体、 ヒ ト型化 （Human i z e d ) 抗体などを使用できる。 こ れらの改変抗体は、 既知の方法を用いて製造するこ とができる。

キメ ラ抗体は、 前記のようにして得た抗体 V 領域をコー ドする DN A をヒ ト抗体 C 領域をコー ドする DNA と連結し、 これを発現べク タ —に組み込んで宿主に導入し産生させる こ とによ り得られる （欧州 特許出願公開番号 EP 125023 、 国際特許出願公開番号 W0 96/02576 参照） 。 この既知の方法を用いて、 本発明に有用なキメ ラ抗体を得 るこ とができる。

例えば、 キメ ラ抗 HM1. 24抗体のし 鎖 V 領域および H 鎖 V 領域をコ — ドする DNA を含むプラス ミ ドを有する大腸菌は、 各々 E s ch e r i ch i a col i DH5 a (pUC19-l.24L- g κ ) および Escher i chi a col i DH5 a (PUC19-1.24H- g ァ 1 ) と して、 工業技術院生命工学工業技術研究 所 （茨城県つく ば巿東 1 丁目 1 番 3 号） に、 平成 8 年 8 月 29日に、 各々 FERM BP- 5646および FERM BP- 5644と してブダペス ト条約に基づ き国際寄託されている （特願平 9- 271536参照） 。

ヒ ト型化抗体は、 再構成 （reshaped) ヒ ト抗体と も称され、 ヒ ト 以外の哺乳動物、 たとえばマウス抗体の相補性決定領域 （CDR; com plementar i ty determining region ) ¾ ヒ ト抗体の相補性決定領域 へ移植したものであり、 その一般的な遺伝子組換え手法も知られて いる （欧州特許出願公開番号 EP 125023 、 国際特許出願公開番号 W0 96/02576 参照） 。

具体的には、 マウス抗体の CDR と ヒ ト抗体のフ レームワーク領域 (framework region ； FR) を連結するよ う に設計した DNA 配列を、 末端部にオーバーラ ップする部分を有するよう に作製した数個のォ リ ゴヌ ク レオチ ドから PCR 法により合成する。 得られた DNA をヒ ト 抗体 C 領域をコ一 ドする DNA と連結し、 次いで発現べク 夕―に組み 込んで、 これを宿主に導入し産生させる こ とにより得られる （欧州 特許出願公開番号 EP 239400 、 国際特許出願公開番号 W0 96/02576 参照） 。

CDR を介して連結される ヒ ト抗体の FRは、 相補性決定領域が良好 な抗原結合部位を形成する ものが選択される。 必要に応じ、 再構成 ヒ ト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するよう に 抗体の可変領域のフ レームワーク領域のァ ミ ノ酸を置換してもよい (Sato, K. et al. , Cancer Res. (1993) 53, 851-856) 。

例えば、 ヒ ト型化抗 HM1.24抗体の L 鎖 V 領域 a バージ ョ ン （配列 番号 ： 2 ) および H 鎖 V 領域 r バ一ジ ョ ン （配列番号 ： 3 ) をコ一 ドする DNA を含むプラス ミ ドを有する大腸菌は、 各々 Escherichia col i DH5 a ( pUC19-RVLa-AHM-g / ) および Esclier i ch i a col i DH5 a (PUC19- RVHr-AHM- g r 1 ) と して、 工業技術院生命工学工業技術 研究所 （茨城県つく ば巿東 1 丁目 1 番 3 号） に、 平成 8 年 8 月 29曰 に、 各々 FERM BP- 5645および FERM BP- 5643と してブダぺス ト条約に 基づき国際寄託されている （特願平 9-271536参照） 。 また、 ヒ ト型 化抗 HM1.24抗体の H 鎖 V 領域 s バ一ジ ョ ン （配列番号 ： 4 ) をコー ドする DNA を含むプラス ミ ドを有する大腸菌は、 Escherichia col i DH5a (pUC19-RVHs-AHM- g ァ 1 ) と して、 工業技術院生命工学ェ 業技術研究所 （茨城県つく ば巿東 1 丁目 1 番 3 号） に、 平成 9 年 （ 1997年） 9 月 29日に FERM BP- 6127と してブダペス ト条約に基づき国 際寄託されている （特願平 9- 271536参照） 。

キメ ラ抗体、 ヒ ト型化抗体には、 ヒ ト抗体 C 領域が使用され、 細 胞障害活性を呈する ヒ 卜抗体 C 領域と して、 ヒ 卜 C ァ例えば、 C ァ 1， C ァ 2， C r 3 , C ァ 4 を使用するこ とができる。 これらのう ち、 特に C ァ 1 ， C 7 3 を有する抗体が強力な細胞障害活性、 すな わち、 ADCC活性、 CDC 活性を有し、 本発明に好適に使用される。

キメ ラ抗体はヒ ト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域と ヒ ト抗体 由来の C 領域からなり、 ヒ ト型化抗体はヒ ト以外の哺乳動物由来抗 体の相補性決定領域と ヒ ト抗体由来のフ レームワーク領域 （framew ork region; FR) および C 領域からなり、 ヒ ト体内における抗原性 が低下しているため、 本発明の治療剤の有効成分と して有用である 本発明に使用される ヒ ト型化抗体の好ま しい具体例と しては、 ヒ ト型化抗 HM1.24抗体が挙げられる （特願平 9- 271536参照） 。 ヒ ト型 化抗 HM1.24抗体の L 鎖 V 領域の好ま しい具体例と しては、 配列番号 2 に示される塩基配列により コー ドされるア ミ ノ酸配列を有する も のが挙げられる。 また、 ヒ ト型化抗 HM1.24抗体の H 鎖 V 領域の好ま しい具体例と しては、 配列番号 3及び 4 に示される塩基配列により コ ー ドされるア ミ ノ酸配列を有する ものが挙げられる。

1-4. 発現および産生

前記のように構築した抗体遺伝子は、 公知の方法により発現させ 、 取得するこ とができる。 哺乳類細胞の場合、 常用される有用なプ 口モータ一、 発現される抗体遺伝子、 その 3'側下流にポ リ A シグナ ルを機能的に結合させた DNA あるいはそれを含むベク タ一により発 現させる こ とができる。 例えばプロモーター Zェンハンサ一と して は、 ヒ トサイ トメ ガロウ ィ ルス前期プロモータ一 /ェンハンサー （ human cytomegalovirus immediate earl y promoter/enhancer ) ¾· 挙げるこ とができる。

また、 その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモ —夕一//ェ ンノヽンサ一と して、 レ ト ロゥ イ ノレス、 ポ リ オ一マウ イ ノレ ス、 アデノ ウ イ ノレス、 シ ミ ア ンゥ イ ノレス 40 (SV 40 ) 等のウ イ ノレス プロ モー タ ーノエ ンノヽ ンサーゃ ヒ ト ェロ ンゲ一 シ ョ ン フ ァ ク タ 一 1 a (HEF1 a ) などの哺乳類細胞由来のプロモータ一/ェンハンサー を用いればよい。

例えば、 SV 40 プロモータ一/ェ ンハ ンサ一を使用する場合、 Mu lliganらの方法 （Nature (1979) 277, 108) 、 また、 HEFl aプロモ —夕一/ェンハ ンサ一を使用する場合、 Mizushima らの方法 （Nucl eic Acids Res. (1990) 18, 5322) に従えば容易に実施する こ とが できる。

大腸菌の場合、 常用される有用なプロモータ一、 抗体分泌のため のシグナル配列、 発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現 させるこ とができる。 例えばプロモータ一と しては、 laczプロモー 夕一、 araBプロモータ一を挙げるこ とができる。 laczプロモーター を使用する場合、 Wardらの方法 （Nature (1098) 341, 544- 546 ； FA SEB J. (1992) 6， 2422-2427) 、 araBプロモータ一を使用する場合 、 Betterらの方法 （Science (1988) 240, 1041 1043 ) に従えばよ い。

抗体分泌のためのシグナル配列と しては、 大腸菌のぺリ ブラズム に産生させる場合、 pelBシグナル配列 （Lei， S. P. et al J. Bact eriol. (1987) 169, 4379 ) を使用すればよい。 ペリ ブラズムに産 生された抗体を分離した後、 抗体の構造を適切に リ フ ォ ール ド （re fold) して使用する （例えば、 W096/30394を参照） 。

複製起源と しては、 SV 40 、 ポ リ オ一マウ ィ ルス、 アデノ ウ ィ ル ス、 ゥ シパピ口一マウ ィ ルス （BPV ) 等の由来のものを用いるこ と ができ、 さ らに、 宿主細胞系で遺伝子コ ピー数増幅のため、 発現べ ク タ一は選択マ一力一と して、 ア ミ ノ グリ コ シ ド トラ ンスフ ェラ一 ゼ （APH ) 遺伝子、 チ ミ ジンキナーゼ （TK) 遺伝子、 大腸菌キサン チングァニンホスホ リ ボシル ト ラ ンスフ ェラ一ゼ （ Ecogp t) 遺伝子 、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （dhfr) 遺伝子等を含むこ とができる。 本発明で使用される抗体の製造のために、 任意の産生系を使用す るこ とができる。 抗体製造のための産生系は、 in vitroおよび in v ivo の産生系がある。 in vitroの産生系と しては、 真核細胞を使用 する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。

