JPH10155494A - 再構成ヒト抗ｈｍ１．２４抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規な再構成ヒト抗体の提供。 【解決手段】 （Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及び
（２）ヒトＬ鎖ＦＲ、及びマウス抗ＨＭ１．２４モノク
ローナル抗体のＬ鎖ＣＤＲを含んでなるＬ鎖Ｖ領域、を
含んで成るＬ鎖；並びに （Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及び（２）ヒトＨ鎖Ｆ
Ｒ、及びマウス抗ＨＭ１．２４モノクローナル抗体のＨ
鎖ＣＤＲを含んで成るＨ鎖Ｖ領域を含んで成るＨ鎖；を
含んで成る再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体。この再構成
ヒト抗体の大部分がヒト抗体に由来し、そしてＣＤＲは
抗原性が低いことから、本発明の再構成ヒト抗体はヒト
に対する抗原性が低く、そしてそれ故に医学療法用とし
て期待される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は再構成ヒト抗ＨＭ
１．２４抗体及びキメラ抗ＨＭ１．２４抗体、並びにこ
れらをコードする遺伝子、該抗体の製造方法、及び該抗
体の使用に関する。本発明の再構成ヒト抗体及びキメラ
抗体は、骨髄腫の治療剤等として特に有用である。

【０００２】

【従来の技術】ヒトB 細胞は、発現している表面抗原に
より分類されるいくつかの段階を通して最終的に抗体産
生形質細胞へと成熟する。B 細胞の終末分化段階では、
細胞質免疫グロブリン産生能を獲得する一方で、細胞表
面免疫グロブリン、HLA-DR、CD20、Fcレセプターおよび
補体C3レセプターなどのB 細胞関連抗原が消失する（Li
ng, N. R. et al., Leucocyte TypingIII (1986) p320,
Oxford, UK, Oxford ）。

【０００３】これまで、形質細胞の細胞膜上の抗原を認
識する抗PCA-1 （Anderson, K. C.et al., J.Immunol.
(1983) 130, 1132 ）、抗PC-1（Anderson, K. C. et a
l.,J. Immunol. (1983)132, 3172 ）、抗MM4 （Tong,
A. W. et al., Blood (1987)69, 238）等のモノクロー
ナル抗体が報告されてきたが、形質細胞と骨髄腫細胞の
検出には依然として抗CD38モノクローナル抗体が使用さ
れている（Epstein, J. et al., N. Engl. J. Med. (19
90) 322, 664、Terstappen, L. W. M. M. et al., Bloo
d (1990) 76, 1739 、Leo, R. et al., Ann. Hematol.
(1992) 64, 132、Shimazaki, C. et al., Am. J. Hemat
ol. (1992) 39, 159 、Hata, H. et al., Blood (199
3) 81, 3357、Harada, H. et al., Blood (1993) 81, 2
658、Billadeau, D. et al., J. Exp. Med. (1993) 17
8, 1023 ）。

【０００４】しかしながら、抗CD38モノクローナル抗体
は、B 細胞の分化に関連する抗原というよりもむしろ、
T 細胞の活性化に関連する抗原であり、B 細胞以外の種
々の細胞上にも発現する。さらに、CD38はリンパ形質細
胞様腫瘍細胞（lymphoplasmacytoid）の一部には発現し
ないにもかかわらず、造血前駆細胞上で強く発現してい
る。これらの理由から、抗CD38モノクローナル抗体はヒ
トB 細胞の分化、成熟に関する研究および形質細胞の疾
患の治療に適していないと考えられる。

【０００５】Goto, T.らはヒト形質細胞を免疫して得ら
れた、B 細胞系列に特異的に発現する分子量が29-33kDa
の抗原を認識するマウスモノクローナル抗体HM1.24を報
告している（Blood (1994) 84, 1922-1930）。モノクロ
ーナル抗体HM1.24が認識する抗原は、B 細胞の終末分化
に関連した抗原であると考えられること（Goto, T. et
al., Jpn. J. Clin. Immun. (1992) 16, 688-691）、お
よび形質細胞腫を移植したマウスにモノクローナル抗体
HM1.24を投与すると、この抗体が腫瘍に特異的に集積し
たこと（尾崎修治ら、第19回日本骨髄腫研究会総会プロ
グラム、一般演題3 ）から、モノクローナル抗体HM1.24
は、ラジオアイソトープで標識することによる腫瘍局在
の診断や、ラジオイムノセラピー（radioimmunotherap
y）などのミサイル療法に応用することが可能であるこ
とが示唆されている。

【０００６】また、上記Blood には、モノクローナル抗
体HM1.24がin vitroにおいてヒト骨髄腫細胞株RPMI8226
に対して補体依存性細胞障害活性を有することが述べら
れている。骨髄腫は、モノクローナルな形質細胞（骨髄
腫細胞）の骨髄内集積を特徴とする腫瘍性疾患である。
骨髄腫は免疫グロブリンを産生分泌する終末分化B 細
胞、すなわち形質細胞がモノクローナルに主として骨髄
に増加する疾患で、血清中にモノクローナルな免疫グロ
ブリンもしくはその構成成分であるL 鎖、H 鎖などが検
出される（小阪昌明ら、日本臨床 (1995) 53, 91-99
）。骨髄腫の治療としては、これまで化学療法剤等が
使用されているが、骨髄腫を寛解に導き、骨髄腫患者の
生存期間を延長するような有効な治療剤は見いだされて
おらず、骨髄腫の治療効果を有する薬剤の登場が待たれ
ていた。

【０００７】マウスのモノクローナル抗体は、ヒトにお
いて高度に免疫原性（「抗原性」という場合もある）が
あり、このため、ヒトにおけるマウスモノクローナル抗
体の医学療法的価値は制限されている。例えば、マウス
抗体をヒトに投与すると異物として代謝されうるので、
ヒトにおけるマウス抗体の半減期は比較的短く、期待さ
れた効果を充分に発揮できない。さらに、投与したマウ
ス抗体に対して発生するヒト抗マウス抗体（HAMA）は、
血清病あるいは他のアレルギー反応など、患者にとって
不都合で危険な免疫応答を惹起する。したがって、マウ
モノクローナル抗体をヒトに頻回投与することはできな
い。

【０００８】これらの問題を解決するため、非ヒト由来
の抗体、例えばマウス由来のモノクローナル抗体の免疫
原性を低減させる方法が開発された。その一つとして、
抗体の可変領域（Ｖ領域）はもとのマウスモノクローナ
ル抗体に由来し、定常領域（Ｃ領域）は適当なヒト抗体
に由来するキメラ抗体を作製する方法がある。得られる
キメラ抗体はもとのマウス抗体の可変領域を完全な形で
含有するので、もとのマウス抗体と同一の特異性をもっ
て抗原に結合することが期待できる。さらに、キメラ抗
体ではヒト以外に由来するアミノ酸配列の比率が実質的
に滅少しており、それ故にもとのマウス抗体に比べて免
疫原性が低いと予想される。キメラ抗体はもとのマウス
モノクローナル抗体と同等に抗原に結合しそして免疫原
性が低いが、それでもなおマウス可変領域に対する免疫
応答が生ずる可能性がある（ＬｏＢｕｇｌｉｏ，Ａ．
Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８６，４２２０−４２２４，ｌ９８９）。

【０００９】マウス抗体の免疫原性を低減させるための
第二の方法は一層複雑であるが、しかしマウス抗体の潜
在的な免疫原性をさらに大幅に低下させるものである。
この方法においては、マウス抗体の可変領域から相補性
決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅ
ｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）のみをヒト抗
体可変領域に移植して「再構成」（ｒｅｓｈａｐｅｄ）
ヒト抗体可変領域を作製する。

【００１０】ただし必要によっては、再構成ヒト抗体可
変領域のＣＤＲの構造をより一層もとのマウス抗体の構
造に近づけるために、ＣＤＲを支持しているフレームワ
ーク領域（ＦＲ）の一部のアミノ酸配列をマウス抗体の
可変領域からヒト抗体可変領域に移植する場合がある。
次に、これらのヒト型化された再構成ヒト抗体可変領域
をヒト抗体定常領域に連結する。最終的に再構成された
ヒト型化抗体のヒト以外のアミノ酸配列に由来する部分
はＣＤＲ、および、極く一部のＦＲのみである。ＣＤＲ
は超可変アミノ酸配列により構成されており、これらは
種特異的配列を示さない。このため、マウスＣＤＲを担
持するヒト型化抗体はもはやヒト抗体ＣＤＲを含有する
天然ヒト抗体より強い免疫原性を有しないはずである。

【００１１】ヒト型化抗体についてはさらに、Ｒｉｅｃ
ｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−
３２７，ｌ９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅ，Ｍ．ら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２３９，ｌ５３４−ｌ５３６，ｌ９８８；Ｋ
ｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら、Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｅｎｇｎｇ．，４，７７３−７８３，ｌ９９ｌ；Ｍ
ａｅｄａ，Ｈ．ら、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，２，ｌ２４−ｌ３４，
ｌ９９ｌ；Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４ｌ８ｌ−４
ｌ８５，ｌ９９ｌ；Ｔｅｍｐｅｓｔ，Ｐ．Ｒ．ら、Ｂｉ
ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，２６６−２７ｌ，ｌ９
９ｌ；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，２８６９−２８７３，ｌ９
９ｌ；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５−４２８９，
ｌ９９２；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，
ｌ４８，ｌｌ４９−ｌｌ５４，ｌ９９２；およびＳａｔ
ｏ，Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５３，８５ｌ−
８５６，ｌ９９３を参照のこと。

【００１２】Queen et al(国際特許出願公開番号WO90-0
7861) には、抗IL-2レセプター抗体Anti-Tacのヒト型化
抗体の作成方法が記載されている。しかしながら、WO90
-07861に記載されているヒト型化抗体の作成方法にした
がっても全ての抗体を完全にヒト型化することは困難で
ある。すなわち、WO90-07861には一般的な抗体のヒト型
化方法が記載されているのではなく、単に抗IL-2レセプ
ター抗体の一つである特定の抗体であるAnti-Tac抗体の
ヒト型化方法が記載されているに過ぎない。また、例え
WO90-07861の方法に従っても、完全に元のマウス抗体と
同程度の活性を有するヒト型化抗体を作製することは難
しい。

【００１３】一般に、個々の抗体のCDR ・FRのアミノ酸
配列は各々異なる。したがって、ヒト型化抗体の構築に
必要な置換されるべきアミノ酸残基の決定とそのアミノ
酸残基と置換するアミノ酸残基の選択は各々の抗体によ
り異なる。したがって、WO90-07861に記載されたヒト型
化抗体の作製方法は全ての抗体のヒト型化に適用するこ
とはできない。Queen et al., Proc.Natl.Acad.Sci. US
A (1989) 86, 10029-10033にはWO90-07861と同じ内容が
記載されている。この文献にはWO90-07861の方法にした
がってもヒト型化抗体の元のマウス抗体の約1/3 の活性
しか得られなかったことが記載されている。すなわち、
WO90-07861の方法自体が元のマウス抗体と同程度の活性
を有する完全なヒト型化抗体を作製することができない
ことを示している。

【００１４】Co et al., Cancer Research (1996) 56,
1118-1125 は上記Queen et al のグループにより発行さ
れた。この文献にはWO90-07861のヒト型化抗体の作成方
法にしたがっても元のマウス抗体と同程度の活性を有す
るヒト型化抗体を構築することができなかったことが記
載されている。すなわち、WO90-07861の方法自体が元の
マウス抗体と同程度の活性を有する完全なヒト型化抗体
を作製することができないことと共に、WO90-07861のヒ
ト型化抗体の作製方法が全ての抗体のヒト型化に適用で
きないことを示している。

【００１５】Ohtomo et al., Molecular Immunology (1
995) 32, 407-416にはマウスONS-M21 抗体のヒト型化が
記載されている。この文献にはWO90-07861に記載のAnti
-Tac抗体のヒト型化で示唆されたアミノ酸残基は何ら活
性に関係せず、WO90-07861に記載された方法は適用でき
ないことを示している。Kettleborough et al., Protei
n Eng. (1991) 4, 773-783には、アミノ酸残基を置換す
ることによりマウス抗体からいくつかのヒト型化抗体を
作製したことを記載している。しかしながら、WO90-078
61に記載のAnti-Tac抗体のヒト型化方法で示唆された以
上のアミノ酸残基の置換が必要だった。これらの文献が
示すのは、WO90-07861に記載されたヒト型化抗体の作製
方法はその中に記載されたAnti-Tac抗体のヒト型化にの
み適用可能な技術であること、及びその技術を使用して
も元のマウス抗体と同程度の活性を得ることはできない
ことである。

【００１６】これらの文献に記載された元のマウス抗体
はWO90-07861に記載されたAnti-Tac抗体と異なるアミノ
酸配列を有する。したがって、Anti-Tac抗体に適用可能
なヒト型化抗体作製方法を他の抗体に適用することはで
きなかった。同様に本件発明のマウス抗HM1.24抗体は、
Anti-Tac抗体と異なるアミノ酸配列を有するためにAnti
-Tac抗体のヒト型化作製方法を適用することはできな
い。さらに、構築に成功した本件発明のヒト型化抗体
は、WO90-07861に記載のヒト型化Anti-Tac抗体と異なる
アミノ酸配列を有しており、このことも異なるCDR-FRの
配列を有する抗体をヒト型化するために全く同じ手法は
適用できないことを示している。

【００１７】したがって、ヒト型化の元となるマウス抗
体が知られていたとしても、いかなるCDR ・FRの配列を
有するヒト型化抗体が活性を示すのかは試行錯誤の実験
により初めて成功する。WO90-07861には、そのCDR の配
列はおろか、本願発明で構築されたヒト型化抗体におい
て組み合わされるFRの配列及びそのFRとの組み合わせに
より活性を有するヒト型化抗体が得られることはいっさ
い記載されていない。前記のごとく、ヒト型化抗体は療
法目的のために有用であると予想されるが、ヒト型化抗
HM1.24抗体は知られておらず、示唆もなされていない。
また、ヒト型化抗体の製造方法において任意の抗体に普
遍的に適用し得る画一的な方法は存在せず、特定の抗原
に対して十分な結合活性、結合阻害活性および中和活性
を示すヒト型化抗体を作製するためには種々の工夫が必
要である（例えば、Ｓａｔｏ，Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．，５３，８５ｌ−８５６，ｌ９９３）。

【００１８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は抗ＨＭ１．２
４抗体の再構成ヒト抗体を提供する。本発明はまた、該
再構成ヒト抗体の作製の過程で有用であるヒト／マウス
キメラ抗体を提供する。本発明はさらに、再構成ヒト抗
体の断片を提供する。並びに本発明はキメラ抗体、再構
成ヒト抗体およびそれらの断片の製造のための発現系を
提供する。本発明はさらにまた、抗ＨＭ１．２４抗体の
キメラ抗体およびそれらの断片の製造方法、及び抗ＨＭ
１．２４抗体の再構成ヒト抗体およびそれらの断片の製
造方法を提供する。

【００１９】

【課題を解決するための手段】さらに具体的には、本発
明は、配列番号：103 に示すアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドを特異的に認識するキメラ抗体及び再構成ヒト
抗体を提供する。該ポリペプチドをコードするcDNAはpU
C19 ベクターのXbaI切断部位の間に挿入されて、プラス
ミドpRS38-pUC19 として調製されている。このプラスミ
ドpRS38-pUC19を含む大腸菌(E. coli) は平成５年（199
3年）10月５日付で工業技術院生命工学工業技術研究所
（茨城県つくば市東１丁目１番３号）にEscherichia co
li DH5α(pRS38-pUC19) として、受託番号FERM BP-4434
としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている（特
開平７−196694参照）。

【００２０】このようなキメラ抗体あるいは再構成ヒト
抗体の一つの態様として、キメラ抗HM1.24抗体あるいは
再構成ヒト抗HM1.24抗体が挙げられる。以下に、具体例
としてキメラ抗HM1.24抗体及び再構成ヒト抗HM1.24抗体
について詳細に述べる。すなわち、本発明はまた、ヒト
軽（Ｌ）鎖定常領域（Ｃ領域）、及び抗ＨＭ１．２４抗
体のＬ鎖可変（Ｖ）領域を含んでなるキメラＬ鎖、並び
にヒト重（Ｈ）鎖Ｃ領域、及び抗ＨＭ１．２４抗体のＨ
鎖Ｖ領域を含んでなるキメラＨ鎖を提供する。本発明は
また、（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及び抗ＨＭ１．２４抗体
のＬ鎖Ｖ領域を含んでなるＬ鎖；並びに（２）ヒトＨ鎖
Ｃ領域、及び抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域を含んで
なるＨ鎖；を含んでなるキメラ抗体を提供する。

【００２１】本発明はさらに、（１）ヒトＬ鎖Ｖ領域の
フレームワーク領域 (ＦＲ) 、及び（２）抗ＨＭ１．２
４抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、を含んでなる抗ＨＭ１．
２４抗体の再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒトＬ鎖Ｖ領
域；並びに、（１）ヒトＨ鎖Ｖ領域のＦＲ、及び（２）
抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、を含んでな
る抗ＨＭ１．２４抗体の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域；を提供
する。

【００２２】本発明はさらに、（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、
並びに（２）ヒトＬ鎖ＦＲ、及び抗ＨＭ１．２４抗体の
Ｌ鎖ＣＤＲを含んでなるＬ鎖Ｖ領域、を含んでなる抗Ｈ
Ｍ１．２４抗体の再構成ヒトＬ鎖；並びに（１）ヒトＨ
鎖Ｃ領域、並びに（２）ヒトＨ鎖ＦＲ、及び抗ＨＭ１．
２４抗体のＨ鎖ＣＤＲを含んでなるＨ鎖Ｖ領域、を含ん
でなる抗ＨＭ１．２４抗体の再構成ヒトＨ鎖；を提供す
る。

【００２３】本発明はまた、 （Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及び（２）ヒトＬ鎖Ｆ
Ｒ、及び抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖ＣＤＲを含んでなる
Ｌ鎖Ｖ領域、を含んでなるＬ鎖；並びに （Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及び（２）ヒトＨ鎖Ｆ
Ｒ、及び抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖ＣＤＲを含んでなる
Ｈ鎖Ｖ領域、を含んでなるＨ鎖；を含んでなる抗ＨＭ
１．２４抗体の再構成ヒト抗体、を提供する。

【００２４】本発明はまた、抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖
Ｖ領域をコードするＤＮＡ及び抗ＨＭ１．２４抗体のＨ
鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを提供する。本発明はさら
に、（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域；及び（２）抗ＨＭ１．２４
抗体のＬ鎖Ｖ領域；を含んでなる、キメラＬ鎖をコード
するＤＮＡ；並びに（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域；及び（２）
抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域を含んでなる、キメラ
Ｈ鎖をコードするＤＮＡ；を提供する。

【００２５】（１）ヒトＬ鎖Ｖ領域のＦＲ、及び（２）
抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、を含んでな
る抗ＨＭ１．２４抗体の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域をコード
するＤＮＡ；並びに（１）ヒトＨ鎖Ｖ領域のＦＲ、及び
（２）抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、を含
んでなる抗ＨＭ１．２４抗体の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域を
コードするＤＮＡ；を提供する。

【００２６】本発明はさらに、（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域；
並びに（２）ヒトＬ鎖ＦＲ、及び抗ＨＭ１．２４抗体の
Ｌ鎖ＣＤＲを含んでなるＬ鎖Ｖ領域；を含んでなる抗Ｈ
Ｍ１．２４抗体の再構成ヒトＬ鎖をコードするＤＮＡ；
並びに（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域；並びに（２）ヒトＨ鎖Ｆ
Ｒ、及び抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖ＣＤＲを含んでなる
Ｈ鎖Ｖ領域；を含んでなる抗ＨＭ１．２４抗体の再構成
ヒトＨ鎖をコードするＤＮＡ；を提供する。本発明はさ
らに、上記種々のＤＮＡのいずれかを含んで成るベクタ
ーを提供する。本発明はさらに、上記のベクターにより
形質転換された宿主細胞を提供する。

【００２７】本発明はまた、抗ＨＭ１．２４抗体のキメ
ラ抗体の製造方法であって、前にキメラＬ鎖をコードす
るＤＮＡを含んでなる発現ベクター及び前記Ｈ鎖をコー
ドするＤＮＡを含んでなる発現ベクターにより同時形質
転換された宿主細胞を培養し、そして目的とする抗体を
回収する、段階を含んでなる方法を提供する。本発明は
さらに、抗ＨＭ１．２４抗体の再構成ヒト抗体の製造方
法であって、前記再構成ヒトＬ鎖をコードするＤＮＡを
含んでなる発現ベクター及び前記構成ヒトＨ鎖をコード
するＤＮＡを含んでなる発現ベクターにより同時形質転
換された宿主細胞を培養し、そして目的とする抗体を回
収する、ことを含んでなる方法を提供する。

【００２８】本発明はさらに、前記のキメラ抗体あるい
は再構成ヒト抗体を含んで成る医薬組成物、特に骨髄腫
治療剤を提供する。本発明はさらに、配列番号：103 に
示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを特異的に認識
するキメラ抗体を有効成分として含有する医薬組成物、
及び配列番号：103 に示すアミノ酸配列を有するポリペ
プチドを特異的に認識する再構成ヒト抗体を有効成分と
して含有する医薬組成物を提供する。医薬組成物として
は、特に骨髄腫治療剤を提供する。

【００２９】

【発明の実施の形態】

１．キメラ抗体の構築 （１）マウス抗ＨＭ１．２４モノクローナル抗体のＶ領
域をコードするDNA のクローニングmRNAの調製 マウス抗ＨＭ１．２４モノクローナル抗体のＶ領域をコ
ードするＤＮＡのクローニングを行うため、回収された
ハイブリドーマから公知の方法、例えばグアニジン−超
遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ、（１９７９）、１８、５２９４−５２９
９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐら（１
９８７）、１６２、１５６−１５９）等により全ＲＮＡ
を調製し、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉ
ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）添付のＯｌｉｇｏ（ｄ
Ｔ）−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｓｐｕｎ ｃｏｌｕｍｎ等
によりｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ
ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ社製）を用いることにより、全ＲＮＡの
抽出操作を経ずに、ｍＲＮＡの調製を行うこともでき
る。

【００３０】ｃＤＮＡの調製及び増幅 上記mRNAの調製で得たｍＲＮＡから、逆転写酵素を用い
てＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域におけるｃＤＮＡをそれぞれ合
成する。Ｌ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ Ｒｅ
ｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｆｉｒｓｔ
−ＳｔｒａｎｄｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ
を用いて行う。合成したｃＤＮＡの増幅は抗体遺伝子の
リーダー配列及びＣ領域とハイブリダイズする適当なプ
ライマー（例えば配列番号２９−３９で表される塩基配
列を有するＭＫＶプライマー及び配列番号４０で表わさ
れる塩基配列を有するＭＫＣプライマー）を用いること
が出来る。

【００３１】Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡの合成と増幅は、
５′−Ａｍｐｌｉ ＦＩＮＤＥＲ ＲＡＣＥ ｋｉｔ
（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆ
ｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．ＵＳＡ ８５，８９９８−９００２，１９８８、
Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ら Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．１７，２９１９−２９３２，１９８９）
でＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）にて行うことが出来
る。上記で合成したｃＤＮＡの５′末端にＡｍｐｌｉ
ＦＩＮＤＥＲ Ａｎｃｈｏｒを連結しＨ鎖Ｖ領域の増幅
のためのプライマーとして例えばＡｎｃｈｏｒプライマ
ー（配列番号７７）及びマウスＨ鎖定常領域（Ｃγ領
域）に特異的にハイブリダイズするプライマー（例えば
配列番号４２で表される塩基配列を有するＭＨＣ２ａプ
ライマー）を用いることが出来る。

【００３２】ＤＮＡの精製及び塩基配列の決定 ＰＣＲ産物について、公知手法に従ってアガロースゲル
電気泳動を行い、目的とするＤＮＡ断片を切り出した
後、ＤＮＡの回収及び精製を行い、ベクターＤＮＡに連
結する。ＤＮＡの精製は、市販のキット（例えばGENECL
EAN II; BIO101) を用いて行われる。ＤＮＡ断片を保持
するためのベクターＤＮＡには公知のもの（例えばpUC1
9 、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等) を用いることができる。

【００３３】前記ＤＮＡと上記ベクターＤＮＡとを、公
知のライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結さ
せ、組換えベクターを得る。次に、得られる組換えベク
ターを大腸菌JM109 等に導入した後アンピシリン耐性コ
ロニーを選抜し、公知方法に基づいてベクターＤＮＡを
調製する（J.Sambrook, et al., "Molecular Cloning",
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 。目的
とするＤＮＡの塩基配列は、上記ベクターＤＮＡを制限
酵素で消化した後、公知方法（例えばジデオキシ法）に
より決定する（J.Sambrook, et al., "Molecular Cloni
ng", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 。
本発明では、自動塩基配列決定装置（DNA Sequencer 37
3A; ABI 社) を用いることができる。

【００３４】相補性決定領域 Ｈ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、抗原結合部位を形成
し、その全般の構造は互いに類似性を有している。すな
わち、それぞれ４つのフレームワーク領域（ＦＲ）が３
つの超可変領域、すなわち相補性決定領域（ＣＤＲ）に
より連結されている。ＦＲのアミノ酸配列は、比較的よ
く保存されているが、一方、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列
の変異性は極めて高い（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」ＵＳ Ｄ
ｅｐｔ． Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒ
ｖｉｃｅｓ，１９８３）。

【００３５】前記４個のＦＲの多くの部分は、β−シー
ト構造をとり、その結果３個のＣＤＲはループを形成す
る。ＣＤＲはある場合にはβ−シート構造の一部を形成
することもある。３個のＣＤＲはＦＲによって相互に立
体的に非常に近い位置に保持され、そして対をなす領域
の３個のＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。このよ
うな事実に基づき、マウス抗ＨＭ１．２４モノクローナ
ル抗体の可変領域のアミノ酸配列をＫａｂａｔらにより
作成された抗体のアミノ酸配列のデータベース（「Ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」 ＵＳ Ｄ
ｅｐｔ． Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄＨｕｍａｎ Ｓｅｒｖ
ｉｃｅｓ，１９８３）にあてはめて、相同性を調べるこ
とによりＣＤＲ領域を見いだすことが出来る。

【００３６】（２）キメラ抗体の発現ベクターの作製 マウスモノクローナル抗体のマウスＬ鎖及びＨ鎖Ｖ領域
をコードするＤＮＡ断片がクローニングされれば、これ
らのマウスＶ領域をヒト抗体定常領域をコードするＤＮ
Ａと連結して発現させることによってキメラ抗ＨＭ１．
２４抗体が得られる。キメラ抗体を作製するための基本
的な方法は、クローニングされたｃＤＮＡに存在するマ
ウスリーダー配列及びＶ領域配列を、哺乳類細胞発現ベ
クター中にすでに存在するヒト抗体Ｃ領域をコードする
配列に連結することを含んで成る。あるいは、クローニ
ングされたｃＤＮＡに存在するマウスリーダー配列及び
Ｖ領域配列をヒト抗体Ｃ領域をコードする配列に連結し
た後、哺乳類細胞発現ベクターに連結することを含んで
成る。

【００３７】ヒト抗体Ｃ領域は任意のヒトＨ鎖Ｃ領域お
よびヒトＬ鎖Ｃ領域であることができ、例えばヒトＨ鎖
Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３やＣγ４あるいはＬ鎖ＣλやＣ
κを各々挙げることができる。キメラ抗体の製造のため
には２種類の発現ベクター、すなわちエンハンサー／プ
ロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとで
マウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮ
Ａを含んで成る発現ベクター、並びにエンハンサー／プ
ロモーター系のごとき発現制御領域のもとでマウスＨ鎖
Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んで
成る発現ベクターを作製する。次に、これらの発現ベク
ターにより哺乳類細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換
し、そして形質転換された細胞をインビトロ又はインビ
ボで培養してキメラ抗体を製造する（例えばＷＯ９１−
１６９２８）。

【００３８】あるいは、クローニングされたｃＤＮＡに
存在するマウスリーダー配列及びＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ
鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ並びにマウスリーダー配列
及びＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ
を単一の発現ベクターに導入し（国際特許出願公開番号
ＷＯ９４−１１５２３参照）、そして該ベクターを用い
て宿主細胞を形質転換し、次にこの形質転換された宿主
をインビボ又はインビトロで培養して目的とするキメラ
抗体を生産させる。

【００３９】１）キメラ抗体Ｈ鎖の構築 キメラ抗体のＨ鎖発現ベクターは、マウスＨ鎖Ｖ領域を
コードするｃＤＮＡを、ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域をコード
するゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む適当な発現ベク
ターに導入することにより得ることが出来る。Ｈ鎖Ｃ領
域としては例えばＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３あるいはＣγ
４が挙げられる。

