KR20100090258A

KR20100090258A - 항ｂｓｔ2 항체

Info

Publication number: KR20100090258A
Application number: KR1020107010635A
Authority: KR
Inventors: 유미꼬 가모가와; 사호리 나미끼; 민권 조; 고지 이시다
Original assignee: 에스비아이 바이오테크 가부시키가이샤; 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2007-10-16
Filing date: 2008-10-16
Publication date: 2010-08-13
Also published as: NZ585394A; EP2210939A1; CA2702939A1; HK1153502A1; IL205073A0; BRPI0817427A2; UA105760C2; US8529896B2; RU2010119450A; EP2210939A4; IL205073A; CN101952426B; AU2008312858A1; JPWO2009051201A1; MX2010004251A; WO2009051201A1; CN101952426A; JP5558825B2; CN104031150A; US20100278832A1

Abstract

본 발명에서는 BST2 항체와 인간 BST2 항원의 각종 스플라이싱 변이체와의 결합성을 지표로 하여 BST2 항체를 선별하였다. 그 결과, 암 세포에 고발현하고 있는 것이 보고되어 있는 BST2D를 특이적으로 인식하는 BST2 항체를 얻는 것에 성공하였다. 본 발명의 항체는 BST2D 발현 세포에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 항체를 치료에 이용함으로써, 항체의 혈중 농도의 저하의 원인이 되는, 표적 조직 이외에의 비특이적인 결합을 방지할 수 있다. 또는, 본 발명의 항체에 의해서 BST2D 발현 조직을 특이적으로 검출하는 진단제가 제공된다.

Description

항ＢＳＴ2 항체{ANTI-BST2 ANTIBODY}

본 발명은 인간 BST2 항원과 결합하는 항체와 그 용도에 관한 것이다.

BST2는 골수종을 비롯한 각종 암 세포에 고발현하는 막관통 당단백질인 것이 알려져 있다(비특허문헌 1 내지 4). 지금까지 BST2 항원에는 여러 종류의 스플라이싱 변이체(splicing variant)의 존재가 보고(특허문헌 1, 특허문헌 5)되어 있다. 이들 중에서도 BST2D는 종양에 고발현하고 있는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 1). 또한, 항BST2 단일클론 항체는 세포 표면에 발현하고 있는 BST(분자종으로서는 BST2D에 상당)와 결합함으로써 해당 세포에 대하여 세포 상해 활성을 갖는 것도 알려져 있다(비특허문헌 2). 그리고, 이 원리를 이용하여, 생체 내의 종양 세포를 표적으로 한 항종양제를 개발하는 것이 시도되고 있다. 예를 들면 인간 골수종 세포 이식 마우스 모델에 있어서, 종양의 축소·치유를 기대할 수 있는 우수한 항종양 효과가 얻어지고 있다(비특허문헌 3, 4).

WO1999/043803 WO1998/035698 WO2002/064159 WO2005/034994 WO2006/008886 WO2006/013923

Goto T. et al, Blood 84(6): 1922-30, 1994 Ohtomo T. et al. Biochem Biophys Res Commun.; 258(3): 583-91, 1999 Ozaki S. et al. Blood 90(8): 3179-86, 1997 Koishihara Y. et al. Blood 92(s): 107, 1998

지금까지 인간 BST2 항원에는 다음과 같은 여러 종류의 스플라이싱 변이체의 존재가 보고되어 있다.

염기 서열 아미노산 서열 아미노산 서열의 길이

인간 BST2D 서열 번호: 1 서열 번호: 2 (180)

인간 BST2H 서열 번호: 20 서열 번호: 21 (158)

인간 BST2HS 서열 번호: 22 서열 번호: 23 (100)

이들 스플라이싱 변이체 중, 인간 BST2D를 인식하는 항체가 골수종 등의 일부의 종양의 치료에 이용하는 시도가 보고되어 있다. 예를 들면, 항BST2 단일클론 항체인 「HM1.24 항체」는 골수종에 대한 치료 효과가 확인된 대표적인 단일클론 항체이다. 「HM1.24 항체」는 인간 골수종 세포를 면역원으로 하여 수립된 단일클론 항체이다. 그 후의 에피토프 해석에 의해 「HM1.24 항체」는 서열 번호: 2로 표시되는 인간 BST2D의, 아미노산 번호 116 내지 127(서열 번호: 24)를 인식하는 것이 확인되어 있다. 그런데 이 영역은 인간 BST2H에 공통되는 아미노산 서열로 이루어져 있다(도 1).

이러한 항원 인식 특성을 갖는 항체는 BST2H를 발현하는 세포나 조직에도 결합할 가능성이 있다. 즉, 예를 들면 진단에 있어서는, 인간 BST2D를 발현하는 종양에 추가로, BST2H를 발현하는 세포가 검출될 우려가 있다. 또는, 치료에 있어서도, BST2H를 발현하는 세포에도 항체가 결합하는 점으로부터, 항체의 혈중 농도가 저하되기 쉬울 가능성이 있다. 본 발명은 이 과제를 해결하고자 하는 것이다. 즉, 인간 BST2D에 특이적으로 결합하는 항체와, 그의 용도를 제공하는 것이 본 발명의 과제이다.

본 발명자들은 HM1.24 항체가 인간에 투여 시에 인간 생체 내의 종양외조직에 비특이적으로 흡착함으로써 HM1.24 항체의 혈중 농도 저하를 초래한다고 생각하고, HM1.24 항체가 인식하고 있는 에피토프 이외의 배열을 인식하는 항체를 발견하는 것을 시도하여, 예의 검토를 행하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명자들은 BST2 항체와 인간 BST2 항원의 각종 스플라이싱 변이체와의 결합성을 지표로 하여 BST2 항체를 선별하고, 치료 및 진단 목적 외 조직에 대한 비특이적 흡착을 억제한, 특이적인 항BST2 항체를 얻는 것에 성공하였다. 해당 항체를 이용함으로써 투여 후의 혈중 농도의 저하를 방지하여, 종래보다도 적은 항체 투여량으로 목적하는 치료 효과를 얻거나, 또는 해당 치료 효과를 유효하게 예측할 수 있는 진단을 가능하게 하는 효과를 얻는 것을 기대할 수 있는 것이다.

즉, 본 발명은 이하와 같은 항인간 BST2 항체, 그의 제조 방법 및 그의 용도에 관한 것이다.

〔1〕인간 BST2D 항원에 결합하고, 또한 인간 BST2H 항원과는 실질적으로 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 항인간 BST2 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.

〔2〕서열 번호: 3에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 인식하는 것을 특징으로 하는 〔1〕에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.

〔3〕서열 번호: 3 중의 전부 또는 적어도 5개 이상의 연속하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 면역원으로서 제조한 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.

〔4〕〔1〕 내지 〔3〕 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 BST2D 단백질의 에피토프와 동일 에피토프에 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.

〔5〕단일클론 항체인 〔1〕 내지 〔4〕 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.

〔6〕수탁 번호 FERM AP-21303으로서 기탁된 하이브리도마 BST2#4LD가 생산하는 단일클론 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.

〔7〕중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역에서, 이하의 아미노산 서열을 CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 포함하는 〔1〕에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편;

중쇄 가변 영역의 CDR1: SGYYWN(서열 번호: 4);

중쇄 가변 영역의 CDR2: YISYDGSNNYNPSLKNR(서열 번호: 5); 및

중쇄 가변 영역의 CDR3: ILGRGY(서열 번호: 6);

경쇄 가변 영역의 CDR1: RASQSVSTSSYSYMH(서열 번호: 7);

경쇄 가변 영역의 CDR2: YASNLES(서열 번호: 8); 및

경쇄 가변 영역의 CDR3: QHSWEIPYT(서열 번호: 9).

〔8〕중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로서, 이하에 기재하는 아미노산 서열을 포함하는, 〔1〕에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편;

서열 번호: 11의 중쇄 가변 영역과 서열 번호: 13의 경쇄 가변 영역.

〔9〕다음의 (A) 또는 (B) 중 어느 하나에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, (A) 또는 (B) 중 어느 하나에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편;

(A) 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역에서, 이하의 아미노산 서열을 CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 포함하는 항체;

중쇄 가변 영역의 CDR1: SGYYWN(서열 번호: 4);

중쇄 가변 영역의 CDR2: YISYDGSNNYNPSLKNR(서열 번호: 5); 및

중쇄 가변 영역의 CDR3: ILGRGY(서열 번호: 6);

경쇄 가변 영역의 CDR1: RASQSVSTSSYSYMH(서열 번호: 7);

경쇄 가변 영역의 CDR2: YASNLES(서열 번호: 8); 및

경쇄 가변 영역의 CDR3: QHSWEIPYT(서열 번호: 9), 또는

(B) 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로서, 이하에 기재하는 아미노산 서열을 포함하는 항체;

〔10〕〔7〕 내지 〔9〕 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 BST2D 단백질의 에피토프와 동일 에피토프에 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.

〔11〕단일클론 항체인 〔7〕 내지 〔10〕 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.

〔12〕세포 표면에 인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 세포에 대하여 CDC 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 〔1〕 내지 〔11〕 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.

〔13〕세포 표면에 인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 세포에 대하여 ADCC 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 〔1〕 내지 〔11〕 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.

〔14〕〔7〕 내지 〔9〕 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.

〔15〕〔7〕 내지 〔9〕 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.

〔16〕〔15〕에 기재된 벡터를 발현 가능하게 유지시키는 형질 전환 세포.

〔17〕〔16〕에 기재된 형질 전환 세포를 배양하고, 그 배양물로부터 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 회수하는 공정을 포함하는 〔7〕 내지 〔9〕 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편의 제조 방법.

〔18〕〔1〕 내지 〔5〕 중 어느 하나에 기재된 항체를 생산하는 하이브리도마.

〔19〕수탁 번호 FERM AP-21303으로서 기탁된 하이브리도마 BST2#4LD.

〔20〕〔19〕에 기재된 하이브리도마를 배양하고, 배양물로부터 항체를 채취하는 공정을 포함하는 항체의 제조 방법.

〔21〕다음 공정을 포함하는, 항인간 BST2D 특이 항체의 제조 방법;

(1) 항인간 BST2D 항체를 인간 BST2H 및 인간 BST2HS 중 어느 하나, 또는 양쪽과 접촉시키는 공정;, 및

(2) 이하의 i 및 ii 중 어느 하나, 또는 양쪽의 반응 특성을 갖는 항인간 BST2D 항체를 항인간 BST2D 특이 항체로서 회수하는 공정;

i. 인간 BST2H에 결합하지 않는 항체, 및

ii. 인간 BST2HS에 결합하지 않는 항체.

〔22〕다음 공정을 포함하는 항인간 BST2D 특이 항체의 제조 방법;

(1) 서열 번호: 3의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 3의 아미노산 서열로부터 선택된 적어도 5개 이상의 연속하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 비인간 동물에게 면역화하는 공정, 및

(2) (1)의 비인간 동물로부터 항체를 회수하거나, 또는 항체 생산 세포를 회수하여 상기 항체 생산 세포가 생산하는 항체를 회수하는 공정.

〔23〕인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 조직의 증식에 기인하는 질환에 대한 치료제로서, 〔1〕 내지 〔13〕 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 유효 성분으로서 포함하는 치료제.

〔24〕〔1〕 내지 〔13〕 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 유효 성분으로서 포함하는, 인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 종양에 대한 치료제.

〔25〕종양이 골수 세포로부터 파생한 종양인 것을 특징으로 하는 〔24〕에 기재된 치료제.

〔26〕골수 세포로부터 파생한 종양이 골수종인 것을 특징으로 하는 〔25〕에 기재된 치료제.

〔27〕골수종이 다발성 골수종인 것을 특징으로 하는 〔26〕에 기재된 치료제.

〔28〕〔1〕 내지 〔13〕 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 포함하는, 인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 조직을 검출하는 진단약.

〔29〕〔1〕 내지 〔13〕 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 포함하는, 인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 종양을 검출하기 위한 진단약.

〔30〕종양이 골수 세포로부터 파생한 종양인 것을 특징으로 하는 〔29〕에 기재된 진단약.

〔31〕골수 세포로부터 파생한 종양이 골수종인 것을 특징으로 하는 〔30〕에 기재된 진단약.

〔32〕골수종이 다발성 골수종인 것을 특징으로 하는 〔31〕에 기재된 진단약.

〔33〕〔1〕 내지 〔13〕 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 투여하는 공정을 포함하는, 인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 종양의 치료 방법.

〔34〕〔1〕 내지 〔13〕 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편의, 인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 종양의 치료를 위한 의약 조성물의 제조에서의 용도.

또는 본 발명은 〔1〕 내지 〔13〕 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편의, 인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 종양의 치료에 있어서의 용도에 관한 것이다. 또한 본 발명은 〔1〕 내지 〔13〕 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편의, 인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 종양을 치료하기 위한 의약 조성물의 제조에서의 용도에 관한 것이다. 또한 본 발명은 〔1〕 내지 〔13〕 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 환자에게 투여하는 공정을 포함하는, 인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 종양을 치료하기 위한 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 〔1〕 내지 〔13〕 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편의, 인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 종양의 진단에 있어서의 용도에 관한 것이다. 또는 본 발명은 〔1〕 내지 〔13〕 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편의, 인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 종양을 진단하기 위한 진단제의 제조에서의 용도에 관한 것이다. 또한 본 발명은 〔1〕 내지 〔13〕 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 환자에게 투여하는 공정을 포함하는, 인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 종양을 생체 내에서 검출하기 위한 방법을 제공한다.

추가로 본 발명은 〔1〕 내지 〔13〕 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편과, 약학적으로 허용되는 담체를 배합하는 공정을 포함하는, 인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 종양을 치료하기 위한 의약 조성물의 제조 방법을 제공한다. 또는 본 발명은 〔1〕 내지 〔13〕 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 약학적으로 허용되는 담체를 배합하는 공정을 포함하는, 인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 종양을 생체 내에서 검출하기 위한 진단제의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의해 항인간 BST2D 특이 항체가 제공된다. 본 발명의 항체는 인간 BST2의 복수의 변이체 중, 인간 BST2D를 발현하는 세포에 특이적으로 결합한다. 인간에게는 BST2H 등의 스플라이싱 변이체가 알려져 있지만, 본 발명의 항체는 인간 BST2H 발현 세포에는 실질적으로 결합하지 않는다. 따라서, 본 발명의 항체를 치료에 이용함으로써 보다 소량의 항체로 치료 효과를 달성할 수 있다. 또는, 진단에 이용한 때에는 골수종 등의 BST2D 발현 세포를 보다 특이적으로 검출할 수 있다.

도 1은 BST2의 스플라이싱 변이체 단백질의 구조를 도시한 도면이다.
도 2는 인간 BST2 항체의 특이성의 검토: 인간 BST2 단백질의 스플라이싱 변이체 BST2(D) 및 BST2(H)를 강제 발현시킨 CHO 세포주를 제조하고, HM1.24, 마우스 #4LD, 마우스 #19LD 항체의 결합을 유세포 분석 기법을 이용하여 측정한 결과를 도시한 도면이다.
도 3은 HM1.24, 마우스 #4LD 항체의 BST2 발현 세포에 대한 CDC 활성을 측정한 결과를 도시한 도면이다.; CDC 활성의 측정은 (BST2(D)-CHO, BST2(H)-CHO, 인간 미엘로마 유래 RPMI8226)를 이용하였다. 래빗 보체를 첨가하고, 항체 농도 0.01-10 μg/mL에서 37℃ 2시간 배양 후 배양액 내에 방출된 LDH량을 측정하여 세포 독성(％)으로 하였다.
도 4는 HM1.24, 마우스 #4LD, 키메라 #4LD, 마우스 #19LD 항체의 BST2 발현 세포에 대한 ADCC 활성을 측정한 결과를 도시한 도면이다.; ADCC 활성의 측정에는, 표적은 BST2(D)-CHO 및 RPMI8226 세포를 이용하였다. 인간 PBMC를 이펙터 세포로 하고 E/T 비율로서 12.5-100까지의 사이에서 세포 살상의 결과 상청에 누출된 LDH량을 측정하여 ADCC 활성(％)으로 하였다. 인간형화 항체 HM1.24(AHM 항체)를 비교를 위해 추가하였다.
도 5는 인간 비장 조직의 동결 세그먼트를 #4LD 항체 또는 #19LD 항체를 이용하여 면역 염색을 행했을 때의 조직 염색상을 나타낸 사진이다.
도 6은 His 태그가 붙은 재조합 인간 BST2 단백질을 #4LD 항체(위) 또는 항His 태그 항체(아래)를 이용하여 검출한 웨스턴 블로팅의 결과를 나타낸 사진이다.
도 7은 RPMI8226 세포주를 이식한 마우스 모델에 있어서, 4LD를 투여했을 때의 종양 부피의 변화를 도시한 도면이다. 화살표는 항체 투여를 나타낸다. 통계 해석은 최종 측정일의 종양 부피를 이용하고, 던네트(Dunnett)형 다중 비교법으로 행하였다. **: P<0.005, *: P<0.05
도 8은 ARH77 세포주를 이식한 마우스 모델에 있어서, 4LD를 투여했을 때의 생존 기간을 도시한 도면이다. 통계 해석은 카플란-메이어 방법 로그순위 검정(Kaplan-Meier method logrank test)으로 행하였다. *: P<0.05

지금까지 보고되어 있는 인간 BST2 항원의 스플라이싱 변이체의 예는 도 1에 도시한 바와 같다. 각 변이체의 아미노산 서열을, 각각 다음 서열 번호에 나타내었다.

염기 서열 아미노산 서열 아미노산 서열의 길이

인간 BST2D 서열 번호: 1 서열 번호: 2 (180)

인간 BST2H 서열 번호: 20 서열 번호: 21 (158)

인간 BST2HS 서열 번호: 22 서열 번호: 23 (100)

본 발명에서 이용하는 단일클론 항체의 제조에 있어서는, 서열 번호: 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 그 단편을 면역원으로서 이용할 수 있다. 본 발명의 단일클론 항체는 서열 번호: 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 항원으로서 인식하고 있는 것이 분명해졌다. 따라서, 이들 단백질을 면역원으로서 이용함으로써 본 발명의 단일클론 항체를 얻을 수 있다.

본 발명의 단일클론 항체는 그 항원 결합 영역을 포함하는 단편일 수도 있다. 항원 결합 영역을 포함하는 단편이란 항체의 항원 결합 부위를 포함하며, 그 항원과의 결합 활성을 유지하고 있는 단편을 말한다. 예를 들면 IgG의 효소적인 소화에 의해서 생성되는, 항원 결합 부위를 포함하는 항체 단편도 본 발명에 있어서의 항체로서 이용할 수 있다. 구체적으로는, 파파인 또는 펩신에 의한 소화에 의해서, Fab 또는 F(ab')₂ 등의 항체 단편을 얻을 수 있다. 이들 항체 단편은 항원과의 결합 친화성을 갖는 항체 분자로서 이용할 수 있는 것이 알려져 있다.

항원 결합 영역을 포함하는 단편은 효소적인 절단뿐만아니라, 유전자 공학적인 수법에 의해서 얻을 수도 있다. 예를 들면, 항원 결합 영역을 코딩하는 유전자를 단리하여 해당 유전자를 발현시킴으로써 항원 결합 영역을 포함하는 항체의 단편을 얻을 수도 있다. 즉 본 발명에 있어서는, 필요한 항원 결합 활성을 유지하고 있는 한, 유전자 재조합에 의해서 구축된 항체를 이용할 수도 있다.