真核細胞を使用する場合、 動物細胞、 植物細胞、 真菌細胞を用い る産生系がある。 動物細胞と しては、 （1) 哺乳類細胞、 例えば、 CH 0， COS, ミ エローマ、 BHK (baby hamster kidney ) ， HeLa, Vero ， (2) 両生類細胞、 例えば、 アフ リ カ ッメ ガエル卵母細胞、 あるい は（3) 昆虫細胞、 例えば、 sf9， sf21， Tn5などが知られている。 植 物細胞と しては、 ニコティ アナ （Nicotiana)属、 例えばニコティ ア ナ ' タバカム （Nicotiana tabacum)由来の細胞が知られており、 こ れをカルス培養すればよい。 真菌細胞と しては、 酵母、 例えば、 サ ッ カ ロ ミ セス （ Saccharomyces ) 属、 伊 ijえばサ ッ カ ロ ミ セス ' セ レ ピシェ ( Saccharomyces serevisiae) 、 糸 4犬菌、 伊 jえ（ま、、 ァスぺノレ ギルス （Aspergillus ) 属、 例えばアスペスギルス ' ニガ一 （Aspe rgi 1 lus niger ) などが知られている。

原核細胞を使用する場合、 細菌細胞を用いる産生系がある。 細菌 細胞と しては、 大腸菌 （E. coli ) 、 枯草菌が知られている。

これらの細胞に、 目的とする抗体遺伝子を形質転換によ り導入し 、 形質転換された細胞を in vitroで培養するこ とにより抗体が得ら れる。 培養は、 公知の方法に従い行う。 例えば、 培養液と して、 DM EM, MEM, RPMU640 、 IMDMを使用するこ とができ、 牛胎児血清 （FC S ) 等の血清補液を併用するこ と もできる。 また、 抗体遺伝子を導 入した細胞を動物の腹腔等へ移すことにより、 in vivo にて抗体を 産生してもよい。

一方、 in vivo の産生系と しては、 動物を使用する産生系や植物 を使用する産生系が挙げられる。 動物を使用する場合、 哺乳類動物 、 昆虫を用いる産生系がある。

哺乳類動物と しては、 ャギ、 ブタ、 ヒッジ、 マウス、 ゥ シなどを 用いるこ とができる （Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Appl ication, 1993) 。 また、 昆虫と しては、 カイ コを用いる こ とができ る。

植物を使用する場合、 タバコを用いることができる。

これらの動物または植物に抗体遺伝子を導入し、 動物または植物 の体内で抗体を産生させ、 回収する。 例えば、 抗体遺伝子をャギ 3 カゼィ ンのよ うな乳汁中に固有に産生される蛋白質をコ一 ドする遺 伝子の途中に挿入して融合遺伝子と して調製する。 抗体遺伝子が揷 入された融合遺伝子を含む DNA 断片をャギの胚へ注入し、 この胚を 雌のャギへ導入する。 胚を受容したャギから生まれる ト ラ ンスジェ ' ニッ クャギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。 ト ラ ンスジエニッ クャギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を 増加させるために、 適宜ホルモンを トラ ンスジヱニッ クャギに使用 してもよい （Ebert, K. M. et al. , Bio/Technology (1994) 12, 69 9-702 ) 。

また、 カイ コを用いる場合、 目的の抗体遺伝子を挿入したバキュ ロウ ィ ルスをカイ コに感染させ、 このカイ コの体液より所望の抗体 を得る （Susumu, M. et al. , Nature(1985)315, 592-594) 。 さ らに 、 タバコを用いる場合、 目的の抗体遺伝子を植物発現用ベク ター、 例えば p M〇 N 5 3 0 に揷入し、 このべク タ一をァグロノくクテ リ ウ ム * ッメ フ ァ シエンス (Agrobacterium tumefaciensリのよ う なノくク テリ アに導入する。 このバクテ リ アをタバコ、 例えばニコチニァ · タバカム （Nicotiana tabacum)に感染させ、 本タバコの葉よ り所望 の抗体を得る （Julian, Κ· Ma et al. , Eur. J. Immunol. (1994)24 ， 13卜 138)。

上述のよう に in vitroまたは in vivo の産生系にて抗体を産生す る場合、 抗体重鎖 （H 鎖） または軽鎖 （L 鎖） をコ一 ドする DNA を 別々 に発現べク タ一に組み込んで宿主を同時形質転換させてもよい し、 あるいは H 鎖およびし 鎖をコ一 ドする DNA を単一の発現べク タ —に組み込んで、 宿主を形質転換させてもよい （国際特許出願公開 番号 W0 94-11523 参照） 。

上述のよう に得られた抗体は、 ポ リ エチレングリ コール （ PEG ) 等の各種分子と結合させ抗体修飾物と して使用する こ と もできる。 本願特許請求の範囲でいう 「抗体」 にはこれらの抗体修飾物も包含 される。 このような抗体修飾物を得るには、 得られた抗体に化学的 な修飾を施すこ とによ って得るこ とができる。 これらの方法はこの 分野においてすでに確立されている。 2. 抗体の分離、 精製

2-1. 抗体の分離、 精製

前記のよ うに産生、 発現された抗体は、 細胞内外、 宿主から分離 し均一にまで精製するこ とができる。 本発明で使用される抗体の分 離、 精製はァフ ィ 二ティ 一ク ロマ ト グラフ ィ 一により行う こ とがで きる。 ァフ ィ 二ティ 一ク ロマ ト グラフ ィ 一に用いるカラムと しては

、 例えば、 プロテイ ン A カラム、 プロテイ ン G カラムが挙げられる 。 プロテイ ン A カラムに用いる担体と して、 例えば、 Hyper D， POR OS, Sepharose F. F.等が挙げられる。

その他、 通常のタ ンパク質で使用されている分離、 精製方法を使 用すればよ く 、 何ら限定される ものではない。 例えば、 上記ァフ ィ 二ティ ーク ロマ トグラ フ ィ ー以外のク ロマ トグラフ ィ ー、 フ ィ ノレタ ―、 限外濾過、 塩析、 透析等を適宜選択、 組み合わせれば、 本発明 で使用される抗体を分離、 精製するこ とができる。 ク ロマ ト グラフ ィ 一と しては、 例えば、 イオン交換ク ロマ トグラフ ィ ー、 疎水ク ロ マ ト グラフ ィ ー、 ゲルろ過等が挙げられる。 これらのク ロマ ト グラ フ ィ 一は HPLCに適用するこ とができる。 また、 逆相 HPLCを用いる こ とができる。

2-2. 抗体の濃度測定

2-1 で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定または ELISA 等に より行う こ とができる。 すなわち、 吸光度の測定による場合には、 本発明で使用される抗体又は抗体を含むサ ンプルを PBS (-)で適当に 希釈した後、 280 nmの吸光度を測定し、 1 mg/ml を 1.35 0D と して 算出する。 また、 ELISA による場合は以下のよう に測定する こ とが できる。 すなわち、 0.1M重炭酸緩衝液 （pH9.6 ) で 1 〃 g/mlに希釈 したャギ抗ヒ ト IgG (BIO SOURCE製） 100 1 を 96穴プレー ト （Nu nc製） に加え、 4 °Cで一晩イ ンキュベー シ ョ ン し、 抗体を固層化す る。

ブロ ッキングの後、 適宜希釈した本発明で使用される抗体または 抗体を含むサンプル、 あるいは標品と してヒ ト IgG (CAPPEL製） 10 0 n 1 を添加し、 室温にて 1 時間ィ ンキュベーシ ョ ンする。 洗浄後 、 5000倍希釈したアルカ リ フ ォ スフ ァ タ一ゼ標識抗ヒ ト IgG (BIO SOURCE製） 100 1 を加え、 室温にて 1 時間イ ンキュベー トする。 洗浄後、 基質溶液を加えィ ンキュベ一シ ョ ンの後、 MICROPLATE REA DER Model 3550 (Bio-Rad 製） を用いて 405nm での吸光度を測定し 、 目的の抗体の濃度を算出する。

3. FCM 解析

リ ンパ球系腫瘍と本発明で使用される抗体との反応性は、 FCM ( フローサイ トメ ト リ 一） 解析で行う こ とができる。 細胞と しては、 樹立細胞株あるいは新鮮分離細胞を用いる こ とができる。 例えば樹 立細胞株と して、 T細胞株である RPMI 8402 (ATCC CRL-1994 ) 、 急性リ ンパ芽球性白血病由来 CCRF CEM (ATCC CCL-119) 、 急性リ ン パ性白血病由来 HPB- ALL (FCCH1018) 、 T リ ンパ腫由来 HPB-MLT ( FCCH1019) 、 急性リ ンパ性白血病由来 JM (FCCH1023) 、 急性リ ンパ 芽球性白血病由来 M0LT- 4 (ATCC CRL-1582 ) 、 急性リ ンパ性白血病 由来 Jurkat (FCCH1024) 、 急性リ ンパ芽球性白血病由来 CCRF- HSB 2 (ATCC CCL-120.1) 、 成人 T 細胞白血病由来 MT 1 (FCCH1043) 、 レ ンネル ト リ ンパ腫由来 KT- 3 (Shimizu, S. et al. , Blood ( 1988)71, 196- 203)などを、 また、 B細胞株と して EBウ ィ ルス形質転換細胞 CE SS (ATCC TIB- 190) 、 EBウ ィ ルス陽性 B 細胞 SKW 6, 4 (ATCC TIB- 2 15) 、 B リ ンパ腫由来 MCI 16 (ATCC CRL-1649 ) 、 急性リ ンパ芽球 性白血病由来 CCRF-SB (ATCC CCL-120) 、 急性骨髄性白血病患者由 来 B 細胞 RPMI 6410 (FCCH6047) 、 Burki tt リ ンパ腫由来 Daudi ( ATCC CCL-213) 、 Burki tt リ ンパ腫由来 EB- 3 (ATCC CCL-85 ) 、 Bu rkitt リ ンパ腫由来 Jijoye (ATCC CCL-87 ) 、 Burki tt リ ンパ腫由 来 Raji (ATCC CCL-86 ) などを、 さ らに非 T非 B細胞株と して急性 骨髄性白血病由来 ί - 60 (ATCC CCL-240) 、 急性単球性白血病由来 THP-1 (ATCC TIB- 202) 、 組織球性リ ンパ腫由来 U- 937 (ATCC CRL -1593 ) 、 慢性骨髄性白血病由来 K-562 (ATCC CCL-243) などを用 いる こ とができる。