【００４０】Ｃγ１ゲノムＤＮＡを含むキメラＨ鎖発現
ベクターの構築 Ｈ鎖Ｃ領域としてＣγ１のゲノムＤＮＡを有している発
現ベクターとしては、例えばＨＥＦ−ＰＭｈ−ｇγ１
（国際特許出願公開番号ＷＯ９２／１９７５９参照）あ
るいはＤＨＦＲ−△Ｅ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｆ（国際特許出
願公開番号ＷＯ９２／１９７５９参照）を用いることが
出来る。

【００４１】マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを
これらの発現ベクターに挿入するためには、ＰＣＲ法に
より適当な塩基配列を導入することが出来る。例えば、
５’−末端に適当な制限酵素の認識配列と、翻訳効率を
よくするために開始コドン直前にＫｏｚａｋコンセンサ
ス配列を有するように設計したＰＣＲプライマー、及
び、３’−末端に適当な制限酵素の認識配列とゲノムＤ
ＮＡの一次転写産物が正しくスプライスされｍＲＮＡと
なるためのスプライスドナー部位を有するように設計し
たＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、これ
ら適当な塩基配列を導入する。こうして構築したマウス
Ｈ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを適当な制限酵素で処
理して、上記発現ベクターに挿入して、Ｃγ１ゲノムＤ
ＮＡを含むキメラＨ鎖発現ベクターを構築する。

【００４２】ｃＤＮＡキメラＨ鎖発現ベクターの構築 Ｈ鎖Ｃ領域としてＣγ１のｃＤＮＡを有している発現ベ
クターは、以下のようにして構築することができる。す
なわち、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト抗体
Ｈ鎖Ｃ領域Ｃγ１のゲノムＤＮＡ（N. Takahashi, et a
l., Cell 29, 671-679 1982 ）をコードする発現ベクタ
ーＤＨＦＲ−△Ｅ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｆ（国際特許出願公
開番号ＷＯ９２／１９７５９参照）とヒト型化ＰＭ１抗
体Ｌ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｌ鎖κ鎖Ｃ領域のゲノムＤ
ＮＡをコードする発現ベクターＲＶｌ−ＰＭ１ａ（国際
特許出願公開番号ＷＯ９２／１９７５９参照）を導入し
たＣＨＯ細胞からｍＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ法で
ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域及びヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域
Ｃγ１を含むｃＤＮＡをクローニングし、適当な動物細
胞発現用ベクターに適当な制限酵素部位を利用すること
で連結し構築できる。

【００４３】マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを
ヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域Ｃγ１を含むｃＤＮＡと直接連結す
るためには、ＰＣＲ法により適当な塩基配列を導入する
ことが出来る。例えば、５’−末端に適当な制限酵素の
認識配列と、翻訳効率をよくするために開始コドン直前
にＫｏｚａｋコンセンサス配列を有するように設計した
ＰＣＲプライマー、及び、３’−末端にＨ鎖Ｃ領域Ｃγ
１と直接連結するための適当な制限酵素の認識配列を有
するように設計したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを
行うことで、これら適当な塩基配列を導入する。

【００４４】こうして構築したマウスＨ鎖Ｖ領域をコー
ドするｃＤＮＡを適当な制限酵素で処理して、上記Ｈ鎖
Ｃ領域Ｃγ１を含むｃＤＮＡと連結して、ｐＣＯＳ１ま
たはｐＣＨＯ１のごとき発現ベクターに挿入することに
より、ｃＤＮＡキメラＨ鎖を含む発現ベクターを構築す
ることが出来る。 ２）キメラ抗体Ｌ鎖の構築 キメラ抗体のＬ鎖発現ベクターは、マウスＬ鎖Ｖ領域を
コードするｃＤＮＡと、ヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域をコード
するゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡとを連結し、適当な発
現ベクターに導入することにより得ることが出来る。Ｌ
鎖Ｃ領域としては例えばκ鎖あるいはλ鎖が挙げられ
る。

【００４５】ｃＤＮＡキメラＬ鎖κ鎖発現ベクターの構
築 マウスＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを含む発現ベク
ターを構築するためには、ＰＣＲ法により適当な塩基配
列を導入することが出来る。例えば、５’−末端に適当
な制限酵素の認識配列と、翻訳効率をよくするためのＫ
ｏｚａｋコンセンサス配列を有するように設計したＰＣ
Ｒプライマー、及び、３’−末端に適当な制限酵素の認
識配列を有するように設計したＰＣＲプライマーを用い
てＰＣＲを行うことで、これら適当な塩基配列を導入す
る。

【００４６】マウスＬ鎖Ｖ領域と連結させるためのヒト
Ｌ鎖κ鎖Ｃ領域は、例えばゲノムＤＮＡを含むＨＥＦ−
ＰＭ１ｋ−ｇｋ（国際特許出願公開番号ＷＯ９２／１９
７５９参照）から構築することが出来る。ＰＣＲ法にて
Ｌ鎖κ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡの５’−末端および
３’−末端に適当な制限酵素の認識配列を導入し、上記
のようにして構築したマウスＬ鎖Ｖ領域とＬ鎖κ鎖Ｃ領
域を連結し、ｐＣＯＳ１またはｐＣＨＯ１のごとき発現
ベクターに挿入することにより、ｃＤＮＡキメラ抗体Ｌ
鎖κ鎖の発現ベクターを構築することが出来る。

【００４７】２．再構成ヒト抗体の作製 （１）再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｖ領域の設計 マウスモノクローナル抗体のＣＤＲがヒト抗体に移植さ
れている再構成ヒト抗体を作製するためには、マウスモ
ノクローナル抗体のＦＲとヒト抗体のＦＲとの間に高い
相同性が存在することが望ましい。従って、マウス抗Ｈ
Ｍ１．２４抗体のＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域を、Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋを用いて構造が解明されてい
るすべての既知抗体のＶ領域と比較する。

【００４８】マウス抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖Ｖ領域は
ヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域のサブグループIV（ＨＳＧＩＶ）の
コンセンサス配列に最も類似しており、６６．４％の相
同性が存在する。一方、ＨＳＧＩ、ＨＳＧII、ＨＳＧII
I とはそれぞれ５６．９％、５５．８％、６１．５％の
相同性を示す。マウス抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖Ｖ領域
は既知ヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域との比較において、ヒト抗体
Ｌ鎖Ｖ領域のサブグループＩの一つであるヒト抗体ＲＥ
ＩのＬ鎖Ｖ領域に６７．０％の相同性を示す。従って、
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ鎖Ｖ領域の作製のため
の出発材料としてＲＥＩのＦＲを使用した。

【００４９】再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ鎖Ｖ領域
のバージョンａを設計した。このバージョンにおいて
は、ヒト抗体ＦＲは再構成ヒトＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗
体中に存在するＲＥＩに基くＦＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎ
ｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２２，２１−２５，（１
９８８）を参照、国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９
７５９に記載の再構成ヒトＰＭ−１抗体のＬ鎖Ｖ領域の
バージョンａに含まれるＦＲ）と同一であり、そしてマ
ウスＣＤＲはマウス抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖Ｖ領域中
のＣＤＲと同一とした。

【００５０】マウス抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域は
ヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域のＨＳＧＩのコンセンサス配列に最
も類似しており、５４．７％の相同性が存在する。一
方、ＨＳＧII、ＨＳＧIII とはそれぞれ３４．６％、４
８．１％の相同性を示す。マウス抗ＨＭ１．２４抗体の
Ｈ鎖Ｖ領域は既知のヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域との比較におい
て、ＦＲ１からＦＲ３までは、ヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域のサ
ブグループＩの一つであるヒト抗体ＨＧ３のＨ鎖Ｖ領域
（Ｒｅｃｈａｖｉ，Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０，８５５−８５９）に非常に類
似しており、６７．３％の相同性を示す。

【００５１】このため、ヒト抗体ＨＧ３のＦＲを、再構
成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域の作製のための
出発材料として用いた。しかしながら、ヒト抗体ＨＧ３
のＦＲ４のアミノ酸配列は記述されていないために、Ｆ
Ｒ４に関してはマウス抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖のＦＲ
４と最も高い相同性を示すヒト抗体ＪＨ６（Ｒａｖｅｔ
ｃｈ，Ｊ．Ｖ．ら、Ｃｅｌｌ，２７，５８３−５９１）
のＦＲ４のアミノ酸配列を用いた。ＪＨ６のＦＲ４は一
つのアミノ酸を除いてマウス抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖
のＦＲ４と同一のアミノ酸配列を有する。

【００５２】再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領
域の第一のバージョンａにおいて、ヒトＦＲ１中の３０
位およびヒトＦＲ３中の７１位のアミノ酸をマウス抗Ｈ
Ｍ１．２４抗体のアミノ酸と同一とした以外、ＦＲ１か
らＦＲ３まではヒト抗体ＨＧ３のＦＲ１からＦＲ３と同
一であり、そしてＣＤＲはマウス抗ＨＭ１．２４抗体の
Ｈ鎖Ｖ領域中のＣＤＲと同一とした。

【００５３】（２）再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ鎖
Ｖ領域の作製 再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ鎖を、ＰＣＲ法による
ＣＤＲグラフティングにより作製する。この方法を図４
に模式的に示す。ヒト抗体ＲＥＩ由来のＦＲを有する再
構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体（バージョンａ）作製のた
めに８個のＰＣＲプライマーを使用する。外部プライマ
ーＡ（配列番号：４７）及びＨ（配列番号：４８）は、
ＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−ＶＬ−ｇκのＤＮＡ配列と
ハイブリダイズするように設計する。

【００５４】ＣＤＲ−グラフティングプライマーＬ１Ｓ
（配列番号：４９）、Ｌ２Ｓ（配列番号：５０）及びＬ
３Ｓ（配列番号：５１）はセンスＤＮＡ配列を有する。
ＣＤＲ−グラフティングプライマーＬ１Ａ（配列番号：
５２）、Ｌ２Ａ（配列番号：５３）及びＬ３Ａ（配列番
号：５４）はアンチ−センスＤＮＡ配列を有し、そして
それぞれプライマーＬ１Ｓ、Ｌ２Ｓ及びＬ３Ｓの５′−
末端のＤＮＡ配列に対する相補的ＤＮＡ配列（２０〜２
３bp）を有する。

【００５５】第一ＰＣＲ段階において４つの反応Ａ−Ｌ
１Ａ、Ｌ１Ｓ−Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｓ−Ｌ３Ａ、及びＬ３Ｓ−
Ｈを行い、そして各ＰＣＲ生成物を精製する。第一ＰＣ
Ｒからの４つのＰＣＲ生成物をそれら自体の相補性によ
りアッセンブリさせる（ＷＯ９２−１９７５９参照）。
次に、外部プライマーＡ及びＨを加えて、再構成ヒト抗
ＨＭ１．２４抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードする全長ＤＮＡを
増幅する（第２ＰＣＲ）。前記ＰＣＲにおいては、ヒト
抗体ＲＥＩからのＦＲに基く再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１
抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョンａをコードするプラスミドＨ
ＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ａ（国際特許出願公開番号ＷＯ９
５−１４０４１を参照）を鋳型として用いることができ
る。

【００５６】第一ＰＣＲ段階においては、鋳型ＤＮＡ、
及び各プライマーを用いる。ＰＣＲ生成物Ａ−Ｌ１Ａ
（２１５bp）、Ｌ１Ｓ−Ｌ２Ａ（９８bp）、Ｌ２Ｓ−Ｌ
３Ａ（１４０bp）及びＬ３Ｓ−Ｈ（１５１bp）を１．５
％低融点アガロースゲルを用いて精製し、第二ＰＣＲで
アッセンブリする。第二ＰＣＲにおいては、各第一ＰＣ
Ｒの生成物及び各外部プライマー（Ａ及びＨ）を用い
る。第二ＰＣＲにより生じた５１６bpのＤＮＡ断片を
１．５％低融点アガロースゲルで精製し、ＢａｍＨＩ及
びＨｉｎｄIII で消化し、得られたＤＮＡ断片をＨＥＦ
発現ベクターＨＥＦ−ＶＬ−ｇκにクローニングする。
ＤＮＡ配列決定の後、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ
鎖Ｖ領域の正しいアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片
を含むプラスミドをＨＥＦ−ＲＶＬａ−ＡＨＭ−ｇκと
命名した。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬａ−ＡＨＭ−ｇ
κに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列
を配列番号：９に示す。

【００５７】再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ鎖Ｖ領域
のバージョンｂを、ＰＣＲを用いる変異誘発法によって
作製することができる。変異原プライマーＦＴＹ−１
（配列番号：５５）およびＦＴＹ−２（配列番号：５
６）は、７１位のフェニルアラニンがチロシンに変異す
るように設計する。プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬａ−ＡＨ
Ｍ−ｇκを鋳型とし、上記プライマーを用いて増幅した
後、最終生成物を精製し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄII
I で消化し、得られたＤＮＡ断片をＨＥＦ発現ベクター
ＨＥＦ−ＶＬ−ｇκにクローニングし、プラスミドＨＥ
Ｆ−ＲＶＬｂ−ＡＨＭ−ｇκを得る。本プラスミドＨＥ
Ｆ−ＲＶＬｂ−ＡＨＭ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のア
ミノ酸配列および塩基配列を配列番号：１０に示す。

【００５８】（３）再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖
Ｖ領域の作製 3-1. 再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖Ｖ領域バージ
ョンａ−ｅの作製 再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードする
ＤＮＡを次の様にして設計することができる。ヒト抗体
ＨＧ３のＦＲ１〜３およびヒト抗体ＪＨ６のＦＲ４をコ
ードするＤＮＡ配列を、マウス抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖
Ｖ領域のＣＤＲをコードするＤＮＡ配列とつなげること
により、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコ
ードする全長ＤＮＡを設計する。次に、このＤＮＡ配列
のそれぞれ５′−側及び３′−側にＨｉｎｄIII 認識部
位／ＫＯＺＡＫコンセンサス配列及びＢａｍＨＩ認識部
位／スプライスドナー配列を付加して、ＨＥＦ発現ベク
ターに挿入できるようにする。

【００５９】こうして設計したＤＮＡ配列を４個のオリ
ゴヌクレオチドに分け、そして次に、これらのオリゴヌ
クレオチドのアセンブリーを妨害する可能性のあるオリ
ゴヌクレオチド中の二次構造についてコンピューター解
析する。４個のオリゴヌクレオチド配列ＲＶＨ１〜ＲＶ
Ｈ４を配列番号：５７〜６０に示す。これらのオリゴヌ
クレオチドは１１９〜１４４塩基の長さを有し、２５〜
２６bpのオーバラップ領域を有する。オリゴヌクレオチ
ドの内のＲＶＨ２（配列番号：５８）、ＲＶＨ４（配列
番号：６０）はセンスＤＮＡ配列を有し、そして他のＲ
ＶＨ１（配列番号：５７）、ＲＶＨ３（配列番号：５
９）はアンチセンスＤＮＡ配列を有する。これら４個の
オリゴヌクレオチドのＰＣＲ法によるアセンブリーの方
法を図に示す（図５参照）。

【００６０】４種のオリゴヌクレオチド並びにＲＨＰ１
（配列番号：６０）及びＲＨＰ２（配列番号：６２）を
外部プライマーとして用い、ＰＣＲを行う。増幅した４
３８bpのＤＮＡ断片を精製し、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍ
ＨＩにより消化し、そして次にＨＥＦ発現ベクターＨＥ
Ｆ−ＶＨ−ｇγ１にクローニングする。ＤＮＡ配列決定
の後、正しいＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡ断片を含むプラスミドをＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ
−ｇγ１と命名した。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−
ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列お
よび塩基配列を配列番号：１１に示す。

【００６１】再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖Ｖ領域
の各バージョンｂ、ｃ、ｄ、ｅを以下のようにして作製
する。なお、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖Ｖ領域
のバージョンｂ以降の各バージョンを作製する際、置換
するアミノ酸残基の抗体分子中での位置を推察するため
に、マウス抗ＨＭ１．２４抗体Ｖ領域の立体構造モデル
を構築することができる。バージョンｂは、変異原プラ
イマーとして６６位のアルギニンがリジンに変異するよ
うに設計したＢＳ（配列番号：６３）およびＢＡ（配列
番号：６４）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−Ａ
ＨＭ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ法により増幅
し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｂ−ＡＨＭ−ｇγ１を得
る。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｂ−ＡＨＭ−ｇγ１に
含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配
列番号：１２に示す。

【００６２】バージョンｃは、変異原プライマーとして
７３位のトレオニンがリジンに変異するように設計した
ＣＳ（配列番号：６５）およびＣＡ（配列番号：６６）
を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１
を鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ法により増幅し、プラスミ
ドＨＥＦ−ＲＶＨｃ−ＡＨＭ−ｇγ１を得る。本プラス
ミドＨＥＦ−ＲＶＨｃ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖
Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：１３
に示す。バージョンｄは、変異原プライマーとして６６
位のアルギニンがリジンに、７３位のトレオニンがリジ
ンに変異するように設計したＤＳ（配列番号：６７）お
よびＤＡ（配列番号：６８）を用い、プラスミドＨＥＦ
−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとしてプラス
ミドＨＥＦ−ＲＶＨｄ−ＡＨＭ−ｇγ１を得る。本プラ
スミドＨＥＦ−ＲＶＨｄ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ
鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：１
４に示す。

【００６３】バージョンｅは、変異原プライマーとして
６７位のバリンがアラニンに、６９位のメチオニンがロ
イシンに変異するように設計したＥＳ（配列番号：６
９）およびＥＡ（配列番号：７０）を用い、プラスミド
ＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして
増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｅ−ＡＨＭ−ｇγ１
を得る。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｅ−ＡＨＭ−ｇγ
１に含まれるＨ鎖Ｖ領域に含まれるアミノ酸配列および
塩基配列を配列番号：１５に示す。

【００６４】3-2. Ｈ鎖ハイブリッドＶ領域の作製 Ｈ鎖ハイブリッドＶ領域を構築することにより、ヒト型
化抗体Ｖ領域のどのＦＲが、ヒト型化抗体の結合活性お
よび結合阻害活性に寄与するかを調べることができる。
構築した２種類のうち、１つはＦＲ１とＦＲ２のアミノ
酸配列がマウス抗ＨＭ１．２４抗体由来であり、ＦＲ３
とＦＲ４のアミノ酸配列が再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗
体のＨ鎖Ｖ領域のバージョンａ由来となるもの（マウス
・ヒトハイブリッド抗ＨＭ１．２４抗体）、もう１つは
ＦＲ１とＦＲ２のアミノ酸配列が再構成ヒト抗ＨＭ１．
２４のＨ鎖Ｖ領域のバージョンａ由来であり、ＦＲ３と
ＦＲ４のアミノ酸配列がマウス抗ＨＭ１．２４抗体由来
となるもの（ヒト・マウスハイブリッド抗ＨＭ１．２４
抗体）である。ＣＤＲ領域のアミノ酸配列はすべてマウ
ス抗ＨＭ１．２４抗体由来である。

【００６５】２種のＨ鎖ハイブリッドＶ領域はＰＣＲ法
により作製する。この方法を図６及び７に模式的に示
す。２種のＨ鎖ハイブリッドＶ領域作製のために４種の
プライマーを使用することができる。外部プライマーａ
（配列番号：７１）及びｈ（配列番号：７２）は、ＨＥ
Ｆ発現ベクターＨＥＦ−ＶＨ−ｇγ１のＤＮＡ配列とハ
イブリダイズするように設計される。Ｈ鎖ハイブリッド
作製プライマーＨＹＳ（配列番号：７３）はセンスＤＮ
Ａ配列を有し、Ｈ鎖ハイブリッドプライマーＨＹＡ（配
列番号：７４）はアンチセンスＤＮＡ配列を有しそして
たがいに相補的なＤＮＡ配列となるよう設計される。

【００６６】ＦＲ１とＦＲ２のアミノ酸配列がマウス抗
ＨＭ１．２４抗体由来であり、ＦＲ３とＦＲ４のアミノ
酸配列が再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域の
バージョンａ由来となるＨ鎖ハイブリッドＶ領域の作製
のために、第一ＰＣＲ段階においてプラスミドＨＥＦ−
１．２４Ｈ−ｇγ１を鋳型とし外部プライマーａとＨ鎖
ハイブリッドプライマーＨＹＡを用いたＰＣＲと、プラ
スミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１を鋳型としＨ
鎖ハイブリッドプライマーＨＹＳと外部プライマーｈを
用いたＰＣＲを行い、そして各ＰＣＲ産物を精製する。

【００６７】第一ＰＣＲからの２つのＰＣＲ精製物をそ
れら自体の相補性によりアッセンブリさせる（国際特許
出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９参照）。次に、外部
プライマーａ及びｈを加えて、ＦＲ１とＦＲ２のアミノ
酸配列がマウス抗ＨＭ１．２４抗体由来であり、ＦＲ３
とＦＲ４のアミノ酸配列が再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗
体のＨ鎖Ｖ領域のバージョンａ由来となるＨ鎖ハイブリ
ッドＶ領域をコードする全長ＤＮＡを第二ＰＣＲ段階で
増幅する。

【００６８】ＦＲ１とＦＲ２のアミノ酸配列が再構成ヒ
ト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域のバージョンａ由来
であり、ＦＲ３とＦＲ４のアミノ酸配列がマウス抗ＨＭ
１．２４抗体由来となるＨ鎖ハイブリッドＶ領域の作製
のために、第一ＰＣＲ段階においてプラスミドＨＥＦ−
ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１を鋳型とし外部プライマーａ
とＨ鎖ハイブリッドプライマーＨＹＡを用いたＰＣＲ
と、プラスミドＨＥＦ−１．２４Ｈ−ｇγ１を鋳型とし
Ｈ鎖ハイブリッドプライマーＨＹＳと外部プライマーｈ
を用いたＰＣＲを行い、そして各ＰＣＲ産物を精製す
る。

【００６９】第一ＰＣＲからの２つのＰＣＲ精製物をそ
れら自体の相補性によりアッセンブリさせる（国際特許
出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９参照）。次に、外部
プライマーａ及びｈを加えて、ＦＲ１とＦＲ２のアミノ
酸配列が再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域の
バージョンａ由来であり、ＦＲ３とＦＲ４のアミノ酸配
列がマウス抗ＨＭ１．２４抗体由来となるＨ鎖ハイブリ
ッドＶ領域をコードする全長ＤＮＡを第二ＰＣＲ段階で
増幅する。

【００７０】第一ＰＣＲ、ＰＣＲ産物の精製、アッセン
ブリ、第二ＰＣＲ、及びＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−Ｖ
Ｈ−ｇγ１へのクローニングの方法は実施例９．再構成
ヒトＨＭ１．２４抗体Ｌ鎖Ｖ領域の作製に示す方法に準
じ行うことができる。ＤＮＡ配列決定の後、ＦＲ１とＦ
Ｒ２のアミノ酸配列がマウス抗ＨＭ１．２４抗体由来で
あり、ＦＲ３とＦＲ４のアミノ酸配列が再構成ヒト抗Ｈ
Ｍ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域のバージョンａ由来となる
Ｈ鎖ハイブリッドＶ領域の正しいアミノ酸配列をコード
するＤＮＡ断片を含むプラスミドをＨＥＦ−ＭＨ−ＲＶ
Ｈ−ＡＨＭ−ｇγ１と命名した。

【００７１】本プラスミドＨＥＦ−ＭＨ−ＲＶＨ−ＡＨ
Ｍ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列及び塩
基配列を配列番号：７５に示す。また、ＦＲ１とＦＲ２
のアミノ酸配列が再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体由来で
あり、ＦＲ３とＦＲ４のアミノ酸配列がマウス抗ＨＭ
１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域のバージョンａ由来となるＨ
鎖ハイブリッドＶ領域の正しいアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡ断片を含むプラスミドをＨＥＦ−ＨＭ−ＲＶＨ
−ＡＨＭ−ｇγ１と命名した。本プラスミドＨＥＦ−Ｈ
Ｍ−ＲＶＨ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のア
ミノ酸配列及び塩基配列を配列番号：７６に示す。

【００７２】3-3. 再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖
Ｖ領域バージョンｆ〜ｓの作製 再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖Ｖ領域の各バージョ
ンｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、
ｒ及びｓを以下のようにして作製する。なお、再構成す
るヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバージョンｆ以
降の各バージョンを作製する際、置換するアミノ酸残基
の抗体分子中での位置を推察するために、前記の通りマ
ウス抗ＨＭ１．２４抗体Ｖ領域の立体構造モデルを構築
することができる。

【００７３】バージョンｆは、変異原プライマーとして
７５位のトレオニンがセリンに、７８位のバリンがアラ
ニンに変異するように設計したＦＳ（配列番号：７８）
およびＦＡ（配列番号：７９）を用い、プラスミドＨＥ
Ｆ−ＲＶＨｅ−ＡＨＭ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして、Ｐ
ＣＲ法により増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｆ−Ａ
ＨＭ−ｇγ１を得る。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｆ−
ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列お
よび塩基配列を配列番号：１６に示す。

【００７４】バージョンｇは、変異原プライマーとして
４０位のアラニンがアルギニンに変異するように設計し
たＧＳ（配列番号：８０）およびＧＡ（配列番号：８
１）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇ
γ１を鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−Ｒ
ＶＨｇ−ＡＨＭ−ｇγ１を得る。本プラスミドＨＥＦ−
ＲＶＨｇ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミ
ノ酸配列および塩基配列を配列番号：１７に示す。

【００７５】バージョンｈは、変異原プライマーとして
ＦＳおよびＦＡを用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｂ−
ＡＨＭ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミド
ＨＥＦ−ＲＶＨｈ−ＡＨＭ−ｇγ１を得る。本プラスミ
ドＨＥＦ−ＲＶＨｈ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ
領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：１８に
示す。バージョンｉは、変異原プライマーとして８３位
のアルギニンがアラニンに、８４位のセリンがフェニル
アラニンに変異するように設計したＩＳ（配列番号：８
２）およびＩＡ（配列番号：８３）を用い、プラスミド
ＨＥＦ−ＲＶＨｈ−ＡＨＭ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして
増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｉ−ＡＨＭ−ｇγ１
を得る。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｉ−ＡＨＭ−ｇγ
１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列
を配列番号：１９に示す。

【００７６】バージョンｊは、変異原プライマーとして
６６位のアルギニンがリジンに変異するように設計した
ＪＳ（配列番号：８４）とＪＡ（配列番号：８５）を用
い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｆ−ＡＨＭ−ｇγ１を鋳
型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｊ−
ＡＨＭ−ｇγ１を得る。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｊ
−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列
および塩基配列を配列番号：２０に示す。

【００７７】バージョンｋは、変異原プライマーとして
８１位のグルタミン酸がグルタミンに変異するように設
計したＫＳ（配列番号：８６）およびＫＡ（配列番号：
８７）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｈ−ＡＨＭ−
ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−
ＲＶＨｋ−ＡＨＭ−ｇγ１を得る。本プラスミドＨＥＦ
−ＲＶＨｋ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のア
ミノ酸配列および塩基配列を配列番号：２１に示す。

【００７８】バージョンｌは、変異原プライマーとして
８１位のグルタミン酸がグルタミンに、８２Ｂ位のセリ
ンがイソロイシンに変異するように設計したＬＳ（配列
番号：８８）およびＬＡ（配列番号：８９）を用い、プ
ラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｈ−ＡＨＭ−ｇγ１を鋳型ＤＮ
Ａとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｌ−ＡＨＭ
−ｇγ１を得る。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｌ−ＡＨ
Ｍ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および
塩基配列を配列番号：２２に示す。

【００７９】バージョンｍは、変異原プライマーとして
８１位のグルタミン酸がグルタミンに、８２ｂのセリン
がイソロイシンに、８７位のトレオニンがセリンに変異
するように設計したＭＳ（配列番号：９０）とＭＡ（配
列番号：９１）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｈ−
ＡＨＭ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミド
ＨＥＦ−ＲＶＨｍ−ＡＨＭ−ｇγ１を得る。本プラスミ
ドＨＥＦ−ＲＶＨｍ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ
領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：２３に
示す。

【００８０】バージョンｎは、変異原プライマーとして
８２Ｂ位のセリンがイソロイシンに変異するように設計
したＮＳ（配列番号：９２）およびＮＡ（配列番号：９
３）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｈ−ＡＨＭ−ｇ
γ１を鋳型ＤＮＡとしてプラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｎ−
ＡＨＭ−ｇγ１を得る。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｎ
−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列
および塩基配列を配列番号：２４に示す。

【００８１】バージョンｏは変異原プライマーとして８
７位のトレオニンがセリンに変異するように設計したＯ
Ｓ（配列番号：９４）およびＯＡ（配列番号：９５）を
用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｈ−ＡＨＭ−ｇγ１を
鋳型ＤＮＡとしてプラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｏ−ＡＨＭ
−ｇγ１を得る。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｏ−ＡＨ
Ｍ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および
塩基配列を配列番号：２５に示す。

【００８２】バージョンｐは、変異原プライマーとして
７８位のバリンがアラニンに変異するように設計したＰ
Ｓ（配列番号：９６）およびＰＡ（配列番号：９７）を
用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１を
鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ法により増幅し、プラスミド
ＨＥＦ−ＲＶＨｐ−ＡＨＭ−ｇγ１を得る。本プラスミ
ドＨＥＦ−ＲＶＨｐ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ
領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：２６に
示す。

【００８３】バージョンｑは、変異原プライマーとして
７５位のトレオニンがセリンに変異するように設計した
ＱＳ（配列番号：９８）およびＱＡ（配列番号：９９）
を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１
を鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ法により増幅し、プラスミ
ドＨＥＦ−ＲＶＨｑ−ＡＨＭ−ｇγ１を得る。本プラス
ミドＨＥＦ−ＲＶＨｑ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖
Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：２７
に示す。

【００８４】バージョンｒは、変異原プライマーとして
ＣＳ（配列番号：６５）およびＣＡ（配列番号：６６）
を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｐ−ＡＨＭ−ｇγ１
を鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ法により増幅し、プラスミ
ドＨＥＦ−ＲＶＨｒ−ＡＨＭ−ｇγ１を得る。本プラス
ミドＨＥＦ−ＲＶＨｒ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖
Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：２８
に示す。

【００８５】バージョンｓは、変異原プライマーとして
69位のメチオニンがイソロイシンに変異するように設計
した変異原プライマーSS（配列番号：100)および変異原
プライマーSA（配列番号：101)を用い、プラスミドHEF-
RVHr-AHM-gγ1 を鋳型DNA として、プラスミドHEF-RVHs
-AHM-gγ1 を得る。本プラスミドHEF-RVHs-AHM-gγ1に
含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配
列番号102 に示す。なお、作製したＬ鎖Ｖ領域のアミノ
酸配列を表１に示し、Ｈ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列を表２
〜４に示す。

【００８６】

【表１】

【００８７】

【表２】

【００８８】

【表３】

【００８９】

【表４】

【００９０】３．キメラ抗体及び再構成ヒト抗体の製造 キメラ抗体あるいは再構成ヒト抗体の製造のためには、
前記のようなそれぞれ２種類の発現ベクター、すなわち
エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域に
よる制御のもとでマウスＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域
をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクター、並びに
エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域の
もとでマウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードす
るＤＮＡを含んで成る発現ベクター、またはエンハンサ
ー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御の
もとでヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコード
するＤＮＡを含んで成る発現ベクター、並びにエンハン
サー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとでヒ
ト型化Ｌ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮ
Ａを含んで成る発現ベクターを作製する。

【００９１】次に、これらの発現ベクターにより哺乳類
細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そして形質転
換された細胞をインビトロ又はインビボで培養してキメ
ラ抗体あるいは再構成ヒト抗体を製造する（例えば国際
特許出願公開番号ＷＯ９１−１６９２８）。また、ヤギ
などの哺乳動物に抗体遺伝子を導入してトランスジェニ
ック動物を作製し、その乳汁等からキメラ抗体あるいは
再構成ヒト抗体を得ることができる。

【００９２】また、Ｈ鎖Ｖ領域及びＨ鎖Ｃ領域ならびに
Ｌ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｃ領域を単一ベクターに連結し、適
当な宿主細胞を形質転換し、抗体を産生させることがで
きる。すなわち、キメラ抗体の発現には、クローニング
されたｃＤＮＡに存在するマウスリーダー配列及びＨ鎖
Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ並びにマ
ウスリーダー配列及びＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域を
コードするＤＮＡを単一の発現ベクターに導入する（国
際特許出願公開番号ＷＯ９４−１１５２３参照）。

【００９３】再構成ヒト抗体の発現には、ヒト型化Ｈ鎖
Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ並びにヒ
ト型化Ｌ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮ
Ａを単一の発現ベクターに導入する（国際特許出願公開
番号ＷＯ９４−１１５２３参照）。そして該ベクターを
用いて宿主細胞を形質転換し、次にこの形質転換された
宿主をインビボ又はインビトロで培養して目的とするキ
メラ抗体または再構成ヒト抗体を生産させる。以上のよ
うにして目的とするキメラ抗体あるいは再構成ヒト抗体
をコードする遺伝子で形質転換した形質転換体を培養
し、産生したキメラ抗体あるいは再構成ヒト抗体は、細
胞内または細胞外から分離し均一にまで精製することが
できる。

【００９４】なお、本発明の目的蛋白質であるキメラ抗
体あるいは再構成ヒト抗体の分離・精製を、アフィニテ
ィーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテ
インＡを用いたカラムとして、ＨｙｐｅｒＤ，ＰＯＲＯ
Ｓ，ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．等が挙げられる。ま
た、その他に、通常の蛋白質で用いられる分離・精製方
法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例
えば各種クロマトグラフィー、限外濾過、塩折、透析等
を適宜選択、組合せれば、キメラ抗体あるいは再構成ヒ
ト抗体は分離・精製することができる。

【００９５】本発明のキメラ抗ＨＭ１．２４抗体又は再
構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体の製造のために任意の発現
系、例えば真核細胞、例えば動物細胞、例えば樹立され
た哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞、及び酵母
細胞、並びに原核細胞、例えば細菌細胞、例えば大腸菌
細胞等を使用することができる。好ましくは、本発明の
キメラ抗体又は再構成ヒト抗体は哺乳類細胞、例えばＣ
ＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞Ｈｅｌａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ミ
エローマ細胞又はＢＨＫ細胞中で発現される。

【００９６】これらの場合、哺乳類細胞での発現のため
に有用な常用のプロモーターを用いることができる。例
えば、ヒト・サイトメガロウィルス前期（ｈｕｍａｎ
ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ
ｅａｒｌｙ；ＨＣＭＶ）プロモーターを使用するのが
好ましい。ＨＣＭＶプロモーターを含有する発現ベクタ
ーの例には、ＨＣＭＶ−ＶＨ−ＨＣγ１，ＨＣＭＶ−Ｖ
Ｌ−ＨＣκ等であって、ｐＳＶ２ｎｅｏに由来するもの
（国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９）が含ま
れる。

【００９７】また、その他に、本発明のために用いるこ
とのできる哺乳動物細胞における遺伝子発現のプロモー
ターとしてはレトロウイルス、ポリオーマウイルス、ア
デノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）など
のウイルスプロモーターやヒト・ポリペプチド・チェー
ン・エロンゲーション・ファクター１α（ＨＥＦ−１
α）などの哺乳動物細胞由来のプロモーターを用いれば
よい。例えばＳＶ４０のプロモーターを使用する場合
は、Ｍｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ ２７７
１０８（１９７９））、また、ＨＥＦ−１αプロモー
ターを使用する場合は、Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．らの
方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ，１８，５３２２，１９９０）に従えば容易に実施す
ることができる。

【００９８】複製起原としては、ＳＶ４０、ポリオーマ
ウイルス、アデノウイルス、牛パピローマウイルス（Ｂ
ＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに宿主
細胞系中での遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクター
は選択マーカーとして、アミノグリコシドホスホトラン
スフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（Ｔ
Ｋ）遺伝子、大腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒド
ロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子等を含むことができ
る。

【００９９】４．キメラ抗体及びヒト型化抗体の結合阻
害活性 （１）抗体の濃度測定 精製抗体の濃度の測定は、ELISA または吸光度の測定に
より行う。抗体濃度測定のためのＥＬＩＳＡプレートを
次のようにして調製する。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート
（例えばＭａｘｉｓｏｒｐ， ＮＵＮＣ ）の各穴を例
えば１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗
体１００μｌを固相化する。

【０１００】１００μｌの希釈バッファー（例えば５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ₂ 、０．１５
Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．０２
％ＮａＮ₃ 、１％ 牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ
８．１）でブロッキングの後、キメラ抗体、ハイブリッ
ド抗体または再構成ヒト抗体を発現させた細胞の培養上
清、例えばＣＯＳ細胞又はＣＨＯ細胞の培養上清あるい
は精製キメラ抗体、ハイブリッド抗体または再構成ヒト
抗体を段階希釈して各穴に加え、次にアルカリフォスフ
ァターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体１００μｌを加え、
１ｍｇ／ｍｌの基質溶液（Ｓｉｇｍａ１０４、ｐ−ニト
ロフェニルリン酸、ＳＩＧＭＡ）を加え、次に４０５ｎ
ｍでの吸光度をｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ
（Ｂｉｏ Ｒａｄ）で測定する。濃度測定のスタンダー
ドとして、ヒトＩｇＧ１κ（Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ
Ｓｉｔｅ）を用いることができる。精製抗体の濃度は、
２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌを１．３５
ＯＤとして算出する。

【０１０１】（２）抗原結合活性 抗原結合活性の測定は、ヒト羊膜細胞株ＷＩＳＨ（ＡＴ
ＣＣＣＣＬ２５）を用いたＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡで行う
ことができる。Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡプレートは次のよ
うにして調製する。９６穴プレートに１０％ウシ胎児血
清を含有するＰＲＭＩ１６４０培地により適切な濃度に
調製したＷＩＳＨ細胞を加え、一晩培養した後、ＰＢＳ
（−）で２回洗浄後０．１％グルタルアルデヒド（ナカ
ライテスク社製）にて固定する。

【０１０２】ブロッキングの後、キメラ抗ＨＭ１．２４
抗体、ハイブリッド抗ＨＭ１．２４抗体または再構成ヒ
ト抗ＨＭ１．２４抗体を発現させた細胞、例えばＣＯＳ
細胞やＣＨＯ細胞の培養上清、あるいは精製したキメラ
抗ＨＭ１．２４抗体、ハイブリッド抗ＨＭ１．２４抗体
または再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体を段階希釈して各
穴に１００μｌ加え、室温にて２時間インキュベーショ
ンおよび洗浄の後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒト
ＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ社製）を加える。室温にて１時間
インキュベーションおよび洗浄の後、基質溶液を加えイ
ンキュベーションする。次いで、６Ｎ硫酸５０μｌで反
応を停止させ、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ ＲＥＡＤＥＲ
Ｍｏｄｅｌ ３５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて
４９０ｎｍでの吸光度を測定する。

【０１０３】（３）結合阻害活性の測定 ビオチン標識マウス抗ＨＭ１．２４抗体による結合阻害
活性は、ヒト羊膜細胞株ＷＩＳＨ（ＡＴＣＣＣＣＬ２
５）を用いたＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡで行うことができ
る。Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡプレートは上記（２）に従い
調製できる。９６穴プレートに１０％ウシ胎児血清を含
有するＲＰＭＩ１６４０培地により適切な濃度に調製し
たＷＩＳＨ細胞を加え、一晩培養した後、ＰＢＳ（−）
で２回洗浄後０．１％グルタルアルデヒド（ナカライテ
スク社製）にて固定する。

【０１０４】ブロッキングの後、キメラ抗ＨＭ１．２４
抗体、ハイブリッド抗ＨＭ１．２４抗体または再構成ヒ
ト抗ＨＭ１．２４抗体を発現させた細胞、例えばＣＯＳ
細胞やＣＨＯ細胞の培養上清、あるいは精製したキメラ
抗ＨＭ１．２４抗体、ハイブリッド抗ＨＭ１．２４抗体
または再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体を段階希釈して各
穴に５０μｌ加え、同時に２μｇ／ｍｌのビチオン標識
マウス抗ＨＭ１．２４抗体５０μｌを添加し、室温にて
２時間インキュベーションおよび洗浄の後、ペルオキシ
ダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ社製）を
加える。室温にて１時間インキュベーションした後洗浄
し、基質溶液を加えインキュベーションした後６Ｎ硫酸
５０μｌで反応を停止させ、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ Ｒ
ＥＡＤＥＲ Ｍｏｄｅｌ ３５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社
製）用いて４９０ｎｍでの吸光度を測定する。

【０１０５】ＡＤＣＣ活性の測定 本発明のキメラ抗体あるいは再構成ヒト抗体のＡＤＣＣ
活性は、次のようにして測定することができる。まず、
ヒトの抹消血や骨髄より比重遠心法で単核球を分離し、
エフェクター細胞として調製する。また、ヒト骨髄腫細
胞、例えば、ＲＰＭＩ ８２２６細胞（ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ １５５）を⁵¹Ｃｒにより標識して、標的細胞として
調製する。次いで、標識した標的細胞にＡＤＣＣ活性を
測定するキメラ抗体あるいは再構成ヒト抗体を加えイン
キュベートし、その後、標的細胞に対し適切な比のエフ
ェクター細胞を加えインキュベートする。

【０１０６】インキュベートした後上清をとり、ガンマ
カウンターで放射活性を測定する。その際、最大遊離放
射能測定用に１％のＮＰ−４０を用いることができる。
細胞障害活性（％）は、（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）×１０
０で計算することができる。なお、Ａは抗体存在下にお
いて遊離された放射活性（ｃｐｍ）、ＢはＮＰ−４０に
よる遊離された放射活性（ｃｐｍ）、およびＣは抗体を
含まず培養液のみで遊離された放射活性（ｃｐｍ）であ
る。また、抗体Ｃ領域にＡＤＣＣ活性あるいはＣＤＣ活
性を期待する場合、抗体Ｃ領域としてヒトＣγ１、ヒト
Ｃγ３を用いることができる。さらに、抗体Ｃ領域のア
ミノ酸を一部付加、改変、修飾することにより、より強
力なＡＤＣＣ活性あるいはＣＤＣ活性を誘導することが
できる。

【０１０７】例えば、アミノ酸置換によるＩｇＧのＩｇ
Ｍ様ポリマー化（Smith, R．I. F.& Morrison, S.L, BI
O/TECHNOLOGY(1994)12, 683-688）、アミノ酸付加によ
るＩｇＧのＩｇＭ様ポリマー化（Smith, R. I. F. et a
l., J.Immunol.(1995)154, 2226-2236) 、Ｌ鎖をコード
する遺伝子の直列連結での発現（Shuford, W.et al.,Sc
ience(1991)252,724-727)、アミノ酸置換によるＩｇＧ
の二量体化（Caron, P.C.et al., J.Exp.Med.(1992)17
6, 1191-1195 、Shopes, B.J.Immunology(1992)148, 29
18-2922) 、化学的修飾によるＩｇＧの二量体化（Wolf
f, E.A.et al., Cancer Res.(1993)53, 2560-2565)およ
び抗体ヒンジ領域のアミノ酸改変によるエフェクター機
能の導入(Norderhaug, L.et al., Eur.J.Immunol.(199
1)21, 2379-2384) が挙げられる。これらは、プラマー
を使用したオリゴマー部位特異的変異導入法、制限酵素
切断部位を利用した塩基配列の付加、共有結合をもたら
す化学修飾剤を使用することによって達成される。

【０１０８】骨髄腫体内診断薬 本発明のキメラ抗ＨＭ１．２４抗体あるいは再構成ヒト
抗ＨＭ１．２４抗体は、ラジオアイソトープ等の標識化
合物と結合させることにより、骨髄腫体内診断薬として
用いることができる。さらには、キメラ抗ＨＭ１．２４
抗体あるいは再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体の断片、例
えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ′）₂ 、ＦｖまたはＨ鎖とＬ鎖の
Ｆｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦ
ｖ（ｓｃＦｖ）とラジオアイソトープ等の標識化合物を
結合させたものも、同様に骨髄腫体内診断薬として用い
ることができる。

【０１０９】具体的には、これら抗体の断片は、これら
抗体の断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベ
クターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させるか、
あるいはキメラ抗ＨＭ１．２４抗体または再構成ヒト抗
ＨＭ１．２４抗体を適当な酵素を用いて消化することで
得られる。上記の骨髄腫体内診断薬は、非経口的に全身
に投与することができる。 医薬組成物および骨髄腫治療剤 本発明のキメラ抗体ＨＭ１．２４抗体あるいはヒト型化
抗ＨＭ１．２４抗体の治療効果を確認するには、前記抗
体を骨髄腫細胞を移植された動物に投与し、抗腫瘍効果
を評価することにより行われる。

【０１１０】動物に移植する骨髄腫細胞としては、ヒト
骨髄腫細胞が好ましく、例えば、ＫＰＭＭ２（特許出願
公開番号特開平７−２３６４７５）、ＲＰＭＩ８２２６
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５５）、ＡＲＨ７７（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １６２１）、Ｓ６Ｂ４５（Suzuki, H.ら、 Eu
r.J.Immunol.(1992)22, 1989-1993)が挙げられる。移植
される動物としては、免疫機能が低下または欠失した動
物が好ましく、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、ベージ
ュマウス、ヌードラットが挙げられる。また、評価する
抗腫瘍効果の確認は、血清中のヒトイムノグロブリン量
の変化、腫瘍体積・重量の測定、尿中のヒトベンズジョ
ーンズタンパク質量の変化あるいは動物の生存期間等に
従い行うことができる。

【０１１１】本発明のキメラ抗ＨＭ１．２４抗体あるい
は再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体を有効成分として含む
医薬組成物および骨髄腫治療剤は、非経口的に全身ある
いは局所的に投与することができる。例えば、点滴など
の静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射を選
択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方
法を選択することができる。有効投与量は、一回につき
体重1kg あたり0.01mgから1000mgの範囲で選ばれる。あ
るいは、患者あたり5mg/body、好ましくは50-100mg/bod
y の投与量を選ぶことができる。本発明のキメラ抗ＨＭ
１．２４抗体あるいは再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体を
有効成分として含む医薬組成物および骨髄腫治療剤は、
投与経路次第で医薬的に許容される担体や添加物を共に
含むものであってもよい。

【０１１２】このような担体および添加物の例として、
水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビ
ニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビ
ニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウ
ム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウ
ム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナ
トリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロ
ース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラ
チン、寒天、ジグリセリン、グリセリン、プロピレング
リコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフ
ィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清
アルブミン（HSA ）、マンニトール、ソルビトール、ラ
クトース、医薬添加物として許容される界面活性剤など
が挙げられる。使用される添加物は、本発明の剤形に応
じて上記の中から適宜あるいは組み合わせて選択される
が、これらに限定されるものではない。

【０１１３】

【実施例】次に、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。実施例１. マウス抗HM1.24抗体可変領域をコードする
cDNAのクローニング １. メッセンジャーRNA （mRNA）の単離 マウス抗HM1.24抗体を産生する2 x 10⁸ 個のハイブリド
ーマ細胞（ＦＥＲＭＢＰ−５２３３）からFast Track m
RNA Isolation Kit Version 3.2 （Invitrogen社製）を
用いてキット添付の指示書に従い、mRNAの単離を行っ
た。

【０１１４】２. 抗体可変領域をコードする遺伝子のPC
R 法による増幅 Thermal Cycler（Perkin Elmer Cetus社製）を用いてPC
R を行った。 2-1. マウスL 鎖V 領域をコードする遺伝子の増幅およ
び断片化 単離したmRNAよりAMV Reverse Transcriptase First-st
rand cDNA SynthesisKit （Life Science社製）を用い
て一本鎖cDNAを合成し、PCR に用いた。また、PCR 法に
使用するプライマーは、マウスカッパ型L 鎖リーダー配
列とハイブリダイズする配列番号：29〜39に示すMKV
（Mouse Kappa Variable）プライマー（Jones, S. T.
ら、Bio/Technology, 9, 88-89, (1991)）を用いた。

【０１１５】PCR 溶液100 μl は、10 mM Tris-HCl (pH
8.3)、50 mM KCl 、0.1 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP,
dTTP) 、1.5 mM MgCl₂、５ユニットのDNA ポリメラーゼ
Ampli Taq （Perkin Elmer Cetus社製）、0.25 mM の配
列番号：29〜39に示すMKV プライマーと3 mMの配列番
号：40に示すMKC プライマーおよび一本鎖cDNA 100 ng
を含有し、これを50μl の鉱油で覆った後、94℃の初期
温度にて３分間そして次に94℃にて１分間、55℃にて１
分間および72℃にて１分間、この順序で加熱した。この
温度サイクルを30回反復した後、反応混合物をさらに72
℃にて10分間インキュベートした。増幅したDNA 断片を
低融点アガロース（Sigma 社製）にて精製し、XmaI（Ne
w England Biolabs 社製）およびSalI（宝酒造製）によ
り37℃にて消化した。

【０１１６】2-2. マウスH 鎖V 領域をコードするcDNA
の増幅および断片化 マウスH 鎖V 領域をコードする遺伝子は5'-RACE 法（Ra
pid Amplification ofcDNA ends; Frohman, M.A. ら、P
roc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002,(1988) 、
Edwards, J.B.D.M.,ら、Nucleic Acids Res., 19, 5227
-5232, (1991) ）により増幅した。マウスIgG2a 定常領
域に特異的にハイブリダイズするプライマーＰ１（配列
番号；41）を用いてcDNAを合成した後、5'-AmpliFINDER
RACEKIT （CLONETECH 社製）を用いてマウスH 鎖V 領
域をコードするcDNAの増幅をマウスIgG2a 定常領域に特
異的にハイブリダイズするプライマーMHC2a （配列番
号：42）およびキット添付のアンカープライマー（配列
番号：77）を用いて行った。増幅したDNA 断片を低融点
アガロース（Sigma 社製）にて精製し、そしてEcoRI
（宝酒造社製）およびXmaI（New England Biolabs 社
製）により37℃にて消化した。

【０１１７】３. 連結および形質転換 上記のようにして調製したマウスカッパ型L 鎖V 領域を
コードする遺伝子を含んで成るDNA 断片を、SalIおよび
XmaIで消化することにより調製したpUC19 ベクターと、
50 mM Tris-HCl (pH7.6)、10 mM MgCl₂ 、10 mM ジチオ
スレイトール、1 mM ATP、50 mg/mlのポリエチレングリ
コール（8000）および１ユニットT4 DNAリガーゼ（GIBC
O-BRL 社製）を含有する反応混合物中で、16℃にて2.5
時間反応させ連結した。同様にマウスH 鎖V 領域をコー
ドする遺伝子を含んで成るDNA 断片を、EcoRI およびXm
aIで消化することにより調製したpUC19 ベクターと16℃
にて3 時間反応させ連結した。

【０１１８】次に、10μl の上記連結混合物を大腸菌DH
5 αのコンピテント細胞50μl に加え、そしてこの細胞
を氷上で30分間、42℃にて１分間そして再び氷上で１分
間静置した。次いで400 μl の2xYT培地（Molecular Cl
oning : A Laboratory Manual, Sambrook ら、Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press, (1989) ）を加え、37℃
にて１時間インキュベートした後、50μｇ/ml のアンピ
シリンを含有する2xYT寒天培地（Molecular Cloning :
A Laboratory Manual, Sambrook ら、Cold Spring Harb
or Laboratory Press, (1989) ）上にこの大腸菌をま
き、37℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体
を得た。

【０１１９】この形質転換体を、50μg/mlのアンピシリ
ンを含有する2xYT培地10 ml 中で37℃にて一夜培養し、
そしてこの培養物から、アルカリ法（Molecular Clonin
g :A Laboratory Manual, Sambrook ら、Cold Spring H
arbor Laboratory Press, (1989) ）に従ってプラスミ
ドDNA を調製した。こうして得られた、抗HM1.24抗体を
産生するハイブリドーマに由来するマウスカッパ型L 鎖
V 領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをpUCH
MVL9と命名した。上記の方法に従って得られた、抗HM1.
24抗体を産生するハイブリドーマに由来するマウスH 鎖
V 領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをpUCH
MVHR16と命名した。

【０１２０】実施例２. DNA の塩基配列の決定 前記のプラスミド中のcDNAコード領域の塩基配列を、自
動DNA シークエンサー（Applied Biosystem Inc.製）お
よびTaq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit
（Applied Biosystem Inc. 製）を用いて、メーカー指
定のプロトコールに従って塩基配列を決定した。プラス
ミドpUCHMVL9に含まれるマウス抗HM1.24抗体のL 鎖V 領
域をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号：１に示
す。また、プラスミドpUCHMVHR16に含まれるマウス抗HM
1.24抗体H 鎖V 領域をコードする遺伝子の塩基配列を配
列番号：２に示す。

【０１２１】実施例３. CDRの決定 L 鎖およびH 鎖のV 領域の全般的構造は、互いに類似性
を有しており、それぞれ４つのフレームワーク部分が３
つの超可変領域、すなわち相補性決定領域（CDR ）によ
り連結されている。フレームワークのアミノ酸配列は、
比較的良く保存されているが、一方CDR 領域のアミノ酸
配列の変異性は極めて高い（Kabat, E.A., ら、「Sequ
ences of Proteins of Immunological Interest 」US D
ept. Health and Human Services, 1983）。このような
事実に基づき、抗HM1.24抗体の可変領域のアミノ酸配列
をKabat らにより作製された抗体のアミノ酸配列のデー
タベースに当てはめて、相同性を調べることによりCDR
領域を表５に示すごとく決定した。

【０１２２】

【表５】

【０１２３】実施例４. クローニングしたcDNAの発現
の確認（キメラ抗HM1.24抗体の作製） １．発現ベクターの作製 キメラ抗HM1.24抗体を発現するベクターを作製するた
め、それぞれのマウス抗HM1.24抗体L 鎖およびH 鎖V 領
域をコードするcDNAクローンpUCHMVL9およびpUCHMVHR16
をPCR 法により修飾した。そしてHEF 発現ベクター（国
際特許出願公開番号WO92-19759参照）に導入した。

【０１２４】L 鎖V 領域のための後方プライマーONS-L7
22S （配列番号：43）およびH 鎖V領域のための後方プ
ライマーVHR16S（配列番号：44）は、各々のV 領域のリ
ーダー配列の最初をコードするDNA にハイブリダイズし
且つKozak コンセンサス配列（Kozak, M, ら、J. Mol.
Biol., 196, 947-950, (1987) ）およびHindIII 制限酵
素認識部位を有するように設計した。L 鎖V 領域のため
の前方プライマーVL9A（配列番号：45）およびH 鎖V 領
域のための前方プライマーVHR16A（配列番号：46）は、
J 領域の末端をコードするDNA 配列にハイブリダイズし
且つスプライスドナー配列およびBamHI 制限酵素認識部
位を有するように設計した。

【０１２５】10 mM Tris-HCl (pH8.3)、50 mM KCl 、0.
1 mM dNTPs、1.5 mM MgCl₂、100 pmole ずつの各プライ
マー、100 ngの鋳型DNA （pUCHMVL9又はpUCHMVHR16）、
および5 unitのAmpli Taq 酵素を含有する100 μl のPC
R 反応混合物を50μl の鉱油で覆い、94℃にて最初の変
性の後、94℃にて１分間、55℃にて１分間、72℃にて１
分間のサイクルを30回行い、最後に72℃にて10分間イン
キュベートした。PCR 生成物を1.5%低融点アガロースゲ
ルを用いて精製し、HindIII およびBamHI で消化し、そ
してL 鎖V 領域についてはHEF-VL-gκに、H 鎖V 領域に
ついてはHEF-VH-gγ1 にそれぞれクローニングした。DN
A 配列決定の後、正しいDNA 配列を有するDNA 断片を含
むプラスミドをそれぞれHEF-1.24L-ｇκ及びHEF-1.24H-
ｇγ1 と命名した。

【０１２６】前記プラスミドHEF-1.24L-ｇκ及びHEF-1.
24H-ｇγ1 からそれぞれの可変領域をコードする領域を
制限酵素Hind IIIおよびBamHI により制限断片とし、こ
れらをプラスミドベクターpUC 19のHind IIIおよびBamH
I 部位に挿入し、各々、pUC19-1.24L-ｇκ及びpUC19-1.
24H-ｇγ1 と命名した。なお、それぞれのプラスミドpU
C19-1.24L-ｇκ又はpUC19-1.24H-ｇγ1 を含有する大腸
菌は、それぞれ、Escherichia coli DH5α（pUC19-1.24
L-ｇκ）およびEscherichia coli DH5α（pUC19-1.24H-
ｇγ1 ）と称し、それぞれFERM BP-5646及びFERM BP-56
44として、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県
つくば市東１丁目１番３号）に平成８年８月29日にブダ
ペスト条約に基づき国際寄託された。

【０１２７】２．COS-７細胞へのトランスフェクション キメラ抗HM1.24抗体の一過性発現を観察するため、前記
発現ベクターをCOS-７（ATCC CRL-1651 ）細胞において
試験した。HEF-1.24L-ｇκ及びHEF-1.24H-ｇγ1 をGene
Pulser 装置（BioRad社製）を用いてエレクトロポレー
ションによりCOS-７細胞に同時形質転換した。各DNA
（10μg ）を、PBS 中1 x 10⁷ 細胞/ml の0.8ml のアリ
コートに加え、1500Ｖ、25μＦの容量にてパルスを与え
た。室温にて10分間の回復期間の後、エレクトロポレー
ション処理された細胞を、10％のγ−グロブリンフリー
ウシ胎児血清を含有するDMEM培養液（GIBCO 社製）30 m
l に加えた。ＣＯ₂ インキュベーターBNA120D （TABAI
社製）中で72時間のインキュベーションの後、培養上清
を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、これを以下
の実験に用いた。

【０１２８】３. FCM 解析 キメラ抗HM1.24抗体の抗原結合活性は、KPMM２細胞を用
いたFCM （フローサイトメトリー）解析で行った。4.7
x 10⁵ 個のKPMM２細胞（特許出願公開番号 特開平7-23
6475）をPBS(−) で洗浄した後、上記キメラ抗HM1.24抗
体産生COS-７細胞培養液50μｌおよびFACS緩衝液（2 ％
ウシ胎児血清、0.1 ％アジ化ナトリウム含有PBS(-)）50
μl 、または500 μg/mlの精製マウス抗HM1.24抗体 5μ
l およびFACS緩衝液95μl を加え、氷温下１時間インキ
ュベートした。

【０１２９】コントロールとしてキメラ抗HM1.24抗体産
生COS 細胞培養液の代わりに2 μg/mlのキメラSK2 （国
際特許出願公開番号WO94-28159）50μl およびFACS緩衝
液50μl 、または精製マウス抗HM1.24抗体の代わりに50
0 μg/mlの精製マウス IgG2aκ（UPC10 ）（CAPPEL社
製）5 μl およびFACS緩衝液95μl を加え、同様にイン
キュベートした。FACS緩衝液で洗浄した後、25μg/mlの
FITC標識ヤギ抗ヒト抗体（GAH ）（CAPPEL社製）、また
は10μg/mlのFITC標識ヤギ抗マウス抗体（GAM ）（Bect
on Dickinson社製）100 μl を加え、氷温下３０分間イ
ンキュベートした。FACS緩衝液で洗浄した後、１ ml の
FACS緩衝液に懸濁し、FACScan(Becton Dickinson社製）
で各細胞の蛍光強度を測定した。

【０１３０】図１に示す通り、キメラ抗HM1.24抗体を添
加した細胞では、マウス抗HM1.24抗体を添加した場合同
様、コントロールと比較して蛍光強度のピークが右側に
シフトしたことから、キメラ抗HM1.24抗体がKPMM２細胞
と結合したことが明らかになった。このことより、クロ
ーニングしたcDNAはマウス抗HM1.24抗体のＶ領域をコー
ドしていることが確認された。

【０１３１】実施例５. キメラ抗HM1.24抗体安定産生
CHO 細胞株の樹立 １. キメラH 鎖発現ベクターの作製 前記プラスミドHEF-1.24H-ｇγ1 を制限酵素PvuIおよび
BamHI にて消化し、EF1 プロモーターおよびマウス抗HM
1.24抗体H 鎖V 領域をコードするDNA を含む約2.8kbpの
断片を1.5%低融点アガロースゲルを用いて精製した。次
に、DHFR遺伝子およびヒトH 鎖定常領域をコードする遺
伝子を含むヒトH 鎖発現ベクターDHFR-△E-RVh-PM1f
（国際特許出願公開番号WO92/19759参照）に使用されて
いる発現ベクターをPvuIおよびBamHI にて消化すること
により調製した約6kbpの断片内に上記DNA 断片を挿入
し、キメラ抗HM1.24抗体H 鎖発現ベクター DHFR-△E-HE
F-1.24H-ｇγ1 を構築した。

【０１３２】２. CHO細胞への遺伝子導入 キメラ抗HM1.24抗体安定産生系を樹立するために、PvuI
で消化して直鎖状にした前記発現ベクターHEF-1.24L-ｇ
κおよび DHFR-△E-HEF-1.24H-ｇγ1 をエレクトロポレ
ーション法により前述と同様（前記COS-7 細胞へのトラ
ンスフェクション）の条件下で同時にCHO 細胞DXB11
（Medical Research Council Collaboration Center よ
り供与）に遺伝子導入した。

【０１３３】３. MTXによる遺伝子増幅 遺伝子導入したCHO 細胞は500 μg/mlのG418（GIBCO-BR
L 社製）および10% のウシ胎児血清を添加したヌクレオ
シド不含α-MEM培養液（GIBCO-BRL 社製）中ではL 鎖お
よびH 鎖発現ベクターが共に導入されたCHO 細胞のみが
生存でき、それらを選別した。次に、上記培養液中に10
nM のMTX （Sigma 社製）を加え、増殖したクローンの
内、キメラ抗HM1.24抗体の産生量が高いものを選択した
結果、約20μg/mlのキメラ抗体産生効率を示すクローン
#8-13 を得、キメラ抗HM1.24抗体産生細胞株とした。

【０１３４】実施例６. キメラ抗HM1.24抗体の作製 キメラ抗HM1.24抗体の作製は以下の方法で行った。上記
キメラ抗HM1.24抗体産生CHO 細胞を、培地として5%γ−
グロブリンフリー新生仔ウシ血清（GIBCO-BRL社製）含
有 Iscove's Modified Dulbecco's Medium（GIBCO-BRL
社製）を用い、高密度細胞培養装置Verax system 20
（CELLEX BIOSCIENCE Inc.社製）で30日間連続培養し
た。

【０１３５】培養開始後13、20、23、26及び30日目に培
養液を回収し、加圧式ろ過フィルターユニットSARTOBRA
N （Sartorius 社製）を用いてろ過した後、抗体大量分
取システムAfi-Prep System （日本ガイシ社製）および
Super Protein A column（bed volume : 100 ml 、日本
ガイシ社製）を用いて、付属の説明書に基づき吸着/洗
浄緩衝液としてPBS(-)、溶出緩衝液として0.1M クエン
酸ナトリウム緩衝液（pH3 ）を用いてキメラ抗HM1.24抗
体をアフィニティー精製した。溶出画分は直ちに１M Tr
is-HCl（pH8.0 ）を添加して、pH7.4 付近に調整した。
抗体濃度は、２８０nmの吸光度を測定し、１mg/ml を1.
35ODとして算出した。

【０１３６】実施例７. キメラ抗HM1.24抗体の活性測
定 キメラ抗HM1.24抗体は下記の結合阻害活性にて評価を行
った。 1. 結合阻害活性の測定 1-1. ビオチン標識抗HM1.24抗体の作製 マウス抗HM1.24 抗体を0.1 M 重炭酸緩衝液で4 mg/ml
に希釈した後、50 mg/mlのBiotin-N- hydroxy succinim
ide(EY LABS Inc.社製）4 μl を添加し、室温で3 時間
反応させた。その後、0.2 M グリシン溶液1.5 mlを加え
室温で30分間インキュベートし反応を停止させ、PD-10
カラム（Pharmacia Biotech 社製）を用いてビオチン化
IgG 画分を分取した。

【０１３７】1-2. 結合阻害活性の測定 ビオチン標識マウス抗HM1.24抗体による結合阻害活性
は、ヒト羊膜細胞株WISH細胞（ATCC CCL 25 ）を用いた
Cell-ELISAで行った。Cell-ELISA プレートは次のよう
にして調製した。96穴プレートに10％ウシ胎児血清を含
有するRPMI1640培地により4 x 10⁵ 細胞/ml に調製した
WISH細胞懸濁液100 μl を加え、一晩培養した後、PBS
(-)で２回洗浄後0.1 ％グルタルアルデヒド（ナカライ
テスク社製）にて固定した。

【０１３８】ブロッキングの後、アフィニティー精製に
より得られたキメラ抗HM1.24抗体あるいはマウス抗HM1.
24抗体を段階希釈して各穴に50μl 加え、同時に2 μg/
mlのビオチン標識マウス抗HM1.24抗体50μl を添加し、
室温にて２時間インキュベーションおよび洗浄の後、ペ
ルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（DAKO社製）を
加えた。室温にて１時間インキュベーションした後洗浄
し、基質溶液を加えインキュベーションの後、６N 硫酸
50μl で反応を停止させ、MICROPLATE READERModel 355
0（Bio-Rad 社製）を用いて490 nmでの吸光度を測定し
た。その結果、図２に示す通り、ビオチン標識マウス抗
HM1.24抗体に対してキメラ抗HM1.24抗体はマウス抗HM1.
24抗体と同等の結合阻害活性を示した。このことより、
キメラ抗体はマウス抗HM1.24抗体と同じV 領域を有する
ことが示された。

【０１３９】実施例８. キメラ抗HM1.24抗体のADCC活
性の測定 ADCC（Antibody-dependent Cellular Cytotoxicity）活
性の測定はCurrent protocols in Immunology, Chapter
7. Immunologic studies in humans, Editor,John E,
Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., 1993の方
法に従った。 1. エフェクター細胞の調製 健常人および多発性骨髄腫患者の末梢血および骨髄より
比重遠心法で単核球を分離した。すなわち健常人および
多発性骨髄腫患者の末梢血および骨髄に等量のPBS(-)を
加え、Ficoll（Pharmacia 社製）- Conrey（第一製薬社
製）（比重1.077 ）に積層し、400 g で30分間遠心し
た。単核球層を分取し、10% ウシ胎児血清（Witaker 社
製）を含むRPMI1640（Sigma 社製）で２回洗浄後、同培
養液で細胞数が5 x 10⁶/mlになるように調製した。

【０１４０】2. 標的細胞の調製 ヒト骨髄腫細胞株RPMI 8226 (ATCC CCL 155)を0.1mCiの
⁵¹Cr-sodium chromateとともに10% ウシ胎児血清（Wita
ker 社製）を含むRPMI1640（Sigma 社製）中で37℃にて
60分インキュベートすることにより放射性標識した。放
射性標識の後、細胞をHanks balanced salt solution
(HBSS) で３回洗浄し、2 x 10⁵/mlに調製した。

【０１４１】3. ADCCアッセイ 96ウエルU 底プレート（Corning 社製）に放射性標識し
た2 x 10⁵/mlの標的細胞を50μl と、アフィニティー精
製によって得られた1 μg/mlのキメラ抗HM1.24抗体、マ
ウス抗ＨＭ1.24抗体、あるいはコントロールヒトIgG1
（Serotec 社製）50μl 加え、4 ℃で15分間反応させ
た。その後、5 x 10⁶/mlのエフェクター細胞を100 μl
を加え、炭酸ガス培養器内で4 時間培養した。その際、
エフェクター細胞（E ）と標的細胞（T ）の比（E:T ）
を 0:1、:5:1、20:1又は50:1とした。

【０１４２】100 μl の上清をとり、ガンマカウンター
（ARC361, Aloka 社製）で培養上清中に遊離された放射
活性を測定した。最大遊離放射能測定用には1 ％NP-40
（BRL 社製）を用いた。細胞障害活性（％）は（A-C ）
／（B-C ）x100で計算した。なおA は抗体存在下におい
て遊離された放射活性（cpm ）、B はNP-40 により遊離
された放射活性（cpm ）および Cは抗体を含まず培養液
のみで遊離された放射活性（cpm ）を示す。図３に示す
通り、ヒトコントロールIgG1と比較してキメラ抗HM1.24
抗体を添加した場合、E:T 比の上昇に従い細胞障害活性
が上昇したことから、このキメラ抗HM1.24抗体がADCC活
性を有することが示された。さらに、マウス抗ＨＭ1.24
抗体を添加しても細胞障害活性は全く見られないことか
ら、エフェクター細胞がヒト由来の細胞の場合、ADCC活
性を得るためにはヒト抗体のFc部分が必要であることが
示された。

【０１４３】実施例９. 再構成ヒト抗ＨＭ1.24抗体の
作製 1. 再構成ヒト抗ＨＭ1.24抗体Ｖ領域の設計 マウスモノクローナル抗体のCDR がヒト抗体に移植され
ている再構成ヒト抗体を作製するためには、マウスモノ
クローナル抗体のFRとヒト抗体のFRとの間に高い相同性
が存在することが望ましい。従って、マウス抗ＨＭ1.24
抗体のＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域を、Protein Data Bank を
用いて構造が解明されているすべての既知抗体のＶ領域
と比較した。

【０１４４】マウス抗ＨＭ1.24抗体のＬ鎖Ｖ領域はヒト
Ｌ鎖Ｖ領域のサブグループIV（HSGIV ）のコンセンサス
配列に最も類似しており、66.4％の相同性が存在する。
一方、HSGI、HSGII 及びHSG III とはそれぞれ56.9％、
55.8％及び61.5％の相同性を示した。マウス抗ＨＭ1.24
抗体のＬ鎖Ｖ領域は既知ヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域との比較に
おいて、ヒトＬ鎖Ｖ領域のサブグループＩの一つである
ヒトＬ鎖Ｖ領域REI に67.0％の相同性を示した。従っ
て、再構成ヒト抗ＨＭ1.24抗体Ｌ鎖Ｖ領域の作製のため
の出発材料としてREI のFRを使用した。

【０１４５】再構成ヒト抗ＨＭ1.24抗体Ｌ鎖Ｖ領域のバ
ージョンａを設計した。このバージョンにおいては、ヒ
トFRは再構成ヒトCAMPATH-1H抗体中に存在するREI に基
くFR（Riechmann, L. ら、Nature 322, 21-25,（1988）
を参照、国際特許出願公開番号WO92-19759に記載の再構
成ヒトPM-1のＬ鎖Ｖ領域のバージョンａに含まれるFR）
と同一であり、そしてマウスCDR はマウス抗ＨＭ1.24抗
体のＬ鎖Ｖ領域中のCDR と同一とした。

【０１４６】マウス抗ＨＭ1.24抗体のＨ鎖Ｖ領域はヒト
Ｈ鎖Ｖ領域のHSG Ｉのコンセンサス配列に最も類似して
おり、54.7％の相同性が存在する。一方、HSGII 及びHS
GIIIとはそれぞれ34.6％及び48.1％の相同性を示した。
マウス抗ＨＭ1.24抗体のＨ鎖Ｖ領域は既知のヒト抗体Ｈ
鎖Ｖ領域との比較において、FR1 からFR3 までは、ヒト
Ｈ鎖Ｖ領域のサブグループＩの一つであるヒト抗体HG3
のＨ鎖Ｖ領域（Rechavi, G. ら、Proc. Nat. Acad. Sc
i. USA 80, 855-859 ）に非常に類似しており、その相
同性は67.3％であった。

【０１４７】このため、ヒト抗体HG3 のFRを、再構成ヒ
ト抗ＨＭ1.24抗体のＨ鎖Ｖ領域の作製のための出発材料
として用いた。しかしながら、ヒト抗体HG3 のFR4 のア
ミノ酸配列は記述されていないために、今回FR4 に関し
てはマウス抗ＨＭ1.24抗体のＨ鎖のFR4 と最も高い相同
性を示すヒト抗体JH6 （Ravetch, J. V.ら、Cell, 27,
583-591 ）のFR4 のアミノ酸配列を用いた。JH6 のFR4
は一つのアミノ酸を除いてマウス抗ＨＭ1.24抗体のＨ鎖
のFR4 と同一のアミノ酸配列を有する。再構成ヒト抗Ｈ
Ｍ1.24抗体のＨ鎖Ｖ領域の第一のバージョンａにおい
て、ヒトFR1 中の30位およびヒトFR3 中の71位のアミノ
酸をマウス抗ＨＭ1.24抗体のアミノ酸と同一とした以
外、FR1 からFR3 まではヒトHG3 のFR1 からFR3 と同一
であり、そしてCDR はマウス抗ＨＭ1.24抗体のＨ鎖Ｖ領
域中のCDR と同一とした。

【０１４８】2. 再構成ヒト抗HM1.24抗体Ｌ鎖Ｖ領域の
作製 再構成ヒト抗HM1.24抗体Ｌ鎖を、PCR 法によるCDR グラ
フティングにより作製した。この方法を図４に模式的に
示す。ヒト抗体REI 由来のFRを有する再構成ヒト抗HM1.
24抗体（バージョンａ）の作製のために８個のPCR プラ
イマーを使用した。外部プライマーＡ（配列番号：47）
及びＨ（配列番号：48）は、HEF 発現ベクターHEF-VL-g
κのDNA 配列とハイブリダイズするように設計された。
CDR −グラフティングプライマーL1S （配列番号：4
9）、L2S （配列番号：50）及びL3S （配列番号：51）
はセンスDNA 配列を有し、そしてCDR −グラフティング
プライマーL1A （配列番号：52）、L2A （配列番号：5
3）及びL3A （配列番号：54）はアンチ−センスDNA 配
列を有しそしてそれぞれプライマーL1S 、L2S及びL3S
の５′−末端のDNA 配列に対する相補的DNA 配列（20〜
23bp）を有する。

【０１４９】第一PCR 段階において４つの反応A-L1A 、
L1S-L2A 、L2S-L3A 、及びL3S-H を行い、そして各PCR
生成物を精製した。第一PCR からの４つのPCR 生成物を
それら自体の相補性によりアッセンブリさせた（国際特
許出願公開番号WO92-19759参照）。次に、外部プライマ
ーＡ及びＨを加えて、再構成ヒト抗HM1.24抗体Ｌ鎖Ｖ領
域をコードする全長DNA を増幅した（第２PCR ）。前記
PCR においては、ヒト抗体REI からのFRに基く再構成ヒ
トONS-M21 抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョンａをコードするプ
ラスミドHEF-RVL-M21a（国際特許出願公開番号WO95-140
41を参照）を鋳型として用いた。

【０１５０】第一PCR 段階においては、10 mM Tri-HCl
（pH8.3 ）、50 mM KCl 、0.1mM dNTPs 、1.5 mM MgC
l₂、100 ngの鋳型DNA 、100 pmole の各プライマー及び
５ｕのAmpli Taq を含有するのPCR 混合物を用いた。各
PCR チューブは50μl の鉱油で覆膜した。最初に94℃で
変性した後、94℃にて１分間、55℃にて１分間及び72℃
にて１分間の反応サイクルを行い、次に72℃にて10分間
インキュベートした。PCR 生成物A-L1A （215bp ）、L1
S-L2A （98bp）、L2S-L3A （140bp ）及びL3S-H （151b
p ）を1.5 ％低融点アガロースゲルを用いて精製し、第
二PCR でアッセンブリした。第二PCR においては、１μ
g の各第一PCR の生成物、及び５ｕのAmpli Taq を含有
する98μl のPCR 混合物を、94℃にて２分間、55℃にて
２分間及び72℃にて２分間で２サイクルインキュベート
し、そして次に100 pmole の各外部プライマー（Ａ及び
Ｈ）を加えた。PCR チューブを50μl の鉱油で覆い、そ
して前記と同一の条件で30サイクルのPCR を行った。

【０１５１】第二PCR により生じた516bp のDNA 断片を
1.5 ％低融点アガロースゲルで精製し、BamHI 及びHind
III で消化し、得られたDNA 断片をHEF 発現ベクターHE
F-VL-gκにクローニングした。DNA 配列決定の後、再構
成ヒト抗HM1.24抗体Ｌ鎖Ｖ領域の正しいアミノ酸配列を
コードするDNA 断片を含むプラスミドをHEF-RVLa-AHM-g
κと命名した。本プラスミドHEF-RVLa-AHM-gκに含まれ
るＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番
号：９に示す。再構成ヒト抗HM1.24抗体Ｌ鎖Ｖ領域のバ
ージョンｂを、PCR を用いる変異誘発法によって作製し
た。変異原プライマーFTY-1 （配列番号：55）およびFT
Y-2 （配列番号：56）は、71位のフェニルアラニンがチ
ロシンに変異するように設計した。

【０１５２】プラスミドHEF-RVLa-AHM-gκを鋳型とし、
上記プライマーを用いて増幅した後、最終生成物を精製
し、BamHI およびHindIII で消化し、得られたDNA 断片
をHEF 発現ベクターHEF-VL-gκにクローニングし、プラ
スミドHEF-RVLb-AHM-gκを得た。本プラスミドHEF-RVLb
-AHM-gκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩
基配列を配列番号：10に示す。

【０１５３】3. 再構成ヒト抗HM1.24抗体Ｈ鎖Ｖ領域の
作製 3-1. 再構成ヒト抗HM1.24抗体Ｈ鎖Ｖ領域バージョンａ
- ｅの作製 再構成ヒト抗HM1.24抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするDNA を
次の様にして設計した。ヒト抗体HG3 のFR1 〜3 および
ヒト抗体JH6 のFR4 をコードするDNA 配列を、マウス抗
HM1.24抗体Ｈ鎖Ｖ領域のCDR をコードするDNA 配列とつ
なげることにより、再構成ヒト抗HM1.24抗体Ｈ鎖Ｖ領域
をコードする全長DNA を設計した。次に、このDNA 配列
のそれぞれ５′−側及び３′−側にHindIII 認識部位／
Kozak コンセンサス配列及びBamHI 認識部位／スプライ
スドナー配列を付加して、HEF 発現ベクターに挿入でき
るようにした。

【０１５４】こうして設計したDNA 配列を４個のオリゴ
ヌクレオチドに分け、そして次に、これらのオリゴヌク
レオチドのアセンブリーを妨害する可能性のあるオリゴ
ヌクレオチド中の二次構造についてコンピューター解析
した。４個のオリゴヌクレオチド配列RVH1〜RVH4を配列
番号：57〜60に示す。これらのオリゴヌクレオチドは11
9 〜144 塩基の長さを有し、25〜26bpのオーバラップ領
域を有する。オリゴヌクレオチドの内のRVH2（配列番
号：58）、RVH4（配列番号：60）はセンスDNA 配列を有
し、そして他のRVH1（配列番号：57）、RVH3（配列番
号：59）はアンチセンスDNA 配列を有する。これら４個
のオリゴヌクレオチドのPCR 法によるアセンブリーの方
法を図に示す（図５参照）。

【０１５５】100 ngずつの４種のオリゴヌクレオチド及
び５ｕのAmpli Taq を含有する98μl のPCR 混合物を、
94℃にて２分間の最初の変性の後、94℃にて２分間、55
℃にて２分間及び72℃にて２分間のから成る２サイクル
のインキュベーションを行った。100 pmole ずつのRHP1
（配列番号：61）及びRHP2（配列番号：62）を外部プラ
イマーとして添加した後、PCR チューブを50μl の鉱油
で覆い、そして94℃にて１分間の最初の変性の後、94℃
にて１分間、55℃にて１分間及び72℃にて１分間の38サ
イクルを行い、そして次に72℃にて10分間インキュベー
トした。

【０１５６】438bp のDNA 断片を1.5 ％低融点アガロー
スゲルを用いて精製し、HindIII 及びBamHI により消化
し、そして次にHEF 発現ベクターHEF-VH-gγ1 にクロー
ニングした。DNA 配列決定の後、正しいＨ鎖Ｖ領域のア
ミノ酸配列をコードするDNA断片を含むプラスミドをHEF
-RVHa-AHM-gγ1 と命名した。本プラスミドHEF-RVHa-AH
M-gγ1 に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩
基配列を配列番号：11に示す。再構成ヒト抗HM1.24抗体
Ｈ鎖Ｖ領域の各バージョンｂ、ｃ、ｄ及びｅを以下のよ
うにして作製した。

【０１５７】バージョンｂは、変異原プライマーとして
66位のアルギニンがリジンに変異するように設計したBS
（配列番号：63）およびBA（配列番号：64）を用い、プ
ラスミドHEF-RVHa-AHM-gγ1 を鋳型DNA として、PCR 法
により増幅し、プラスミドHEF-RVHb-AHM-gγ1 を得た。
本プラスミドHEF-RVHb-AHM-gγ1 に含まれるＨ鎖Ｖ領域
のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：12に示す。
バージョンｃは、変異原プライマーとして73位のトレオ
ニンがリジンに変異するように設計したCS（配列番号：
65）およびCA（配列番号：66）を用い、プラスミドHEF-
RVHa-AHM-gγ1 を鋳型DNA として、PCR 法により増幅
し、プラスミドHEF-RVHc-AHM-gγ1 を得た。本プラスミ
ドHEF-RVHc-AHM-gγ1 に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸
配列および塩基配列を配列番号：13に示す。

【０１５８】バージョンｄは、変異原プライマーとして
66位のアルギニンがリジンに、73位のトレオニンがリジ
ンに変異するように設計したDS（配列番号：67）および
DA（配列番号：68）を用い、プラスミドHEF-RVHa-AHM-g
γ1 を鋳型DNA としてプラスミドHEF-RVHd-AHM-gγ1 を
得た。本プラスミドHEF-RVHd-AHM-gγ1 に含まれるＨ鎖
Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：14に
示す。バージョンｅは、変異原プライマーとして67位の
バリンがアラニンに、69位のメチオニンがロイシンに変
異するように設計したES（配列番号：69）およびEA（配
列番号：70）を用い、プラスミドHEF-RVHa-AHM-gγ1 を
鋳型DNA として増幅し、プラスミドHEF-RVHe-AHM-gγ1
を得た。本プラスミドHEF-RVHe-AHM-gγ1 に含まれるＨ
鎖Ｖ領域に含まれるアミノ酸配列および塩基配列を配列
番号：15に示す。

【０１５９】3-2. Ｈ鎖ハイブリッドＶ領域の作製 Ｈ鎖ハイブリッドＶ領域を２種構築した。１つはFR1 と
FR2 のアミノ酸配列がマウス抗ＨＭ1.24 抗体由来であ
り、FR3 とFR4 のアミノ酸配列が再構成ヒト抗ＨＭ1.24
抗体のＨ鎖Ｖ領域のバージョンａ由来となるマウス・ヒ
トハイブリッド抗ＨＭ1.24抗体、もう１つはFR1 とFR2
のアミノ酸配列が再構成ヒト抗ＨＭ1.24抗体のＨ鎖Ｖ領
域のバージョンａ由来であり、FR3 とFR4 のアミノ酸配
列がマウス抗ＨＭ1.24抗体由来となるヒト・マウスハイ
ブリッド抗ＨＭ1.24抗体である。CDR 領域のアミノ酸配
列はすべてマウス抗ＨＭ1.24抗体由来である。

【０１６０】２種のＨ鎖ハイブリッドＶ領域はPCR 法に
より作製した。この方法を図６及び７に模式的に示す。
２種のＨ鎖ハイブリッドＶ領域作製のために４種のプラ
イマーを使用した。外部プライマーａ（配列番号：71）
及びｈ（配列番号：72）は、HEF 発現ベクターHEF-VH-g
γ1 のDNA 配列とハイブリダイズするように設計され
た。Ｈ鎖ハイブリッド作製プライマーHYS （配列番号：
73）はセンスDNA 配列を有し、Ｈ鎖ハイブリッドプライ
マーHYA （配列番号：74）はアンチセンスDNA 配列を有
しそしてたがいに相補的なDNA 配列となるよう設計され
た。

【０１６１】FR1 とFR2 のアミノ酸配列がマウス抗ＨＭ
1.24抗体由来であり、FR3 とFR4 のアミノ酸配列が再構
成ヒト抗ＨＭ1.24抗体のＨ鎖Ｖ領域のバージョンａ由来
となるＨ鎖ハイブリッドＶ領域の作製のために、第一PC
R 段階においてプラスミド HEF-1.24H-gγ1 を鋳型とし
外部プライマーａとＨ鎖ハイブリッドプライマーHYAを
用いたPCR と、プラスミドHEF-RVHa-AHM-gγ1 を鋳型と
しＨ鎖ハイブリッドプライマーHYS （配列番号：73）と
外部プライマーｈ（配列番号：72）を用いたPCR を行
い、そして各PCR 産物を精製した。第一PCR からの２つ
のPCR 生成物をそれら自体の相補性によりアッセンブリ
させた（国際特許出願公開番号WO92-19759参照）。

【０１６２】次に、外部プライマーａ（配列番号：71）
及びｈ（配列番号：72）を加えて、FR1 とFR2 のアミノ
酸配列がマウス抗ＨＭ1.24抗体由来であり、FR3 とFR4
のアミノ酸配列が再構成ヒト抗ＨＭ1.24抗体のＨ鎖Ｖ領
域のバージョンａ由来となるＨ鎖ハイブリッドＶ領域を
コードする全長DNA を第二PCR 段階で増幅した。FR1 と
FR2 のアミノ酸配列が再構成ヒト抗ＨＭ1.24抗体のＨ鎖
Ｖ領域のバージョンａ由来であり、FR3 とFR4 のアミノ
酸配列がマウス抗ＨＭ1.24抗体由来となるＨ鎖ハイブリ
ッドＶ領域の作製のために、第一PCR 段階においてプラ
スミドHEF-RVHa-AHM-gγ1 を鋳型とし外部プライマーａ
とＨ鎖ハイブリッドプライマーHYA を用いたPCR と、プ
ラスミド HEF-1.24H-gγ1 を鋳型としＨ鎖ハイブリッド
プライマーHYS と外部プライマーｈを用いたPCR を行
い、そして各PCR 産物を精製した。第一PCR からの２つ
のPCR 生成物をそれら自体の相補性によりアッセンブリ
させた（国際特許出願公開番号WO92-19759参照）。

【０１６３】次に、外部プライマーａ及びｈを加えて、
FR1 とFR2 のアミノ酸配列が再構成ヒト抗ＨＭ1.24抗体
のＨ鎖Ｖ領域のバージョンａ由来であり、FR3 とFR4 の
アミノ酸配列がマウス抗ＨＭ1.24 抗体由来となるＨ鎖
ハイブリッドＶ領域をコードする全長DNA を第二PCR 段
階で増幅した。第一PCR 、PCR 産物の精製、アッセンブ
リ、第二PCR 、及びHEF 発現ベクターHEF-VH-gγ1 への
クローニングの方法は実施例 9. 再構成ヒトＨＭ1.24抗
体Ｌ鎖Ｖ領域の作製に示す方法に準じた。

【０１６４】DNA 配列決定の後、FR1 とFR2 のアミノ酸
配列がマウス抗ＨＭ1.24抗体由来であり、FR3 とFR4 の
アミノ酸配列が再構成ヒト抗ＨＭ1.24抗体のＨ鎖Ｖ領域
のバージョンａ由来となるＨ鎖ハイブリッドＶ領域の正
しいアミノ酸配列をコードするDNA 断片を含むプラスミ
ドをHEF-MH-RVH-AHM-gγ1 と命名した。本プラスミドHE
F-MH-RVH-AHM-gγ1 に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配
列及び塩基配列を配列番号：75に示す。また、FR1 とFR
2 のアミノ酸配列が再構成ヒト抗ＨＭ1.24抗体Ｈ鎖Ｖ領
域のバージョンａ由来であり、FR3 とFR4 のアミノ酸配
列がマウス抗体ＨＭ1.24 抗体由来となるＨ鎖ハイブリ
ッドＶ領域の正しいアミノ酸配列をコードするDNA 断片
を含むプラスミドをHEF-HM-RVH-AHM-gγ1 と命名した。
本プラスミドHEF-HM-RVH-AHM-gγ1 に 含まれるＨ鎖Ｖ
領域のアミノ酸配列及び塩基配列を配列番号：76に示
す。

【０１６５】3-3. 再構成ヒト抗HM1.24抗体Ｈ鎖Ｖ領域
バージョンｆ〜ｓの作製 再構成ヒト抗HM1.24抗体Ｈ鎖Ｖ領域の各バージョンｆ、
ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及び
ｓを以下のようにして作製した。バージョンｆは、変異
原プライマーとして75位のトレオニンがセリンに、78位
のバリンがアラニンに変異するように設計したFS（配列
番号：78）およびFA（配列番号：79）を用い、プラスミ
ドHEF-RVHe-AHM-gγ1 を鋳型DNA として、PCR 法により
増幅し、プラスミドHEF-RVHf-AHM-gγ1 を得た。本プラ
スミドHEF-RVHf-AHM-gγ1 に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミ
ノ酸配列および塩基配列を配列番号：16に示す。

【０１６６】バージョンｇは、変異原プライマーとして
40位のアラニンがアルギニンに変異するように設計した
GS（配列番号：80）およびGA（配列番号：81）を用い、
プラスミドHEF-RVHa-AHM-gγ1 を鋳型DNA として増幅
し、プラスミドHEF-RVHg-AHM-gγ1 を得た。本プラスミ
ドHEF-RVHg-AHM-gγ1 に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸
配列および塩基配列を配列番号：17に示す。バージョン
ｈは、変異原プライマーとしてFS（配列番号：78）およ
びFA（配列番号：79）を用い、プラスミドHEF-RVHb-AHM
-gγ1 を鋳型DNA として増幅し、プラスミドHEF-RVHh-A
HM-gγ1 を得た。本プラスミドHEF-RVHh-AHM-gγ1 に含
まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列
番号：18に示す。

【０１６７】バージョンｉは、変異原プライマーとして
83位のアルギニンがアラニンに、84位のセリンがフェニ
ルアラニンに変異するように設計したIS（配列番号：8
2）およびIA（配列番号：83）を用い、プラスミドHEF-R
VHh-AHM-gγ1 を鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドH
EF-RVHi-AHM-gγ1 を得た。本プラスミドHEF-RVHi-AHM-
gγ1 に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基
配列を配列番号：19に示す。バージョンｊは、変異原プ
ライマーとして66位のアルギニンがリジンに変異するよ
うに設計したJS（配列番号：84）とJA（配列番号：85）
を用い、プラスミドHEF-RVHf-AHM-gγ1 を鋳型DNA とし
て増幅し、プラスミドHEF-RVHj-AHM-gγ1 を得た。本プ
ラスミドHEF-RVHj-AHM-gγ1 に含まれるＨ鎖Ｖ領域のア
ミノ酸配列および塩基配列を配列番号：20に示す。

【０１６８】バージョンｋは、変異原プライマーとして
81位のグルタミン酸がグルタミンに変異するように設計
したKS（配列番号：86）およびKA（配列番号：87）を用
い、プラスミドHEF-RVHh-AHM-gγ1 を鋳型DNA として増
幅し、プラスミドHEF-RVHk-AHM-gγ1 を得た。本プラス
ミドHEF-RVHk-AHM-gγ1 に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ
酸配列および塩基配列を配列番号：２１に示す。バージ
ョンｌは、変異原プライマーとして81位のグルタミン酸
がグルタミンに、82B 位のセリンがイソロイシンに変異
するように設計したLS（配列番号：88）およびLA（配列
番号：89）を用い、プラスミドHEF-RVHh-AHM-gγ1 を鋳
型DNA として増幅し、プラスミドHEF-RVHl-AHM-gγ1 を
得た。本プラスミドHEF-RVHl-AHM-gγ1 に含まれるＨ鎖
Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：22に
示す。

【０１６９】バージョンｍは、変異原プライマーとして
81位のグルタミン酸がグルタミンに、82b 位のセリンが
イソロイシンに、87位のトレオニンがセリンに変異する
ように設計したMS（配列番号：90）とMA（配列番号：9
1）を用い、プラスミドHEF-RVHh-AHM-gγ1 を鋳型DNA
として増幅し、プラスミドHEF-RVHm-AHM-gγ1 を得た。
本プラスミドHEF-RVHm-AHM-gγ1 に含まれるＨ鎖Ｖ領域
のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：23に示す。
バージョンｎは、変異原プライマーとして82B 位のセリ
ンがイソロイシンに変異するように設計したNS（配列番
号：92）およびNA（配列番号：93）を用い、プラスミド
HEF-RVHh-AHM-gγ1 を鋳型DNA としてプラスミドHEF-RV
Hn-AHM-gγ1 を得た。本プラスミドHEF-RVHn-AHM-gγ1
に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を
配列番号：24に示す。

【０１７０】バージョンｏは、変異原プライマーとして
87位のトレオニンがセリンに変異するように設計したOS
（配列番号：94）およびOA（配列番号：95）を用い、プ
ラスミドHEF-RVHh-AHM-gγ1 を鋳型DNA としてプラスミ
ドHEF-RVHo-AHM-gγ1 を得た。本プラスミドHEF-RVHo-A
HM-gγ1 に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩
基配列を配列番号：25に示す。バージョンｐは、変異原
プライマーとして78位のバリンがアラニンに変異するよ
うに設計したPS（配列番号：96）およびPA（配列番号：
97）を用い、プラスミドHEF-RVHa-AHM-gγ1 を鋳型DNA
として、PCR 法により増幅し、プラスミドHEF-RVHp-AHM
-gγ1 を得た。本プラスミドHEF-RVHp-AHM-gγ1 に含ま
れるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番
号：26に示す。

【０１７１】バージョンｑは、変異原プライマーとして
75位のトレオニンがセリンに変異するように設計したQS
（配列番号：98）およびQA（配列番号：99）を用い、プ
ラスミドHEF-RVHa-AHM-gγ1 を鋳型DNA として、PCR 法
により増幅し、プラスミドHEF-RVHq-AHM-gγ1 を得た。
本プラスミドHEF-RVHq-AHM-gγ1 に含まれるＨ鎖Ｖ領域
のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：27に示す。
バージョンｒは、変異原プライマーとしてCS（配列番
号：65）およびCA（配列番号：66）を用い、プラスミド
HEF-RVHp-AHM-gγ1 を鋳型DNA として、PCR 法により増
幅し、プラスミドHEF-RVHr-AHM-gγ1 を得た。本プラス
ミドHEF-RVHr-AHM-gγ1 に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ
酸配列および塩基配列を配列番号：28に示す。

【０１７２】再構成ヒト抗HM1.24抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバー
ジョンｓを、PCR を用いる変異誘発法によって作製し
た。変異原プライマーSS（配列番号：100)およびSA（配
列番号：101)は、69位のメチオニンがイソロイシンに変
異するように設計した。プラスミドHEF-RVHr-AHM-gγ1
を鋳型とし、上記プライマーを用いて増幅した後、最終
生成物を精製し、BamHI およびHindIII で消化し、得ら
れたDNA 断片をHEF 発現ベクターHEF-VH-gγ1 にクロー
ニングし、プラスミドHEF-RVHs-AHM-gγ1 を得た。本プ
ラスミドHEF-RVHs-AHM-gγ1 に含まれるＨ鎖Ｖ領域のア
ミノ酸配列および塩基配列を配列番号：102 に示す。

【０１７３】なお、前記プラスミドHEF-RVLa-AHM-gκ及
びHEF-RVHr-AHM-gγ1 からそれぞれの可変領域をコード
する領域を制限酵素HindIII およびBamHI により制限断
片とし、これらをプラスミドベクターpUC19 のHindIII
およびBamHI 部位に挿入した。それぞれのプラスミドは
pUC19-RVLa-AHM-gκ及びpUC19-RVHr-AHM-gγ1 と命名し
た。なお、それぞれのプラスミドpUC19-RVLa-AHM-gκお
よびpUC19-RVHr-AHM-gγ1を含有する大腸菌は、それぞ
れ、Escherichia coli DH5α（pUC19-RVLa-AHM-gκ）お
よびEscherichia coli DH5α（pUC19-RVHr-AHM-gγ1 ）
と称し、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つ
くば市東１丁目１番３号）に平成８年８月29日に、各々
FERM BP-5645およびFERM BP-5643としてブダペスト条約
に基づき国際寄託された。

【０１７４】なお、前記プラスミドHEF-RVHs-AHM-gγ1
からの可変領域をコードする領域を制限酵素HindIII お
よびBamHI により制限断片とし、これをプラスミドベク
ターpUC19 のBamHI およびHindIII 部位に挿入した。得
られたプラスミドをpUC19-RVHs-AHM-gγ1 と命名した。
プラスミドpUC19-RVHs-AHM-gγ1 を含有する大腸菌は、
Escherichia coli DH5α（pUC19-RVHs-AHM-gγ1 ）と称
し、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば
市東１丁目１番３号）に平成９年（1997年）９月29日に
FERM BP-6127としてブダペスト条約に基づき国際寄託さ
れた。

【０１７５】4. 再構成ヒト抗HM1.24抗体、キメラ抗HM
1.24抗体、及びＨ鎖ハイブリッド抗体の作製 再構成ヒト抗HM1.24抗体の各鎖を評価するために再構成
ヒト抗HM1.24抗体とポジティブコントロール抗体として
キメラ抗HM1.24抗体を発現させた。そして再構成ヒト抗
HM1.24抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバージョンｂ以降の各バージョ
ンを作製する際、どのFR内のアミノ酸残基を置換すべき
かを検討するためにＨ鎖ハイブリッド抗体を発現させ
た。また、再構成ヒト抗HM1.24抗体Ｌ鎖バージョンａの
評価のためにキメラＨ鎖との組合せで発現させた。

【０１７６】4-1. 再構成ヒト抗HM1.24抗体の発現
（１） 再構成ヒト抗HM1.24抗体Ｈ鎖のための発現ベクター（HE
F-RVHa-AHM-gγ1 〜HEF-RVHr-AHM-gγ1 ）と再構成ヒト
抗HM1.24抗体Ｌ鎖のための発現ベクター（HEF-RVLa-AHM
-gκあるいはHEF-RVLb-AHM-gκ）各10μg をGene Pulse
r 装置（BioRad社製）を用いてエレクトロポレーション
によりCOS-７細胞に同時形質転換した。各DNA （10μg
）を、PBS 中1 x 10⁷ 細胞/ml の0.8ml のアリコート
に加え、1500Ｖ、25μＦの容量にてパルスを与えた。

【０１７７】室温にて10分間の回復期間の後、エレクト
ロポレーション処理された細胞を、10％のγ−グロブリ
ンフリーウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培養液30 ml
（GIBCO 社製）に加えた。37℃、５％ＣＯ₂ の条件下で
72時間の培養をＣＯ₂ インキュベーターBNA120D （TABA
I 社製）を用いて行った後、培養上清を集め、遠心ロー
ター03（HITACHI 社製）を装着した遠心機15PR-22(HITA
CHI 社製）により1000rpm、５分間の遠心分離を行い細
胞破片を除去し、マイクロコンセントレーター（Centri
con 100 、Amicon社製）を遠心ローターJA-20 ・1 （BE
CKMAN 社製）を装着した遠心器J2-21 （BECKMAN 社製）
により2000 rpmの条件下で限外濾過濃縮をおこない、Ce
ll-ELISAに用いた。

【０１７８】再構成ヒト抗HM1.24抗体の発現（２） 再構成ヒト抗HM1.24抗体Ｈ鎖バージョンｓのための発現
ベクター（HEF-RVHs-AHM-gγ1)と再構成ヒト抗HM1.24抗
体Ｌ鎖のための発現ベクター（HEF-RVLa-AHM-gκ) 各10
μg をGene Pulser 装置（BioRad社製）を用いてエレク
トロポレーションによりCOS 細胞に同時形質転換した。
各DNA(10μg)を、PBS 中1 x 10⁷ 細胞/ml の0.8ml のア
リコートに加え、1,500V、25μF の容量にてパルスを与
えた。

【０１７９】室温にて10分間の回復期間の後、エレクト
ロポレーション処理された細胞を、10％のγ−グロブリ
ンフリーウシ胎児血清を含有するDMEM培養液30ml(GIBCO
社製）に加えた。37℃、５％ CO₂の条件下で72時間の培
養をCO₂ インキュベーターBNA120D (TABAI社製）を用い
て行った後、培養上清を集め、遠心ローター03(HITACHI
社製）を装着した遠心機05PR-22 (HITACHI社製）により
1000rpm 、５分間の遠心分離を行い細胞破片を除去し、
マイクロコンセントレーター(Centricon 100、Amicon社
製）を遠心ローターJA-20 ・1 (BECKMAN社製）を装着し
た遠心器J2-21(BECKMAN社製）により2000rpm の条件下
で限外濾過濃縮をおこない、濾過フィルター、マイレク
スGV13mm（ミリポア社製）用いて濾過滅菌したものをCe
ll-ELISAに用いた。

【０１８０】4-2. キメラ抗HM1.24抗体の発現 キメラ抗HM1.24抗体Ｈ鎖のための発現ベクター HEF-1.2
4H-gγ1 とキメラ抗HM1.24抗体Ｌ鎖のための発現ベクタ
ー HEF-1.24L-gκ各10μg を用い、上記再構成ヒト抗HM
1.24抗体の発現の方法にしたがってCell-ELISAに用いる
ためのキメラ抗HM1.24抗体を調製した。

【０１８１】4-3. ヒト型化Ｌ鎖バージョンａとキメラ
Ｈ鎖からなる抗HM1.24抗体の発現 キメラ抗HM1.24抗体Ｈ鎖のための発現ベクターHEF-1.24
H-g γ1 と再構成ヒト抗HM1.24抗体Ｌ鎖バージョンａの
ための発現ベクターHEF-RVLa-AHM-Gκ各10μｇを用い、
上記再構成ヒト抗HM1.24抗体の発現の方法に従って、Ce
ll-ELISAに用いるためのヒト型化Ｌ鎖バージョンａとキ
メラＨ鎖からなる抗HM1.24抗体を調製した。

【０１８２】4-4. Ｈ鎖ハイブリッド抗体の発現 Ｈ鎖ハイブリッドＶ領域のための発現ベクター（HEF-MH
-RVH-AHM-gγ1 或いはHEF-HM-RVH-AHM-gγ1 ）と再構成
ヒト抗HM1.24抗体Ｌ鎖のための発現ベクターHEF-RVLa-A
HM-gκ各10μg を用い、上記再構成ヒト抗HM1.24抗体の
発現の方法にしたがってCell-ELISAに用いるためのＨ鎖
ハイブリッド抗体を調製した。

【０１８３】4-5. 抗体濃度の測定 得られた抗体の濃度測定はELISA により行った。ELISA
用96穴プレート（Maxisorp, NUNC社製）の各穴にコーテ
ィングバッファー（0.1M NaHCO₃, 0.02% NaN₃,pH9.6 ）
により１μg/mlの濃度に調製したヤギ抗ヒトIgG 抗体
（BIO SOURCE社製）100μｌを加え、室温で１時間のイ
ンキュベーションを行い固相化した。100μｌの希釈バ
ッファー（50mM Tris-HCl, 1mM MgCl₂, 0.15M NaCl,0.0
5%Tween20,0.02%NaN₃, 1%牛血清アルブミン（BSA)，pH
8.1)でブロッキングした後、限外濾過濃縮を行った再構
成ヒト抗HM1.24抗体、キメラ抗HM1.24抗体、及びＨ鎖ハ
イブリッド抗体を順次段階希釈して各穴に100 μｌずつ
加え室温で１時間のインキュベーションおよび洗浄の
後、アルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ヒトIgG 抗体
（DAKO社製）100 μｌを加えた。

【０１８４】室温にて１時間のインキュベーションおよ
び洗浄の後、基質バッファー（50mMNaHCO₃, 10mM MgCl₂
(pH9.8)) に溶解した１mg/ml の基質溶液（Sigma104, p
-ニトロフェニルリン酸、SIGMA 社製）100 μｌを加
え、405nm での吸光度をMICROPLATE READER Model 3550
(Bio-Rad社製）を用いて測定した。濃度測定の標品とし
てヒトIgG1κ（The Binding Site社製）を用いた。

【０１８５】5. 再構成ヒト抗HM1.24抗体安定産生ＣＨ
Ｏ細胞株の樹立 5-1. 再構成ヒト抗HM1.24抗体Ｈ鎖発現ベクターの作製 プラスミドHEF-RVHr-AHM-gγ1 を制限酵素PvuI及びBamH
I にて消化し、EF1 プロモーター及び再構成ヒト抗HM1.
24抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするDNA を含む約 2.8 kbpの
断片を 1.5％低融点アガロースゲルを用いて精製した。
次に、DHFR遺伝子およびヒトＨ鎖定常領域をコードする
遺伝子を含むヒトＨ鎖発現ベクターDHFR- ΔE-RVh- PM1
ｆ（国際特許出願公開番号ＷＯ92−19759)に使用されて
いる発現ベクターをPvuI及びBamHI にて消化することに
より調製した約６kbp の断片内に上記DNA 断片を挿入
し、再構成ヒト抗HM1.24抗体Ｈ鎖発現ベクターDHFR- Δ
E-HEF-RVHr-AHM-gγ1 を構築した。

【０１８６】5-2. CHO 細胞への遺伝子導入 再構成ヒト抗HM1.24抗体安定産生系を樹立するために、
PvuIで消化して直鎖状にした前記発現ベクターDHFR- Δ
E-HEF-RVHr-AHM-gγ1 及びHEF-RVLa-AHM-gκをエレクト
ロポレーション法により前述と同様（前記COS-7 細胞へ
のトランスフェクション）の条件下で同時にCHO 細胞DX
B-11に遺伝子導入した。

【０１８７】5-3. MTX による遺伝子増幅 遺伝子導入した CHO細胞は500 μg/mlのG418（GIBCO-BR
L 社製）及び10％のウシ胎児血清を添加したヌクレオシ
ド不含α−ＭＥＭ培養液中（GIBCO-BRL 社製）ではＬ鎖
及びＨ鎖発現ベクターが共に導入されたCHO 細胞のみが
増殖でき、それらを選別した。次に、上記培養液中に10
nM のMTX(Sigma 社製）を加え、増殖したクローンのう
ち再構成ヒト抗HM1.24抗体の産生量が高いものを選択し
た結果、約３μg/mlの再構成ヒト抗HM1.24抗体産生率を
示すクローン＃１を得、再構成ヒト抗HM1.24抗体産生細
胞株とした。

【０１８８】5-4. 再構成ヒト抗HM1.24抗体の作製 再構成ヒト抗HM1.24抗体の作製は以下の方法で行った。
上記再構成ヒト抗HM1.24抗体産生CHO 細胞を、培地とし
て10％のγ−グロブリンフリーウシ胎児血清（GIBCO-BR
L 社製）を含有する500 μg/mlのG418（GIBCO-BRL 社
製）を添加したヌクレオシド不含α−ＭＥＭ培養液（GI
BCO-BRL 社製）を用い、37℃、５％ＣＯ₂の条件下で10
日の培養をＣＯ₂ インキュベーターBNA120D （TABAI 社
製）を用いて行った。培養開始後８、10日目に培養液を
回収し、TS-9ローターを装着した遠心機RL-500SP（トミ
ー精工社製）を用いて2000rpm 、10分間の遠心分離を行
い培養液中の細胞破片を除去した後、0.45μm 径のメン
ブレンをもつボトルトップフィルター（FALCON社製）に
より濾過滅菌した。

【０１８９】この再構成ヒト抗HM1.24抗体産生CHO 細胞
培養液に等量のPBS(-)を加えた後、高速抗体精製装置Co
nSep LC100（MILLIPORE 社製）およびHyper D Protein
A カラム（日本ガイシ社製）を用い、付属の説明書に基
づき吸着緩衝液としてPBS(-)、溶出緩衝液として0.1M
クエン酸ナトリウム緩衝液（pH3 ）を用いて再構成ヒト
抗HM1.24抗体をアフィニティー精製した。溶出画分は直
ちに１M Tris-HCl（pH8.0 ）を添加してpH7.4 付近に調
整した後、遠心限外濃縮器Centriprep 10 （MILLIPORE
社製）を用いて濃縮およびPBS(-)への緩衝液置換を行
い、孔径0.22μｍのメンブレンフィルターMILLEX-GV
（MILLIPORE 社製）を用いて濾過滅菌し精製再構成ヒト
抗HM1.24抗体を得た。精製抗体の濃度は、280nm の吸光
度を測定し、１mg/ml を1.350Dとして算出した。

【０１９０】実施例１１. 再構成ヒト抗HM1.24 抗体
の活性測定 再構成ヒト抗HM1.24抗体は下記の抗原結合活性および結
合阻害活性にて評価を行った。 １．抗原結合活性および結合阻害活性の測定法 1-1. 抗原結合活性の測定 抗原結合活性の測定は、WISH細胞を用いたCell-ELISAで
行った。Cell-ELISAプレートは前記実施例７.1-2で記載
の通り作製した。

【０１９１】ブロッキングの後、COS-7 細胞の培養上清
を濃縮して得られた、またはCHO 細胞の培養上清より精
製された再構成ヒト抗HM1.24抗体を段階希釈して各穴に
100μl 加え、室温にて２時間インキュベーションおよ
び洗浄の後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトIgG 抗
体（DAKO社製）を加えた。室温にて１時間インキュベー
ションおよび洗浄の後、基質溶液を加えインキュベーシ
ョンの後、６N 硫酸50μl で反応を停止させ、MICROPLA
TE READER Model 3550（Bio-Rad 社製）を用いて490nm
での吸光度を測定した。

【０１９２】1-2. 結合阻害活性の測定 ビオチン標識マウス抗HM1.24抗体による結合阻害活性
は、WISH細胞を用いたCell-ELISAで行った。Cell-ELISA
プレートは前述の通り作製した。ブロッキングの後、
COS-7 細胞の培養上清を濃縮して得られた、またはCHO
細胞の培養上清より精製された再構成ヒト抗HM1.24抗体
を段階希釈して各穴に50μl 加え、同時に2 μg/mlのビ
オチン標識マウス抗HM1.24抗体50μl を添加し、室温に
て２時間インキュベーションおよび洗浄の後、ペルオキ
シダーゼ標識ストレプトアビジン（DAKO社製）を加え
た。室温にて１時間インキュベーションした後洗浄し、
基質溶液を加えインキュベーションの後、６N 硫酸50μ
l で反応を停止させ、MICROPLATE READER Model 3550
（Bio-Rad 社製）を用いて490nm での吸光度を測定し
た。

【０１９３】2. 再構成ヒト抗HM1.24抗体の評価 2-1. Ｌ鎖 再構成ヒト抗HM1.24抗体のＬ鎖バージョンａの評価は、
前記の抗原結合活性の測定により行った。図８に示す通
り、Ｌ鎖バージョンａはキメラＨ鎖と組合わせて発現さ
せると、キメラ抗HM1.24抗体と同程度の抗原結合活性を
示した。しかし、さらなる活性の上昇またはH 鎖との相
性を考慮し、新たにＬ鎖バージョンｂを作製した。そし
て、H 鎖のバージョンａ、ｂ、ｆ又はｈと組み合わせた
ときの抗原結合活性および結合阻害活性の測定を行いL
鎖バージョンａ、ｂを共に評価した。図９、１０、１１
及び１２に示すとおり、H 鎖ａ、ｂ、ｆ及びｈの全ての
バージョンで、Ｌ鎖バージョンａがバージョンｂに比べ
て両活性とも強かった。従って、再構成ヒト抗HM1.24抗
体のＬ鎖バージョンａを以下の実験に用いた。

【０１９４】2-2. Ｈ鎖バージョンａ- ｅ 再構成ヒト抗HM1.24抗体のＨ鎖バージョンａ- ｅの評価
はＬ鎖バージョンａとの組合せで、前記の抗原結合活性
および結合阻害活性の測定により行った。その結果、図
１１、１３、１４及び１５に示す通り、全てのバージョ
ンにおいてキメラ抗HM1.24抗体と比較して両活性とも弱
く、さらなるアミノ酸の変換が必要であると考えられ
た。

【０１９５】2-3. Ｈ鎖ハイブリッド抗体 Ｈ鎖ハイブリッド抗体の評価は前記の抗原結合活性の測
定により行った。その結果、図１６に示す通り、抗原結
合活性はヒト- マウスハイブリッド抗HM1.24抗体ではキ
メラ抗HM1.24抗体と同等の活性を有している一方、マウ
ス・ヒトハイブリッド抗HM1.24抗体はキメラ抗HM1.24抗
体と比較してその活性が弱かった。従って、マウス抗HM
1.24抗体、あるいはキメラ抗HM1.24抗体と同等の抗原結
合活性を有する再構成ヒトHM1.24抗体を作成するために
は、H 鎖V 領域のうち、FR3 あるいはFR4 に含まれるア
ミノ酸を変換する必要があることが示された。

【０１９６】2-4. Ｈ鎖バージョン ｆ- ｒ 再構成ヒト抗HM1.24抗体のＨ鎖バージョンｆの評価は前
記の抗原結合活性測定により行った。その結果、図１７
に示す通り、抗原結合活性はキメラ抗HM1.24抗体と比較
すると劣るが、上記バージョンａ- ｃと比較して活性が
向上したことから、本バージョンで新たに変換した67、
69、75及び78番目の４つのアミノ酸のうちいずれかが再
構成ヒト抗体の活性に関与していることが示唆された。
再構成ヒト抗HM1.24抗体のＨ鎖バージョンｇの評価は前
記の抗原結合活性、および結合阻害活性の測定により行
った。その結果、図１８及び１９に示す通り、本バージ
ョンは上記バージョンａと同程度の活性しか示さなかっ
たことから、上記Ｈ鎖ヒト・マウスハイブリッド抗体の
評価で示した通り、本バージョンで変換した40番目のア
ミノ酸は再構成ヒト抗体の活性の向上には寄与していな
いことが示された。

【０１９７】再構成ヒト抗HM1.24抗体のＨ鎖バージョン
ｈ- ｊの評価は前記の抗原結合活性、および結合阻害活
性の測定により行った。その結果、図２０、２１、２
２、２３に示す通り、全てのversion で両活性ともキメ
ラ抗HM1.24抗体と比較すると弱く、上記バージョンｆと
同程度であることから、バージョンｆで新たに変換した
４アミノ酸のうち、67及び69番目のアミノ酸は再構成ヒ
ト抗体の活性の向上に寄与していないことが示唆され
た。再構成ヒト抗HM1.24抗体のＨ鎖バージョンｋ- ｐの
評価は前記の抗原結合活性、および結合阻害活性の測定
により行った。その結果、図２４、２５、２６及び２７
に示す通り、全てのバージョンで両活性ともキメラ抗HM
1.24抗体と比較すると弱く、上記バージョンｈと同程度
であることから、これら６つのバージョンで新たに変換
した80番目以降のアミノ酸は再構成ヒト抗体の活性の向
上に寄与していないことが示唆された。

【０１９８】再構成ヒト抗HM1.24抗体のＨ鎖バージョン
ｑの評価は前記の抗原結合活性、および結合阻害活性の
測定により行った。その結果、図２５及び２７に示す通
り、本バージョンは両活性とも上記バージョンｈあるい
はバージョンｐと比較すると弱く、上記バージョンａと
同程度の活性しか持たなかったことから、78番目のアミ
ノ酸の置換が再構成ヒト抗体の活性の向上に必須である
ことが示唆された。再構成ヒト抗HM1.24抗体のＨ鎖バー
ジョンｒの評価は前記の測定により行った。その結果、
図１５及び２８に示す通り、バージョンｒはキメラ抗HM
1.24抗体と同程度の抗原結合活性および結合阻害活性を
有することが示された。

