JPWO2005034994A1 - 固形腫瘍治療剤 - Google Patents

Abstract

配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体または抗体活性を維持している抗体断片を有効成分として含有する固形腫瘍治療剤。

Description

本発明は、固形癌に発現される蛋白質に特異的に結合する抗体を有効成分として含有する（悪性リンパ腫など造血器腫瘍を除く）固形癌に対する治療剤に関する。また、本発明は、固形癌に発現される蛋白質に特異的に結合し、細胞傷害活性を有する抗体に関する。

ＨＭ１．２４抗原は、ヒト骨髄腫細胞に高発現している膜蛋白質として見出された。すなわち、ヒト骨髄腫細胞ＫＰＣ−３２をマウスに免疫して得られたモノクローナル抗体（抗ＨＭ１．２４抗体）がヒト骨髄腫細胞および形質細胞に結合し、認識される抗原（ＨＭ１．２４抗原）がＲＰＭＩ８２２６などのヒト骨髄腫細胞株では高発現していることが示された（Ｇｏｔｏ，Ｔら、Ｂｌｏｏｄ（１９９４）８４，１９２２）。また、同時にヒト骨髄腫細胞ＲＰＭＩ８２２６を移植したマウスに抗ＨＭ１．２４抗体を投与することで抗腫瘍効果が得られることも報告されている。その後、ＨＭ１．２４抗原のｃＤＮＡを取得し、その塩基配列を調べたところ、骨髄ストローマ細胞に発現する蛋白質として報告されていたＢｓｔ２（Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｊら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（１９９５）２６，５２７；国際出願公開ＷＯ９５／１０５３６号公報）と同一分子であることが判明した。
一方、骨髄腫以外にもリンパ球系腫瘍において、ＨＭ１．２４抗原が発現していること、および抗ＨＭ１．２４抗体がリンパ球系腫瘍に対し、抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＡＤＣＣ活性）や補体依存性細胞傷害活性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＣＤＣ活性）による細胞傷害活性を有し、抗腫瘍効果を発現することが示されている（国際出願公開ＷＯ９８／３５６９８号公報）。また、造血器腫瘍をｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ αあるいはγ刺激することで、ＨＭ１．２４抗原の発現量が増加することが明らかにされており、抗ＨＭ１．２４抗体の抗腫瘍効果を増強できることが明らかになっている（国際出願公開ＷＯ０２／６４１５９号公報）。
このように、ＨＭ１．２４抗原は造血器腫瘍での発現は認められていたものの、肺癌、乳癌、大腸癌を初めとする固形癌に発現していることは知られておらず、さらに、ＡＤＣＣによりこれらの固形癌細胞を傷害できることも、知られていなかった。
造血器腫瘍を除く固形癌としては、頭頸部癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（扁平上皮癌、腺癌、大細胞癌、腺扁平上皮癌、及び多形、肉腫様あるいは肉腫成分を含む癌、などを含む）、食道癌、乳癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆道癌、膵臟癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、皮膚癌、脳腫瘍、小児固形癌、悪性骨腫瘍などが挙げられる。
近年の医療技術の進歩により、これら固形癌に対し新たな治療法が提案され、試みられているが、進行期にある固形癌に対してはほとんど治癒が見込めず、未だ不十分であるといわざるを得ない。

現在、おこなわれている固形癌の治療には、外科手術により病巣そのものを切除する以外に、種々の化学療法、放射線療法、骨髄移植などが挙げられ、さらにこれらを組み合わせて集学的治療により生存期間の延長とＱＯＬ改善を目指している。しかし、前記のごとく、いずれの治療法も未だ完全ではなく、固形癌を寛解に導き、患者の生存期間を延長させる画期的な治療剤あるいは治療法が待たれている。したがって、本発明の目的は、造血器腫瘍を除く固形癌に対する新しい治療剤を提供することである。
本発明者らは、かかる治療剤を提供すべく、抗ＨＭ１．２４抗体を用いて、固形腫瘍細胞での発現量を検討するフローサイトメトリー（ＦＣＭ）解析、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性のような細胞傷害活性の測定などの研究を重ねた結果、抗ＨＭ１．２４抗体が認識する抗原蛋白質が造血器腫瘍以外にも様々な固形癌に発現していること、および抗ＨＭ１．２４抗体が固形癌に対し、抗腫瘍効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合し、かつ細胞傷害活性を有する抗体を有効成分として含有する、固形癌治療剤を提供する。
前記の抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体、ヒト抗体の定常領域とマウス抗体の可変領域とから成るキメラ抗体、マウス抗体の相補性決定領域とヒト抗体のフレームワーク領域および定常領域とから成るヒト化抗体、または、相補性決定領域、フレームワーク領域および定常領域がいずれもヒト抗体に由来する抗体である。
前記の抗体は、糖鎖が改変された抗体であってもよい。
前記の抗体断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２またはＦｖ断片である。
前記の固形腫瘍は、例えば、頭頸部癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（扁平上皮癌、腺癌、大細胞癌、腺扁平上皮癌、及び多形、肉腫様あるいは肉腫成分を含む癌、などを含む）、食道癌、乳癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆道癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、皮膚癌、脳腫瘍、小児固形癌および悪性骨腫瘍、並びにこれらの固形癌の転移癌である。

図１は、ヒト固形癌細胞株（ＭＣＦ７，ＷｉＤｒおよびＣａｋｉ−１）に対するヒト化抗ＨＭ１．２４抗体の反応性を示すグラフである。実線は蛍光標識したヒト化抗ＨＭ１．２４抗体、点線は蛍光標識ヒトＩｇＧ１と反応させた試料である。
図２は、ヒト固形癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１，ＢｘＰｃ−３およびＰＡ−１）に対するヒト化抗ＨＭ１．２４抗体の反応性を示すグラフである。実線は蛍光標識したヒト化抗ＨＭ１．２４抗体、点線は蛍光標識ヒトＩｇＧ１と反応させた試料である。
図３は、ヒト固形癌細胞株（ＣＯＬＯ ２０５およびＵＣＣ−５）に対するヒト化抗ＨＭ１．２４抗体の反応性を示すグラフである。実線は蛍光標識したヒト化抗ＨＭ１．２４抗体、点線は蛍光標識ヒトＩｇＧ１と反応させた試料である。
図４は、ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体のヒト固形癌細胞株に対するＡＤＣＣ活性を示すグラフである。
図５は、ＹＢ２／０で発現させた精製ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％Ｔ）のパターンを示す。左図：還元条件下、右図：非還元条件下。精製ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体各４μｇをアプライした。
図６は、ＨＭ１．２４抗体−ＤＧ４４とＨＭ１．２４抗体−ＹＢの各抗体濃度におけるヒトＰＢＭＣのＡＤＣＣ活性を、４種類のＨＭ１．２４抗原発現ＣＨＯ細胞（ＨＭ２６，ＨＭ３１，ＨＭ２１，ＨＭ３６）を標的細胞として、Ｅ／Ｔ ｒａｔｉｏ＝２５で測定した結果である。
図７は、ＨＭ１．２４抗体−ＤＧ４４とＨＭ１．２４抗体−ＹＢ１μｇ／ｍＬにおけるヒトＰＢＭＣのＡＤＣＣ活性を、ＨＭ３１を標的細胞として、Ｅ／Ｔ ｒａｔｉｏ＝１，５，２５で測定した結果である。
図８は、ＣＨＯ由来の抗体（ａ）及びＹＢ２／０由来抗体（ｂ）から調製したＰＡ化糖鎖の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムである。産生細胞の種類により糖鎖パターンが変化し、特にＹＢ２／０由来抗体では、フコース無しと推定されるピーク群（Ａ−Ｄ）が増加していることを示している。
図９は、第８図と第１表で示した糖Ａ〜Ｈの構造を示す。
図１０は、第８図と第１表で示した糖Ｉ〜Ｏの構造を示す。
図１１は、ヒトＧｎＴＩＩＩ ｃＤＮＡのＰＣＲによる全合成に使用したプライマー配列と組合わせを示した。予めプライマーに導入したＢａｍＨＩ配列の前後のＰＣＲ断片を同部位で連結し、ヒトＧｎＴＩＩＩ ｃＤＮＡ全配列を取得した。
図１２は、ＨＭ１．２４抗体−ＤＧ４４及びＧｎＴＩＩＩ発現ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体産生株由来抗体１００ｎｇ／ｍＬにおけるＡＤＣＣ活性の比較。ＧｎＴＩＩＩを発現させることによりＡＤＣＣ活性が増強している抗体産生株が得られた。
図１３は、ＨＭ１．２４抗体−ＤＧ４４とＧｎＴＩＩＩ発現ＣＨＯ細胞由来ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体の各抗体濃度におけるヒトＰＢＭＣのＡＤＣＣ活性を、ＨＭ３６を標的細胞として、Ｅ／Ｔ ｒａｔｉｏ＝２５で測定した結果である。
図１４は、生来型ヒトＧｎＴＩＩＩをコードする塩基配列（配列番号：３０）（ＧｎＴＩＩＩ ｏｒｉ．ｎｕｃ）と変異型ヒトＧｎＴＩＩＩをコードする塩基配列（配列番号：３１）（ＧｎＴＩＩＩ ｍｕｔ．ｎｕｃ）と対比を示す。図中、星印は、両配列の対応する塩基が同一であることを示す。
図１５は、生来型ヒトＧｎＴＩＩＩをコードする塩基配列（配列番号：３０）（ＧｎＴＩＩＩ ｏｒｉ．ｎｕｃ）と変異型ヒトＧｎＴＩＩＩをコードする塩基配列（配列番号：３１）（ＧｎＴＩＩＩ ｍｕｔ．ｎｕｃ）と対比を示す。図中、星印は、両配列の対応する塩基が同一であることを示す。
図１６は、生来型ヒトＧｎＴＩＩＩをコードする塩基配列（配列番号：３０）（ＧｎＴＩＩＩ ｏｒｉ．ｎｕｃ）と変異型ヒトＧｎＴＩＩＩをコードする塩基配列（配列番号：３１）（ＧｎＴＩＩＩ ｍｕｔ．ｎｕｃ）と対比を示す。図中、星印は、両配列の対応する塩基が同一であることを示す。
図１７は、生来型ヒトＧｎＴＩＩＩをコードする塩基配列（配列番号：３０）（ＧｎＴＩＩＩ ｏｒｉ．ｎｕｃ）と変異型ヒトＧｎＴＩＩＩをコードする塩基配列（配列番号：３１）（ＧｎＴＩＩＩ ｍｕｔ．ｎｕｃ）と対比を示す。図中、星印は、両配列の対応する塩基が同一であることを示す。
図１８は、生来型ヒトＧｎＴＩＩＩをコードする塩基配列（配列番号：３０）（ＧｎＴＩＩＩ ｏｒｉ．ｎｕｃ）と変異型ヒトＧｎＴＩＩＩをコードする塩基配列（配列番号：３１）（ＧｎＴＩＩＩ ｍｕｔ．ｎｕｃ）と対比を示す。図中、星印は、両配列の対応する塩基が同一であることを示す。
図１９は、生来型ヒトＧｎＴＩＩＩをコードする塩基配列（配列番号：３０）（ＧｎＴＩＩＩ ｏｒｉ．ｎｕｃ）と変異型ヒトＧｎＴＩＩＩをコードする塩基配列（配列番号：３１）（ＧｎＴＩＩＩ ｍｕｔ．ｎｕｃ）と対比を示す。図中、星印は、両配列の対応する塩基が同一であることを示す。

