JP5558825B2 - 抗bst2抗体 - Google Patents
抗bst2抗体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5558825B2 JP5558825B2 JP2009538149A JP2009538149A JP5558825B2 JP 5558825 B2 JP5558825 B2 JP 5558825B2 JP 2009538149 A JP2009538149 A JP 2009538149A JP 2009538149 A JP2009538149 A JP 2009538149A JP 5558825 B2 JP5558825 B2 JP 5558825B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- antigen
- human
- cells
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
塩基配列 アミノ酸配列 アミノ酸配列の長さ
ヒトBST2D 配列番号:1 配列番号:2 (180)
ヒトBST2H 配列番号:20 配列番号:21 (158)
ヒトBST2HS 配列番号:22 配列番号:23 (100)
これらのスプライシングバリアントのうち、ヒトBST2Dを認識する抗体が骨髄腫などの一部の腫瘍の治療に利用する試みが報告されている。たとえば、抗BST2モノクローナル抗体である「HM1.24抗体」は、骨髄腫に対する治療効果が確認された代表的なモノクローナル抗体である。「HM1.24抗体」は、ヒト骨髄腫細胞を免疫原として樹立されたモノクローナル抗体である。その後のエピトープ解析により、「HM1.24抗体」は、配列番号:2で表されるヒトBST2Dの、アミノ酸番号116〜127(配列番号:24)を認識していることが確認されている。ところがこの領域は、ヒトBST2Hに共通するアミノ酸配列からなっている(図1)。
すなわち、本発明者らは、BST2抗体とヒトBST2抗原の各種スプライシングバリアントとの結合性を指標にしてBST2抗体を選別し、治療及び診断目的外組織への非特異的吸着を抑えた、特異的な抗BST2抗体を得ることに成功した。当該抗体を用いることにより、投与後の血中濃度の低下を防止し、従来よりも少ない抗体投与量で目的の治療効果を得る、又は当該治療効果を有効に予測できる診断を可能とする効果を得ることが期待できるものである。
〔1〕ヒトBST2D抗原に結合し、かつヒトBST2H抗原とは実質的に結合しないことを特徴とする抗ヒトBST2抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
〔2〕配列番号:3に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識することを特徴とする〔1〕に記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
〔3〕配列番号:3のうちの全部または少なくとも5個以上の連続するアミノ酸配列を有するペプチドを免疫原として作製した抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
〔4〕〔1〕から〔3〕のいずれかに記載の抗体が結合するBST2Dタンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
〔5〕モノクローナル抗体である〔1〕から〔4〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
〔6〕受託番号FERM AP-21303として寄託されたハイブリドーマBST2#4LDが産生するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
〔7〕重鎖可変領域と軽鎖可変領域において、以下のアミノ酸配列をCDR1、CDR2およびCDR3として含む〔1〕に記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片;
重鎖可変領域のCDR1:SGYYWN(配列番号:4);
重鎖可変領域のCDR2:YISYDGSNNYNPSLKNR(配列番号:5);および
重鎖可変領域のCDR3:ILGRGY(配列番号:6);
軽鎖可変領域のCDR1:RASQSVSTSSYSYMH(配列番号:7);
軽鎖可変領域のCDR2:YASNLES(配列番号:8);および
軽鎖可変領域のCDR3:QHSWEIPYT(配列番号:9)。
〔8〕重鎖可変領域および軽鎖可変領域として、以下に記載するアミノ酸配列を含む、〔1〕に記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片;
配列番号:11の重鎖可変領域と配列番号:13の軽鎖可変領域。
〔9〕次の(A)または(B)のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入された抗体であって、(A)または(B)のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、またはその抗原結合領域を含む断片;
(A)重鎖可変領域と軽鎖可変領域において、以下のアミノ酸配列をCDR1、CDR2およびCDR3として含む抗体、;
重鎖可変領域のCDR1:SGYYWN(配列番号:4);
重鎖可変領域のCDR2:YISYDGSNNYNPSLKNR(配列番号:5);および
重鎖可変領域のCDR3:ILGRGY(配列番号:6);
軽鎖可変領域のCDR1:RASQSVSTSSYSYMH(配列番号:7);
軽鎖可変領域のCDR2:YASNLES(配列番号:8);および
軽鎖可変領域のCDR3:QHSWEIPYT(配列番号:9)、または
(B)重鎖可変領域および軽鎖可変領域として、以下に記載するアミノ酸配列を含む抗体、;
配列番号:11の重鎖可変領域と配列番号:13の軽鎖可変領域。
〔10〕〔7〕から〔9〕のいずれかに記載の抗体が結合するBST2Dタンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
〔11〕モノクローナル抗体である〔7〕から〔10〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
〔12〕細胞表面にヒトBST2D抗原を発現している細胞に対してCDC活性を有することを特徴とする〔1〕から〔11〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
〔13〕細胞表面にヒトBST2D抗原を発現している細胞に対してADCC活性を有することを特徴とする〔1〕から〔11〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
〔14〕〔7〕から〔9〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、をコードするポリヌクレオチド。
〔15〕〔7〕から〔9〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
〔16〕〔15〕に記載のベクターを発現可能に保持した形質転換細胞。
〔17〕〔16〕に記載の形質転換細胞を培養し、その培養物から抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、を回収する工程を含む〔7〕から〔9〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、の製造方法。
〔18〕〔1〕から〔5〕のいずれかに記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
〔19〕受託番号FERM AP-21303として寄託されたハイブリドーマBST2#4LD。
〔20〕〔19〕に記載のハイブリドーマを培養し、培養物から抗体を採取する工程を含む抗体の製造方法。
〔21〕次の工程を含む、抗ヒトBST2D特異抗体の製造方法;
(1)抗ヒトBST2D抗体をヒトBST2HおよびヒトBST2HSのいずれか、または両方と接触させる工程;、および
(2)以下のiおよびiiのいずれか、または両方の反応特性を有する抗ヒトBST2D抗体を抗ヒトBST2D特異抗体として回収する工程;
i. ヒトBST2Hに結合しない抗体、および
ii.ヒトBST2HSに結合しない抗体。
〔22〕次の工程を含む抗ヒトBST2D特異抗体の製造方法;
(1)配列番号:3のアミノ酸配列、または配列番号:3のアミノ酸配列から選択された少なくとも5個以上の連続するアミノ酸配列を含むペプチドを非ヒト動物に免疫する工程、および
(2)(1)の非ヒト動物から抗体を回収するか、または抗体産生細胞を回収して該抗体産生細胞が産生する抗体を回収する工程。
〔23〕ヒトBST2D抗原を発現している組織の増殖に起因する疾患に対する治療剤であって、〔1〕から〔13〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、を有効成分として含む治療剤。
〔24〕〔1〕から〔13〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を有効成分として含む、ヒトBST2D抗原を発現している腫瘍に対する治療剤。
〔25〕腫瘍が、骨髄細胞から派生した腫瘍であることを特徴とする〔24〕に記載の治療剤。
〔26〕骨髄細胞から派生した腫瘍が、骨髄腫であることを特徴とする〔25〕に記載の治療剤。
〔27〕骨髄腫が、多発性骨髄腫であることを特徴とする〔26〕に記載の治療剤。
〔28〕〔1〕から〔13〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を含む、ヒトBST2D抗原を発現している組織を検出する診断薬。
〔29〕〔1〕から〔13〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を含む、ヒトBST2D抗原を発現している腫瘍を検出するための診断薬。
〔30〕腫瘍が、骨髄細胞から派生した腫瘍であることを特徴とする〔29〕に記載の診断薬。
〔31〕骨髄細胞から派生した腫瘍が、骨髄腫であることを特徴とする〔30〕に記載の診断薬。
〔32〕骨髄腫が、多発性骨髄腫であることを特徴とする〔31〕に記載の診断薬。
〔33〕〔1〕から〔13〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を投与する工程を含む、ヒトBST2D抗原を発現している腫瘍の治療方法。
〔34〕〔1〕から〔13〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片の、ヒトBST2D抗原を発現している腫瘍の治療のための医薬組成物の製造における使用。
また本発明は、〔1〕から〔13〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片の、ヒトBST2D抗原を発現している腫瘍の診断における使用に関する。あるいは本発明は、〔1〕から〔13〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片の、ヒトBST2D抗原を発現している腫瘍を診断するための診断剤の製造における使用に関する。更に本発明は、〔1〕から〔13〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を患者に投与する工程を含む、ヒトBST2D抗原を発現している腫瘍を生体内において検出するための方法を提供する。
加えて本発明は、〔1〕から〔13〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片と、薬学的に許容される担体を配合する工程を含む、ヒトBST2D抗原を発現している腫瘍を治療するための医薬組成物の製造方法を提供する。あるいは本発明は、〔1〕から〔13〕のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を薬学的に許容される担体を配合する工程を含む、ヒトBST2D抗原を発現している腫瘍を生体内において検出するための診断剤の製造方法に関する。