【０１９９】以上の結果より、再構成ヒト抗HM1.24抗体
がマウス抗HM1.24抗体あるいはキメラ抗HM1.24抗体と同
程度の抗原結合能を持つための、H 鎖における必要で最
小の変換は30、71及び78番目、さらには73番目のアミノ
酸であることが示された。なお、再構成ヒト抗HM1.24抗
体Ｈ鎖バージョンａ- ｒについて、その抗原結合活性、
および結合阻害活性を表６にまとめた。

【０２００】

【表６】

【０２０１】2.5. Ｈ鎖バージョンｓ 再構成ヒト抗HM1.24抗体のＨ鎖バージョンｓの評価は、
Ｌ鎖バージョンａとの組合せで前記の抗原結合活性、お
よび結合阻害活性の測定により行った。その結果、図２
９、３０に示すようにバージョンｓはバージョンｒと同
程度の抗原結合活性および結合阻害活性を有することが
示された。また、上記のごとく、本発明の再構成ヒト抗
HM1.24抗体はFR中の１個又は複数個のアミノ酸残基を他
のアミノ酸に置換してもなお、抗原に結合する能力を維
持している。したがって、本発明は、その本来の性質を
維持している限り、Ｈ鎖又はＬ鎖のＶ領域において、１
個又は複数個のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換
されている再構成ヒト抗HM1.24抗体をも包含する。

【０２０２】3. 精製再構成ヒト抗HM1.24抗体の評価 前記精製再構成ヒト抗HM1.24抗体は前記の抗原結合活性
および結合阻害活性にて評価を行った。その結果、図３
１及び３２に示す通り再構成ヒト抗HM1.24抗体は、キメ
ラ抗HM1.24抗体と同程度の抗原結合活性および結合阻害
活性を有することが示された。このことより、再構成ヒ
ト抗HM1.24抗体はマウス抗HM1.24抗体と同じ抗原結合能
を持つことが示された。

【０２０３】実施例１２. キメラ抗HM1.24抗体のヒト
骨髄腫マウスモデルに対する抗腫瘍効果 1. 投与抗体の調製 1-1. キメラ抗HM1.24抗体の調製 前記実施例６で得られた精製キメラ抗HM1.24抗体を、遠
心限外濃縮器Centriprep 10 （MILLIPORE 社製）で濃縮
およびPBS(-)への緩衝液置換を行い、孔径0.22μｍのメ
ンブレンフィルターMILLEX-GV （MILLIPORE 社製）を用
いて濾過滅菌した。これを濾過滅菌したPBS(-)を用いて
200 μg/mlに調製し、以下の実験に用いた。抗体濃度
は、280nm の吸光度を測定し、１mg/ml を1.350Dとして
算出した。

【０２０４】1-2. コントロールヒトIgG1の精製 キメラ抗HM1.24抗体のコントロールとして用いるヒトIg
G1は以下のように精製した。Hu IgG1 Kappa Purified
（BINDING SITE社製）に等量のPBS(-)を加えた後、高速
抗体精製装置ConSep LC100（MILLIPORE 社製）およびHy
per D Protein Aカラム（日本ガイシ社製）を用い、付
属の説明書に基づき吸着緩衝液としてPBS(-)、溶出緩衝
液として0.1M クエン酸ナトリウム緩衝液（pH3 ）を用
いてアフィニティー精製した。溶出画分は直ちに１M Tr
is-HCl（pH8.0 ）を添加してpH7.4付近に調整した後、
遠心限外濃縮器Centriprep 10 （MILLIPORE 社製）を用
いて濃縮およびPBS(-)への緩衝液置換を行い、孔径0.22
μｍのメンブレンフィルターMILLEX-GV （MILLIPORE 社
製）を用いて濾過滅菌した。これを濾過滅菌したPBS(-)
を用いて200 μg/mlに調製し、以下の実験に用いた。抗
体の濃度は、280nm の吸光度を測定し、１mg/ml を1.35
0Dとして算出した。

【０２０５】2. マウス血清ヒトIgG 定量法 マウスの血清中に含まれるヒトIgG の定量は以下のELIS
A で行った。0.1M重炭酸緩衝液（pH9.6 ）で1 μg/mlに
希釈したヤギ抗ヒトIgG （TAGO社製）100 μlを96穴プ
レート（Nunc社製）に加え、４℃で一晩インキュベーシ
ョンし、抗体を固相化した。ブロッキングの後、段階希
釈したマウス血清あるいは標品としてヒトIgG （CAPPEL
社製）100 μl を添加し、室温にて１時間インキュベー
ションした。洗浄後、2000倍希釈したアルカリフォスフ
ァターゼ標識抗ヒトIgG （CAPPEL社製）100 μl を加
え、室温にて１時間インキュベートした。洗浄後、基質
溶液を加えインキュベーションの後、MICROPLATE READE
R Model 3550（Bio-Rad 社製）を用いて405nm での吸光
度を測定した。

【０２０６】3. キメラ抗HM1.24抗体のヒト骨髄腫移植
マウスに対する抗腫瘍効果 3-1. ヒト骨髄腫移植マウスの作製 ヒト骨髄腫移植マウスは以下のように作製した。SCIDマ
ウス（日本クレア）を用いてin vivo 継代したKPMM2 細
胞を、10％ウシ胎児血清（GIBCO-BRL 社製）を含むRPMI
1640培地（GIBCO-BRL 社製）で3 x 10⁷ 個 / ml になる
ように調製した。あらかじめ前日抗アシアロGM1 （和光
純薬社製）100 μl を腹腔内投与したSCIDマウス（オ
ス、８週令）（日本クレア）に上記KPMM2 細胞懸濁液 2
00μl を尾静脈より注入した。

【０２０７】3-2. 抗体投与 上記ヒト骨髄腫移植マウスよりKPMM2 細胞移植後12日目
に血清を採取し、上記2 のELISA を用いて、血清中のヒ
トIgG を定量した。血清中のヒトIgG の上昇によりKPMM
2 細胞の骨髄生着を確認した。これらマウスに対し、KP
MM2 細胞移植後14、21、28日目に上記１で調製した抗体
をそれぞれ100 μl 腹腔内投与した。 3-3. キメラ抗HM1.24抗体のヒト骨髄腫移植マウスに対
する抗腫瘍効果の評価 キメラ抗HM1.24抗体の抗腫瘍効果については、マウスの
生存期間で評価した。図３３に示す通り、キメラ抗HM1.
24抗体を投与したマウスではコントロールヒトIgG1を投
与したマウスと比較して、生存期間の延長が認められ
た。従って、キメラ抗HM1.24抗体がヒト骨髄腫移植マウ
スに対して抗腫瘍効果を有することが示された。

【０２０８】実施例13． 再構成ヒト抗HM1.24抗体のAD
CC活性の測定 ADCC (Antibody-dependent Cellular Cytotoxicity) 活
性の測定はCurrent protocols in Immunology, Chapter
7. Immunologic studies in humans, Editor,John E,
Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., 1993の方
法に従った。 1. エフェクター細胞の調製 健常人の末梢血より比重遠心法で単核球を分離した。す
なわち健常人の末梢血に等量のPBS(-)を加え、Ficoll-P
aque PLUS (Pharmacia社製）に積層し、 400ｇで40分間
遠心した。単核球層を分取し、10％ウシ胎児血清(GIBCO
BRL社製）を含むRPMI 1640 (GIBCO BRL社製）で４回洗
浄後、同培養液で細胞数が5 x 10⁶/mlになるように調製
した。

【０２０９】SCIDマウス（日本クレア）の骨髄細胞より
LAK (Limphokine Activated KillerCell)を誘導した。
すなわちマウスの大腿骨より骨髄細胞を分離し10％ウシ
胎児血清(GIBCO BRL社製）を含むRPMI 1640 (GIBCO BRL
社製）で２回洗浄後、同培養液で細胞数が2 x 10⁵/mlに
なるように調製した。50ng/ml のリコンビナントヒトIL
-2(R & D SYSTEMS社製）および10ng/ml のリコンビナン
トマウスGM-CSF(R & DSYSTEMS社製）とともに、炭酸ガ
ス培養器(TABAI社製）内で７日間培養した。同培養液で
細胞数が2 x 10⁶/mlになるように調製した。

【０２１０】2. 標的細胞の調製 ヒト骨髄腫細胞株KPMM2(特開平７−236475）あるいは形
質細胞腫由来ARH-77 (ATCC CRL-1621)を0.1mCiの⁵¹Cr-s
odium chromate(ICN社製）とともに10％ウシ胎児血清(G
IBCO BRL社製）を含むRPMI 1640 (GIBCO BRL社製）中で
37℃にて60分インキュベートすることにより放射性標識
した。放射性標識の後、細胞を同培養液で３回洗浄し、
2 x 10⁵/mlに調製した。

【０２１１】3. ADCCアッセイ 96ウエルＵ底プレート（ベクトンディッキンソン社製）
に放射性標識した2 x10⁵/mlの標的細胞を50μl と、再
構成ヒト抗HM1.24抗体、マウス抗HM1.24抗体、コントロ
ールヒトIgG1（The Binding Site Limited社製）、ある
いはコントロールマウスIgG2ａ（UPC10 、CAPPEL社製）
50μl を加え、４℃で15分間反応させた。その後、エフ
ェクター細胞100 μl を、炭酸ガス培養器内で４時間培
養した。その際、エフェクター細胞（Ｅ）と標的細胞
（Ｔ）の比（Ｅ：Ｔ）を 0:1、3.2:1 、8:1 、20:1又は
50:1とした。

【０２１２】100 μl の上清をとり、ガンマカウンター
(ARC-300 、Aloka 社製）で培養上清中に遊離された放
射活性を測定した。最大遊離放射能測定用には１％NP-4
0 （半井社製）を用いた。細胞障害活性（％）は（Ａ−
Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）X 100 で計算した。なおＡは抗体存在
下において遊離された放射活性(cpm）、ＢはNP-40 によ
り遊離された放射活性(cpm）およびＣは抗体を含まず培
養液のみで遊離された放射活性(cpm）を示す。

【０２１３】図34にエフェクター細胞として健常人末梢
血より調製した細胞を用い、標的細胞にKPMM2 を用いた
場合の結果を示す。図35にエフェクター細胞として健常
人末梢血より調製した細胞を用い、標的細胞にARH77 を
用いた場合の結果を示す。コントロールヒトIgG1と比較
して再構成ヒト抗HM1.24抗体を添加した場合、抗体濃度
の上昇に従い細胞障害活性が上昇したことから、この再
構成ヒト抗HM1.24抗体がADCC活性を有することが示され
た。

【０２１４】また、再構成ヒト抗HM1.24抗体を添加した
場合、マウス抗HM1.24抗体を添加した場合と比べて明ら
かに細胞障害活性が上昇したことから、この再構成ヒト
抗HM1.24抗体がマウス抗HM1.24抗体よりも高いADCC活性
を有することが示された。さらに、標的細胞がKPMM2 の
場合、 0.1μg/ml以上の濃度で再構成ヒト抗HM1.24抗体
を添加した場合、細胞障害活性が変わらないことから、
0.1μg/ml以上の濃度で十分なADCC活性を有することが
示された。標的細胞がARH77 の場合、１μg/ml以上の濃
度で再構成ヒト抗HM1.24抗体を添加した場合、細胞障害
活性が変わらないことから、１μg/ml以上の濃度で十分
なADCC活性を有することが示された。

【０２１５】図36にエフェクター細胞としてSCIDマウス
骨髄より調製した細胞を用いた場合の結果を示す。コン
トロールヒトIgG1と比較して再構成ヒト抗HM1.24抗体を
添加した場合、抗体濃度の上昇に従い細胞障害活性が上
昇したことから、この再構成ヒト抗HM1.24抗体がADCC活
性を有することが示された。また、 0.1μg/ml以上の濃
度で再構成ヒト抗HM1.24抗体を添加した場合、細胞障害
活性が変わらないことから、 0.1μg/ml以上の濃度で十
分なADCC活性を有することが示された。これらの結果か
ら再構成ヒト抗HM1.24抗体は、エフェクター細胞として
ヒト由来、あるいはマウス由来の細胞を用いた場合でも
ADCC活性を有することが示された。

【０２１６】実施例14． 再構成ヒト抗HM1.24抗体のヒ
ト骨髄腫マウスモデルに対する抗腫瘍効果 1. 投与抗体の調製 プラスミドHEF-RVLa-AHM-gκとプラスミドHEF-RVHr-AHM
-gγ１を細胞に導入して得られた再構成ヒト抗HM1.24抗
体については、濾過滅菌したPBS(-)を用いて40、200 、
1000μ/ml に、また、実施例12.1-2で得たコントロール
ヒトIgG1については、濾過滅菌したPBS(-)を用いて 200
μg/mlに調製し、投与抗体とした。 2. 再構成ヒト抗HM1.24抗体のヒト骨髄腫移植マウスに
対する抗腫瘍効果 2-1. ヒト骨髄腫移植マウスの作製 ヒト骨髄腫移植マウスは、実施例12.3-1に従い作製し
た。マウスは、SCIDマウス（５週令)(日本クレア）を用
いた。

【０２１７】2-2. 抗体投与 上記2-1 で作製したヒト骨髄腫移植マウスよりKPMM2 細
胞移植９日目に血清を採取し、実施例12.2のELISA を用
いて、血清中のヒトIgG を定量した。血清中のヒトIgG
の上昇によりKPMM2 細胞の骨髄生着を確認した。これら
マウスに対し、KPMM2 細胞移植後10日目に上記１で調製
した抗体をそれぞれ 100μl 静脈内投与した。

【０２１８】2-3. 再構成ヒト抗HM1.24抗体のヒト骨髄
腫移植マウスに対する抗腫瘍効果の評価 再構成ヒト抗HM1.24抗体の抗腫瘍効果については、マウ
スの血清ヒトIgG 量の変化、および生存期間で評価し
た。マウスの血清ヒトIgG 量の変化については、KPMM2
細胞移植35日目に血清を採取し、実施例12.2のELISA を
用いてヒトIgG を定量した。その結果、図37に示すよう
にコントロールヒトIgG1投与群では、KPMM2 細胞移植35
日目の血清ヒトIgG量は移植９日目（抗体投与前日）と
比較して約1000倍程度まで増加しているのに対し、再構
成ヒト抗HM1.24抗体投与群ではいずれの投与量でも、移
植９日目とほぼ同じかあるいはそれ以下であり、再構成
ヒト抗HM1.24抗体がKPMM2 細胞の増殖を抑制しているこ
とが示された。

【０２１９】一方、生存期間についても図38に示す通
り、再構成ヒト抗HM1.24抗体投与群ではコントロールヒ
トIgG1投与群と比較して、生存期間の延長が認められ
た。以上より、再構成ヒト抗HM1.24抗体投与がヒト骨髄
腫移植マウスに対して抗腫瘍効果を有することが示され
た。

【０２２０】実施例15． ヒト骨髄腫マウスモデルにお
ける、再構成ヒト抗HM1.24抗体と既存薬剤メルファラン
との抗腫瘍効果の比較 1. 投与薬剤の調製 1-1. 投与抗体の調製 プラスミドHEF-RVLa-AHM-gκとプラスミドHEF-RVHr-AHM
-gγ１を細胞に導入して得られた再構成ヒト抗HM1.24抗
体については、濾過滅菌したPBS(-)を用いて40、200 μ
g/mlに、また、実施例12.1-2で得たコントロールヒトIg
G1については、濾過滅菌したPBS(-)を用いて 200μg/ml
に調製し、投与抗体とした。 1-2. メルファランの調製 骨髄腫に対する既存薬剤であるメルファラン(SIGMA製）
は、 0.2％カルボメチルセルロース(CMC)(ダイセル化学
工業製）を用いて、0.1mg/mlになるように調製した。

【０２２１】2. ヒト骨髄腫移植マウスに対する再構成
ヒト抗HM1.24抗体およびメルファランの抗腫瘍効果 2-1. ヒト骨髄腫移植マウスの作製 ヒト骨髄腫移植マウスは、実施例14.2-1に従い作製し
た。 2-2. 薬剤投与 上記2-1 で作製したヒト骨髄腫移植マウスよりKPMM2 細
胞移植９日目に血清を採取し、実施例12.2のELISA を用
いて、血清中のヒトIgG を定量した。血清中のヒトIgG
の上昇によりKPMM2 細胞の骨髄生着を確認した。これら
マウスに対し、KPMM2 細胞移植後10日目に上記1-1 で調
製した抗体をそれぞれ 100μl 静脈内投与した。さら
に、移植後10日目から１日１回、５日間 0.2％ CMC溶液
200μl を経口投与した。一方、メルファラン投与群に
ついては、上記1-2 で調製したメルファラン溶液をKPMM
2 細胞移植後10日目から１日１回、５日間体重10g あた
り 100μl(メルファランとして1mg/kg) を経口投与し
た。

【０２２２】2-3. 再構成ヒト抗HM1.24抗体のヒト骨髄
腫移植マウスに対する抗腫瘍効果の評価 再構成ヒト抗HM1.24抗体の抗腫瘍効果については、マウ
スの血清ヒトIgG 量の変化、および生存期間で評価し
た。マウスの血清ヒトIgG 量の変化については、KPMM2
細胞移植35日目に血清を採取し、実施例12.2のELISA を
用いてヒトIgG を定量した。その結果、図39に示すよう
にコントロールヒトIgG1投与群では、KPMM2 細胞移植35
日目の血清ヒトIgG量は移植９日目（抗体投与前日）と
比較して1000倍程度増加し、マウス中でKPMM2 細胞が増
殖しているものと思われた。

【０２２３】また、既存薬であるメルファランを投与し
た群でも、コントロールヒトIgG1投与群ほどではないも
のの、血清ヒトIgG 量は薬剤投与前より増加しており、
メルファランの投与ではマウス中のKPMM2 細胞の増殖を
完全には抑制できないと思われた。一方、再構成ヒト抗
HM1.24抗体投与群ではいずれの投与量でも、移植９日目
より血清ヒトIgG 量が減少しており、再構成ヒト抗HM1.
24抗体がKPMM2 細胞の増殖を抑制していることが示され
た。

【０２２４】一方、生存期間についても図40に示す通
り、再構成ヒト抗HM1.24抗体投与群ではコントロールヒ
トIgG1投与群、あるいはメルファラン投与群と比較し
て、生存期間の延長が認められた。以上より、再構成ヒ
ト抗HM1.24抗体投与がヒト骨髄腫移植マウスに対して抗
腫瘍効果を有すること、さらに本抗体の抗腫瘍効果は既
存薬剤のメルファランよりも強いことが示された。以上
より、ヒト由来のエフェクター細胞を用いた場合、マウ
ス抗HM1.24抗体は殆どヒト骨髄腫細胞に対して、細胞障
害活性を示さなかったのに比して、再構成ヒト抗HM1.24
抗体およびキメラ抗HM1.24抗体は強い細胞障害活性を示
した。この事実は抗体をヒト型化することの重要性を示
し、再構成ヒト抗HM1.24抗体のヒトでの有用性を期待さ
せる。

【０２２５】ヒト骨髄腫移植SCIDマウスにおいて、再構
成ヒト抗HM1.24抗体が非常に強い抗腫瘍効果を示した
が、ヒトにおいては当然エフェクターはヒト由来であ
り、リンパ球も正常に存在していることから、再構成ヒ
ト抗HM1.24抗体のさらに強い抗腫瘍効果が期待できる。
骨髄腫モデルにおいて、再構成ヒト抗HM1.24抗体は既存
の骨髄腫治療薬に比べ強い抗腫瘍効果を示したことよ
り、再構成ヒト抗HM1.24抗体が画期的な骨髄腫治療薬に
なることが期待される。

【０２２６】参考例１． マウス抗HM1.24モノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマの調製 Goto, T. et al., Blood (1994) 84, 1992-1930 に記載
の方法にて、マウス抗HM1.24モノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマを調製した。ヒト多発性骨髄腫患者の骨髄
に由来するエプスタインーバーウィルスー核抗原（EBN
A）ー陰性形質細胞株KPC-32（1x10⁷ 個）（Goto, T. et
al., Jpn. J. Clin. Hematol. (11991) 32, 1400）をB
ALB/Cマウス（チャールスリバー製）の腹腔内に6 週間
おきに2 回注射した。

【０２２７】このマウスを屠殺する3 日前にマウスの抗
体産生価をさらに上昇させるために、1.5 x 10⁶ 個のKP
C-32細胞をマウスの脾臓内に注射した（Goto, T. et a
l., Tokushima J. Exp. Med. (1990) 37, 89 ）。マウ
スを屠殺した後に脾臓を摘出し、Groth, de St. & Schr
eideggerの方法（Cancer Research (1981) 41, 3465 ）
に従い摘出した脾臓細胞とミエローマ細胞SP2/0 を細胞
融合に付した。

【０２２８】KPC-32細胞をコートしたプレートを使用す
るELISA （Posner, M. R. et al.,J. Immunol. Methods
(1982) 48, 23 ）によりハイブリドーマ培養上清中の
抗体のスクリーニングを行った。5 x 10⁴ 個のKPC-32細
胞を50 ml のPBS に懸濁し、96ウエルプレート（U 底
型、Corning 、Iwaki 製）に分注した。1%ウシ血清アル
ブミン（BSA ）を含むPBS でブロックした後、ハイブリ
ドーマ培養上清を加え4℃にて2 時間インキュベートし
た。次いで、4 ℃にて1 時間ペルオキシダーゼ標識抗マ
ウスIgG ヤギ抗体（Zymed 製）を反応させ、一度洗浄し
て、室温にて30分間o-フェニレンジアミン基質溶液（Su
mitomo Bakelite 製）を反応させた。

【０２２９】2N硫酸で反応を停止させ、ELISA reader
（Bio-Rad 製）で492nm における吸光度を測定した。ヒ
ト免疫グロブリンに対する抗体を産生するハイブリドー
マを除去するために、陽性ハイブリドーマ培養上清をヒ
ト血清にあらかじめ吸着させ、他の細胞下部に対する反
応性をELISA にてスクリーニングした。陽性のハイブリ
ドーマを選択し、種々の細胞株およびヒトの標本に対す
る反応性をフローサイトメトリーで調べた。最後に選択
されたハイブリドーマクローンを二度クローン化し、こ
れをプリスタン処理したBALB/Cマウスの腹腔に注射し
て、腹水を取得した。

【０２３０】モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム
による沈澱とプロテインA アフィニティクロマトグラフ
ィーキット（Ampure PA 、Amersham製）によりマウス腹
水より精製した。精製抗体は、Quick Tag FITC結合キッ
ト（ベーリンガーマンハイム製）を使用することにより
フルオロセイニチオシアネート（FITC）と結合させた。
その結果、30のハイブリドーマクローンが産生するモノ
クローナル抗体がKPC-32およびRPMI 8226 細胞と反応し
た。クローニングの後、これらのハイブリドーマの培養
上清を他の細胞株と末梢血由来単核球との反応性を調べ
た。

【０２３１】このうち、3 つのクローンが形質細胞に特
異的に反応するモノクローナル抗体であった。これらの
3 つのクローンのうち、最もフローサイトメトリー分析
に有用であり、かつRPMI 8226 細胞に対する補体依存性
細胞障害活性を有するハイブリドーマクローンを選択
し、HM1.24と名付けた。このハイブリドーマが産生する
モノクローナル抗体のサブクラスを、サブクラス特異的
抗マウスウサギ抗体（Zymed 製）を用いたELISA にて決
定した。抗HM1.24抗体は、IgG2a κのサブクラスを有し
ていた。抗HM1.24抗体を産生するハイブリドーマHM1.24
は、工業技術院生命工学工業研究所（茨城県つくば市東
１丁目１番３号）に、平成７年９月14日にFERM BP-5233
としてブタペスト条約に基づき国際寄託された。

【０２３２】参考例２． HM1.24抗原ポリペプチドをコ
ードするcDNAのクローニング 1. cDNAライブラリーの作製 １）全RNA の調製 マウスモノクローナル抗体HM1.24が特異的に認識する抗
原ポリペプチドであるHM1.24抗原をコードするcDNAを以
下のように単離した。ヒト多発性骨髄腫細胞株KPMM2 か
ら、全RNA をChirgwinら（Biochcmistry, 18, 5294 (19
79))の方法に従って調製した。すなわち、2.2 x 10⁸ 個
のKPMM2 を20mlの4Mグアニジンチオシアネート（ナカラ
イテスク製）中で完全にホモジナイズさせた。

【０２３３】ホモジネートを遠心管中の5.3M塩化セシウ
ム溶液層状に重層し、次にこれをBeckman SW40ローター
中で31,000rpm にて20℃で24時間遠心分離することによ
りRNA を沈殿させた。RNA 沈殿物を70％エタノールによ
り洗浄し、そして1mM EDTA及び 0.5％ SDSを含有する10
mM Tris-HCl (pH 7.4) 300μl 中に溶解し、それにPron
ase(Boehringer製）を0.5mg/mlとなるように添加した
後、37℃にて30分間インキュベートした。混合物をフェ
ノール及びクロロホルムで抽出し、RNA をエタノールで
沈殿させた。次に、RNA 沈殿物を1mM EDTAを含有する10
mM Tris-HCl (pH7.4) 200μl に溶解した。

【０２３４】２）poly(A) ＋RNA の調製 前記のようにして調製した全RNA の約 500μg を材料と
してFast Track 2.0mRNA Isolation Kit(Invitrogen
製）を用いてキット添付の処方に従ってpoly(A)＋RNA
を精製した。 ３）cDNAライブラリーの構築 上記poly(A) ＋RNA 10μg を材料としてcDNA合成キット
TimeSaver cDNA Synthesis Kit(Pharmacia製）を用いて
キット添付の処方に従って二本鎖cDNAを合成し、更にDi
rectional Cloning Toolbox (Pharmacia製）を用いてキ
ット付属のEcoRI アダプターをキット添付の処方に従っ
て連結した。EcoRI アダプターのカイネーション及び制
限酵素NotI処理はキット添付の処方に従って行った。更
に、約500bp 以上の大きさのアダプター付加二本鎖cDNA
を 1.5％低融点アガロースゲル(Sigma製）を用いて分
離、精製し、アダプター付加二本鎖cDNA約40μl を得
た。

【０２３５】このようにして作製したアダプター付加二
本鎖cDNAを、あらかじめ制限酵素EcoRI 、NotI及びアル
カリフォスファターゼ（宝酒造製）処理したpCOS1 ベク
ター（特願平８−255196）とT4 DNAリガーゼ(GIBCO-BRL
製）を用いて連結し、cDNAライブラリーを構築した。構
築したcDNAライブラリーは、大腸菌細胞株DH5 α(GIBCO
-BRL製）に形質導入され、全体のサイズは約2.5 x 10⁶
個の独立したクローンであると推定された。

【０２３６】2. 直接発現法によるクローニング １）COS-7 細胞へのトランスフェクション 上記の形質導入した大腸菌約5 x 10⁵ クローンを50μg/
mlのアンピシリンを含む2-YT培地（Molecular Cloning
: A Laboratory Mannual. Sambrookら、Cold Spring H
arbor Laboratory Press (1989)) にて培養することに
よりcDNAの増幅を行い、アルカリ法（Molecular Clonin
g : A Laboratory Mannual. Sambrookら、Cold Spring
Harbor Laboratory Press (1989)) により大腸菌からプ
ラスミドDNA を回収した。得られたプラスミドDNA はGe
ne Pulser 装置(Bio-Rad製）を用いてエレクトロポレー
ション法によりCOS-7 細胞にトランスフェクションし
た。

【０２３７】すなわち、精製したプラスミドDNA 10μg
を1 x 10⁷ 細胞/ml でPBS 中に懸濁したCOS-7 細胞液0.
8ml に加え、1500V 、25μFDの容量にてパルスを与え
た。室温にて10分間の回復期間の後、エレクトロポレー
ション処理された細胞は、10％牛胎児血清(GIBCO-BRL
製）を含むDMEM培養液(GIBCO-BRL製）にて、37℃、５％
CO₂の条件下で３日間培養した。

【０２３８】２）パンニングデイッシュの調製 マウス抗HM1.24抗体をコーティングしたパンニングデイ
ッシュを、B.Seedら(Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 84, 33
65-3369 (1987)) の方法に従って調製した。すなわち、
マウス抗HM1.24抗体を10μg/mlになるように50mM Tris-
HCl (pH 9.5)に加えた。このようにして調製した抗体溶
液3ml を直径60mmの細胞培養皿に加え、室温にて２時間
インキュベートした。0.15M NaCl溶液にて３回洗浄した
後、５％牛胎児血清、1mM EDTA、0.02％ NaN₃ を含むPB
S を加え、ブロッキングした後、下記クローニングに用
いた。

【０２３９】３）cDNAライブラリーのクローニング 前述のようにトランスフェクトしたCOS-7 細胞は、5mM
EDTAを含むPBS にて剥がし、５％牛胎児血清を含むPBS
で一回洗浄した後、約1 x 10⁶ 細胞/ml となるように５
％牛胎児血清及び0.02％ NaN₃ を含むPBS に懸濁し、上
記のように調製したパンニングデイシュに加え、室温に
て約２時間インキュベートした。５％牛胎児血清及び0.
02％ NaN₃ を含むPBS で３度緩やかに洗浄した後、 0.6
％ SDS及び10mM EDTA を含む溶液を用いてパンニングデ
イシュに結合した細胞からプラスミドDNA の回収を行っ
た。