예를 들면 효소적인 소화에 의해서 얻어지는 단편은 효소가 인식하는 특정한 아미노산 서열로 절단되어 있다. 다른 한편, 유전자 공학적인 수법으로 얻어지는 항체 단편은 항체의 임의의 위치에서 단편화할 수 있다. 따라서, Fab 또는 F(ab')₂ 등의 항체 단편과는 다른 위치에서 단편화되어 있는 항체 단편이어도, 그 항원 결합 활성을 유지하는 한, 본 발명에 있어서의 항원 결합 영역을 포함하는 단편에 포함된다. 또한, 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 다시 정상 영역과 접합함으로써 재구성된 항체 분자도 본 발명에 있어서의 항체에 포함된다. 따라서, 유전자 재조합에 의해서 구축된 항체란, 예를 들면 키메라 항체, CDR 이식 항체, 싱글체인 Fv, 디아바디(diabody, diabodies), 선상 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다특이성 항체 등을 나타낼 수 있다. 단일클론 항체, 또는 그것을 생산하는 항체 생산 세포를 바탕으로 이들 항체를 얻는 방법은 공지이다.

강한 이펙터 작용을 나타내는 항체의 서브클래스는 공지이다. 따라서, 본 발명에 기초하는 키메라 항체나 CDR 이식 항체에 있어서는, 정상 영역으로서 이펙터 작용이 우수한 서브클래스를 선택함으로써 그 치료 효과를 높일 수 있다.

서열 번호: 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 재조합체로서 얻을 수 있다. 예를 들면 서열 번호: 1에 기재된 염기 서열은 서열 번호: 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하고 있다. 따라서, 이들 염기 서열로 이루어지는 DNA를 적당한 숙주-벡터를 사용하여 발현시키면 목적으로 하는 단백질을 얻을 수 있다. 또는, 서열 번호: 2에 기재된 아미노산 서열로부터 선택된 연속하는 아미노산 서열로 이루어지는 올리고펩티드를 면역원으로 할 수도 있다. 면역원으로서 선택하여야 할 아미노산 서열은 예를 들면 7 내지 50, 바람직하게는 5 내지 20 정도의 아미노산으로 이루어진다.

본 발명에 있어서, 면역원으로서 특히 바람직한 올리고펩티드는 인간 BST2D 특이적 배열(서열 번호: 3)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 올리고펩티드이다. 인간 BST2D 특이적 배열이란 BST2D 아미노산 서열(서열 번호: 2)에 특징적으로 보이고, 다른 BST2 스플라이싱 변이체, 구체적으로는 BST2H 아미노산 서열(서열 번호: 21)이나 BST2HS 아미노산 서열(서열 번호: 23)에는 보이지 않는 아미노산 서열이다. 보다 구체적으로는, 서열 번호: 3에 기재된 아미노산 서열(19 잔기)로부터 선택되는 적어도 5 이상의 연속하는 아미노산 서열을 포함하는 올리고펩티드는 본 발명에 있어서의 인간 BST2D 특이 항체를 얻기 위한 바람직한 면역원이다. 면역원로 하는 펩티드는 BST2D에 특이적인 항체를 유도할 수 있는 것이면 BST2D로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여, 부가적인 아미노산 서열을 더 포함할 수 있다. 즉 본 발명은 다음 공정을 포함하는 항인간 BST2D 특이 항체의 제조 방법에 관한 것이다.

인간 BST2D 특이적 배열(서열 번호: 3)는 클러스탈더블유(ClustalW) 알고리즘(http://www.ebi.ac.uk/clustalW/)을 이용한, BST2D, BST2H, BST2HS 단백질의 아미노산 서열의 멀티플 얼라인먼트에 의해 특정하였다. 성숙 BST2D 단백질의 C 말단의 예측은 프로그램(GPI modification site prediction program)을 이용하였다(1. GPI modification site prediction: http://mendel.imp.ac.at/sat/gpi/gpi_server.html, 2. DGPI: http://129.194.185.165/dgpi/DGPI_demo_en.html), 3. GPI-SOM: http://gpi.unibe.ch/).

임의의 아미노산 서열을 갖는 올리고펩티드를 얻는 방법은 공지이다. 예를 들면, 화학적으로 아미노산을 결합시켜 목적으로 하는 아미노산 서열을 갖는 올리고펩티드를 얻을 수 있다. 또는, 상기 재조합체로서 얻어진 전장 아미노산 서열을 갖는 단백질을 절단함으로써 소정의 아미노산 서열을 갖는 단편을 얻을 수도 있다. 얻어진 올리고펩티드는 적당한 캐리어-단백질과 결합함으로써 보다 면역원성을 높일 수 있다. 캐리어-단백질에는 키홀 림펫 헤모시아닌이나 소혈청 알부민 등이 이용된다.

계속해서 면역원을 적당한 면역 동물에게 면역화한다. 서열 번호: 2에 기재된 단백질, 혹은 그의 부분 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 아쥬반트(adjuvant)와 동시에 면역 동물에게 투여할 수 있다.

또한, 서열 번호: 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 발현 가능하게 유지한 형질 전환 세포를 면역원으로서 이용할 수 있다. 예를 들면 서열 번호: 1에 기재된 염기 서열의 코딩 영역을 구성하는 염기 서열을 포함하는 DNA는 상기 DNA로서 바람직하다. 이들 DNA를 적당한 발현 벡터에 조립하고, 숙주 세포를 형질 전환하면 면역원으로서 유용한 형질 전환 세포를 얻을 수 있다.

면역원로 하기 위한 숙주 세포는 면역 동물과 동일한 종에서 유래되는 세포로 할 수 있다. 동종의 세포를 이용함으로써 외래성의 단백질에 대한 특이적인 면역 응답을 유도할 수 있다. 예를 들면, 면역 동물에게 래트를 이용하는 것이면 래트에서 유래되는 숙주 세포를 사용할 수 있다. 상기 단백질을 포함하는 형질 전환 세포의 분획을 면역원으로서 이용할 수도 있다. 실시예에 기술한 바와 같이, 서열 번호: 2에 기재된 아미노산 서열에는 막관통 도메인이 보였다(도 1의 막관통 영역; transmembrane region). 따라서, 이들 아미노산 서열을 갖는 단백질은 세포막에 발현할 가능성이 있다. 상기 단백질을 발현하는 세포의 세포막 분획을 면역원으로서 이용할 수 있다.

BST2D를 발현하는 세포의 표면에는 도 1에 도시된 바와 같이, BST2D의 세포막 외 영역이 제시되어 있다. 이 영역에는 BST2의 다른 변이체과 공통의 구조도 포함되어 있다. 따라서, BST2D 발현 세포를 면역원에 이용한 경우에는, 다른 변이체에 결합하는 항체도 생산될 가능성은 있다. 그러나, 각 변이체과의 결합 특이성을 지표로 항체를 선택함으로써 목적으로 하는 항체를 얻을 수 있다. 즉 본 발명은 다음 공정을 포함하는 항인간 BST2D 특이 항체의 제조 방법을 제공한다. 항체의 각 변이체에 대한 반응 특이성은 별도 설명하는 것과 같은 방법에 의해서 확인할 수 있다.

(2) 이하의 i 및 ii 중 어느 하나, 또는 양쪽의 반응 특이성을 갖는 항인간 BST2D 항체를 항인간 BST2D 특이 항체로서 회수하는 공정;

i. 인간 BST2H에 결합하지 않는 항체, 및

ii. 인간 BST2HS에 결합하지 않는 항체.

본 발명에 있어서의 면역 동물로서는 모든 비인간 척추 동물을 이용할 수 있다. 단일클론 항체를 얻기 위해서는 하이브리도마로 하기 위한 융합 파트너의 입수가 용이한 동물이 유리하다. 예를 들면, 마우스, 래트, 래빗, 소, 염소 등의 세포에서 유래되는 하이브리도마의 수립이 확립되어 있다. 이들 면역 동물을 본 발명에 사용할 수 있다. 한편 아쥬반트에는 프로인트의 완전 아쥬반트나 프로인트의 불완전 아쥬반트 등이 이용된다.

면역 동물은 3 내지 10일 간격으로 복수회 면역화된다. 1회의 면역에 이용되는 형질 전환 세포의 수는 임의적이다. 통상, 10³ 내지 10⁸, 예를 들면 10⁶의 형질 전환 세포가 면역화된다. 또한 단백질이나 펩티드에 의한 면역에 있어서는, 일반적으로 1 내지 100 μg이 면역화된다. 복수회의 면역을 거친 면역 동물로부터 면역 담당 세포를 회수하고 목적으로 하는 항체를 생산하는 세포를 클로닝함으로써 본 발명의 단일클론 항체를 얻을 수 있다. 면역 담당 세포란 면역 동물에 있어서 항체 생산능을 갖는 세포를 말한다.

면역 담당 세포는 예를 들면 하이브리도마법에 의해서 클로닝할 수 있다. 면역 담당 세포는 1개의 세포가 1 종류의 항체를 생산하고 있다. 따라서, 1개의 세포에서 유래되는 세포 집단을 확립하는 것(즉 클로닝)을 할 수 있으면 단일클론 항체를 얻을 수 있다. 하이브리도마법이란 면역 담당 세포를 적당한 세포주와 융합시켜 불사화(immortalize)한 후에 클로닝하는 방법을 말한다. 하이브리도마법에 유용한 많은 세포주가 알려져 있다. 이들 세포주는 림프구계 세포의 불사화 효율이 우수하고, 또한 세포 융합에 성공한 세포의 선택에 필요한 각종 유전 마커를 갖고 있다. 또한 항체 생산 세포의 취득을 목적으로 하는 경우에는 항체 생산능을 누락한 세포주를 이용할 수도 있다.

예를 들면 마우스미엘로마 P3x63Ag8.653(ATCC CRL-1580)은 마우스나 래트의 세포 융합을 행할 때에 유용한 세포주로서 널리 이용되고 있다. 일반적으로 하이브리도마는 동종의 세포의 융합에 의해서 제조되지만, 근연(近緣)의 이종 사이에서의 헤테로하이브리도마로부터 단일클론 항체를 취득할 수도 있다.

세포 융합의 구체적인 프로토콜은 공지이다. 즉, 면역 동물의 면역 담당 세포를 적당한 융합 파트너와 혼합하여 세포 융합시킨다. 면역 담당 세포에는, 비세포(脾細胞)나 말초혈 B 세포 등이 이용된다. 융합 파트너로서는 먼저 진술한 각종 세포주를 이용할 수 있다. 세포 융합에는 폴리에틸렌글리콜법이나, 전기 융합법이 이용된다.

다음으로, 융합 세포가 갖는 선택 마커에 기초하여 세포 융합에 성공한 세포가 선택된다. 예를 들면 HAT 감수성의 세포주를 세포 융합에 이용한 경우에는, HAT 배지에 있어서 육성하는 세포를 선택함으로써 세포 융합에 성공한 세포가 선택된다. 또한 선택된 세포가 생산하는 항체가 목적으로 하는 반응성을 갖고 있는 것을 확인한다.

각 하이브리도마는 항체의 반응성에 기초하여 스크리닝된다. 즉, 서열 번호: 2로 나타내는 인간 BST2D의, 아미노산 번호 116 내지 127(서열 번호: 24)를 에피토프로서 인식하지 않는 항인간 BST2D 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마가 선택된다. 하이브리도마의 선택에 있어서는 하이브리도마가 생산한 항체가 우선 인간 BST2D 항원과 결합하는 것을 확인하고, 또한 서열 번호: 24에 나타내는 에피토프를 결합 영역으로서 인식하지 않는 것을 확인한다. 본원에 있어서, 「에피토프로서 인식하지 않음」 또는 「에피토프를 결합 영역으로서 인식하지 않음」은 다음과 같이 하여 서열 번호: 24에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 결합 활성을 평가하여 확인할 수 있다.

구체적으로 서열 번호: 24에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 결합 활성을 평가하는 수단으로서는, ELISA법(효소 결합 면역 흡착 검정법), RIA법(방사 면역 측정법), EIA법(효소 면역 측정법), FACS(유세포 분석 기법) 그 밖의 당업자에 주지인 방법으로부터 적절하게 적합한 방법을 사용할 수 있다.

보다 구체적인 예시로서는, BST2H와의 결합성을 갖지 않는 것을 확인하는, 또는 BST2HS와의 결합성을 갖는 것을 확인하는 수단을 들 수 있다. 효소 표지 항체를 사용한 ELISA법을 이용한 해당 수단으로서는, BST2D 또는 BST2H 항원을 적당한 고상으로 결합하여, 항원에 결합하는 단일클론 항체를 면역 동물의 면역 글로불린을 인식하는 표지 항체에 의해서 검출할 수도 있다. 마이크로플레이트의 내벽에 BST2D 또는 BST2H 항원을 결합시키고, ELISA법을 이용하면 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 신속히 스크리닝할 수 있다. 또한 BST2D 항원에 결합하는 단일클론 항체 중에서 적당한 고상으로 결합된 BST2H에 대한 결합성을 상기 와 같이 ELISA법에 의해서 측정함으로써 원하는 결합 활성을 갖는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택할 수 있다.

이상과 같이 하여, 인간 BST2D에 결합하고, 인간 BST2H와는 실질적으로 결합하지 않는 항체를 선택할 수 있다. 본 발명에 있어서 인간 BST2H와는 실질적으로 결합하지 않는 항체란, 보다 구체적으로는, 인간 BST2H 발현 세포와는 실질적으로 결합하지 않는 항체를 말한다. 어떤 항체가 인간 BST2H 발현 세포와는 실질적으로 결합하지 않는 것은, 별도로 설명하는 방법에 의해서 확인할 수 있다.

선택된 하이브리도마는 바람직하게는 추가로 서브클로닝에 의해서, 최종적으로 목적으로 하는 항체의 생산이 확인된 경우에, 본 발명의 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마로서 선택할 수 있다. 항원에 대한 항체의 결합 활성을 측정·평가하는 방법으로서 상기 ELISA법 외에 FACS법 등의 방법도 적절하게 사용할 수 있다. FACS를 이용하는 방법은 특히 완충액 등에 현탁한 세포 표면 상에 발현하고 있는 항원에 대한 항체의 결합을 측정, 평가하는 방법으로서 바람직하다. FACS 법에 이용되는 유세포 분석기로서는 예를 들면 다음과 같은 장치가 알려져 있다.

FACS칸토(Canto)™ II

FACS아리아(Aria)™

FACS어레이(Array)™

FACS밴티지(Vantage)™ SE

FACS칼리버(Calibur)™

(모두 BD 바이오사이언스사의 상품명)

에픽스 알트라 하이퍼소트(EPICS ALTRA HyPerSort)

사이토믹스(Cytomics) FC 500

에픽스(EPICS) XL-MCL ADC 에픽스(EPICS) XL ADC

셀 랩 콴터(Cell Lab Quanta)/셀 랩 콴터 에스시(Cell Lab Quanta SC)

(모두 베크만 쿨터사의 상품명)

BST2 항체의 항원에 대한 결합 활성의 바람직한 측정 방법의 일례로서 다음 방법을 들 수 있다. 우선, BST2D, BST2H, 또는 BST2HS를 발현하는 세포와 반응시킨 피검 항체를 인식하는 FITC 표지한 이차 항체로 염색한다. 다음으로, FACS칼리버(BD사)에 의해 형광 강도와 세포수를 측정한다. 해당 세포에 대한 항체의 결합량은 셀 퀘스트 소프트웨어(CELL QUEST Software, BD사)를 이용하여 해석함으로써 얻어진 형광 강도, 즉 기하 평균의 값에 반영한다. 즉, 해당 기하 평균의 값을 얻음으로써 항체의 결합량에 의해서 표시되는 항체의 결합 활성을 측정할 수 있다.

본 방법에 있어서, 예를 들면 「BST2H 발현 세포에 실질적으로 결합하지 않음」은 이하의 방법에 의해서 판단할 수 있다. 우선, 상기 BST2H 분자를 발현하는 세포에 대하여 결합한 피검 항체를 이차 항체로 염색한다. 예를 들면, 피검 항체가 마우스의 항체이면 FITC 표지한 항마우스 면역 글로불린 항체를 이차 항체로서 이용할 수 있다. 이어서 세포의 형광 강도를 검출한다. 형광 검출에 유세포 분석기로서 FACS칼리버를 이용한 경우, 얻어진 형광 강도는 셀 퀘스트 소프트웨어를 이용하여 해석할 수 있다. 피검 항체 존재 하 및 비존재 하에서의 기하 평균의 값으로부터, 이의 비(ΔGeo-Mean)를 하기의 계산식에 기초하여 산출함으로써 피검 항체의 결합에 의한 형광 강도의 증가 비율을 구할 수 있다.

ΔGeo-Mean=Geo-Mean(피검 항체 존재 하)/Geo-Mean(피검 항체 비존재 하)

해석에 의해서 얻어지는 피검 항체의 BST2H 발현 세포에 대한 결합량이 반영된 기하 평균비값(BST2HΔGeo-Mean값)를 피검 항체의 BST2D 또는 BST2H 발현 세포에 대한 결합량이 반영된 ΔGeo-Mean비값과 비교한다. 대조 항체로서는 HM1.24 항체를 이용할 수 있다.

본 발명에 있어서는, 피검 항체의 BSH2H 발현 세포에 대한 ΔGeo-Mean비값이, 피검 항체의 BST2D 또는 BST2HS 발현 세포에 대한 ΔGeo-Mean비값의 적어도 50％, 바람직하게는 30％, 더욱 바람직하게는 20％, 특히 바람직하게는 10％보다 작으면, 「BST2H 발현 세포에 실질적으로 결합하지 않는」 것으로 한다. Geo-Mean값(기하 평균)을 구하는 계산식은 셀 퀘스트 소프트웨어 유저 가이드(CELL QUEST Software User's Guide, BD 바이오사이언스사)에 기재되어 있다. BST2H 발현 세포에 대한 결합 활성도 동일하게 하여 평가할 수 있다. 공지된 결합 활성의 평가에 이용하는 BST2HS 분자, BST2H 분자, 그리고 BST2D의 각 분자를 발현하는 세포는 모두 공통의 발현 벡터와 숙주 세포를 이용하여 제조하고, 각각의 세포에서의 발현량이 동등 정도인 것이 바람직하다.

본 발명의 단일클론 항체는 BST2D 발현 세포에 결합하고, 또한 BST2H 분자를 발현하는 세포에 대한 결합 활성이 상기 BST2D 발현 세포에 대한 결합 활성보다도 낮은 단일클론 항체를 포함한다. 또는 본 발명의 바람직한 단일클론 항체는 상기 BST2D 발현 세포에 결합하고, 또한 BST2H 분자를 발현하는 세포에 대하여 실질적으로 결합하지 않는 단일클론 항체를 포함한다.

또한 본 발명은 본원 발명에서 개시된 단일클론 항체가 결합하는 에피토프와 동일 에피토프에 결합하는 항체도 또한 제공한다. 즉 본 발명은 본 발명의 단일클론 항체가 인식하는 에피토프와 동일한 에피토프를 인식하는 항체와, 그 용도에 관한 것이다. 예를 들면 본 발명에 있어서의 바람직한 단일클론 항체인 4LD는 서열 번호: 37; EVERLRRENQVLSVR의 아미노산 서열을 에피토프로서 인식한다. 보다 구체적으로는, 서열 번호: 2에 나타내는 인간 BST2D의 전장 아미노산 서열 중의 세포 외 도메인을 구성하는 아미노산 서열(47-180)로부터 선택된 연속하는 아미노산 서열로 구성된 합성 펩티드 중, K(47)---R(147)은 본 발명의 4LD 항체에 의해서 인식되지만, K(47)--V(146)은 동일 조건으로 4LD 항체의 결합을 검출할 수 없다. 또한, E(133)---Q(180)는 본 발명의 4LD 항체에 의해서 인식되지만, V(134)----Q(180)은 동일 조건으로 4LD 항체의 결합을 검출할 수 없다.