上記細胞を PBS (-)で洗浄した後、 FACS 緩衝液 （2 %ゥ シ胎児血 清、 0.1 %アジ化ナ ト リ ウム含有 PBS(- )) で 25〃 g/mlに希釈した抗 体あるいはコ ン ト ロール抗体 100 / 1 を加え、 氷温化 30分イ ンキュ ペー トする。 FACS緩衝液で洗浄した後、 25 g/mlの FITC標識ャギ抗 マウス抗体 （GAM, Becton Dickinson 製） 100 fi 1 を加え、 氷温化 30分間イ ンキュベー トする。 FACS緩衝液で洗浄した後、 600 /Z 1 あ るいは 1 mlの FACS緩衝液に懸濁し、 FACScan (Becton Dickinson製 ) で各細胞の蛍光強度を測定すればよい。

各細胞の蛍光強度の測定値から、 本発明で使用される抗体と各細 胞の反応性を知る こ とができる。 すなわち、 各細胞の蛍光強度の測 定値から、 各細胞に HM1.24抗原が発現しているか否か （陽性か陰性 力、） 及び発現の強度を知るこ とができる。 リ ンパ球系腫瘍細胞にお ける HM1.24抗原の発現の有無および発現強度については、 後述の実 施例 2.2. FCM 解析に記載されている。

本発明の治療対象となる リ ンパ球系腫瘍の腫瘍細胞は、 HM1.24抗 原を発現している。 より詳し く は、 リ ンパ球系腫瘍の腫瘍細胞は、 HM1.24抗原陽性のパーセンテ一ジが 5 %未満ではない腫瘍細胞が好 ま しい。 より詳し く は、 リ ンパ球系腫瘍の腫瘍細胞は、 HM1.24抗原 陽性のパーセンテージが 20%以上である腫瘍細胞が好ま しい。 より 詳し く は、 リ ンパ球系腫瘍の腫瘍細胞は、 HM1.24抗原陽性のパ一セ ンテ一ジが 50%以上である腫瘍細胞が好ま しい。 より詳し く は、 リ ンパ球系腫瘍の腫瘍細胞は、 HM1.24抗原陽性のパーセ ンテージが 80 %以上である腫瘍細胞が好ま しい。

4. 細胞障害活性

4-1. CDC 活性の測定

本発明に使用される抗体は、 細胞障害活性と して、 例えば、 C D C活性を有する抗体である。

本発明の リ ンパ球系腫瘍治療剤の リ ンパ球系腫瘍に対する CDC 活 性は、 次のよう にして測定する こ とができる。 まず標的細胞を適当 な培地、 例えば 10% ゥ シ胎児血清 （GIBC0 BRL 製） 含有 RPMI 1640 培地 （GIBC0- BRL 製） で 4 x 10⁵ 個/ ml になるよう に調製する。 標 的細胞と しては CCRF- CEM (ATCC CCL-119) ， CCRF-HSB-2 (ATCC CCL -120.1) 、 HPB-MLT (FCCH1019) ， EB 3 (ATCC CCL-85 ) , MC116

(ATCC CRL-1649 ) ， CCRF- SB (ATCC CCL-120) ， K- 562 (ATCC C Cい 243) などを用いる こ とができる。 これら細胞を 96穴平底プレー ト （FALCON製） に 50 l 加え、 37°CC0₂ イ ンキュベータ一中でー晚 培養する。

次いで、 CDC 活性を測定する抗体を加え、 60分間イ ンキュベー ト した後、 適当に希釈した補体、 例えば Baby Rabbi t Complement (CE DARLANE 製） を加え、 2 時間イ ンキュベー トする。 これに Alamar B ule (BIO SOURCE製） を各穴に 10〃 1 加え、 4 時間イ ンキュベー ト した後、 各穴の蛍光強度 （励起波長 530 nm、 検出波長 590 nm) を蛍 光測定システム CytoFluor 2350 (MILLIP0RE 製） で測定する。 細胞 障害活性 （％) は、 （A- C ) I (B-C ) X 100 で計算するこ とがで きる。 なお、 A は抗体存在下でイ ンキュベー ト したと きの蛍光強度 、 B は抗体を含まず培養液のみでイ ンキュベー ト したときの蛍光強 度、 C は細胞を含まない穴の蛍光強度である。

4-2. ADCC活性の測定 — 本発明に使用される抗体は、 細胞障害活性と して、 例えば、 A D C C活性を有する抗体である。

本発明のリ ンパ球系腫瘍治療剤のリ ンパ球系腫瘍に対する ADCC活 性は、 次のよう にして測定するこ とができる。 まず、 ヒ 卜の末梢血 や骨髄より比重遠心法で単核球分離し、 エフ ェ ク ター細胞と して調 製する。 また、 標的細胞と しては CCRF-CEM (ATCC CCL-119) ， CC F -HSB-2 (ATCC CCL-120.1) 、 HPB-MLT (FCCH1019) ， EB-3 (ATCC C CL-85 ) ， MC116 (ATCC CRL-1649 ) ， CCRF-SB (ATCC CCL-120) ， K-562 (ATCC CCL-243) などを ^{5 1} Crにより標識して、 標的細胞と して調製する。 次いで、 標識した標的細胞に ADCC活性を測定する抗 体を加えイ ンキュベー ト し、 その後、 標的細胞に対し適切な比のェ フ エ ク タ一細胞を加えィ ンキュベー 卜する。

イ ンキュベー ト した後上清を取り、 ガンマカウ ンタ一で放射活性 を測定する。 その際、 最大遊離放射能測定用に、 1 %の NP-40 を用 いるこ とができる。 細胞障害活性 （％) は、 （A - C ) I (B-C ) X 100 で計算する こ とができる。 なお、 A は抗体存在下において遊離 された放射活性 （cpm ) 、 B は NP-40 によ り遊離された放射活性 （ cpm ) 、 C は抗体を含まず培養液のみで遊離された放射活性 （cpm ) である。

4-3. 細胞障害活性の増強

ADCC活性や CDC 活性のような細胞障害活性を発揮するには、 ヒ ト においては抗体定常領域 （ C領域） と して C ァ、 特に C ァ 1 、 C r 3 を使用する こ とが好ま しい。 さ らに、 抗体 C領域のァ ミ ノ酸を一 部付加、 改変、 修飾する こ とにより、 より強力な ADCC活性、 あるい は CDC 活性を誘導する こ とができる。

例えば、 ァ ミ ノ酸置換による IgG の IgM 様ポ リ マー化 （Smith, R . I. F. & Morrison, S. L. B 10/TECHN0L0GY(1994) 12, 683-688) , ア ミ ノ酸付加による IgG の IgM 様ポ リ マー化 （Smith, R. I. F. et al. ， J. Immunology (1995) 154, 2226-2236 ) 、 L鎖をコ— ドする遺伝子の直列連結での発現 （Shuford, W. et al. , Science (1991) 252, 724-727 ) 、 ア ミ ノ酸置換による IgG の二量体化 （Ca ron, P. C. et al. , J. Exp. Med. (1992) 176, 1191 1195， Shope s， B. , J. Immunology (1992) 148， 2918-2922) 、 化学修飾による IgG の二量体化 （Wolff, E. A. et al. , Cancer Res. (1993) 53， 2560-2565 ) 、 および抗体ヒ ンジ領域のア ミ ノ酸改変によるエフ ヱ ク タ一機能の導入 （Norderhaug, L. et al. , Eur. J. Immunol. (1 991) 21， 2379 2384) が挙げられる。 これらは、 プライマ一を利用 したオリ ゴマー部位特異的変異導入法、 制限酵素切断部位を利用 し た塩基配列の付加、 共有結合をもたらす化学修飾剤を使用するこ と によって達成される。

5. 治療効果の確認

本発明の リ ンパ球系腫瘍治療剤の治療効果を確認するには、 本発 明で使用される抗体をリ ンパ球系腫瘍細胞を移植した動物に投与し 、 抗腫瘍効果を評価する こ とにより行う こ とができる。

動物に移植する リ ンパ球形腫瘍細胞と しては、 樹立細胞株あるい は新鮮分離細胞を用いる こ とができる。 例えば樹立細胞株と して、 T細胞株である CCRF-CEM (ATCC CCい 119) ， HPB-MLT (FCCH1019) ， MOLT- 4 (ATCC CRい 1582 ) ， CCRF-HSB- 2 (ATCC CCL-120.1) など を、 また、 B細胞株と して CESS (ATCC TIB 190) ， SKW 6.4 (ATCC

TIB-215) ， CCRF-SB (ATCC CCL-120) ， RPMI 6410 (FCCH6047) ， EB-3 (ATCC CCL-85 ) などを用いるこ とができる。

また、 移植される動物と しては、 免疫機能が低下または欠失した 動物が好ま し く、 例えば、 ヌ 一 ドマウ ス、 SCIDマウ ス、 ベー ジュマ ウス、 ヌ 一 ドラ ッ トなどを用いるこ とができる。 評価する抗腫瘍効 ' 果の確認は、 腫瘍体積 · 重量の測定や動物の生存期間などにより行 う こ とができる。

後述の実施例に示されるよう に、 抗 HM 1 . 24抗体の投与によ り ヒ ト リ ンパ球系腫瘍移植マウスにおいて、 腫瘍体積の増加が抑制され、 さ らに腫瘍移植マウスの生存期間の延長が認められた。 これらのこ とから、 抗 HM 1. 24抗体はリ ンパ球系腫瘍に対し抗腫瘍効果を有する こ とが示された。