【０２４０】回収したプラスミドDNA を再び大腸菌DH5
αに形質導入し、前述のようにプラスミドDNA を増幅
後、アルカリ法にて回収した。回収したプラスミドDNA
をCOS-7 細胞にエレクトロポレーション法によりトラン
スフェクトして前述と同様に結合した細胞よりプラスミ
ドDNA の回収を行った。同様の操作を更に１回繰り返
し、回収したプラスミドDNA を制限酵素EcoRI およびNo
tIで消化した結果、約0.9kbpのサイズのインサートの濃
縮が確認された。さらに、回収したプラスミドDNAの一
部を形質導入した大腸菌を50μg/mlのアンピシリンを含
む2-YTアガープレートに接種し、一晩培養後、単一のコ
ロニーよりプラスミドDNA を回収した。制限酵素EcoRI
およびNotIにて消化し、インサートのサイズが約0.9kbp
を示すクローンp3.19 を得た。

【０２４１】本クローンについては、PRISM, Dye Termi
nater Cycle Sequencingキット（Perkin Elmer製）を用
いて、キット添付の処方に従い反応を行い、ABI 373A D
NA Sequencer (Perkin Elmer製）にて塩基配列の決定を
行った。このアミノ酸配列および塩基配列を配列番号10
3 に示す。配列番号：103 に示すアミノ酸配列を有する
ポリペプチドをコードするcDNAはpUC19 ベクターのXbaI
切断部位の間に挿入されて、プラスミドpRS38-pUC19 と
して調製されている。このプラスミドpRS38-pUC19 を含
む大腸菌(E. coli) は平成５年（1993年）10月５日付で
工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東
１丁目１番３号）にEscherichia coli DH5α (pRS38-pU
C19)として、受託番号FERM BP-4434としてブダペスト条
約に基づき国際寄託されている（特開平７−196694参
照）。

【０２４２】

【発明の効果】キメラ抗HM1.24抗体はマウス抗HM1.24抗
体の可変領域とヒト抗体定常領域からなり、再構成抗HM
1.24抗体はマウス抗HM1.24抗体の相捕性決定領域とヒト
抗体フレームワーク領域およびヒト抗体定常領域からな
ることから、ヒトにおける抗原性が低く、それ故に医薬
組成物、特に骨髄腫治療剤として期待される。

【０２４３】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３９４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATG GGC TTC AAG ATG GAG TCA CAT TTT CTG GTC TTT GTA TTC GTG TTT 48 Met Gly Phe Lys Met Glu Ser His Phe Leu Val Phe Val Phe Val Phe -20 -15 -10 CTC TGG TTG TCT GGT GTT GAC GGA GAC ATT GTG ATG ACC CAG TCT CAC 96 Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His -5 -1 1 5 AAA TTC ATG TCC ACA TCA GTA GGA GAC AGG GTC AGC ATC ACC TGC AAG 144 Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys 10 15 20 GCC AGT CAG GAT GTG AAT ACT GCT GTA GCC TGG TAT CAA CAA AAA CCA 192 Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 25 30 35 40 GGA CAA TCG CCT AAA CTA CTG ATT TAC TCG GCA TCC AAC CGG TAC ACT 240 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 45 50 55 GGA GTC CCT GAT CGC ATC ACT GGC AGT GGA TCT GGG ACG GAT TTC ACT 288 Gly Val Pro Asp Arg Ile Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 60 65 70 TTC ACC ATC AGC AGT GTG CAG GCG GAA GAC CTG GCA CTT TAT TAC TGT 336 Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys 75 80 85 CAG CAA CAT TAT AGT ACT CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACA AAG TTG 384 Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu 90 95 100 GAA ATA AAA C 394 Glu Ile Lys 105

【０２４４】配列番号：２ 配列の長さ：４１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATG GAA TGT AAC TGG ATA CTT CCT TTT ATT CTG TCA GTA ACT TCA GGT 48 Met Glu Cys Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Leu Ser Val Thr Ser Gly -15 -10 -5 GCC TAC TCA CAG GTT CAA CTC CAG CAG TCT GGG GCT GAG CTG GCA AGA 96 Ala Tyr Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg -1 1 5 10 CCT GGG GCT TCA GTG AAG TTG TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTT 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTA AAA CAG AGG CCT GGA CAG GGT CTG 192 Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 GAA TGG ATT GGG TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240 Glu Trp Ile Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser 50 55 60 CAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT GCA GAT AAA TCC TCC AGT 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 65 70 75 ACA GCC TAC ATG CAA CTC AGC ATC TTG GCA TTT GAG GAC TCT GCG GTC 336 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ile Leu Ala Phe Glu Asp Ser Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCA AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 95 100 105 TGG GGC CAA GGC ACC ACT CTC ACA GTC TCC TCA G 418 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０２４５】配列番号：３ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【０２４６】配列番号：４ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【０２４７】配列番号：５ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【０２４８】配列番号：６ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【０２４９】配列番号：７ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Ile Phe Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly 5 10 15

【０２５０】配列番号：８ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【０２５１】配列番号：９ 配列の長さ：３７９ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly -15 -10 -5 GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC 96 Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala -1 1 5 10 AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAG GCT AGT CAG GAT GTG 144 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val 15 20 25 AAT ACT GCT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA AAG GCT CCA AAG 192 Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 30 35 40 45 CTG CTG ATC TAC TCG GCA TCC AAC CGG TAC ACT GGT GTG CCA AGC AGA 240 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60 TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC ACC TTC ACC ATC AGC AGC 288 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser 65 70 75 CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCT ACC TAC TAC TGC CAG CAA CAT TAT AGT 336 Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser 80 85 90 ACT CCA TTC ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 95 100 105

【０２５２】配列番号：１０ 配列の長さ：３７９ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly -15 -10 -5 GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC 96 Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala -1 1 5 10 AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAG GCT AGT CAG GAT GTG 144 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val 15 20 25 AAT ACT GCT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA AAG GCT CCA AAG 192 Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 30 35 40 45 CTG CTG ATC TAC TCG GCA TCC AAC CGG TAC ACT GGT GTG CCA AGC AGA 240 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60 TTC AGC GGT AGC GGT AGT GGT ACC GAC TAC ACC TTC ACC ATC AGC AGC 288 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser 65 70 75 CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCT ACC TAC TAC TGC CAG CAA CAT TAT AGT 336 Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser 80 85 90 ACT CCA TTC ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 95 100 105

【０２５３】配列番号：１１ 配列の長さ：４１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly -15 -10 -5 GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys -1 1 5 10 CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192 Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240 Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser 50 55 60 CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATG ACC GCA GAC ACG TCC ACG AGC 288 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser 65 70 75 ACA GTC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 95 100 105 TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０２５４】配列番号：１２ 配列の長さ：４１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly -15 -10 -5 GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys -1 1 5 10 CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192 Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240 Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser 50 55 60 CAG AAG TTC AAG GGC AAA GTC ACC ATG ACC GCA GAC ACG TCC ACG AGC 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser 65 70 75 ACA GTC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 95 100 105 TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０２５５】配列番号：１３ 配列の長さ：４１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly -15 -10 -5 GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys -1 1 5 10 CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192 Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240 Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser 50 55 60 CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTC ACT ATG ACC GCA GAC AAG TCC ACG AGC 288 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser 65 70 75 ACA GTC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０２５６】配列番号：１４ 配列の長さ：４１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly -15 -10 -5 GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys -1 1 5 10 CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192 Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240 Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser 50 55 60 CAG AAG TTC AAG GGC AAA GTC ACC ATG ACC GCA GAC AAG TCC ACG AGC 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser 65 70 75 ACA GTC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 95 100 105 TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０２５７】配列番号：１５ 配列の長さ：４１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly -15 -10 -5 GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys -1 1 5 10 CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192 Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240 Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser 50 55 60 CAG AAG TTC AAG GGC AGA GCC ACC CTG ACC GCA GAC ACG TCC ACG AGC 288 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser 65 70 75 ACA GTC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 95 100 105 TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０２５８】配列番号：１６ 配列の長さ：４１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly -15 -10 -5 GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys -1 1 5 10 CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192 Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240 Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser 50 55 60 CAG AAG TTC AAG GGC AGA GCC ACC CTG ACT GCA GAC ACG TCC TCG AGC 288 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser 65 70 75 ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 95 100 105 TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０２５９】配列番号：１７ 配列の長さ：４１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly -15 -10 -5 GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys -1 1 5 10 CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG CGC CCT GGA CAA GGG CTT 192 Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240 Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser 50 55 60 CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATG ACC GCA GAC ACG TCC ACG AGC 288 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser 65 70 75 ACA GTC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 95 100 105 TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０２６０】配列番号：１８ 配列の長さ：４１8 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly -15 -10 -5 GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys -1 1 5 10 CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192 Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240 Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser 50 55 60 CAG AAG TTC AAG GGC AAA GTC ACC ATG ACC GCA GAC ACG TCC TCG AGC 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser 65 70 75 ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 95 100 105 TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０２６１】配列番号：１９ 配列の長さ：４１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly -15 -10 -5 GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys -1 1 5 10 CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192 Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240 Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser 50 55 60 CAG AAG TTC AAG GGC AAA GTC ACC ATG ACC GCA GAC ACG TCC TCG AGC 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser 65 70 75 ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG GCA TTT GAG GAC ACG GCC GTG 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Ala Phe Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 95 100 105 TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０２６２】配列番号：２０ 配列の長さ：４１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly -15 -10 -5 GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys -1 1 5 10 CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192 Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240 Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser 50 55 60 CAG AAG TTC AAG GGC AAA GCC ACC CTG ACT GCA GAC ACG TCC TCG AGC 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser 65 70 75 ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 95 100 105 TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０２６３】配列番号：２１ 配列の長さ：４１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly -15 -10 -5 GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys -1 1 5 10 CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192 Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240 Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser 50 55 60 CAG AAG TTC AAG GGC AAA GTC ACC ATG ACC GCA GAC ACG TCC TCG AGC 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser 65 70 75 ACA GCC TAC ATG CAG CTG AGC AGC CTA AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 95 100 105 TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０２６４】配列番号：２２ 配列の長さ：４１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly -15 -10 -5 GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys -1 1 5 10 CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192 Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240 Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser 50 55 60 CAG AAG TTC AAG GGC AAA GTC ACC ATG ACC GCA GAC ACG TCC TCG AGC 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser 65 70 75 ACA GCC TAC ATG CAG CTG AGC ATC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ile Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 95 100 105 TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０２６５】配列番号：２３ 配列の長さ：４１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly -15 -10 -5 GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys -1 1 5 10 CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192 Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240 Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser 50 55 60 CAG AAG TTC AAG GGC AAA GTC ACC ATG ACC GCA GAC ACG TCC TCG AGC 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser 65 70 75 ACA GCC TAC ATG CAG CTG AGC ATC CTG AGA TCT GAG GAC TCG GCC GTG 336 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ile Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０２６６】配列番号：２４ 配列の長さ：４１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly -15 -10 -5 GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys -1 1 5 10 CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192 Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240 Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser 50 55 60 CAG AAG TTC AAG GGC AAA GTC ACC ATG ACC GCA GAC ACG TCC TCG AGC 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser 65 70 75 ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC ATC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ile Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 95 100 105 TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０２６７】配列番号：２５ 配列の長さ：４１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly -15 -10 -5 GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys -1 1 5 10 CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192 Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240 Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser 50 55 60 CAG AAG TTC AAG GGC AAA GTC ACC ATG ACC GCA GAC ACG TCC TCG AGC 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser 65 70 75 ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC TCG GCC GTA 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 95 100 105 TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０２６８】配列番号：２６ 配列の長さ：４１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly -15 -10 -5 GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys -1 1 5 10 CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192 Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240 Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser 50 55 60 CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATG ACC GCA GAC ACG TCC ACG AGC 288 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser 65 70 75 ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 95 100 105 TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０２６９】配列番号：２７ 配列の長さ：４１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly -15 -10 -5 GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys -1 1 5 10 CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192 Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240 Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser 50 55 60 CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATG ACC GCA GAC ACG TCC TCG AGC 288 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser 65 70 75 ACA GTC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 95 100 105 TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０２７０】配列番号：２８ 配列の長さ：４１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly -15 -10 -5 GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys -1 1 5 10 CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192 Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240 Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser 50 55 60 CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATG ACC GCA GAC AAG TCC ACG AGC 288 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser 65 70 75 ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 95 100 105 TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０２７１】配列番号：２９ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGAAGTTGC CTGTTAGGCT GTTGGTGCTG 40

【０２７２】配列番号：３０ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGAGWCAG ACACACTCCT GYTATGGGT 39

【０２７３】配列番号：３１ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGAGTGTGC TCACTCAGGT CCTGGSGTTG 40

【０２７４】配列番号：３２ 配列の長さ：４３ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGAGGRCCC CTGCTCAGWT TYTTGGMWTC TTG 43

【０２７５】配列番号：３３ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGATTTWC AGGTGCAGAT TWTCAGCTTC 40

【０２７６】配列番号：３４ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGAGGTKCY YTGYTSAGYT YCTGRGG 37

【０２７７】配列番号：３５ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGGCWTCA AGATGGAGTC ACAKWYYCWG G 41

【０２７８】配列番号：３６ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGTGGGGAY CTKTTTYCMM TTTTTCAATT G 41

【０２７９】配列番号：３７ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGTRTCCW CASCTCAGTT CCTTG 35

【０２８０】配列番号：３８ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGTATATAT GTTTGTTGTC TATTTCT 37

【０２８１】配列番号：３９ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGAAGCCC CAGCTCAGCT TCTCTTCC 38

【０２８２】配列番号：４０ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGATCCCGGG TGGATGGTGG GAAGATG 27

【０２８３】配列番号：４１ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TAGAGTCACC GAGGAGCCAG TTGTA 25

【０２８４】配列番号：４２ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGATCCCGGG AGTGGATAGA CCGATG 26

【０２８５】配列番号：４３ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GATAAGCTTC CACCATGGGC TTCAAGATGG AGTC 34

【０２８６】配列番号：４４ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GATAAGCTTC CACCATGGAA TGTAACTGGA TACT 34

【０２８７】配列番号：４５ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGCGGATCCA CTCACGTTTT ATTTCCAACT TTGT 34

【０２８８】配列番号：４６ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGCGGATCCA CTCACCTGAG GAGACTGTGA GAGT 34

【０２８９】配列番号：４７ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CAGACAGTGG TTCAAAGT 18

【０２９０】配列番号：４８ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GAATTCGGAT CCACTCACGT TTGATT 26

【０２９１】配列番号：４９ 配列の長さ：４８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AGTCAGGATG TGAATACTGC TGTAGCCTGG TACCAGCAGA AGCCAGGA 48

【０２９２】配列番号：５０ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCATCCAACC GGTACACTGG TGTGCCAAGC AGATTCAGC 39

【０２９３】配列番号：５１ 配列の長さ：４５ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CAACATTATA GTACTCCATT CACGTTCGGC CAAGGGACCA AGGTG 45

【０２９４】配列番号：５２ 配列の長さ：４７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCAGTATTCA CATCCTGACT GGCCTTACAG GTGATGGTCA CTCTGTC 47

【０２９５】配列番号：５３ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACACCAGTGT ACCGGTTGGA TGCCGAGTAG ATCAGCAG 38

【０２９６】配列番号：５４ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTGAATGGAG TACTATAATG TTGCTGGCAG TAGTAGGTAG C 41

【０２９７】配列番号：５５ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGTACCGACT ACACCTTCAC CATCAGCAGC C 31

【０２９８】配列番号：５６ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGTGAAGGTG TAGTCGGTAC CGCTACCGCT A 31

【０２９９】配列番号：５７ 配列の長さ：１４４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ATGCCTTGCA GGAAACCTTC ACTGAGGCCC CAGGCTTCTT CACCTCAGCC CCAGACTGCA 60 CCAGCTGCAC CTGGGAGTGA GCACCTGGAG CTACAGCCAG CAAGAAGAAG ACCCTCCAGG 120 TCCAGTCCAT GGTGGAAGCT TATC 144

【０３００】配列番号：５８ 配列の長さ：１３０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCAGTGAAGG TTTCCTGCAA GGCATCTGGA TACACCTTCA CTCCCTACTG GATGCAGTGG 60 GTGCGACAGG CCCCTGGACA AGGGCTTGAG TGGATGGGAT CTATTTTTCC TGGAGATGGT 120 GATACTAGGT 130

【０３０１】配列番号：５９ 配列の長さ：１３１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AATACACGGC CGTGTCCTCA GATCTCAGGC TGCTCAGCTC CATGTAGACT GTGCTCGTGG 60 ACGTGTCTGC GGTCATGGTG ACTCTGCCCT TGAACTTCTG ACTGTACCTA GTATCACCAT 120 CTCCAGGAAA A 131

【０３０２】配列番号：６０ 配列の長さ：１１９ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GAGATCTGAG GACACGGCCG TGTATTACTG TGCGAGAGGA TTACGACGAG GGGGGTACTA 60 CTTTGACTAC TGGGGGCAAG GGACCACGGT CACCGTCTCC TCAGGTGAGT GGATCCGAC 119

【０３０３】配列番号：６１ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GATAAGCTTC CACCATGGAC TGGAC 25

【０３０４】配列番号：６２ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTCGGATCCA CTCACCTGAG GAGAC 25

【０３０５】配列番号：６３ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AAGTTCAAGG GCAAAGTCAC CATGAC 26

【０３０６】配列番号：６４ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTCATGGTGA CTTTGCCCTT GAACTT 26

【０３０７】配列番号：６５ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ATGACCGCAG ACAAGTCCAC GAGCAC 26

【０３０８】配列番号：６６ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTGCTCGTGG ACTTGTCTGC GGTCAT 26

【０３０９】配列番号：６７ 配列の長さ：４６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AAGTTCAAGG GCAAAGTCAC CATGACCGCA GACAAGTCCA CGAGCAC 46

【０３１０】配列番号：６８ 配列の長さ：４７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTGCTCGTGG ACTTGTCTGC GGTCATGGTG ACTTTGCCCT TGAACTT 47

【０３１１】配列番号：６９ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AAGTTCAAGG GCAGAGCCAC CCTGACCGCA GACACGTC 38

【０３１２】配列番号：７０ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GACGTGTCTG CGGTCAGGGT GGCTCTGCCC TTGAACTT 38

【０３１３】配列番号：７１ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CAGACAGTGG TTCAAAGT 18

【０３１４】配列番号：７２ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCCCCAAAGC CAAGGTC 17

【０３１５】配列番号：７３ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ATTTTTCCTG GAGATGGTGA TAC 23

【０３１６】配列番号：７４ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTATCACCAT CTCCAGGAAA TAT 23

【０３１７】配列番号：７５ 配列の長さ：４１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATG GAA TGT AAC TGG ATA CTT CCT TTT ATT CTG TCA GTA ACT TCA GGT 48 Met Glu Cys Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Leu Ser Val Thr Ser Gly -15 -10 -5 GCC TAC TCA CAG GTT CAA CTC CAG CAG TCT GGG GCT GAG CTG GCA AGA 96 Ala Tyr Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg -1 1 5 10 CCT GGG GCT TCA GTG AAG TTG TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTT 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTA AAA CAG AGG CCT GGA CAG GGT CTG 192 Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 GAA TGG ATT GGG TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240 Glu Trp Ile Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser 50 55 60 CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATG ACC GCA GAC ACG TCC ACG AGC 288 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser 65 70 75 ACA GTC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 95 100 105 TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０３１８】配列番号：７６ 配列の長さ：４１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly -15 -10 -5 GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys -1 1 5 10 CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192 Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240 Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser 50 55 60 CAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT GCA GAT AAA TCC TCC AGT 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 65 70 75 ACA GCC TAC ATG CAA CTC AGC ATC TTG GCA TTT GAG GAC TCT GCG GTC 336 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ile Leu Ala Phe Glu Asp Ser Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCA AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 95 100 105 TGG GGC CAA GGC ACC ACT CTC ACA GTC TCC TCA G 418 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０３１９】配列番号：７７ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAG 38

【０３２０】配列番号：７８ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCAGACACGT CCTCGAGCAC AGCCTACATG GAGCT 35

【０３２１】配列番号：７９ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AGCTCCATGT AGGCTGTGCT CGAGGACGTG TCTGC 35

【０３２２】配列番号：８０ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TGGGTGCGAC AGCGCCCTGG ACAAGG 26

【０３２３】配列番号：８１ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CCTTGTCCAG GGCGCTGTCG CACCCA 26

【０３２４】配列番号：８２ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TACATGGAGC TGAGCAGCCT GGCATTTGAG GACACGGCCG T 41

【０３２５】配列番号：８３ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACGGCCGTGT CCTCAAATGC CAGGCTGCTC AGCTCCATGT A 41

【０３２６】配列番号：８４ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AAGTTCAAGG GCAAAGCCAC CCTGAC 26

【０３２７】配列番号：８５ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTCAGGGTGG CTTTGCCCTT GAACTT 26

【０３２８】配列番号：８６ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCCTACATGC AGCTGAGCAG CCT 23

【０３２９】配列番号：８７ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AGGCTGCTCA GCTGCATGTA GGC 23

【０３３０】配列番号：８８ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCCTACATGC AGCTGAGCAT CCTGAGATCT GAGGACAC 38

【０３３１】配列番号：８９ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GATCTCAGGA TGCTCAGCTG CATGTAGGCT GTGCT 35

【０３３２】配列番号：９０ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCCTACATGC AGCTGAGCAT CCTGAGATCT GAGGACTCGG CCGTGTATTA 50

【０３３３】配列番号：９１ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACGGCCGAGT CCTCAGATCT CAGGATGCTC AGCTGCATGT AGGCTGTGCT 50

【０３３４】配列番号：９２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GAGCTGAGCA TCCTGAGATC 20

【０３３５】配列番号：９３ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GATCTCAGGA TGCTCAGCTC CATGTA 26

【０３３６】配列番号：９４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AGATCTGAGG ACTCGGCCGT 20

【０３３７】配列番号：９５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACGGCCGAGT CCTCAGATCT 20

【０３３８】配列番号：９６ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCAGACACGT CCACGAGCAC AGCCTACATG GAGCT 35

【０３３９】配列番号：９７ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AGCTCCATGT AGGCTGTGCT CGTGGACGTG TCTGC 35

【０３４０】配列番号：９８ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCAGACACGT CCTCGAGCAC AGTCTACATG GAGCT 35

【０３４１】配列番号：９９ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AGCTCCATGT AGACTGTGCT CGAGGACGTG TCTGC 35

【０３４２】配列番号：１００ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AGAGTCACCA TCACCGCAGA CAAGTC 26

【０３４３】配列番号：１０１ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GACTTGTCTG CGGTGATGGT GACTCT 26

【０３４４】配列番号：１０２ 配列の長さ：４１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly -15 -10 -5 GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys -1 1 5 10 CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192 Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240 Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser 50 55 60 CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATC ACC GCA GAC AAG TCC ACG AGC 288 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser 65 70 75 ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 95 100 105 TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０３４５】配列番号：１０３ 配列の長さ：１０１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 GAATTCGGCA CGAGGGATCT GG ATG GCA TCT ACT TCG TAT GAC TAT TGC 49 Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys 1 5 AGA GTG CCC ATG GAA GAC GGG GAT AAG CGC TGT AAG CTT CTG CTG GGG 97 Arg Val Pro Met Glu Asp Gly Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly 10 15 20 25 ATA GGA ATT CTG GTG CTC CTG ATC ATC GTG ATT CTG GGG GTG CCC TTG 145 Ile Gly Ile Leu Val Leu Leu Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu 30 35 40 ATT ATC TTC ACC ATC AAG GCC AAC AGC GAG GCC TGC CGG GAC GGC CTT 193 Ile Ile Phe Thr Ile Lys Ala Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu 45 50 55 CGG GCA GTG ATG GAG TGT CGC AAT GTC ACC CAT CTC CTG CAA CAA GAG 241 Arg Ala Val Met Glu Cys Arg Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu 60 65 70 CTG ACC GAG GCC CAG AAG GGC TTT CAG GAT GTG GAG GCC CAG GCC GCC 289 Leu Thr Glu Ala Gln Lys Gly Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala 75 80 85 ACC TGC AAC CAC ACT GTG ATG GCC CTA ATG GCT TCC CTG GAT GCA GAG 337 Thr Cys Asn His Thr Val Met Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu 90 95 100 105 AAG GCC CAA GGA CAA AAG AAA GTG GAG GAG CTT GAG GGA GAG ATC ACT 385 Lys Ala Gln Gly Gln Lys Lys Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr 110 115 120 ACA TTA AAC CAT AAG CTT CAG GAC GCG TCT GCA GAG GTG GAG CGA CTG 433 Thr Leu Asn His Lys Leu Gln Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu 125 130 135 AGA AGA GAA AAC CAG GTC TTA AGC GTG AGA ATC GCG GAC AAG AAG TAC 481 Arg Arg Glu Asn Gln Val Leu Ser Val Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr 140 145 150 TAC CCC AGC TCC CAG GAC TCC AGC TCC GCT GCG GCG CCC CAG CTG CTG 529 Tyr Pro Ser Ser Gln Asp Ser Ser Ser Ala Ala Ala Pro Gln Leu Leu 155 160 165 ATT GTG CTG CTG GGC CTC AGC GCT CTG CTG CAG TGA GATCCCAGGA 575 Ile Val Leu Leu Gly Leu Ser Ala Leu Leu Gln *** 170 175 180 AGCTGGCACA TCTTGGAAGG TCCGTCCTGC TCGGCTTTTC GCTTGAACAT TCCCTTGATC 635 TCATCAGTTC TGAGCGGGTC ATGGGGCAAC ACGGTTAGCG GGGAGAGCAC GGGGTAGCCG 695 GAGAAGGGCC TCTGGAGCAG GTCTGGAGGG GCCATGGGGC AGTCCTGGGT CTGGGGACAC 755 AGTCGGGTTG ACCCAGGGCT GTCTCCCTCC AGAGCCTCCC TCCGGACAAT GAGTCCCCCC 815 TCTTGTCTCC CACCCTGAGA TTGGGCATGG GGTGCGGTGT GGGGGGCATG TGCTGCCTGT 875 TGTTATGGGT TTTTTTTGCG GGGGGGGTTG CTTTTTTCTG GGGTCTTTGA GCTCCAAAAA 935 AATAAACACT TCCTTTGAGG GAGAGCACAC CTTAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 995 AAAATTCGGG CGGCCGCC 1013

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ヒト骨髄腫細胞株KPMM2 を用いたFCM
解析において、キメラ抗HM1.24抗体の蛍光強度がマウス
抗HM1.24抗体の蛍光強度と同様に、コントロール抗体に
比べシフトしていることを示すグラフである。

【図２】図２は、WISH細胞を用いたCell-ELISAにおい
て、キメラ抗HM1.24抗体はマウス抗HM1.24抗体と同様
に、ビオチン化マウス抗HM1.24抗体のWISH細胞への結合
を濃度依存的阻害していることを示すグラフである。

【図３】図３は、コントロールヒトIgG1、あるいはマウ
ス抗HM1.24抗体は、RPMI8226細胞に対する細胞障害活性
を持たないのに対し、キメラ抗HM1.24抗体はE/T 比の上
昇に伴い、RPMI 8226 細胞に対する細胞障害活性が上昇
していることを示すグラフである。

【図４】図４は、PCR 法によるCDR グラフティングによ
り再構成ヒト抗HM1.24抗体L 鎖を、作製する方法を示す
模式図である。

【図５】図５は、再構成ヒト抗HM1.24抗体H 鎖の作製に
おいて、PCR 法によりRVH1、RVH2、RVH3及びRVH4のオリ
ゴヌクレオチドをアセンブリーする方法を示す模式図で
ある。

【図６】図６は、PCR 法によりヒト・マウスハイブリッ
ド抗HM1.24抗体H 鎖V 領域を作製する方法を示す模式図
である。

【図７】図７は、PCR 法によりマウス・ヒトハイブリッ
ド抗HM1.24抗体H 鎖V 領域を作製する方法を示す模式図
である。

【図８】図８は、再構成ヒト抗HM1.24抗体L 鎖バージョ
ンａはキメラ抗HM1.24抗体と同程度の抗原結合活性を有
することを示すグラフである。なお、-1, -2はロットの
違いを示す。

【図９】図９は、L 鎖バージョンａとH 鎖バージョン
ａ、ｂ、ｆ又はｈを組み合わせた再構成ヒト抗HM1.24抗
体およびキメラ抗体HM1.24抗体の抗原結合活性を示すグ
ラフである。

【図１０】図１０は、L 鎖バージョンｂとH 鎖バージョ
ンａ、ｂ、ｆ又はｈを組み合わせた再構成ヒト抗HM1.24
抗体およびキメラ抗体HM1.24抗体の結合活性を示すグラ
フである。

【図１１】図１１は、L 鎖バージョンａとH 鎖バージョ
ンａ、ｂ、ｆ又はｈを組み合わせた再構成ヒト抗HM1.24
抗体およびキメラ抗体HM1.24抗体の結合阻害活性を示す
グラフである。