これまでに報告されているヒトBST2抗原のスプライシングバリアントの例は、図1に示す通りである。各バリアントのアミノ酸配列を、それぞれ次の配列番号に示した。
塩基配列 アミノ酸配列 アミノ酸配列の長さ
ヒトBST2D 配列番号:1 配列番号:2 (180)
ヒトBST2H 配列番号:20 配列番号:21 (158)
ヒトBST2HS 配列番号:22 配列番号:23 (100)
たとえば酵素的な消化によって得られる断片は、酵素が認識する特定のアミノ酸配列で切断されている。他方、遺伝子工学的な手法で得られる抗体断片は、抗体の任意の位置で断片化することができる。したがって、FabあるいはF(ab')2などの抗体断片とは異なる位置で断片化されている抗体断片であっても、その抗原結合活性を維持する限り、本発明における抗原結合領域を含む断片に含まれる。更に、抗原結合領域を含む断片を、再び定常領域と接合することによって再構成された抗体分子も、本発明における抗体に含まれる。したがって、遺伝子組み換えによって構築された抗体とは、たとえばキメラ抗体、CDR移植抗体、シングルチェインFv、diabody (diabodies)、線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体等を示すことができる。モノクローナル抗体、あるいはそれを産生する抗体産生細胞をもとに、これらの抗体を得る方法は公知である。
強いエフェクター作用を示す抗体のサブクラスは公知である。したがって、本発明に基づくキメラ抗体やCDR移植抗体においては、定常領域として、エフェクター作用に優れるサブクラスを選択することによって、その治療効果を高めることができる。
(1)配列番号:3のアミノ酸配列、または配列番号:3のアミノ酸配列から選択された少なくとも5個以上の連続するアミノ酸配列を含むペプチドを非ヒト動物に免疫する工程、および
(2)(1)の非ヒト動物から抗体を回収するか、または抗体産生細胞を回収して該抗体産生細胞が産生する抗体を回収する工程。
ヒトBST2D特異的配列(配列番号:3)はClustalWアルゴリズム(http://www.ebi.ac.uk/clustalW/)を利用した、BST2D, BST2H, BST2HS 蛋白質のアミノ酸配列のマルチプルアラインメントにより特定した。成熟BST2D蛋白質のC末端の予測はGPI modification site prediction programを用いた(1. GPI modification site prediction:http://mendel.imp.ac.at/sat/gpi/gpi_server.html、2.DGPI: http://129.194.185.165/dgpi/DGPI_demo_en.html)3.GPI-SOM: http://gpi.unibe.ch/)。
(1)抗ヒトBST2D抗体をヒトBST2HおよびヒトBST2HSのいずれか、または両方と接触させる工程;、および
(2)以下のiおよびiiのいずれか、または両方の反応特異性を有する抗ヒトBST2D抗体を抗ヒトBST2D特異抗体として回収する工程;
i. ヒトBST2Hに結合しない抗体、および
ii.ヒトBST2HSに結合しない抗体。
具体的に配列番号:24に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する結合活性を評価する手段としては、ELISA法(酵素結合免疫吸着検定法)、RIA法(放射免疫測定法)、EIA法(酵素免疫測定法)、FACS(フローサイトメトリー法)その他の当業者に周知な方法から適宜適した方法を用いることができる。
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM
(いずれもBD Biosciences社の商品名)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta / Cell Lab Quanta SC
(いずれもBeckman Coulter社の商品名)
ΔGeo-Mean=Geo-Mean(被験抗体存在下)/Geo-Mean(被験抗体非存在下)
解析によって得られる被験抗体のBST2H発現細胞に対する結合量が反映されたGeometric Mean比値(BST2HΔGeo-Mean値)を、被験抗体のBST2D又はBST2H発現細胞に対する結合量が反映されたΔGeo-Mean比値と比較する。対照抗体としては、HM1.24抗体を利用することができる。
したがって、配列番号:37;EVERLRRENQVLSVRで構成されるエピトープを認識するモノクローナル抗体は、本発明のモノクローナル抗体として好ましい。より具体的には、配列番号:2に示すヒトBST2Dの全長アミノ酸配列中の細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列(47-180)から選択された連続するアミノ酸配列で構成された合成ペプチドのうち、K(47)---R(147)およびE(133)---Q(180)からなるペプチドには結合し、K(47)--V(146)およびV(134)---Q(180)への結合が同じ条件で検出できない抗体は、本発明におけるBST2D抗体として好ましい。このような抗体は、例えば、以下の方法により得ることができる。
また、上記〔4〕又は〔10〕に記載の抗体には、上述の通り、一価抗体だけでなく、多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、または、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。
(1)重鎖可変領域と軽鎖可変領域において、以下のアミノ酸配列をCDR1、CDR2およびCDR3として含む抗体、またはその抗原結合領域を含む断片;
重鎖可変領域のCDR1:SGYYWN(配列番号:4);
重鎖可変領域のCDR2:YISYDGSNNYNPSLKNR(配列番号:5);および
重鎖可変領域のCDR3:ILGRGY(配列番号:6);
軽鎖可変領域のCDR1:RASQSVSTSSYSYMH(配列番号:7);
軽鎖可変領域のCDR2:YASNLES(配列番号:8);および
軽鎖可変領域のCDR3:QHSWEIPYT(配列番号:9)。
(2)重鎖可変領域および軽鎖可変領域として、以下に記載するアミノ酸配列を含む、上記〔1〕に記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片;
配列番号:11の重鎖可変領域と配列番号:13の軽鎖可変領域。
(3)(1)または(2)のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入された抗体であって、(1)または(2)のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体;
(4)(1)から(3)のいずれかに記載の抗体が結合するBST2Dタンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体、またはその抗原結合領域を含む断片;
(5)モノクローナル抗体である(1)から(5)のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片;
疎水性アミノ酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、
親水性アミノ酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、
脂肪族側鎖を有するアミノ酸(G、A、V、L、I、P)、
水酸基含有側鎖を有するアミノ酸(S、T、Y)、
硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸(C、M)、
カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸(D、N、E、Q)、
塩基含有側鎖を有するアミノ酸(R、K、H)、
芳香族含有側鎖を有するアミノ酸(H、F、Y、W)
(括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す)
(a)寄託機関の名称・あて名
名称:独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番1号中央第6(郵便番号305-8566)
(b)寄託日:2007年6月6日
(c)受託番号:FERM BP-10964(ハイブリドーマ#4LD)
キメラ抗体としてもかまわないし、モノクローナル抗体としてもかまわない。
BST2Dを特異的に認識する抗体を、その抗体が由来する生物種とは異なる宿主に投与する場合には、当該宿主にとって異物と認識されにくい形に加工するのが望ましい。たとえば、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ(chimeric)抗体、ヒト化(humanized)抗体などが挙げられる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
−定常領域を欠失した抗原結合領域を含む断片(Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, third edition, Academic Press Limited. 1995; Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)
−モノクローナル抗体の抗原結合領域と宿主のイムノグロブリンの定常領域とで構成されるキメラ抗体(遺伝子発現実験マニュアル 講談社 1994年 (石田 功、安東 民衛 編)
−宿主のイムノグロブリンにおける相補性決定領域(CDR)をモノクローナル抗体のCDRに置換したCDR置換抗体(遺伝子発現実験マニュアル 講談社 1994年 (石田 功、安東 民衛 編)
本発明における細胞傷害活性としては、例えば抗体依存性細胞介在性細胞傷害(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity:ADCC)活性、補体依存性細胞傷害(complement-dependent cytotoxicity:CDC)活性などを挙げることができる。本発明において、CDC活性とは補体系による細胞傷害活性を意味する。一方ADCC活性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、そのFc部分にFcγ受容体保有細胞(免疫細胞等)がFcγ受容体を介して結合し、標的細胞に傷害を与える活性を意味する。
(1)エフェクター細胞〔ヒト末梢単核細胞〕の調製
ヒト健常ドナーより得た末梢血よりフィコール法を用いて単離した末梢単核細胞を用いる。
(2)補体溶液の調製
Baby Rabbit Complement(CEDARLANE社製)をCDCメディウムで希釈し、最終補体濃度を6%として使用できる。
(3)標的(ターゲット)細胞の調製
BST2Dタンパク質またはBST2Hタンパク質を発現したCHO細胞やヒトミエローマ由来RPMI8226細胞などのようなBST2タンパク質を発現した細胞が標的細胞として用いることが出来る。
BST2タンパク質を発現する細胞としては、BST2タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細胞、各種腫瘍細胞等を利用することができる。
CDC活性の測定の場合は、96ウェルU底プレートに、標的細胞と、抗BST2抗体を50μlずつ加え、その後、補体溶液50μlを加え、炭酸ガスインキュベーター内で37℃で2時間培養する。抗体の終濃度は0.01μg/ml,0.1 μg/ml,1 μg/mlまたは10μg/mlとする。培養後、培養上清を回収し、培養上清中のLDH量をCytoTox96(登録商標)Assay(PROMEGA社)により測定し、「補体活性によってターゲット細胞から漏出したLDH量(Experimental Sample)」とする。
CDC活性は以下のようなコントロールを設定して、アッセイを行う。
(1) 実験区におけるLDH放出量(ターゲット細胞に対する補体の傷害作用)
(2) ターゲット細胞の自然LDH放出量
(3) ターゲット細胞からの最大LDH放出量
(4) Lysis Solutionの添加による液量補正用コントロール
(5) 培養液のみのバックグラウンド(ブランク)