6. 投与経路および製剤

本発明のリ ンパ球系腫瘍治療剤は、 非経口的に全身あるいは局所 的に投与するこ とができる。 例えば、 点滴などの静脈内注射、 筋肉 内注射、 腹腔内注射、 皮下注射を選択するこ とができ、 患者の年齢 、 症状により適宜投与方法を選択するこ とができる。 有効投与量は 、 一回につき体重 1 Kgあたり 0. 0 1 mg から 1 00 mgの範囲で選ばれる 。 あるいは、 患者あたり 1 - 1 000 mg 、 好ま し く は 5 - 50 mg の投与量 を選ぶこ とができる。

本発明の リ ンパ球系腫瘍治療剤は、 投与経路次第で医薬的に許容 される担体や添加物を共に含むものであってもよい。 このよ う な担 体および添加物の例と して、 水、 医薬的に許容される有機溶媒、 コ ラ ーゲン、 ポ リ ビニルアルコ ール、 ポ リ ビニルピロ リ ド ン、 カルボ キシ ビ二ルポ リ マ一、 カルボキシメ チルセル口一スナ ト リ ウ ム、 ポ リ ア ク リ ル酸ナ ト リ ウム、 アルギン酸ナ ト リ ウム、 水溶性デキス ト ラ ン、 カルボキシメ チルスタ ーチナ ト リ ウ ム、 ぺク チ ン、 メ チルセ ルロース、 ェチルセルロース、 キサンタ ンガム、 アラ ビア ゴム、 力 ゼイ ン、 ゼラ チン、 寒天、 ジグ リ セ リ ン、 プロ ピ レ ング リ コ ール、 ポ リ エチ レ ング リ コール、 ワセ リ ン、 ラ フ ィ ン、 ステア リ ノレアル コール、 ステア リ ン酸、 ヒ ト血清アルブ ミ ン （H SA ) 、 マ ンニ ト ー ル、 ソルビ ト ール、 ラ ク ト ース、 医薬添加物と して許容される界面 '活性剤などが挙げられる。 使用される添加物は、 剤型に応じて上記 の中から適宜あるいは組合せて選択される力く、 これらに限定される ものではない。

本発明の治療対象疾患と しては、 標的とする腫瘍細胞上に本発明 で使用される抗体が結合する抗原が存在する、 骨髄腫を除く リ ンパ 球系腫瘍である。 具体的には、 急性 B リ ンパ性白血病 （B- ALL ) 、 慢性 B リ ンパ性白血病 （B-CLL ) 、 pre-B リ ンパ腫、 BurkUt リ ン パ腫、 濾胞性リ ンパ腫、 濾胞外套リ ンパ腫、 びまん性リ ンパ腫、 急 性 T リ ンパ性白血病 （T-ALL ) 、 慢性 T リ ンパ性白血病 （T CLL ) 、 成人 T細胞白血病 （ATL ) 、 非 ATL 末梢性 T リ ンパ腫 （PN ) 等 が挙げられる。 本発明の治療剤は、 これら リ ンパ球系腫瘍の治療剤 と して有用である。 実施例

次に、 本発明を実施例により さ らに具体的に説明するが、 本発明 はこれら実施例に限定される ものではない。

実施例 1. 抗題 1.24抗体の作製

1. 抗 HM1.24抗体を含むマウス腹水の調製

抗 HM1.24抗体産生ハイプリ ド一マを Goto, T らの方法 （Blood (1 994) 84. 1922-1930) に従い得た。

あらかじめ 11， 3 日前に 2， 6， 10， 14-テ トラメ チルペンタデカ ン （ 和光純薬工業製） をそれぞれ 500 a 1 ずつ腹腔内に投与した BALB/c マウス （曰本ク レア製） に、 本ハイプリ ドーマ 5 X 10⁶ 個を腹腔内 に注入した。 ハイプリ ドーマ注入後 10日 目よ り、 マウスの腹腔内に 溜った腹水を 19ゲージの留置針ハッ ピーキャス （メ ディ キッ ト製） で採取した。 採取した腹水は、 低速遠心機 RLX- 131 ( ト ミ 一精ェ製 ) を用いて回転数 1000， 3000 rpmで 2 回遠心し、 ハイブリ ドーマ、 血球等の雑排物を除去した。

2. マウス腹水からの抗 HM1.24抗体の精製

上記マウス腹水からの抗 HM1.24抗体の精製は以下の方法で行つた 。 マウス腹水に等量の PBS (-)を加えた後、 中空糸フ ィ ルタ一メ ディ アブレップ （MILLIPORE 製） を用いてろ過した後、 高速抗体精製装 置 ConSep LC100 (MILLIPORE 製） および Hyper D Protein A カラム (カラム体積 20 ml、 日本ガイ シ製） を用い、 付属の説明書に基づ き吸着緩衝液と して PBS( -)、 溶出緩衝液と して 0.1 M クェン酸ナ ト リ ウム緩衝液 （pH 4) を用いてァフ ィ 二ティ 一精製した。 溶出画分 は直ちに 1 M Tris-HCl ( H 8.0) を添加して pH7.4 付近に調整した 後、 遠心限外濃縮器 Centriprep 10 を用いて濃縮および PBS (-)への 緩衝液置換を行い、 孔径 0.22// m のメ ンブラ ンフ ィ ルタ一MILLEX - G V (MILLIPORE 製） でろ過滅菌し、 精製抗 HM1.24抗体を得た。

3. 抗体濃度の測定

精製抗体の濃度測定は吸光度の測定により行った。 すなわち、 精 製抗体を PBS (-)で希釈した後、 280 nmの吸光度を測定し、 1 mg/ml を 1.35 0D と して算出 した。

実施例 2. 抗 HM1.24抗体の リ ンパ球系腫瘍細胞に対する反応性の検

1. コ ン ト ロールマウス IgG2a の精製

コ ン ト ロールマウス IgG2a の精製は以下の方法で行つた。 市販の mouse IgG2a(KAPPA)(UPC 10) ascites (CAPPEL製） を精製水および PBS (-)で溶解した。 これを孔径 0.2 m のメ ンブラ ンフ ィ ルター Ac rodisc (Gelman Sciences 製） を用いてろ過した後、 高速抗体精製 装置 ConSep LC100 (MILLIPORE 製） および Hyper D Protein A カラ ム （カラム体積 20 ml、 日本ガイ シ製） を用い、 付属の説明書に基 づき吸着緩衝液と して PBS( -)、 溶出緩衝液と して 0.1 M クェン酸ナ ' ト リ ウム緩衝液 （pH 4) を用いてァフ ィ 二ティ ー精製した。

溶出画分は直ちに 1 M Tris-HCl (pH 8.0) を添加して pH7.4 付近 に調整した後、 遠心限外濃縮器 Centriprep 10 を用いて濃縮および PBS (-)への緩衝液置換を行い、 孔径 0.22 /m のメ ンブラ ンフ ィ ルタ -MILLEX-GV (MILLIPORE 製） でろ過滅菌し精製コ ン ト ロ ールマウ ス IgG2a を得た。

精製コ ン ト ロ ールマウス IgG2a の濃度測定は、 上記 3 の抗体濃度 の測定に従った。

2. FCM 解析

抗 HM1.24抗体の リ ンパ球系腫瘍細胞に対する反応性の検討は、 FC (フ ローサイ トメ ト リ' 一） 解析で行つた。 T細胞株である RPMI 8 402 (ATCC CRL-1995 ) 、 急性リ ンパ芽球性白血病由来 CCRF-CEM ( ATCC CCL-119) 、 急性リ ンパ性白血病由来 HPB- ALL (FCCH1018) 、 T リ ンパ腫由来 HPB- MLT (FCCH1019) 、 急性リ ンパ性白血病由来 JM (FCCH1023) 、 急性リ ンパ芽球性白血病由来 MOLT- 4 (ATCC CRL-158 2 ) 、 急性リ ンパ性白血病由来 Jurkat (FCCH1024) 、 急性リ ンパ芽 球性白血病由来 CCRF-HSB- 2 (ATCC CCL-120.1) 、 成人 T 細胞白血病 由来 MT 1 (FCCH1043) 、 レ ンネル ト リ ンパ腫由来 KT- 3 ( Sh i mi zu， S . et al. , Blood ( 1988)71， 196- 203)を、

また、 B細胞株と して EBウ イ ルス形質転換細胞 CESS (ATCC TIB-1 90) 、 EBウ ィ ルス陽性 B 細胞 SKW 6.4 (ATCC TIB 215) 、 B リ ンパ 腫由来 MCI 16 (ATCC CRL-1649 ) 、 急性リ ンパ芽球性白血病由来 CC RF-SB (ATCC CCL-120) 、 急性骨髄性白血病患者由来 B 細胞 RPMI 6 410 (FCCH6047) 、 Burkitt リ ンパ腫由来 Daudi (ATCC CCい 213) 、 Burkitt リ ンパ腫由来 EB- 3 (ATCC CCい 85 ) 、 Burkitt リ ンパ腫 由来 Jijoye (ATCC CCい 87 ) 、 Burkitt リ ンパ腫由来 Raji (ATCC C CL-86 ) を、 さ らに非 T非 B細胞株と して急性骨髄性白血病由来 HL -60 (ATCC CCL-240) 、 急性単球性白血病由来 THP-1 (ATCC TIB- 2 02) 、 組織球性リ ンパ腫由来 U-937 (ATCC CRL-1593 ) 、 慢性骨髄 性白血病由来 K- 562 (ATCC CCい 243) を PBS ( )で洗浄した後、 FAC S 緩衝液 （2 %ゥ シ胎児血清、 0. 1 %アジ化ナ ト リ ウム含有 PBS (- ) ) で 25〃 g/mlに希釈した抗 HM1.24抗体あるいは精製コ ン ト ロール マウス IgG2a 100 1 を加え、 氷温化 30分ィ ンキュベ一 ト した。