【図１２】図１２は、L 鎖バージョンｂとH 鎖バージョ
ンａ、ｂ、ｆ又はｈを組み合わせた再構成ヒト抗HM1.24
抗体およびキメラ抗体HM1.24抗体の結合阻害活性を示す
グラフである。

【図１３】図１３は、再構成ヒト抗HM1.24抗体H 鎖バー
ジョンａ、ｂ、ｃ、ｄ及びキメラ抗HM1.24抗体の抗原結
合活性を示すグラフである。

【図１４】図１４は、再構成ヒト抗HM1.24抗体H 鎖バー
ジョンａ、ｅ及びキメラ抗HM1.24抗体の抗原結合活性を
示すグラフである。なお、-1, -2はロットの違いを示
す。

【図１５】図１５は、再構成ヒト抗HM1.24抗体H 鎖バー
ジョンａ、ｃ、ｐ、ｒ及びキメラ抗HM1.24抗体の結合阻
害活性を示すグラフである。

【図１６】図１６は、ヒト・マウスハイブリッド抗HM1.
24抗体、マウス・ヒトハイブリッド抗HM1.24抗体および
キメラ抗HM1.24抗体の抗原結合活性を示すグラフであ
る。

【図１７】図１７は、再構成ヒト抗HM1.24抗体H 鎖バー
ジョンａ、ｂ、ｃ、ｆ及びキメラ抗HM1.24抗体の抗原結
合活性を示すグラフである。

【図１８】図１８は、再構成ヒト抗HM1.24抗体H 鎖バー
ジョンａ、ｇ及びキメラ抗HM1.24抗体の抗原結合活性を
示すグラフである。

【図１９】図１９は、再構成ヒト抗HM1.24抗体H 鎖バー
ジョンａ、ｇ及びキメラ抗HM1.24抗体の結合阻害活性を
示すグラフである。

【図２０】図２０は、再構成ヒト抗HM1.24抗体H 鎖バー
ジョンｈ、ｉ及びキメラ抗HM1.24抗体の抗原結合活性を
示すグラフである。

【図２１】図２１は、再構成ヒト抗HM1.24抗体H 鎖バー
ジョンｆ、ｈ、ｊ及びにキメラ抗HM1.24抗体の抗原結合
活性を示す。

【図２２】図２２は、再構成ヒト抗HM1.24抗体H 鎖バー
ジョンｈ、ｉ及びキメラ抗HM1.24抗体の結合阻害活性を
示すグラフである。

【図２３】図２３は、再構成ヒト抗HM1.24抗体H 鎖バー
ジョンｆ、ｈ、ｊ及びキメラ抗HM1.24抗体の結合阻害活
性を示すグラフである。

【図２４】図２４は、再構成ヒト抗HM1.24抗体H 鎖バー
ジョンｈ、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ及びキメラ抗HM1.24抗体
の抗原結合活性を示すグラフである。

【図２５】図２５は、再構成ヒト抗HM1.24抗体H 鎖バー
ジョンａ、ｈ、ｐ、ｑ及びキメラ抗HM1.24抗体の抗原結
合活性を示すグラフである。

【図２６】図２６は、再構成ヒト抗HM1.24抗体H 鎖バー
ジョンｈ、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ及びキメラ抗HM1.24抗体
のWISH細胞への結合阻害活性を示すグラフである。

【図２７】図２７は、再構成ヒト抗HM1.24抗体H 鎖バー
ジョンａ、ｈ、ｐ、ｑ及びキメラ抗HM1.24抗体の結合阻
害活性を示すグラフである。

【図２８】図２８は、再構成ヒト抗HM1.24抗体H 鎖バー
ジョンａ、ｃ、ｐ、ｒ及びキメラ抗HM1.24抗体の抗原結
合活性を示すグラフである。

【図２９】図２９は、再構成ヒト抗HM1.24抗体バージョ
ンｓが、再構成ヒト抗HM1.24抗体バージョンｒと同程度
の抗原結合活性を有することを示すグラフである。

【図３０】図３０は、再構成ヒト抗HM1.24抗体バージョ
ンｓが、再構成ヒト抗HM1.24抗体バージョンｒと同程度
の結合阻害活性を有することを示すグラフである。

【図３１】図３１は、精製再構成ヒト抗HM1.24抗体は、
キメラ抗HM1.24抗体と同程度の抗原結合活性を有するこ
とを示すグラフである。

【図３２】図３２は、精製再構成ヒト抗HM1.24抗体は、
キメラ抗HM1.24抗体と同程度の結合阻害活性を有するこ
とを示すグラフである。

【図３３】図３３は、ヒト骨髄腫移植マウスにおいて、
キメラ抗HM1.24抗体の投与により、コントロールヒトIg
G1投与に比べて、生存期間が延長していることを示すグ
ラフである。

【図３４】図３４は、エフェクター細胞としてヒト健常
人末梢血由来細胞を用いた場合、コントロールヒトIgG1
はKPMM2 細胞に対して細胞障害活性を示さず、また、マ
ウス抗HM1.24抗体も細胞障害活性が弱いのに対し、再構
成ヒト抗HM1.24抗体は、KPMM2 細胞に対して強い細胞障
害活性を示していることを示す表すグラフである。

【図３５】図３５は、エフェクター細胞としてヒト健常
人末梢血由来細胞を用いた場合、コントロールヒトIgG1
はARH-77細胞に対して細胞障害活性を示さず、また、マ
ウス抗HM1.24抗体も細胞障害活性が弱いのに対し、再構
成ヒト抗HM1.24抗体は、ARH-77細胞に対して強い細胞障
害活性を示していることを示す表すグラフである。

【図３６】図３６は、エフェクター細胞としてSCIDマウ
ス骨髄由来細胞を用いた場合、コントロールヒトIgG1は
KPMM2 細胞に対する細胞障害活性を持たないのに対し、
再構成ヒト抗HM1.24抗体は抗体温度の上昇に伴い、KPMM
2 細胞に対する細胞障害活性が上昇していることを表す
グラフである。

【図３７】図３７は、ヒト骨髄腫移植マウスにおいて、
コントロールヒトIgG1では投与前に比べ投与後も血清ヒ
トIgG 量が増加しているのに対し、再構成ヒト抗HM1.24
抗体では、抗体投与により、血清ヒトIgG 量の増加を抑
制していることを示すグラフである。

【図３８】図３８は、ヒト骨髄腫移植マウスにおいて、
再構成ヒト抗HM1.24抗体の投与により、コントロールヒ
トIgG1投与に比べ、生存期間が延長していることを示す
グラフである。

【図３９】図３９は、ヒト骨髄腫移植マウスにおいて、
メルファラン、およびコントロールヒトIgG1では投与前
に比べ投与後も血清ヒトIgG 量が増加しているのに対
し、再構成ヒト抗HM1.24抗体では、抗体投与により、血
清ヒトIgG 量の増加を抑制していることを示すグラフで
ある。

【図４０】図４０は、ヒト骨髄腫移植マウスにおいて、
再構成ヒト抗HM1.24抗体の投与により、メルファラン、
あるいはコントロールヒトIgG1投与に比べ、生存期間が
延長していることを示すグラフである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/42 Ｃ０７Ｋ 16/42 16/46 16/46 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 吉村 康史 静岡県御殿場市駒門１−135 中外製薬株 式会社内 (72)発明者 小石原 保夫 静岡県御殿場市駒門１−135 中外製薬株 式会社内 (72)発明者 小阪 昌明 徳島県徳島市八万町千鳥11−10

Claims (88)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト軽（Ｌ）鎖定常領域（Ｃ領域）、及
   び抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖可変（Ｖ）領域を含んでな
   るキメラＬ鎖。
2. 【請求項２】 前記Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号：１に示され
   るアミノ酸配列を有する請求項１に記載のキメラＬ鎖。
3. 【請求項３】 前記ヒトＬ鎖Ｃ領域がＣκである請求項
   １に記載のキメラＬ鎖。
4. 【請求項４】 ヒト重（Ｈ）鎖Ｃ領域、及び抗ＨＭ１．
   ２４抗体のＨ鎖Ｖ領域を含んでなるキメラＨ鎖。
5. 【請求項５】 前記Ｈ鎖Ｖ領域が配列番号：２に示され
   るアミノ酸配列を有する請求項４に記載のキメラＨ鎖。
6. 【請求項６】 前記ヒトＨ鎖Ｃ領域がＣγである請求項
   ４に記載のキメラＨ鎖。
7. 【請求項７】 （１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及び抗ＨＭ１．
   ２４抗体のＬ鎖Ｖ領域を含んでなるＬ鎖；並びに（２）
   ヒトＨ鎖Ｃ領域、及び抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域
   を含んでなるＨ鎖；を含んでなるキメラ抗体。
8. 【請求項８】 前記Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号：１に示され
   るアミノ酸配列を有し、そして前記Ｈ鎖Ｖ領域が配列番
   号：２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項７に記
   載のキメラ抗体。
9. 【請求項９】 （１）ヒトＬ鎖Ｖ領域のフレームワーク
   領域( ＦＲ) 、及び（２）抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖Ｖ
   領域のＣＤＲ、を含んでなる抗ＨＭ１．２４抗体の再構
   成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒトＬ鎖Ｖ領域。
10. 【請求項１０】 前記ＣＤＲが下記アミノ酸配列に示さ
    れるアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の再構成ヒ
    トＬ鎖Ｖ領域。 CDR1：Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala
    （配列番号：３） CDR2：Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr （配列番号：４） CDR3：Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr （配列番
    号：５）
11. 【請求項１１】 前記ＦＲがヒトサブグループＩ（ＨＳ
    ＧＩ）のヒト抗体ＦＲに由来する、請求項１０に記載の
    再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域。
12. 【請求項１２】 前記ＦＲがヒト抗体ＲＥＩのＦＲに由
    来する、請求項１１に記載の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域。
13. 【請求項１３】 前記ＦＲがヒト抗体ＲＥＩのＦＲと実
    質的に同じである、請求項１１に記載の再構成ヒトＬ鎖
    Ｖ領域。
14. 【請求項１４】 前記Ｌ鎖Ｖ領域が、表１においてＲＶ
    Ｌａとして示されるアミノ酸配列を有する請求項１１に
    記載の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域。
15. 【請求項１５】 （１）ヒトＨ鎖Ｖ領域のＦＲ、及び
    （２）抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、を含
    んでなる抗ＨＭ１．２４抗体の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域。
16. 【請求項１６】 前記ＣＤＲが下記アミノ酸配列に示さ
    れるアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の再構成
    ヒトＨ鎖Ｖ領域。 CDR1：Pro Tyr Trp Met Gln （配列番号：６） CDR2：Ser Ile Phe Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
    Gln Lys Phe Lys Gly（配列番号：７） CDR3：Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
    （配列番号：８）
17. 【請求項１７】 前記ＦＲがＨＳＧＩのヒト抗体ＦＲに
    由来する、請求項１６に記載の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域。
18. 【請求項１８】 前記ＦＲ１ー３がヒト抗体ＨＧ３のＦ
    Ｒ１ー３に由来し、前記ＦＲ４がヒト抗体ＪＨ６のＦＲ
    ４に由来する、請求項１６に記載の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領
    域。
19. 【請求項１９】 前記ＦＲ１ー３がヒト抗体ＨＧ３のＦ
    Ｒ１ー３と実質的に同じであり、前記ＦＲ４がヒト抗体
    ＪＨ６のＦＲ４と実質的に同じである、請求項１６に記
    載の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域。
20. 【請求項２０】 前記ＦＲ１においてKabat の規定によ
    る30位のアミノ酸がスレオニンであり、前記ＦＲ３にお
    いてKabat の規定による71位のアミノ酸がアラニンであ
    り、前記ＦＲ３においてKabat の規定による78位のアミ
    ノ酸がアラニンである、請求項１６に記載の再構成ヒト
    抗体Ｈ鎖。
21. 【請求項２１】 前記ＦＲ３においてKabat の規定によ
    る73位のアミノ酸がリジンである、請求項１６に記載の
    再構成ヒト抗体Ｈ鎖。
22. 【請求項２２】 前記Ｈ鎖Ｖ領域が、表２〜４において
    ＲＶＨｆ、ＲＶＨｈ、ＲＶＨｉ、ＲＶＨｊ、ＲＶＨｋ、
    ＲＶＨｌ、ＲＶＨｍ、ＲＶＨｎ、ＲＶＨｏ、ＲＶＨｐ、
    ＲＶＨｒ又はＲＶＨｓとして示されるアミノ酸配列を有
    する、請求項１７に記載の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域。
23. 【請求項２３】 （１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、並びに（２）
    ヒトＬ鎖ＦＲ、及び抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖ＣＤＲを
    含んでなるＬ鎖Ｖ領域、を含んでなる抗ＨＭ１．２４抗
    体の再構成ヒトＬ鎖。
24. 【請求項２４】 前記ヒトＬ鎖Ｃ領域がヒトＣκ領域で
    あり、ヒトＬ鎖ＦＲがＨＳＧＩのヒト抗体のＦＲに由来
    し、前記Ｌ鎖ＣＤＲが請求項１０に示されるアミノ酸配
    列を有する、請求項２３に記載の再構成ヒトＬ鎖。
25. 【請求項２５】 前記ＦＲがヒト抗体ＲＥＩのＦＲに由
    来する、請求項２３に記載の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域。
26. 【請求項２６】 前記ＦＲがヒト抗体ＲＥＩのＦＲと実
    質的に同じである、請求項２３に記載の再構成ヒトＬ鎖
    Ｖ領域。
27. 【請求項２７】 前記Ｌ鎖Ｖ領域が表３においてＲＶＬ
    ａとして示されるアミノ酸配列を有する、請求項２３に
    記載の再構成ヒトＬ鎖。
28. 【請求項２８】 （１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、並びに（２）
    ヒトＨ鎖ＦＲ、及び抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖ＣＤＲを
    含んでなるＨ鎖Ｖ領域、を含んでなる抗ＨＭ１．２４抗
    体の再構成ヒトＨ鎖。
29. 【請求項２９】 前記ヒトＨ鎖Ｃ領域がヒトＣγ１領域
    であり、前記ヒトＨ鎖ＦＲがＨＳＧＩのヒト抗体ＦＲに
    由来し、前記Ｈ鎖ＣＤＲが請求項１６に示されるアミノ
    酸配列を有する、請求項２８に記載の再構成ヒトＨ鎖。
30. 【請求項３０】 前記ＦＲ１ー３がヒト抗体ＨＧ３のＦ
    Ｒ１ー３に由来し、前記ＦＲ４がヒト抗体ＪＨ６のＦＲ
    ４に由来する、請求項２８に記載の再構成ヒトＨ鎖。
31. 【請求項３１】 前記ＦＲ１ー３がヒト抗体ＨＧ３のＦ
    Ｒ１ー３と実質的に同じであり、前記ＦＲ４がヒト抗体
    ＪＨ６のＦＲ４と実質的に同じである、請求項２８に記
    載の再構成ヒトＨ鎖。
32. 【請求項３２】 前記ＦＲ１においてKabat の規定によ
    る30位のアミノ酸がスレオニンであり、前記ＦＲ３にお
    いてKabat の規定による71位のアミノ酸がアラニンであ
    り、前記ＦＲ３においてKabat の規定による78位のアミ
    ノ酸がアラニンである、請求項２８に記載の再構成ヒト
    抗体Ｈ鎖。
33. 【請求項３３】 前記ＦＲ３においてKabat の規定によ
    る73位のアミノ酸がリジンである、請求項２８に記載の
    再構成ヒト抗体Ｈ鎖。
34. 【請求項３４】 前記Ｈ鎖Ｖ領域が、表２〜４において
    ＲＶＨｆ、ＲＶＨｈ、ＲＶＨｉ、ＲＶＨｊ、ＲＶＨｋ、
    ＲＶＨｌ、ＲＶＨｍ、ＲＶＨｎ、ＲＶＨｏ、ＲＶＨｐ、
    ＲＶＨｒ又はＲＶＨｓとして示されるアミノ酸配列を有
    する、請求項２８に記載の再構成ヒトＨ鎖。
35. 【請求項３５】 （Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及び
    （２）ヒトＬ鎖ＦＲ、及び抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖Ｃ
    ＤＲを含んでなるＬ鎖Ｖ領域、を含んでなるＬ鎖；並び
    に （Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及び（２）ヒトＨ鎖Ｆ
    Ｒ、及び抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖ＣＤＲを含んでなる
    Ｈ鎖Ｖ領域、を含んでなるＨ鎖；を含んでなる抗ＨＭ
    １．２４抗体の再構成ヒト抗体。
36. 【請求項３６】 前記Ｌ鎖ＣＤＲが請求項１０に示され
    るアミノ酸配列を有し、前記Ｈ鎖ＣＤＲが請求項１６に
    示されるアミノ酸配列を有する、請求項３５に記載の再
    構成ヒト抗体。
37. 【請求項３７】 前記Ｌ鎖ＣＤＲが請求項１０に示され
    るアミノ酸配列を有し、前記Ｈ鎖ＣＤＲが請求項１６に
    示されるアミノ酸配列を有し；前記ヒトＬ鎖ＦＲがＨＳ
    ＧＩの抗体のＦＲに由来し；前記ヒトＨ鎖ＦＲがＨＳＧ
    Ｉのヒト抗体ＦＲに由来し：前記ヒトＬ鎖Ｃ領域はヒト
    Ｃκ領域であり；そして前記ヒトＨ鎖Ｃ領域はヒトＣγ
    １領域である、請求項３５に記載の再構成ヒト抗体。
38. 【請求項３８】 前記Ｌ鎖ＦＲがヒト抗体ＲＥＩのＦＲ
    に由来し、前記Ｈ鎖ＦＲ１ー３がヒト抗体ＨＧ３に由来
    し、前記Ｈ鎖ＦＲ４がヒト抗体ＪＨ６のＦＲ４に由来す
    る、請求項３５に記載の再構成ヒト抗体。
39. 【請求項３９】 前記Ｌ鎖Ｖ領域が、表１においてＲＶ
    Ｌａとして示されるアミノ酸配列を有する、請求項３５
    に記載の再構成ヒト抗体。
40. 【請求項４０】 前記Ｈ鎖Ｖ領域が、表２〜４において
    ＲＶＨｆ、ＲＶＨｈ、ＲＶＨｉ、ＲＶＨｊ、ＲＶＨｋ、
    ＲＶＨｌ、ＲＶＨｍ、ＲＶＨｎ、ＲＶＨｏ、ＲＶＨｐ、
    ＲＶＨｒ又はＲＶＨｓとして示されるアミノ酸配列を有
    する、請求項３５に記載の再構成ヒト抗体。
41. 【請求項４１】 抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖Ｖ領域をコ
    ードするＤＮＡ。
42. 【請求項４２】 前記Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号：１に示さ
    れるアミノ酸配列をコードする、請求項４１に記載のＤ
    ＮＡ。
43. 【請求項４３】 前記Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡが
    配列番号：１に示されるヌクレオチド配列を有する、請
    求項４１に記載のＤＮＡ。
44. 【請求項４４】 抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域をコ
    ードするＤＮＡ。
45. 【請求項４５】 前記Ｈ鎖Ｖ領域が配列番号：２に示さ
    れるアミノ酸配列コードする、請求項４４に記載のＤＮ
    Ａ。
46. 【請求項４６】 前記Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡが
    配列番号：２に示されるヌクレオチド配列を有する、請
    求項４４に記載のＤＮＡ。
47. 【請求項４７】 （１）ヒトＬ鎖Ｃ領域；及び（２）抗
    ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖Ｖ領域；を含んでなる、キメラ
    Ｌ鎖をコードするＤＮＡ。
48. 【請求項４８】 前記Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号：１に示さ
    れるアミノ酸配列をコードする、請求項４７に記載のＤ
    ＮＡ。
49. 【請求項４９】 前記Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号：１に示さ
    れるヌクレオチド配列を有する、請求項４７に記載のＤ
    ＮＡ。
50. 【請求項５０】 （１）ヒトＨ鎖Ｃ領域；及び（２）抗
    ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域を含んでなる、キメラＨ
    鎖をコードするＤＮＡ。
51. 【請求項５１】 前記Ｈ鎖Ｖ領域が配列番号：２に示さ
    れるアミノ酸配列をコードする、請求項５０記載のＤＮ
    Ａ。
52. 【請求項５２】 前記Ｈ鎖Ｖ領域が配列番号：２に示さ
    れるヌクレオチド配列を有する、請求項５０に記載のＤ
    ＮＡ。
53. 【請求項５３】 （１）ヒトＬ鎖Ｖ領域のＦＲ、及び
    （２）抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、を含
    んでなる抗ＨＭ１．２４抗体の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域を
    コードするＤＮＡ。
54. 【請求項５４】 前記ＣＤＲが請求項１０に示されるア
    ミノ酸配列を有する、請求項５３に記載の再構成ヒトＬ
    鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ。
55. 【請求項５５】 前記ＦＲがＨＳＧＩのヒト抗体ＦＲに
    由来する、請求項５３に記載の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域を
    コードするＤＮＡ。
56. 【請求項５６】 前記ＦＲがヒト抗体ＲＥＩのＦＲに由
    来する、請求項５３に記載の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域をコ
    ードするＤＮＡ。
57. 【請求項５７】 前記ＦＲがヒト抗体ＲＥＩのＦＲと実
    質的に同じである、請求項５３に記載の再構成ヒトＬ鎖
    Ｖ領域をコードするＤＮＡ。
58. 【請求項５８】 前記Ｌ鎖Ｖ領域が表１におけるＲＶＬ
    ａとして示されるアミノ酸配列をコードする、請求項５
    １に記載のＤＮＡ。
59. 【請求項５９】 配列番号：９に示されるヌクレオチド
    配列を有する、請求項５３に記載の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領
    域をコードするＤＮＡ。
60. 【請求項６０】 （１）ヒトＨ鎖Ｖ領域のＦＲ、及び
    （２）抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、を含
    んでなる抗ＨＭ１．２４抗体の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域を
    コードするＤＮＡ。
61. 【請求項６１】 前記ＣＤＲが請求項１６に示されるア
    ミノ酸配列を有する、請求項６０に記載の再構成ヒトＨ
    鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ。
62. 【請求項６２】 前記ＦＲがＨＳＧＩのヒト抗体のＦＲ
    に由来する、請求項６０に記載の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域
    をコードするＤＮＡ。
63. 【請求項６３】 前記ＦＲ１ー３がヒト抗体ＨＧ３のＦ
    Ｒ１ー３に由来し、前記ＦＲ４がヒト抗体ＪＨ６のＦＲ
    ４に由来する、請求項６０に記載の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領
    域をコードするＤＮＡ。
64. 【請求項６４】 前記ＦＲ１ー３がヒト抗体ＨＧ３のＦ
    Ｒ１ー３と実質的に同じであり、前記ＦＲ４がヒト抗体
    ＪＨ６のＦＲ４と実質的に同じである、請求項６０に記
    載の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ。
65. 【請求項６５】 前記ＦＲ１においてKabat の規定によ
    る30位のアミノ酸がスレオニンであり、前記ＦＲ３にお
    いてKabat の規定による71位のアミノ酸がアラニンであ
    り、前記ＦＲ３においてKabat の規定による78位のアミ
    ノ酸がアラニンである、請求項６０に記載の再構成ヒト
    抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ。
66. 【請求項６６】 前記ＦＲ３においてKabat の規定によ
    る73位のアミノ酸がリジンである、請求項６０に記載の
    再構成ヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ。
67. 【請求項６７】 前記Ｈ鎖Ｖ領域が、表２〜４において
    ＲＶＨｆ、ＲＶＨｈ、ＲＶＨｉ、ＲＶＨｊ、ＲＶＨｋ、
    ＲＶＨｌ、ＲＶＨｍ、ＲＶＨｎ、ＲＶＨｏ、ＲＶＨｐ、
    ＲＶＨｒ又はＲＶＨｓとして示されるアミノ酸配列を有
    する、請求項６０に記載の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域をコー
    ドするＤＮＡ。
68. 【請求項６８】 配列番号：１８、１９、２０、２１、
    ２２、２３、２４、２５、２６、２８又は１０２に示さ
    れるヌクレオチド酸配列を有する、請求項６０に記載の
    再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ。
69. 【請求項６９】 （１）ヒトＬ鎖Ｃ領域；並びに（２）
    ヒトＬ鎖ＦＲ、及び抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖ＣＤＲを
    含んでなるＬ鎖Ｖ領域；を含んでなる抗ＨＭ１．２４抗
    体の再構成ヒトＬ鎖をコードするＤＮＡ。
70. 【請求項７０】 前記Ｌ鎖Ｖ領域が表１におけるＲＶＬ
    ａとして示されるアミノ酸配列をコードする、請求項６
    ９に記載のＤＮＡ。
71. 【請求項７１】 前記Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号：９に示さ
    れるヌクレオチド配列を有する請求項６９に記載のＤＮ
    Ａ。
72. 【請求項７２】 前記ヒトＬ鎖Ｃ領域がヒトＬ鎖Ｃκ領
    域である、請求項６９に記載のＤＮＡ。
73. 【請求項７３】 （１）ヒトＨ鎖Ｃ領域；並びに（２）
    ヒトＨ鎖ＦＲ、及び抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖ＣＤＲを
    含んでなるＨ鎖Ｖ領域；を含んでなる抗ＨＭ１．２４抗
    体の再構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮＡ。
74. 【請求項７４】 Ｈ鎖Ｖ領域が表２〜４においてＲＶＨ
    ｆ、ＲＶＨｈ、ＲＶＨｉ、ＲＶＨｊ、ＲＶＨｋ、ＲＶＨ
    ｌ、ＲＶＨｍ、ＲＶＨｎ、ＲＶＨｏ、ＲＶＨｐ、ＲＶＨ
    ｒ又はＲＶＨｓとして示されるアミノ酸配列をコードす
    る、請求項７３に記載の再構成ヒトＨ鎖をコードするＤ
    ＮＡ。
75. 【請求項７５】 前記Ｈ鎖Ｖ領域が配列番号：１８、１
    ９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２８
    又は１０２に示されるヌクレオチド配列を有する、請求
    項７３に記載の再構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮＡ。
76. 【請求項７６】 前記ヒトＨ鎖Ｃ領域がヒトＨ鎖Ｃγ１
    領域である、請求項７３に記載の再構成ヒトＨ鎖をコー
    ドするＤＮＡ。
77. 【請求項７７】 請求項４１、４２、４３、４４、４
    ５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５
    ３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６
    １、６２、３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、
    ７０、７１、７２、７３、７４、７５および７６のいず
    れか１項に記載のＤＮＡを含んでなるベクター。
78. 【請求項７８】 請求項４１、４２、４３、４４、４
    ５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５
    ３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６
    １、６２、３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、
    ７０、７１、７２、７３、７４、７５および７６のいず
    れか１項に記載のＤＮＡを含んでなるベクターにより形
    質転換された宿主細胞。
79. 【請求項７９】 抗ＨＭ１．２４抗体のキメラ抗体の製
    造方法であって、請求項４１、４２、４３、４７、４８
    および４９のいずれかに記載のＤＮＡを含んでなる発現
    ベクター及び請求項４４、４５、４６、５０、５１およ
    び５２のいずれかに記載のＤＮＡを含んでなる発現ベク
    ターにより同時形質転換された宿主細胞を培養し、そし
    て目的とする抗体を回収する、段階を含んでなる方法。
80. 【請求項８０】 抗ＨＭ１．２４抗体の再構成ヒト抗体
    の製造方法であって、請求項５３、５４、５５、５６、
    ５７、５８、５９、６９、７０、７１および７２のいず
    れか１項に記載のＤＮＡを含んでなる発現ベクター及び
    請求項６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６
    ５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７
    ３、７４、７５および７６のいずれか１項に記載のＤＮ
    Ａを含んでなる発現ベクターにより同時形質転換された
    宿主細胞を培養し、そして目的とする抗体を回収する、
    ことを含んでなる方法。
81. 【請求項８１】 配列番号：１０３に示すアミノ酸配列
    を有するポリペプチドを特異的に認識するキメラ抗体を
    有効成分として含有する医薬組成物。
82. 【請求項８２】 キメラ抗ＨＭ１．２４抗体を有効成分
    として含有する医薬組成物。
83. 【請求項８３】 配列番号：１０３に示すアミノ酸配列
    を有するポリペプチドを特異的に認識するキメラ抗体を
    有効成分として含有する骨髄腫治療剤。
84. 【請求項８４】 キメラ抗ＨＭ１．２４抗体を有効成分
    として含有する骨髄腫治療剤。
85. 【請求項８５】 配列番号：１０３に示すアミノ酸配列
    を有するポリペプチドを特異的に認識する再構成ヒト抗
    体を有効成分として含有する医薬組成物。
86. 【請求項８６】 再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体を有効
    成分として含有する医薬組成物。
87. 【請求項８７】 配列番号：１０３に示すアミノ酸配列
    を有するポリペプチドを特異的に認識する再構成ヒト抗
    体を有効成分として含有する骨髄腫治療剤。
88. 【請求項８８】 再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体を有効
    成分として含有する骨髄腫治療剤。