本発明者らは、ＨＭ１．２４抗原が、造血器腫瘍以外の固形癌に発現し、抗ＨＭ１．２４抗体がＡＤＣＣなどを介して細胞傷害活性を示すことを初めて明らかにした。本発明において、抗ＨＭ１．２４抗体が抗腫瘍効果を示す細胞は、ＨＭ１．２４抗原を発現した造血器腫瘍以外の固形癌であり、具体的には、頭頸部癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（扁平上皮癌、腺癌、大細胞癌、腺扁平上皮癌、及び多形、肉腫様あるいは肉腫成分を含む癌、などを含む）、食道癌、乳癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆道癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、皮膚癌、脳腫瘍、小児固形癌、悪性骨腫瘍などが挙げられる。また、これら固形癌の転移ならびに転移巣、固形癌に伴うがん性胸膜炎、がん性腹膜炎、がん性髄膜炎なども挙げられる。
次に、本発明に用いる抗体について説明する。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体の方が好ましい。次に、モノクローナル抗体の作製方法について説明する。
ハイブリドーマ
本発明で使用される抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ＨＭ１．２４抗原蛋白質やＨＭ１．２４抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作抗原であるＨＭ１．２４抗原発現細胞としては、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＫＰＭＭ２（特開平７−２３６４７５）やＫＰＣ−３２（Ｇｏｔｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（１９９１）３２，１４００）を用いることができる。また、感作抗原として配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質、あるいは抗ＨＭ１．２４抗体が認識するエピトープを含むペプチドまたはポリペプチドを使用することができる。
なお、感作抗原として使用される、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質のｃＤＮＡはｐＵＣ１９ベクターのＸｂａＩ切断部位の間に挿入されて、プラスミドｐＲＳ３８−ｐＵＣ１９として調製されている。このプラスミドｐＲＳ３８−ｐＵＣ１９を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、平成５年（１９９３年）１０月５日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ｐＲＳ３８−ｐＵＣ１９）として、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４４３４としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている（特開平７−１９６６９４参照）。このプラスミドｐＲＳ３８−ｐＵＣ１９に含まれるｃＤＮＡ断片を用いて遺伝子工学的手法により、抗ＨＭ１．２４抗体が認識するエピトープを含むペプチドまたはポリペプチドを作製することができる。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または、皮下に注射することにより行われる。
具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。
このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付される。細胞融合に付される好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７９）１２３：１５４８−１５５０），Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１：１−７），ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６：５１１−５１９），ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８：４０５−４１５），ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６：２６９−２７０），ＦＯ（ｄｅ Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５：１−２１），Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８：３１３−３２３），Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７：１３１−１３３）等が適宜使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３：３−４６）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１０００−６０００程度のＰＥＧ溶液を通常、３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数曰〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングが行われる。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＭ１．２４抗原またはＨＭ１．２４抗原発現細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、ＨＭ１．２４抗原またはＨＭ１．２４抗原発現細胞への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるＨＭ１．２４抗原またはＨＭ１．２４抗原発現細胞を投与し、前述の方法に従い所望のヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ９３／１２２２７，ＷＯ９２／０３９１８，ＷＯ９４／０２６０２，ＷＯ９４／２５５８５，ＷＯ９６／３４０９６，ＷＯ９６／３３７３５参照）。
さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングにより所望のヒト抗体を単離することもできる。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、ＨＭ１．２４抗原を固定化したプレートを用いて、ＨＭ１．２４抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、ＨＭ１．２４抗原に結合する抗体の可変領域をコードする遺伝子を同定することができる。これらの遺伝子配列を用いれば、ヒト抗ＨＭ１．２４抗体を作製することができる。これらの方法は既に周知の方法であり、ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／２０７９１，ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８，ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
モノクローナル抗体
具体的には、抗ＨＭ１．２４抗体産生ハイブリドーマの作製は、Ｇｏｔｏ，Ｔ．らの方法（Ｂｌｏｏｄ（１９９４）８４．１９２２−１９３０）により行うことができる。独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、平成７年４月２７日にＦＥＲＭ ＢＰ−５２３３としてブダペスト条約に基づき国際寄託された抗ＨＭ１．２４抗体産生ハイブリドーマをＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア製）の腹腔内に注入して腹水を得、この腹水から抗ＨＭ１．２４抗体を精製する方法や、本ハイブリドーマを適当な培地、例えば、１０％ウシ胎児血清、５％ＢＭ−ＣｏｎｄｉｍｅｄＨ１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地、ハイブリドーマＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ製）、ＰＦＨＭ−ＩＩ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ製）等で培養し、その培養上清から抗ＨＭ１．２４抗体を精製する方法で行うことができる。
組換え型抗体
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｃａｒｌ，Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｊａｍｅｓ，Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋ，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ｂｙ ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ ＬＴＤ，１９９０参照）。
具体的には、目的とする抗体を産生するハイブリドーマから、抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ら、（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等を使用してｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することができる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ等を用いて行うことができる。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには５′−Ａｍｐｌｉ ＦＩＮＤＥＲ ＲＡＣＥ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲを用いた５′−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８−９００２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）を使用することができる。得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作成し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシ法により確認する。
目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。
本発明で使用される抗体を製造するには、後述のように抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
改変抗体
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ １２５０２３、国際特許出願公開番号ＷＯ９６／０２５７６参照）。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
例えば、キメラ抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖およびＨ鎖を含むプラスミドを有する大腸菌は、各々Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ｐＵＣ１９−１．２４Ｌ−ｇκ）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ｐＵＣ１９−１．２４Ｈ−ｇγ１）として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、平成８年８月２９日に、各々ＦＥＲＭ ＢＰ−５６４６およびＦＥＲＭ ＢＰ−５６４４としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている（国際特許出願公開番号ＷＯ９８／１４５８０参照）。
ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ １２５０２３、国際特許出願公開番号ＷＯ９６／０２５７６参照）。
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ−ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ９６／０２５７６参照）。
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
例えば、ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖およびＨ鎖を含むプラスミドを有する大腸菌は、各々Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ｐＵＣ１９−ＲＶＬａ−ＡＨＭ−ｇκ）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ｐＵＣ１９−ＲＶＨｒ−ＡＨＭ−ｇγ１）として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、平成８年８月２９日に、各々ＦＥＲＭ ＢＰ−５６４５およびＦＥＲＭ ＢＰ−５６４３としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている（国際特許出願公開ＷＯ９８／１４５８０参照）。
キメラ抗体、ヒト化抗体には、ヒト抗体Ｃ領域が使用され、細胞傷害活性を呈するヒト抗体Ｃ領域として、ヒトＣγ例えば、Ｃγ１，Ｃγ２，Ｃγ３，Ｃγ４を使用することができる。これらのうち、特にＣγ１，Ｃγ３を有する抗体が強力な細胞傷害活性、すなわち、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性を有し、本発明に好適に使用される。
キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来のＣ領域からなり、ヒト化抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体由来のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）およびＣ領域からなり、ヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。
本発明に使用されるヒト化抗体の好ましい具体例としては、ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体が挙げられる（ＷＯ９８／１４５８０参照）。
本発明では、糖鎖が改変された抗体も使用できる。（特願２００３−２０７１６５参照）
本発明の抗体として、α−１，６コアーフコース（α−１，６ｃｏｒｅ ｆｕｃｏｓｅ）（還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位とがα結合している。）を含まない糖鎖を有する抗ＨＭ１．２４抗体、及びバイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）構造を有する糖鎖を有する抗体が高いＡＤＣＣ活性を有するほか、α−１，６コアーフコース（α−１，６ｃｏｒｅ ｆｕｃｏｓｅ）を含まない糖鎖とバイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）構造を有する糖鎖を共に有する抗ＨＭ１．２４抗体が、一層高いＡＤＣＣ活性を有する。
従って本発明で使用する抗体として、糖鎖の改変によりＡＤＣＣ活性が増強された、ＨＭ１．２４抗原に対する抗体（抗ＨＭ１．２４抗体）を使用することができる。この抗体は、典型的にはモノクローナル抗体またはそれに由来する抗体であり、例えばキメラ抗体、又は更に好ましくはヒト化抗体である。より具体的には、本発明では、α−１，６コアーフコース（α−１，６ｃｏｒｅ ｆｕｃｏｓｅ）を含まない糖鎖を有する抗体、及びバイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）構造を有する糖鎖を有する抗体、更には、α−１，６コアーフコース（α−１，６ｃｏｒｅ ｆｕｃｏｓｅ）を含まない糖鎖を有し、且つバイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）構造を有する糖鎖を有する抗体を使用することができる。
上記の糖鎖が修飾された抗体は、ＨＭ１．２４抗原に対する抗体（抗ＨＭ１．２４抗体）をコードする核酸が導入されたＹＢ２／０細胞を培養し、そして当該培養物から当該抗体を採取することを特徴とする方法；Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）をコードする核酸を導入した宿主細胞を培養し、当該培養物から当該抗体を採取することを特徴とする方法；並びに、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）をコードする核酸を導入したＹＢ２／０細胞を培養し、そして当該培養物から当該抗体を採取することを特徴とする方法などにより製造することができる。
本発明で使用する糖鎖の修飾によりＡＤＣＣ活性が増強された抗ＨＭ１．２４抗体を得るには、α−１，６コアーフコース（α−１，６ｃｏｒｅ ｆｕｃｏｓｅ）を付加する能力を有しないか又はその能力が低い宿主細胞中で抗ＨＭ１．２４抗体を発現させるか、あるいは糖鎖にバイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）構造を形成する能力を有する宿主細胞中で抗ＨＭ１．２４抗体を発現させる必要がある。そして、そのためには、目的とする抗ＨＭ１．２４抗体をコードする遺伝子がクローニングされなければならない。そして、クローニングされた遺伝子によりコードされた抗ＨＭ１．２４抗体としては、モノクローナル抗体、可変領域がマウスなどのヒト以外の動物に由来し、不変領域がヒトの抗体に由来するキメラ抗体、可変領域中の相補性決定領域のみがマウスなどのヒト以外の動物の抗体に由来し、それ以外の抗体部分はヒト抗体に由来するヒト化抗体などが上げられる。