FACS緩衝液で清浄した後、 25 z g /ml の F ITC標識ャギ抗マウス抗 体（GAM) 100 a 1 を加え、 氷温化 30分間イ ンキュベー ト した。 FACS 緩衝液で洗浄した後、 600 pi 1 あるいは 1 mlの FACS緩衝液に懸濁し 、 FACScan (Becton Deckinson社製） で各細胞の蛍光強度を測定し た。 その結果、 図 1 〜23に示すように、 T 細胞株では全例で、 また B 細胞株で Daudi, Raji の 2 種類で反応しないもののその他全てで 抗 HM1.24抗体と反応し、 HM1.24抗原を高発現しているこ とが確認さ れた。 一方、 非 T 非 B 細胞株では全例で抗 HM1.24抗体と反応せず、 抗原の発現を検出できなかった。

また、 図 1 〜23の各細胞のヒス トグラムにおいて、 コ ン ト ロール マウス IgG2a を用いた染色で陰性細胞が 98%、 陽性細胞が 2 %とな るよう にヒス ト グラムマーカ一を設定し、 そのヒス ト グラムマ一力 —に従つて抗 HM1.24抗体を用いたときの圆 1.24抗原陽性の細胞のパ —センテ一ジを算出 したものが表 1 である。 HM1.24抗原陽性細胞の ノ、。—センテ一ジにより HM1.24抗原発現率を一、 +/—、 +、 + +、 + + +の 5段階に区別した結果、 図 1 〜23と同様 T細胞株では全例 で、 また B細胞株でも Daudi 、 Raj iを除く 全てで + +あるいは + + +と非常に HM1.24抗原を高発現している こ とが確認された。 また、 非 T非 B細胞株では全例で HM1.24抗原陽性細胞が 5 %未満の であ り、 抗原の発現が無いか、 あるいは非常に少ないこ とが示された。 細胞名 発現率

B細胞株 CESS + + + 94. 5

SKW 6.4 + + + 92. 8

MC116 + + 65. 0

CCRF-SB + + + 98. 4

RPMI 6410 + + + 94. 5

EB-3 + + + 88. 3

J i j oye + + + 92. 3

Daud i ― 2. 8

Raj i 2. 0

T細胞株

非 Τ非 Β細胞株

THP-1 1. 5

U-937 1. 1

K-562 3. 9

-, < 5 % ； +/-, 5-20% ； +， 20-50% ； + + , 50-80% ； + + +， > 80% 実施例 3. CDC 活性の測定

抗 HM1.24抗体の、 リ ンパ球系腫瘍細胞に対する CDC 活性は、 以下 のよう に して測定した。

1. 標的細胞の調製

標的細胞と して急性リ ンパ性白血病由来 CCRF-CEM (ATCC CCL-119 ) 、 急性リ ンパ芽球性白血病由来 CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1) 、 T リ ンパ腫由来 ΗΡΒ MLT (FCCH1019) 、 Burki tt リ ンパ腫由来 EB- 3 (ATCC CCL-85 ) 、 B リ ンパ腫由来 116 (ATCC CRL-1649 ) 、 急性 リ ンパ性白血病由来 CCRF-SB (ATCC CCL-120) 、 慢性骨髄性白血病 由来 K562 (ATCC CCい 243) を、 10% ゥ シ胎児血清 （GIBCO- BRL 製） 含有 RPMI 1640 培地 (GIBC0-BRL 製） で 4 x 10⁵ 個/ ml になるよ う に調製した。 これら細胞懸濁液を 96穴平底プレー ト （FALCON製） に 50 1 加え、 37°C、 5 %C0₂ 高湿イ ンキュベータ一 （TABAI 製） 中 で一晩培養した。

2. 抗 HM1.24抗体の調製

前記実施例 1 で得られた精製抗 HM1.24抗体を、 10% ゥ シ胎児血清 (GIBC0-BRL 製） 含有 RPMI 1640 培地 （GIBCO- BRL 製） で 0， 0.2， 2， 20 g/mlに調製し、 上記 1 で作製した 96穴平底プレー 卜の各穴 に 50// 1 ずつ加えた。 37° ( 、 5 %C0₂ 高湿イ ンキュベータ一 （TABA I 製） 中で 60分間ィ ンキュベ一 ト した後、 低速遠心機 05PR- 22 (日 立製） を用いて、 1000 rpm、 5 分間遠心し、 上清 50 1 を除去した

3. 補体の調製

Baby Rabbit Complement (CEDARLANE 製） を 1 バイアルあたり 1 mlの精製水で溶解し、 さ らに FCS 不含 RPMI 1640 培地 （GIBCO- BRL 製） 5 mlで希釈した。 これを上記 2 の 96穴平底プレー 卜の各穴に 50 U 1 添加し、 37°C、 5 %C0₂ 高湿イ ンキュベータ一 （TABAI 製） 中 で 2 時間ィ ンキュベー ト した。

4. CDC 活性の測定

ィ ンキュベ一 ト後、 上記 3 の 96穴平底プレー 卜の各穴に Alamar B ule (BIO SOURCE製） を 10〃 I ずつ加え、 37°C、 5 %C0, 高湿イ ン キュベ一ター （TABAI 製） 中で 4 時間イ ンキュベー ト した後、 各穴 の蛍光強度 （励起波長 530 ηπκ 検出波長 590 nm) を蛍光測定システ ム CytoFluor 2350 (MILLIP0RE 製） で測定した。 細胞障害活性 （％ ) は、 （A C ) I (B-C ) X 100 で計算した。 なお、 A は抗体存在 下でイ ンキュベー ト したときの蛍光強度、 B は抗体を含まず培養液 のみでイ ンキュベー ト したときの蛍光強度、 C は細胞を含まない穴 の蛍光強度である。 その結果、 図 24および 25に示すように、 FCM 解析で抗 HM1.24抗体 と反応しなかつた K562は、 抗 HM1.24抗体を添加しても細胞障害が起 きなかったのに対し、 抗 HM1.24抗体と反応する CCRF-CEM, CCRF-HSB - 2， HPB- LT, EB-3, MC116および CCRF- SB では、 添加した抗 HM1.24 抗体の濃度依存的に細胞障害が見られた。 このこ とから、 抗删 1.24 抗体は、 細胞表面に抗 HM1.24抗体が特異的に結合する抗原蛋白質を 有する リ ンパ球系腫瘍に対して、 CDC 活性を示すこ とが明らかとな つた。

実施例 4. 抗 HM1.24抗体のヒ ト リ ンパ球系腫瘍移植マウスに対する 抗腫瘍効果

1. 投与抗体の調製

1-1. 抗 HM1.24抗体の調製

前記実施例 1 で得られた精製抗 HM1.24抗体を、 ろ過滅菌した PBS( -）を用いて 1 mg/ml， 200〃 g/mlに調製し、 以下の実験に用いた。

1- 2. コ ン ト ロールマウ ス IgG2a の調製

前記実施例 2 で得られた精製を、 ろ過滅菌した PBS (-)を用いて 1 mg/ml に調製し、 以下の実験に用いた。

2. 抗 HM1.24抗体のヒ ト リ ンパ球系腫瘍移植マウスに対する抗腫 瘍効果

2- 1. ヒ ト リ ンパ球系腫瘍移植マウスの作製

ヒ ト リ ンパ球系腫瘍移植マウスは以下のよう に作製した。 SCIDマ ウ ス （日本ク レア） を用いて in vivo 継代した急性リ ンパ芽球性白 血病由来 CCRF- HSB-2細胞 （ATCC CCL 120.1) を、 10% ゥ シ胎児血清 (GIBC0-BRL 製） を含む RPMI 1640 培地で 1 x 10⁸ 個/ ml になるよ う に調製した。 あらかじめ前日抗ァシァロ GM1 (和光純薬工業製） 100 II 1 を腹腔内投与した SC IDマウス （ォス、 6 週令） （日本ク レ ァ） の腹部皮下に、 上記で調製した細胞懸濁液を注入した。 2-2. 抗体投与

腫瘍移植後 7 日目に上記ヒ ト リ ンパ球系腫瘍移植マウスの CCRF - H SB- 2移植部位の腫瘍径をノ ギスを用いて測定し、 腫瘍体積を算出し た後、 各群の腫瘍体積の平均がほぼ等し く なるよう に群分けを行つ た （各群 8 匹、 3 群） 。 同日より上記 1 で調製した 1 mg/ml または 200 g/mlの抗 HM1.24抗体、 あるいは 1 mg/ml のコ ン ト ロールマウ ス lgG2a それぞれ 100 1 を各群に腹腔内投与した。 投与は週 2 回 、 合計 19回同様に行った。 この間、 週 2 回ノ ギスを用いて腫瘍径を 測定し腫瘍体積を算出 した。

2-3. 抗 HM1.24抗体のヒ ト リ ンパ球系腫瘍移植マウ スに対する抗 腫瘍効果の評価

抗 HM1.24抗体の抗腫瘍効果については、 腫瘍体積の変化およびマ ウスの生存期間で評価した。 その結果、 図 26に示すよ う に抗 HM1.24 抗体投与群は、 コ ン ト ロールマウス IgG2a 抗体投与群に比べ腫瘍体 積の増加が抑制された。 また、 図 27に示すよう に、 抗 HM1.24抗体投 与群は、 コ ン ト ロールマウス IgG2a 抗体投与群に比べマウスの生存 期間の延長が見られた。 これらのこ とから、 抗 HM1.24抗体はヒ ト リ ンパ球系腫瘍移植マウ スに対して抗腫瘍効果を有する こ とが示され o