따라서, 서열 번호: 37; EVERLRRENQVLSVR로 구성되는 에피토프를 인식하는 단일클론 항체는 본 발명의 단일클론 항체로서 바람직하다. 보다 구체적으로는, 서열 번호: 2에 나타내는 인간 BST2D의 전장 아미노산 서열 중의 세포 외 도메인을 구성하는 아미노산 서열(47-180)로부터 선택된 연속하는 아미노산 서열로 구성된 합성 펩티드 중, K(47)---R(147) 및 E(133)---Q(180)으로 이루어지는 펩티드에는 결합하고, K(47)--V(146) 및 E(133)---Q(180)에의 결합을 동일 조건으로 검출할 수 없는 항체는 본 발명에 있어서의 BST2D 항체로서 바람직하다. 이러한 항체는 예를 들면 이하의 방법에 의해 얻을 수 있다.

피검 항체가 어떤 항체가 결합하는 에피토프와 동일 에피토프에 결합하는 것, 즉 어떤 항체와 에피토프를 공유하는 것은, 양자의 동일 에피토프에 대한 경합에 의해서 확인할 수 있다. 본 발명에 있어서, 항체 간의 경합은 FACS나 교차 블로킹 어세이 등에 의해서 검출할 수 있다. FACS에서는 우선 본 발명의 단일클론 항체를 BST2D 발현 세포에 결합시켜 형광 시그널이 측정된다. 다음으로, 후보 경합 항체를 반응시킨 후에 본 발명의 단일클론 항체를 동일 세포와 반응시키고, 마찬가지로 FACS에 의해 해석한다. 또는, 본 발명의 단일클론 항체와 피검경합 항체를 동시에 동일 세포에 반응시킬 수도 있다. 경합 항체를 반응시켰을 때에 본 발명의 단일클론 항체의 FACS의 해석 패턴이 변화하면 경합 항체가 본 발명의 단일클론 항체와 동일 에피토프를 인식하는 것을 확인할 수 있다.

기타, 예를 들면 경합 ELISA 어세이는 바람직한 교차 블로킹 어세이이다. 구체적으로는, 교차 블로킹 어세이에 있어서는, 마이크로타이터 플레이트의 웰 상에 BST2D를 발현한 세포가 고정된다. 후보 경합 항체의 존재 하, 또는 비존재 하에서 프리인큐베이트한 후에, 본 발명의 단일클론 항체가 첨가된다. 웰 중의 BST2D 발현 세포에 결합한 본 발명의 단일클론 항체의 양은 동일 에피토프에의 결합에 대하여 경합하는 후보 경합 항체(피검 항체)의 결합능과 역상관관계에 있다. 즉 동일 에피토프에 대한 피검 항체의 친화성이 커지면 커질수록 본 발명의 단일클론 항체의 BST2D 단백질 발현 세포를 고정한 웰에의 결합량은 저하된다. 또는 반대로, 동일 에피토프에 대한 피검 항체의 친화성이 커지면 커질수록 피검 항체의 BST2D 단백질 발현 세포를 고정한 웰에의 결합량은 증가한다.

웰에 결합한 항체량은 미리 항체를 표지하여 둠으로써 용이하게 측정할 수 있다. 예를 들면, 비오틴 표지된 항체는 아비딘퍼옥시다아제 콘쥬게이트와 적절한 기질을 사용함으로써 측정할 수 있다. 퍼옥시다아제 등의 효소 표지를 이용한 교차 블로킹 어세이를 특히 경합 ELISA 어세이라고 한다. 항체는 검출 또는 측정이 가능한 다른 표지 물질로 표지할 수 있다. 구체적으로는, 방사 표지 또는 형광 표지 등이 공지이다.

또한 피검 항체가 본 발명의 단일클론 항체와는 상이한 종에서 유래되는 정상 영역을 갖는 경우에는, 웰에 결합한 어느 하나의 항체를 어느 하나의 종에서 유래되는 정상 영역을 특이적으로 인식하는 표지 항체에 의해서 측정할 수도 있다. 또는 동종 유래의 항체이어도 클래스가 상이한 경우에는, 각 클래스를 특이적으로 식별하는 항체에 의해서 웰에 결합한 항체를 측정할 수 있다.

후보의 경합 항체 비존재 하에서 실시되는 대조군 시험에서 얻어지는 결합 활성과 비교하여 후보 항체가 적어도 20％, 바람직하게는 적어도 20 내지 50％, 더욱 바람직하게는 적어도 50％, 본 발명의 단일클론 항체의 결합을 블로킹할 수 있다면, 상기 후보 경합 항체는 본 발명의 단일클론 항체와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하거나, 또는 동일 에피토프에의 결합에 대하여 경합하는 항체이다.

단일클론 항체가 결합하는 에피토프와 동일 에피토프에 결합하는 항체로서는, 예를 들면, 상기 〔4〕 또는 〔10〕에 기재된 항체를 들 수 있다.

또한, 상기 〔4〕 또는 〔10〕에 기재된 항체에는 상술한 바와 같이 1가 항체뿐만아니라, 다가 항체도 포함된다. 본 발명의 다가 항체에는 전부 동일 항원 결합 부위를 갖는 다가 항체, 또는 일부 또는 전부 다른 항원 결합 부위를 갖는 다가 항체가 포함된다.

본 발명의 항체로서는, BST2D를 인식하는 임의의 항체를 이용할 수 있다. 예를 들면 이하 (1) 내지 (5)에 기재된 항체를 바람직한 항체로서 예시할 수 있다. 이들 항체는 예를 들면 전장 항체, 저분자화 항체, 동물 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체일 수도 있다.

(1) 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역에서, 이하의 아미노산 서열을 CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 포함하는 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편;

중쇄 가변 영역의 CDR1: SGYYWN(서열 번호: 4);

중쇄 가변 영역의 CDR2: YISYDGSNNYNPSLKNR(서열 번호: 5); 및

중쇄 가변 영역의 CDR3: ILGRGY(서열 번호: 6);

경쇄 가변 영역의 CDR1: RASQSVSTSSYSYMH(서열 번호: 7);

경쇄 가변 영역의 CDR2: YASNLES(서열 번호: 8); 및

경쇄 가변 영역의 CDR3: QHSWEIPYT(서열 번호: 9).

(2) 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로서, 이하에 기재하는 아미노산 서열을 포함하는, 상기 〔1〕에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편;

(3) (1) 또는 (2) 중 어느 하나에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, (1) 또는 (2) 중 어느 하나에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체;

(4) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 BST2D 단백질의 에피토프와 동일 에피토프에 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편;

(5) 단일클론 항체인 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편;

상기 (3)에 기재된 항체의 바람직한 양태는 CDR에 개변이 생기지 않은 항체이다. 일례로서, 상기 (3)에 기재된 항체 중, 「(1)에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, (1)에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체」의 바람직한 양태는, 「(1)에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖고, (1)에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, CDR1로서 서열 번호: 4에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열 번호: 5에 기재된 아미노산 서열, 및 CDR3으로서 서열 번호: 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄와, CDR1로서 서열 번호: 7에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열 번호: 8에 기재된 아미노산 서열, 및 CDR3으로서 서열 번호: 9에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체」이다. 상기 (3)에 기재된 항체 중, 그 밖의 항체의 바람직한 양태도 마찬가지로 표현할 수 있다.

본 발명에 있어서 「동등한 활성을 갖는 항체」란 「기능적으로 동등한 항체」이다. 「동등한 활성」 또는 「기능적으로 동등」이란, 예를 들면, 항체의 BST2D 또는 BST2H에 대한 결합 활성, 결합 친화성이나 항체의 BST2D 단백질을 발현하고 있는 세포에 대한 CDC 활성(보체 의존성 세포 상해 활성) 또는 ADCC 활성(항체 의존성 세포 개재성 세포 상해 활성) 등이 동등한 것을 의미한다.

폴리펩티드에 변이를 도입하는 방법은 어떤 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 제조하기 위한, 당업자에 잘 알려져 있는 방법의 하나이다. 예를 들면, 당업자이면, 부위 특이적 변이 유발법(Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492, Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) 등을 이용하여, 본 발명의 항체에 적절하게 변이를 도입함으로써 상기 항체와 기능적으로 동등한 항체를 제조할 수 있다. 또한, 아미노산의 변이는 자연계에서도 생길 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 항체의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 변이한 아미노산 서열을 갖고, 상기 항체와 기능적으로 동등한 항체도 또한 본 발명의 항체에 포함된다.

이러한 변이체에 있어서의 변이하는 아미노산수는 통상 50 아미노산 이내이고, 바람직하게는 30 아미노산 이내이고, 더욱 바람직하게는 10 아미노산 이내(예를 들면, 5 아미노산 이내)이다.

변이하는 아미노산 잔기에 있어서는, 아미노산 측쇄의 성질이 보존되어 있는 별도의 아미노산으로 변이되는 것이 바람직하다. 예를 들면 아미노산 측쇄의 성질에 기초하여 다음과 같은 분류가 확립하고 있다.

소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V),

친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T),

지방족 측쇄를 갖는 아미노산(G, A, V, L, I, P),

수산기 함유 측쇄를 갖는 아미노산(S, T, Y),

황 원자 함유 측쇄를 갖는 아미노산(C, M),

카르복실산 및 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산(D, N, E, Q),

염기 함유 측쇄를 갖는 아미노산(R, K, H),

방향족 함유 측쇄를 갖는 아미노산(H, F, Y, W)

(괄호 내는 모두 아미노산의 일 문자 표기를 나타냄)

어떤 아미노산 서열에 대한 1 또는 복수개의 아미노산 잔기의 결실, 부가 및/또는 다른 아미노산에 의한 치환에 의해 수식된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 그의 생물학적 활성을 유지하는 것은 이미 알려져 있다(Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1984) 81, 5662-5666, Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Research(1982) 10, 6487-6500, Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433, Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1982) 79, 6409-6413). 즉, 일반적으로, 어떤 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 서열 중, 각 군에 분류된 아미노산은 서로 치환했을 때에 해당 폴리펩티드의 활성이 유지될 가능성이 높다고 되어 있다. 본 발명에 있어서, 상기 아미노산군의 군 내의 아미노산 사이의 치환을 보존적 치환이라고 한다.

본 발명의 항체로서는 항체 유전자를 적당한 벡터에 조립하고, 이것을 숙주에 도입하고, 유전자 재조합 기술을 이용하여 생산시킨 유전자 재조합형 항체를 사용할 수 있다(예를 들면, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 참조). 구체적으로는 해당 하이브리도마로부터 항체의 항원 결합 영역을 코딩하는 cDNA를 취득하고, 이것을 적당한 발현 벡터에 삽입함으로써 발현시킬 수 있다. 항체의 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 취득하고, 발현 벡터에 조립하고, 다음으로 이 벡터로 적당한 숙주 세포를 형질 전환하여 항체를 발현시키는 기술은 공지이다. 또한 항원 결합 영역을 포함하는 가변 영역을 정상 영역과 결합시킴으로써 키메라 항체로 하는 수법도 공지이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 벡터가 도입된 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 벡터가 도입되는 숙주 세포로서는 특별히 제한은 없고, 예를 들면, 대장균이나 여러가지 동물 세포 등을 이용하는 것이 가능하다. 본 발명의 숙주 세포는, 예를 들면, 본 발명의 항체의 제조나 발현을 위한 생산계로서 사용할 수 있다. 폴리펩티드 제조를 위한 생산계는 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)의 생산계가 있다. 시험관 내의 생산계로서는 진핵 세포를 사용하는 생산계나 원핵 세포를 사용하는 생산계를 들 수 있다.

진핵 세포를 사용하는 경우, 예를 들면, 동물 세포, 식물 세포, 진균 세포를 숙주에 사용할 수 있다. 동물 세포로서는 포유류 세포, 예를 들면, CHO(J. Exp. Med. (1995) 108, 945), COS, NIH3T3, 미엘로마, BHK(baby hamster kidney), HeLa, Vero, 양서류 세포, 예를 들면 아프리카 발톱 개구리 난모 세포(Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340), 또는 곤충 세포, 예를 들면, Sf9, Sf21, Tn5이 알려져 있다. CHO 세포로서는, 특히, DHFR 유전자를 결손한 CHO 세포인 dhfr-CHO(Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1980) 77, 4216-4220)나 CHO K-1(Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1968) 60, 1275)를 바람직하게 사용할 수 있다. 동물 세포에 있어서, 대량 발현을 목적으로 하는 경우에는 특히 CHO 세포가 바람직하다. 숙주 세포에의 벡터의 도입은 예를 들면 인산칼슘법, DEAE 덱스트란법, 카티오닉 리포솜 DOTAP(베링거 맨하임사 제조)를 이용한 방법, 엘렉트로포레이션법, 리포펙션 등의 방법으로 행하는 것이 가능하다.

진균 세포로서는, 효모, 예를 들면, 사카로미세스(Saccharomyces)속, 예를 들면, 사카로미세스·세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 사상균, 예를 들면, 아스퍼질러스(Aspergillus)속, 예를 들면, 아스퍼질러스·니거(Aspergillus niger)가 알려져 있다.

원핵 세포를 사용하는 경우, 세균 세포를 이용하는 생산계가 있다. 세균 세포로서는 대장균(E. coli), 예를 들면, JM109, DH5α, HB101 등을 들 수 있으며, 기타, 고초균이 알려져 있다.

이들 세포를 목적으로 하는 폴리뉴클레오티드에 의해 형질 전환하고, 형질 전환된 세포를 시험관 내에서 배양함으로써 항체가 얻어진다. 배양은 공지된 방법에 따라서 행할 수 있다. 예를 들면, 동물 세포의 배양액으로서, 예를 들면, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM을 사용할 수 있다. 그 때, 소태아 혈청(FCS) 등의 혈청 보액을 병용할 수도 있고, 무혈청 배양할 수도 있다. 배양 시의 pH는 약 6 내지 8인 것이 바람직하다. 배양은, 통상, 약 30 내지 40℃에서 약 15 내지 200시간 행하고, 필요에 따라서 배지의 교환, 통기, 교반을 가한다.

이에 따라 얻어진 본 발명의 항체는 숙주 세포 내 또는 세포 외(배지 등)으로부터 단리하여, 실질적으로 순수하고 균일한 항체로서 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는 통상의 항체의 정제에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법을 사용하면 되고, 전혀 한정되지 않는다. 예를 들면, 크로마토그래피 칼럼, 필터, 초여과, 염석, 용매 침전, 용매 추출, 증류, 면역 침강, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동, 등전점 전기 영동법, 투석, 재결정 등을 적절하게 선택, 조합하면 항체를 분리, 정제할 수 있다.

크로마토그래피로서는, 예를 들면 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). 이들 크로마토그래피는 액상 크로마토그래피, 예를 들면 HPLC, FPLC 등의 액상 크로마토그래피를 이용하여 행할 수 있다. 친화성 크로마토그래피에 이용하는 칼럼으로서는, 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼을 들 수 있다. 예를 들면, 프로테인 A를 이용한 칼럼으로서, 하이퍼 디(Hyper D), 포로스(POROS), 세파로스(Sepharose) F. F. (Pharmacia) 등을 들 수 있다. 본 발명은 이들 정제 방법을 이용하여 고도로 정제된 항체도 포함한다.

또한, 단일클론 항체의 항원 결합 영역을 다른 면역 글로불린에 이식할 수도 있다. 면역 글로불린의 항원 결합 영역은 상보성 결정 영역(CDR)과, 프레임 영역으로 구성되어 있다. 각 면역 글로불린의 항원 결합 특성은 CDR에 의해서 결정되어 있고, 프레임은 항원 결합 영역의 구조를 유지하고 있다. CDR의 아미노산 서열이 매우 다양성이 풍부한 데 비하여, 프레임 부분의 아미노산 서열은 고도로 보존되어 있다. CDR을 구성하는 아미노산 서열을 다른 면역 글로불린 분자의 프레임 영역에 조립함으로써 항원 결합 특성도 이식할 수 있는 것이 알려져 있다. 이 방법을 이용하여 이종의 면역 글로불린이 갖는 항원 결합 특성을 인간·면역 글로불린에 제공하는 방법이 확립되어 있다.

이와 같이 하여 제조된 단일클론 항체는 모두 본 발명에 이용할 수 있다. 즉, 해당 단일클론 항체의 항원 결합 영역을 코딩하는 cDNA에서 유래되는 폴리뉴클레오티드에 의해서 코딩된 항원 결합 영역을 포함하는 면역 글로불린으로 이루어지는 단일클론 항체를 본 발명에 이용할 수 있다.

본 발명에 이용할 수가 있는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마로서, 예를 들면, 하이브리도마 #4LD, #3LD, #9LD를 나타낼 수 있다. 하이브리도마 #4LD는 2007년 6월 6일부로 도꾸리쯔 교우세이 호우진 산교 기쥬쯔 소우고우 겐뀨쇼 내 특허 생물 기탁 센터에 대하여, 수탁 번호 FERM AP-21303으로서 기탁되고, 또한 부다페스트 조약에 기초하는 국제 기탁으로서 수탁 번호 FERM BP-10964가 주어졌다. 이하에 기탁을 특정하는 내용을 기재한다.

(a) 기탁 기관의 명칭·주소

명칭: 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터

주소: 일본 이바라끼껜 쯔구바시 히가시 1쪼메 1반 1고 쭈오 다이6(우편 번호 305-8566)

(b) 기탁일: 2007년 6월 6일

(c) 수탁 번호: FERM BP-10964(하이브리도마 #4LD)

본 발명에 이용하기 위한 단일클론 항체는 그것을 생산하는 하이브리도마를 배양하고 그 배양물로부터 회수할 수 있다. 하이브리도마는 시험관 내 또는 생체 내에서 배양할 수 있다. 시험관 내에서는, RPMI1640 등의 공지된 배지를 이용하여 하이브리도마를 배양할 수 있다. 배양 상청에는 해당 하이브리도마가 분비한 면역 글로불린이 축적된다. 따라서, 배양 상청을 채취하고, 필요에 따라서 정제함으로써 본 발명의 단일클론 항체를 얻을 수 있다. 배지에는 혈청을 첨가하지 않은 쪽이 면역 글로불린의 정제가 용이하다. 그러나, 하이브리도마의 보다 신속한 증식과, 항체 생산의 촉진을 목적으로 하여, 10％ 정도의 소태아 혈청을 배지에 가할 수도 있다.

하이브리도마는 생체 내에서 배양할 수도 있다. 구체적으로는, 누드 마우스의 복강에 하이브리도마를 접종함으로써 복강 내에서 하이브리도마를 배양할 수 있다. 단일클론 항체는 복수 중에 축적된다. 따라서, 복수를 채취하고, 필요에 따라서 정제하면 필요한 단일클론 항체를 얻을 수 있다. 얻어진 단일클론 항체는 목적에 따라서 적절하게 수식, 또는 가공할 수 있다.

키메라 항체로 하여도 상관없고, 단일클론 항체로 하여도 상관없다.