ＷＯ ９８／１４５８０の記載から明らかな通り、モノクローナル抗ＨＭ１．２４抗体を産生するハイブリドーマは既に樹立されており、このハイブリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、平成７年４月２７日に、ＦＥＲＭ ＢＰ−５２３３として寄託されている。また、このハイブリドーマから、軽鎖可変領域（Ｌ鎖Ｖ領域）をコードするＤＮＡ及び重鎖可変領域（Ｈ鎖Ｖ領域）をコードするＤＮＡがクローニングされ、そしてこれらのＤＮＡを含むプラスミドを収容した大腸菌が、それぞれ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ｐＵＣ１９−１．２４Ｌ−ｇκ）（ＦＥＲＭ ＢＰ−５６４６）及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ｐＵＣ１９−１．２４Ｈ−ｇγ１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−５６４４）として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、平成８年８月２９日に寄託されている。
さらに、上にクローニングしたＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ及びＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡから、キメラ抗ＨＭ１．２４抗体及びヒト化抗ＨＭ１．２４抗体が作成された。ヒト化抗体については、ＷＯ ９８／１４５８０の第３７頁〜第４０頁の表１〜表４に示されるように、ヒト化抗体のＬ鎖についてはバージョンａ及びｂが作製され、Ｈ鎖については、バージョンａ〜ｓが作製され、これらを込み合わせたヒト化抗体の抗原結合活性の測定の結果、Ｌ鎖バージョンａとＨ鎖バージョンｒ又はｓとの組合わせから成るヒト化抗体が強力な抗原結合活性を有することが確認された。
従って、本発明においては、上に引用したＷＯ ９８／１４５８０に記載されている種々のモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などを使用することができる。しかしながら、上記の抗体のみならず、ＨＭ１．２４に対する他のモノクローナル抗体に由来するキメラ抗体、ヒト化抗体などを使用することもできる。その場合、これらの調製方法としては、例えばＷＯ ９８／１４５８０に記載されている方法を用いることができる。
抗ＨＭ１．２４抗体に結合する糖鎖には、抗体分子のアスパラギンの側鎖のＮ原子に結合するＮ−グリコシド結合糖鎖と、抗体分子のセリン又はスレオニンの側鎖ヒドロキシル基に結合するＯ−グリコシル結合糖鎖とがあり、本発明においてフコースの存否が問題となるのはＮ−グリコシル結合糖鎖である。このＮ−グリコシル結合糖鎖は、図９及び図１０に示すごとく、１個のマンノース（Ｍａｎ）と２個のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）がβ１，４結合で結合した基本構造（コア）「−Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮｃ−」を有し、この構造の右のＧｌＮＡｃを還元末端と称し、左側のＭａｎを非還元末端と称する。フコース（Ｆｕｃ）が結合している場合、これは主として、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位とがα結合している。
本発明の一つの態様によれば、抗ＨＭ１．２４抗体は上記のフコースを含まない糖鎖を有する。抗体分子が複数のＮ−グリコシル糖鎖を有する場合、少なくとも１個の糖鎖は上記のフコースを有しない。このような、フコースを含まない糖鎖を有する抗体は、当該抗体を、糖鎖へのフコース付加能を欠失した細胞、すなわち、フコース転移活性を有しないか又はこの活性が低い宿主中で発現させれば良い。
本発明で使用する抗体製造においては、フコース転移活性を有しないか又はこの活性が低い任意の宿主を用いることができるが、具体例として、ラットミエローマＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＹＢ２／０細胞と略される）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２として保存されている）が挙げられる。本発明で用いることができるその他の細胞としては、例えば、ＦＴＶＩＩＩノックアウトＣＨＯ細胞（ＷＯ ０２／３１１４０）、Ｌｅｃ１３細胞（ＷＯ０３／０３５８３５）、フコーストランスポーター欠損細胞（特願２００３−１７４００６、特願２００３−２８２０８１、特願２００３−１７４０１０、特願２００３−２８２１０２）を挙げることができる。
本発明のもう一つの態様によれば、本発明で使用する抗ＨＭ１．２４抗体は、バイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）Ｎ−アセチルグルコサミンを有する糖鎖を有する。Ｎ−グリコシル結合糖鎖は前記の如き基本構造（コアー）を有し、その非還元末端には、図９に示すごとく、マンノースを含む２個の鎖がα１，６結合及びα１，３結合により結合している。他方、図１０に示す糖鎖においては、基本構造（コアー）の非還元末端に、前記２個の糖鎖のほかに、１個のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）がβ１，４結合により結合している。このＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が、「バイセクテングＮ−アセチルグルコサミン」である。
バイセクティングＮ−アセチルグルコサミンを有する糖鎖は、Ｏ−グリコシル結合糖鎖又はＮ−グリコシル結合糖鎖であり、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）により、Ｎ−アセチルグルコサミンを糖鎖に転移させることにより形成される。この酵素をコードする遺伝子は既にクローニングされており、そのアミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡの塩基配列は記載されている（ＮＣＢＩデーターベース（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｄ１３７８９））。また、このＤＮＡは、上記の配列情報に基づいてＰＣＲ法など、常法に従って、クローニングすることができる。
ＧｎＴＩＩＩをコードするＤＮＡを用いて、バイセクティングＮ−アセチルグルコサミンを有する糖鎖を形成するには、このＤＮＡを含んでなる発現ベクターにより、抗ＨＭ１．２４抗体を産生する宿主細胞を形質転換すればよい。すなわち、ＧｎＴＩＩＩをコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターと抗ＨＭ１．２４抗体をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターとにより、宿主細胞を形質転換し、これを培養すればよい。
本発明の第三の態様によれば、本発明の抗ＨＭ１．２４抗体は、α−１，６コアーフコース（α−１，６ｃｏｒｅ ｆｕｃｏｓｅ）を有しない糖鎖とバイセクティングＮ−アセチルグルコサミンを有する糖鎖の両方を有する。このタイプの抗体を製造するには、ＧｎＴＩＩＩをコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターと抗ＨＭ１．２４抗体をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターとにより、α−１，６コアーフコースを有する糖鎖を形成する活性を有しないか又はこの活性が弱い宿主細胞、例えばＹＢ２／０細胞、を形質転換し、これを培養すればよい。
宿主細胞の形質転換方法、培養方法、及び培養物からの抗体の単離・精製方法は、常法に従って行うことができる。
抗体断片
本発明において、全長抗体の一部すなわち抗体断片を人為的に作製して、抗体の効果を部分的ないしは全て代替させることができる。
抗体断片とは、一般に、抗原結合領域または可変領域のことである。例えば、抗体断片にはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、及びＦｖ断片が含まれる。抗体のパパイン消化により、Ｆａｂ断片と呼ばれる、それぞれ１つの抗原結合部位を有する２つの同じ抗原結合断片、及び、残りの容易に結晶化するためにＦｃと呼ばれる断片が生じる。また、ペプシン消化により２つの抗原結合部位を有し、抗原を交差結合し得るＦ（ａｂ’）_２断片、及び、残りの別な断片（ｐＦｃ’と呼ばれる）が得られる。その他の断片としては、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、線状抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体断片より形成された多特異性抗体が含まれる。
ここで、Ｆｖ断片は最小の抗体断片であり、完全な抗原認識部位と結合部位を含む。この領域は１つの重鎖及び軽鎖の可変ドメインが非共有結合により強く連結されたダイマーである（Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌダイマー）。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用し、Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌダイマーの表面に抗原結合部位を形成する。６つのＣＤＲは、抗体に抗原結合部位を付与するものである。しかしながら、１つの可変ドメイン（または、抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、全結合部位よりは低い親和性ではあるが、抗原を認識し結合する能力を有する。
また、Ｆａｂ断片（Ｆ（ａｂ）とも呼ばれる）はさらに、軽鎖の定常ドメイン、及び、重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片はＦａｂ断片と、抗体のヒンジ領域からの１またはそれ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端由来の数個の残基を付加的に有する点で異なる。
本発明において、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）とは、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、該断片は、同じポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ−ＶＬ）を含む。同じ鎖中で２つのドメインの間を結合できない位に短いリンカーを用いると、２つのドメインはもう一方の鎖の定常ドメインとペアを形成し、２つの抗原結合部位が創り出される。Ｄｉａｂｏｄｙはより詳細に、例えば、ＥＰ４０４，０９７号、ＷＯ９３／１１１６１号、及びＨｏｌｌｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｅａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０，６４４４）に記載される。
一本鎖抗体（以下、一本鎖Ｆｖ若しくはｓＦｖとも呼ぶ）、またはｓＦｖ抗体断片には、抗体のＶＨ及びＶＬドメインが含まれ、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドはさらに、ＶＨ及びＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーを含み、それによりｓＦｖは、抗原結合のために必要な構造が形成できる。ｓＦｖについては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ『Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ』Ｖｏｌ．１１３（Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４））に記載されている。
抗体ファージライブラリー
本発明では、目的とするモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを得るために、抗体ファージライブラリーを使用することができる。
抗体ファージライブラリーより抗体、または抗体断片を単離するためには、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８，５５２）により記載された技術を用いて製造された抗体ファージライブラリーを用いることができる。ファージライブラリーを用いたマウスおよびヒト抗体の単離は、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）３５２，６２４）、およびＭａｒｋｓら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９１）２２２，５８１）が記載した方法を用いることができる。
また、チェーンシャッフリングによる方法（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）１０，７７９）を用いることで高親和性（ｎＭ程度）のヒト抗体を得ることができる。また、巨大なファージライブラリーを構築するための方法としては、コンビナトリアル感染、およびｉｎ ｖｉｖｏ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６（１９９３））などが知られている。これらの技術も、従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に代えて利用することができる。
ヒト抗体産生トランスジェニック動物
本発明では、ヒト抗体産生トランスジェニック動物を用いることで、ヒト抗体を産生するハイブリドーマを直接得ることができる。
ヒト抗体は、免疫原（抗原）をヒト抗体産生トランスジェニック哺乳動物に免疫し、既存の一般的な抗体産生方法によって取得することができる。その抗体遺伝子は、該細胞からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて組換え抗体を作製することができる。
用いるヒト抗体産生非ヒト哺乳動物、特にヒト抗体産生トランスジェニックマウスの作製方法は公知である（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９４）７，１３；Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７）１５，１４６；特表平４−５０４３６５号公報；特表平７−５０９１３７号公報；日経サイエンス（１９９５）６，４０；国際出願公開ＷＯ９４／２５５８５号公報；Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３６８，８５６；特表平６−５００２３３号公報等）。該ヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物は具体的には、次のような手順により製造することができる：
（１）非ヒト哺乳動物の内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の少なくとも一部を相同組換えにより薬剤耐性マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子等）で置換することにより該動物内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子が機能的に不活性化されたノックアウト非ヒト哺乳動物を作製する工程、
（２）非ヒト哺乳動物内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の少なくとも一部を相同組換えにより薬剤耐性マーカー遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子等）で置換することによる該動物内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子（特にκ鎖遺伝子）が機能的に不活性化されたノックアウト非ヒト哺乳動物を作製する工程、
（３）酵母人工染色体（Ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＹＡＣ）ベクター等に代表されるような巨大遺伝子を運搬可能なベクターを用いて、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座の所望の領域がマウス染色体中に組込まれたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する工程、
（４）ＹＡＣ等に代表されるような巨大遺伝子を運搬可能なベクターを用いて、ヒト免疫グロブリン軽鎖（特にκ鎖）遺伝子座の所望の領域がマウス染色体中に組込まれたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する工程、
（５）前期（１）〜（４）のノックアウト非ヒト哺乳動物及びトランスジェニック非ヒト哺乳動物を任意の順序で交配することにより、非ヒト哺乳動物内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座及び非ヒト哺乳動物内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座がともに機能的に不活性化され、且つヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座の所望の領域及びヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の所望の領域が共に非ヒト哺乳動物染色体上に組込まれたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する工程。
上述のように、非ヒト哺乳動物の内在性免疫グロブリン遺伝子座の適当な領域を外来性マーカー遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子等）で相同組換えにより置換することにより該遺伝子座が再構成できないように不活性化することができる。該相同組換えを用いた不活性化には、例えば、ポジティブ・ネガティブ・セレクション（ＰＮＳ）と呼ばれる方法を用いることができる（曰経サイエンス（１９９４）５，５２）。また、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の機能的な不活性化には、例えば、Ｊ領域またはＣ領域（例えばＣμ領域）の一部に障害を導入することにより達成でき、免疫グロブリン軽鎖（例えばκ鎖）の機能的不活性化には、例えば、Ｊ領域若しくはＣ領域の一部、またはＪ領域及びＣ領域にまたがる領域を含む領域に障害を導入することにより達成可能である。
トランスジェニック動物は、通常の方法により製造することができる（例えば、最新動物細胞実験マニュアル、エル・アイ・シー発行、第７章、第３６１から４０８頁（１９９０））。具体的には、例えば、正常な非ヒト動物胚盤胞に由来するヒポキサンチングアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＲＰＴ）陰性胚性幹（ＥＳ）細胞を、該ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座または軽鎖遺伝子座をコードする遺伝子またはその一部並びにＨＲＰＴ遺伝子が挿入されたＹＡＣベクターを含む酵母とスフェロプラスト融合法により融合する。