(1)、(2)、(3)、で得られたそれぞれの吸光値の平均値から (5) のブランクの平均値を差し引く。そして以下の計算式にしたがってCDC活性を算出する。
CDC活性(%) =(実験区における放出量−ターゲット自然放出量)/(ターゲット最大放出量−ターゲット液量補正コントロール−ターゲット自然放出量)× 100
ADCC活性測定の場合には、96ウエルU底プレートに標的細胞(BST2(D)-CHO細胞、ヒトミエローマ由来RPMI8226株)(4 X 105/ml)を50 ml づつ分注する。抗BST2抗体溶液を最終濃度10μg/mL となるように加え4℃ 30min.インキュベートし、エフェクター細胞(PBMC)をターゲット細胞の12.5, 25, 50, 100倍加え37℃ 4 時間培養する。細胞上清のLDH量を測定し細胞傷害活性により、ターゲット細胞から漏出したLDH量を測定する(Experimental sample)。ADCC 活性をCDC活性の測定と同様なコントロールを設定して、アッセイを行う。
白血病 (leukemia)、
骨髄異形成症候群 (myelodysplastic syndrome;MDS)、
悪性リンパ腫 (malignant lymphoma)、
慢性骨髄性白血病 (chronic myeloid leukemia)、
形質細胞異常症 (plasma cell dyscrasia)、
骨髄増殖性疾患 (myeloproliferative disorder)
上記の血液腫瘍のうち、形質細胞異常症は、骨髄腫 (myeloma)、多発性骨髄腫 (multiple myeloma)、マクログロブリン血症 (macroglobulinemia )を含む。また、骨髄増殖性疾患には、真性赤血球増加症 (primary polycythemia)、本態性血小板血症 (essential thrombocythemia)、特発性骨髄線維症 (agnogenic myeloid metaplasia)などが含まれる。これらの血液腫瘍のうち、治療の対象として好ましいのは、骨髄腫、より具体的には、多発性骨髄腫である。また、本発明の抗体は生体内で治療および診断目的外組織への非特異的吸着を生じず、特異的に治療および診断目的の細胞へ結合することが可能と考えられる為、生体に投与する際には特に有効であると考えられる。
トキシン類:緑膿菌毒素(Pseudomonas Endotoxin; PE)、ジフテリアトキシン、リシン
放射性同位元素:99mTc、89Sr、131I、90Y
抗癌剤:カリキアマイシン、マイトマイシン、パクリタキセル
蛋白質からなるトキシン類は、2官能性試薬によって抗体あるいはその断片などに結合することができる。あるいは、抗体をコードする遺伝子にトキシン類をコードする遺伝子を接合し、両者の融合蛋白質を得ることもできる。放射性同位元素を抗体に結合する方法も公知である。たとえば、キレート剤を利用して、抗体を放射性同位元素で標識する方法が公知である。更に抗癌剤は、糖鎖あるいは2官能性試薬などの利用により、抗体に結合することができる。
本発明は、本発明の抗体を有効成分として含有する、腫瘍治療剤を提供する。本発明の抗体はCDC活性およびADCC活性を有するので、癌などの腫瘍(特に血液腫瘍)の治療や予防に特に有効であると考えられる。
ボルテゾミブ サリドマイド レナリドマイド
メルファラン デキサメサゾン ビンクリスチン
ドキソルビシン インターフェロンα リツキシマブ
更に、骨髄腫の治療剤に加えて、抗体の作用を増強するための治療剤を併用することもできる。たとえば、エフェクター作用を高める薬剤として、免疫増強剤を本発明の抗体とともに投与することができる。具体的には、インターフェロン−γ、インターロイキン−2、インターロイキン−12などとともに抗体を投与することによって、抗体のエフェクター機能の増強作用が期待できる。あるいは、CpGオリゴヌクレオチドなどを含むToll様受容体アゴニストにも免疫増強作用が期待できる。
投与経路は、任意である。当業者は、治療に際して効果的な投与経路を適宜選択することができる。具体的には、経口的に、あるいは非経口的な投与を示すことができる。たとえば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、あるいは皮下注射等により、全身あるいは局所に抗体を投与することができる。本発明における非経口投与に適当な製剤として、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。また細胞に与える場合には、培養液中に通常1μg/mL、好ましくは10μg/mL以上、より好ましくは50μg/mL以上、更に好ましくは0.5mg/mL以上のイムノグロブリンを与える。
「薬学的に許容される」という用語は、各国政府の監督当局により承認されているか、または各国の薬局方もしくは一般的に認知されている薬局方に動物、哺乳動物、および特にヒトへの使用に関して列記されていることを言う。本発明の治療剤は、1回または複数回の用量の凍結乾燥粉末または錠剤の形態で供給することもできる。凍結乾燥粉末または錠剤には、更に、投与の前に該組成物を所望の濃度となるように溶解するための注射用の滅菌済みの水、生理的食塩水または緩衝液を組み合わせることもできる。
本発明において、ヒトBST2D抗原を発現している組織とは、たとえばヒトBST2D抗原を発現している腫瘍を示すことができる。骨髄に存在する細胞から派生した腫瘍、より具体的には、骨髄腫におけるヒトBST2D抗原の高発現が確認されている。本発明において、診断の対象として特に好ましい骨髄腫は、多発性骨髄腫である。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
A.免疫原の作製
免疫原とする細胞は、以下のように293T細胞にヒトBST2D遺伝子を導入して調製した。100mm / Collagen Coated Dish(IWAKI)の底面全体にいきわたらせたopti-MEM(GIBCO) 3mLに導入遺伝子を含む発現ベクターpCDNA3.1-hBST2D 4μgを添加し、混合した。次に、該発現ベクター溶液とは別に、3mLのopti-MEMで58μLのLipofectamineTM2000(Invitrogen)を希釈し、室温で5分間静置してリポフェクトアミン溶液を調製した。その後、該発現ベクター溶液が入っているディッシュに、リポフェクトアミン溶液を静かに添加し混合した。室温で20分間静置した後、10%FBS(牛胎児血清)を含む DMEM培地(SIGMA)で1×106cells/mLに希釈した293T細胞 10mLをディッシュへ静かに添加した。37℃ CO2インキュベーターで48時間静置培養後、ピペッティングにより細胞を回収し、免疫原用トランスフェクタントとした。
B−1)免疫
ヒトBST2D遺伝子を導入した293T細胞を免疫する前日に、PBS200μLとアジュバント200μL(complete adjuvant (FREUND) 三菱化学ヤトロン RM606-1)を混合しエマルジョンにしたものを、Balb/cマウス雌(4週齢)4匹の両足の裏に各50μLずつ免疫した。翌日、2×107個の細胞をPBS 400μLでサスペンドしたものを50μLずつ免疫した。3日おきに2回目、3回目の免疫を行い、3回目の免疫の3日後に、次のように細胞融合を行なった。
免疫したマウスの両足リンパ節より細胞を採取し、10%FBSを含むRPMI1640培地(SIGMA)で培養したマウスミエローマ細胞P3-X63-Ag8-U1と、マウスリンパ節由来細胞の比が2:1〜10:1になるように混和して、遠心分離により細胞を回収した。得られた細胞画分に、RPMI1640培地により等量希釈したPEG4000(MERCK)を加えて、細胞融合を行なった。細胞を洗浄した後、supplementを含む15%FBS-HAT培地160mLで懸濁し、96穴プレート16枚に、200μL/ウェルで播種した。3日後に培地を交換し、コロニー形成が確認された1〜2週間後に、1次スクリーニングを行なった。
目的の抗体を産生するハイブリドーマの第一次スクリーニングはCell ELISA法を用い以下のように行った。実施例1のAで作製した細胞1×107個を0.5% BSA/2mM EDTA/PBS10mLに懸濁して、Cell ELISA用プレート(NUNC 249570 96V NW PS)を用いウェルあたり100μlずつ分注した。2000rpmで2分間、遠心し上清を除去した後、ハイブリドーマ培養上清を各ウェルあたり50μL添加し、室温にて30分間反応させた。洗浄操作(0.5%BSA/2mM・EDTA/PBS)を2回行い、洗浄後のウェルに、10000倍希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG抗体(MBL;Code330)を50μL添加し、30分間反応させた。洗浄操作を3回行なった後、発色溶液を添加して、OD 450nm-620nmを測定して、陽性反応を示すウェルを選択した。
フローサイトメトリー(FCM)解析により、ハイブリドーマ培養上清の解析を行った。実施例1のAで作製した細胞を0.5%BSA/2mM EDTA/PBSに懸濁して、1サンプルあたり1×105個として遠心チューブに回収した後、ハイブリドーマ培養上清各40μl を添加して、室温にて30分間反応させた。その後、0.5%BSA/2mM・EDTA/PBSを1mlずつ各チューブに添加して1200rpmで3分間、4℃で遠心した後に上清を捨てる、という洗浄操作を2回繰り返した。洗浄後のチューブに、100倍希釈したFITC標識ヤギ抗マウスIgG抗体(Beckman coulter;IM0819)を40μLずつ添加し、室温で30分間反応させた。洗浄操作を2回行なった後、フローサイトメーターFC500(Beckman coulter)を用いてハイブリドーマ培養上清に含まれる抗体がヒトBST2Dを特異的に認識するかどうかを解析した。FCMの解析においてヒトBST2Dを発現していない293T細胞には結合しないが、発現している293T細胞に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択した。選択したハイブリドーマを、限外希釈法によりクローニングし、マウス抗ヒトBST2抗体産生ハイブリドーマ#3LD、#4 LD、#7 LD、#9 LD、#19 LDを取得した。
A.ハイブリドーマの培養
実施例1で得られたマウス抗ヒトBST2抗体産生ハイブリドーマ#3LD、#4 LD、#7 LD、#9 LD、#19 LD を、各々下記組成の5%FBS添加RPMI培地で培養した。培養温度は37℃、培養時間は96時間とした。
5% FBS添加RPMI培地:
RPMI1640培地 (Sigma社、カタログ番号:R8758)
5% FBS
0.01M HEPES
1mM ピルビン酸ナトリウム
2mM L−グルタミン
100 U/mL ペニシリン
100 μg/mL ストレプトマイシン
55μM 2−メルカプトエタノール
pH 7.2-pH 7.4
96時間培養後に各ハイブリドーマの培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、粗抗体液とした。
Aで得られた粗抗体液を、それぞれプロテイン Aアフィニティーカラム(rProtein A Sepharose FF, Amershram Pharmacia社、カタログ番号:17-1279-01)で精製した。精製条件は以下の通りである。カラム付属の説明書に従い吸着バッファーとして下記組成のPBS(-)バッファー、溶出バッファーとして0.1Mクエン酸ナトリウムバッファー(pH 3)を用いてアフィニティー精製した。溶出画分は1M Tris-HCl (pH 8.0)を添加してpH7.2付近に調整した。調整された抗体溶液は、透析膜(10000カット、PIERCE社製)を用いてPBS(-)に置換し、精製マウス抗ヒトBST2モノクローナル抗体#3LD、#4 LD、#7 LD、#9 LD、#19 LD (以下、「マウス#3LD抗体」、「マウス#4LD抗体」等と略記する)を得た。精製抗体の濃度は280 nmの吸光度を測定し、1mg/mLを1.38 ODとして算出した。
PBS(-) バッファー:
0.2g/L リン酸二水素一カリウム
0.2g/L 塩化カリウム
8g/L 塩化ナトリウム
1.15g/L 無水リン酸一水素二ナトリウム
C−1)ターゲット細胞株(BST2D-CHO細胞株)の作製