본 발명에 있어서, BST2D를 특이적으로 인식하는 단일클론 항체로서는, 서열 번호: 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 인식하고, 서열 번호: 21에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 인식하지 않은 단일클론 항체를 이용할 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들면, 어떤 조건 하에서 서열 번호: 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드에 결합하고, 동일 조건 하에서 서열 번호: 21에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드에 대한 결합을 검출할 수 없는 항체를 선택함으로써 얻을 수 있다. 보다 구체적으로는, 예를 들면, 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 21의 아미노산 서열 코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환한 세포에 대한 항체의 결합 특성을 비교함으로써, 목적으로 하는 항체를 선택할 수 있다. 형질 전환 세포에 대한 항체의 결합 특성을 비교하기 위해서 FACS 등의 공지된 방법을 이용할 수 있다.

BST2D를 특이적으로 인식하는 항체를 그 항체가 유래하는 생물종과는 다른 숙주에 투여하는 경우에는, 해당 숙주에 있어서 이물이라고 인식되기 어려운 형태로 가공하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체, 예를 들면, 키메라(chimeric) 항체, 인간화(humanized) 항체 등을 들 수 있다. 이들 개변 항체는 기지의 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 키메라 항체는 인간 이외의 포유 동물, 예를 들면, 마우스 항체의 중쇄, 경쇄의 가변 영역과 인간 항체의 중쇄, 경쇄의 정상 영역으로 이루어지는 항체이고, 마우스 항체의 가변 영역을 코딩하는 DNA를 인간 항체의 정상 영역을 코딩하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현 벡터에 조립하여 숙주에게 도입하여 생산시킴으로써 얻을 수 있다.

인간화 항체는 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 칭해지고, 인간 이외의 포유 동물, 예를 들면 마우스 항체의 상보성 결정 영역(CDR; complementarity determining region)를 인간 항체의 상보성 결정 영역에 이식한 것이고, 그 일반적인 유전자 재조합 수법도 알려져 있다. 다음과 같은 분자로 가공함으로써 면역 글로불린을 이물로서 인식되기 어렵게 할 수 있다. 면역 글로불린 분자를 이하와 같이 가공하는 수법은 공지이다.

- 정상 영역을 결실한 항원 결합 영역을 포함하는 단편(Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, third edition, Academic Press Limited. 1995; Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)

- 단일클론 항체의 항원 결합 영역과 숙주의 면역 글로불린의 정상 영역으로 구성되는 키메라 항체(유전자 발현 실험 메뉴얼 고단샤 1994년(이시다 이사오, 안도 타미에 편)

- 숙주의 면역 글로불린에 있어서의 상보성 결정 영역(CDR)을 단일클론 항체의 CDR로 치환한 CDR 치환 항체(유전자 발현 실험 메뉴얼 고단샤 1994년(이시다 이사오, 안도 타미에 편)

또한, 인간에 대한 이종 항원성이 없는 인간 항체의 취득 방법도 알려져 있다. 예를 들면 인간 항체 유전자를 조립한 비인간 동물을 면역 동물로서 이용함으로써 비인간 동물을 이용하면서, 인간 항체를 얻을 수 있다. 보다 구체적으로는, 예를 들면, 인간 항체 유전자를 조립한 트랜스제닉 마우스가 인간 항체를 제조하기 위한 면역 동물로서 실용화되어 있다(Ishida et al., Cloning and Stem Cells, 4: 85-95, 2002). 이러한 동물을 이용함으로써, 인간의 BST2를 항원으로 하여 BST2를 인식하는 인간 항체를 얻을 수 있다. 인간 항체는 인간에게 투여하는 항체로서 바람직한 항체이다.

또는, 인간 항체 라이브러리를 이용하여 패닝에 의해 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 즉 파지 디스플레이법(McCafferty J. et al., Nature 348: 552-554, 1990; Kretzschmar T et.al., Curr Opin Biotechnol. 2002 Dec; 13(6): 598-602.)에 의해서, 인간의 면역 글로불린 가변 영역 유전자를 취득할 수도 있다. 파지 디스플레이법에 있어서는, 인간 면역 글로불린 가변 영역을 코딩하는 유전자가 파지 유전자에게 삽입된다. 여러가지 면역 글로불린 유전자를 소스로 하여 파지 라이브러리를 제조할 수도 있다. 파지는 자신을 구성하는 단백질의 융합 단백질로서, 해당 가변 영역을 발현한다. 파지에 의해서 발현된 파지 표면의 가변 영역은 항원과의 결합 활성을 유지하고 있다. 따라서, 항원 또는 항원을 발현한 세포 등에 결합하는 파지를 선택함으로써 파지 라이브러리로부터 목적으로 하는 결합 활성을 갖는 가변 영역을 발현한 파지를 스크리닝할 수 있다. 또한, 이렇게 해서 선택된 파지 입자의 중에는 목적으로 하는 결합 활성을 갖는 가변 영역을 코딩하는 유전자가 보유되어 있다. 즉, 파지 디스플레이법에 있어서는, 가변 영역의 결합 활성을 지표로 하여 목적으로 하는 결합 활성을 갖는 가변 영역을 코딩하고 있는 유전자를 취득할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항체는 바람직하게는 세포 상해 활성을 갖는 항체이다.

본 발명에 있어서의 세포 상해 활성으로서는, 예를 들면 항체 의존성 세포 개재성 세포 상해(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC) 활성, 보체 의존성 세포 상해(complement-dependent cytotoxicity: CDC) 활성 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, CDC 활성이란 보체계에 의한 세포 상해 활성을 의미한다. 한편 ADCC 활성이란 표적 세포의 세포 표면 항원에 특이적 항체가 부착되었을 때, 그 Fc 부분에 Fcγ 수용체 보유 세포(면역 세포 등)이 Fcγ 수용체를 통해 결합하여 표적 세포에 상해를 제공하는 활성을 의미한다.

항BST2D 항체가 ADCC 활성을 갖는지 여부, 또는 CDC 활성을 갖는지 여부는 공지된 방법에 의해 측정할 수가 있다(예를 들면, 문헌[Current protocols in Immunology, Chapter7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.,(1993)] 등).

구체적으로는, 우선, 이펙터 세포, 보체 용액, 표적 세포의 제조가 실시된다.

(1) 이펙터 세포〔인간 말초 단핵 세포〕의 제조

건강한 인간 도너로부터 얻은 말초혈로부터 피콜법을 이용하여 단리한 말초 단핵 세포를 이용한다.

(2) 보체 용액의 제조

베이비 래빗 콤플리먼트(Baby Rabbit Complement, CEDARLANE사 제조)를 CDC 메디움으로 희석하고, 최종 보체 농도를 6％로서 사용할 수 있다.

(3) 표적 세포의 제조

BST2D 단백질 또는 BST2H 단백질이 발현된 CHO 세포나 인간 미엘로마 유래 RPMI8226 세포 등과 같은 BST2 단백질이 발현된 세포를 표적 세포로서 이용할 수 있다.

BST2 단백질을 발현하는 세포로서는, BST2 단백질을 코딩하는 유전자로 형질 전환된 세포, 각종 종양 세포 등을 이용할 수 있다.

CDC 활성, 또는 ADCC 활성은 하기에 진술하는 방법에 의해 측정할 수 있다.

CDC 활성의 측정의 경우에는 96웰 U 바닥 플레이트에 표적 세포와, 항BST2 항체를 50 μl씩 가하고, 그 후, 보체 용액 50 μl를 가하고, 탄산 가스 인큐베이터 내에서 37℃에서 2시간 배양한다. 항체의 최종농도는 0.01 μg/ml, 0.1 μg/ml, 1 μg/ml 또는 10 μg/ml로 한다. 배양 후, 배양 상청을 회수하고, 배양 상청 중의 LDH량을 사이토톡스(CytoTox)96(등록상표) 어세이(PROMEGA사)에 의해 측정하고, 「보체 활성에 의해서 표적 세포로부터 누출한 LDH량(실험 샘플; Experimental Sample)」으로 한다.

CDC 활성은 이하와 같은 대조군을 설정하여 검정을 행한다.

(1) 실험구에서의 LDH 방출량(표적 세포에 대한 보체의 상해 작용)

(2) 표적 세포의 자연 LDH 방출량

(3) 표적 세포로부터의 최대 LDH 방출량

(4) 용해 용액(Lysis Solution)의 첨가에 의한 용량 보정용 대조군

(5) 배양액 만의 백그라운드(블랭크)

(1), (2), (3)에서 얻어진 각각의 흡광치의 평균치로부터 (5)의 블랭크의 평균치를 뺀다. 그리고 이하의 계산식에 따라서 CDC 활성을 산출한다.

CDC 활성(％)=(실험구에서의 방출량-표적 자연 방출량)/(표적 최대 방출량-표적 용량 보정 대조군-표적 자연 방출량)×100

ADCC 활성 측정의 경우에는, 96웰 U 바닥 플레이트에 표적 세포(BST2(D)-CHO세포, 인간 미엘로마 유래 RPMI8226주)(4X10⁵/ml)를 50 ml씩 분주한다. 항BST2 항체 용액을 최종 농도 10 μg/mL가 되도록 가하고 4℃ 30분 인큐베이트하고, 이펙터 세포(PBMC)를 표적 세포의 12.5, 25, 50, 100배 가하고 37℃ 4시간 배양한다. 세포 상청의 LDH량을 측정하여 세포 상해 활성에 의해 표적 세포로부터 누출된 LDH량을 측정한다(실험 샘플). ADCC 활성을 CDC 활성의 측정과 동일한 대조군을 설정하여 검정을 행한다.

본 발명에 의한 BST2D 특이 항체를 투여함으로써 BST2D를 발현하고 있는 각종 종양을 치료 또는 예방할 수 있다. 즉 본 발명은 BST2D에 결합하고, BST2H에는 실질적으로 결합하지 않는 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 환자에게 투여하는 공정을 포함하는, 인간 BST2D를 발현하고 있는 종양을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 의해서 치료할 수가 있는 혈액 종양으로서 다음과 같은 종양을 나타낼 수 있다. 또한 혈액 종양은 조혈기 종양을 포함한다.

백혈병(leukemia),

골수 이형성 증후군(myelodysplastic syndrome; MDS),

악성 림프종(malignant lymphoma),

만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia),

형질 세포 이상증(plasma cell dyscrasia),

골수 증식성 질환(myeloproliferative disorder)

상기한 혈액 종양 중, 형질 세포 이상증은 골수종(myeloma), 다발성 골수종(multiple myeloma), 매크로글로불린 혈증(macroglobulinemia)을 포함한다. 또한, 골수 증식성 질환에는 진성 적혈구 증가증(primary polycythemia), 본태성 혈소판 혈증(essential thrombocythemia), 특발성 골수선유증(agnogenic myeloid metaplasia) 등이 포함된다. 이들 혈액 종양 중, 치료의 대상으로서 바람직한 것은, 골수종, 보다 구체적으로는, 다발성 골수종이다. 또한, 본 발명의 항체는 생체 내에서 치료 및 진단 목적 외 조직에의 비특이적 흡착을 발생시키지 않고, 특이적으로 치료 및 진단 목적의 세포에 결합하는 것이 가능하다고 생각되기 때문에, 생체에 투여할 때는 특히 유효하다고 생각된다.

본 발명자들은 본 발명의 항체가 CDC 활성 및 ADCC 활성을 갖는 것을 발견하였다. 이 지견에 기초하여 본 발명의 항체를 유효 성분으로서 함유하는 종양 치료제를 제공한다. 또한, 치료 또는 예방을 목적으로 하여 본 발명에 의한 항체를 이용할 때에는 필요에 따라서 항체를 수식할 수도 있다. 본 발명에 따르면 인간 BST2D의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 항체는 BST2D를 발현하는 세포에 대하여 세포 장해 작용을 갖는다. 또는, 항체를 세포 장해 물질(cytotoxic agent)에 의해서 수식함으로써 BST2D를 발현하는 세포에 대한 장해 작용을 더욱 증강할 수 있다. 세포 장해 물질로서는, 이하와 같은 물질을 나타낼 수 있다.

톡신류: 녹농균 독소(Pseudomonas Endotoxin; PE), 디프테리아 톡신, 리신

방사성 동위원소: ⁹⁹ ^mTc, ⁸⁹Sr, ¹³¹I, ⁹⁰Y

항암제: 칼리키아마이신, 마이토마이신, 파클리탁셀

단백질로 이루어지는 톡신류는 2관능성 시약에 의해서 항체 또는 그의 단편 등에 결합할 수 있다. 또는, 항체를 코딩하는 유전자에 톡신류를 코딩하는 유전자를 접합하고, 양자의 융합 단백질을 얻을 수도 있다. 방사성 동위원소를 항체에 결합하는 방법도 공지되어 있다. 예를 들면, 킬레이트제를 이용하여 항체를 방사성 동위원소로 표지하는 방법이 공지되어 있다. 또한 항암제는 당쇄 또는 2관능성 시약 등의 이용에 의해 항체에 결합할 수 있다.

본 발명은 본 발명의 항체를 유효 성분으로서 함유하는 종양 치료제를 제공한다. 본 발명의 항체는 CDC 활성 및 ADCC 활성을 갖기 때문에, 암 등의 종양(특히 혈액 종양)의 치료나 예방에 특히 유효하다고 생각된다.

본 발명의 항체를 치료제로서 이용하는 경우에는, 예를 들면, 본 항체의 용액 제제를 단독으로 또는 다른 치료제와의 병용하여, 정맥 내 또는 피하 등에 투여하는 형태가 생각된다. 병용에 이용되는 치료제로서는, 예를 들면, 다발성 골수종의 치료에 이용되는 공지된 치료제를 조합할 수 있다. 예를 들면 다음과 같은 치료제가 골수종의 치료에 이용되고 있다.

보르테조밉 탈리도마이드 레날리도마이드

멜팔란 덱사메타존 빈크리스틴

독소루비신 인터페론α 리툭시맙

또한, 골수종의 치료제에 추가로 항체의 작용을 증강하기 위한 치료제를 병용할 수도 있다. 예를 들면, 이펙터 작용을 높이는 약제로서 면역 증강제를 본 발명의 항체와 동시에 투여할 수 있다. 구체적으로는, 인터페론-γ, 인터루킨-2, 인터루킨-12 등과 함께 항체를 투여함으로써, 항체의 이펙터 기능의 증강 작용을 기대할 수 있다. 또는, CpG 올리고뉴클레오티드 등을 포함하는 Toll형 수용체 아고니스트에도 면역 증강 작용을 기대할 수 있다.

본 발명에 의한 종양의 치료제에 있어서, BST2D를 특이적으로 인식하는 항체 또는 그 단편, 또는 그의 적어도 항원 결합 영역을 포함하는 항체는 단백질로서, 또는 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서 투여할 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 투여하기 위해서는 목적으로 하는 단백질을 발현할 수 있도록, 적당한 주최자의 제어 하에서 목적으로 하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 배치한 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 벡터에는 인핸서나 터미네이터를 배치할 수도 있다. 면역 글로불린을 구성하는 중쇄와 경쇄의 유전자를 보유하여 면역 글로불린 분자를 발현할 수가 있는 벡터가 공지되어 있다.

면역 글로불린을 발현할 수가 있는 벡터는 세포에 도입함으로써 투여할 수 있다. 생체에의 투여에 있어서는, 생체에의 투여에 의해서 세포에 감염시킬 수 있는 것은 그대로 투여할 수 있다. 또는, 일단 생체로부터 분리한 림프구에 벡터를 도입하여 다시 생체에 복귀할 수도 있다(생체 외(ex vivo)).

또한, 면역 글로불린을 발현하는 벡터로서 생체에 투여하는 경우에는, 중쇄와 경쇄를 별도의 플라스미드로서 코트랜스펙트하는 것으로 하고, 체중 1 kg당 각 플라스미드를 0.1 내지 10 mg, 예를 들면 1 내지 5 mg을 투여할 수 있다. 또한 시험관 내에서 세포에 도입하기 위해서는 1 내지 5 μg/10⁶ cell의 벡터가 이용된다.

본 발명의 치료제는 의약품의 형태로 투여하는 것이 가능하고, 경구적 또는 비경구적으로 전신 또는 국소적으로 투여할 수 있다. 예를 들면, 점적 등의 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 복강 내 주사, 피하 주사, 좌약, 주장(注腸), 경구성 장용제 등을 선택할 수가 있고, 환자의 연령, 증상에 따라 적절하게 투여 방법을 선택할 수 있다. 생체에 투여되는 치료제의 양은 단일클론 항체의 양으로 하면, 면역 글로불린으로서 체중 1 kg당, 통상 0.5 mg 내지 100 mg, 예를 들면 1 mg 내지 50 mg, 바람직하게는 2 mg 내지 10 mg이다. 생체에의 항체의 투여 간격은 치료 기간 안의 생체 내에서의 면역 글로불린의 유효 농도를 유지할 수 있도록 적절하게 조절할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 1 내지 2주간 간격으로 투여할 수 있다.

투여 경로는 임의이다. 당업자는 치료에 있어서 효과적인 투여 경로를 적절하게 선택할 수 있다. 구체적으로는, 경구적으로 또는 비경구적인 투여를 나타낼 수 있다. 예를 들면, 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 복강 내 주사, 또는 피하 주사 등에 의해 전신 또는 국소에 항체를 투여할 수 있다. 본 발명에 있어서의 비경구투여에 적당한 제제로서 주사제, 좌제, 분무제 등을 들 수 있다. 또한 세포에 제공하는 경우에는, 배양액 내에 통상 1 μg/mL, 바람직하게는 10 μg/mL 이상, 보다 바람직하게는 50 μg/mL 이상, 더욱 바람직하게는 0.5 mg/mL 이상의 면역 글로불린을 제공한다.

본 발명에 있어서의 종양 치료제는 임의의 방법에 의해 생체에 투여할 수 있다. 통상 단일클론 항체는 약학적으로 허용되는 담체와 배합되어 치료제로서 사용된다. 본 발명의 치료제에는 필요에 따라서 증점제, 안정제, 방부제 및 가용화제 등의 첨가제를 배합할 수 있다. 이러한 담체 또는 첨가제로서는 락토오스, 시트르산, 스테아르산, 스테아르산마그네슘, 수크로오스, 전분, 탈크, 젤라틴, 한천, 식물유, 에틸렌글리콜 등을 들 수 있다.

「약학적으로 허용된다」라는 용어는 각국 정부의 감독 당국에 의해 승인되어 있거나, 또는 각국의 약전 또는 일반적으로 인지되어 있는 약전에 동물, 포유 동물, 및 특히 인간에 대한 사용에 대해서 기재되어 있는 것을 말한다. 본 발명의 치료제는 1회 또는 복수회의 용량의 동결 건조 분말 또는 정제의 형태로 공급할 수도 있다. 동결 건조 분말 또는 정제에는 또한 투여 전에 상기 조성물을 원하는 농도가 되도록 용해하기 위한 주사용의 멸균 완료된 물, 생리적 식염수 또는 완충액을 조합할 수도 있다.

본 발명에 의해서 제공된 인간 BST2D를 특이적으로 인식하는 항체는 인간 BST2D를 발현하는 세포의 검출에 이용할 수 있다. 예를 들면, 인간으로부터 채취된 조직이나, 생체 중에서 인간 BST2D 발현 세포를 검출함으로써, BST2D 발현 세포에 기인하는 질환을 진단할 수 있다. 즉 본 발명은 본 발명의 인간 BST2D를 특이적으로 인식하는 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 포함하는, 인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 조직을 검출하는 진단약에 관한 것이다. 또는 본 발명은 본 발명의 인간 BST2D를 특이적으로 인식하는 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편의, 인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 조직을 검출하기 위한 진단약의 제조에서의 사용에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 인간 BST2D를 특이적으로 인식하는 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편의, 인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 조직을 검출하기 위한 진단에 있어서의 사용에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 조직이란 예를 들면 인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 종양을 나타낼 수 있다. 골수 세포로부터 파생한 종양, 보다 구체적으로는, 골수종에 있어서의 인간 BST2D 항원의 고발현이 확인되어 있다. 본 발명에 있어서, 진단의 대상으로서 특히 바람직한 골수종은 다발성 골수종이다.