該外来遺伝子がマウス内在性遺伝子上にインテグレートされたＥＳ細胞をＨＡＴセレクションにより選別する。次いで、選別したＥＳ細胞を別の正常非ヒト哺乳動物から取得した受精卵（胚盤胞）にマイクロインジェクションする（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，７３８０；米国特許第４，８７３，１９１号）。該胚盤胞を仮親となる別の非ヒト哺乳動物の子宮に移植することにより、キメラトランスジェニック非ヒト哺乳動物が誕生する。該キメラ動物を正常な非ヒト哺乳動物と交配させ、ヘテロトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得る。該ヘテロ動物同士を交配することにより、メンデルの法則に従い、ホモトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができる。
発現および産生
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、その３′側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させたＤＮＡあるいはそれを含むベクターにより発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）等のウィルスプロモーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサーを用いればよい。
例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合、Ｍｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合、Ｍｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）に従えば容易に実施することができる。
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、ｌａｃＺプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃＺプロモーターを使用する場合、Ｗａｒｄらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１０９８）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーターを使用する場合、Ｂｅｔｔｅｒらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）に従えばよい。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切にリフォールド（ｒｅｆｏｌｄ）して使用する（例えば、ＷＯ９６／３０３９４を参照）。
複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の産生系を使用することができる。抗体製造のための産生系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ，ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ，Ｖｅｒｏ、（２）両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは（３）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９，ｓｆ２１，Ｔｎ５などが知られている。植物細胞としては、ニコティアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属、例えばニコティアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）などが知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌が知られている。
これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ，ＭＥＭ，ＲＰＭＩ１６４０，ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。また、抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔等へ移すことにより、ｉｎ ｖｉｖｏにて抗体を産生してもよい。
一方、ｉｎ ｖｉｖｏの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。
哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシなどを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，１９９３）。また、昆虫としては、カイコなどを用いることができる。
植物を使用する場合、タバコなどを用いることができる。
これらの動物または植物に抗体遺伝子を導入し、動物または植物の体内で抗体を産生させ、回収する。例えば、抗体遺伝子をヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
また、カイコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させ、このカイコの体液より所望の抗体を得る（Ｓｕｓｕｍｕ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。さらに、タバコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えばニコチニア・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得る（Ｊｕｌｉａｎ，Ｋ．−Ｃ．Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。
上述のようにｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの産生系にて抗体を産生する場合、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ９４−１１５２３参照）。
上述のように得られた抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合させ抗体修飾物として使用することもできる。本願特許請求の範囲でいう「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野においてすでに確立されている。
抗体の分離、精製
前記のように産生、発現された抗体は、細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティークロマトグラフィーにより行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。プロテインＡカラムに用いる担体として、例えば、Ｈｙｐｅｒ Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．等が挙げられる。
その他、通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせれば、本発明で使用される抗体を分離、精製することができる。クロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過等が挙げられる。
薬物・毒物などとの結合体
本発明では、治療目的として抗体に各種試薬を結合して使用することもできる。このような試薬としては、ドキソルビシン、メトトレキサート、タキソールなどの化学療法剤、重金属、Ｉｏｄｉｎｅ−１３１，Ｙｔｔｒｉｕｍ−９０などの放射核種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ毒素などのトキシン類、を挙げることができる。治療用試薬との結合体を生産する方法および治療用に使用する方法については、米国特許５０５７３１３号、米国特許５１５６８４０号に記載されている。
抗体の濃度測定
上記方法で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定またはＥＬＩＳＡ等により行うことができる。すなわち、吸光度の測定による場合には、本発明で使用される抗体又は抗体を含むサンプルをＰＢＳ（−）で適当に希釈した後、２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌを１．３５０Ｄとして算出する。また、ＥＬＩＳＡによる場合は以下のように測定することができる。すなわち、０．１Ｍ重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で１μｇ／ｍｌに希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＢＩＯ ＳＯＵＲＣＥ製）１００μｌを９６穴プレート（Ｎｕｎｃ製）に加え、４℃で一晩インキュベーションし、抗体を固相化する。
ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で使用される抗体または抗体を含むサンプル、あるいは標品としてヒトＩｇＧ（ＣＡＰＰＥＬ製）１００μｌを添加し、室温にて１時間インキュベーションする。洗浄後、５０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ（ＢＩＯ ＳＯＵＲＣＥ製）１００μｌを加え、室温にて１時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液を加えインキュベーションの後、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ ＲＥＡＤＥＲ Ｍｏｄｅｌ ３５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を用いて４０５ｎｍでの吸光度を測定し、目的の抗体の濃度を算出する。
ＦＣＭ解析
骨髄腫細胞と本発明で使用される抗体との反応性は、ＦＣＭ（フローサイトメトリー）解析で行うことができる。細胞としては、樹立細胞株あるいは新鮮分離細胞を用いることができる。樹立細胞株としては、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２６）、ヒト大腸癌細胞株ＣＯＬＯ ２０５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２２）およびＷｉＤｒ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２１８）、ヒト膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６８７）、ヒト子宮頚癌細胞株ＵＣＣ−５（実験動物中央研究所）、ヒト腎臓癌細胞株Ｃａｋｉ−１（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−４６）、ヒト卵巣癌細胞株ＰＡ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７２）などを用いることができる。
上記細胞をＰＢＳ（−）で洗浄した後、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ウシ胎児血清、０．０５％アジ化ナトリウム含有ＰＢＳ（−））で２５μｇ／ｍｌに希釈した抗体あるいはコントロール抗体１００μｌを加え、氷温化３０分インキュベートする。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、２５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス抗体（ＧＡＭ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）１００μｌを加え、氷温化３０分間インキュベートする。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、６００μｌあるいは１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）で各細胞の蛍光強度を測定すればよい。
また、前記の間接法による染色ではなく、細胞を高濃度の免疫グロブリンで処理し、Ｆｃレセプターをブロックした後にＦＩＴＣ標識した抗ＨＭ１．２４抗体を用いた直接法による染色によりＦＣＭ解析することもできる。
細胞傷害活性
ＡＤＣＣ活性の測定
本発明に使用される抗体は、細胞傷害活性として、例えば、ＡＤＣＣ活性を有する抗体である。
本発明において腫瘍細胞に対するＡＤＣＣ活性は、次のようにして測定することができる。まず、ヒトの末梢血や骨髄より比重遠心法で単核球を分離し、エフェクター細胞（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ：Ｅ）として調製する。
また、標的細胞（Ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ：Ｔ）としては、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２６）、ヒト大腸癌細胞株ＣＯＬＯ ２０５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２２）およびＷｉＤｒ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２１８）、ヒト子宮頚癌細胞株ＵＣＣ−５（実験動物中央研究所）、ヒト卵巣癌細胞株ＰＡ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７２）、患者由来の細胞などを^５１Ｃｒにより標識して、標的細胞として調製する。次いで、標識した標的細胞にＡＤＣＣ活性を測定する抗体を加えインキュベートし、その後、標的細胞に対し適切な比のエフェクター細胞を加えインキュベートする。
インキュベートした後上清を取り、ガンマカウンターで放射活性を測定する。その際、最大遊離放射能測定用に、１％のＮＰ−４０を用いることができる。細胞傷害活性（％）は、（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）×１００で計算することができる。なお、Ａは抗体存在下において遊離された放射活性（ｃｐｍ）、ＢはＮＰ−４０により遊離された放射活性（ｃｐｍ）、Ｃは抗体を含まず培養液のみで遊離された放射活性（ｃｐｍ）である。
細胞傷害活性の増強
ＡＤＣＣ活性のような細胞傷害活性を発揮するには、ヒトにおいては抗体定常領域（Ｃ領域）としてＣγ、特にＣγ１，Ｃγ３を使用することが好ましい。さらに、抗体Ｃ領域のアミノ酸を一部付加、改変、修飾することにより、より強力なＡＤＣＣ活性、あるいはＣＤＣ活性を誘導することができる。
例えば、アミノ酸置換によるＩｇＧのＩｇＭ様ポリマー化（Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｉ．Ｆ．＆ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（１９９４）１２，６８３−６８８）、アミノ酸付加によるＩｇＧのＩｇＭ様ポリマー化（Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｉ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）１５４，２２２６−２２３６）、Ｌ鎖をコードする遺伝子の直列連結での発現（Ｓｈｕｆｏｒｄ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５２，７２４−７２７）、アミノ酸置換によるＩｇＧの二量体化（Ｃａｒｏｎ，Ｐ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９２）１７６，１１９１−１１９５，Ｓｈｏｐｅｓ，Ｂ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１４８，２９１８−２９２２）、化学修飾によるＩｇＧの二量体化（Ｗｏｌｆｆ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９３）５３，２５６０−２５６５）、および抗体ヒンジ領域のアミノ酸改変によるエフェクター機能の導入（Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１）２１，２３７９−２３８４）が挙げられる。
これらは、プライマーを利用したオリゴマー部位特異的変異導入法、制限酵素切断部位を利用した塩基配列の付加、共有結合をもたらす化学修飾剤を使用することによって達成される。
投与経路および製剤
本発明の固形癌治療剤は、非経口的にあるいは経口的に、全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、胸腔内注射、腹腔内注射、皮下注射を選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．０１〜１００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり１０−２０００ｍｇ、好ましくは１００−１０００ｍｇの投与量を選ぶことができる。
本発明の固形癌治療剤は、投与経路次第で医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであっても良い。
このような担体および添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加物は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。
本発明の治療対象疾患としては、標的とする腫瘍細胞上に本発明で使用される抗体が結合する抗原が存在する造血器腫瘍を除く固形癌である。具体的には、頭頸部癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、食道癌、乳癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆道癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、皮膚癌、脳腫瘍、小児固形癌、悪性骨腫瘍などが挙げられる。また、これら固形癌の転移ならびに転移巣、固形癌に伴うがん性胸膜炎、がん性腹膜炎、がん性髄膜炎なども挙げられる。本発明の治療剤は、これら造血器腫瘍を除く固形癌の治療剤として有用である。

次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］抗ＨＭ１．２４抗体の固形癌細胞株に対する反応性
１．フローサイトメトリー解析
ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２６）、ヒト大腸癌細胞株ＣＯＬＯ ２０５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２２）およびＷｉＤｒ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２１８）、ヒト膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６８７）、ヒト子宮頚癌細胞株ＵＣＣ−５（実験動物中央研究所）、ヒト腎臓癌細胞株Ｃａｋｉ−１（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−４６）、ヒト卵巣癌細胞株ＰＡ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７２）を用いた。
これらの細胞について、それぞれ約１×１０^６個の細胞を、８０μＬのＦＡＣＳ／ＰＢＳ（１ｇのウシ血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ社製）を１ＬのＣｅｌｌＷＡＳＨ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に溶解して調製）に懸濁後、２００μｇ／ｍＬの蛍光標識ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体（ＮＨＳ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社製）にて、ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体を標識して調製）または蛍光標識ヒトＩｇＧ１（ＮＨＳ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎにてヒトＩｇＧ１（ＳＩＧＭＡ社製）を標識して調製）またはＦＡＣＳ／ＰＢＳを２０μＬ加え、氷上にて３０分間反応させた。１ｍＬのＦＡＣＳ／ＰＢＳにて２回洗浄後、１ｍＬのＦＡＣＳ／ＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ ＸＬ、ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社製）にて細胞の蛍光強度を測定した。
２．結果
抗ＨＭ１．２４抗体は全ての細胞株に対し、反応性を示した（図１、図２及び図３）。
［実施例２］固形癌細胞株に対する抗ＨＭ１．２４抗体によるＡＤＣＣ活性
ＡＤＣＣ活性の測定はＣｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ７．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｊｏｈｎ Ｅ，Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９３の方法に従った。
１．標的細胞の調製
ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２６）、ヒト大腸癌細胞株ＣＯＬＯ ２０５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２２）およびＷｉＤｒ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２１８）、ヒト子宮頚癌細胞株ＵＣＣ−５（実験動物中央研究所）、ヒト卵巣癌細胞株ＰＡ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７２）を標的細胞として用いた。
各細胞を９６ウェル平底プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に３×１０^３／ウェル（ＣＯＬＯ ２０５およびＷｉＤｒは２×１０^３／ウェル、ＵＣＣ５は５×１０^３／ウェル、ＰＡ−１は１×１０^３／ウェル）播種し、３日間培養した。培養後、^５１Ｃｒ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｒｏｍａｔｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を添加し終濃度を５０μＣｉ／ｍＬとし、３７℃にて１時間培養することにより放射性標識した。標識後、細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＨｙＣｌｏｎｅ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）にて１回洗浄し、同培地５０μＬを添加し、標的細胞とした。
２．エフェクター細胞の調製
健康成人ボランティアの末梢血からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ^ＴＭ ＰＬＵＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて単核球を分離した。１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にて細胞濃度を１×１０^７／ｍＬに調製し、エフェクター細胞とした。
３．ＡＤＣＣ活性の測定
ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体またはヒトＩｇＧ１を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にて希釈し、標的細胞に５０μＬずつ加え、氷上にて１５分間反応させた。次にエフェクター細胞を１００μＬ加え、炭酸ガスインキュベーター内で３７℃にて４時間培養した。抗体の終濃度は０または１０μｇ／ｍＬとした。培養後、上清を１００μＬ回収し、ガンマカウンター（ＣＯＢＲＡＩＩＡＵＴＯ−ＧＡＭＭＡ、ＭＯＤＥＬ Ｄ５００５、Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ社製）にて放射活性を測定した。ＡＤＣＣによる細胞傷害活性を以下の計算式により求めた。なお、最大遊離放射活性は、標的細胞に１％ＮＰ−４０（半井社製）を加えることで細胞を破壊して測定した。細胞傷害活性（％）は、（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）×１００で計算した。なお、Ａは抗体存在下において遊離された放射活性（ｃｐｍ）、ＢはＮＰ−４０により遊離された放射活性（ｃｐｍ）、Ｃは抗体を含まず培養液のみで遊離された放射活性（ｃｐｍ）である。
４．結果
ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体はＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＣＯＬＯ ２０５、ＷｉＤｒ、ＵＣＣ−５、ＰＡ−１に対して、ＡＤＣＣ活性を示した（図４）。
参考例１． ラットミエローマＹＢ２／０でのヒト化抗ＨＭ１．２４抗体の発現
１０μｇのヒト化抗ＨＭ１．２４抗体発現ベクター（ＡＨｉ／Ｎ５ＫＧ１Ｖ−ｌａｒｋ，Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ ａｎ Ｉｍｐａｉｒｅｄ Ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ Ｍａｒｋｅｒ． Ｉｎ： Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｙ．＆ Ｉｍａｎａｋａ，Ｔ．（ｅｄｓ）ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｖｏｌ ６０４：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２７，１９９５，ＷＯ９８／４５８０）を２×１０^６／０．６ｍＬ ＰＢＳ（−）のＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＴ−１６６２）へ、エレクトロポレーション法で１．５ｋＶ，２５μＦの条件で導入した。培養は５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で行った。
１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社）に４００μｇ／ｍＬ Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎを加えて選択した後、５０ｎＭ ＭＴＸ，１００ｎＭ ＭＴＸ，２００ｎＭ ＭＴＸと順次ＭＴＸ濃度をあげ、遺伝子増幅を行った。また、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ社）に２００ｎＭ ＭＴＸ、４００μｇ／ｍＬ Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎを含む１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４０中、０．５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌで蒔きこみ、限界希釈法にて細胞のクローニングを行った。
ヒト化抗ヒトＨＭ１．２４抗体遺伝子を導入したＹＢ２／０細胞の培養上清は参考例２で示すＥＬＩＳＡにより定量した。
参考例２． ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体の定量（ＥＬＩＳＡ法）
９６−ウエルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｎｕｎｃ社製）にコート緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ炭酸水素ナトリウム，ｐＨ９．６）で１００ｎｇ／ｍｌ程度に希釈した可溶型ＨＭ１．２４抗原を１００μＬずつ添加し、４℃で１晩以上反応させた。反応後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを２００μＬ／ウエルで加え室温で約２時間放置し、作製したプレートは４℃で保存した。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを転倒除去した後、各ｗｅｌｌをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄した。
適宜希釈したヒト化抗ＨＭ１．２４抗体標準液又はサンプル溶液と１００ｎｇ／ｍＬに希釈したビオチン標識ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体を１：１で混ぜた後、１００μＬ／ｗｅｌｌで分注した。室温で、約１時間反応させた後、各ウエルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄した。アビジン標識ＨＲＰを各ウエルに添加し、室温で１５分以上反応させ、ＴＭＢ ｌｉｑｉｄ（Ｓｉｇｍａ社製）を１００μＬ／ウエルで加え、２ｍｏｌ／Ｌ硫酸を５０μＬ／ウエル加えることにより反応を止めた後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体標準液の濃度−吸光度の検量線から、サンプル溶液のヒト化ＨＭ１．２４抗体濃度を算出した。
参考例３． ＹＢ２／０で発現させたヒト化抗ヒトＨＭ１．２４抗体の精製
ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体の発現が確認された細胞は、１７００ｃｍ^２のローラーボトル（ＣＯＲＮＩＮＧ社）で拡大培養を行った。すなわち１×１０^９個のヒト化抗ＨＭ１．２４抗体発現ＹＢ２／０細胞を４００ｍＬの２００ｎＭ ＭＴＸ、４００μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含む１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地で（２．５ｒｐｍ）でコンフルエントになるまで培養した。その後、培養上清の回収用にＦＣＳをＰＢＳ（−）で平衡化したｒＰｒｏｔｅｉｎＡ ＦＦ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ社）を予め素通りさせることでウシ由来ＩｇＧを除き（ＦＣＳ（−））、このＦＣＳ（−）を用いた２００ｎＭ ＭＴＸ、４００μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含む１０％ＦＣＳ（−）／ＲＰＭＩ１６４０培地で３〜４日間培養した。
培養上清は０．２２μｍフィルター処理した後、ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ ＦＦ（ＰＢＳ／ＰＢＳ−クエン酸：リニアグラジエント溶出）およびＳｏｕｒｃｅ１５Ｓ（２０ｍＭ酢酸、０−０．５ｍＭ ＮａＣｌ：リニアグラジエント溶出）で精製した。精製したヒト化抗ＨＭ１．２４抗体はＨＭ１．２４抗体−ＹＢと名付けた（図５）。
参考例４． ＨＭ１．２４抗原（ＢＳＴ−２）を発現するＣＨＯ細胞の作製
ＨＭ１．２４抗原蛋白質を発現するＣＨＯ細胞を次のようにして作製した（Ｏｈｔｏｍｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２５８（１９９９），５８３−５９１）。即ち、ＤＨＦＲを欠損したＣＨＯ細胞株に、ＨＭ１．２４抗原をコードする発現ベクターｐ３．１９（上記文献）を導入し、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８で選択し、さらに限界希釈法によりＨＭ２６、ＨＭ３１、ＨＭ２１及びＨＭ３６の４つの細胞株を得た。細胞表面上のＨＭ１．２４抗原の発現数は特願２００１−１１５８８９に記された方法にてフローサイトメトリーで測定したところ、それぞれ細胞あたり３．８×１０^３、２．２×１０^４、２．２×１０^４及び１．８×１０^５個であった。
参考例５． ヒト末梢血由来ＰＢＭＣを用いたＡＤＣＣ活性の測定
（１）ヒトＰＢＭＣ溶液の調製
健常人よりヘパリン加採血した末梢血を、ＰＢＳ（−）で２倍に希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ^ＴＭＰＬＵＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）に重層した。これを遠心（５００×ｇ、３０分間、２０℃）した後、単核球画分である中間層を分取した。３回洗浄後、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩに懸濁し、ヒトＰＢＭＣ溶液とした。
（２）標的細胞溶液の調製
参考例４に示したＨＭ１．２４抗原（ＢＳＴ−２）を発現するＣＨＯ細胞は、細胞剥離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ）を用いてディッシュから剥離し、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ ２００μＬに浮遊し、５．５５ＭＢｑのＣｈｒｏｍｉｕｍ−５１を加え、５％炭酸ガスインキュベータ中３７℃１時間培養した。この細胞を３回洗浄した後、１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地中個々の細胞濃度に調製し、標的細胞溶液とした。
（３）クロム遊離試験（ＡＤＣＣ活性）
標的細胞溶液を９６ウェルＵ底プレートに５０μＬずつ分注し、各濃度に調製した抗体溶液５０μＬを添加し、氷上で１時間反応させた後に、ヒトＰＢＭＣ溶液１００μＬを加え、５％炭酸ガスインキュベータ中３７℃４時間培養し、培養後培養上清１００μＬ中の放射活性をガンマカウンターで測定した。下式により特異的クロム遊離率を求めた。
特異的クロム遊離率（％）＝（Ａ−Ｃ）×１００／（Ｂ−Ｃ）
Ａは各ウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値、Ｂは標的細胞浮遊液を５０μＬ、１０％ＮＰ−４０水溶液（Ｎｏｎｉｄｅｔ（商標）Ｐ−４０，ナカライテスク社製）を２０μＬ、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地を１３０μＬ添加したウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値、Ｃは標的細胞浮遊液を５０μＬ、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地を１５０μＬ添加したウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値を示す。
参考例６． βガラクトシダーゼ安定発現ＣＨＯ細胞株を用いたＡＤＣＣ活性測定法
エフェクター細胞として健常人の末梢血より比重遠心法で分離した単核球を用いた。すなわち、健常人の末梢血に等量のＰＢＳを加え、Ｆｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＰＬＵＳ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に積層し、５００ｇで３０分間遠心した。単核球相を分取し、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０で３回洗浄後、１０％ＦＣＳを含むα−ＭＥＭで細胞数が５ｘ１０^６／ｍＬになるように調製した。
トリプシン−ＥＤＴＡで剥がし、１０％ＦＣＳを含むα−ＭＥＭで懸濁した２ｘ１０^５細胞／ｍＬのβガラクトシダーゼ安定発現ＣＨＯ＃３０細胞株５０μＬと、様々な濃度の抗ＨＭ１．２４抗体５０μＬを９６ウエルＵ底プレートに加え、４℃で１５分間反応させた。ついでエフェクター細胞１００μＬを加え、３７℃で４時間培養した。培養後、２０μＬの培養上清を採取し、βガラクトシダーゼ活性を測定した。最大遊離酵素量はＧａｌａｃｔｏｎｅ−ｓｔａｒアッセイキットの細胞溶解緩衝液により遊離される酵素量とした。
細胞傷害活性は、
細胞傷害活性（％）＝（Ａ−Ｃ）×１００／（Ｂ−Ｃ）
（％β−ガラクトシダーゼ）
として計算した。ここでＡは抗体存在下において遊離されたβガラクトシダーゼ活性（ＲＬＵ／ｓｅｃ）、Ｂは細胞溶解緩衝液により遊離されたβガラクトシダーゼ活性（ＲＬＵ／ｓｅｃ）、Ｃは抗体を含まず培養液のみで遊離されたβガラクトシダーゼ活性（ＲＬＵ／ｓｅｃ）を示す。
参考例７． ＹＢ２／０由来ヒト化抗ヒトＨＭ１．２４抗体のＡＤＣＣ活性の測定
ＹＢ２／０で発現させたＨＭ１．２４抗体（ＨＭ１．２４抗体−ＹＢ）のＡＤＣＣ活性を参考例５の方法にて測定した結果を図６〜図７に示した。図６に示したように、いずれの標的細胞においても、ＨＭ１．２４抗体−ＹＢは、ＤＧ４４（ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞：Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｇａｍｍａ Ｒａｙｓ ａｔ ｔｈｅ Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ Ｌｏｃｕｓ： Ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）ａｎｄ Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎｓ．Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２：５５５，１９８６）で産生したＨＭ１．２４抗体（ＨＭ１．２４抗体−ＤＧ４４）よりも高いＡＤＣＣ活性を示した。
具体的には、より低濃度でＡＤＣＣ活性の誘導が認められ、最大のＡＤＣＣ活性にも向上が見られた。特にＨＭ１．２４抗原の発現数が少ない標的細胞ＨＭ２６，ＨＭ３１を用いた場合、ＨＭ１．２４抗体−ＤＧ４４では非常に低いＡＤＣＣ活性しか示さなかったのに対してＨＭ１．２４抗体−ＹＢでは高いＡＤＣＣ活性が出現した。また、図７に示したように、標的細胞数に対するＰＢＭＣ数の割合（Ｅ／Ｔ比）が２５の時のみならず、Ｅ／Ｔ比が５の場合もＨＭ１．２４抗体−ＹＢはＨＭ１．２４抗体−ＤＧ４４よりも高いＡＤＣＣ活性を示した。
参考例８． 糖鎖の解析
１．２−アミノピリジン標識糖鎖（ＰＡ化糖鎖）の調製
本発明のＹＢ２／０由来抗体、及び対照試料としてＣＨＯ由来の抗体に、Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ）を作用させ、糖鎖を蛋白質から遊離させた（Ｗｅｉｔｚｈａｎｄｌｅｒ Ｍ．ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ８３：１２（１９９４），１６７０−１６７５）。セルロースカートリッジ（ＴＡＫＡＲＡ製）を用いた固相抽出（Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３２（２００１），３８１−３８８）により脱塩した後濃縮乾固し、２−アミノピリジンによる蛍光標識を行った（Ｋｏｎｄｏ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５４：８（１９９０），２１６９−２１７０）。得られたＰＡ化糖鎖を、セルロースカートリッジを用いた固相抽出により脱試薬した後遠心濃縮し、精製ＰＡ化糖鎖とした。
２．精製ＰＡ化糖鎖の逆相ＨＰＬＣによる分析
上記参考例８の１項の方法で、本発明のＹＢ２／０由来抗体、及び対照試料としてＣＨＯ由来の抗体についてＰＡ化糖鎖の調製を行った後、ＯＤＳカラム（ＴＡＫＡＲＡ製Ｐａｌｐａｋ Ｔｙｐｅ Ｒ）による逆相ＨＰＬＣ分析を打い、クロマトグラムを比較した。ＣＨＯ由来抗体の糖鎖に比較して、ＹＢ２／０由来抗体の糖鎖は、２０分から３５分までに溶出するフコース無しと推定される糖鎖（Ａ−Ｄ）のピーク増加が確認された（図８）。
３．精製ＰＡ化糖鎖の二次元マッピングによる分析
上記参考例．８の１項の方法で、本発明のＹＢ２／０由来抗体についてＰＡ化糖鎖の調製を行った後、ＯＤＳカラムによる逆相ＨＰＬＣ分析及びアミンカラム（ＴＡＫＡＲＡ製Ｐａｌｐａｋ Ｔｙｐｅ Ｎ）による順相ＨＰＬＣ分析を組み合わせた、二次元マッピングを実施した。具体的には、アミンカラムによる順相ＨＰＬＣで、精製ＰＡ化糖鎖のメインピークを粗分画し、各分画を逆相ＨＰＬＣにて分析した。
各糖鎖の同定は、ＰＡ化糖鎖標準品（ＴＡＫＡＲＡ製、ホーネン製、生化学工業製；図９のＫ，Ｏ，Ｐを除く）とのＨＰＬＣにおける溶出位置の比較及びＴＯＦ−ＭＳによる分子量確認にて行った。同定された各糖鎖の相対比を第１表に示す（Ｊ，Ｋの区別及びＮ，Ｏの区別は本参考例においては行っていない）。また、表１に示す糖鎖の構造を図９及び図１０に示す。この結果本発明のＹＢ２／０由来抗体は、フコースの無い糖鎖が３０％以上存在し、且つバイセクティングＧｌｃＮＡｃを持つ糖鎖が存在することが確認された。

参考例９． ヒトＧｎＴＩＩＩ発現ベクターの作製
ヒトＧｎＴＩＩＩ遺伝子配列はＮＣＢＩデーターベース（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｄ１３７８９）より入手した。配列はＧＥＮＥＴＹＸ−ＳＶ／ＲＣで解析し、繰返し配列が多いことから、ＰＣＲによる増幅を容易にする目的で、サイレント変異を複数箇所導入したプライマーをデザインし、ＰＣＲによる合成にて取得した。ＰＣＲにはＫＯＤポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、塩基番号８０１から８７０までの二本鎖を最初の鋳型とし、下に示すプライマーを用いて順次、ＰＣＲを行った。下記のプライマー配列において、大文字はサイレント変異を導入した塩基を示す。また、数字は翻訳開始部位からの何塩基目かを示す。図１１は、ＧｎＴＩＩＩ遺伝子に対する各プライマーの位置を示す。

必要に応じて増幅断片をアガロースゲル電気泳動して、目的断片をゲルから切り出して精製したものを次のＰＣＲの鋳型とした。最終的にＰＣＲのみで全長を増幅することが困難であったため、予めプライマー内にサイレント変異として挿入しておいたＢａｍＨＩ部位を用いて、その前後の断片を増幅後に連結することにより、全長ヒトＧｎＴＩＩＩ遺伝子を取得した。図１５〜図１９に、生来型ヒトＧｎＴＩＩＩをコードする塩基配列（配列番号：３０）（ＧｎＴＩＩＩ ｏｒｉ．ｎｕｃ）と変異型ヒトＧｎＴＩＩＩをコードする塩基配列（配列番号：３１）（ＧｎＴＩＩＩ ｍｕｔ．ｎｕｃ）と対比を示す。図中、星印は、両配列の対応する塩基が同一であることを示す。
ヒトＧｎＴＩＩＩは、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｈｙｇｒｏ−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に組込み、配列を確認した。
参考例１０． ＨＭ１．２４抗体−ＤＧ４４発現ＣＨＯ細胞でのＧｎＴＩＩＩの発現
上記参考例９で得られた１０μｇのＧｎＴＩＩＩ／ｐｃＤＮＡ３．１（Ｈｙｇｒｏ−）をＨＭ１．２４抗体−ＤＧ４４発現ＣＨＯ株にエレクトロポレーション法で１．５ｋＶ，２５μＦの条件で導入した。培養は５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で行った。９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ社）に、１０％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）を用いて、１０細胞／１００μＬ／ｗｅｌｌで蒔きこみ、２日間培養した。４００μｇ／ｍＬハイグロマイシンを含む１０％ＦＣＳ−ＩＭＤＭ培地に代え、１〜２週間、細胞の選択を行った。ハイグロマイシン耐性コロニーが出現し、増殖の認められた細胞の培養上清を回収し、ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体抗体量を参考例２のＥＬＩＳＡ法により測定した。
参考例１１． ＧｎＴＩＩＩ発現ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体産生ＣＨＯ細胞のＡＤＣＣ活性によるスクリーニング
ＧｎＴＩＩＩを強制的に発現させたヒト化抗ＨＭ１．２４抗体産生細胞（クローンＮｏ．１〜３１）に由来するヒト化抗ＨＭ１．２４抗体及びＨＭ１．２４抗体−ＤＧ４４の培養液を抗体濃度４００ｎｇ／ｍｌに培地を用いて希釈し、参考例６に示した方法を用いてＡＤＣＣ活性を測定し比較した（図１２）。
最終的にＡＤＣＣ活性とヒト化抗ＨＭ１．２４抗体発現量および増殖速度を考慮してスクリーニングを行い、クローンＮｏ．６（５７Ｂ２）を得た。
参考例１２． ＧｎＴＩＩＩ発現ＣＨＯ細胞由来ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体のＡＤＣＣ活性の測定
ＧｎＴＩＩＩを強制的に発現させたヒト化抗ＨＭ１．２４抗体産生細胞に由来するヒト化抗ＨＭ１．２４抗体のＡＤＣＣ活性を参考例５の方法にて測定した結果を図１３に示した。クローンＮｏ．３，Ｎｏ．６（５７Ｂ２）とＨＭ１．２４抗体−ＤＧ４４を比較した結果、いずれのクローンもＨＭ１．２４抗体−ＤＧ４４よりも高いＡＤＣＣ活性を示した。

【配列表】

Claims (21)

1. 配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体または抗体活性を維持している抗体断片を有効成分として含有する固形腫瘍治療剤。
2. 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１に記載の治療剤。
3. 前記抗体が、ヒト抗体の定常領域とマウス抗体の可変領域とから成るキメラ抗体である、請求項１に記載の治療剤。
4. 前記抗体が、マウス抗体の相補性決定領域とヒト抗体のフレームワーク領域および定常領域とから成るヒト化抗体である、請求項１に記載の治療剤。
5. 前記抗体がヒト抗体である、請求項１に記載の治療剤。
6. 前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２またはＦｖ断片である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の治療剤。
7. 前記固形腫瘍が、頭頸部癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、食道癌、乳癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆道癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、皮膚癌、脳腫瘍、小児固形癌もしくは悪性骨腫瘍、またはこれらの固形癌の転移癌である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の治療剤。
8. 固形腫瘍治療剤の製造のための、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体または抗体活性を維持している抗体断片の使用。
9. 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項８に記載の使用。
10. 前記抗体が、ヒト抗体の定常領域とマウス抗体の可変領域とから成るキメラ抗体である、請求項８に記載の使用。
11. 前記抗体が、マウス抗体の相補性決定領域とヒト抗体のフレームワーク領域および定常領域とから成るヒト化抗体である、請求項８に記載の使用。
12. 前記抗体がヒト抗体である、請求項８に記載の使用。
13. 前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２またはＦｖ断片である、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の使用。
14. 前記固形腫瘍が、頭頸部癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、食道癌、乳癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆道癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、皮膚癌、脳腫瘍、小児固形癌もしくは悪性骨腫瘍、またはこれらの固形癌の転移癌である、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の使用。
15. 配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体または抗体活性を維持している抗体断片を治療を必要とする対象に投与することを含んで成る固形腫瘍の治療方法。
16. 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記抗体が、ヒト抗体の定常領域とマウス抗体の可変領域とから成るキメラ抗体である、請求項１５に記載の方法。
18. 前記抗体が、マウス抗体の相補性決定領域とヒト抗体のフレームワーク領域および定常領域とから成るヒト化抗体である、請求項１５に記載の方法。
19. 前記抗体がヒト抗体である、請求項１５に記載の方法。
20. 前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２またはＦｖ断片である、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記固形腫瘍が、頭頸部癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、食道癌、乳癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆道癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、皮膚癌、脳腫瘍、小児固形癌もしくは悪性骨腫瘍、またはこれらの固形癌の転移癌である、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。

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