前日に、6cmφディッシュ1枚あたり6×105個になるように播種しておいたCHO-K1細胞にヒトBST2D遺伝子を含む発現ベクターをEffectene Transfection Reagent (QIAGEN社)を用いて導入し、800μg/ml Zeocin (invitrogen社)処理し、ベクターが導入されたZeocin耐性株を選択した。
導入したヒトBST2D発現ベクター: pCDNA3.1-hBST2D 2μg
その後さらにセルソーター(BD FACSAria(Becton Dickinson社))を用い、BST2Dを高発現している細胞株(BST2D-CHO細胞株)を得た。選択した細胞株はFCM解析によってBST2Dを高発現している事を確認した。FCMにBD FACSCaliber (BD社)を用いる以外は、FCM解析の操作は実施例1のDに従った。解析用の抗体として、下記の抗体を使用した。
FCM解析用抗体: 488-conjugated rat anti-human BST2-5C11抗体(human BST2-5C11抗体はWO2006/013923に記載されている。)
ヒトBST2H発現ベクター(pCDNA3.1-hBST2H)を導入する以外はC−1)と同様にし、BST2Hを高発現している細胞株(BST2H-CHO細胞株)を得た。FCM解析用の抗体としては、下記の抗体を使用した。
FCM解析用抗体: 488-congjugated rat- anti-human BST2-3D3抗体(human BST2-3D3抗体は受託番号:FERM BP-10339のハイブリドーマが産生する抗体であり、WO2006/013923に記載されている。)
C−1)で得られたBST2D-CHO細胞株および、C−2)で得られたBST2H-CHO細胞株を用い、上記Bで得られた5種の精製マウス抗ヒトBST2モノクローナル抗体について、結合特異性を検討した。検討は、定法に従いFCM解析で行った。FCM解析の結果よりマウス#3LD抗体、マウス#4LD抗体、マウス#9LD抗体は、BST2D-CHO細胞とは結合するが、BST2H-CHO細胞とは結合しないことが認められた。他方、マウス#7LD抗体、マウス#19LD抗体は、BST2D-CHO細胞とも、BST2H-CHO細胞とも結合する抗体であることが認められた。したがって、以下の実験では、マウス#3LD抗体、マウス#4LD抗体、マウス#9LD抗体は、D型のBST2にのみ結合する抗体(以下、「抗ヒトBST2(D+/H-)抗体」と記載)として扱い、マウス#7LD抗体、マウス#19LD抗体は、D型・H型いずれのBST2にも結合する抗体(以下、「抗ヒトBST2(D+/H+)抗体」と記載)として取り扱った。マウス#4LD抗体およびマウス#19LD抗体のFCM解析結果を、図2に例示する。
マウス抗ヒトBST2抗体であるHM1.24抗体(中外製薬社製)について、C−3)の方法と同様にFCM解析により結合特異性の確認を行った。FCM解析結果をC−3)の結果とともに図2に示す。マウス抗ヒトHM1.24抗体も、BST2D-CHO細胞株とBST2H-CHO細胞株の両者に結合する抗体であることが改めて確認された。
A.抗体
実施例2で得られた、マウス#4LD抗体を用い、以下の通りCDC活性を測定した。
B−1)ターゲット細胞株
以下の細胞をターゲット株として使用した。
・ BST2D-CHO細胞株 : 実施例2のC−1)と同様に作製
・ BST2H-CHO細胞株 : 実施例2のC−2)と同様に作製
ヒト・ミエローマ由来RPMI8226細胞株
B−2)ターゲット細胞と抗ヒトBST2(D+/H-)抗体との反応
上記B−1)記載のBST2D-CHO細胞およびBST2H-CHO細胞を、5mM EDTA/PBS溶液を用いて各々回収し、下記組成のCDCメディウムで4×105個/mlになるように懸濁した。また、ヒト・ミエローマ由来RPMI8226細胞も、下記組成のCDCメディウムで4×105個/mlになるように懸濁した。これらの懸濁液をU底96穴プレートに、1ウェル当たり50μlずつ分注した。
CDCメディウム:
RPMI1640
0.1% BSA
100units/mL Penicillin
100μg/mL Streptomycin
10mM Hepes(pH7.6)
2mM L-Glutamin
補体含有CDCメディウム:
1ml幼令ウサギ補体(CEDARLANE社製、カタログ番号:CL3441)
CDCメディウム(上記参照)
・ターゲット細胞から自然に放出されるLDH量(Target Cell Spontaneous LDH Release):ターゲット細胞のみを試料と同じ容量で培養し、調製した。
・ターゲット細胞が最大に放出した場合のLDH量(Target Cell Maximum LDH Release):ターゲット細胞のみを試料と同じ容量で培養し、上清回収60分前に、最終濃度が0.8%になるようにキット付属のTritonX-100溶液を添加して調製した。
・液量補正用コントロール(Volume Correction Control):ターゲット細胞が最大に放出した場合のLDH量を調製した際に添加したTritonX-100と同じ量を、試料と同じ容量の培養液に加えて調製した。なお以下のCDC活性(%)を算出するための式中では、Volume Correction ControlをVolume Controlと記載した。
・培養液のバックグラウンドコントロール(Culture Medium Background):試料と同じ容量の培養液と、培養液に補体含有CDC mediumを加えて試料と同じ容量にした溶液を調製した。
CDC活性は、測定したそれぞれのLDH量より下式により算出した。
C−1)ターゲット細胞株とエフェクター細胞
以下の細胞をターゲット株として使用した。
・ BST2D-CHO細胞株 : 実施例2のC−1)と同様に作製
・ ヒト・ミエローマ由来RPMI8226株
以下の細胞をエフェクター細胞として使用した。
・ ヒト末梢単核細胞:ヒト末梢血よりフィコール法を用いて単離した末梢単核細胞を用いた。
上記B−1)記載のBST2D-CHO細胞およびヒト・ミエローマ由来RPMI8226細胞を、5mM EDTA/PBS溶液を用いて各々回収し、下記組成の10% FBS添加RPMI培地で4×105個/mlになるように懸濁した。これらの懸濁液をU底96穴プレートに、1ウェル当たり50μlずつ分注した。
・ターゲット細胞から自然に放出されるLDH量(Target Cell Spontaneous LDH Release):ターゲット細胞のみを試料と同じ容量で培養し、調製した。
・ターゲット細胞が最大に放出した場合のLDH量(Target Cell Maximum LDH Release):ターゲット細胞のみを試料と同じ容量で培養し、上清回収60分前に、最終濃度が0.8%になるようにキット付属のTritonX-100溶液を添加して調製した。
・エフェクター細胞から自然に放出されるLDH量(Effector Cell Spontaneous LDH Release):エフェクター細胞のみを試料と同じ容量で培養し、調製した。
・液量補正用コントロール(Volume Correction Control):ターゲット細胞が最大に放出した場合のLDH量を調製した際に添加したTritonX-100と同じ量を、試料と同じ容量の培養液に加えて調製した。なお以下のADCC活性(%)を算出するための式中では、Volume Correction ControlをVolume Controlと記載した。
・培養液のバックグラウンドコントロール(Culture Medium Background):試料と同じ容量の培養液を加えて調製した。
ADCC活性は、下式により算出した。
マウス抗ヒトHM1.24抗体を用い、実施例3と同様にしてCDC活性を測定した。
結果を、実施例3とともに図3に示す。マウス抗ヒトHM1.24抗体(抗ヒトBST2(D+/H+)抗体)はBST2(H)-CHO細胞とBST2(D)-CHO細胞の両方の細胞に同程度の強いCDC活性を示した。一方マウス抗ヒトBST2 #4LD抗体(抗ヒトBST2(D+/H-)はBST2(D)-CHO細胞に対して特異的にCDC活性を示したがBST2(H)-CHO細胞に対しては殺傷活性を示さなかった。
A.ヒトおよびカニクイザルの末梢血単核球画分(以下、「PBMC」と記載する)との結合性
マウス#4LD抗体をPE-標識ヤギ抗マウス抗体で標識し、PBMCを染色して定法に従いフローサイトメトリー法による解析を行った。 試薬、装置は下記のものを使用した。
Flow cytometory (FACSCalibur etc) [Becton Dickinson]
2nd antibody R-PE-Conjugated Goat Anti-Mouse Immunoglobulin Specific Polyclonal Antibody (Multiple Adsorption); (BD Biosciences: 550589)
HISTOPAQUE-1077(SIGMA H8889)
FcR Blocking Reagent (Milteny Biotec 130-059-901)
RPMI1640medium 5%FCS/penicillin-streptmycin/L-glutamin
ACK Lysis solution(0.15M NH4Cl、10mM KHCO3、0.1mM Na2EDTA、pH7.2〜7.4)
血液をRPMI1640(no FCS)にて希釈し、HISTOPAQUE-1077へ重層した後、1800rpmで20分間、遠心分離した。中間層を回収してRPMI1640meduimを加え、1800rpmで10分間遠心分離した。上清を吸引し、細胞ペレットにACK Lysis solution1mlを加えて懸濁して、氷上に3分間静置した後、RPMI1640meduimを加え、1200rpmで5分間遠心分離した。上清を吸引し細胞ペレットをPBMCとし、これにRPMI1640meduimを加え懸濁して、細胞数をカウントして1200rpmで5分間遠心分離した。 20%FCR blocking reagent/1%FCS/PBS にPBMCが5×107cells/mlになるように調整して、U底96 穴プレートに10μl(5×105cells)入れ、さらに1μg/mlのマウス#4LD抗体を25μlずつ加え、4℃で遮光して15分間静置した後、150μlの1%FCS /PBSを加えて、2000rpmで2分間遠心分離した。上清を捨てた後、1%FCS /PBSを加えて、2000rpmで2分間遠心分離して、上清を捨てた。2nd antibodyを20μlずつ加え、4℃で遮光して15分間静置した後、150 μlの1%FCS /PBSを加えて、2000rpmで2min遠心分離して、上清を捨てた。150μlの1%FCS /PBSを加えて、2000rpmで2分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットを150μlの1%FCS /PBS溶液に懸濁してFACSチューブへと移し、さらに150μlの1%FCS /PBSを加えFACSCalibur にて解析した。さらに、FlowJo softwareを使って、PBMCの染色率(%)を求めて表1に示した。
マウス#4LD抗体をポリマー試薬(DAKO K5007)で標識し、定法に従いヒト脾臓組織の凍結切片を染色した。組織の顕微鏡写真を図5に示した。マウス#4LD抗体はヒト脾臓組織にほとんど結合していないが、一方比較例のマウス#19LD抗体はヒト脾臓組織によく結合していた。このことよりマウス#4LD抗体は#19LD抗体に比べ特異性が高いことがしめされた。
RPMI8226細胞を、マウス#4LD, マウス#19LD,HM1.24抗体0.01, 0.1, 1, 10μg/mlの濃度で染色して、その時の染色率からPrism 4 softwareを使ってKd値(平衡解離定数)を算出した。
試薬、装置は以下のものを使用した。
Prism 4 software [GraphPad Software, Inc.]
・ FlowJo software [Tree Star, Inc.]
・ Flow cytometory (FACSCalibur etc) [Becton Dickinson]