본 발명에 있어서, 인간 BST2D를 특이적으로 인식하는 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편은 시험관 내 또는 생체 내에서 진단에 사용할 수 있다. 예를 들면, 환자로부터 채취된 시료를 대상으로서, 시험관 내에서 골수종 등의 인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 세포나 조직을 동정할 수 있다. 이러한 진단에 이용되는 생체 조직으로서는 골수 조직을 들 수 있다. 또는, 인간 BST2D를 특이적으로 인식하는 항체를 환자에게 투여하고, 그 집적을 추적함으로써, 생체 내에서의 인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 세포나 조직의 국재를 분명하게 할 수 있다.

시험관 내에서 항체의 세포나 조직에의 결합을 검출하는 방법은 알려져 있다. 예를 들면, 항체를 형광 색소나 효소로 미리 표지하여 두고, 고정 표본에의 결합을 표지를 지표로 추적할 수 있다. 또는, 아비딘비오틴계를 이용하여 항체를 간접적으로 표지할 수도 있다. 한편, 생체 내에서는 방사성핵종으로 항체를 표지하여, 생체 내에서의 항체의 거동을 추적하는 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 테크네튬 99m(⁹⁹ ^mTc) 등의 방사성핵종으로 표지한 종양 항원을 인식하는 항체로 생체 내의 종양 조직을 진단하기 위한 화상 진단법이 실용화되어 있다. 항체나 그의 항원 결합 부위를 포함하는 단편은 환원에 의해 ⁹⁹ ^mTc로 직접 표지할 수 있다. 생체 내에 투여된 방사성핵종은 신틸레이션 카메라나 싱글 포톤 CT(SPECT) 장치로 영상화할 수 있다. 이러한 방법을 본 발명에 응용하여, 인간 BST2D를 발현하는 종양 조직의 국재를 분명히 할 수 있다. 보다 구체적으로는, 골수종의 원발소나 전이소의 진단에 이용할 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 인간 BST2D를 특이적으로 인식하는 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 ⁹⁹ ^mTc 등으로 표지하고, 해당 표지된 항체 또는 항체 단편을 피험자에게 투여하고 생체 밖으로부터 ⁹⁹ ^mTc의 방사선을 추적함으로써 체 내의 BST2 발현 조직을 검출할 수가 있다(신티그래피). 종양에서의 인간 BST2D 항원의 발현을 확인함으로써 치료 목적으로 본 발명의 인간 BST2D를 특이적으로 인식하는 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편의 투여에 적합한 환자의 선정에 이용할 수도 있다.

본 발명의 단일클론 항체는 인간 BST2D를 발현하는 세포나 조직을 특이적으로 인식한다. 따라서, 시험관 내에서는 골수종 등의 BST2D를 발현하는 세포나 조직을 특이적으로 동정할 수 있다. 또는, 생체 내에서도 마찬가지로 BST2D를 발현하는 조직이나 세포를 선택적으로 검출할 수 있다. BST2에는 BST2H와 같은 골수종 이외의 세포에 있어서의 발현이 확인되는 변이체도 존재한다. 따라서, 특히 생체 내에서는 BST2D 특이적인 항체의 이용에 의해서 백그라운드 노이즈나 비특이적인 시그널을 방지할 수 있다.

또한, 본 명세서에서 인용된 모든 선행 기술 문헌은 참조로서 본 명세서에 도입된다.

이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하는데, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다.

[실시예]

실시예 1 마우스 항인간 BST2 항체 생산 하이브리도마의 제조

A. 면역원의 제조

면역원으로 하는 세포는 이하와 같이 293T 세포에 인간 BST2D 유전자를 도입하여 제조하였다. 100 mm/콜라겐 코팅된 디쉬(IWAKI)의 저면 전체에 미치게 한 opti-MEM(GIBCO) 3 mL에 도입 유전자를 포함하는 발현 벡터 pCDNA3.1-hBST2D 4 μg을 첨가하고, 혼합하였다. 다음으로, 상기 발현 벡터 용액과는 별도로 3 mL의 opti-MEM으로 58 μL의 리포펙타민(Lipofectamine)™ 2000(Invitrogen)를 희석하고, 실온에서 5분간 정치하여 리포펙타민 용액을 제조하였다. 그 후, 상기 발현 벡터 용액이 들어가 있는 디쉬에 리포펙타민 용액을 조용히 첨가하여 혼합하였다. 실온에서 20분간 정치한 후, 10％ FBS(소태아 혈청)을 포함하는 DMEM 배지(SIGMA)로 1×10⁶ cells/mL로 희석한 293T 세포 10 mL를 디쉬에 조용히 첨가하였다. 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 48시간 정치 배양한 후, 피펫팅에 의해 세포를 회수하여, 면역원용 트랜스펙턴트로 하였다.

B. 하이브리도마의 제조

B-1) 면역

인간 BST2D 유전자를 도입한 293T 세포를 면역화하기 전날에 PBS 200 μL와 아쥬반트 200 μL(콤플리트 아쥬반트(FREUND) 미쯔비시 가가꾸 이아트론 RM606-1)을 혼합하여 에멀전으로 한 것을, Balb/c 마우스 암컷(4주령) 4마리의 양발의 뒤에 각 50 μL씩 면역화하였다. 다음날, 2×10⁷개의 세포를 PBS 400 μL에서 현탁시킨 것을 50 μL씩 면역화하였다. 3일 걸러서 2회째, 3회째의 면역을 행하고, 3회째의 면역의 3일 후에 다음과 같이 세포 융합을 행하였다.

B-2) 세포 융합

면역화한 마우스의 양발 림프절로부터 세포를 채취하고, 10％ FBS를 포함하는 RPMI1640 배지(SIGMA)에서 배양한 마우스 미엘로마 세포 P3-X63-Ag8-U1와, 마우스 림프절 유래 세포의 비가 2:1 내지 10:1이 되도록 혼화하고, 원심 분리에 의해 세포를 회수하였다. 얻어진 세포 분획에 RPMI1640 배지에 의해 등량 희석한 PEG4000(MERCK)을 가하여 세포 융합을 행하였다. 세포를 세정한 후, 보조제(supplement)를 포함하는 15％ FBS-HAT 배지 160 mL로 현탁하여 96 구멍 플레이트 16매에 200 μL/웰에서 파종하였다. 3일 후에 배지를 교환하고, 콜로니 형성이 확인된 1 내지 2주간 후에 1차 스크리닝을 행하였다.

C. Cell ELISA법에 의한 하이브리도마의 1차 스크리닝

목적의 항체를 생산하는 하이브리도마의 제일차 스크리닝은 Cell ELISA법을 이용하여 이하와 같이 행하였다. 실시예 1의 A에서 제조한 세포 1×10⁷개를 0.5％ BSA/2 mM EDTA/PBS 10 mL에 현탁하고, Cell ELISA용 플레이트(NUNC 249570 96V NW PS)를 이용하여 웰당 100 μl씩 분주하였다. 2000 rpm으로 2분간 원심하여 상청을 제거한 후, 하이브리도마 배양 상청을 각 웰당 50 μL 첨가하고, 실온에서 30분간 반응시켰다. 세정 조작(0.5％ BSA/2 mM·EDTA/PBS)을 2회 행하고, 세정 후의 웰에 10000배 희석한 퍼옥시다아제 표지 염소 항마우스 IgG 항체(MBL; Code330)를 50 μL 첨가하고, 30분간 반응시켰다. 세정 조작을 3회 행한 후, 발색 용액을 첨가하고, OD 450 nm 내지 620 nm를 측정하여, 양성 반응을 나타내는 웰을 선택하였다.

D. 유세포 분석기(FCM) 해석에 의한 항체의 결합성의 검토

유세포 분석기(FCM) 해석에 의해 하이브리도마 배양 상청의 해석을 행하였다. 실시예 1의 A에서 제조한 세포를 0.5％ BSA/2 mM EDTA/PBS에 현탁하고, 1 샘플당 1×10⁵개로 하여 원심 튜브에 회수한 후, 하이브리도마 배양 상청각 40 μl를 첨가하고, 실온에서 30분간 반응시켰다. 그 후, 0.5％ BSA/2 mM·EDTA/PBS를 1 ml씩 각 튜브에 첨가하고 1200 rpm으로 3분간, 4℃에서 원심한 후에 상청을 버리는 세정 조작을 2회 반복하였다. 세정 후의 튜브에 100배 희석한 FITC 표지 염소 항마우스 IgG 항체(Beckman coulter; IM0819)를 40 μL씩 첨가하고, 실온에서 30분간 반응시켰다. 세정 조작을 2회 행한 후, 유세포 분석기 FC 500(Beckman coulter)을 이용하여 하이브리도마 배양 상청에 포함되는 항체가 인간 BST2D를 특이적으로 인식하는지 어떤지를 해석하였다. FCM의 해석에 있어서 인간 BST2D를 발현하지 않은 293T 세포에는 결합하지 않지만, 발현하고 있는 293T 세포에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하였다. 선택한 하이브리도마를 한외 희석법에 의해 클로닝하여, 마우스 항인간 BST2 항체 생산 하이브리도마 #3LD, #4LD, #7LD, #9LD, #19LD를 취득하였다.

실시예 2 마우스 항인간 BST2 단일클론 항체의 제조와 특이성의 검토

A. 하이브리도마의 배양

실시예 1에서 얻어진 마우스 항인간 BST2 항체 생산 하이브리도마 #3LD, #4LD, #7LD, #9LD, #19LD를 각각 하기 조성의 5％ FBS 첨가 RPMI 배지에서 배양하였다. 배양 온도는 37℃, 배양 시간은 96시간으로 하였다.

5％ FBS 첨가 RPMI 배지:

RPMI1640 배지(Sigma사, 카타로그 번호: R8758)

5％ FBS

0.01 M HEPES

1 mM 피루브산나트륨

2 mM L-글루타민

100 U/mL 페니실린

100 μg/mL 스트렙토마이신

55 μM 2-머캅토에탄올

pH7.2-pH7.4

96시간 배양 후에 각 하이브리도마의 배양 상청을 모아, 원심 분리에 의해 세포 파편을 제거하여 조항체액으로 하였다.

B. 항체의 정제

A에서 얻어진 조항체액을 각각 프로테인 A 친화성 칼럼(r프로테인 A 세파로스 FF, Amershram Pharmacia사, 카타로그 번호: 17-1279-01)로 정제하였다. 정제 조건은 이하와 같다. 칼럼 부속의 설명서에 따라서 흡착 버퍼로서 하기 조성의 PBS(-) 버퍼, 용출 버퍼로서 0.1 M 시트르산나트륨 버퍼(pH3)를 이용하여 친화성 정제하였다. 용출 분획은 1 M Tris-HCl(pH8.0)를 첨가하고 pH7.2 부근으로 조정하였다. 조정된 항체 용액은 투석막(10000 컷트, PIERCE사 제조)를 이용하여 PBS(-)로 치환하여, 정제 마우스 항인간 BST2 단일클론 항체 #3LD, #4LD, #7LD, #9LD, #19LD(이하, 「마우스 #3LD 항체」, 「마우스 #4LD 항체」 등으로 약기함)를 얻었다. 정제 항체의 농도는 280 nm의 흡광도를 측정하고, 1 mg/mL를 1.38 OD로서 산출하였다.

PBS(-) 버퍼:

0.2 g/L 인산이수소일칼륨

0.2 g/L 염화칼륨

8 g/L 염화나트륨

1.15 g/L 무수인산일수소이나트륨

C. 항체의 특이성의 검토

C-1) 표적 세포주(BST2D-CHO 세포주)의 제조

전일에, 6 cmφ 디쉬 1매당 6×10⁵개가 되도록 파종하여 놓은 CHO-K1 세포에 인간 BST2D 유전자를 포함하는 발현 벡터를 이펙틴 트랜스펙션 시약(Effectene Transfection Reagent, QIAGEN사)를 이용하여 도입하고, 800 μg/ml 제오신(Zeocin, invitrogen사) 처리하고, 벡터가 도입된 제오신 내성주를 선택하였다.

도입한 인간 BST2D 발현 벡터: pCDNA3.1-hBST2D 2 μg

그 후 추가로 셀 소터(BD FACS아리아(Becton Dickinson사))를 이용하여, BST2D를 고발현하고 있는 세포주(BST2D-CHO 세포주)를 얻었다. 선택한 세포주는 FCM 해석에 의해서 BST2D를 고발현하고 있는 것을 확인하였다. FCM에 BD FACS칼리버(BD사)를 이용하는 이외에는, FCM 해석의 조작은 실시예 1의 D에 따랐다. 해석용의 항체로서 하기의 항체를 사용하였다.

FCM 해석용 항체: 488-콘쥬게이션화 래트 항인간 BST2-5C11 항체(인간 BST2-5C11 항체는 WO2006/013923에 기재되어 있음)

C-2) 표적 세포주(BST2H-CHO 세포주)의 제조

인간 BST2H 발현 벡터(pCDNA3.1-hBST2H)를 도입하는 이외에는 C-1)과 동일하게 하여 BST2H를 고발현하고 있는 세포주(BST2H-CHO 세포주)를 얻었다. FCM 해석용의 항체로서는 하기의 항체를 사용하였다.

FCM 해석용 항체: 488-콘쥬게이션화 래트 항인간 BST2-3 D3 항체(인간 BST2-3 D3 항체는 수탁 번호: FERM BP-10339의 하이브리도마가 생산하는 항체로서, WO2006/013923에 기재되어 있음)

C-3) 정제 마우스 항인간 BST2 단일클론 항체의 결합 특이성의 검토

C-1)에서 얻어진 BST2D-CHO 세포주 및, C-2)에서 얻어진 BST2H-CHO 세포주를 이용하여, 상기 B에서 얻어진 5종의 정제 마우스 항인간 BST2 단일클론 항체에 대해서 결합 특이성을 검토하였다. 검토는 정법에 따라서 FCM 해석으로 행하였다. FCM 해석의 결과로부터 마우스 #3LD 항체, 마우스 #4LD 항체, 마우스 #9LD 항체는 BST2D-CHO 세포와는 결합하지만, BST2H-CHO 세포와는 결합하지 않는 것이 인정되었다. 다른 한편, 마우스 #7LD 항체, 마우스 #19LD 항체는 BST2D-CHO 세포와도, BST2H-CHO 세포와도 결합하는 항체인 것이 인정되었다. 따라서, 이하의 실험에서는 마우스 #3LD 항체, 마우스 #4LD 항체, 마우스 #9LD 항체는 D형의 BST2에만 결합하는 항체(이하, 「항인간 BST2(D+/H-) 항체」라고 기재함)로서 취급하고, 마우스 #7LD 항체, 마우스 #19LD 항체는, D형·H형의 어느 BST2에도 결합하는 항체(이하, 「항인간 BST2(D+/H+) 항체」라고 기재함)로서 취급하였다. 마우스 #4LD 항체 및 마우스 #19LD 항체의 FCM 해석 결과를 도 2에 예시한다.

C-4) 마우스 항인간 HM1.24 항체의 반응성의 확인

마우스 항인간 BST2 항체인 HM1.24 항체(주가이 세이야꾸사 제조)에 대해서 C-3)의 방법과 동일하게 FCM 해석에 의해 결합 특이성의 확인을 행하였다. FCM 해석 결과를 C-3)의 결과와 함께 도 2에 도시한다. 마우스 항인간 HM1.24 항체도 BST2D-CHO 세포주와 BST2H-CHO 세포주의 양자에 결합하는 항체인 것이 재차 확인되었다.

실시예 3 항인간 BST2(D+/H-) 항체의 CDC 활성 및 ADCC 활성의 측정

A. 항체

실시예 2에서 얻어진 마우스 #4LD 항체를 이용하여, 이하와 같이 CDC 활성을 측정하였다.

B. CDC 활성의 측정

B-1) 표적 세포주

이하의 세포를 표적주로서 사용하였다.

· BST2D-CHO 세포주 : 실시예 2의 C-1)과 동일하게 제조

· BST2H-CHO 세포주 : 실시예 2의 C-2)와 동일하게 제조

인간·미엘로마 유래 RPMI8226 세포주

B-2) 표적 세포와 항인간 BST2(D+/H-) 항체와의 반응

상기 B-1)에 기재된 BST2D-CHO 세포 및 BST2H-CHO 세포를 5 mM EDTA/PBS 용액을 이용하여 각각 회수하고, 하기 조성의 CDC 메디움으로 4×10⁵개/ml가 되도록 현탁하였다. 또한, 인간·미엘로마 유래 RPMI8226 세포도 하기 조성의 CDC 메디움으로 4×10⁵개/ml가 되도록 현탁하였다. 이들 현탁액을 U 바닥 96 구멍 플레이트에 1웰당 50 μl씩 분주하였다.

CDC 메디움:

RPMI1640

0.1％ BSA

100 units/mL 페니실린

100 μg/mL 스트렙토마이신

10 mM Hepes(pH7.6)

2 mM L-글루타민

여기에, 항체의 최종 농도가 0.01 μg/mL, 0.1 μg/mL, 1 μg/mL, 및 10 μg/mL가 되도록 CDC 메디움으로 조정한 50 μl의 항BST2(D+/H-) 항체 용액(마우스 #4LD 항체 용액)을 가하여 혼합하였다. 또한, 최종 보체 농도가 6％가 되도록 50 μl의 하기 조성의 보체 함유 CDC 메디움를 가하여 혼합한 후, 37℃에서 2시간 배양하였다. 이 때, 항BST2(D+/H-) 항체 대신에 마우스 IgG2a를 이용한 것을 동시에 제조하여 대조군로서 이용하였다. 마우스 #4LD 항체의 비교 대상으로서, 항BST(D+/H+) 항체인 HM1.24 항체를 이용한 CDC 활성 측정도 동시에 행하였다.

보체 함유 CDC 메디움:

1 ml 유령(幼令) 토끼 보체(CEDARLANE사 제조, 카타로그 번호: CL3441)

CDC 메디움(상기 참조)

그 후, 현탁액이 들어간 U 바닥 96 구멍 플레이트를 원심 조작(원심 조건: 250 G, 4분간)하여, 세포의 혼입이 없도록 유의하면서 배양 상청을 회수하였다. 이 배양 상청 중의 LDH량을 사이토톡스96(등록상표) 어세이(PROMEGA사)에 의해 측정하여, 「보체 활성에 의해서 표적 세포로부터 누출한 LDH량(실험 샘플)」으로 하였다.

CDC 활성을 구하기 위하여 이하의 파라미터도 준비하였다.

·표적 세포로부터 자연스럽게 방출되는 LDH량(Target Cell Spontaneous LDH Release): 표적 세포 만을 시료와 동일한 용량으로 배양하여, 제조하였다.

·표적 세포가 최대로 방출한 경우의 LDH량(Target Cell Maximum LDH Release): 표적 세포 만을 시료와 동일한 용량으로 배양하고, 상청 회수 60분 전에 최종 농도가 0.8％가 되도록 키트 부속의 트리톤(Triton)X-100 용액을 첨가하여 제조하였다.

·용량 보정용 대조군(Volume Correction Control): 표적 세포가 최대로 방출한 경우의 LDH량을 제조했을 때에 첨가한 트리톤X-100과 동일한 양을 시료와 동일한 용량의 배양액에 가하여 제조하였다. 또한 이하의 CDC 활성(％)을 산출하기 위한 식 중에서는, 용량 보정용 대조군을 용량 대조군(Volume Control)으로 기재하였다.

·배양액의 백그라운드 대조군(Culture Medium Background): 시료와 동일한 용량의 배양액과, 배양액에 보체 함유 CDC 메디엄을 가하여 시료와 동일한 용량으로 한 용액을 제조하였다.

표적 최대(Target Maximum)와 표적 자연(Target Spontaneous)의 흡광도로부터는, 시료와 동일한 용량의 배양액을 차감하고, 실험 샘플의 흡광도로부터는, 배양액에 보체 함유 CDC 메디엄을 가하여 시료와 동일한 용량으로 한 용액을 빼어 보정을 하였다.

CDC 활성은 측정한 각각의 LDH량으로 하기 수학식에 의해 산출하였다.

결과를, 도 3에 도시하였다. 마우스 #4LD 항체(항인간 BST2(D+/H-) 항체)는, BST2(H)-CHO 세포에는 거의 CDC 활성을 나타내지 않지만, 한편 BST2(D)-CHO 세포에는 강한 CDC 활성을 나타내었다.

C. ADCC 활성의 측정

C-1) 표적 세포주와 이펙터 세포

이하의 세포를 표적주로서 사용하였다.

· BST2D-CHO 세포주 : 실시예 2의 C-1)과 동일하게 제조

· 인간·미엘로마 유래 RPMI8226주

이하의 세포를 이펙터 세포로서 사용하였다.

· 인간 말초 단핵 세포: 인간 말초혈로부터 피콜법을 이용하여 단리한 말초 단핵 세포를 이용하였다.

C-2) 표적 세포, 항인간 BST2(D) 항체와 이펙터 세포와의 반응

상기 B-1)에 기재된 BST2D-CHO 세포 및 인간·미엘로마 유래 RPMI8226 세포를, 5 mM EDTA/PBS 용액을 이용하여 각각 회수하여, 하기 조성의 10％ FBS 첨가 RPMI 배지에서 4×10⁵개/ml가 되도록 현탁하였다. 이들 현탁액을 U 바닥 96 구멍 플레이트에 1웰당 50 μl씩 분주하였다.

여기에, 항체의 최종 농도가 10 μg/ml가 되도록, 10％ FBS 첨가 RPMI 배지에서 조정한 50 μl의 항BST2 항체 용액을 가하여 혼합하고, 4℃에서 30분간 배양하였다. 그 후, 이펙터 세포를 표적 세포의 25, 50, 100배가 되도록 제조한 세포 혼합액을 50 μl 가하여 혼합한 후, 그 플레이트를 원심(원심 조건: 250 G, 4분간)하여 표적 세포와 이펙터 세포를 가깝게 하였다. 그로부터 37℃에서 4시간 배양하였다. 항BST2 항체로서는, 마우스 #4LD 항체(항인간 BST2(D+/H-) 항체), 키메라 #4LD 항체(키메라 항인간 BST2(D+/H-) 항체, 실시예 5, 6 참조), HM1.24 마우스 항체, HM1.24 인간화 항체(특허문헌 3: WO2002/064159, 특허문헌 4: WO2005/034994)을 이용하였다. 이 때, 항BST2 항체 대신에 마우스 IgG2a를 이용한 것 샘플을 동시에 제조하여 대조군으로서 이용하였다.

그 후, 현탁액을 원심 분리(원심 조건: 250 G, 4분간)하고, 세포의 혼입이 없도록 유의하면서 상청을 회수하였다. 그 상청 중의 LDH를 정법에 의해 측정하여, 「세포 상해 활성에 의해서 표적 세포로부터 누출한 LDH량(실험 샘플)」으로 하였다.

ADCC 활성을 구하기 위하여, B-2)와 동일한 이하의 파라미터도 준비하였다.

·표적 세포가 최대로 방출한 경우의 LDH량(Target Cell Maximum LDH Release): 표적 세포 만을 시료와 동일한 용량으로 배양하고, 상청 회수 60분 전에 최종 농도가 0.8％가 되도록 키트 부속의 트리톤X-100 용액을 첨가하여 제조하였다.

·이펙터 세포로부터 자연스럽게 방출되는 LDH량(Effector Cell Spontaneous LDH Release): 이펙터 세포 만을 시료와 동일한 용량으로 배양하여, 제조하였다.

·용량 보정용 대조군(Volume Correction Control): 표적 세포가 최대로 방출한 경우의 LDH량을 제조했을 때에 첨가한 트리톤X-100과 동일한 양을, 시료와 동일한 용량의 배양액에 추가로 제조하였다. 또한 이하의 ADCC 활성(％)을 산출하기 위한 식 중에서는 용량 보정용 대조군을 용량 대조군로 기재하였다.

·배양액의 백그라운드 대조군(Culture Medium Background): 시료와 동일한 용량의 배양액을 가하여 제조하였다.

표적 자연, 표적 최대, 이펙터 자연(Effector Spontaneous)과 실험 샘플의 흡광도로부터는 배양액의 백그라운드 대조군을 빼어 보정을 하였다.

ADCC 활성은 하기 수학식에 의해 산출하였다.

결과를, 도 4에 도시하였다. BST2D-CHO 세포에 대하여 마우스 #4LD 항체는 강한 ADCC 활성을 나타내고, 그 강도는 HM1.24 인간화 항체와 거의 동일한 정도였다. 한편 PRMI8266 세포에 대하여 마우스 #4LD 항체는 거의 ADCC 활성을 나타내지 않았지만, 키메라 #4LD 항체는 HM1.24 인간화 항체와 동일한 정도의 강한 ADCC 활성을 나타내는 것을 알 수 있었다.

비교예 1 항인간 BST2(D+/H+) 항체의 CDC 활성

마우스 항인간 HM1.24 항체를 이용하여, 실시예 3과 동일하게 하여 CDC 활성을 측정하였다.

결과를, 실시예 3과 함께 도 3에 도시하였다. 마우스 항인간 HM1.24 항체(항인간 BST2(D+/H+) 항체)는 BST2(H)-CHO 세포와 BST2(D)-CHO 세포의 양쪽의 세포에 동일한 정도의 강한 CDC 활성을 나타내었다. 한편 마우스 항인간 BST2 #4LD 항체(항인간 BST2(D+/H-)는 BST2(D)-CHO 세포에 대하여 특이적으로 CDC 활성을 나타내었지만 BST2(H)-CHO 세포에 대해서는 살상 활성을 나타내지 않았다.

실시예 4 항인간 BST2(D+/H-) 항체와 각종 생체 조직과의 결합성

A. 인간 및 게잡이 원숭이의 말초혈 단핵구 분획(이하, 「PBMC」라고 기재함)과의 결합성

마우스 #4LD 항체를 APC-표지 염소 항마우스 항체로 표지하고, PBMC를 염색하고 정법에 따라서 유세포 분석 기법에 의한 해석을 행하였다. 시약, 장치는 하기의 것을 사용하였다.

플로우 사이토메트리(Flow cytometory, FACS칼리버 etc) [Becton Dickinson]

2차 항체[R-PE-Conjugated Goat Anti-Mouse Immunoglobulin Specific Polyclonal Antibody(Multiple Adsorption); (BD Biosciences: 550589)]

히스토파크(HISTOPAQUE)-1077(SIGMA H8889)

FcR 블로킹 시약 (Milteny Biotec130-059-901)

RPMI1640메디엄 5％FCS/페니실린-스트렙토마이신/L-글루타민

ACK 용해 용액(0.15 M NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0.1 mM Na₂EDTA, pH7.2 내지 7.4)

혈액을 RPMI1640(no FCS)으로 희석하고, 히스토파크-1077에 중층한 후, 1800 rpm으로 20분간 원심 분리하였다. 중간층을 회수하여 RPMI1640메디엄을 가하고, 1800 rpm으로 10분간 원심 분리하였다. 상청을 흡인하고, 세포 펠릿에 ACK 용해 용액 1 ml를 가하여 현탁하고, 얼음 상에 3분간 정치한 후, RPMI1640메디엄을 가하고, 1200 rpm으로 5분간 원심 분리하였다. 상청을 흡인하여 세포 펠릿을 PBMC로 하고, 이것에 RPMI1640메디엄을 가하여 현탁하고, 세포수를 카운트하고 1200 rpm으로 5분간 원심 분리하였다. 20％ FCR 블로킹 시약/1％ FCS/PBS에 PBMC가 5×10⁷ cells/ml가 되도록 조정하여, U 바닥 96 구멍 플레이트에 10 μl(5×10⁵ cells) 넣고, 또한 1 μg/ml의 마우스 #4LD 항체를 25 μl씩 가하고, 4℃에서 차광하여 15분간 정치한 후, 150 μl의 1％ FCS/PBS를 가하고, 2000 rpm으로 2분간 원심 분리하였다. 상청을 버린 후, 1％ FCS/PBS를 가하고, 2000 rpm으로 2분간 원심 분리하고, 상청을 버렸다. 2차 항체를 20 μl씩 가하고, 4℃에서 차광하여 15분간 정치한 후, 150 μl의 1％ FCS/PBS를 가하고, 2000 rpm으로 2분 원심 분리하고, 상청을 버렸다. 150 μl의 1％ FCS/PBS를 가하고, 2000 rpm으로 2분간 원심 분리하고, 상청을 버렸다. 펠릿을 150 μl의 1％ FCS/PBS 용액에 현탁하여 FACS 튜브에 옮기고, 또한 150 μl의 1％ FCS/PBS를 가하여 FACS칼리버로 해석하였다. 또한, 플로우조 소프트웨어(FlowJo software)를 사용하여, PBMC의 염색율(％)을 구하여 표 1에 나타내었다.

B. 인간 비장 조직의 동결 세그먼트에 대한 조직 염색

마우스 #4LD 항체를 중합체 시약(DAKO K5007)으로 표지하여, 정법에 따라서 인간 비장 조직의 동결 세그먼트를 염색하였다. 조직의 현미경 사진을 도 5에 도시하였다. 마우스 #4LD 항체는 인간 비장 조직에 거의 결합하지 않지만, 한편 비교예의 마우스 #19LD 항체는 인간 비장 조직에 잘 결합하고 있었다. 이것으로부터 마우스 #4LD 항체는 #19LD 항체에 비하여 특이성이 높은 것이 나타내어졌다.

C. 미엘로마 유래 RPMI8226 세포와의 결합성

RPMI8226 세포를 마우스 #4LD, 마우스 #19LD, HM1.24 항체 0.01, 0.1, 1, 10 μg/ml의 농도로 염색하고, 그 때의 염색율로부터 프리즘 4 소프트웨어(Prism 4 software)를 사용하여 Kd값(평형 해리 상수)을 산출하였다.

시약, 장치는 이하의 것을 사용하였다.

프리즘 4 소프트웨어[GraphPad Software, Inc.]

· 플로우조 소프트웨어[Tree Star, Inc.]

· 플로우 사이토메트리(FACS칼리버 etc) [Becton Dickinson]

· 2차 항체(mouse Ig-FITC [Fluorescein isothiocyanate-Conjugated Goat Anti-Mouse Immunoglobulin Specific Polyclonal Antibody (Multiple Adsorption); BD Biosciences: 554001], etc)

세포를 회수하여 세포수를 카운트하고, 1％ FCS/PBS으로 세포를 현탁하여, 세포수를 1×10⁶ cells/ml로 하였다. 100 μl(1×10⁵ cells/well)씩 96 웰 v-바닥 플레이트에 넣고, 2000 rpm으로 2분간 원심 분리하고, 상청을 버렸다. 0.01, 0.1, 1, 10 μg/ml의 마우스 #4LD, 마우스 #19LD, HM1.24 항체를 25 μl씩 가하고, 4℃에서 차광하여 15분간 정치한 후, 150 μl의 1％ FCS/PBS를 가하고, 2000 rpm으로 2분간 원심 분리하고, 상청을 버렸다. 1％ FCS/PBS를 가하고, 2000 rpm으로 2분간 원심 분리하고, 상청을 버렸다. 2차 항체를 20 μl씩 가하고, 4℃에서 차광하여 15분간 정치한 후, 150 μl의 1％ FCS/PBS를 가하고, 2000 rpm으로 2분간 원심 분리하고, 상청을 버렸다. 150 μl의 1％ FCS/PBS를 가하고, 2000 rpm으로 2분간 원심 분리하고, 상청을 버렸다. 펠릿을 150 μl의 1％ FCS/PBS 용액에 현탁하여 FACS 튜브에 옮기고, 또한 150 μl의 1％ FCS/PBS로 웰을 공세하고 튜브로 옮겨 FACS칼리버로 해석하였다. 또한, 플로우조 소프트웨어를 사용하여 염색율의 비율을 구하였다. 또한, 그 때의 염색율로부터 프리즘 4 소프트웨어를 사용하여 Kd값을 산정하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다. 마우스 #4LD 항체는 HM1.24 항체와 마우스 #19LD 항체와 비교하여, RPMI8226 세포에 대하여 높은 결합 친화성을 나타내었다.

비교예 2 항인간 BST2(D+/H+) 항체와 각종 생체 조직과의 결합성

마우스 #4LD 항체 대신에 마우스 #19LD 항체 또는 HM1.24 항체를 이용하여, 실시예 4와 동일하게 하였다. 결과를, 실시예 4와 함께, 표 1, 표 2, 및 도 5에 도시하였다.

항인간 BST2(D+/H-) 항체인 마우스 #4LD 항체는 PBMC나 HUVEC와 같은 본 발명에서 치료 표적으로 하지 않는 세포에의 결합은 매우 약하지만, 한편, 미엘로마세포라고 하는 치료 표적이 되는 세포에의 강한 결합이 인정되었다. 따라서, 항인간 BST2 항체로서 항인간 BST2(D+/H-) 항체를 사용한 경우에는, 투여 후의 항체 혈중 농도의 저하를 막아, 치료 목적의 조직에 의해 높은 농도의 항체를 공급하는 것이 가능하다고 추찰된다.

실시예 5 키메라 항 BST2 (D+/H-) 항체( 키메라 #4 LD 항체)의 제조

A.정상 영역의 아이소타입 확인

하이브리도마 배양 상청에 대해서 시판되고 있는 마우스 단일클론 항체 아이소타이핑 키트(mouse monoclonal antibody isotyping kit, Serotec Product사, 카타로그 번호: MMT1)를 이용하여, 생산된 마우스 #4LD 항체의 정상 영역의 아이소타입을 확인하였다. 중쇄 정상 영역은 Igγ2a이고, 경쇄 정상 영역은 Igκ였다.

B. 마우스 #4LD 항체의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 클로닝

B-1) 사용하는 하이브리도마에 대해서

하이브리도마로서 마우스 항인간 BST2D 항체 생산 하이브리도마 #4LD를 사용하였다.

B-2) 총 RNA(total RNA)의 단리

시판되고 있는 키트 「알엔이지 미니 키트(RNeasy Mini Kit)」(Qiagen사, 카타로그 번호: 74106)를 이용하여 키트 첨부의 지시서에 따라서, 상기 A-1)에 나타내는 하이브리도마로부터 총 RNA를 단리하였다. 모두, 1×10⁷개의 하이브리도마로부터 약 200 μg의 총 RNA가 얻어졌다.

B-3) 마우스 중쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 증폭 및 단편화

B-2)에서 단리한 총 RNA 중 5 μg을 사용하여, 5' RACE 법에 의해서, 마우스 중쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 증폭하였다. 증폭에 있어서는, 시판 키트 「5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA ENDs, Version 2.0 Kit」(인비트로겐사, 카타로그 번호: 18374-058)를 이용하였다. 상세는 이하와 같다. 우선, A-2)에서 얻어진 총 RNA에서 역전사 효소에 의해서 제1쇄 cDNA를 합성하였다. 이 때, 안티센스 프라이머(GSP1)는 하기의 것을 이용하였다(서열 번호: 14). 다음으로, RNaseH에서 총 RNA를 분해하고, 1개쇄가 되어 남은 제1쇄 cDNA를 1.5％ 저융점 아가로스법에 의해서 정제하였다. 또한, 제1쇄 cDNA의 3'- 말단에, 터미널 디옥시누클레오티딜 트랜스페라제(TdT)를 이용하여, 뉴클레오티드 단독 중합체인 dC를 부가하였다. 그리고, dC(앵커 배열)에 상보적인 뉴클레오티드 중합체를 3'- 말단에 갖고 있는 앵커 프라이머(서열 번호: 16)와, 하기의 안티센스 프라이머(GSP2)(서열 번호: 15)를 이용하여, PCR법에 의해서 cDNA를 증폭하였다. 또한, 얻어진 PCR 산물을 템플릿으로 하여, AUAP 프라이머(서열 번호: 17)와 안티센스 프라이머(GSP2)(서열 번호: 15)를 이용하고, 네스티드(Nested) PCR법에 의해 cDNA를 증폭하였다. 또한, 이 PCR 산물을 1.5％ 저융점 아가로스법에 의해서 정제하였다.

Mu IgG2aVH5RACE-GSP1 (서열 번호: 14)

5' TCC AGA GTT CCA GGT CAA GGT CAC3' (24-mer)

Mu IgG2aVH5RACE-GSP2 (서열 번호: 15)

5' GCC AGT GGA TAG ACC GAT GG3' (20-mer)

5' RACE용 앵커 프라이머(서열 번호: 16)

5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG-3' (36-mer)

5' RACE용 AUAP 프라이머(서열 번호: 17)

5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3' (20-mer)

B-4) 마우스 경쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 증폭 및 단편화

B-2)에서 단리한 총 RNA로부터, B-3)과 동일하게 하여 마우스 경쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 증폭하였다. 이 때, 안티센스 프라이머는 하기의 것을 사용하였다. 얻어진 PCR 산물을 1.5％ 저융점 아가로스법에 의해서 정제하였다.

Mu IgVL5RACE-GSP1 (서열 번호: 18)

5' TTC ACT GCC ATC AAT CTT CCA CTT3' (24-mer)

Mu IgVL5RACE-GSP2 (서열 번호: 19)

5' GAT GGA TAC AGT TGG TGC AGC3' (21-mer)

B-5) cDNA의 염기 서열의 확인과 CDR 영역의 결정

B-3)에서 얻어진 중쇄 가변 영역, 및 B-4)에서 얻어진 경쇄 가변 영역의 cDNA 단편을 각각 시판 키트 「제로 블런트 토포 피시알 클로닝 키트(Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit)」(인비트로겐사, 카타로그 번호: 1325137)를 이용하여, 키트 첨부의 지시서에 따라서 pCR4Blunt-TOPO 벡터에 클로닝하고, 대장균 컴퍼턴트 세포에 도입하여 대장균 형질 전환체를 얻었다. 이 형질 전환체로부터 상기 플라스미드를 얻고, 플라스미드 중의 cDNA 염기 서열을 자동 DNA 서열 분석기 「피시알 기초 에이비아이 프리즘 3100 제네틱 애널라이저(PCR-based ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer)」(Applied Biosystems사)를 이용하여 확인하였다. 상보성 결정 영역(이하, 「CDR 영역」이라고 기재함) 주변에 프레임 시프트, 난센스 변이 등을 발생시키고 있기 때문에 불활성 RNA가 되었지만 전사물은 제외하여, 옳은 배열의 것을 추출하였다. 또한, 해당 플라스미드 중에 포함되는 cDNA 염기 서열에 대해서, 카배트 데이터 베이스와 상동성을 확인하고, 각각의 가변 영역 내의 CDR 영역과 가변 영역의 배열을 결정하였다.

B-3)에서 얻어진 마우스 #4LD 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 배열은 서열 번호: 10, 아미노산 서열은 서열 번호: 11이다. 마우스 #4LD 항체의 중쇄 가변 영역 내의 CDR1, CDR2, CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6이다.

B-4)에서 얻어진 마우스 #4LD 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 배열은 서열 번호: 12, 아미노산 서열은 서열 번호: 13이다. 마우스 #4LD 항체의 경쇄 가변 영역 내의 CDR1, CDR2, CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9이다.

C. 인간 IgG 정상 영역을 코딩하는 cDNA의 클로닝

인간 인터페론 생산 세포(Interferon Producing cells; IPC)의 cDNA 라이브러리로부터, 인간 IgG1 중쇄 정상 영역과 인간 Ig 카파 경쇄 정상 영역을 선택하고, 각각, 시판 키트 「제로 블런트 토포 피시알 클로닝 키트」(인비트로겐사, 카타로그 번호: 1325137)를 이용하여, 키트 첨부의 지시서에 따라서 pCR4Blunt-TOPO 벡터에 클로닝하고, 대장균 컴퍼턴트 세포에 도입하여 대장균 형질 전환체를 얻었다. 이 형질 전환체로부터 상기 플라스미드를 얻어, 플라스미드 중의 cDNA 염기 서열을 자동 DNA 서열 분석기 「피시알 기초 에이비아이 프리즘 3100 제네틱 애널라이저」(Applied Biosystems사)를 이용하여 확인하였다.

D. 가변 영역과 정상 영역의 연결과 클로닝

B-5)에서 얻어진 마우스 #4LD 항체 중쇄 가변 영역과, C에서 얻어진 인간 IgG 중쇄 정상 영역은 DNA 배열이 오버랩하는 영역을 갖는다. 따라서, 이 영역을 이용하여 오버랩 신장법에 의해서 2개쇄 DNA를 얻었다. 상세한 방법은 하기와 같다.

D-1) 키메라 #4LD 항체의 중쇄를 코딩하는 cDNA의 제조

B-5)에서 얻어진 「마우스 #4LD 항체 중쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 갖는 플라스미드」를 NotI와 XbaI 제한 효소로 소화하고, 1.5％ 아가로스 겔법으로 정제하였다. 이것을, 각 100 pmol/μL가 되도록 하기 조성의 TE 버퍼로 용해하여, 마우스 #4LD 항체 중쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA 단편의 용액으로 하였다.

TE 버퍼:

10 mM Tris-HCl

1 mM EDTA

pH7.5 내지 8.0

또한, C에서 얻어진 「인간 IgG 중쇄 정상 영역을 코딩하는 cDNA를 갖는 플라스미드」도 마찬가지로 처리하여 100 pmol/μL의 용액으로 하였다. 다음으로, 양자를 혼합하고, 우선 70℃에서 10분, 그 후 37℃에서 5분 유지함으로써 오버랩 영역에 수소 결합을 형성시켰다. 그 후, PCR법에 의해서 cDNA를 증폭한 후, 얻어진 cDNA를 NotI와 XbaI 제한 효소로 처리한 후, 1.5％ 저융점 아가로스법에 의해서 정제하였다.

키메라 #4LD 항체 중쇄 및 경쇄 cDNA 발현용 벡터 제조를 위해 PCR 증폭으로 사용한 프라이머 배열은 각각 다음과 같다.

키메라 #4LD 항체 중쇄용 PCR 프라이머

4LD-VH NotI-1 F(서열 번호: 29)

5' AAA GCG GCC GCG CCG CCA CCA TGA AAG TGT TGA GTC TGT TGT ACC TGT TG3' (50-mer)

4LD-VH XbaI-2R (서열 번호: 30)

5' CTA GTC TAG ATG AGG AGA CTG TGA GAG TGG TGC CTT GGC3' (39-mer)

4LD-VH-3F (서열 번호: 31)

5' GTC TCC TCA GCC TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC3' (33-mer)

4LD-VH-4R (서열 번호: 32)

5' TGA TCA TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA GAG GCT CTT C3' (37-mer)

키메라 #4LD 항체 경쇄용 PCR 프라이머

4LD-VL NotI-1F (서열 번호: 33)

5' AAA GCG GCC GCG CCG CCA CCA TGG AGA CAG ACA CAC TCC TGC3' (42-mer)

4LD-VL XbaI-2R (서열 번호: 34)

5' CTA GTC TAG ACG TTT TAT TTC CAG CTT GGT CCC CCC TCC G3' (40-mer)

4LD-VL-3F (서열 번호: 35)

5' AAA TAA AAC GAA CTG TGG CTG CAC CAT CTG TCT TCA TCT TCC C3' (43-mer)

4LD-VL-4R (서열 번호: 36)5' TGA TCA CTA GCA CTC TCC CCT GTT GAA GCT CTT TGT GAC3' (39-mer)

D-2) 키메라 #4LD 항체의 경쇄를 코딩하는 cDNA의 제조

B-5)에서 얻어진 마우스 #4LD 항체 경쇄 가변 영역과, C에서 얻어진 인간 Ig 카파 경쇄 정상 영역에 대해서도, D-1)과 동일하게 하여 키메라 #4LD 항체의 경쇄를 코딩하는 cDNA를 얻었다.

D-3) 클로닝

D-1)에서 얻어진 cDNA를 NotI와 XbaI를 클로닝 사이트로 하여, 플라스미드 벡터 pcDNA3.1-제오신(인비트로겐사)에 클로닝하여, 키메라 #4LD 항체 중쇄 발현 벡터로 하였다. 또한, D-2)에서 얻어진 cDNA를 NotI와 XbaI를 클로닝 사이트로 하여, 플라스미드 벡터 pcDNA3.1-하이그로마이신(인비트로겐사)에 클로닝하여, 키메라 #4LD 항체 경쇄 발현 벡터로 하였다. 각 벡터의 명칭은 하기와 같다.

키메라 #4LD 항체 중쇄 발현용 벡터 : pcDNA-4LDVH

키메라 #4LD 항체 경쇄 발현용 벡터 : pcDNA-4LDVL

E.키메라 #4LD 항체의 발현

E-1) 일과성 형질 전환

D-3)에서 얻어진 키메라 #4LD 항체 중쇄 발현 벡터(pcDNA-4LDVH) 1 μg과 키메라 #4LD 항체 경쇄 발현 벡터(pcDNA-4LDVL) 1 μg을 이펙틴 트랜스펙션 키트(Qiagen사, 카타로그 번호: 301427)를 이용하여 293T 세포에 코트랜스펙션하였다. 그 후, 하기 조성의 2％ Low IgG FBS 첨가 DMEM 배지를 이용하고, 37℃에서 배양하였다.

2％ Low IgG FBS 첨가 DMEM 배지:

DMEM 배지(Sigma사, 카타로그 번호: D5796)

2％ Low IgG FBS (HyClone사, 카타로그 번호: SH30151.03)

2 mM L-글루타민

100 U/ml 페니실린

100 μg/ml 스트렙토마이신

pH7.2-pH7.4

벡터 도입 후 96시간 배양하고, 배양 상청을 모아 원심 분리에 의해 세포 파편을 제거하여 조항체액으로 하였다.

F. 항체의 정제

E-1)에서 얻어진 조항체액을 각각 프로테인 A 친화성 칼럼(r프로테인 A 세파로스 FF, Amershram Pharmacia사, 카타로그 번호: 17-1279-01)로 정제하였다. 칼럼 정제 조건은 이하와 같다. 칼럼 부속의 설명서에 따라서 흡착 버퍼로서 하기 조성의 PBS(-) 버퍼, 용출 버퍼로서 0.1 M 시트르산나트륨 버퍼(pH3)를 이용하고 항체를 친화성 정제하였다. 용출 분획은 1 M Tris-HCl (pH8.0)를 첨가하고 pH7.2 부근으로 조정하였다. 조정된 항체 용액은 투석막(10000 컷트, PIERCE사 제조)를 이용하여 PBS(-)로 치환하여, 정제 항키메라 #4LD 항체를 얻었다.

정제 항체의 농도는 280 nm의 흡광도를 측정하고, 1 mg/ml를 1.38 OD로서 산출하였다.

PBS(-) 버퍼:

0.2 g/L 인산이수소일칼륨

0.2 g/L 염화칼륨

8 g/L 염화나트륨

1.15 g/L 무수인산일수소이나트륨

제조된 키메라 #4LD 항체의 중쇄, 및 경쇄의 염기 서열과 아미노산 서열은 각각 다음 서열 번호와 같다.

중쇄 경쇄

서열 번호: 25(염기 서열) 서열 번호: 27(염기 서열)

서열 번호: 26(아미노산 서열) 서열 번호: 28(아미노산 서열)

실시예 6 항인간 BST2 (D+) 항체의 에피토프의 결정

A. 인간 BST2 단백질의 발현 벡터의 구축과 재조합 인간 BST2 단백질의 제조

인간 BST2D의 전장 배열(서열 번호: 2) 중의, 세포 외 도메인 47 위치-180 위치의 아미노산 서열을 대상으로 하여, 그의 N 말단 측 또는 C 말단 측으로부터 아미노산 잔기를 1개씩 삭감한 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA를 PCR법에 의해서 합성하였다. 목적으로 하는 아미노산 서열의 디자인 방법을 이하에 나타내었다.

N 말단 측 해석용 아미노산 서열의 디자인:

C 말단 측 해석용 아미노산 서열의 디자인:

PCR법에는 인간 BST2D를 코딩하는 cDNA의 염기 서열(서열 번호: 1)의, 목적으로 하는 아미노산 서열을 코딩하는 영역의 양끝에 어닐링하는 프라이머를 이용하였다. 각 프라이머에는 EcoR I 및 XhoI 사이트를 부가하였다. 전장(full length) 인간 BST2의 cDNA를 조립한 벡터를 주형으로 하여, 도요보사 제조의 KOD DNA 폴리머라제에 의해서 PCR 반응을 행하였다. 얻어진 PCR 산물을 EcoR I와 Xho I(TaKaRa사 제조)로 절단하여 아가로스 겔로 전기 영동하고, 그것을 Qiagen사 제조의 민일루트(MinElute)로 정제하였다. 그 정제한 PCR 산물을 His 태그가 붙은 pET32 발현 벡터(Novagen사 제조)의 EcoR I/Xho I 사이트에 클로닝하였다. 이들 발현 벡터를 대장균(BL21(DE3))에 형질 도입하고, 각각의 대장균으로부터 N 말단에 His 태그가 부가 된 각 인간 BST2 단백질을 노바겐사의 오버나이트 익스프레스 시스템으로 제조하였다.

B. 항체

실시예 2에서 얻어진 마우스 #4LD 항체를 이용하고, 이하와 같이 웨스턴 블로팅법으로 에피토프를 결정하였다.

C. 웨스턴 블로팅법

각각의 His 태그가 붙은 인간 BST2 단백질(A에서 합성된 것)을 샘플 버퍼로 용해하고, 70℃ 10분간 가열하였다. 그 용해시킨 단백질을 4-20％ 그래디언트 SDS-PAGE겔(Invitrogen사 제조)을 사용하여 분리하고, PVDF 멤브레인(Millipore사 제조)에 전사하였다. 그것으로부터, BSA로 블로킹을 하여, 1 μg/mL4LD 항체나 2000배 희석한 항His 태그 항체(Novagen사 제조)로 반응시켰다. HRP로 라벨화된 항마우스 IgG 항체(Jackson사 제조)와 반응한 후, ECL 검출 시약(GE Healthcare사 제조)를 이용하여 화학 발광시켜, 후지 필름사 제조의 LAS-1000로 His 태그가 붙은 인간 BST2 단백질을 검출하였다.

샘플 버퍼:

NuPAGE LDS 샘플 버퍼 (4X) [Invitrogen사 제조]

NuPAGE 환원 시약 (10X) [Invitrogen사 제조]

를 멸균 증류수로 제조하였다.

그 결과는 도 6에 도시한 바와 같다. 각 레인의 재조합 인간 BST2 단백질의 아미노산 서열은 이하와 같다. 이하의 아미노산의 위치를 나타내는 숫자는 서열 번호: 2에서의 N 말단의 M을 1로 하는 수치이다. N 말단 측(상좌측)의 레인3-9, 및 C 말단 측(상우측)의 레인 4-10 중, #4LD 항체로 시그널이 검출된 레인을 +로, 되지 않은 레인을 -로 나타내었다.

N 말단 측

C 말단 측

도 6으로부터 분명한 바와 같이, 4LD 항체의 K(47)---R(147)/N 말단 측의 레인 7에의 결합은 검출되었지만, K(47)--V(146)/N 말단 측의 레인 8에의 결합은 검출할 수 없었다. 따라서, 4LD 항체의 항원 인식에는, 147 위치의 R이 필요한 것이 확인되었다. 한편, C 말단 측의 결과(도 6 상우측)로부터 4LD 항체는, E(133)---Q(180)/레인 6에는 결합했지만, V(134)----Q(180)에의 결합은 검출할 수 없었다. 따라서, 4LD 항체의 항원 인식에는, 133 위치의 E가 필요한 것이 확인되었다. 4LD의 에피토프는, EVERLRRENQVLSVR(서열 번호: 37)의 15 아미노산인 것을 알았다. 서열 번호: 37의 아미노산 서열은 BST2D의 전장 아미노산 서열(서열 번호: 2)의 133-147 위치에 상당한다. 도 1에 도시하는 바와 같이, 이 에피토프는 인간 BST2D에 특이적인 아미노산 서열에 의해서 구성되어 있었다.

실시예 7 생체 내 약효 시험

(1) 세포주

인간의 미엘로마 유래 세포주인 RPMI8226 세포(ATCC) 및 인간 B 세포주 ARH77 세포(ATCC)를 이용하였다. 세포는 10％ FBS(BIONET사 제조)를 포함하는 RPMI1640 배지(SIGMA사 제조)로 유지계대하였다.

(2) RPMI8226 인간 암세포주 이식 마우스 모델의 제조

세포를 계대용 배지에서 5×10⁷개/mL가 되도록 제조하였다. 세포의 이식 전일에 미리 항아시알로 GM1 항체(와꼬 쥰야꾸사 제조, 1 바이알을 5 mL로 용해) 100 μL를 복강 내에 투여한 SCID 마우스(수컷, 5주령) (닛본 클레아)의 복부 피하에 이 세포 현탁액 100 μL(5×10⁶개/마우스)를 이식하였다. 종양 부피는 이하의 식으로써 산출하고, 종양 부피가 140 내지 240 mm³가 된 시점에 모델 성립으로 하였다.

종양 부피=장경×단경×단경/2

종양 부피를 바탕으로 군 분류를 행하였다.

(3) ARH77 인간 암세포주 이식 마우스 모델의 제조

세포를 계대용 배지에서 2.5×10⁷개/mL가 되도록 제조하였다. 세포의 이식전일에 미리 항아시알로 GM1 항체(와꼬 쥰야꾸사 제조, 1바이알을 5 mL로 용해) 100 μL를 복강 내에 투여한 SCID 마우스(수컷, 5주령) (닛본 클레아)의 꼬리 정맥으로부터 이 세포 현탁액 200 μL(5×10⁶개/마우스)를 이식하였다. 종양 이식 후 10일째에 마우스 혈청 중의 ARH77 세포가 생산하는 인간 IgG(M 단백질)량을 ELISA로 측정하여(혈청 M 단백질량의 측정의 항 참조), M 단백질이 검출되었기 때문에 모델 성립으로 하였다. 혈청 M 단백질량을 기초로 군 분류를 행하였다.

(4) 혈청 M 단백질량의 측정

배중족 정맥에 의해 혈액을 채취하고, 혈청을 분리하고, 마우스 혈청 중의 M 단백질량의 측정은 항인간 IgG 항체를 이용한 샌드위치 ELISA로 행하였다. 즉, 항인간 IgG 항체(Biosource)를 고상화한 96 웰 플레이트(Nunc)을 희석 완충액(D.B.)으로 블로킹 처리한 후, D.B.를 이용하여 적절하게 희석한 혈청 샘플 첨가하였다. D.B의 조성은 다음과 같다.

희석 버퍼: 1 mmol/L MgCl₂,

150 mmol/L NaCl,

0.02 w/v％ NaN₃,

0.05 vol ％ Tween20,

1 w/v％ 소 혈청 알부민(BSA)

함유 50 mmol/L Tris-HCl 완충액 pH 8.1

또 항체 농도 산출을 위한 기준으로서, 1000 ng/mL로부터 2배 계열로 11단계 희석한 인간 IgG(ICN/cappel)를 마찬가지로 첨가하였다. 알칼리포스파타아제표지 항인간 IgG 항체(Biosource)를 반응시킨 후, 시그마(Sigma)104(Sigma-Aldrich)를 기질로 하여 발색시키고, 흡광도 리더에 의해 405 nm의 흡광도를 측정하였다(참조 파장 635 nm). 기준 인간 IgG의 검량선으로부터 혈청 샘플 중의 인간 IgG(M 단백질)량을 산출하였다. 또한, 본 ELISA의 검출 한계는 검량선으로부터 판단하여 1 ng/mL로 하였다.

(5) 투여 항체의 제조

4LD 항체를 투여 당일, 여과 멸균한 PBS(-)를 이용하여, 0.5 mg/mL(5 mg/kg 투여군) 및 0.15 mg/mL(1.5 mg/kg 투여군), 0.1 mg/mL(1 mg/kg 투여군), 0.05 mg/mL(0.5 mg/kg 투여군)가 되도록 제조하여, 투여 시료로 하였다.

(6) 항체 투여

(2)에서 제조한 RPMI8226 세포 이식 마우스 모델은 이식 후 27일째부터 주에 2회, 3주간, 상기 (5)에서 제조한 투여 시료를 10 mL/kg으로, 꼬리 정맥으로부터 투여하였다(투여량: 5 mg/kg, 1.5 mg/kg, 0.5 mg/kg). 음성 대조로서, PBS(-) (비히클)를 마찬가지로 주에 2회, 3주간, 10 mL/kg으로, 꼬리 정맥으로부터 투여하였다. 1군 6마리로 행하였다. 또한, (3)으로 제조한 ARH77 세포 이식 마우스 모델은 이식 후 10일부터, 주에 1회, 3주간, 상기 (5)에서 제조한 투여 시료를 10 mL/kg으로, 꼬리 정맥으로부터 투여하였다. (투여량: 5 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.05 mg/kg) 음성 대조로서, PBS(-) (비히클)를 마찬가지로 주에 1회, 3주간, 10 mL/kg으로, 꼬리 정맥으로부터 투여하였다. 1군 5마리로 행하였다.

(7) 항종양 효과의 평가

4LD 항체의 RPMI8226 세포 이식 마우스 모델에 있어서의 항종양 효과에 대해서는 종양 부피의 계시 변화(도 7)로 평가하였다. 그 결과, 4LD 항체 투여군으로서는 비히클 투여군과 비교하여 종양의 증식 억제가 인정되었다. 또한, ARH77 세포 이식 마우스 모델에 있어서의 항종양 효과에 대해서는 생존 기간(도 8)으로 평가하였다. 그 결과, 4LD 항체 투여군으로서는 비히클 투여군과 비교하여 항체 투여군에서 생존 기간의 연장이 인정되었다.

이상으로부터, 4LD 항체가 갖는 인간 골수종 세포 이식 마우스 모델에 대한 항종양 효과가 확인되었다.