参考例 1. マゥス抗 HM1.24モノ ク 口一ナル抗体産生ハイプリ ドーマ の調製

Goto, T. et al. , Blood (1994) 84, 1992-1930 に記載の方法に て、 マウス抗 HM1.24モノ ク ロ一ナル抗体産生ハイプリ ドーマを調製 した。

ヒ ト多発性骨髄腫患者骨髄由来の形質細胞株 KPC-32 (lxlO⁷ 個） (Goto, T. et ai. , Jpn. J. Clin. Hematol. (1991) 32, 1400 ) を BALB/Cマウ ス （チ ヤ 一ルス リバ一製） の腹腔内に 6 週間おきに 2 ― 回注射した。

このマウ スを屠殺する 3 日前にマケスの抗体産生価をさ らに上昇 させるために、 1.5 X 10⁶ 個の KPC- 32をマウスの脾臓内に注射した (Goto, T. et al. , Tokushima J. Exp. Med. (1990) 37, 89 ) 。 マウ スを屠殺した後に脾臓を摘出 し、 Groth, de St. Schreidegg erの方法 （Cancer Research (1981) 41 3465 ) に従い摘出 した脾 臓細胞と ミ エ口一マ細胞 SP2/0 を細胞融合に付した。

KPC- 32を用いた Cell ELISA (Posner, M. R. et al. , J. Immunol . Methods (1982) 48, 23 ) によりハイプリ ドーマ培養上清中の抗 体のスク リ ーニングを行った。 5 X 10⁴ 個の KPC-32を 50 ml の PBS に懸濁し、 96穴プレー ト （U 底型、 Corning, Iwaki製） に分注し 37 °Cで一晩風乾した。 1%ゥ シ血清アルブミ ン （BSA ) を含む PBS でブ ロ ッ ク した後、 ハイプリ ドーマ培養上清を加え 4 °Cにて 2 時間イ ン キュべ一 卜 した。 次いで、 4 °Cにて 1 時間ペルォキシダ一ゼ標識抗 マウ ス IgG ャギ抗体 （Zymed 製） を反応させ、 洗浄後室温にて 30分 間 0 フ ヱ二 レ ン ジア ミ ン基質溶液 （Sumi tomo Bakel i te 製） を反応 させた。

2N硫酸で反応を停止させ、 ELISA reader (Bio-Rad 製） で 492nm における吸光度を測定した。 ヒ ト免疫グロプリ ンに対する抗体を産 生するハイプリ ドーマを除去するために、 陽性ハイプリ ドーマ培養 上清をヒ ト血清にあらかじめ吸着させ、 他の細胞株に対する反応性 を EL I SA にてスク リ ーニングした。 陽性のハイプリ ドーマを選択し 、 種々の細胞に対する反応性をフローサイ トメ ト リ ーで調べた。 最 後に選択されたハイプリ ド一マク ロー ンを二度ク ロー ン化し、 これ をプリ スタ ン処理した BALB/Cマゥスの腹腔に注射して、 腹水を取得 し /

モノ ク ローナル抗体は、 硫酸アンモニゥムによる沈澱とプロティ ン A ァフ ィ 二ティ ク ロマ ト グラ フ ィ ーキ ッ ト （ Ampure PA 、 Amersh am製） によりマウ ス腹水より精製した。 精製抗体は、 Quick Tag Fl TC結合キッ ト （ベ一 リ ンガーマ ンハイ ム製） を使用する こ とにより FITC標識した。

その結果、 30のハイ ブ リ ドーマク ロ ー ンが産生するモノ ク ロ一ナ ル抗体が KPC-32および RPMI 8226 と反応した。 ク ロ一ニングの後、 これらのハイプリ ドーマの培養上清と他の細胞株あるいは末梢血単 核球との反応性を調べた。

このう ち、 3 つのク ローンが形質細胞に特異的に反応するモノ ク 口 一ナル抗体であった。 これらの 3 つのク ローンのう ち、 最もフロ —サイ トメ ト リ ー分析に有用であり、 かつ RPMI 8226 に対する CDC 活性を有するハイプリ ドーマク ローンを選択し、 HM1.24と名付けた 。 このハイプリ ドーマが産生するモノ ク ローナル抗体のサブク ラス を、 サブク ラス特異的抗マウスゥサギ抗体 （Zymed 製） を用いた EL ISA にて決定した。 抗 HM1.24抗体は、 IgG2a のサブク ラ スを有し ていた。 抗 HM1.24抗体を産生するハイプリ ドーマ HM1.24は、 工業技 術院生命工学工業研究所 （茨城県つく ば巿東 1 丁目 1 番 3 号） に、 平成 7 年 9 月 14日に FERM BP-5233と してブタぺス ト条約に基づき国 際寄託された。

参考例 2. ヒ ト型化抗 HM1.24抗体の作製

ヒ ト型化抗 HM1.24抗体を下記の方法によ り得た。

参考例 1 で作製されたハイプリ ドーマ HM1.24から、 常法により全 RNA を調製した。 これよりマウス抗体 V 領域をコー ドする cDNAをポ リ メ ラ一ゼ連鎖反応 （PCR ) 法および 5' -RACE 法により、 合成、 増 幅した。 マウ ス V 領域をコー ドする遺伝子を含む DNA 断片を得、 こ れらの DNA 断片を各々 プラス ミ ド pUC 系ク ロ一ニングベク タ一に連 結し、 大腸菌コ ン ビテ ン ト細胞に導入して大腸菌形質転換体を得た - 。 この形質転換体から上記プラス ミ ドを得、 プラス ミ ド中の cDNAコ 一ド領域の塩基配列を常法に従い決定し、 さ らに各々の V 領域の相 補性決定領域 （CDR ) を決定した。

キメ ラ抗 HM1.24抗体を発現するベク ターを作製するため、 それぞ れマウス抗 HM1.24抗体 L 鎖および H 鎖の V 領域をコ一 ドする cDNAを HEF ベク タ一に挿入した。 また、 ヒ ト型化抗 HM1.24抗体を作製する ために、 CDR 移植法によりマウス抗 HM1.24抗体の V 領域 CDR をヒ ト 抗体へ移植した。 ヒ ト抗体の L 鎖と してヒ ト抗体 REI のし 鎖を用い 、 ヒ ト抗体 H 鎖と してフ レームワーク領域 （FR) 1-3 についてはヒ ト抗体 HG3 の FR1- 3 を用い FR4 についてはヒ ト抗体 JH6 の FR4 を用 いた。 CDR を移植した抗体が適切な抗原結合部位を形成するよう に H 鎖 V 領域の FRのァ ミ ノ酸を置換した。

このよう にして作製したヒ ト型化抗 HM1.24抗体の L 鎖および H 鎖 の遺伝子を哺乳類細胞で発現させるために、 HEF ベク タ一に、 各々 の遺伝子を別々 に導入し、 ヒ ト型化抗 HM1.24抗体の L 鎖または H 鎖 を発現するべク タ一を作製した。

これら二つの発現べクタ一を CH0 細胞に同時に導入する こ とによ り、 ヒ ト型化抗 HM1.24抗体を産生する細胞株を樹立した。 この細胞 株を培養して得られたヒ ト型化抗 HM1.24抗体のヒ ト羊膜由来細胞株 WISHへの抗原結合活性および結合阻害活性を、 Cell ELISAにて調べ た。 その結果、 ヒ ト型化抗 HM1.24抗体は、 キメ ラ抗体と同等の抗原 結合活性を有し、 さ らにピオチン化マウス抗 HM1.24抗体を用いた結 合阻害活性についても、 キメ ラ抗体あるいはマウス抗体と同等の活 性を有した。

なお、 キメ ラ抗 HM1.24抗体の L 鎖 V 領域および H 鎖 V 領域をコ一 ドする DNA を含むプラス ミ ドを有する大腸菌は、 各々 Escherichia col i DH5 a (pUC19-l.24L- g / ) および Escher i ch i a col i DH5 a ( - PUC19-1.24H-g ァ 1 ) と して、 工業技術院生命工学工業技術研究所 (茨城県つく ば巿東 1 丁目 1 番 3 号） に、 平成 8 年 8 月 29日に、 各 々 FERM BP- 5646および FERM BP- 5644と してブダぺス ト条約に基づき 国際寄託された。 また、 ヒ ト型化抗 HM1.24抗体の L 鎖 V 領域 a バ一 ジ ョ ン （配列番号 ： 2 ) および H 鎖 V 領域 r バ一ジ ョ ン （配列番号 ： 3 ) をコー ドする DNA を含むプラス ミ ドを有する大腸菌は、 各々 Escherichia col i DH5 a ( pUC19-RVLa-AHM-gk ) および Escher i ch i a col i DH5a ( pUC19 - RVHr- AHM- g ァ 1 ) と して、 工業技術院生命 工学工業技術研究所 （茨城県つく ば巿東 1 丁目 1 番 3 号） に、 平成 8 年 8 月 29日に、 各々 FERM BP-5645および FERM BP-5643と してブダ ぺス ト条約に基づき国際寄託された。 また、 ヒ ト型化抗 HM1.24抗体 の H 鎖 V 領域 s バージ ョ ン （配列番号 ： 4 ) をコー ドする DNA を含 むプラス ミ ドを有する大腸菌は、 Escherichis col i DH5a (pUC19 RVHs-AHM- g ァ 1 ) と して、 工業技術院生命工学工業技術研究所 （ 茨城県つく ば巿東 1 丁目 1 番 3 号） に、 平成 9 年 （1997年） 9 月 29 日に FERM BP- 6127と してブダぺス ト条約に基づき国際寄託された。 ^"例 HM1.24 抗原蛋白質 cDNAのク ロ一ニング

抗 HM1.24抗体が特異的に認識する HM1.24抗原蛋白質をコ一 ドする cDNAをク ロ一ニングした。

1 . cDNA ライブラ リ 一の作製

1 ) 全 RNA の調製

ヒ 卜多発性骨髄腫細胞株 KP圆 2 から、 全 RNA を Chirgwinら （Bioc hemistry, 18， 5294 ( 1979) ) の方法に従って調製した。 すなわち 、 2.2 10⁸ 個の KPMM2 を 20 ml の 4 M グァニジンチオシァネー ト (ナカライテスク製） 中で完全にホモジナイズさせた。

ホモジネ一 卜を遠心管中の 5.3 M 塩化セシウム溶液に重層 し、 次 にこれを Beckman SW40口一夕一中で 31, OOOrpm にて 20°Cで 24時間遠 心分離するこ とにより RNA を沈殿させた。 RNA 沈殿物を 70 %ェタノ —ルにより洗浄し、 そ して 1 mM EDTA 及び 0.5 % SDS を含有する 10 mM Tri s-HCl (pH7.4 ) 300 1 中に溶解し、 それに Pronase (Bo ehringer製） を 0.5 mg/ml となるよう に添加した後、 37°Cにて 30分 間ィ ンキュベ一 卜 した。 混合物をフ ヱ ノ ール及びク ロ 口ホルムで抽 出 し、 RNA をエタノ ールで沈殿させた。 次に、 RNA 沈殿物を ImM ED TAを含有する 10 mM Tris-HCl (pH7.4 ) 200 1 に溶解した。

2 ) poly(A) + RNA の調製

前記のよ うにして調製した全 RNA の約 500 g を材料と して Fast Track 2.0 mRNA Isolation Kit ( I nv i t r ogen製） を用いてキッ 卜 添付の処方に従って poly(A) + RNA を精製した。

3 ) cDNAライブラ リ ーの構築

上記 poly(A) + RNA 10 z g を材料と して cDNA合成キッ 卜 TimeSave r cDNA Synthesis Kit (Pharmacia 製） を用いてキッ 卜添付の処方 に従って二本鎖 cDNA を合成し、 更に Directional Cloning Toolbo x (Pharmacia 製） を用いてキッ ト付属の EcoR Iアダプタ一をキッ 卜添付の処方に従って連結した。 EcoRl アダプタ一の力イネ一シ ョ ン及び制限酵素 Notl 処理はキッ 卜添付の処方に従って行った。 更 に、 約 500 bp 以上の大きさのアダプタ一付加二本鎖 cDNA を 1.5 % 低融点ァガロースゲル （Sigma 製） を用いて分離、 精製し、 ァダ プ夕一付加二本鎖 cDNA 約 40 1 を得た。

このよう にして作製したアダプタ一付加二本鎖 cDNA を、 あらか じめ制限酵素 EcoR I、 No 11及びアルカ リ フ ォスフ ァ タ一ゼ （宝酒造 製） 処理した pCOSlベク タ一 （特願平 8-255196) と T4 DNA リ ガ一 ゼ （GIBC0 - BRL 製） を用いて連結し、 cDNAラィブラ リ 一を構築した 。 構築した cDNA ライブラ リ 一は、 大腸菌細胞株 DH5a (G1BC0-BR L 製） に形質導入され、 全体のサイズは約 2.5 X 10⁶個の独立した ク ロー ンであると推定された。

2 . 直接発現法によるク ローニング

1 ) C0S-7 細胞への ト ラ ンスフ ヱ ク シ ヨ ン

上記の形質導入した大腸菌約 5 X 10⁵ク ロー ンを 50 /z g/mlのァ ン ピシ リ ンを含む 2- YT 培地 （Molecular Cloning: A Laboratory Mannual. Sambrook ら、 Col d Spring Harbor Laboratory Press C 1989) ) にて培養するこ とにより cDNA の増幅を行い、 アルカ リ法 (Molecular Cloning: A Laboratory Mannual. Sambrook ら、 Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1989) ) により大腸菌からプ ラス ミ ド DNAを回収した。 得られたプラス ミ ド DNAは Gene Pulser 装置 （Bio-Rad 製） を用いてエレク ト ロボ レ一シ ヨ ン法により COS - 7細胞に ト ラ ンスフ ヱ ク シ ョ ンした。

すなわち、 精製したプラ ス ミ ド DNA 10 n を 1 X 10⁷細胞/ ml で PBS中に懸濁した C0S-7細胞液 0.8 ml に加え、 1500 V， 25// FD の容量にてパルスを与えた。 室温にて 10分問の回復期間の後、 エレ ク ト ロポレーシヨ ン処理された細胞は、 10 %牛胎児血清 （GIBC0-BR L 製） を含む DMEM培養液 （GIBC0- BRL 製） にて、 37° (：、 5 %(0₂の条 件下で 3 日間培養した。

2 ) ノ、。ンニングディ ッ シュの調製

マウス抗 HM1.24抗体をコ一ティ ングしたパンニングディ ッ シュを 、 B. Seed ら （Pro Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3365-3369 (198 7)) の方法に従って調製した。 すなわち、 マウス抗 HM1.24抗体を 10 g/mlになるように 50 mM Tris-HCl (pH9.5 ) に加えた。 このよ うに して調製した抗体溶液 3 mlを直径 60 mm の細胞培養皿に加え、 室温にて 2 時間イ ンキュベー ト した。 0.15 M NaCl 溶液にて 3 回洗 浄した後、 5%牛胎児血清、 1 mM EDTA 、 0.02 %NaN₃を含む PBS を加 え、 ブロ ッキングした後、 下記ク ローニングに用いた。 3 ) cDNAライブラ リ ーのク ローニング

前述のよう に ト ラ ンスフ ヱ ク ト した COS - 7細胞は、 5 mM EDTA を 含む PBS にて剥がし、 5%牛胎児血清を含む PBS で一回洗浄した後、 約 1 X 10⁶細胞/ mlとなるように 5%牛胎児血清及び 0.02% NaN₃を含 む PBS に懸濁し、 上記のよう に調製したパンニングデイ シュに加え 、 室温にて約 2時間イ ンキュベー ト した。 5 % 牛胎児血清及び 0.02

%NaN₃を含む PBS で 3度緩やかに洗浄した後、 0.6%SDS 及び 10 mM EDTAを含む溶液を用いてパンニングデイ シュに結合した細胞からプ ラ ス ミ ド DNAの回収を行った。

回収したプラ ス ミ ド DNAを再び大腸菌 DH5 に形質導入し、 前述 のよう にプラス ミ ド DNA を增幅後、 アルカ リ法にて回収した。 回収 したプラス ミ ド DNAを COS- 7細胞にエレク ト ロポレーシ ョ ン法によ り トラ ンスフ ヱ ク 卜 して前述と同様に結合した細胞よりプラス ミ ド DNA の回収を行った。 同様の操作を更に 1 回繰り返し、 回収したプ ラ ス ミ ド DNA を制限酵素 EcoRI および Not Iで消化した結果、 約 0.9 kbpのサイズのイ ンサ一 卜の濃縮が確認された。 さ らに、 回収した プラ ス ミ ド DNA の一部を形質導入した大腸菌を 50〃 g/mlのア ンピシ リ ンを含む 2 YTァガ一プレー 卜に接種し、 一晩培養後、 単一のコ ロ 二一よりプラス ミ ド DNA を回収した。 制限酵素 EcoRI および Not Iに て消化し、 イ ンサ一 卜のサイズが約 0.9 kbpを示すク ロー ン p3.19 を得た。

本ク ローンについては、 PRISM, Dye Terminater Cycle Sequenci ngキッ ト （PerkinElmer 製） を用いて、 キッ 卜添付の処方に従い反 応を行い、 ABI 373A DNA Sequencer (Perkin Elmer製） にて塩基配 列の決定を行つた。 この塩基配列および対応するア ミ ノ酸配列を配 列番号 1 に示す。 産業上の利用可能性

FCM 解析の結果、 抗 HM1.24抗体はほとんどのヒ ト リ ンパ球系腫瘍 由来の細胞と強く 反応した。 このこ とは、 リ ンパ球系腫瘍の多く で 、 抗 HM1.24抗体が認識するェピ ト一プを有するポ リべプチ ドが強く 発現している こ とを示す。 また、 抗 HM1.24抗体と反応する ヒ ト リ ン パ球系腫瘍移植マウスにおいて、 抗 HM1.24抗体の投与により腫瘍体 積の増加が抑制され、 さ らに生存期間の延長が認められた。 これら のこ とから、 抗 HI.24 抗体あるいは抗 HM1.24抗体が認識するェピ ト ープを有するポ リべプチ ドを認識する抗体は多く の リ ンパ球系腫瘍 に対し細胞障害活性を示し、 その結果リ ンパ球系腫瘍患者の治療に 対し非常に有用である こ とが示唆される。

特許協力条約第 13規則の 2 の寄託された微生物への言及及び寄託 機関

寄託機関 名 称 ： 工業技術院生命工学工業技術研究所

あて名 ： 日本国茨城県つく ば巿東 1 丁目 1 一 3 微生物（1) 名 称 ： Escherichia col i DH5 a ( pRS38-pUC19) 寄託番号 ： FERM BP- 4434

寄託日 ： 1993年 10月 5 日

(2) 名 称 ： ハィブリ ド一マ HM1.24

寄託番号 ： FERM BP- 5233

寄託日 ： 1995年 9 月 14日

(3) 名 称 ： Escherichia col i DH5« ( UC19-RVHr-AHM- g r 1)

寄託番号 ： FERM BP-5643

寄託日 ： 1996年 8 月 29日

(4) 名 称 ： Escherichia col i DH5a ( pUC19 1· 24H- g r 1) 寄託番号 ： FERM BP-5644

寄託日 ： 1996年 8月 29日

(5) 名 称 ： Escherichia col i DH5 a ( pUC19-RVLa-AHN- g )

寄託番号 ： FERM BP- 5645

寄託日 ： 1996年 8月 29日

(6) 名 称 ： Escherichia col i DH5 (pUC19-l.24L- g κ )

寄託番号 ： FERM BP-5646

寄託日 ： 1996年 8月 29日

(7) 名 称 ： Escherichia col i DH5 a ( pUC19-RVHs-AHM- g 7 1)

寄託番号 ： FERM BP- 6127

寄託日 ： 1997年 9月 29曰

配列表

配列番号 ： 1

配列の長さ ： 1013

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 一本鎖

トポロジー ： 直線状

配列の種類 ： cDNA

GAATTCGGCA CGAGGGATCT GG ATG GCA TCT ACT TCG TAT GAC TAT TGC 49

Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys

1 5

AGA GTG CCC ATG GAA GAC GGG GAT AAG CGC TGT AAG CTT CTG CTG GGG 97 Arg Val Pro Met Glu Asp Gly Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly 10 15 20 25

ATA GGA ATT CTG GTG CTC CTG ATC ATC GTG ATT CTG GGG GTG CCC TTG 145 He Gly l ie Leu Val Leu Leu l ie l ie Val He Leu Gly Val Pro Leu

30 35 40

ATT ATC TTC ACC ATC AAG GCC AAC AGC GAG GCC TGC CGG GAC GGC CTT 193 l ie He Phe Thr l ie Lys Ala Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu

45 50 55

CGG GCA GTG ATG GAG TGT CGC AAT GTC ACC CAT CTC CTG CAA CAA GAG 241 Arg Ala Val Met Glu Cys Arg Asn Val Thr Hi s Leu Leu Gin Gin Glu

60 65 70

CTG ACC GAG GCC CAG AAG GGC TTT CAG GAT GTG GAG GCC CAG GCC GCC 289 Leu Thr Glu Ala Gin Lys Gly Phe Gin Asp Val Gl u Ala Gin Ala Ala

75 80 85 Z ： 粜

8ΐ0ΐ 30030D90 OOOOliVVVV

S66 VVVVVVVVVV VVVVVVVVVV VVVVVVVIIO 9V9V30V0VD 00V011103X 3V3VVVXVV S86 VVVVV03130 V0IX101000 0101111110 OUOOOOOOO 9001111111 10001V1101 L8 1013301001 0IV3000000 1010000100 991V3090I1 V0V01033V0 3010101131 918 333000XOVO 1VV3V00331 3031030V0V 03X3301010 10003V003V 9X1D0031DV SSL 3V0V009010 190013010V 30000XV339 000VD01310 OVOOVOOlOi OOOOOVVOVO S69 0090V1D0D0 0V30V0V000 000V1I003V OVVOOOOOIV 3100930V01 31X0V31V0I SS9 31V0XX0331 XV3VV0U30 3111X30031 3010310301 00VV001131 V3V300130V

081 SAT 0丄 ΐ

U % uio naq ngq ¾iv J8S nai io ng naq Ι¾Λ at l

91S V00V033XV0 V01 OVO 013 013 130 OOV 013 300 DID 913 010 丄丄 V

S9I 091 SSI naq ngq uio OJJ ¾iv ¾1V ¾IV J3S J9S J9S dsy uio J3 J3S OJJ J I

62S 013 013 OVO 333 030 030 100 33X 30V 001 OVO OVO 031 30V 033 3V1

091 S I OH

丄 sAi sAq dsy BIV ^d\ \ V 1¾Λ J3S ngq I¾A UIO USV "10 V 3-iV m ovv ovv ovo ooo oxv vov oio oov vn oio ovo ovv wo vov vov ssi οετ S2T ngq 3JV nig 八 ⁿI ¾1V ^J3S ¾IV dsv u]g ng sA s !y usy naq JIU £ 013 VOO OVO 0X0 OVO V39 131 000 3V9 OVO 110 OVV IVO OVV Vll vov

021 9ΐΐ 0Π

J 311 nio i9 nio nai nio Λ sA sAq UIQ AtO "19 ¾1V s q

S8C 10V 31V OVO VOD OVO 113 OVO OVO 010 VVV OVV WO VOO VV3 330 OVV

SOT OOT S6 06 nio BIV dsv n9i J9S ¾1V naq ¾iv }dn U ^{J S} !H usv ^s 丄

L £ OVO VOO IVO 0X0 331 130 OIV VIO 330 D1V 010 13V 3V3 OVV 301 OOV .

89S00/86df/13d 869SC/86 O W 配列の長さ ： 3 7 9

配列の型 ： 核酸

トポロ ジー ： 直鎖状

配列の種類 ： c D N A

配列

ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT 48 Met Gly Trp Ser Cys l ie l ie Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

-15 -10 - 5

GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC 96 Val Hi s Ser Asp l ie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala

- 1 1 5 10

AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAG GCT AGT CAG GAT GTG 144 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr l ie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val

15 20 25

AAT ACT GCT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA AAG GCT CCA AAG 192 Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gl y Lys Ala Pro Lys 30 35 40 45

CTG CTG ATC TAC TCG GGA TCC AAC CGG TAC ACT GGT GTG CCA AGC AGA 240 Leu Leu l i e Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gl y Val Pro Ser Arg

50 55 60

TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC ACC TTC ACC ATC AGC AGC 288 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr l i e Ser Ser

65 70 75

CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCT ACC TAC TAC TGC CAG CAA CAT TAT AGT 336 Leu Gin Pro Gl u Asp l ie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin H i s Tyr Ser

80 85 90 ACT CCA TTC ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu l i e Lys

95 100 105

配列番号 ： 3

配列の長さ ： 4 1 8

配列の型 ： 核酸

トポロジー ： 直鎖状

配列の種類 ： c D N A

配列

ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48

Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly

-15 -10 -5

GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96

Ala Hi s Ser Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gl y Ala Gl u Val Lys Lys

-1 1 5 10

CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144

Pro Gl y Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gl y Tyr Thr Phe

15 20 25

ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192

Thr Pro Tyr Trp Met Gin Trp Val Arg Gin Ala Pro Gl y Gin Gly Leu

30 35 ' 40 45

GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240

Gl u Trp Met Gly Ser l i e Phe Pro Gl y Asp Gl y Asp Thr Arg Tyr Ser

50 55 60

CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATG ACC GCA GAC AAG TCC ACG AGC 288

Gin Lys Phe Lys Gl y Arg Val Thr Me t Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser

65 70 75 ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

80 85 90

TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gl y Tyr Tyr Phe Asp Tyr

95 100 105

TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418

Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

110 115 120

配列番号 ： 4

配列の長さ ： 4 1 8

配列の型 ： 核酸

トポロジー ： 直鎖状

配列の種類 ： c D N A

配列

ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly

- 15 -10 -5

GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96 Ala Hi s Ser Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gl y Ala Gl u Val Lys Lys

- 1 1 5 10

CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gl y Ala Ser Val Lys V l Ser Cys Lys Ala Ser Gl y Tyr Thr Phe

15 20 25

ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192 Thr Pro Tyr Trp Met Gin Trp Val Arg Gin Al a Pro Gl y Gin Gl y Leu 30 35 40 45 " GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240

Glu Trp Met Gly Ser l ie Phe Pro Gly Asp Gl y Asp Thr Arg Tyr Ser

50 55 60

CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATC ACC GCA GAC AAG TCC ACG AGC 288

Gin Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser

65 70 75

ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

80 85 90

TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr

95 100 105

TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418

Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

110 115 120

Claims

請 求 の 範 囲

I . 配列番号 1 に示されるア ミ ノ酸配列を有する蛋白質に特異的 に結合し、 かつ細胞障害活性を有する抗体を有効成分と して含有す る、 リ ンパ球系腫瘍 （骨髄腫を除く ） 治療剤。

2 . リ ンパ球系腫瘍が T細胞腫瘍である、 請求項 1 に記載の治療 剤。

3 . リ ンパ球系腫瘍が B細胞腫瘍 （骨髄腫を除く ） である、 請求 項 1 に記載の治療剤。

4 . 抗体がモノ ク ローナル抗体である、 請求項 1 に記載の治療剤

5 . 細胞障害活性が A D C C活性である、 請求項 1 に記載の治療 剤。

6 . 細胞障害活性が C D C活性である、 請求項 1 に記載の治療剤

7 . 抗体がヒ ト抗体定常領域 C 7を有する、 請求項 4 に記載の治 療剤。

8 . ヒ ト抗体定常領域 C ァが C ァ 1 または C ァ 3 である、 請求項 7 に記載の治療剤。

9 . 抗体が抗 HM 1. 24抗体である、 請求項 4 に記載の治療剤。

1 0 . 抗体がキメ ラ抗体またはヒ ト型化抗体である、 請求項 4 に 記載の治療剤。

I I . 抗体がキメ ラ抗 HM 1. 24抗体である、 請求項 9 に記載の治療 剤。

1 2 . 抗体がヒ ト型化抗 HM 1. 24抗体である、 請求項 9 に記載の治 療剤。

1 3 . 抗体が抗 HM1. 24抗体が認識するェピ トープと特異的に結合 する、 請求項 1 に記載の治療剤。

1 4 . 配列番号 1 に示されるア ミ ノ酸配列を有する蛋白質に特異 的に結合し、 かつ細胞障害活性を有する抗体。

1 5 . 細胞障害活性が A D C C活性である、 請求項 1 3 に記載の キ几体。

1 6 . 細胞障害活性が C D C活性である、 請求項 1 3 に記載の抗 体。