・ 2nd antibody (mouse Ig-FITC [Fluorescein isothiocyanate-Conjugated Goat Anti-Mouse Immunoglobulin Specific Polyclonal Antibody (Multiple Adsorption); BD Biosciences: 554001], etc)
細胞を回収して細胞数をカウントし、1%FCS/PBSで細胞を懸濁して、細胞数を1×106 cells / mlにした。100μl(1×105 cells / well)ずつ96 well v-bottom plateに入れて、2000rpmで 2分間遠心分離し、上清を捨てた。0.01, 0.1, 1, 10μg/mlのマウス#4LD,マウス#19LD,HM1.24抗体を25 μlずつ加え、4℃で遮光して15分間静置した後、150μlの1%FCS /PBSを加えて、2000rpmで 2分間遠心分離し、上清を捨てた。1%FCS /PBSを加えて、2000rpmで 2分間遠心分離し、上清を捨てた。2nd antibodyを20μlずつ加え、4℃で遮光して15分間静置した後、150 μlの1%FCS /PBSを加えて、2000rpmで 2分間遠心分離し、上清を捨てた。150 μlの1%FCS /PBSを加えて、2000rpmで 2分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットを150μlの1%FCS /PBS溶液に懸濁してFACSチューブへと移し、さらに150 μlの1%FCS /PBSでwellを共洗いしてチューブへと移してFACSCalibur にて解析した。さらに、FlowJo softwareを使って、染色率の割合を求めた。また、その時の染色率からPrism 4 softwareを使ってKd値を算定した。その結果を表2に示した。マウス#4LD抗体は、HM1.24抗体とマウス#19LD抗体と比べて、RPMI8226細胞に対して高い結合親和性を示した。
マウス#4LD抗体の代わりに、マウス#19LD抗体またはHM1.24抗体を用い、実施例4と同様にした。結果を、実施例4とともに、表1、表2、および図5に示した。
[表1] ヒトおよびカニクイザルのPBMCと抗ヒトBST2抗体との結合性
[表2] ヒト・ミエローマ由来RPMI8226細胞に対する結合能(Kd値)
A.定常領域のアイソタイプ確認
ハイブリドーマ培養上清について、市販のmouse monoclonal antibody isotypingキット(Serotec Product社、カタログ番号:MMT1)を用い、産生されたマウス#4LD抗体の定常領域のアイソタイプを確認した。重鎖定常領域はIgγ2aであり、軽鎖定常領域はIgκであった。
B−1) 使用するハイブリドーマについて
ハイブリドーマとして、マウス抗ヒトBST2D抗体産生ハイブリドーマ#4LDを使用した。
市販のキット「RNeasy Mini Kit」(Qiagen社、カタログ番号:74106)を用いてキット添付の指示書に従い、上記A−1)に示すハイブリドーマからtotal RNAを単離した。いずれも、1×107個のハイブリドーマから、約200μgのtotal RNAが得られた。
B−2)で単離したtotal RNAのうち5μgを使用し、5’RACE法によって、マウス重鎖可変領域をコードするcDNAを増幅した。増幅にあたっては、市販キット「5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA ENDs, Version 2.0Kit」(インビトロジェン社、カタログ番号:18374-058)を用いた。詳細は以下の通りである。まず、A−2)で得られたtotal RNAから逆転写酵素によって、第1鎖cDNAを合成した。このとき、アンチセンスプライマー(GSP1)は下記のものを用いた(配列番号:14)。次に、RNaseHでtotal RNA を分解し、1本鎖となって残った第1鎖cDNAを、1.5%低融点アガロース法によって精製した。さらに、第1鎖cDNAの3’-末端に、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)を用いて、ヌクレオチドホモポリマーであるdCを付加した。そして、dC(アンカー配列)に相補的なヌクレオチドポリマーを3’-末端に有しているアンカープライマー(配列番号:16)と、下記のアンチセンスプライマー(GSP2)(配列番号:15)を用いて、PCR法によってcDNAを増幅した。更に、得られたPCR産物をテンプレートとし、AUAPプライマー(配列番号:17)とアンチセンスプライマー(GSP2)(配列番号:15)を用いて、Nested PCR法によりcDNAを増幅した。さらに、このPCR産物を1.5%低融点アガロース法によって精製した。
Mu IgG2aVH5RACE-GSP1 (配列番号:14)
5' TCC AGA GTT CCA GGT CAA GGT CAC 3' (24-mer)
Mu IgG2aVH5RACE-GSP2 (配列番号:15)
5' GCC AGT GGA TAG ACC GAT GG 3' (20-mer)
5'RACE用アンカープライマー(配列番号:16)
5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG-3' (36-mer)
5'RACE用AUAPプライマー(配列番号:17)
5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3' (20-mer)
B−2)で単離したtotal RNA から、B−3)と同様にして、マウス軽鎖可変領域をコードするcDNAを増幅した。このとき、アンチセンスプライマーは、下記のものを使用した。得られたPCR産物を1.5%低融点アガロース法によって精製した。
Mu IgVL5RACE-GSP1 (配列番号:18)
5' TTC ACT GCC ATC AAT CTT CCA CTT 3' (24-mer)
Mu IgVL5RACE-GSP2 (配列番号:19)
5' GAT GGA TAC AGT TGG TGC AGC 3' (21-mer)
B−3)で得られた重鎖可変領域、およびB−4)で得られた軽鎖可変領域のcDNA断片を、それぞれ、市販キット「Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit」(インビトロジェン社、カタログ番号:1325137)を用い、キット添付の指示書に従ってpCR4Blunt-TOPO ベクターにクローニングし、大腸菌コンピテント細胞に導入して大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体から上記プラスミドを得て、プラスミド中のcDNA塩基配列を自動DNAシークエンサー「PCR-based ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer」(Applied Biosystems社)を用いて確認した。相補性決定領域(以下、「CDR領域」と記す)周辺に、フレームシフト、ナンセンス変異等を生じているために不活性RNAとなったものの転写物は除外し、正しい配列のものを抽出した。さらに、当該プラスミド中に含まれるcDNA塩基配列について、カバットデータベースと相同性を確認して、各々の可変領域内のCDR領域と可変領域の配列を決定した。
B−3)で得られたマウス#4LD抗体の重鎖可変領域の核酸配列は配列番号:10、アミノ酸配列は配列番号:11である。 マウス#4LD抗体の重鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6である。
B−4)で得られたマウス#4LD抗体の軽鎖可変領域の核酸配列は配列番号:12、アミノ酸配列は配列番号:13である。マウス#4LD抗体の軽鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9である。
ヒトインターフェロン産生細胞(Interferon Producing cells; IPC)のcDNAライブラリーから、ヒトIgG1重鎖定常領域とヒトIg kappa軽鎖定常領域を選択し、それぞれ、市販キット「Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit」(インビトロジェン社、カタログ番号:1325137)を用い、キット添付の指示書に従ってpCR4Blunt-TOPO ベクターにクローニングし、大腸菌コンピテント細胞に導入して大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体から上記プラスミドを得て、プラスミド中のcDNA塩基配列を自動DNAシークエンサー「PCR-based ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer」(Applied Biosystems社)を用いて確認した。
B−5)で得られたマウス#4LD抗体重鎖可変領域と、Cで得られたヒトIgG重鎖定常領域は、DNA配列がオーバーラップする領域を持つ。そこで、この領域を用い、オーバーラップ伸長法によって二本鎖DNAを得た。詳細な方法は下記の通りである。
D−1)キメラ#4LD抗体の重鎖をコードするcDNAの調製
B−5)で得られた、「マウス#4LD抗体重鎖可変領域をコードするcDNAを有するプラスミド」をNotIとXbaI制限酵素で消化し、1.5%アガロースゲル法で精製した。これを、各100pmol/μLとなるように、下記組成のTEバッファーで溶解し、マウス#4LD抗体重鎖可変領域をコードするcDNA断片の溶液とした。
TEバッファー:
10mM Tris-HCl
1mM EDTA
pH7.5〜8.0
また、Cで得られた「ヒトIgG重鎖定常領域をコードするcDNAを有するプラスミド」も同様に処理し、100pmol/μLの溶液とした。次に、両者を混合し、まず70℃で10分、その後37℃で5分保持することによって、オーバーラップ領域に水素結合を形成させた。その後、PCR法によってcDNAを増幅後、得られたcDNAを、NotIとXbaI制限酵素で処理した後、1.5%低融点アガロース法によって精製した。
キメラ#4LD抗体重鎖および軽鎖cDNA発現用ベクター作成のため、PCR増幅で使用したprimer配列は、それぞれ次の通りである。
キメラ#4LD抗体重鎖用PCR primer
4LD-VH NotI-1F(配列番号:29)
5' AAA GCG GCC GCG CCG CCA CCA TGA AAG TGT TGA GTC TGT TGT ACC TGT TG 3' (50-mer)
4LD-VH XbaI-2R (配列番号:30)
5' CTA GTC TAG ATG AGG AGA CTG TGA GAG TGG TGC CTT GGC 3' (39-mer)
4LD-VH-3F(配列番号:31)
5' GTC TCC TCA GCC TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC 3' (33-mer)
4LD-VH-4R (配列番号:32)
5' TGA TCA TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA GAG GCT CTT C 3' (37-mer)
キメラ#4LD抗体軽鎖用PCR primer
4LD-VL NotI-1F(配列番号:33)
5' AAA GCG GCC GCG CCG CCA CCA TGG AGA CAG ACA CAC TCC TGC 3' (42-mer)
4LD-VL XbaI-2R (配列番号:34)
5' CTA GTC TAG ACG TTT TAT TTC CAG CTT GGT CCC CCC TCC G 3' (40-mer)
4LD-VL-3F (配列番号:35)
5' AAA TAA AAC GAA CTG TGG CTG CAC CAT CTG TCT TCA TCT TCC C 3' (43-mer)
4LD-VL-4R (配列番号:36)
5' TGA TCA CTA GCA CTC TCC CCT GTT GAA GCT CTT TGT GAC 3' (39-mer)
B−5)で得られたマウス#4LD抗体軽鎖可変領域と、Cで得られたヒトIg kappa軽鎖定常領域についても、D−1)と同様にし、キメラ#4LD抗体の軽鎖をコードするcDNAを得た。