[산업상 이용가능성]

본 발명에 의해, 인간 BST2 항원의 각종 스플라이싱 변이체 중에서, BST2D를 특이적으로 인식하는 항체가 제공되었다. 종래의 HM1.24 항체에 비하여 BST2D에 대한 특이성이 높은 본 발명의 항BST2 항체는 골수종 등의 BST2D를 발현하는 조직이나 세포의 치료나 진단에 이용할 수 있다. 예를 들면, 골수종의 치료에 있어서, BST2H와 BST2D를 면역학적으로 식별하지 않은 항체와 비교하여, 본 발명의 항체는 혈중에 있어서 보다 긴 기간에 걸쳐 항체의 혈중 농도를 유지한다. 따라서, 보다 낮은 투여량으로 치료 효과를 달성할 수 있다. 또는 본 발명의 항체는 골수종 등의 BST2D를 발현하는 세포를 특이적으로 검출할 수가 있는 진단제로서 이용할 수 있다. 특히, 생체 내에서의 골수종의 화상 진단에 있어서, BST2 분자의 다른 변이체을 면역학적으로 식별하는 본 발명의 항체는 백그라운드 노이즈가 낮은, 보다 병소에 특이적인 이미지를 제공하는 진단 도구로서 유용하다.

독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터

FERMBP10964

20080508

SEQUENCE LISTING <110> SBI BIOTECH CO.,LTD. CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> Anti-BST2 antibody <130> G2-A0701P <150> JP 2007-269470 <151> 2007-10-16 <160> 37 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 866 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (4)..(546) <400> 1 tgg atg gca tct act tcg tat gac tat tgc aga gtg ccc atg gaa gac 48 Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys Arg Val Pro Met Glu Asp 1 5 10 15 ggg gat aag cgc tgt aag ctt ctg ctg ggg ata gga att ctg gtg ctc 96 Gly Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly Ile Gly Ile Leu Val Leu 20 25 30 ctg atc atc gtg att ctg ggg gtg ccc ttg att atc ttc acc atc aag 144 Leu Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu Ile Ile Phe Thr Ile Lys 35 40 45 gcc aac agc gag gcc tgc cgg gac ggc ctt cgg gca gtg atg gag tgt 192 Ala Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala Val Met Glu Cys 50 55 60 cgc aat gtc acc cat ctc ctg caa caa gag ctg acc gag gcc cag aag 240 Arg Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu Leu Thr Glu Ala Gln Lys 65 70 75 ggc ttt cag gat gtg gag gcc cag gcc gcc acc tgc aac cac act gtg 288 Gly Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val 80 85 90 95 atg gcc cta atg gct tcc ctg gat gca gag aag gcc caa gga caa aag 336 Met Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu Lys Ala Gln Gly Gln Lys 100 105 110 aaa gtg gag gag ctt gag gga gag atc act aca tta aac cat aag ctt 384 Lys Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr Thr Leu Asn His Lys Leu 115 120 125 cag gac gcg tct gca gag gtg gag cga ctg aga aga gaa aac cag gtc 432 Gln Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Arg Glu Asn Gln Val 130 135 140 tta agc gtg aga atc gcg gac aag aag tac tac ccc agc tcc cag gac 480 Leu Ser Val Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr Tyr Pro Ser Ser Gln Asp 145 150 155 tcc agc tcc gct gcg gcg ccc cag ctg ctg att gtg ctg ctg ggc ctc 528 Ser Ser Ser Ala Ala Ala Pro Gln Leu Leu Ile Val Leu Leu Gly Leu 160 165 170 175 agc gct ctg ctg cag tga gatcccagga agctggcaca tcttggaagg 576 Ser Ala Leu Leu Gln 180 tccgtcctgc tcggcttttc gcttgaacat tcccttgatc tcatcagttc tgagcgggtc 636 atggggcaac acggttagcg gggagagcac ggggtagccg gagaagggcc tctggagcag 696 gtctggaggg gccatggggc agtcctgggt gtggggacac agtcgggttg acccagggct 756 gtctccctcc agagcctccc tccggacaat gagtcccccc tcttgtctcc caccctgaga 816 ttgggcatgg ggtgcggtgt ggggggcatg tgctgcctgt tgttatgggt 866 <210> 2 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys Arg Val Pro Met Glu Asp Gly 1 5 10 15 Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly Ile Gly Ile Leu Val Leu Leu 20 25 30 Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu Ile Ile Phe Thr Ile Lys Ala 35 40 45 Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala Val Met Glu Cys Arg 50 55 60 Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu Leu Thr Glu Ala Gln Lys Gly 65 70 75 80 Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val Met 85 90 95 Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu Lys Ala Gln Gly Gln Lys Lys 100 105 110 Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr Thr Leu Asn His Lys Leu Gln 115 120 125 Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Arg Glu Asn Gln Val Leu 130 135 140 Ser Val Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr Tyr Pro Ser Ser Gln Asp Ser 145 150 155 160 Ser Ser Ala Ala Ala Pro Gln Leu Leu Ile Val Leu Leu Gly Leu Ser 165 170 175 Ala Leu Leu Gln 180 <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asn Gln Val Leu Ser Val Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr Tyr Pro Ser 1 5 10 15 Ser Gln Asp <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn 1 5 10 15 Arg <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Ile Leu Gly Arg Gly Tyr 1 5 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10 15 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Tyr Thr 1 5 <210> 10 <211> 396 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 10 atgaaagtgt tgagtctgtt gtacctgttg acagccattc ctggtatcct gtctgatgta 60 cagcttcagg agtcaggacc tggcctcgtg aaaccttctc agtctctgtc tctcacctgc 120 tctgtcactg gctactccat caccagtggt tattactgga actggatccg gcagtttcca 180 ggaaacaaac tggaatggat gggctacata agctacgacg gtagcaataa ctacaaccca 240 tctctcaaaa atcgaatctc catcactcgt gacacatcta agaaccagtt tttcctgaag 300 ttgaattctg tgactactga ggacacagct acatattact gtgcaattct gggacgcggc 360 tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctca 396 <210> 11 <211> 114 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ile Leu Gly Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 12 <211> 393 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 12 atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 120 atctcatgca gggccagcca aagtgtcagt acatctagct atagttatat gcactggtac 180 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatcaagt atgcatccaa cctagaatct 240 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 300 cctgtggagg aggaggatac tgcaacatat tactgtcagc acagttggga gattccgtac 360 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 393 <210> 13 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp 85 90 95 Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 14 tccagagttc caggtcaagg tcac 24 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 15 gccagtggat agaccgatgg 20 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <220> <221> modified_base <222> (24)..(25) <223> n is inosine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> modified_base <222> (29)..(30) <223> n is inosine <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> modified_base <222> (34)..(35) <223> n is inosine <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <400> 16 ggccacgcgt cgactagtac gggnngggnn gggnng 36 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 17 ggccacgcgt cgactagtac 20 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 18 ttcactgcca tcaatcttcc actt 24 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 19 gatggataca gttggtgcag c 21 <210> 20 <211> 480 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (4)..(480) <400> 20 tgg atg gca tct act tcg tat gac tat tgc aga gtg ccc atg gaa gac 48 Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys Arg Val Pro Met Glu Asp 1 5 10 15 ggg gat aag cgc tgt aag ctt ctg ctg ggg ata gga att ctg gtg ctc 96 Gly Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly Ile Gly Ile Leu Val Leu 20 25 30 ctg atc atc gtg att ctg ggg gtg ccc ttg att atc ttc acc atc aag 144 Leu Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu Ile Ile Phe Thr Ile Lys 35 40 45 gcc aac agc gag gcc tgc cgg gac ggc ctt cgg gca gtg atg gag tgt 192 Ala Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala Val Met Glu Cys 50 55 60 cgc aat gtc acc cat ctc ctg caa caa gag ctg acc gag gcc cag aag 240 Arg Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu Leu Thr Glu Ala Gln Lys 65 70 75 ggc ttt cag gat gtg gag gcc cag gcc gcc acc tgc aac cac act gtg 288 Gly Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val 80 85 90 95 atg gcc cta atg gct tcc ctg gat gca gag aag gcc caa gga caa aag 336 Met Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu Lys Ala Gln Gly Gln Lys 100 105 110 aaa gtg gag gag ctt gag gga gag atc act aca tta aac cat aag ctt 384 Lys Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr Thr Leu Asn His Lys Leu 115 120 125 cag gac gcg tct gca gag gtg gag cga ctg agg tca gag ata gcc ttc 432 Gln Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Ser Glu Ile Ala Phe 130 135 140 ccc cgc tac cct cca cct gcc aca ttc ctc tca ccc cca cat ccc tag 480 Pro Arg Tyr Pro Pro Pro Ala Thr Phe Leu Ser Pro Pro His Pro 145 150 155 <210> 21 <211> 158 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys Arg Val Pro Met Glu Asp Gly 1 5 10 15 Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly Ile Gly Ile Leu Val Leu Leu 20 25 30 Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu Ile Ile Phe Thr Ile Lys Ala 35 40 45 Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala Val Met Glu Cys Arg 50 55 60 Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu Leu Thr Glu Ala Gln Lys Gly 65 70 75 80 Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val Met 85 90 95 Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu Lys Ala Gln Gly Gln Lys Lys 100 105 110 Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr Thr Leu Asn His Lys Leu Gln 115 120 125 Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Ser Glu Ile Ala Phe Pro 130 135 140 Arg Tyr Pro Pro Pro Ala Thr Phe Leu Ser Pro Pro His Pro 145 150 155 <210> 22 <211> 314 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (4)..(306) <400> 22 tgg atg gca tct act tcg tat gac tat tgc aga gtg ccc atg gaa gac 48 Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys Arg Val Pro Met Glu Asp 1 5 10 15 ggg gat aag cgc tgt aag ctt ctg ctg ggg ata gga att ctg gtg ctc 96 Gly Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly Ile Gly Ile Leu Val Leu 20 25 30 ctg atc atc gtg att ctg ggg gtg ccc ttg att atc ttc acc atc aag 144 Leu Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu Ile Ile Phe Thr Ile Lys 35 40 45 gcc aac agc gag gcc tgc cgg gac ggc ctt cgg gca gtg atg gag tgt 192 Ala Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala Val Met Glu Cys 50 55 60 cgc aat gtc acc cat ctc ctg caa caa gag ctg acc gag gcc cag aag 240 Arg Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu Leu Thr Glu Ala Gln Lys 65 70 75 ggc ttt cag gat gtg gag gcc cag gcc gcc acc tgc aac cac act gtg 288 Gly Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val 80 85 90 95 gag aga tca cta cat taa accataag 314 Glu Arg Ser Leu His 100 <210> 23 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys Arg Val Pro Met Glu Asp Gly 1 5 10 15 Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly Ile Gly Ile Leu Val Leu Leu 20 25 30 Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu Ile Ile Phe Thr Ile Lys Ala 35 40 45 Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala Val Met Glu Cys Arg 50 55 60 Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu Leu Thr Glu Ala Gln Lys Gly 65 70 75 80 Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val Glu 85 90 95 Arg Ser Leu His 100 <210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Leu Glu Gly Glu Ile Thr Thr Leu Asn His Lys Leu 1 5 10 <210> 25 <211> 1389 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized nucleotide sequence <400> 25 atgaaagtgt tgagtctgtt gtacctgttg acagccattc ctggtatcct gtctgatgta 60 cagcttcagg agtcaggacc tggcctcgtg aaaccttctc agtctctgtc tctcacctgc 120 tctgtcactg gctactccat caccagtggt tattactgga actggatccg gcagtttcca 180 ggaaacaaac tggaatggat gggctacata agctacgacg gtagcaataa ctacaaccca 240 tctctcaaaa atcgaatctc catcactcgt gacacatcta agaaccagtt tttcctgaag 300 ttgaattctg tgactactga ggacacagct acatattact gtgcaattct gggacgcggc 360 tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc 420 ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct gggctgcctg 480 gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc 540 ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg 600 gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag 660 cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca 720 tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca 780 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 840 gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 900 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 960 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1020 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1080 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 1140 acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1200 cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1260 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1320 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1380 ggtaaatga 1389 <210> 26 <211> 462 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 26 Met Lys Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala Ile Pro Gly Ile 1 5 10 15 Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro 20 25 30 Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr 35 40 45 Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro 65 70 75 80 Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln 85 90 95 Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Ile Leu Gly Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 115 120 125 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 130 135 140 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 145 150 155 160 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 165 170 175 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 180 185 190 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 195 200 205 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 210 215 220 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 225 230 235 240 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 245 250 255 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 260 265 270 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 275 280 285 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 290 295 300 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 305 310 315 320 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 325 330 335 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 340 345 350 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 355 360 365 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 370 375 380 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 385 390 395 400 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 405 410 415 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 420 425 430 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 435 440 445 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 27 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized nucleotide sequence <400> 27 atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 120 atctcatgca gggccagcca aagtgtcagt acatctagct atagttatat gcactggtac 180 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatcaagt atgcatccaa cctagaatct 240 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 300 cctgtggagg aggaggatac tgcaacatat tactgtcagc acagttggga gattccgtac 360 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc 420 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgctag 717 <210> 28 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 28 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 100 105 110 Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 210 215 220 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 29 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 29 aaagcggccg cgccgccacc atgaaagtgt tgagtctgtt gtacctgttg 50 <210> 30 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 30 ctagtctaga tgaggagact gtgagagtgg tgccttggc 39 <210> 31 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 31 gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg gtc 33 <210> 32 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 32 tgatcatcat ttacccggag acagggagag gctcttc 37 <210> 33 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 33 aaagcggccg cgccgccacc atggagacag acacactcct gc 42 <210> 34 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 34 ctagtctaga cgttttattt ccagcttggt cccccctccg 40 <210> 35 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 35 aaataaaacg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt ccc 43 <210> 36 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 36 tgatcactag cactctcccc tgttgaagct ctttgtgac 39 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Glu Val Glu Arg Leu Arg Arg Glu Asn Gln Val Leu Ser Val Arg 1 5 10 15

Claims

인간 BST2D 항원에 결합하고, 또한 인간 BST2H 항원과는 실질적으로 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 항인간 BST2 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
제1항에 있어서, 서열 번호: 3에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 인식하는 것을 특징으로 하는, 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
서열 번호: 3 중의 전부 또는 적어도 5개 이상의 연속하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 면역원으로서 제조한 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
제1항에 기재된 항체가 결합하는 BST2D 단백질의 에피토프와 동일 에피토프에 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
제1항에 있어서, 단일클론 항체인, 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
수탁 번호 FERM BP-10964로서 기탁된 하이브리도마 BST2#4LD가 생산하는 단일클론 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
제1항에 있어서, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역에서, 이하의 아미노산 서열을 CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 포함하는 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편;
중쇄 가변 영역의 CDR1: SGYYWN(서열 번호: 4);
중쇄 가변 영역의 CDR2: YISYDGSNNYNPSLKNR(서열 번호: 5); 및
중쇄 가변 영역의 CDR3: ILGRGY(서열 번호: 6);
경쇄 가변 영역의 CDR1: RASQSVSTSSYSYMH(서열 번호: 7);
경쇄 가변 영역의 CDR2: YASNLES(서열 번호: 8); 및
경쇄 가변 영역의 CDR3: QHSWEIPYT(서열 번호: 9).
제1항에 있어서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로서, 이하에 기재하는 아미노산 서열을 포함하는, 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편;
서열 번호: 11의 중쇄 가변 영역과 서열 번호: 13의 경쇄 가변 영역.
다음의 (A) 또는 (B) 중 어느 하나에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, (A) 또는 (B) 중 어느 하나에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편;
(A) 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역에서, 이하의 아미노산 서열을 CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 포함하는 항체;
중쇄 가변 영역의 CDR1: SGYYWN(서열 번호: 4);
중쇄 가변 영역의 CDR2: YISYDGSNNYNPSLKNR(서열 번호: 5); 및
중쇄 가변 영역의 CDR3: ILGRGY(서열 번호: 6);
경쇄 가변 영역의 CDR1: RASQSVSTSSYSYMH(서열 번호: 7);
경쇄 가변 영역의 CDR2: YASNLES(서열 번호: 8); 및
경쇄 가변 영역의 CDR3: QHSWEIPYT(서열 번호: 9), 또는
(B) 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로서, 이하에 기재하는 아미노산 서열을 포함하는 항체;
서열 번호: 11의 중쇄 가변 영역과 서열 번호: 13의 경쇄 가변 영역.
제7항에 기재된 항체가 결합하는 BST2D 단백질의 에피토프와 동일 에피토프에 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
제7항에 있어서, 단일클론 항체인 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
제1항에 있어서, 세포 표면에 인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 세포에 대하여 CDC 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
제1항에 있어서, 세포 표면에 인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 세포에 대하여 ADCC 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
제7항에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제7항에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제15항에 기재된 벡터를 발현 가능하게 유지시키는 형질 전환 세포.
제16항에 기재된 형질 전환 세포를 배양하고, 그 배양물로부터 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 회수하는 공정을 포함하는 제7항에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편의 제조 방법.
제5항에 기재된 항체를 생산하는 하이브리도마.
수탁 번호 FERM BP-10964로서 기탁된 하이브리도마 BST2#4LD.
제19항에 기재된 하이브리도마를 배양하고, 배양물로부터 항체를 채취하는 공정을 포함하는 항체의 제조 방법.
다음 공정을 포함하는, 항인간 BST2D 특이 항체의 제조 방법;
(1) 항인간 BST2D 항체를 인간 BST2H 및 인간 BST2HS 중 어느 하나, 또는 양쪽과 접촉시키는 공정; 및
(2) 이하의 i 및 ii 중 어느 하나, 또는 양쪽의 반응 특이성을 갖는 항인간 BST2D 항체를 항인간 BST2D 특이 항체로서 회수하는 공정;
i. 인간 BST2H에 결합하지 않는 항체, 및
ii. 인간 BST2HS에 결합하지 않는 항체.
다음 공정을 포함하는 항인간 BST2D 특이 항체의 제조 방법;
(1) 서열 번호: 3의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 3의 아미노산 서열로부터 선택된 적어도 5개 이상의 연속하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 비인간 동물에게 면역화하는 공정, 및
(2) (1)의 비인간 동물로부터 항체를 회수하거나, 또는 항체 생산 세포를 회수하여 상기 항체 생산 세포가 생산하는 항체를 회수하는 공정.
인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 조직의 증식에 기인하는 질환에 대한 치료제로서, 제1항에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 유효 성분으로서 포함하는 치료제.
제1항에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 유효 성분으로서 포함하는, 인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 종양에 대한 치료제.
제24항에 있어서, 종양이 골수 세포로부터 파생한 종양인 것을 특징으로 하는 치료제.
제25항에 있어서, 골수 세포로부터 파생한 종양이 골수종인 것을 특징으로 하는 치료제.
제26항에 있어서, 골수종이 다발성 골수종인 것을 특징으로 하는 치료제.
제1항에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 포함하는, 인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 조직을 검출하는 진단약.
제1항에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 포함하는, 인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 종양을 검출하기 위한 진단약.
제29항에 있어서, 종양이 골수 세포로부터 파생한 종양인 것을 특징으로 하는 진단약.
제30항에 있어서, 골수 세포로부터 파생한 종양이 골수종인 것을 특징으로 하는 진단약.
제31항에 있어서, 골수종이 다발성 골수종인 것을 특징으로 하는 진단약.
제1항에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 투여하는 공정을 포함하는, 인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 종양의 치료 방법.
제1항에 기재된 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편의, 인간 BST2D 항원을 발현하고 있는 종양의 치료를 위한 의약 조성물의 제조에서의 용도.