D−1)で得られたcDNAを、NotIとXbaIをクローニングサイトとして、プラスミドベクターpcDNA3.1-ゼオシン(インビトロジェン社)にクローニングし、キメラ#4LD抗体重鎖発現ベクターとした。また、D−2)で得られたcDNAを、NotIとXbaIをクローニングサイトとして、プラスミドベクターpcDNA3.1-ハイグロマイシン(インビトロジェン社)にクローニングし、キメラ#4LD抗体軽鎖発現ベクターとした。各ベクターの名称は、下記の通りである。
キメラ#4LD抗体重鎖発現用ベクター : pcDNA-4LDVH
キメラ#4LD抗体軽鎖発現用ベクター : pcDNA-4LDVL
E−1)一過性形質転換
D−3)で得られた、キメラ#4LD抗体重鎖発現ベクター(pcDNA-4LDVH)1μgとキメラ#4LD抗体軽鎖発現ベクター(pcDNA-4LDVL)1μgを、effectine transfection kit (Qiagen社、カタログ番号:301427)を用いて293T細胞にコトランスフェクションした。その後、下記組成の2% Low IgG FBS添加DMEM培地を用い、37℃で培養した。
2% Low IgG FBS添加DMEM培地:
DMEM培地(Sigma社、カタログ番号:D5796)
2% Low IgG FBS (HyClone社、カタログ番号:SH30151.03)
2mM L−グルタミン
100 U/ml ペニシリン
100 μg/ml ストレプトマイシン
pH 7.2-pH 7.4
ベクター導入後96時間培養し、培養上清を集めて遠心分離により細胞破片を除去し、粗抗体液とした。
E−1)で得られた粗抗体液を、それぞれプロテインAアフィニティーカラム(rProtein A Sepharose FF, Amershram Pharmacia社、カタログ番号:17-1279-01)で精製した。カラム精製条件は以下の通りである。カラム付属の説明書に従い吸着バッファーとして下記組成のPBS(-)バッファー、溶出バッファーとして0.1Mクエン酸ナトリウムバッファー(pH 3)を用いて抗体をアフィニティー精製した。溶出画分は1M Tris-HCl (pH 8.0)を添加してpH7.2付近に調整した。調整された抗体溶液は、透析膜(10000カット、PIERCE社製)を用いてPBS(-)に置換し、精製抗キメラ#4LD抗体を得た。
精製抗体の濃度は280 nmの吸光度を測定し、1mg/mlを1.38 ODとして算出した。
PBS(-) バッファー:
0.2g/L リン酸二水素一カリウム
0.2g/L 塩化カリウム
8g/L 塩化ナトリウム
1.15g/L 無水リン酸一水素二ナトリウム
作成されたキメラ#4LD抗体の重鎖、および軽鎖の塩基配列とアミノ酸配列は、それぞれ次の配列番号の通りである。
重鎖 軽鎖
配列番号:25(塩基配列) 配列番号:27(塩基配列)
配列番号:26(アミノ酸配列) 配列番号:28(アミノ酸配列)
A.ヒトBST2タンパク質の発現ベクターの構築とリコンビナントヒトBST2タンパク質の作成
ヒトBST2Dの全長配列(配列番号:2)中の、細胞外ドメイン47位−180位のアミノ酸配列を対象として、そのN末端側またはC末端側からアミノ酸残基を1つずつ削ったアミノ酸配列をコードするcDNAをPCR法によって合成した。目的とするアミノ酸配列のデザイン方法を以下に示した。
N末端側解析用アミノ酸配列のデザイン:
C末端側解析用アミノ酸配列のデザイン:
PCR法には、ヒトBST2DをコードするcDNAの塩基配列(配列番号:1)の、目的とするアミノ酸配列をコードする領域の両端にアニールするプライマーを利用した。各プライマーにはEcoR IおよびXhoIサイトを付加した。全長のヒトBST2のcDNAを組み込んだベクターを鋳型として、東洋紡社製のKOD DNA polymeraseによってPCR反応を行った。得られたPCR産物をEcoR IとXho I(TaKaRa社製)で切断してアガロースゲルで電気泳動し、それをQiagen社製のMinEluteで精製した。その精製したPCR産物を、Hisタグの付いたpET32発現ベクター(Novagen社製)のEcoR I/Xho Iサイトにクローニングした。それら発現ベクターを大腸菌(BL21(DE3))に形質導入し、それぞれの大腸菌からN末端にHisタグが付加された各ヒトBST2タンパク質をNovagen社のオーバーナイトエクスプレスシステムで作成した。
実施例2で得られた、マウス#4LD抗体を用い、以下の通りウェスタンブロッティング法でエピトープを決定した。
それぞれのHisタグの付いたヒトBST2タンパク質(Aで合成されたもの)をサンプルバッファーで溶解し、70℃10分間加熱した。その溶解させたタンパク質を4-20%グラジエントSDS-PAGEゲル(Invitrogen社製)を使って分離し、PVDFメンブレン(Millipore社製)に転写した。それから、BSAでブロッキングをし、1μg/mL 4LD抗体か2000倍希釈した抗Hisタグ抗体(Novagen社製)で反応させた。HRPでラベル化された抗マウスIgG抗体(Jackson社製)と反応後、ECL検出試薬(GE Healthcare社製)を用いて化学発光させ、富士フィルム社製のLAS-1000でHisタグの付いたヒトBST2タンパク質を検出した。
サンプルバッファー:
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) [Invitrogen社製]
NuPAGE Reducing Agent (10X) [Invitrogen社製]
を滅菌蒸留水で調製した。
(1)細胞株
ヒトのミエローマ由来細胞株であるRPMI8226細胞(ATCC)およびヒトB細胞株ARH77細胞(ATCC)を用いた。細胞は10%FBS(BIONET社製)を含むRPMI1640培地(SIGMA社製)にて維持継代した。
細胞を継代用培地にて5×107個/mLになるように調製した。細胞の移植前日に、あらかじめ抗アシアロGM1抗体(和光純薬社製、1バイアルを5mLで溶解)100μLを腹腔内へ投与したSCIDマウス(オス、5週齢)(日本クレア)の腹部皮下へこの細胞懸濁液100 μL(5×106個/マウス)を移植した。腫瘍体積は以下の式にて算出し、腫瘍体積が140〜240 mm3になった時点でモデル成立とした。
腫瘍体積=長径×短径×短径/2
腫瘍体積をもとに群分けを行った。
細胞を継代用培地にて2.5×107個/mLになるように調製した。細胞の移植前日に、あらかじめ抗アシアロGM1抗体(和光純薬社製、1バイアルを5mLで溶解)100μLを腹腔内へ投与したSCIDマウス(オス、5週齢)(日本クレア)の尾静脈よりこの細胞懸濁液200 μL(5×106個/マウス)を移植した。腫瘍移植後10日目に、マウス血清中のARH77細胞が産生するhuman IgG(Mタンパク)量をELISAで測定し(血清Mタンパク量の測定の項参照)、Mタンパクが検出されたことからモデル成立とした。血清Mタンパク量を基に群分けを行った。
背中足静脈により血液を採取し、血清を分離し、マウス血清中のMタンパク量の測定は、抗human IgG抗体を用いたサンドイッチELISAで行った。すなわち、抗human IgG抗体(Biosource)を固相化した96 well plate(Nunc)を希釈緩衝液(D.B.)でブロッキング処理した後、D.B.を用いて適宜希釈した血清サンプル添加した。D.Bの組成は次のとおりである。
Dilution Buffer; 1 mmol/L MgCl2,
150 mmol/L NaCl,
0.02 w/v% NaN3,
0.05 vol % Tween20,
1 w/v% bovine serum albumin(BSA)
含有50 mmol/L Tris-HCl緩衝液 pH8.1
また抗体濃度算出のためのスタンダードとして、1000 ng/mLから2倍系列で11段階希釈したhuman IgG(ICN/cappel)を同様に添加した。アルカリフォスファターゼ標識抗human IgG抗体(Biosource)を反応させた後、Sigma104(Sigma-Aldrich)を基質として発色させ、吸光度リーダーにより405 nmの吸光度を測定した(参照波長635 nm)。スタンダードhuman IgGの検量線から血清サンプル中のhuman IgG(Mタンパク)量を算出した。なお、本ELISAの検出限界は検量線から判断して1 ng/mLとした。
4LD抗体を投与当日、濾過滅菌したPBS(−)を用いて、0.5 mg/mL(5 mg/kg投与群)および0.15 mg/mL(1.5 mg/kg投与群)、0.1 mg/mL(1 mg/kg投与群)、0.05 mg/mL(0.5 mg/kg投与群)になるように調製し、投与試料とした。
(2)で作製したRPMI8226細胞移植マウスモデルは移植後27日目より 週に2回、三週間、上記(5)で調製した投与試料を10 mL/kgにて、尾静脈より投与した(投与量:5 mg/kg, 1.5 mg/kg, 0.5 mg/kg)。陰性対照として、PBS(−)(vehicle)を同様に週に2回、三週間、10 mL/kgにて、尾静脈より投与した。1群6匹で行った。また、(3)で作製したARH77細胞移植マウスモデルは移植後10日より、週に1回、三週間、上記(5)で調製した投与試料を10 mL/kgにて、尾静脈より投与した。(投与量:5 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.05 mg/kg)陰性対照として、PBS(−)(vehicle)を同様に週に1回、三週間、10 mL/kgにて、尾静脈より投与した。1群5匹で行った。
4LD抗体のRPMI8226細胞移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果については腫瘍体積の継時変化(図7)で評価した。その結果、4LD抗体投与群ではvehicle投与群と比較して腫瘍の増殖抑制が認められた。また、ARH77細胞移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果については生存期間(図8)で評価した。その結果、4LD抗体投与群ではvehicle投与群と比較して抗体投与群で生存期間の延長が認められた。
以上より、4LD抗体が有するヒト骨髄腫細胞移植マウスモデルに対する抗腫瘍効果が示された。
Claims (28)
- ヒトBST2D抗原に結合し、かつヒトBST2H抗原とは実質的に結合しないことを特徴とする抗ヒトBST2抗体であって、配列番号:37のアミノ酸配列をエピトープとして認識する抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
- モノクローナル抗体である請求項1に記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
- 受託番号FERM BP-10964として寄託されたハイブリドーマBST2#4LDが産生するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
- 重鎖可変領域と軽鎖可変領域において、以下のアミノ酸配列をCDR1、CDR2およびCDR3として含む請求項1に記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片;
重鎖可変領域のCDR1:SGYYWN(配列番号:4);
重鎖可変領域のCDR2:YISYDGSNNYNPSLKNR(配列番号:5);および
重鎖可変領域のCDR3:ILGRGY(配列番号:6);
軽鎖可変領域のCDR1:RASQSVSTSSYSYMH(配列番号:7);
軽鎖可変領域のCDR2:YASNLES(配列番号:8);および
軽鎖可変領域のCDR3:QHSWEIPYT(配列番号:9)。 - 重鎖可変領域および軽鎖可変領域として、以下に記載するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片;
配列番号:11の重鎖可変領域と配列番号:13の軽鎖可変領域。 - 請求項3に記載の抗体が結合するBST2Dタンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
- モノクローナル抗体である請求項4に記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
- 細胞表面にヒトBST2D抗原を発現している細胞に対してCDC活性を有することを特徴とする請求項1から7のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
- 細胞表面にヒトBST2D抗原を発現している細胞に対してADCC活性を有することを特徴とする請求項1から8のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
- 該抗体または断片がヒトBST2D抗原を発現している骨髄腫細胞移植マウスモデルに対して抗腫瘍効果を有する、請求項1から9のいずれかに記載の抗体または断片。
- 請求項4に記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項4に記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項12に記載のベクターを発現可能に保持した形質転換細胞。
- 請求項13に記載の形質転換細胞を培養し、その培養物から抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、を回収する工程を含む請求項4に記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、の製造方法。
- 請求項2に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
- 受託番号FERM BP-10964として寄託されたハイブリドーマBST2#4LD。
- 請求項16に記載のハイブリドーマを培養し、培養物から抗体を採取する工程を含む抗体の製造方法。
- ヒトBST2D抗原を発現している組織の増殖に起因する疾患に対する治療剤であって、請求項10に記載の抗体または断片を有効成分として含む治療剤。
- 請求項10に記載の抗体または断片を有効成分として含む、ヒトBST2D抗原を発現している腫瘍に対する治療剤。
- 腫瘍が、骨髄に存在する細胞から派生した腫瘍であることを特徴とする請求項19に記載の治療剤。
- 骨髄に存在する細胞から派生した腫瘍が、骨髄腫であることを特徴とする請求項20に記載の治療剤。
- 骨髄腫が、多発性骨髄腫であることを特徴とする請求項21に記載の治療剤。
- 請求項1に記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を含む、ヒトBST2D抗原を発現している組織を検出する診断薬。
- 請求項1に記載の抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を含む、ヒトBST2D抗原を発現している腫瘍を検出するための診断薬。
- 腫瘍が、骨髄に存在する細胞から派生した腫瘍であることを特徴とする請求項24に記載の診断薬。
- 骨髄に存在する細胞から派生した腫瘍が、骨髄腫であることを特徴とする請求項25に記載の診断薬。
- 骨髄腫が、多発性骨髄腫であることを特徴とする請求項26に記載の診断薬。
- 請求項10に記載の抗体または断片の、ヒトBST2D抗原を発現している腫瘍の治療のための医薬組成物の製造における使用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009538149A JP5558825B2 (ja) | 2007-10-16 | 2008-10-16 | 抗bst2抗体 |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007269470 | 2007-10-16 | ||
JP2007269470 | 2007-10-16 | ||
PCT/JP2008/068794 WO2009051201A1 (ja) | 2007-10-16 | 2008-10-16 | 抗bst2抗体 |
JP2009538149A JP5558825B2 (ja) | 2007-10-16 | 2008-10-16 | 抗bst2抗体 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2009051201A1 JPWO2009051201A1 (ja) | 2011-03-03 |
JP5558825B2 true JP5558825B2 (ja) | 2014-07-23 |
Family
ID=40567462
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009538149A Expired - Fee Related JP5558825B2 (ja) | 2007-10-16 | 2008-10-16 | 抗bst2抗体 |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US8529896B2 (ja) |
EP (1) | EP2210939A4 (ja) |
JP (1) | JP5558825B2 (ja) |
KR (1) | KR20100090258A (ja) |
CN (2) | CN104031150A (ja) |
AU (1) | AU2008312858A1 (ja) |
BR (1) | BRPI0817427A8 (ja) |
CA (1) | CA2702939A1 (ja) |
HK (1) | HK1153502A1 (ja) |
IL (1) | IL205073A (ja) |
MX (1) | MX2010004251A (ja) |
NZ (1) | NZ585394A (ja) |
RU (1) | RU2010119450A (ja) |
UA (1) | UA105760C2 (ja) |
WO (1) | WO2009051201A1 (ja) |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8771693B2 (en) | 2009-10-27 | 2014-07-08 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Methods and compositions for the generation and use of conformation-specific antibodies |
US10485780B2 (en) | 2011-03-14 | 2019-11-26 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Methods and compositions for the treatment of proliferative disorders |
US10487114B2 (en) | 2011-04-27 | 2019-11-26 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Methods for administering peptides for the generation of effective c/s conformation-specific antibodies to a human subject in need thereof |
WO2012162698A1 (en) | 2011-05-26 | 2012-11-29 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Methods and compositions for the treatment of immune disorders |
AU2013271378A1 (en) | 2012-06-07 | 2014-12-18 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Methods and compositions for the inhibition of Pin1 |
US20150299315A1 (en) * | 2012-10-22 | 2015-10-22 | Becton, Dickinson And Company | Non-b-lineage cells capable of producing antibody |
AU2014240063B2 (en) * | 2013-03-15 | 2019-04-11 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Methods and compositions for the generation and use of conformation-specific antibodies |
WO2016011265A2 (en) | 2014-07-17 | 2016-01-21 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Biomarkers for pin1-associated disorders |
US9968579B2 (en) | 2014-07-17 | 2018-05-15 | Beth Isreal Deaconess Medical Center, Inc. | ATRA for modulating Pin1 activity and stability |
KR102524920B1 (ko) | 2014-07-22 | 2023-04-25 | 아폴로믹스 인코포레이티드 | 항-pd-1 항체 |
EP3177649B1 (en) | 2014-08-05 | 2024-02-28 | Apollomics Inc. | Anti-pd-l1 antibodies |
WO2016145186A1 (en) | 2015-03-12 | 2016-09-15 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Enhanced atra-related compounds for the treatment of proliferative diseases, autoimmune diseases, and addiction conditions |
CN107619443B (zh) * | 2016-07-14 | 2020-08-14 | 深圳宾德生物技术有限公司 | 抗人和鼠cd317的单克隆抗体及其制备方法和应用 |
EP4168029A1 (en) * | 2020-06-19 | 2023-04-26 | Board of Regents, The University of Texas System | Anti-bst2 antibodies targeting bst2 long isoform |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002057316A1 (fr) * | 2000-12-28 | 2002-07-25 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Nouvel anticorps monoclonal |
WO2002064159A1 (en) * | 2001-02-07 | 2002-08-22 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Remedies for tumor in hematopoietic organs |
WO2002084290A1 (fr) * | 2001-04-13 | 2002-10-24 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Procede permettant de quantifier l'expression d'antigenes |
WO2005034994A1 (ja) * | 2003-10-10 | 2005-04-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 固形腫瘍治療剤 |
WO2006013923A1 (ja) * | 2004-08-05 | 2006-02-09 | Ginkgo Biomedical Research Institute Co., Ltd. | 自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤 |
WO2006054748A1 (ja) * | 2004-11-22 | 2006-05-26 | Ginkgo Biomedical Research Institute Co., Ltd. | 腎炎の治療剤 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US305121A (en) * | 1884-09-16 | Razor-strop | ||
TW474991B (en) * | 1993-10-15 | 2002-02-01 | Toshio Hirano | Membrane protein polypeptide having function of pre-B cell proliferation and the encoded gene thereof |
ATE297219T1 (de) | 1997-02-12 | 2005-06-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Antikörper als arzneimittel gegen lymphocytische tumore (ausschliesslich myelome) |
WO1999043803A1 (fr) | 1998-02-25 | 1999-09-02 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Gene codant pour la proteine antigenique hm1.24 et son promoteur |
CA2570602A1 (en) | 2004-06-11 | 2006-01-26 | Ginkgo Biomedical Research Institute Co., Ltd. | Agents for regulating the activity of interferon-producing cells |
US20080299128A1 (en) | 2006-06-20 | 2008-12-04 | Myung Kim | Effect of Bst2 on inflammation |
-
2008
- 2008-10-16 CN CN201410162825.3A patent/CN104031150A/zh active Pending
- 2008-10-16 RU RU2010119450/10A patent/RU2010119450A/ru unknown
- 2008-10-16 NZ NZ585394A patent/NZ585394A/en not_active IP Right Cessation
- 2008-10-16 UA UAA201005531A patent/UA105760C2/uk unknown
- 2008-10-16 US US12/738,285 patent/US8529896B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-10-16 AU AU2008312858A patent/AU2008312858A1/en not_active Abandoned
- 2008-10-16 CN CN200880122043.XA patent/CN101952426B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2008-10-16 EP EP08838804A patent/EP2210939A4/en not_active Withdrawn
- 2008-10-16 WO PCT/JP2008/068794 patent/WO2009051201A1/ja active Application Filing
- 2008-10-16 BR BRPI0817427A patent/BRPI0817427A8/pt not_active IP Right Cessation
- 2008-10-16 MX MX2010004251A patent/MX2010004251A/es active IP Right Grant
- 2008-10-16 CA CA2702939A patent/CA2702939A1/en not_active Abandoned
- 2008-10-16 KR KR1020107010635A patent/KR20100090258A/ko not_active Application Discontinuation
- 2008-10-16 JP JP2009538149A patent/JP5558825B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-04-14 IL IL205073A patent/IL205073A/en not_active IP Right Cessation
-
2011
- 2011-07-18 HK HK11107441.7A patent/HK1153502A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2013
- 2013-08-22 US US13/973,930 patent/US20130336967A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002057316A1 (fr) * | 2000-12-28 | 2002-07-25 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Nouvel anticorps monoclonal |
WO2002064159A1 (en) * | 2001-02-07 | 2002-08-22 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Remedies for tumor in hematopoietic organs |
WO2002084290A1 (fr) * | 2001-04-13 | 2002-10-24 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Procede permettant de quantifier l'expression d'antigenes |
WO2005034994A1 (ja) * | 2003-10-10 | 2005-04-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 固形腫瘍治療剤 |
WO2006013923A1 (ja) * | 2004-08-05 | 2006-02-09 | Ginkgo Biomedical Research Institute Co., Ltd. | 自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤 |
WO2006054748A1 (ja) * | 2004-11-22 | 2006-05-26 | Ginkgo Biomedical Research Institute Co., Ltd. | 腎炎の治療剤 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101952426A (zh) | 2011-01-19 |
AU2008312858A1 (en) | 2009-04-23 |
IL205073A (en) | 2014-07-31 |
BRPI0817427A8 (pt) | 2019-01-29 |
MX2010004251A (es) | 2010-08-30 |
US8529896B2 (en) | 2013-09-10 |
UA105760C2 (uk) | 2014-06-25 |
KR20100090258A (ko) | 2010-08-13 |
US20100278832A1 (en) | 2010-11-04 |
WO2009051201A1 (ja) | 2009-04-23 |
CN104031150A (zh) | 2014-09-10 |
EP2210939A1 (en) | 2010-07-28 |
EP2210939A4 (en) | 2012-08-08 |
BRPI0817427A2 (pt) | 2015-06-16 |
IL205073A0 (en) | 2010-11-30 |
US20130336967A1 (en) | 2013-12-19 |
NZ585394A (en) | 2012-05-25 |
CA2702939A1 (en) | 2009-04-23 |
JPWO2009051201A1 (ja) | 2011-03-03 |
RU2010119450A (ru) | 2011-11-27 |
CN101952426B (zh) | 2014-04-16 |
HK1153502A1 (en) | 2012-03-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5558825B2 (ja) | 抗bst2抗体 | |
JP5918540B2 (ja) | 抗dll3抗体 | |
US20170204179A1 (en) | Anti-ilt7 antibody | |
AU2008321840B2 (en) | Diagnosis and treatment of cancer using anti-GPR49 antibody | |
JP6104794B2 (ja) | 抗itm2a抗体を用いる癌の診断および治療 | |
EP2374883A1 (en) | Anti-cd4 antibody | |
KR20170017916A (ko) | 면역 억제 기능을 갖는 세포에 대한 t 세포 리다이렉트 항원 결합 분자 | |
TR201807750T4 (tr) | Anti-TIM-3 antikoru. | |
US20200157231A1 (en) | Diagnosis and treatment of cancer using anti-lgr7 antibody | |
WO2011105573A1 (ja) | 抗icam3抗体およびその用途 | |
CN114206929A (zh) | 一种抗tigit免疫抑制剂及应用 | |
JP7317148B2 (ja) | 抗cd47抗体およびその使用 | |
US20240026017A1 (en) | Anti-human ccr1 monoclonal antibody | |
JP5746018B2 (ja) | 抗tmprss11e抗体を用いた癌の診断と治療 | |
MX2011006895A (es) | Pasta de papel de fibra mejorada. | |
WO2020253785A1 (en) | Anti-cd47 antibodies and uses thereof | |
CN107810191B (zh) | Aml抗原及其用途 | |
AU2014201680A1 (en) | Diagnosis and treatment of cancer using anti-GPR49 antibody |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110801 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20110801 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130821 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131021 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20140512 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140605 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5558825 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |