WO2006013923A1

WO2006013923A1 - 自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤

Info

Publication number: WO2006013923A1
Application number: PCT/JP2005/014299
Authority: WO
Inventors: Yumiko Kamogawa
Original assignee: Ginkgo Biomedical Research Institute Co., Ltd.
Priority date: 2004-08-05
Filing date: 2005-08-04
Publication date: 2006-02-09
Also published as: JPWO2006013923A1

Abstract

　本発明は、インターフェロン産生細胞(Interferon Producing Cell;IPC)の活性抑制物質を有効成分として含有する、RAの治療剤を提供する。IPC活性抑制物質には、たとえばIPCの細胞表面抗原を認識する抗体が用いられる。たとえばBST2またはそのホモログを認識する抗体は、本発明に有用である。また本発明は、IPCの活性を調節する作用を有する物質を選択する工程を含む、RAの治療剤をスクリーニングするための方法を提供する。　本発明によって、IPCの活性を抑制することで、RA患者の免疫バランスを調節できることが明らかにされた。すなわち本発明は、自己免疫疾患を伴う関節炎の新たな治療戦略を提供した。

Description

明細書

自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤

技術分野

[0001] 本発明は、自己免疫疾患を伴う関節炎 (arthritis with autoimmune disease)の治療に関する。

背景技術

[0002] 慢性関節リウマチ (Rheumatoid arthritis; RA)は、リウマチ性疾患の代表的な疾患の一つである。 RAの罹患率は人口の約 1%程度と考えられている。日本においても、 7 0万人程度の患者が存在すると予測されている。 RAは慢性の全身性疾患で、リウマチ様関節炎とも呼ばれる。 RAの病態は主に慢性の関節炎である。関節炎に伴う痛みは移動しやすぐ関節炎の病変は、指、腕、手、足の指 (趾)、ひざ関節、あるいは頸椎関節などの全身に及ぶ。 RAの慢性的な関節炎は、主に、以下のような病変、並びにそれに起因する慢性的な炎症と骨組織破壊によってもたらされると考えられている

[0003] RAの炎症症状は、 T細胞あるいはマクロファージの関節腔内への浸潤などによって誘導される。関節腔内に浸潤した炎症性の細胞は、炎症性サイト力インおよび血管新生因子を産生する。一方、炎症性サイト力インなどの刺激を受けて、滑膜細胞が軟骨組織に向カゝつて増殖を開始する。滑膜組織は、正常な関節構成組織の一つである。正常な関節組織は、滑膜組織に包まれている。そして、関節腔内は滑膜組織が産生する滑液によって満たされている。 RAにおいては、関節腔内の滑膜細胞の増殖に伴って、肉芽組織が形成される。この肉芽組織は、滑膜パンヌス (synovial pannus) と呼ばれる RAに特徴的な病変である。滑膜パンヌスの中の滑膜細胞はプロテアーゼを産生する。関節内の軟骨組織を構成するコラーゲン繊維は、滑膜細胞が産生するプロテアーゼの作用によって分解される。軟骨組織の分解は、関節腔内の炎症の原因となる。

一方、滑膜細胞の関節腔内における増殖は、血管新生を誘導する。血管新生もまた、炎症の原因となると共に、 T細胞あるいはマクロファージのような炎症性細胞の遊走をもたらす。このような一連の関節組織の障害によって、関節の腫大 (s_Welling)、あるいは痛みなどの RA特有の症状力あたらされる。そして症状の進行に伴って、軟骨組織の破壊が進み、やがて運動機能障害が現れるようになる。

[0004] 現在のところ、 RAの原因や発症機構の詳細は明らかにされていない。ただ RAが、自己免疫性疾患の特徴を有することは、様々な知見によって裏付けられている。たとえば、多くの RA患者の血液中には、自己の IgGを認識する自己抗体が検出される。この自己抗体はリウマチ因子 (Rheumatoid factor; RF)と呼ばれる。 RFは古くから RAの診断マーカーとして利用されてきた。

[0005] RAの治療目標は、患者の QOLの改善と組織破壊の抑制である。 RA患者の QOLの改善とは、具体的には、組織の運動障害と痛みの軽減が主な課題となる。現在、日常的に採用されているもっとも一般的な治療方法は、消炎鎮痛剤の投与である。たとえば、シクロォキシゲナーゼ (Cycro-oxygenase;COX)阻害剤である非ステロイド性抗炎症薬 (nonsteroidal antiinflammatory drug; NSAIDs)が、しばしば RAの症状の緩和のために患者に投与される。特に COX-2は、炎症性メディエーターによって誘導され、炎症病巣でプロスタグランディンの産生に関与する酵素である。 NSAIDsは、 COX-2 の阻害を通じて炎症症状を緩和する。

[0006] RA治療のための消炎鎮痛剤としてステロイド剤が選択される場合もある。 RA患者に対するステロイド剤の投与によって、短時間のうちに確実な消炎作用を期待できる。ステロイド剤の投与は、 RAにおいては、効果的な治療方法の一つである。しかし RA は慢性疾患である。したがってステロイド剤投与を治療法として選択した場合には、ステロイド剤が長期的に反復投与される。その結果、ステロイド剤の副作用が問題となる場合がある (非特許文献 lZSaag K.G. et al.， AM.J.Med.,96, 115, 1994)。たとえばステロイド剤によって患者の免疫機能が抑制され、患者が感染症に罹患する可能性が高まる恐れがあることが指摘されている。したがって、通常ステロイド剤は、短期的に治療効果を得る必要がある場合に、一時的に使用される。

[0007] 更に RA患者の免疫異常の修飾によって、 RAの活動性を調節することができる薬剤が実用化されている。この種の薬剤は、抗リウマチ薬、あるいは疾患修飾リウマチ薬 (d isease modifying antirheumatic drugs; DMARDs)と呼ばれる (非特許文献 2Z三森経世 Medicina, 38, 430, 2001)。 DMARDsの投薬は、 NSAIDsで十分な治療効果が見られない患者においてもしばしば有効である。また DMARDsには、寛解導入作用、あるいは関節保護作用が期待できることから、早期からの導入が奨められるようになっている。しかし、一方で、治療効果が見られない患者 (non-responder)の存在も明らかにされている。また、副作用の発現率も高いことが指摘されている。

[0008] RAの滑膜細胞では炎症性サイト力インが産生され、関節破壊が進行して!/、る。そこで炎症性サイト力インが治療標的として着目された。たとえば腫瘍壊死因子 (TNF- a ) 、インターロイキン (IL-1あるいは IL-6)を標的とする治療方法が試みられている。具体的には、以下の抗体、あるいは融合蛋白質の有効性が治験により評価されている。抗 TNF- aキメラ抗体 c2A (Remicade/Centocor社の登録商標）

抗 TNF- αヒト抗体 D2E7(非特許文献 3ZPeter C, Curr.Opin.in Rheumatol, 12, 16 4-169,2001)

TNF- a受容体 Fc融合蛋白質（Enbrel： etanerceptZAmgen社、 Wyeth社の商品名 ) 抗 IL-6受容体ヒト化抗体（MRA:Atlizumab;非特許文献 4Z Arthritis Rheum. 2002 Dec;46(12):3143-50.)

[0009] また RA患者のヘルパー T細胞には偏りがあることも明らかにされている。すなわち、 IFN- γの刺激によるナイーブ Τ細胞のヘルパー Thl細胞への分化が観察される。へルパー Thl細胞は Thlサイト力インである IFN- γの産生を介して、 RAのような臓器特異的自己免疫疾患症状に関与する。 RA患者においては、浸潤 Τ細胞から IFN- γを産生する Thl細胞あるいは ThO細胞が見られ、 T細胞のバランスは Thl側にシフトしている。更に、リンパ球浸潤部位で検出されるマクロファージが IL-12あるいは IL-18を産生している。これらのサイト力インは、 IFN- γ産生を誘導する。このように、 RA患者においては、炎症性サイト力インの産生が亢進する状態が見られる。 Thl側に偏った RA患者の免疫バランスを調節することで RAの治療効果を達成する試みがある。すなわち Thl細胞応答を増強するサイト力インの作用を、その拮抗剤によって抑制し、免疫学的なバランスを調節して、 RAを治療する試みである。

[0010] このようなアプローチを実現するためのサイト力イン拮抗剤として、タイプ 1インターフエロンに対する抗体が用いられた (特許文献 1ZWO 01/054721)。すなわち、 IFN- aに対する抗体による RAの治療が提案された。実際、 RA患者においては IFN- o;の産生が亢進していることが知られている (非特許文献 5ZHopkins et al.Clin Exp Imm unol. 1988 Jul;73(l):88-92.)₀また、 IFN- α製剤投与の副作用として RAの増悪あるいは発症が認められることも報告されて、る。

[0011] 特許文献 l : WO 01/054721

非特許文献 l : Saag K.G. et al., AM.J.Med.,96, 115, 1994

非特許文献 2：三森経世 (Mimori Tsuneyo) Medicina, 38, 430, 2001

非特許文献 3 : Peter C, Curr.Opin.in Rheumatol. , 12 , 164- 169 , 2001

非特許文献 4 : Choy E.H. et al. , Arthritis Rheum. 2002 Dec;46(12):3143- 50.

非特許文献 5 : Hopkins et al .Clin Exp Immunol. 1988 Jul;73(l):88- 92.

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0012] タイプ 1インターフェロンの活性の抑制によって、 RAの治療効果が期待できると考えられている。たとえばタイプ 1インターフェロンの拮抗剤は、インターフェロンの活性を抑制する。これに対して、もしもインターフェロン産生そのものを調節することができれば、拮抗剤と同様に、 RAの治療効果が期待できる。インターフェロン産生の調節による RAの治療は、拮抗剤による治療と比較して、より本質的な治療戦略であると言うことができる。すなわち本発明は、インターフェロンの産生調節による、 RAの治療技術の提供を課題とする。

課題を解決するための手段

[0013] ヒトにおいて、免疫システムのバランスが偏る原因の一つは、タイプ 1インターフエ口ンの作用である。タイプ 1インターフェロンには、インターフェロンお (IFN a )およびィンターフェロン 13 (IFN β )が含まれる。 IFN aあるいは IFN βは、抗ウィルス活性、あるいは抗腫瘍活性を有するインターフェロンとして知られてヽる。ウィルス感染に伴って、これらのインターフェロンを大量に産生する細胞として同定されたのがインターフエロン産生細胞（以下、 IPCと省略する場合がある）である。 IPCは血中にわず力しか存在していない。末梢血リンパ球に占める IPCの割合は、 1%以下と考えられている。しかし IPCは、きわめて高いインターフェロンの産生能を有する。 IPCの IFN産生能は、たとえば 3000pg/mL/10⁶cellsに達する。つまり、細胞の数は少ないが、血中 IFN aあるいは IFN jSの大部分は、 IPCによってもたらされていると言って良い。

[0014] したがって、 IPCのインターフェロン産生、あるいは IPCの細胞数そのものを抑制することができれば、生体内のタイプ 1インターフェロンの量を制御することができる。その結果、偏った免疫バランスを調節し、 RAをはじめとする自己免疫疾患を伴う関節炎のより本質的な治療を実現できる可能性がある。

[0015] 本発明者らは、生体内において IPCの活性を調節することができれば、自己免疫疾患を伴う関節炎の症状を改善できると考えた。そして本発明者らは、 IPCの細胞表面抗原を認識する数多くの抗体を作成し、 IPCの活性に及ぼす影響を解析した。その結果、特定の抗原を認識する抗体は、 IPCの活性を調節する作用を有することを明ら力にした。更に、その自己免疫疾患を伴う関節炎治療効果を解析した。そして IPCの活性を抑制する抗体によって、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果が得られることを確認して本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の自己免疫疾患を伴う関節炎療剤、治療方法、並びに治療剤のスクリーニング方法に関する。

〔1〕インターフロン産生細胞の活性抑制物質を有効成分として含有する自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤。

〔2〕インターフェロン産生細胞の活性抑制物質力インターフェロン産生細胞のインターフロン産生および細胞の生存のいずれ力、または両方を抑制する作用を有する物質である〔1〕に記載の治療剤。

〔3〕インターフェロン産生細胞の活性抑制物質力インターフェロン産生細胞のインターフロン産生および細胞の生存のいずれ力、または両方を抑制する作用を有する抗体である〔2〕に記載の治療剤。

〔4〕抗体が、 BST2およびそのホモログのいずれか、または両方を認識する抗体、またはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片である〔3〕に記載の治療剤。

〔5〕抗体が、 FERM BP-10339として寄託されたハイブリドーマ 3D3#7、または FERM B

P-10340として寄託されたハイブリドーマ 3G7#6が産生するモノクローナル抗体の、少なくとも抗原結合領域を含む抗体である〔4〕に記載の治療剤。

〔6〕インターフロン産生細胞の活性を抑制する工程を含む、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療方法。

[7]抑制すべきインターフェロン産生細胞の活性力インターフェロン産生細胞のィンターフェロン産生および細胞の生存のいずれか、または両方である〔6〕に記載の治療方法。

〔8〕インターフェロン産生細胞の活性を抑制する工程力インターフェロン産生細胞のインターフェロン産生および細胞の生存の、ずれか、または両方を抑制する作用を有する抗体を投与する工程を含む、〔7〕に記載の治療方法。

〔9〕抗体が、 BST2およびそのホモログのいずれか、または両方を認識する抗体、またはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片である、〔8〕に記載の治療方法。

〔10〕抗体力 FERM BP-10339として寄託されたハイブリドーマ 3D3#7、または FERM

BP-10340として寄託されたハイブリドーマ 3G7#6が産生するモノクローナル抗体の、少なくとも抗原結合領域を含む抗体である〔9〕に記載の治療方法。

〔11〕次の工程を含む、被験化合物の自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果の検出方法。

(1)インターフェロン産生細胞とインターフェロン産生細胞のインターフェロン産生誘導物質を、以下の i)-iii)の、ずれかの順序で接触させる工程、

0被験化合物とインターフェロン産生細胞を接触後に、インターフェロン産生を誘導する細胞刺激剤をインターフェロン産生細胞に接触させる、

ii)被験化合物とインターフェロン産生を誘導する細胞刺激剤を同時にインターフエ口ン産生細胞に接触させる、または

iii)インターフェロン産生を誘導する細胞刺激剤をインターフェロン産生細胞に接触させた後に、被験化合物とインターフェロン産生細胞を接触させる

(2)インターフェロン産生細胞の活性を測定する工程、および

(3)対照と比較して、インターフロン産生細胞の活性が抑制されたとき、被験化合物の関節炎の治療効果が検出される工程

〔12〕細胞刺激剤がウィルス、ウィルスの構成要素、およびバクテリアの DNAからなる群力選択される少なくとも 1つの細胞刺激剤である〔11〕に記載の方法。

〔13〕被験化合物が、インターフェロン産生細胞を認識する抗体またはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片である〔11〕に記載の方法。

〔14〕〔11〕に記載の方法によって自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果が検出された被験化合物を選択する工程を含む、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果を有する化合物のスクリーニング方法。

〔15〕〔14〕に記載のスクリーニング方法によって選択されたィ匕合物を有効成分として含有する自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤。

[0016] あるいは本発明は、インターフロン産生細胞の活性抑制物質の、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤の製造における使用に関する。あるいは本発明は、上記スクリ一-ング方法によって選択されたィ匕合物の、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤の製造における使用に関する。

ところで、 IPCを認識する既知のモノクローナル抗体である抗 BDCA-2モノクローナノレ抗体 (Dzionek, A. et al. J.Immunol. 165: 6037-6046, 2000.)は、ヒ HPCの IFN産生を抑制する作用を有することが明らかにされて、る。その他にもマウスのインターフエロン産生細胞を認識するモノクローナル抗体力インターフェロンの産生を抑制することも報告されている (Blood 2004 Jun 1;103/11:4201- 4206. Epub 2003 Dec)。マウスのプラズマ細胞様榭状細胞 (Plasmacytoid Dendritic Cell)に対するモノクローナル抗体による榭状細胞数の減少が報告された (J. Immunol. 2003, 171:6466-6477)。しかしこれらの抗体の自己免疫疾患を伴う関節炎の治療に対する治療効果は未知である。発明の効果

[0017] 本発明により、 IPCを標的とする自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤が提供された。すなわち IPCの活性抑制剤によって、自己免疫疾患を伴う関節炎を治療しうることが明ら力となった。 IPCは、たとえば IPCの細胞表面抗原を認識する抗体などの投与によってその活性が抑制される。たとえば、 BST2並びにそのホモログに対する抗体は、 IPCに結合してその IFN産生および細胞の生存そのものに対して抑制的に作用する。そして BST2に結合する抗体は、生体内に投与した場合に、実際に RAに対する治療効果が確認された。

[0018] 本発明においては、 IPCの機能調節によって自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果を達成した。既に Type 1 IFNの拮抗剤について、 RAの治療効果を示す可能性が開示されているが、十分な効果は示されていない。一方本発明は、 IFNの機能調節ではなぐ IFNを産生する細胞を標的とする治療戦略を提供した。つまり本発明のァブローチは、より本質的な RA治療を可能とする。より具体的には、たとえば、本発明におヽては次のようなメリットが期待できる。

[0019] まず、 IPCの活性抑制剤は、少量でも高度な治療効果を達成することができる。 IPC は、わずかな細胞が多量の IFNを産生する。 IFNの中和には、 IFNの分子数に応じた抗体が必要である。しかし本発明においては、産生細胞の活性が直接抑制される。その結果、抗 IFN抗体による中和と比較して、より少量の抗体で強力な IFNの抑制効果を期待できる。抗体ある、は可溶性受容体などによって IFNの機能を調節する場合、 IFNの濃度に応じた治療剤が必要となる。一方、 IPCの活性調節剤は、きわめて多量の IFNを産生している IPCに直接作用する。そのため、 IFNの産生を効率的に抑制することができる。一般的に、抗体医薬の製造コストは高い。現在のところ、製造コストの大幅な抑制を実現できる方法は確立されていない。したがって、治療に必要な抗体の投与量が少ないことは、経済的な大きな利点である。また投与量が少ないことは、経済的に有利なだけでなぐ副作用の危険性を小さくすることにもつながる。

[0020] 更に、持続的に IFNが産生されている場合には、 IFNの抗体による中和は、一過的な抑制に留まると予想される。 IFNに結合した抗体は免疫複合体を形成し、貪食細胞などの作用によって速やかに除去される。そして、抗体の IFN活性中和作用は失われる。 IPCは高度な IFN産生機能を有する細胞である。したがって、抗 IFN抗体の作用によって一時的に IFN濃度を低下させたとしても、 IFNは再び速やかに補充されてしまう可能 ¾が高い。

一方、本発明においては、 IPCの活性を抑制することから、長期間にわたる IFN産生抑制効果が期待できる。特に、本発明の望ましい態様によれば、 BST2あるいはそのホモログを認識する抗体は、 IPCの IFN産生のみならず、細胞数をも抑制する。つまり、新たな IPCが供給されるまでは、 IFN産生の抑制効果が持続する。また IPCが産生し得る他の炎症性サイト力インの産生も直接的あるいは間接的に抑制されることになる。これらの効果が相乗的に作用し、 IFNの産生は効果的に抑制される。その結果、 RA の高度な治療効果が達成される。特に RAのような慢性の疾患の治療方法にぉ、ては、治療効果の持続性が大きな利点となる。

図面の簡単な説明

[図 l]FLT-3リガンド添加後、 10日間培養したマウスの骨髄細胞 (IPCが濃縮されている）の細胞表面を、作製した抗体及び他のマーカーで染色した FACS解析像である。培養上清陽性分画、陰性分画をそれぞれ R2、 R3とした。グラフ内の、 R1 &R2は抗体陽性の細胞集団、 Rl &R3は抗体陰性の細胞集団を表わす。

[図 2]各モノクローナル抗体で抽出した細胞の形態を表わす顕微鏡写真 (x400)である。（a)はインフルエンザウイルス PR8に感染させる前の形態、（b)はインフルエンザゥィルス PR8と 24時間培養した後の形態を示す。感染後の細胞は榭状突起を持ち、榭状細胞に典型的な形態を示した。

[図 3]モノクローナル抗体 SNK01を用いて分離した細胞のインターフェロン産生能を示すグラフである。図中、横軸は細胞の処理の種類を、縦軸は培養上清中の IFN a 濃度 (pg/mL)を示す。横軸の P(+)はモノクローナル抗体に結合した細胞にウィルスを感染させた場合、 N(+)はモノクローナル抗体に結合しなカゝつた細胞にウィルスを感染させた場合、そして N (—)はモノクローナル抗体に結合しなカゝつた細胞にウィルスを感染させなかった場合の結果を示す。

[図 4]モノクローナル抗体 SNK01のインターフェロン産生能への影響を示すグラフである。図中、横軸は処理に用いた抗体の濃度^ g/mL)を、縦軸は培養上清中の IFN a 濃度 (pg/mL)を示す。横軸の (-)はウィルス処理していない場合の結果を示す。 SNK0 1は濃度依存的にインターフロン産生抑制活性を示した。

[図 5]モノクローナル抗体 SNK01によるウェスタンブロッテイングアツセィの結果を示す写真である。写真上は抗 Hisタグ抗体、下は本発明のモノクローナル抗体 SNK01による結果を示す。写真左側が PCDNA3.1- mBST2DHis、右側が pcDNA3.1- mBST2H- Hi sで形質転換した COS7細胞の結果である。培養した細胞を溶解処理した際の沈殿物 (P)と上清 (S)についての結果を示した。

[図 6]マウス BST2の mRNA発現レベルを組織、細胞間で比較した結果を示す写真である。レーンはそれぞれ解析した組織、細胞を示す。

[図 7]マウス BST2及びそのホモログのアミノ酸配列とゲノム構造を示す図である。（a)は各ァイソフォームのアミノ酸配列のァライメントを、（b)はェキソンマッピングを示す。

[図 8]ヒト BST2及びそのホモログのアミノ酸配列とゲノム構造を示す図である。（a)は各ァイソフォームのアミノ酸配列のァライメントを、（b)はェキソンマッピングを示す。

[図 9]ヒト BST2の mRNA発現レベルを組織、細胞間で比較した結果を示す写真である

[図 10]作製したマウス BST2に対するモノクローナル抗体のインターフェロン産生能への影響を示すグラフである。図中、横軸は処理に用いたハイプリドーマ培養上清の種類を、縦軸は培養上清中の IFN a濃度 (pg/mL)を示す。 CpGは CpGで処理した際、 P R8はインフルエンザウイルス PR8を感染させた際の結果を示す。

[図 11]作製したヒト BST2に対するモノクローナル抗体のインターフェロン産生能への影響を示すグラフである。図中、横軸は処理に用いた抗体の種類と濃度、縦軸はヒト I PCを HSVで刺激した際の培養上清中の IFN a濃度 (pg/mL)を示す。

[図 12a]野生型マウス（WT)あるいは IFNレセプターノックアウトマウス（IFNR- KO)の各種細胞を CpGある!/、はインフルエンザウイルス PR8で刺激した後、蛍光色素 Alexa488 で標識した SNK01抗体で染色した図である。横軸は SNK01の蛍光強度、すなわち BS T2の発現強度を、縦軸は細胞数を示す。（a)は全脾臓細胞を解析した図である。

[図 12b] (b)は各細胞を分画して解析した図である。

[図 12c] (c)は IPCを分画して解析した図である。

[図 13]ヒト IPCのマーカーとして抗 BDCA- 4、 BDCA- 2抗体を用いて、ヒ HPCを IFN a にて刺激した際の BST2の発現を検討した図である。横軸は 5C11#7抗体の蛍光強度、すなわち BST2の発現強度を、縦軸は細胞数を示す。

[図 14]ヒ HPCを CpGにて刺激した際の BST2の発現を検討した図である。横軸は、抗ヒト BST2抗体 3E2#8、 5C11#7の蛍光強度、すなわち BST2の発現強度を、縦軸は細胞数を示す。それぞれ太線は CpGで刺激した場合、点線は未刺激の場合のパターンを示す。

[図 15]抗マウス BST2抗体 SNK01を投与したマウス力も採取した細胞を用いて解析した図である。（a)は投与のスケジュールを示す。（b)は各臓器中の IPC割合を示し、横軸が投与した抗体を、縦軸が IPCの割合を示す。（-)は抗体のかわりに PBSのみを投与した群を示す。 (c)は骨髄細胞を CpGあるいはインフルエンザウイルス PR8で刺激した際に産生した IFNの濃度を示す。横軸が投与した抗体を示す。

[図 16]抗マウス BST2抗体 SNK01を投与し、ウィルス感染させたマウスを用いて解析した図である。（a)は投与のスケジュールを示す。（b)は血清中の IFN o;の濃度を示し、横軸が投与した抗体を示す。（c)は脾臓中の IPC割合を示し、横軸が投与した抗体を、縦軸が IPCの割合を示す。（-)は抗体のかわりに PBSのみを投与した群を示す。

[図 17a]関節炎惹起抗体カクテルを用いて作成したマウス関節リウマチモデルを用いて抗体の効果を検討した (n=15)。 (a)は抗体投与のスケジュールを示す図である。

[図 17b] (b)は関節炎を発症した割合を示す図である。縦軸が発症率、すなわち発症したマウスの数を生存して、るマウスの数で割った値を示し、横軸は抗体カクテル投与後の日数を示す。

[図 17c] (c)は関節炎スコアの平均値を示す図である。横軸は抗体カクテル投与後の日数を示す。 IgGはコントロールのラット IgGを示す。

圆 18]抗体を投与した関節リウマチモデルマウス (n=10)において、関節炎惹起抗体力クテル投与 16日目の血清中のリウマチ因子を測定した図である。縦軸が各個体の EL ISAの吸光度値、すなわち、リウマチ因子の量を示し、横軸は投与した抗体を示す。圆 19]抗体を投与した関節リウマチモデルマウス (n=10)において、関節炎惹起抗体力クテル投与 16日目の血清中の IFN aの濃度を ELISAによって測定した結果である。縦軸は各個体の血清中の IFN aの濃度 (pg/mL)を、横軸は投与した抗体を示す。圆 20]抗体を投与した関節リウマチモデルマウス (n=10)において、関節炎惹起抗体力クテル投与 16日目の血清中の TNF aの濃度を ELISAによって測定した結果である。縦軸は各個体の血清中の TNF aの濃度 (pg/mL)を、横軸は投与した抗体を示す。圆 21]抗体を投与した関節リウマチモデルマウスにおいて、関節炎惹起抗体カクテル投与 16日目の脾臓及び末梢血中の IPCの割合を FACSにより解析した図である。 (a) は FACSの解析像の例を示し、上段が末梢血、下段が脾臓のパターンを示す。左側がコントロール抗体を投与したマウス、右側が SNK01を投与したマウスのパターンである。四角で囲んだ細胞集団が IPCで上の数値はその細胞群の割合（％)を示す。 (b )は複数のマウスの結果をグラフに示したもので、縦軸が IPCの割合を示し、横軸は投与した抗体を示す。 No Abは抗体を投与していないマウスの結果である。

[図 22]関節炎惹起抗体カクテルを用いて作成した関節リウマチモデルマウスを用いて、発症後の抗体の効果を検討した図である (n=5)。縦軸は関節炎スコアの平均値を示し、横軸は抗体カクテル投与後の日数を示す。図中の矢印は抗体を投与したタイミングを示し、 IgGはコントロールとして投与したラッ HgGを示す。

発明を実施するための最良の形態

[0022] 本発明は、インターフェロン産生細胞の活性抑制物質を有効成分として含有する自己免疫疾患をともなう関節炎の治療剤に関する。本発明において、自己免疫疾患とは、免疫機能によって組織の障害や炎症力 Sもたらされていることを言う。免疫機能には、抗体による液性免疫と、免疫担当細胞による細胞性免疫が含まれる。本発明における自己免疫疾患は、自己抗原に対する免疫機構の発動によって定義することもできる。ここでいう自己抗原には、健常者の組織に存在する抗原に加えて、宿主に何らかの手段によって導入された外来性の抗原も含まれる。たとえば、感染、移植、あるいは接触などによって生体に導入された外来性の抗原に対する免疫機能の攻撃が細胞あるいは組織を障害することがある。このような障害は、本発明における自己免疫疾患に含まれる。生体が自己免疫疾患を有していることは、自己抗原に対する免疫機構の反応性を指標として検出することができる。自己免疫疾患の指標とすることができる自己抗原として IgGなどが知られている。

[0023] 一方、関節炎 (arthritis)は、関節組織の炎症によって定義される病態である。関節における炎症は、疼痛および関節の腫脹によって知ることができる。すなわち本発明における自己免疫疾患を伴う関節炎とは、自己免疫機構による細胞または組織の障害が観察され、かつ関節における炎症が見られる状態と言うこともできる。本発明における関節炎は、自己免疫機構による直接的な障害のみならず、間接的な障害も含まれる。たとえば、免疫担当細胞の機能亢進による炎症性サイト力インの産生過剰に起因する関節炎は、自己免疫疾患を伴う関節炎の体表的な病態である。更に、自己免疫疾患を含む、複合的なメカニズムによってもたらされる関節炎は、本発明における治療の対象である関節炎に含まれる。たとえば RAは、本発明における自己免疫疾患を伴う関節炎の代表的な疾患である。 RAの病態は、炎症性サイト力インや滑膜細胞の増殖などの複合的な要因によって構成される。より具体的には、以下のような関節炎は、本発明における治療の対象として好ましい。

慢性関節リウマチ（Rheumatoid arthritis； RA)

若年性関節リウマチ（Juvenile Idiopathic Arthritis ;JI A)

乾癬'性関節炎（psoriatic arthritis ;Ps A)

強 '性ぜ椎炎 (ankylosing spondylitis)

実際、 RAや乾癬性関節炎（psoriatic arthritis ;PsA。または PA)の患者においては、滑液や滑膜組織に多くの IPCが存在していて、病態形成に関与していることも示唆されている (Lande et al.， J. Immunol. 173:2815-2824, 2004)。このような事実からも、本発明に基づく IPCの活性の制御による関節炎の治療が有用であることが裏付けられる

[0024] 本発明において、慢性関節リウマチ (RA)とは、リウマチ性疾患のうち、特に慢性の関節炎を伴う疾患をいう。より具体的には、自己免疫性疾患の症状と、関節炎を伴う疾患が、慢性関節リウマチに含まれる。自己免疫性疾患の症状は、たとえば、血中の RFの存在によって確認することができる。あるいは、 Thlリンパ球の増加、あるいは関節組織への浸潤を指標として、自己免疫疾患症状を確認することもできる。 RAは本発明における自己免疫疾患を伴う関節炎として好ましい。

[0025] 若年性関節リウマチ (Juvenile Idiopathic Arthritis JIA)は、症状が関節リウマチに類似する 16歳未満の小児に発症する慢性関節炎である。乾癬性関節炎（Psoriatic Art hritis)は、種々の免疫異常によって生じる皮膚の慢性再発性炎症性角化症である乾癬に合併して見られる多発性関節炎である。また、強直性脊椎炎 (Ankylosing spond ylitis)は、症状は関節リウマチに類似しているが、 HLA-B27陽性者が高頻度であり、微生物抗原と HLA-B27分子に共通抗原があって、異常な免疫応答の原因となると考えられて!/ヽる疾患である。

[0026] 以上のような疾患は、いずれも IPCによって自己免疫機構の亢進力もたらされていると考えられる。したがって、 IPCの機能抑制に基づく自己免疫疾患の調節によって治療効果が期待できる。したがって、本発明においては、これらの疾患を、 IPCの機能亢進による自己免疫疾患を有する関節炎と言うこともできる。 [0027] また、本発明におけるインターフェロン産生細胞 (IPC)とは、 IFN産生能を有する細胞を言う。たとえば、インターフェロンを産生し、細胞表面に BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方を発現する細胞は、本発明における IPCに含まれる。本発明において、 BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方の発現とは、これらの分子が細胞の活性ィ匕に伴って発現する場合を含む。たとえばヒト並びにマウスにおいて、榭状細胞の前駆細胞であって、刺激により IFNを産生する細胞は、 IPCとして好ましい。以下、特に断りの無い場合には、 IPCは、榭状細胞の前駆細胞である細胞のみならず、 IFN産生能を有し、かつ細胞表面に BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方を発現する細胞を含む。このような IPCの同定方法は公知である。たとえばいくつかの細胞表面マーカーを指標として IPCを他の血液細胞と識別することができる。具体的には、ヒト IPCの細胞表面マーカーのプロファイルは次のとおりである (Shor tman.K. and Liu, YJ. Nature Reviews 2: 151—161, 2002)。近年になって、 BDCA— 2陽性細胞を IPCと位置づける報告もある (Dzionek, A. et al. J.lmmunol. 165: 6037-6046, 2000.)。したがって、 BDCA-2陽性細胞は、本発明における IPCとして好ましい。

[ヒ HPCの細胞表面抗原のプロファイル]

CD4陽性、 CD123陽性、

Uneage(CD3、 CD14、 CD16、 CD19、 CD20、 CD56)陰性、 CDllc陰性

[0028] あるいはマウス IPCは、以下のプロファイルによって定義されている。

[マウス IPCの細胞表面抗原のプロファイル]

-CDllc, B220、 Ly6C、および CD45RBが陽性

— CDllb、 CD3、 CD19が陰性

更に、ヒトあるいはマウスの IPCに共通して見られる特徴として、以下のような特徴を示すことができる。

[細胞の形態上の特徴]

プラズマ細胞に似ている

細胞表面が平滑な丸、細胞

—核が比較的大きい

[細胞の機能的な特徴] —ウィルス感染時に、短期間に大量の Type-1 interferonを産生するウィルス感染後、榭状細胞に分化する

[0029] 本発明において、 IPCの活性抑制とは、 IPCが有する機能の少なくとも一つを抑制することを言う。すなわち、 IPCの活性抑制剤には、 IPCが有する機能の少なくとも一つを抑制する任意の物質が含まれる。 IPCの機能として、 IFNの産生と細胞生存を示すことができる。細胞の生存は、細胞数と言い換えることもできる。したがって、これらの機能の両方あるいはいずれかを抑制する場合に、 IPCの活性を抑制すると言う。そして、これらの機能の両方あるいはいずれかを抑制する物質を、 IPCの活性抑制剤として利用することができる。

[0030] IPCによって産生されるタイプ 1IFNが種々の疾患の原因となっていることが明らかにされている。したがってその産生を抑制することは、それらの疾患の治療戦略として有用である。たとえば、自己免疫性の疾患の病態と IFN aの関連性が指摘されている。 IFN o;の大部分が IPCによって産生されている。したがってその産生を抑制すれば、 IFN o;によってもたらされる病態を緩和することができる。なお本発明において、 IPC による IFN産生抑制とは、 IPCが産生する IFNの少なくとも 1種類の IFN産生を抑制することを言う。本発明における好ましい IFNは、タイプ 1IFNである。中でも IFN aは重要である。

[0031] IPCには、少数の細胞で大量の IFNを産生する細胞が含まれる。たとえば、ウィルスなどで刺激を受けた榭状細胞の前駆細胞は、生体が産生する IFNの大部分を産生する。大量の IFNを産生する IPCの細胞数を抑制することは、結果として IFNの産生量を抑制することになる。したがって、 IPCの細胞数の抑制によっても、 IFN aによってもたらされる病態を緩和することがでさる。

[0032] 本発明にお、て、好ま、IPCの活性抑制剤は、 IPCの細胞表面抗原を認識し、その活性を抑制する抗体である。具体的には、 IPCのインターフェロン産生能、および I PCの細胞の数のいずれか、または両方を抑制する抗体である。ある抗体が、 IPCの活性を抑制することは、たとえば後に述べる自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果の検出方法などによって確認することができる。たとえば本発明者らは、 BST2およびそのホモログの、ずれかまたは両方を認識する抗体力 IPCの活性を抑制することを確認した。

すなわち本発明は、 BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方を認識する抗体、またはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片を有効成分として含有する自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤に関する。また本発明は、 BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方を認識する抗体、またはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片を投与する工程を含む、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療方法に関する。あるいは本発明は、 BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方を認識する抗体、またはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片の、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤の製造における使用に関する。

[0033] 本発明にお、て、 IPCは BST2およびそのホモログの!/、ずれかまたは両方を発現し、かつ IFNを産生する細胞であれば特に限定されない。たとえば、ヒト、およびマウスにお！、ては、 IPCが BST2およびそのホモログの!/、ずれかまたは両方を発現して、ることが確認された。したがって、ヒト、およびマウスの IPCは、本発明における IPCとして好ましい。特にヒト IPCにおいては、その活性化に伴って BST2およびそのホモログの発現レベルが顕著に上昇する。そのため、 BST2およびそのホモログを認識する抗体は、ヒトにおいては、活性化された IPCに対して特異的に作用する。したがって、ヒ HPC は本発明の IPCとして特に好ましい。

本発明者らは、 BST2あるいはそのホモログに対する抗体力 IPCの活性を抑制することを明らかにした。そして、 IPCの活性抑制を通じて、 RAの症状を緩和しうることを確認した。すなわち本発明者らは、 IPCの活性を抑制する方法を見出し、そして実際にその方法によって IPCの活性を抑制することによって RAの治療を実現できることを確認した。これらの知見に基づいて、 IPCの機能の抑制力自己免疫疾患を伴う関節炎の治療戦略として有用であることが明らかにされた。

[0034] その他、 BDCA- 2に対する抗体 (Dzionek, A. et al. J.Immunol. 165: 6037-6046, 20 00.)も、 IPCの機能を抑制することが明らかにされている (Dzionek, A. et al. J. Exp. M ed. 194;1823-34. 2001.)。したがって、 BDCA-2に結合する抗体も、本発明における「 IPC活性抑制物質」として利用することができる。

[0035] 本発明において、 BST2遺伝子は、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列によって定義されるヒト由来の蛋白質である。配列番号： 2に記載のアミノ酸配列は配列番号： 1に記載の塩基配列からなる cDNAによってコードされて!/、る。ヒト BST2の cDNAのクローユングと、モノクローナル抗体についての報告がある (Ishikawa J. et al. Genomics 26: 527, 1995; GenBank Acc#.D28137)₀ BST2は、プレ B細胞増殖支持能を有する膜蛋白質であるとされた (特開平 7-196694)。 BST2のゲノム遺伝子とプロモーターについての知見も得られている (WO99/43803)。また、ヒト BST2は、ミエローマに対するモノクローナル抗体である抗 HM1.24抗体が認識している抗原であることが明らかにされている (Ohmoto T. et al. B.B.R.C 258: 583, 1999)。抗 HM1.24抗体は、ヒトプラズマセルラインを免疫原として榭立されたモノクローナル抗体である (Goto T. et al. Blood 84:19 92, 1994)。その後ミエローマを特異的に認識することが明らかにされ、ミエローマの治療を目的としてヒト化抗体が作成された (Ozaki S. et al. Blood 93: 3922, 1999;： W 098/14580)。ヒトイ匕抗 HM1.24抗体は、造血組織の癌に対する治療効果を有している (WO02/064159)_o現在はその実用化を目指して臨床試験が進められている。以上のようにヒト BST2は、造血器系の腫瘍におけるマーカーとして利用されている。また、ヒト BST2に特異的に結合する抗体が、 T細胞や B細胞の活性化を抑制し、自己免疫疾患などの治療薬となりうることが示唆されている（特開平 10-298106)。しかし現在のところ BST2を認識する抗体と IPCの関連を示唆する報告は無い。

[0036] 本発明において、 BST2はそのホモログを含む。 BST2のホモログとは、配列番号： 2 に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質と定義することができる。このような蛋白質は、天然に存在する蛋白質を含む。一般に真核生物の遺伝子は、 IFN遺伝子等で知られているように、多型現象 (polymorphism)を有する。この多型現象によって生じた塩基配列の変化によって、 1または複数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および Zまたは付加される場合がある。このようにヒトに由来する蛋白質であって、かつ配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のァミノ酸が、置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列を有し、配列番号: 2 に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、本発明の BST2ホモログに含まれる。

[0037] 具体的には、たとえば BST2のスプライシングバリアント、あるいは遺伝子多型によつて生じる変異体は、 BST2ホモログに含まれる。たとえば本発明者らは、配列番号： 1 の塩基配列力もなる cDNAに対するスプライシングバリアントの存在を明らかにした。このスプライシングバリアントは、配列番号： 3または配列番号： 5に示す塩基配列力なり、配列番号： 4または配列番号： 6に記載のアミノ酸配列をコードして、た。

[0038] あるいは多型現象によって塩基配列に変化はあっても、アミノ酸配列が変わらない場合もある。このような塩基配列の変異は、サイレント変異と呼ばれる。サイレント変異を有する塩基配列からなる遺伝子も、本発明に含まれる。なおここで言う多型現象とは、集団内において、ある遺伝子が個体間で異なる塩基配列を有することを言う。一般に、遺伝学的には多型と変異は遺伝子型の分布率によって定義されている。しかしここで言う多型は、異なる塩基配列が見出される割合 (分布率)とは無関係である。

[0039] BST2のホモログは、ヒト以外の種における機能的に同等な蛋白質を含む。 BST2と機能的に同等な蛋白質は、たとえばハイブリダィゼーシヨンを利用して同定することができる。すなわち、配列番号： 1に示すような BST2をコードするポリヌクレオチド、あるいはその断片をプローブとし、これとハイブリダィズすることができるポリヌクレオチドを単離するのである。ハイブリダィゼーシヨンをストリンジェントな条件下で実施すれば、塩基配列としては相同性の高いポリヌクレオチドが選択され、その結果として単離される蛋白質には BST2と機能的に同等なタンパク質が含まれる可能性が高まる。

[0040] 本発明者らは、 BST2のマウスにおけるホモログに対する抗体力ヒトにおける抗体と同様にマウス IPCの活性を抑制することを確認した。マウス BST2は、配列番号： 9に記載の塩基配列を有し配列番号： 10に記載のアミノ酸配列をコードしていた。更に本発明者らは、 BST2のスプライシングノリアントである BST2Hについても同様に、マウスにおけるホモログの存在を確認した。マウス BST2Hの塩基配列は配列番号： 7に、この塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号： 8に示した。マウスの BST2H に対する抗体も、 IPCの活性を抑制することが確認された。

本発明において明らかにされたヒトとマウスの BST2とそのホモログの塩基配列情報、およびアミノ酸配列情報を以下にまとめた。

塩基配列アミノ酸配列アミノ酸配列の長さヒト BST2D 配列番号： 1 配列番号： 2 (180) ヒト BST2H 配列番号： 3 配列番号： 4 (158)

ヒト BST2HS 配列番号： 5 配列番号： 6 (100)

マウス BST2H 配列番号： 7 配列番号： 8 (178)

マウス BST2D 配列番号： 9 配列番号： 10 (172)

マウス BST2HS 配列番号： 22 配列番号： 23 (105)

[0041] なおストリンジヱントな条件とは、具体的には例えば 6 X SSC、 40%ホルムアミド、 25°C でのハイブリダィゼーシヨンと、 I X SSC、 55°Cでの洗浄といった条件を示すことができる。ストリンジエンシーは、塩濃度、ホルムアミドの濃度、あるいは温度といった条件に左右される。当業者は、これらの条件を必要なストリンジエンシーを得られるように適宜調節することができる。

[0042] ノ、イブリダィゼーシヨンを利用することによって、たとえばヒト以外の動物種における BST2のホモログをコードするポリヌクレオチドの単離が可能である。ヒト以外の動物種、すなわちマウス、ラット、ゥサギ、ブタ、あるいはャギ等の動物種力も得ることができるポリヌクレオチドがコードする BST2のホモログは、本発明における機能的に同等な蛋白質を構成する。

[0043] ノ、イブリダィゼーシヨン技術等を利用して単離されるポリヌクレオチドがコードする蛋白質は、通常、ヒト BST2D (配列番号： 2)とアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも 30%以上、好ましくは 50%以上、さらに好ましくは 80% 以上（例えば、 95%以上、あるいは 98%、更には 99%以上）の配列の同一性を指す。塩基配列やアミノ酸配列の同一性は、インターネットを利用したホモロジ一検索サイトを利用して調べることができる [例えば日本 DNAデータバンク（DDBJ)にお!/、て、 FAS TA、 BLAST, PSI-BLAST、および SSEARCH等の相同性検索が利用できる [例えば日本 DNAデータバンク（DDBJ)のウェブサイトの相同性検索（Search and Analysis)のへ' ~~ン； http://www.ddbj.nig.ac.Jp/E— mail/homology—j.ntml]。ま 7こ、 Nationalし ente r for Biotechnology Information (NCBI)において、 BLASTを用いた検索を行うことができる（例えば NCBIのホームページのウェブサイトの BLASTのページ； http：〃 www.n cbi.nlm.nih.gov/BLAST/; Altschul, S.F. et al" J. Mol. Biol, 1990, 215(3):403- 10; Altschul, S.F. & Gish, W.， Meth. EnzymoL, 1996, 266:460-480; Altschul, S.F. et al. , Nucleic Acids Res., 1997, 25:3389—3402)。

[0044] 例えば Advanced BLAST 2.1におけるアミノ酸配列の同一性の算出は、プログラムに blastpを用い、 Expect値を 10、 Filterは全て OFFにして、 Matrixに BLOSUM62を用い、 Gap existence cost、 Per residue gap cost、およひ Lambda ratioをてれてれ 11、 1 、 0.85 (デフォルト値）に設定して検索を行ヽ、同一性 (identity)の値 (％)を得ることができる（Karlin, S. and S. F. Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68; Karlin, S. and S. F. Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873—7)。

[0045] 更に既に構造が明らかにされている cDNA、あるいはゲノム DNAの塩基配列情報の検索によって、他の種における BST2ホモログを見出すこともできる。すなわち、公知の塩基配列情報ある、はアミノ酸配列情報を蓄積したデータベースを対象として、ヒト BST2の塩基配列情報および Zまたはアミノ酸配列情報をクエリーとする相同性検索によって、類似の配列情報が検索される。もしも他の種に由来する相同性の高い既知の遺伝子並びに蛋白質がデータベース中に存在すれば、相同性検索によって、それを見出すことができる。遺伝子の全長が同定されていなくても、 ESTなどの断片配列情報が得られれば、インシリコクローユングによって、遺伝子の全長配列を構成できる場合もある。こうして明らかにされた他の種に由来するホモログについて、実際に当該動物種の IPCにおける発現が確認できれば、本発明における BST2のホモログとして禾 IJ用することができる。

[0046] 本発明に用いる BST2およびそのホモログの、ずれかまたは両方を認識する抗体は、 BST2およびそのホモログ、あるいはそれらの断片を免疫原として調製することができる。本発明における抗体は、任意のクラスであってよい。また抗体が由来する生物種も限定されない。更に、抗体の抗原結合領域を含む断片を抗体として用いることができる。たとえば IgGの酵素的な消化によって生成される、抗原結合部位を含む抗体断片も、本発明における抗体として利用することができる。具体的には、パパインあるいはトリプシンによる消化によって、 Fabあるいは F(ab')2などの抗体断片を得ることができる。これらの抗体断片は、抗原との結合親和性を有する抗体分子として利用しうることは周知である。あるいは、必要な抗原結合活性を維持している限り、遺伝子組み換えによって構築された抗体を用いることもできる。遺伝子組み換えによって構築された抗体とは、たとえばキメラ抗体、 CDR移植抗体、あるいはシングルチェイン Fv等を示すことができる。任意の免疫原を利用してこれらの抗体を得る方法は公知である本発明にお、て、ある抗体の抗原結合領域を他の抗体の定常領域に接合したキメラ抗体や、ある抗体の CDRを他の抗体に移植した CDRグラフト抗体を、少なくとも抗原結合領域を含む抗体という。更に、抗原結合活性を維持した抗原結合領域を含む抗体断片も、少なくとも抗原結合領域を含む抗体に含まれる。

[0047] 本発明において、抗体は、必要に応じて修飾することができる。本発明によれば、 B ST2またはそのホモログの、ずれかまたは両方を認識する抗体は、 IPCの細胞数を抑制する作用を有する。すなわち、抗体そのものが IPCに対する細胞傷害性を有していると考えられた。強いエフェクター作用を示す抗体のサブクラスは公知である。あるいは、抗体を細胞傷害物質 (cytotoxic agent)によって修飾することによって、 IPCの活性抑制効果を更に増強することができる。細胞傷害物質としては、以下のような物質を示すことができる。

トキシン類：緑膿菌毒素 (Pseudomonas Endotoxin; PE)、ジフテリアトキシン、リシン放射性同位元素: Tc"^m、 Sr⁸⁹、 I¹³¹、 Y⁹°

抗癌剤：カリキアマイシン、マイトマイシン、パクリタキセル

蛋白質力もなるトキシン類は、 2官能性試薬によって抗体あるいはその断片などに結合することができる。あるいは、抗体をコードする遺伝子にトキシン類をコードする遺伝子を接合し、両者の融合蛋白質を得ることもできる。放射性同位元素を抗体に結合する方法も公知である。たとえば、キレート剤を利用して、抗体を放射性同位元素で標識する方法が公知である。更に抗癌剤は、糖鎖あるいは 2官能性試薬などの利用により、抗体に結合することができる。

[0048] 本発明にお、て用いられる抗体は、人為的に構造を改変された抗体であっても良い。たとえば、抗体の細胞障害作用や安定性を改善するための様々な修飾方法が公知である。具体的には、重鎖の糖鎖が改変されたィムノグロブリンが知られている（ Shinkawa, T. et al. J. Biol. Chem.278:3466-3473. 2003.)。糖鎖の改変によって、ィムノグロブリンの ADCC (抗体依存性の細胞障害; Antibody Dependent Cell-mediated C ytotoxicity)活性が増強された。あるいは、 Fc領域のアミノ酸配列を改変されたィムノグロブリンも公知である。すなわち、ィムノグロブリンの Fc受容体との結合活性を人為的に高めることによって、 ADCC活性が増強された（Shield,RL.et al. J.Biol.Chem. 27 6;6591- 6604, 2001.)。

また、 Fc受容体に結合した IgGは、細胞内にいったん取り込まれる。その後、エンドノームに発現した Fc受容体と結合して、再び血中に放出される現象が明らかにされている。 Fc受容体との結合活性が高い IgGは、細胞に取り込まれた後に再び血中に放出される可能性が高まる。その結果、 IgGの血中における滞留期間が延長される (H inton.PR. et al. J Biol Chem. 279:6213-6216. 2004)。その他、 Fc領域のアミノ酸配列の改変は、 CDC (補体依存性の細胞障害作用; Complement Dependent Cytotoxicity )活性の変化をもたらすとも言われてヽる。これらの改変を施した抗体を本発明における抗体として用いることができる。

[0049] たとえばモノクローナル抗体は、当該モノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞力も採取することができる。本発明に用いることができるモノクローナル抗体の産生細胞は、たとえば BST2またはそのホモログ、その断片、あるいはそれらを産生する細胞またはその細胞膜分画を免疫原として免疫動物に投与し、その抗体産生細胞をクロ一-ングすることによって取得することができる。より具体的には、本発明に用いる抗体は、たとえば次の工程を含む方法によって得ることができる。

( BST2またはそのホモログを免疫原として免疫動物に投与する工程

(2) (1)の免疫動物の抗体産生細胞から、 BST2を認識する抗体を産生する抗体産生細胞を選択する工程、

(3) (2)で選択された抗体産生細胞を培養するか、または当該抗体産生細胞が産生する抗体をコードする遺伝子を単離し、この遺伝子を発現可能に保持する細胞を培養する工程、および

(4) (3)の培養物からインターフェロン産生細胞の活性を抑制する抗体を回収する工程

[0050] 一般的なモノクローナル抗体の製造方法においては、免疫細胞と腫瘍細胞との細胞融合によって得られるハイプリドーマが抗体産生細胞として利用される。本発明における免疫原には、 BST2またはそのホモログ、あるいはその断片を用いることができる。免疫原は、それをコードする遺伝子で形質転換した細胞から精製することができる。更に、 BST2またはそのホモログを発現している細胞を免疫原として利用することができる。このような細胞としては、具体的には以下のような細胞を示すことができる。これらの細胞の細胞膜分画を免疫原とすることもできる。

—生体力も採取された IPC

一造血幹細胞などから分化誘導された IPC

一外来性の BST2またはそのホモログ遺伝子を発現可能に保持する細胞

生体から IPCを採取するためには、たとえば先に述べたような細胞表面マーカーの発現プロファイルに基づいて、目的とする細胞を採取すればよい。複数の細胞表面マーカーを指標として特定の細胞を集めるための方法は公知である。たとえば免疫染色とセルソーターを利用することによって、目的とする発現プロファイルに適合する細胞を容易に分取することができる。たとえばヒトの IPCは、 BDCA-2陽性細胞を選択することにより、 IPCが濃縮される。ヒトから採取された IPCは、必要に応じて活性化された後に免疫原として利用される。

IPCは、生体の末梢血あるいは造血組織以外に、培養細胞として得ることもできる。たとえばヒトおよびマウスの造血幹細胞を培養し、 IPCに分ィ匕させることによって大量に得ることができる。ヒトおよびマウス造血幹細胞を in vitroで IPCに分化させるための条件は公知である。

[0051] たとえば、 in vitroにおける造血幹細胞からのヒト (Blom, B. et al.J.Exp.Med. 192: 17 85-1796, 2000.； Chen, W. et al. Blood 103: 2547-2553, 2004.)、およびマウス (Gillie rt et al 2002, J. Exp. Med. 958-953)の IPCの誘導が報告されている。あるいは in vivo でのマウス IPCの誘導も公知である (Bjorckらの Blood 2001, 3520-3526)。 in vitroで分ィ匕させた IPCは、 IPCを認識するモノクローナル抗体を得るための免疫原として有利である。

[0052] 具体的には、造血幹細胞を含む細胞集団を IPC誘導剤の存在下で培養すること〖こより、 IPCへの分化が誘導される。造血幹細胞を含む細胞集団としては、たとえば骨髄細胞を用いることができる。また IPC誘導剤には、 FLT-3リガンド、あるいは FLT-3リガンドとトロンボポェチン (TPO)の組み合わせを用いることができる。培地中の FLT-3 リガンドの濃度は、通常 1〜： LOOng/mLとすることができる。その他の培養条件は、一般的な血液細胞の培養条件を応用すればよい。すなわち基礎培地としては、 RPMI1 640等を用い、更に 10%程度の牛胎児血清をカ卩えることができる。あるいはヒ HPCの誘導においては、 Yssel's Mediumが用いられた。 in vitroにおける IPCへの分化は、ヒトでは、たとえば 25日前後にピークを迎える。

[0053] 培養された造血幹細胞から、 IPCに分化した細胞を取得すれば、免疫原のための I PCを得ることができる。実際には、いくつかの細胞表面マーカーを利用して、 IPCに特徴的な細胞表面抗原を有する細胞を分取する。すなわち、たとえば BDCA-2陽性細胞をヒ HPCとして取得することができる。あるいは、 CDllc陽性、 CDllb陰性、および B220陽性の細胞分画をセルソーターで分取しマウス IPCを得ることができる。

あるいは、既に IPC特異的であることが明らかな抗体を利用して、当該抗体陽性の細胞を IPCとして分取することもできる。本発明者らが榭立した、マウス IPC特異抗原を認識するモノクローナル抗体産生細胞 2E6(WO 2004/013325, FERM- BP-8445)が産生するモノクローナル抗体を、マウス IPCの分取に利用することができる。

[0054] IPCは、末梢血力も分取することもできる。しかし先に述べたように IPCの末梢血におけるポピュレーションは極めて低いので、末梢血から IPCを採集するには多量の血液が必要となる。したがって、免疫原とする IPCには、造血幹細胞から分化させた細胞を利用するのが有利である。

[0055] 本発明に用いるモノクローナル抗体の調製においては、 IPCのみならず、配列番号

: 2、配列番号: 4、および配列番号: 6からなる群力選択されるいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質、またはその断片を免疫原として利用することもできる。本発明のモノクローナル抗体は、配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群力も選択される、ずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質を抗原として認識していることが明らかにされた。したがって、これらの蛋白質を免疫原として用いることによって、本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。

[0056] 配列番号： 2、配列番号： 4、および配列番号： 6からなる群から選択される、ずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質は、組み換え体として得ることができる。たとえば配列番号： 1に記載の塩基配列は、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列をコードして、る。また配列番号： 3に記載の塩基配列は配列番号： 4に記載のアミノ酸配列をコードしている。したがって、これらの塩基配列からなる DNAを適当な宿主ベクターを使って発現させれば、目的とする蛋白質を得ることができる。

[0057] あるいは、配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号: 6からなる群から選択されるいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列力選択された連続するアミノ酸配列力もなるオリゴペプチドを免疫原とすることもできる。免疫原として選択すべきアミノ酸配列は、たとえば 5— 50、好ましくは 7— 20程度のアミノ酸力もなる。任意のアミノ酸配列を有するオリゴペプチドを得る方法は公知である。たとえば、化学的にアミノ酸を結合させて、目的とするアミノ酸配列を有するオリゴペプチドを得ることができる。あるいは、上記組み換え体として得られた全長アミノ酸配列を有する蛋白質を切断することによって、所定のアミノ酸配列を有する断片を得ることもできる。得られたオリゴぺプチドは、適当なキャリアー蛋白質と結合することによって、より免疫原性を高めることができる。キャリアー蛋白質には、キーホールリンペットへモシァニンゃゥシ血清アルブミンなどが用いられる。

[0058] 配列番号： 2と、配列番号： 4および配列番号： 6のアミノ酸配列の大部分は一致している。したがって、共通のアミノ酸配列力も選択されたアミノ酸配列を利用することによって、これらの蛋白質の全てを認識するモノクローナル抗体を得ることができる。また 3種類の蛋白質のそれぞれについて、 2種類が共有するアミノ酸配列を利用することによって、特定の 2つの蛋白質を、他の 1つと識別することができる。あるいは各アミノ酸配列に固有のアミノ酸配列を利用することによって、各蛋白質を特異的に識別するモノクローナル抗体を取得することもできる。たとえば、配列番号: 4に記載のァミノ酸配列において、 N末端から 139〜158のアミノ酸配列は、配列番号: 4に固有のアミノ酸配列である。同様に、配列番号: 6に記載のアミノ酸配列においては、 N末端から 96〜100のアミノ酸配列力配列番号： 6に固有のアミノ酸配列である。

[0059] 続いて免疫原を、適当な免疫動物に免疫する。 IPCは適当なアジュバントとともに免疫動物へ投与することができる。あるいは、配列番号：2、配列番号: 4、および配列番号: 6からなる群力選択されるいずれかの配列番号に記載の蛋白質、若しくはその部分アミノ酸配列力もなるペプチドを、アジュバントとともに免疫動物に投与することがでさる。

[0060] 更に、配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号: 6からなる群から選択されるいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列をコードする DNAを発現可能に保持した形質転換細胞を免疫原として利用することができる。たとえば配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれかの配列番号に記載の塩基配列のコード領域を構成する塩基配列を含む DNAは、上記 DNAとして好ましい。これらの DNAを適当な発現ベクターに組み込み、宿主細胞を形質転換すれば免疫原として有用な形質転換細胞を得ることができる。

[0061] 免疫原とするための宿主細胞は、免疫動物と同じ種に由来する細胞とすることができる。同種の細胞を用いることにより、外来性の蛋白質に対する特異的な免疫応答を誘導することができる。たとえば、免疫動物にラットを用いるのであれば、ラットに由来する宿主細胞を用いるのが有利である。上記蛋白質を含む形質転換細胞の分画を免疫原として用いることもできる。実施例に示したように、配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号: 6力なる群力選択されるいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列には、膜貫通ドメインが見られた（図 8の膜貫通領域; transmembrane region) ₀したがって、これらのアミノ酸配列を有する蛋白質は、細胞膜に発現する可能性がある。実際に COS細胞に発現させた場合には、配列番号: 8および配列番号： 10に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質は、形質転換体培養物の沈殿分画においてより多くの蛋白質が検出された。したがって、上記蛋白質を発現する細胞の、細胞膜分画を免疫原として利用できる。

[0062] 本発明における免疫動物は、 IPCを異物と認識するあらゆる非ヒト脊椎動物を利用することができる。モノクローナル抗体を得るためには、ハイプリドーマとするための融合パートナーの入手が容易な動物が有利である。たとえば、マウス、ラット、ラビット、ゥシ、ャギなどの細胞に由来するハイブリドーマの樹立が確立されている。これらの免疫動物を、本発明に用いることができる。一方アジュバントには、フロイントの完全アジュバントゃフロイントの不完全アジュバント等が用いられる。

[0063] 免疫動物は、 3〜： L0日間隔で複数回免疫される。 1回の免疫に用いられる IPCの数は、任意である。通常、 10³〜10⁸、たとえば 10⁶の IPCが免疫される。また蛋白質ゃぺプチドによる免疫においては、一般に 1〜： LOO /z gが免疫される。複数回の免疫を経た免疫動物から免疫担当細胞を回収し、目的とする抗体を産生する細胞をクロー二ングすることにより、本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。免疫担当細胞とは、免疫動物において抗体産生能を有する細胞を言う。

[0064] 免疫担当細胞は、たとえばハイプリドーマ法によってクローニングすることができる。

免疫担当細胞は、 1つの細胞が 1種類の抗体を産生している。したがって、 1つの細胞に由来する細胞集団を確立すること (すなわちクローユング）ができれば、モノクローナル抗体を得ることができる。ハイプリドーマ法とは、免疫担当細胞を適当な細胞株と融合させ、不死化する (immortalize)した後にクローユングする方法を言う。ハイブリドーマ法に有用な多くの細胞株が知られている。これらの細胞株は、リンパ球系細胞の不死化効率に優れ、かつ細胞融合に成功した細胞の選択に必要な各種の遺伝マーカーを有している。更に抗体産生細胞の取得を目的とする場合には、抗体産生能を欠落した細胞株を用いることもできる。

[0065] たとえばマウスミエローマ P3x63Ag8.653(ATCC CRL- 1580)は、マウスやラットの細胞融合法に有用な細胞株として広く用いられている。本発明においては、マウスの IP Cを免疫原としているので、免疫動物はマウス以外の動物となる。一般にハイプリドーマは、同種の細胞の融合によって作成される力近縁の異種間でのヘテロハイブリド一マ力モノクローナル抗体を取得することもできる。

[0066] 細胞融合の具体的なプロトコルは公知である。すなわち、免疫動物の免疫担当細胞を適当な融合パートナーと混合し、細胞融合させる。免疫担当細胞には、脾細胞や末梢血 B細胞などが用いられる。融合パートナーとしては、先に述べた各種の細胞株を利用することができる。細胞融合には、ポリエチレングリコール法や、電気融合法が用いられる。

次に、融合細胞が有する選択マーカーに基づいて、細胞融合に成功した細胞が選択される。たとえば HAT感受性の細胞株を細胞融合に用いた場合には、 HAT培地にぉ、て成育する細胞を選択することによって、細胞融合に成功した細胞が選択される。更に選択された細胞が産生する抗体が、目的とする反応性を有していることを確認する。

[0067] 各ノ、イブリドーマは、抗体の反応性に基づいて、スクリーニングされる。すなわち、 B ST2およびそのホモログのいずれ力または両方に結合する抗体を産生するハイブリド一マが選択される。好ましくは、選択されたノヽイブリドーマをサブクローユングし、最終的に目的とする抗体の産生が確認された場合に、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマとして選択する。

[0068] 具体的には、たとえば配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6力なる群から選択されるいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列力なる蛋白質や、その部分アミノ酸配列からなるペプチドを抗原としてスクリーニングすることができる。抗原を適当な固相に結合し、抗原に結合するモノクローナル抗体を、免疫動物のィムノグロブリンを認識する標識抗体によって検出することができる。マイクロプレートの内壁に抗原を結合させ、酵素標識抗体を使った ELISA法を利用すれば、モノクローナル抗体を迅速にスクリーニングすることができる。抗原に対する結合活性が確認されたモノクローナル抗体は、必要に応じて実際に IPCの活性に与える影響が確認される。 IP Cに対する影響は、たとえば後に述べるような方法によって確認することができる。

[0069] このようなモノクローナル抗体は、当該ハイプリドーマから抗体の抗原結合領域をコードする cDNAを取得し、これを適当な発現ベクターに挿入することによって発現させることができる。抗体の可変領域をコードする cDNAを取得し、適当な宿主細胞に発現させる技術は公知である。また抗原結合領域を含む可変領域を、定常領域と結合させること〖こよってキメラ抗体とする手法ち公知である。

[0070] 更に、モノクローナル抗体の抗原結合活性を他のィムノグロブリンに移植することもできる。ィムノグロブリンの抗原結合領域は、相補性決定領域 (CDR)と、フレーム領域で構成されてヽる。各ィムノグロブリンの抗原結合特性は CDRによって決定されており、フレームは抗原結合領域の構造を維持している。 CDRのアミノ酸配列がきわめて多様性に富むのに対して、フレーム部分のアミノ酸配列は高度に保存されている。 C DRを構成するアミノ酸配列を他のィムノグロブリン分子のフレーム領域に組み込むことによって、抗原結合活性も移植できることが知られている。この方法を利用して、異種のィムノグロブリンが有する抗原結合特性をヒト'ィムノグロブリンに移植する方法が確立されている。

[0071] このようにして作成されたモノクローナル抗体はヽずれも本発明に利用することができる。すなわち、当該モノクローナル抗体の抗原結合領域をコードする cDNAに由来するポリヌクレオチドによってコードされた抗原結合領域を含むィムノグロブリン力なるモノクローナル抗体を本発明に利用することができる。

本発明に利用することができるモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマとして、たとえば、ハイプリドーマ 3D3#7あるいは 3G7#6を示すことができる。ハイプリドーマ 3 D3#7およびハイプリドーマ 3G7#6は、 2005年 5月 27日付けで独立行政法人産業技術総合研究所内特許生物寄託センターに対して、受託番号 FERM BP-10339および受託番号 FERM BP-10340として寄託されている。以下に、寄託を特定する内容を記載する。

(a)寄託機関の名称'あて名

名称:独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター

あて名：日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 1号中央第 6 (郵便番号 305-8566)

(b)寄託日： 2005年 5月 27日

(c)受託番号： BP-10339 (ハイブリドーマ 3D3#7)

(c)受託番号： BP-10340 (ハイブリドーマ 3G7#6)

[0072] 本発明に利用するためのモノクローナル抗体は、それを産生するハイプリドーマを培養しその培養物から回収することができる。ハイプリドーマは、 in vitroまたは in vivo で培養することができる。 in vitroにおいては、 RPMI1640などの公知の培地を用いて、ノ、イブリドーマを培養することができる。培養上清には当該ハイプリドーマが分泌したィムノグロブリンが蓄積される。したがって、培養上清を採取し、必要に応じて精製することにより、本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。培地には、血清を添カロしない方力ィムノグロブリンの精製が容易である。しかし、ハイプリドーマのより迅速な増殖と、抗体産生の促進を目的として、 10%程度のゥシ胎児血清を培地にカロ免ることちでさる。

[0073] ノ、イブリドーマは、 in vivoにおいて培養することもできる。具体的には、ヌードマウスの腹腔にハイプリドーマを接種することにより、腹腔内でハイプリドーマを培養することができる。モノクローナル抗体は、腹水中に蓄積する。したがって、腹水を採取し、必要に応じて精製すれば、必要なモノクローナル抗体を得ることができる。得られたモノクローナル抗体は、目的に応じて適宜、修飾、あるいはカ卩ェすることができる。

[0074] BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方に結合する抗体は、 IPCに接触させるとその活性を抑制する。したがってこれらの抗体を、本発明における IPCの活性抑制剤に利用することができる。すなわち本発明は、下記 (a)- (c)力なる群力選択される少なくとも 1種類の成分を有効成分として含む、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤を提供する。あるいは本発明は、下記 (a)- (c)カゝらなる群カゝら選択される少なくとも 1種類の成分を投与する工程を含む自己免疫疾患を伴う関節炎の治療方法に関する。更に本発明は、下記 (a)- (c)力もなる群力も選択される少なくとも 1種類の成分の自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤の製造における使用に関する。

(a) BST2およびそのホモログの、ずれかまたは両方に結合する抗体、またはその抗原結合領域を含む断片

(b) (a)の抗体の相補性決定領域を移植したィムノグロブリン、またはその抗原結合領域を含む断片、および

(c) (a)または (b)に記載の成分をコードするポリヌクレオチド

本発明において、 IPCの活性を抑制するモノクローナル抗体としては、配列番号： 2 、配列番号: 4、および配列番号: 6力なる群力選択されるいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識するモノクローナル抗体を利用することができる。

[0075] 抗体が IPCの IFN産生活性の抑制作用を有することは次のようにして確認することができる。 IPCはウィルスの刺激によって IFNを大量に産生する。 IPCに対するウィルス刺激の前、後、あるいはウィルス刺激と同時に抗体を与え、抗体を与えない IPCを対照として、 IFNの産生能を比較する。 IFN産生能は、 IPCの培養上清中に含まれる IFN - aや IFN- βを測定することによって評価することができる。比較の結果、抗体の添加によって、上清中の IFNの量が有意に低下すれば、試験された抗体は、 IFN産生能を抑制する作用を有することが確認できる。これら IFNの測定方法は公知である。 I PCは、生体における IFNの大部分を産生する細胞である。したがって、 IPCの IFN産生能の抑制によって、生体の IFNの産生状態を調節することができる。

[0076] 本発明にお、て、 IPC活性には IPCの細胞数の維持が含まれる。したがって本発明における IPCの活性の抑制は、 IPCの細胞数の抑制を含む。 IFN産生と同様に、感染性のウィルスなどの刺激によって IPCの活性ィ匕が誘導される。活性ィ匕された IPCの細胞数が、抗体の存在下で抑制されることを確認すれば、当該抗体が IPCの活性を抑制していることがわかる。比較対照としては、 IFN産生と同様に、活性を確認すべき抗体と同じ動物種に由来する不活性なィムノグロブリンを用いることができる。 IPCの細胞数は、細胞の計数によって定量的に比較することができる。細胞数は、 FACSゃ顕微鏡によって計数することができる。

[0077] BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方を認識する抗体を、その抗体が由来する生物種とは異なる宿主に投与する場合には、当該宿主にとって異物と認識されにくい形にカ卩ェするのが望ましい。たとえば、次のような分子に加工することにより、ィムノグロブリンを異物として認識されに《することができる。ィムノグロブリン分子を以下のようにカ卩ェする手法は公知である。

一定常領域を欠失した抗原結合領域を含む断片 (Monoclonal Ant¾odies： Principle s and Practice, third edition, Academic Press Limited. 1995; Antioody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)

モノクローナル抗体の抗原結合領域と宿主のィムノグロブリンの定常領域とで構成されるキメラ抗体 (遺伝子発現実験マニュアル講談社 1994年（石田功、安東民衛編)）

一宿主のィムノグロブリンにおける相補性決定領域 (CDR)をモノクローナル抗体の CD Rに置換した CDR置換抗体 (遺伝子発現実験マニュアル講談社 1994年（石田功、安東民衛編)）

[0078] あるいはヒト抗体遺伝子を組み込まれた非ヒト動物を免疫動物として用いることにより、非ヒト動物を用いながら、ヒト抗体を得ることができる。たとえば、ヒト抗体遺伝子を組み込んだトランスジエニックマウス力ヒト抗体を製造するための免疫動物として実用化されている (Ishida et al., Cloning and Stem Cells, 4:85-95,2002)。このような動物を用いることにより、ヒトの BST2を抗原として、 BST2を認識するヒト抗体を得ることができる。ヒト抗体は、ヒトに投与する抗体として好ましい抗体である。

[0079] あるいは、ファージディスプレー法 (McCafferty J. et al.， Nature 348:552-554, 1990;

Kretzschmar T et.al, Curr Opin Biotechnol. 2002 Dec;13(6):598- 602.)によって、ヒトのィムノグロブリン可変領域遺伝子を取得することもできる。ファージディスプレー法にお、ては、ヒトイムノグロブリン可変領域をコードする遺伝子がファージ遺伝子に組み込まれる。多様なィムノグロブリン遺伝子をソースとして、ファージライブラリーを作成することもできる。ファージは自身を構成する蛋白質の融合蛋白質として、当該可変領域を発現する。ファージによって発現されたファージ表面の可変領域は、抗原との結合活性を維持している。したがって、抗原あるいは抗原を発現した細胞などに結合するファージを選択することによって、ファージライブラリーから、目的とする結合活性を有する可変領域を発現したファージをスクリーニングすることができる。更に、こうして選択されたファージ粒子の中には、目的とする結合活性を有する可変領域をコードする遺伝子が保持されている。すなわち、ファージディスプレー法においては、可変領域の結合活性を指標として、目的とする結合活性を有する可変領域をコードして、る遺伝子を取得することができる。

[0080] 本発明による自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤、または治療方法にぉ、て、 BS

T2およびそのホモログの、ずれかまたは両方を認識する抗体またはその断片、あるいはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体は、蛋白質として、あるいはそれをコードするポリヌクレオチドとして、投与することができる。ポリヌクレオチドを投与するには

、目的とする蛋白質を発現できるように、適当なプロモーターの制御下に目的とする蛋白質をコードするポリヌクレオチドを配置したベクターを利用するのが望ましい。ベクタ一には、ェンハンサーゃターミネータ一を配置することもできる。ィムノグロブリンを構成する重鎖と軽鎖の遺伝子を保持し、ィムノグロブリン分子を発現することができるベクターが公知である。

ィムノグロブリンを発現することができるベクターは、細胞に導入することにより投与することができる。生体への投与にあたっては、生体への投与によって細胞に感染させることができるものはそのまま投与することができる。あるいは、いったん生体から分離したリンパ球にベクターを導入して再び生体に戻すこともできる (ex vivo)。 [0081] 本発明に基づく自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤、または治療方法において、生体に投与されるモノクローナル抗体の量は、ィムノグロブリンとして体重 lkgあたり、通常 0. 5mg〜： LOOmg、たとえば lmg〜50mg、好ましくは 2mg〜： LOmgである。生体への抗体の投与間隔は、治療期間中の生体内におけるィムノグロブリンの有効濃度が維持できるように適宜調節することができる。具体的には、たとえば、 1〜2週間間隔で投与することができる。投与経路は、任意である。当業者は、治療に際して効果的な投与経路を適宜選択することができる。具体的には、経口的に、あるいは非経口的な投与を示すことができる。たとえば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、あるいは皮下注射等により、全身あるいは局所に抗体を投与することができる。本発明における非経口投与に適当な製剤として、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。また細胞に与える場合には、培養液中に通常 1 IX g/mL、好ましくは g/mL以上、より好ましくは 50 /z g/mL以上、更に好ましくは 0. 5mg/mL以上のィムノグロブリンを与える。

[0082] 本発明の自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤、または治療方法において、モノクローナル抗体は、任意の方法により生体に投与することができる。通常モノクローナル抗体は、薬学的に許容される担体と配合される。モノクローナル抗体には、必要に応じて増粘剤、安定剤、防腐剤および可溶化剤などの添加剤を配合することができる。このような担体または添加剤としては、ラタトース、クェン酸、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、スクロース、デンプン、タルク、ジエラチン、寒天、植物油、ェチレングリコールなどが挙げられる。「薬学的に許容される」という用語は、各国政府の監督当局により承認されている力、または各国の薬局方もしくは一般的に認知されている薬局方に動物、哺乳動物、および特にヒトへの使用に関して列記されていることを言う。本発明の自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤は、 1回または複数回の用量の凍結乾燥粉末または錠剤の形態で供給することもできる。凍結乾燥粉末または錠剤には、更に、投与の前に該組成物を所望の濃度となるように溶解するための注射用の滅菌済みの水、生理的食塩水または緩衝液を組み合わせることもできる。

[0083] 更に、ィムノグロブリンを発現するベクターとして投与する場合には、重鎖と軽鎖を別のプラスミドとしてコトランスフエタトするとして、体重 lkgあたり各プラスミドを 0. 1〜 10mg、たとえば l〜5mgを投与することができる。また in vitroにおいて細胞に導入するためには、 1〜5 μ g/10⁶cellのベクターが用いられる。

[0084] 更に本発明は、次の工程を含む被験化合物の自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果の検出方法に関する。

(3)対照と比較して、インターフロン産生細胞の活性が抑制されたとき、被験化合物の自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果が検出される工程

[0085] 本発明の方法において、細胞刺激剤とは IPCの活性ィ匕およびインターフェロン産生を誘導しうる物質を言う。たとえば、ウィルスやウィルスの構成成分を、細胞刺激剤として示すことができる。具体的には、単純へルぺスウィルス (Herpes simplex virus ;HS V)、あるいはインフルエンザウイルス (Influenza virus)などのウィルスの投与により IPC が活性化することが知られている。その他、バクテリア中の DNAである CpGの IPC活性化作用も公知である。これらの細胞刺激剤は、単独で用いても良いし、異なる細胞刺激剤を組み合わせて用いることもできる。細胞刺激剤と被験化合物とは同時に IPCに接触させても良いし、細胞刺激剤との接触の前あるいは後に IPCと被験化合物を接虫させることちでさる。

[0086] 本発明におヽて、細胞刺激剤、 IPC,および被験化合物は、生体外 (in vitro),生体内 (in vivo),あるいは ex vivoにおいて接触させることができる。生体外 (in vitro)においては、 IPCを培養可能な条件下で、先に述べたような任意の順番で細胞刺激剤および被験化合物を IPCと接触させることができる。また生体内 (in vivo)においては、生体内の IPCに対して、被験化合物あるいは細胞刺激物質を投与した後に、 IPCを採取する。採取された IPCを生体外におヽて細胞刺激物質あるいは被験化合物に接触させた後、細胞の活性ィ匕のレベルを評価することができる。細胞の活性ィ匕のレベルは、細胞が産生する IFNの濃度の変化などによって評価することができる。

更に ex vivoでの評価においては、生体外で調製された IPCに対して、細胞刺激剤または被験化合物を接触させる。接触後の IPCを生体に投与し、更に被験化合物または細胞刺激剤を投与する。生体内における IPCの活性ィ匕のレベルを評価し、被験化合物の作用が評価される。 IPCの活性化のレベルは、たとえば血中の IFNのレベルを指標として評価することができる。なお生体外における IPCの調製とは、生体から IP Cを採取すること、あるいは IPCの前駆細胞の分ィ匕誘導によって人工的に IPCを調製することを言う。

[0087] なお本発明の方法における対照としては、被験化合物に代えて自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果が予め知られている物質を用いることができる。たとえば、生理食塩水は治療効果の無い物質である。あるいは自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果を有することが確認されている物質を対象として用い、その物質との相対的な比較によって被験化合物の作用を評価することもできる。

[0088] 本発明による自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果の検出方法において、 IPCの活性とは、たとえば IFNの産生レベル、および IPCの数の、いずれか、または両方を言う。特に好ましい活性は、 IPCによる IFNの産生能である。 IPCの IFN産生能は、細胞の培養物中に含まれる IFNの量、あるいは濃度を決定することによって比較することができる。各種の IFNを測定するための試薬、あるいはキットが市販されている。あるいは、 IPCの細胞数は、 IPCの培養物中に存在する細胞数を計数することによって比較することができる。細胞数は、 IPCの細胞表面抗原を認識する抗体を使った FACS〖こよって明らかにすることができる。 IPCの細胞表面抗原には、たとえば BST2や BDCA- 2などを利用することができる。その他、 CD4並びに CD123を、 IPCを計数するためのマーカーとすることもできる。

[0089] 本発明において、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果を検出するために必要な試薬には、更に IPCを活性化するための細胞刺激剤、 IPCの培養のための培地や培養容器などを組み合わせることもできる。また、 IPCの活性ィ匕作用に与える影響が明らかな物質を対照として組み合わせることもできる。

[0090] 更に本発明の自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果を測定する方法を利用して、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤の候補ィ匕合物のスクリーニング方法が提供される。すなわち本発明は、次の工程を含む、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果を有する被験化合物のスクリーニング方法に関する。

(1)本発明の自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果を測定する方法によって、被験化合物が有している自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果を測定する工程、および

(2)対照と比較して前記効果が大きい被験化合物を選択する工程

本発明のスクリ一-ング方法に用、る被験化合物としては、 IPCの細胞表面抗原を認識する抗体、その少なくとも抗原結合領域を含む抗体、あるいはその可変領域を含む断片を用いることができる。抗体として、可変領域を発現させたファージライブラリーを用いることもできる。あるいは、コンビナトリアルケミストリ一により合成されたィ匕合物標品のほか、動 ·植物組織の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、またそれらから精製された標品などを候補ィ匕合物として用いることもできる

[0091] 本発明に基づいて、 IPC表面抗原を認識する抗体の、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果を見出すためには、たとえば次の工程を含む検出方法を実施することができる。

0抗体と IPCを接触後に、 IFN産生を誘導する細胞刺激剤を IPCに接触させる、 ii)抗体と IFN産生を誘導する細胞刺激剤を同時に IPCに接触させる、または

iii) IFN産生を誘導する細胞刺激剤を IPCに接触させた後に、抗体と IPCを接触させる

(2) IPCの活性を測定する工程、および

(3)対照と比較して、 IPCの活性が抑制されたとき、抗体の自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果が検出される工程

本発明に基づぐ抗体の自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果の検出方法は、更に当該活性を有する抗体のスクリーニング方法を可能とする。すなわち本発明は、以下の工程を含む、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果を有する抗体のスクリー二ング方法に関する。

(1)本発明の自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果を測定する方法によって、抗体が有している自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果を測定する工程、および

(2)対照と比較して前記効果が大きい抗体を選択する工程

本発明の検出方法並びにスクリーニング方法において、抗体とは、天然のィムノグロブリン分子、その抗原結合領域を含む断片、アミノ酸配列や糖鎖が修飾された変異体、および化学的な修飾を施した誘導体が含まれる。抗体の抗原結合領域を含む断片は、ィムノグロブリンを酵素的に消化することによって得ることができる。あるいは、当該領域をコードする遺伝子を単離し、適当な発現系において発現させることにより、遺伝子工学的に得ることもできる。このようなィムノグロブリンの組み換え体として、たとえばファージ抗体ライブラリーを示すことができる。一方、 IPCおよび細胞刺激剤は、先に示したようなものを利用することができる。

[0092] IPCに対する刺激は IFNの産生を誘導することから、その活性化の調節によって IFN 産生を調節することができる。そして本発明者らは、 IPCの活性の抑制を通じて、 RA の治療効果を得られることを明らかにした。したがって、 IPCの活性を抑制することができる物質は RAの治療剤として用いることができる。すなわち、本発明のスクリーニング方法によって選択することができる化合物は、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤として有用である。

[0093] 本発明のスクリーニング方法において、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果を有することが明らかな物質を接触させた IPCを対照として用いれば、この物質よりも治療効果の大き、物質を見出すことができる。 IPCは生体中の IFNの大部分を産生する重要な細胞である。したがって、本発明のスクリーニング方法によって得ることができる化合物は、免疫バランスの調節による自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤として重要である。あるいは、本発明のスクリーニング方法によって得ることができる化合物は、免疫バランスの調節による自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤の製造に使用することがでさる。 [0094] 本発明のスクリーニングによって選択された化合物を、必要に応じて、 IPC以外の様々な細胞に接触させることにより、他の細胞に対する作用を確認することができる。 IP C以外の細胞に対して顕著な増殖抑制や細胞障害作用が検出されなければ、その化合物は安全な治療薬として使用できる可能性が高まる。あるいは、特定の細胞に対する障害作用が確認された場合であっても、局所投与など、投与形態を選択することにより、治療薬として利用できる可能性はある。更に、リウマチモデル動物などに投与して、より詳細に RAの治療効果を評価することができる。

なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。

実施例 1

[0095] モノクローナル抗体作成プロトコール

免疫原とする細胞は以下のようにして調製した。 Balb/cマウス雌 (4〜6週令）の骨髄細胞を、 10ng/mlの FLT- 3リガンド（R&D Systems社製）を添カ卩した 10%FCS- RPMI164 0培地〔10%牛胎児血清（FCS)、およびペニシリン、ストレプトマイシンを含む RPMI16 40培地〕にて 10日間培養した。 10日後、 IPC (Interferon producing cell)を、 CDllc陽性、 CDllb陰性、 B220陽性分画としてセルソーター（FACSVantage, Becton Dickinso n社製）で分離した。抗体は Becton Dickinson社製のものを用いた。

上記の分離した細胞を、 0、 4、 11日目に、片足あたり lxlO⁶個ずつ、完全フロインドアジュバント（CFA:ャトロン社製）と共にラットのフットパッド（foot pad)へ注入した。 12 日目に免疫ラットのリンパ節を分離し、リンパ球を採取した。マウスのミエローマ細胞 P 3x63Ag8.653とラットのリンパ球を 4 : 5の割合で混合し、ポリエチレングリコール（PEG) を加えて細胞を融合した。融合後の細胞を十分に洗浄して HAT培地に分散させ、 1 ゥエルあたり 5xl0⁴個の細胞を含むように 96 well plateにまいた。

[0096] 細胞が増殖したゥエルの細胞を回収して希釈して、その培養上清をマウス脾臓細胞、及び培養骨髄細胞に対する反応性を指標としてスクリーニングした。スクリーニング方法の詳細は実施例 2のとおりである。陽性反応を示したゥエルの細胞を限外希釈によりクローユングし、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを確立した。更に、ノ、イブリドーマの培養上清、あるいはハイプリドーマをマウスの腹腔内に移植して得られた腹水より精製された抗体の反応性を解析した。

実施例 2

[0097] 培養上清のスクリーニング

Balb/cマウス雌（4〜6週令）の骨髄細胞を、 10ng/mlの FLT- 3リガンドを添カ卩した 10 %FCS-RPMI1640培地にて 10日間培養した。 10日目には約 40%の細胞が IPCになつた。この細胞を用い、ハイプリドーマ培養上清を 1次抗体とし、 2次抗体に FITC標識抗ラッ Hg抗体 (BD Pharmingen社製）を用いて染色した。その後、各種抗体 (CDllb、 CDllcゝ CD3、 CD19、 CD45RB、 B220、 Ly6C ;いずれも Becton Dickinson社製）により二重染色し、フローサイトメトリー法により解析 (FACS解析)した。

[0098] 培養上清陽性分画、陰性分画をそれぞれ R2、 R3とし各々の Gate内での各種抗原の発現をヒストグラムで示した（図 1)。作成した数種類の抗体によって染色される細胞群は、文献上で定義されているマウス IPC (Nature Immunol, 2001; 2, 1144-1150.) の細胞表面抗原プロファイルが一致した。したがって、これらの抗体はマウス IPCに特異的に結合する抗体であると考えられた。

実施例 3

[0099] 抗体で分離した細胞の形態

実施例 2と同様に培養した骨髄細胞を、培養上清を 1次抗体とし、 2次抗体に FITC 標識抗ラット Ig抗体を用いて染色した。その後、セルソーター（FACSVantage, Becton Dickinson社製)を用いて陽性細胞を分離した。サイトスピン後、ギムザ染色し、顕微鏡下にて観察したところ、 IPCに特異的な形態を示した（図 2a)。すなわち、この細胞の形は丸ぐ大きな核を有していた。

[0100] lxlO⁵個の細胞を 96 well丸底プレートにてインフルエンザウイルス PR8と共に 24時間 37°Cにて培養し、同様にギムザ染色した後、顕微鏡下にて観察したところ、形態的に典型的な榭状細胞に分化した（図 2b)。この結果から、上記抗体によって分離された細胞は、ウィルス感染によって榭状細胞に分ィ匕すると、うマウス IPCの特徴を有して!、ることが確認された。このようなマウス IPC特異的なモノクローナル抗体およびその抗体を産生するハイプリドーマのうち、 SNK01を選択して以降の実験に用、た。実施例 4

[0101] 抗体で分離した細胞のインターフロン産生能

実施例 2と同様に培養した骨髄細胞を SNK01培養上清および 2次抗体で染色後、セルソーターにて陽性、陰性細胞を分離した。各々の分画の細胞、 lxlO⁵個ずつを 96 well丸底プレートに分注し（100 μ 1/well)、インフルエンザウイルス PR8を感染させ、 2 4時間後の培養上清中の IFN aの濃度を以下のような ELISA法にて測定した。

[0102] まずラット抗マウス IFN a抗体（PBL Biomedical Laboratory社製）を 96 wellプレートに 4°Cで一晩反応させ、プレートコートした。プレートを洗浄後、培養上清 100 1を添加し、 4°Cで一晩反応させた。プレートを洗浄後、 IFN aと IFN βを認識する標識化抗インターフェロン抗体を添加し、 1時間反応させて、検出を行った。それぞれの反応は 3連で行い、平均値を求めた。検量線を作成することにより、培養上清中の IFN a濃度を算出した。

SNK01陽性細胞では、陰性細胞に比べて、高いインターフェロンの産生が認められた。すなわち、モノクローナル抗体 SNK01が認識する抗原は IPCに特異的な表面抗原であることが確認できた（図 3)。

実施例 5

[0103] 抗体のマウスインターフェロン産生能への影響

実施例 2と同様に培養したマウス骨髄細胞を lxlO⁵個ずつ、 96 well丸底プレートに分注した。これに SNK01抗体、またはコントロール抗体であるラッ HgGを添カ卩し、 37°C にて 30分間培養後、インフルエンザウイルス PR8を添カ卩し、 37°Cにて 24時間培養し、培養上清中の IFN aを上記実施例 4に示した ELISAにより測定した（図 4)。その結果、 SNK01は濃度依存的に IFN aの産生を抑制した。すなわち、この抗体のマウス IPC に与える作用は、特異的な作用であると考えられた。

実施例 6

[0104] 抗体が認識する分子のクローユング

1) IPC- cDNAライブラリーの作製

実施例 2と同様に FLT-3リガンドで骨髄細胞力も誘導した IPCより全 RNAをフエノール-グァ-ジン法により抽出し、 oligo- dTカラムにより mRNAを精製した。精製した mRN Aから Gubler- Hoffinan法により cDNAを合成し、両端に EcoRI- Notlアダプター (インビトロジェン社製)を結合後、スパンカラム (クロマスピン 400、クロンテック社製）により未反応の EcoRIアダプターおよび 500塩基以下の短!、cDNAを除去した。得られた両端に EcoRIサイトを有する cDNAを動物細胞用発現用ベクター pME18s (Xhol断片を除!ヽたもの)の EcoRIサイトに T4リガーゼにより結合し、大腸菌 DH10 (インビトロジェン社製）にエレクト口ポーレーシヨン法により形質転換した。これを 100 g/mlのカルべ-シリンを含む LB培地（LB.カルべ-シリン） 500mlで 30°Cでー晚培養し、 QIA filter plasmid ma xi kit (Qiagen社製)により同キットのプロトコールに従って plasmidを抽出、精製し、 IP C- cDNAライブラリーを得た。

[0105] 2) COS7細胞による発現クローニング

COS7細胞を 6cmデイシュに 5xl0⁵個ずつ 10枚まき、 37°C、 5%CO存在下で 20時間

2

培養後、 Effectene trasfection Reagent(Qiagen社製)により同製品のプロトコールに従い、上記 1)で取得した IPC cDNAライブラリー ¾ ransfectionした。 48時間、 37°C、 5% CO下で培養後、 PBS (Phosphate Buffered Saline)で洗浄、 PBS/5mM EDTAで細胞

2

をデイシュから剥離し、さらに PBSで洗浄後、セルストレナー（70 m,ファルコン社製）を通した。遠心後（1300rpm, 5分）上清を除去し、 PBS/ 0.5%BSA/2mM EDTAを lml 添カロして懸濁し、 Fc block (ファーミンジェン社製） 40 μ 1を加え 4°Cで 20分間置いた。これにピオチン化した SNK01抗体 30〜50 μ gを加え、氷上で 30分間保持した。 PBSで洗浄後、 100 μ 1の PBSに懸濁し、ストレプトアビジンマイクロビーズ (Miltenyi Biotec社製） 10-20 μ 1を加え 10°Cで 15分静置した。 PBS/ 0.5%BSA/2mM EDTAで洗浄することにより過剰なストレプトアビジンマイクロビーズを除去し、 lmlの PBS/ 0.5%BSA/2mM E DTAに懸濁した。 AutoMACS (Miltenyi Biotec社製）で posseldsの条件で細胞を分取した。改良 Hirt法（BioTechniques Vol.24,760-762,1998)により plasmidを抽出、精製した。得られた plasmidを大腸菌 DH10にエレクト口ポーレーシヨン法により形質転換し、 L Β·カルべ-シリン 100mlで 30°Cでー晚培養し、 QIA filter plasmid midi kit (Qiagen社製)により同キットのプロトコールに従って plasmidを抽出、精製した。

[0106] 以上の操作を 1クールとして、この後同じ操作を 4回繰り返し、 SNK01抗体に反応する抗原をコードする plasmidを濃縮した。最後に、 AutoMACSのかわりにセルソーター（ FACSVantage, Becton Dickinson社製）により陽性細胞を分取し、これらより抽出した plasmidを形質転換した大腸菌 DH10を適量 LB 'カルべ-シリンプレートに塗布した。 3 0°Cでー晚培養し、現れたコロニーを 30個ピックアップし、それぞれより plasmidを抽出、 COS7細胞に transfectionし、 SNK01抗体を用いて FACS解析することにより陽性 plas midを選抜した。

[0107] 得られた plasmid上にクローン化されている cDNAの塩基配列を決定し、マウス遺伝子データベースに登録されている塩基配列情報と blastサーチすることにより、その遺伝子を決定した。また、同時にヒト遺伝子データベースをサーチすることによりその力ゥンターパートを同定した。

その結果モノクローナル抗体 SNK01が結合したクローンは、配列番号： 7および、配列番号： 9に記載の塩基配列を有していた。これらの塩基配列によってコードされるァミノ酸配列を、配列番号: 8および配列番号： 10に示した。

配列番号： 9に記載の塩基配列は、マウス BST2として既知の塩基配列であった (Ge nBank Acc#.BC027328)。一方、配列番号： 7に記載の塩基配列は、配列番号： 9の塩基配列と部分的に同一の塩基配列を有していたが、 3 '末端側に異なる塩基配列が見られ、異なるアミノ酸配列をコードしていた。すなわち、配列番号: 8に記載のァミノ酸配列のうち、 N末端から 139位までのアミノ酸配列は、配列番号： 10に記載されたァミノ酸配列と一致した。そして配列番号: 8に記載のアミノ酸配列において、 N末端から 140〜178番目のアミノ酸は、配列番号： 8に記載のアミノ酸配列に固有の配列であつた。両者はォータナティブスプライシングによって生じたノリアントであると考えられた。これらの知見に基づいて、配列番号： 7に記載の塩基配列によってコードされるァミノ酸配列（配列番号: 8)力なるタンパク質は、マウス BST2の新規なスプライシングノリアントであると考えられた。以下、配列番号: 7に記載の塩基配列からなる遺伝子を mBST2H、配列番号： 9に記載の塩基配列からなる遺伝子を mBST2Dとも称する。 ( 図 7(a))

[0108] 3) FACSによる確認

上記発現クローニング法により得られたプラスミドを QIA filter plasmid midi kit (Qiag en社製)により再度大腸菌より高度に精製し、もう一度 COS7細胞に transfectionした。 48時間後、定法に従って、 SNK01抗体および FITC標識抗ラッ Hg抗体で反応させ、 F ACS解析を行うことで、 plasmid上にクローン化されている cDNA力抗原をコードしているかどうかを確認した。

その結果、上記モノクローナル抗体 SNK01は、プラスミドを導入した COS7細胞に対する結合が観察された。したがって、プラスミド上にクローンィ匕されている cDNAは、いずれもこのモノクローナル抗体によって認識された抗原をコードしていることが確認された。

実施例 7

[0109] ウェスタンブロティング法による抗体の反応性の確認

前記モノクローナル抗体力配列番号： 8または配列番号： 10に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識し結合することを、ウェスタンブロッテイング法によって確認した。配列番号: 8または配列番号： 10に記載のアミノ酸配列を遺伝子組み換え体として発現させ、本発明のモノクローナル抗体との反応性を確認した。具体的な操作は次のとおりである。

[0110] 1 ) pcDNA3.1- mBST2Dおよび pcDNA3.1- mBST2Hの構築

クロー-ングした mBST2Dおよび mBST2Hをコードする plasmid(l μ g)を铸型として、 P

CRにより配列番号： 7または配列番号： 9に記載の塩基配列を有する DNAを増幅した

。 PCRに用いたプライマーの塩基配列は次のとおりである。

forward primer (酉己列番： 1丄

5 -tttttgctagcgacggatcacatggcgccctctttctatcactatctgcccgtgcccatggatgagatgggggggaa gcaagga-3

reverse primer (酉己列番： 12)

5 -tttttttctcgagtcctcaaaagagcaggaacagtgac-ύ '

また反応液の組成は以下のとおりである。

1XGC bufferl,

dNTP mix (0.25 mM ),

LA Taq DNA polymerase 5U(以上タカラバイオ製)/ 100 μ L

forward primer (1 pmol): reverse primer (1 pmol)

[0111] 95°Cで 1分インキュベート後、 [95°C30秒 Z55°C30秒 Z72°C1分 30秒]を 1サイクルとして、 25回の条件で PCRを行った。ァガロースゲル電気泳動にて目的の大きさの DNA断片が増幅されていることを確認後、フエノールクロロフオルム抽出、エタノール沈殿後、回収した増幅産物を TE buffer 10 μ Lに溶解した。これを制限酵素 Nhe I および Xho I (タカラバイオ製)で切断後、 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製 )を用いてァガロースゲル電気泳動により精製し、エタノール沈殿後、 TE buffer 4 L に溶解した。

一方、哺乳動物細胞発現 plasmid pcDNA3.1 (インビトロジェン社製）5 gを制限酵素 Nhe Iおよび Xho Iで消化、 CIAP (タカラバイオ製)処理後、ァガロースゲル電気泳動により精製し、エタノール沈殿後、 TE buffer 4 μ Lに溶解した。前述の DNA断片それぞれ 2 μ Lと、この plasmid 0.5 μ Lを ligation kit ver.II (タカラバイオ製)を用いて連結し、大腸菌 DH5に形質転換した。

LB培地（100 μ g/mlアンピシリン）にて 37°Cでー晚培養後、出現したコロニー数個を選び、 QIAprep Spin miniprep kit(QIAGEN社製)を用いて plasmidを抽出した。抽出されたプラスミドに挿入されてヽる DNA断片の塩基配列を定法に従って決定した。配列番号: 8または配列番号： 10に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する DNA断片が挿入されているプラスミドであることを確認し、目的の構築物 PCDNA3.1- mBST2Dおよび PCDNA3.1- mBST2Hを得た。

[0112] 2) pcDNA3.1- mBST2D- Hisおよび PCDNA3.1- mBST2H- Hisの構築

pcDNA3.1- mBST2D (pcDNA3.1- mBST2D- His構築の場合）あるいは pcDNA3.1- m BST2H (pcDNA3.1- mBST2H- His構築の場合） 1 μ gを铸型として、 PCRにより Hisタグをコードする塩基配列を付加した。 PCRに用いたプライマーの塩基配列は次のとおりである。なお forward primer (配列番号： 13)は、 pcDNA3.1- mBST2D- Hisと pcDNA3.1 -mBST2H- Hisに同じものを用いた。反応液の組成と温度サイクルの条件は 1)と同様とした。

forward primer (酉己列番：13) :

5 -ccagctcacccgcacccaggacagtc-ύ ' reverse primer (pcDNA3.1-mBST2D- His用、配列番号： 14)：

5 ' -tttttttctcgagtcaatgatgatgatgatgatgaaagagcagaaacagtgacactttga-3 '

reverse primer (pcDNA3.1-mBST2H- His用、配列番号： 15)：

5'— tttttttctcgagtcaatgatgatgatgatgatggaagtctccttttggatcctgagctg— 3,

[0113] ァガロースゲル電気泳動にて目的の大きさの DNA断片が増幅されていることを確認後、フエノールクロロフオルム抽出、エタノール沈殿後、 TE buffer 10 μ Lに溶解した。これを制限酵素 BamH Iおよび Xho I (タカラバイオ製)で切断後、 QIAquick Gel Extra ction Kit (QIAGEN社製)を用いてァガロースゲル電気泳動により精製し、エタノール沈殿後、 TE buffer 4 μ 1に溶解した。

一方、 PCDNA3.1- mBST2Dおよび pcDNA3.1- mBST2H 5 μ gを制限酵素 BamH Iおよび Xho Iで消化、 CIAP (タカラバイオ製)処理後、ァガロースゲル電気泳動により精製し、エタノール沈殿後、 TE buffer 4 μ Lに溶解した。 PCRで増幅された DNA断片それぞれ 2 μ Lとこれらの plasmid 0.5 μ Lを ligation kit ver.II (タカラバイオ製)を用いて連結し、大腸菌 DH5に形質転換した。

LB培地（100 μ g/mlアンピシリン）にて 37°Cでー晚培養後、出現したコロニー数個を選び、 QIAprep Spin miniprep kit(QIAGEN社製)を用いてこれらより plasmidを抽出した。抽出されたプラスミドに挿入されて、る DNA断片の塩基配列を定法に従って決定した。 Hisタグをコードする塩基配列が付加された DNA断片が挿入されて、ることを確認し、目的の構築物 PCDNA3.1- mBST2D- Hisおよび PCDNA3.1- mBST2H- Hisを得た。

[0114] 3) Western— blotting

6cmデイシュに COS7細胞を 5xl0⁵で 10枚まき、 37°C、 5%CO下で 20時間培養し

2

た。培養後の COS7細胞に、 Effectene trasfection Reagent(Qiagen社製)により、 pcDN A3. l-mBST2D- Hisあるいは pcDNA3.1-mBST2H- Hisを形質転換した。操作は、同製品のプロトコールに従った。 37°C ' 5%CO下で 48時間の培養後、 PBSで洗浄、 PBS/

2

5mM EDTAで細胞をデイシュ力も剥離し回収した。回収した細胞は、さらに PBSで洗浄後、 IxHalt Protease Inhibitor Coctail (PIERCE社製)を含む 2mlの RIPA bufferをカロえて氷上で 1時間溶解した。 RIPA bufferの組成を以下に示す。 50 mM Tris-HCl(pH7.4),

150 mM NaCl,

1% Triton x- 100,

0.5% sodium deoxycholate,

0.1% SDS

[0115] 溶解後の細胞は、 4°C、 15000 rpm、 5分間の遠心分離した。上清は Microcon YM- 10(MILLIPORE社製)にて L以下まで濃縮し、ウェスタンブロッテイングの試料とした。一方、沈殿物は、 lxHalt Protease Inhibitor Coctail (PIERCE社製)を含む lmLの RIPA bufferでもう一度洗浄後に、ウェスタンブロッテイングの試料とした。

沈殿には 200 Lの lx変性 bufferを、濃縮した上清には等量の 2x変性 bufferをカロえ 100°Cにて 10分間煮沸した後、それぞれ 5 μ Lを NuPAGE4-12% Bis-Tris Gel (インビトロジェン社製)にて電気泳動した。泳動後のゲル力も試料をセミドライ方式のブロッティング装置（BIO CRAFT社製、 MODEL BE- 330)にて、 PVDF膜 (MILLIPORE社製 )にトランスファーした。

抗体による検出はィムノスターキット (和光純薬社製)を用いた。まず、 1次抗体として、 HRP標識抗 His tag抗体 (インビトロジヱン社製)を 5000倍希釈の濃度で用いて、ィムノスターキットのプロトコールに従ってシグナルを検出した。シグナルの検出後、 P VDF膜を変性溶液（7M 塩酸グァ-ジン、 50mMグリシン、 0.05mM EDTA、 0.1 M 塩ィ匕カリウム、 20 mM 2-メルカプトエタノール)で室温で 1時間振とう処理することにより、標識抗 His tag抗体を除去した。次に、ピオチン標識した SNK01抗体を用いて、同様に、シグナルを検出した。結果を図 5に示す。

[0116] モノクローナル抗体 SNK01にお!/、て、アミノ酸配列から予想される分子量（約 20kD) の位置に明瞭なバンドが見られた。 SNK01は、 BST2D (配列番号： 10)と BST2H (配列番号: 8)の両方に対して強く反応した。 20kD以上の位置にも強、反応が検出された。これらの分子量の大きい蛋白質は、糖鎖の修飾を有していると予想された。 BST2D (配列番号： 10)は、上清よりも沈殿で強いシグナルが見られた。 BST2H (配列番号： 8)も沈殿でより強いシグナルが見られたが、上清に対しても抗体の強い反応が検出された。 BST2D (配列番号： 10)に対する Hisタグ抗体のシグナルが検出されていないのは、 C末端に付加した Hisタグがプロセシングによって除去されてしまったためと考えられた。

実施例 8

[0117] RT- PCR法によるマウス BST2の発現確認

各細胞より抽出した RNAより合成した cDNAを铸型として、定法に従って PCRを行ヽ、抗原遺伝子が IPCに特異的に発現していることを確認した。 PCRに用いたプライマ一の塩基配列は次の通りである。

配列番号： 7用 forward (配列番号： 16)：

5 -acatggcgccctctttctatcac-3

reverse (配列番号： 17)：

0 -gagcccaggttttgaaggaagtg-3

配列番号： 9用 forward (配列番号： 18)：

5 -agctcacccgcacccaggacagt-3

reverse (目 il列番号： 19)：

5 -cactccccagtcctaaagttct-3

βァクチン用センスプライマー（配列番号： 20)：

5 -gtgggccgctctaggcaccaa-3

アンチセンスプライマー（配列番号： 21)：

5 -ctctttgatgtcacgcacgatttc-3

[0118] 発現レベルを比較した cDNAまたは細胞は次の通りである。 DNAパネルは市販品（ Clonetech社製）を利用した。細胞は、セルソーター（FACSVantage, Becton Dickinso n社製）により高度に分離したものを用いた。結果は図 6に示した。 BST2D (配列番号: 9)は、複数の細胞で発現が見られた。強い発現が見られたのは IPCであった。 BST2 H (配列番号： 7)はマウス IPCで強、発現が観察された。

CD3陽性細胞 (T細胞）、

CD8陽性細胞、

マウス IPC、

myeloid DC、およびマウス各臓器より抽出した RNAより合成した cDNAパネル

実施例 9

[0119] マウス BST2の新規スプライシングバリアントのクローユング

実施例 8において、配列番号： 7用プライマーの組み合わせにより、配列番号： 7の c DNAに該当する増幅断片の他に、短い増幅断片が観察された。本増幅断片を定法によりクローユングして塩基配列を確認したところ、配列番号： 7に示した mBST2Hの第 2ェクソン部分が欠失した塩基配列を有していた。すなわち、配列番号 : 22に示した塩基配列を有する、マウス BST2の新規のスプライシングバリアントであると考えられた。この遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号： 23に示した。実施例 8に示したように、本遺伝子もマウス IPCに発現していることを確認した。この配列番号： 22記載の遺伝子を、以下 mBST2HSとも称する。

mBST2D、 mBST2H、 mBST2HSのアミノ酸配列のァライメントを図 7(a)に、それぞれのゲノム構造を図 7(b)に示す。

実施例 10

[0120] マウス BST2発現ベクターの作成

実施例 6により得られた mBST2Dおよび mBST2Hの cDNAを铸型とし、以下の塩基配列からなるプライマーを使って以下の条件で PCRを行った。

pmB¾ Γ2—ト； tttttgctagcgacggatcacatggcgccctctttctatcactatctgcccgtgcccatggatgagat gggggggaagcaagga (酉己歹 U番： 24)および

pmB¾ r2~R; tttttttctcgagtcctcaaaagagcaggaacagtgac (酉己列番号： 25ノ

DNAポリメラーゼ： LA Taq (タカラバイオ社）

[95°Cを 30秒、 55°Cを 30秒、 72°Cを 2分]を 25サイクル

増幅されたそれぞれの断片を制限酵素 Nhel及び Xhol (V、ずれもタカラバイオ社製）で処理して切断した後、同様に Nhelと Xholで処理した動物細胞発現用ベクター pcD NA3.1- Zeo(+) (インビトロジェン社）と ligation kit ver.II (タカラバイオ社製）を用いて連結し、それぞれの発現ベクターとした。 mBST2HSの発現ベクターについては mBST2H の第 2ェクソン部分を PCR法を用いて定法に従って除去することによって作成した。実施例 11 [0121] ヒトォーソログ cDNAのクローユングと発現ベクターの作成

本発明において同定されたマウス IPC特異抗原 BST2のヒトォーソログを検索したところ、ヒト BST2として報告された既知の遺伝子であった（IshikawaJ. et al. Genomics, 1995; 26, 527- ; GenBank Acc#. D28137)。更にマウスで見出された新規スプライシングバリアントのヒトォーソログも含めて以下のようにして PCR法によりクローユングし、 3種類の発現ベクターを作成した。

[0122] 下記の実施例に示した方法に従って、 Herpes Simplex virus刺激を行ったヒト IPCを調製し、 RNAを抽出後、スーパースクリプトファーストストランドシステムキット (インビトロジェン社）を用いて、ファーストストランド cDNAを合成した。これを铸型に、 hBST2 pr imer F; aaaaaaagctagctggatggcatctacttcgtatg (酉己列番： 2o)および hBST2 primer R ； aaaaaaactcgagacccataacaacaggcagcacat (酉己歹号： 2 Jで、 LA i，aq (タカフノイ ) を酵素にもちいて PCR(95°Cを 30秒、 55°Cを 30秒、 72°Cを 2分、 25 cycle)を行った。増幅された断片を、制限酵素 Nhelおよび Xholで切断後、 PCDNA3.1- Zeo(+) (インビトロジェン社）の Nheト Xholサイトに挿入し、ヒト BST2の発現プラスミドとした。

[0123] マウススプライシングバリアントのォーソログである遺伝子に関しては、 IPCの cDNA ライブラリーを铸型として以下の塩基配列からなるプライマーで、 LA Taq (タカラバイォ)を酵素にもちいて PCR(95°Cを 30秒、 55°Cを 30秒、 72°Cを 2分、 25 cycle)を行った。 cDNAは、 GeneRacer kit (インビトロジェン社）によって合成した。増幅された断片を、制限酵素 Nhelおよび Xholで切断後、 pcDNA3.1- Zeo(+) (インビトロジェン社）の Nhel -Xholサイトに挿入し、発現プラスミドとした。

mBST2Hォーソログ用のプライマー

hBST2 primer F (配列番号： 26)および

primerhBHR ;ttttttctcgagctagggatgtgggggtgagaggaatgtggcaggtggagggtagcgggggaagg ctatctctgacctcagtcgctccacctctgcagac (酉己列番号： 28)

mBST2HSォーソログ用のプライマー

hBST2 primer F (配列番号： 26)および

pnmerhBi f2HSRl； aaaaaaactcgagcttatggtttaatgtagtgatctctccacagtgtggttgcaggtggc ggcct (配列番号： 29) [0124] 既知遺伝子であるヒト BST2の塩基配列を配列番号： 1に、アミノ酸配列を配列番号： 2に示した。以下、この配列を有する遺伝子を hBST2Dとも称する。また、上記により得られた mBST2Hのヒトォーソログ（以下、 hBST2Hとも称する）の塩基配列を配列番号： 3に、アミノ酸配列を配列番号： 4に、また、 mBST2HSのヒトォーソログ（以下、 hBST2H Sとも称する）の塩基配列を配列番号： 5に、アミノ酸配列を配列番号: 6に示した。 hBST2D、 hBST2H、 hBST2HSのアミノ酸配列のァライメントを図 8(a)に、それぞれのゲノム構造を図 8(b)に示した。 hBST2Hおよび hBST2HSは新規スプライシングバリアントであることが示唆された。

実施例 12

[0125] RT-PCR法によるヒト BST2遺伝子の発現の確認

各細胞より抽出した RNAより合成した cDNAを铸型として、定法に従って PCRを行ヽ、ヒト BST2の各ノリアントの発現を検討した。 PCR条件としては、 95°C、 1分間反応させた後、 95°Cを 30秒、 60°Cを 30秒、 73°Cを 45秒を、 1サイクルとして、 Dタイプは 30サイクル、 Hタイプ及び HSタイプは 35サイクル反応させた（図 9)。

プライマーの配列は次の通りである。

Forward primer; gccttcgggcagtgatggagtgtc (目列 ¾·号： dO)

D用 Reverse primer; tcaagcgaaaagccgagcaggac (Ic^[J¾ -^"

H、 HS用 Reverse primer; aatgtggcaggtggagggtag (目己列番号： 32)

結果、ヒト BST2mRNAは複数の組織、細胞で発現していることがわかった。また、 IP Cにおいては HSV刺激により、発現が増強されることがわ力た。

実施例 13

[0126] マウス BST2を認識する抗体の作製と評価

1)抗マウス BST2抗体の作製

マウス BST2の 3種類のサブタイプ D、 H、 HSのいずれ力、あるいは複数を認識する抗体を以下のように作製した。

6cmディッシュ 5枚に、 1枚あたり 4xl0⁵個の COS7細胞を播種し、 20時間培養後に Eff ectene trasfection Reagent(Qiagen社製)を用いて同製品のプロトコールに従い、上記実施例 10で作製したそれぞれのタイプの cDNAがクローユングされた 3種類の発現べクタ一を同量（ディッシュ 1枚あたり 1 g)ずつ混合してトランスフエクシヨンした。 24時間後、新鮮な培地に交換し、更に 24時間後、 PBS/5mM EDTAで細胞を回収し、 PBS で洗浄した後に、 Wister rat (5〜6週令）の両足の foot padにアジュバンド CFAとともに注入した。このような操作を 0、 4、 11日目に行って免疫したラットから、 12日目にリンパ節を採取して、実施例 1に示したのと同様の方法で、ハイプリドーマを作製した。ハイブリドーマの培養上清を Cell ELISAによってスクリーニングし、 3種類の発現ベクターをトランスフエクシヨンした COS7細胞には反応し、宿主の COS7細胞には反応しないクローンを選択した。更に FACS解析でも結合活性を確認して細胞のクローユングを行い、最終的には 5つの陽性クローンを得た。

[0127] 2)マウス IFN産生能への影響

得られたクローンの培養上清を用いて、実施例 5に示した方法に従って、 IFN産生に与える影響を検討したところ、 V、ずれもコントロール抗体と比較して IPCの IFN産生を抑制する活性があった。更に、 0.1 μ Μの CpG ODN 1668 (MWG Biotech社）を用いて刺激した際にも、 IFN産生抑制活性を示した（図 10)。このことから、 SNK01以外の mBST2に対する抗体も IPC力もの IFN産生を抑制する活性を示すことが確認された。実施例 14

[0128] ヒト BST2 (hBST2)を認識する抗体の作製と評価

1)ヒト BST2抗体の作製

ヒト BST2の 3種類のサブタイプ D、 H、 HSのいずれ力あるいは複数を認識する抗体を実施例 13と同様の方法に従って作製した。実施例 11で作製したそれぞれのタイプのヒト cDNAがクローユングされた 3種類の発現ベクターを用い、培養上清を FACS 解析することによってハイプリドーマをスクリーニングした。クローン 3D3#7、 3E2#8、 5C 11#7、および 3G7#6などの、複数のクローンが得られた。得られた複数のクローンの精製抗体を取得し、更に解析を行った。

[0129] 2)ヒト IFN産生能への影響

健常人より末梢血を採取し、 PBL (末梢血リンパ球)を分離した。 Lineage抗体 (CD3、 CD14、 CD16、 CD19、 CD20、 CD56抗体)にて MACSで種々の細胞を除去した後、 CD 4陽性、 CD123陽性、 Lineage陰性細胞群を IPCとしてセルソーターで分離した。このように取得したヒト IPCを 2xl0⁴cells/wellで 96 wellプレートに播種し、それぞれ 3、 10、 30 μ g/mLの濃度で抗 BST2抗体を添加して 37°Cで 1時間培養した。 1時間培養後に Her pes Simplex virus(20 pfo/cell)を添カ卩し、 37°Cで 24時間培養し、培養上清中の IFN a を ELISA kit(Bender Med System社)により、測定した。その結果、抗ヒト BST2抗体は、既に報告のある BDCA2抗体 (Miltenyi社)と同様に、ヒ HFN産生抑制活性を示すことが明らかとなった。（図 11)すなわち、ヒト BST2を認識する抗体は、その分子を発現する細胞の IFN産生活性に影響を与えることが明ら力となった。

実施例 15

[0130] BST2タンパク質の発現パターン

1)マウス BST2の発現パターン

モノクローナル抗体 SNK01を用いて、マウス BST2タンパク質の発現を FACSにより解祈した。 Balb/cマウス、あるいは Typel IFN receptorノックアウトマウスの脾臓細胞を、 CpG (0.5 μ Μ)あるいはインフルエンザウイルス PR8で 24時間刺激した後、各種抗体を用いて細胞染色を行った。刺激をしていない通常の状態では、図 1に示したように BST2は IPCに特異的に発現していた力 Balb/cマウスにおいては刺激によって、多くの細胞において BST2の発現が誘導されることが明らかになった（図 12)。 CD3陽性である T細胞、 CD19陽性である B細胞、 DX5陽性である NK細胞、 Gr- 1陽性である顆粒球、いずれにおいても同様の傾向が検出された。更に、それらの CpG、ウィルスによる BST2の発現増強は、 IFNRノックアウトマウスでは検出されなかったことから、 IFNのシグナルを介して BST2の発現が誘導されることが推定された。

[0131] 2)ヒト BST2の発現パターン

実施例 14の 1)で作製した抗体 5C11を用いて、ヒト BST2タンパク質の発現を FACS により解析した。健常人の末梢血より PBLを採取し、 IFN o;を lng/mlの濃度で添カロして 37°C、 24時間培養し、抗 BDCA-2抗体、抗 BDCA-4抗体と 5C11との二重染色を行つた（図 13)。この結果、ヒ HPCにおいて、通常は BST2の発現が検出されないが、 IF N刺激により BST2の発現が誘導されることが明らかになった。すなわち、 BST2分子はマウスと同様ヒトにおいても、 IFNにより発現が誘導され、更に IFNの産生自体に影響を与えることが明らかになった。また、 CpGにより刺激した場合にも、 IPC上で発現が誘導されることが明らかになった（図 14)。

実施例 16

[0132] 抗体の in vivoにおける評価

1)抗体投与マウスより採取した細胞の解析

Balb/cマウスの腹腔内に SNK01、およびコントロールのラット IgGを 1匹あたり 300 g ずつ、一日おきに 3回投与し (0.9mg/マウス）、 6日目に脾臓、骨髄をそれぞれ採取し、 IPCの細胞数 (cell population)を B220、 CDllc、 CD1 lbの染色によって解析した。更に、骨髄細胞を lxl0⁶/wellにて 96wellプレートに播種し、 CpG (0.5 μ Μ)あるいはインフルェンザウィルス PR8によって刺激し、 24時間後の培養上清のサイト力イン値を ELI SAにより測定した（図 15)。

その結果、 SNK01投与群において、 IPCの各種刺激に対する IFNの産生能が低いことが明らかになった。なお、 IL- 12の産生への影響は認められな力た。このことより、 BST2に対する抗体の投与により、 BST2分子が発現している細胞の機能に変化を生じ、 in vitroでの刺激による IFN産生能が抑制されたことが示された。

[0133] 2) ウィルス感染マウスを用いた解析

抗体を前投与（1.5日前と 0.5日前にそれぞれ一匹あたり 500 g)したマウス (n=3)に 5xl0⁴pfo/mouseの MCMV (マウスサイトメガロウィルス）を腹腔内に投与し、感染を起した。この感染後、 1.5日後のマウスの血清中の IFN aを ELISAにより測定した。また、脾臓での IPCの細胞数 (cell population)を B220、 CDllc、 CD1 lbの染色によって解析した（図 16)。

その結果、 SNK01投与群において、血清中の IFN産生量は抑制されていた。すなわち、本抗体投与により、 in vivoにおける IFN産生能が抑制されたことが示された。これらの結果から、抗体の細胞への結合が、細胞機能を調節したものと考えられた。実施例 17

[0134] 関節リウマチ（RA)モデルマウスへの抗体の投与試験

関節炎惹起抗体カクテル (Chondrex社製)を用いて、添付の説明書に従って作成したマウスの関節リウマチモデルに BST2に対する抗体を投与し、関節炎抑制活性を評価した。 Balb/cマウス (雌 6週令）に関節炎惹起抗体カクテルを 2mg/マウスで腹腔内投与する 2日前、 1日前に、 SNK01、およびコントロールのラット IgGを 1匹あたり 300 g ずつ腹腔内に投与した。抗体カクテル投与後は 1日おきに 300 g/マウスの抗体を腹腔内に投与していき、カクテル投与 3日後には LPSを 50 g投与し、以後 SNK01及びコントロール抗体の投与を続けた（図 17 (a) )。 2回の試験をそれぞれブラインドで行い、継時変化を観察した。試験に用いたマウスの数は、 1回目の試験は 5匹 (n=5)、 2 回目の試験が 10匹 (n=10)の、合計 15匹 (n=15)である。

[0135] 関節炎発症率は、生き残って、る動物数に対する発症した動物数の割合を計算して求めた (n=15)。また、関節炎スコアは以下のような基準で評価した。

0 :健常

1：足首や手首に軽度の限局された赤変や腫脹が認められる。

あるいは個々の指に明らかな赤変や腫脹が認められる。

2 :足首や手首に中程度の赤変と腫脹が認められる。

3 :指を含めて足全体に重度の赤変と腫脹が認められる。

4 :複数の関節に渡って肢全体に炎症が認められる。

[0136] 図 17(b)(c)に示したように、 SNK01投与群ではコントロール投与群に比べて、関節炎の発症が抑制された。

また、抗体カクテル投与 16日後に採取したマウスの血清を用いて、 ELISA法にてリゥマチ因子の解析を行った。まず、 56°Cで 30分熱変性させた Rabbit IgG (R&D Syste ms社製） (10 μ g/ml in PBS)を ELISA plate (NUNC社製）に 50 μ 1/wellで添カ卩して、 4 °Cでー晚反応させ、プレートコートした。プレート洗浄、ブロッキングを行なった後、希釈したマウス血清を 50 1/well添加して 1時間反応させた。プレートを洗浄後、希釈した HRP標識 Rabbit anti-Mouse IgG(H&L) (abeam社製）を 50 μ 1/wellで反応させ、 Subs trate Reagent (BD Pharmingen社製）を反応させた後、 OD450 (450nmにおける吸光度）を測定した。その結果を図 18に示した。 SNK01投与群ではコントロール投与群に比べて、リウマチ因子が抑制されていた。

[0137] 更に、抗体カクテル投与後のマウスの血清中のサイト力イン量を測定した。 IFN aについては実施例 4に示した方法にて測定し、抗体カクテル投与 16日後の血清の結果を図 19に示した。 SNK01投与群ではコントロール投与群に比べて、 IFN産生が抑制されていた。また、血清中の TNF a濃度を、 ELISA Development kit (Genzyme- Techne 社製)を用いて添付の説明書に示された方法に従って測定した。抗体カクテル投与 1 6日後の血清の結果を図 20に示した。 SNK01投与群ではコントロール投与群に比べて、 TNF産生も抑制されていた。

[0138] 脾臓細胞及び末梢血中の IPCの割合を FACS解析によって測定した。その際には、実施例 1に示した方法により作成された IPC特異的抗体である SNK02、及び CDllc抗体（Becton Dickinson社製）を用いて染色を行なった。その結果、 SNK01投与群では脾臓細胞や末梢血中の IPCの割合が減少して、た（図 21)。

以上のことより、 SNK01抗体投与によって IPCの活性が抑制され、関節炎の発症が抑制されたことが示された。

実施例 18

[0139] 関節炎発症マウスへの抗体の投与試験

実施例 17と同様の方法によって、マウス (n=5)に関節炎惹起抗体カクテル及び LPS を投与して関節炎を引き起こした後、 SNK01抗体を投与して、関節炎の治療効果を評価した。マウスの数は各群 5匹とし、 6日目より 1日おきに 5回、すなわち 6、 8、 10、 12 、 14日目に 500 gずつ SNK01およびコントロールのラッ HgGをそれぞれ腹腔内に投与し、継時変化を観察した。関節炎スコアは実施例 17と同様の方法に従って求めた。発症したマウスについての結果を図 22に示した。 SNK01は関節炎スコアの減少、すなわち、関節炎の治療効果を示した。なお、 17日目の血清では SNK01投与群において IFN量が抑制されて!、た。

産業上の利用可能性

[0140] 本発明によって IPCを治療標的とする RAなどの自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤、並びに治療方法が提供された。 IPCには他の細胞の数千倍もの IFNを産生する細胞が含まれる。したがって、その IFN産生能、および細胞生存 (あるいは細胞数)のいずれかあるいは両方を抑制すれば、 IFNの産生が効果的に抑制され、 RAなどの症状を緩和することができる。 IPCに作用する本発明の治療剤は、関節炎症状の抑制のみではなぐ RA患者の免疫バランスの改善を通じてより本質的な治療を実現する。

[0141] 加えて本発明は、 RAなどの自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果の検出方法と、その方法を利用した治療に有用な候補ィ匕合物のスクリーニング方法を提供した。本発明によって、 IPCの活性の調節が、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療において重要な課題であることが明らかにされた。したがって、 IPCの活性を調節する化合物を選択することによって、 RAなどの自己免疫疾患を伴う関節炎の治療に有用な化合物を選択することができる。すなわち本発明のスクリーニング方法に基づ、て選択された化合物は、 RAなどの自己免疫疾患を伴う関節炎の治療に有用である。

Claims

請求の範囲

[I] インターフェロン産生細胞の活性抑制物質を有効成分として含有する自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤。

[2] インターフェロン産生細胞の活性抑制物質力インターフェロン産生細胞のインターフエロン産生および細胞の生存のいずれか、または両方を抑制する作用を有する物質である請求項 1に記載の治療剤。

[3] インターフェロン産生細胞の活性抑制物質力インターフェロン産生細胞のインターフエロン産生および細胞の生存のいずれか、または両方を抑制する作用を有する抗体である請求項 2に記載の治療剤。

[4] 抗体が、 BST2およびそのホモログの、ずれか、または両方を認識する抗体、またはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片である請求項 3に記載の治療剤。

[5] 抗体が、 FERM BP-10339として寄託されたハイブリドーマ 3D3#7、または FERM BP-1

0340として寄託されたハイブリドーマ 3G7#6が産生するモノクローナル抗体の、少なくとも抗原結合領域を含む抗体である請求項 4に記載の治療剤。

[6] インターフェロン産生細胞の活性を抑制する工程を含む、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療方法。

[7] 抑制すべきインターフェロン産生細胞の活性力インターフェロン産生細胞のインタ一フエロン産生および細胞の生存のいずれか、または両方である請求項 6に記載の治療方法。

[8] インターフェロン産生細胞の活性を抑制する工程力インターフェロン産生細胞のィンターフェロン産生および細胞の生存のいずれか、または両方を抑制する作用を有する抗体を投与する工程を含む、請求項 7に記載の治療方法。

[9] 抗体が、 BST2およびそのホモログの、ずれか、または両方を認識する抗体、またはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片である、請求項 8に記載の治療方法。

[10] 抗体が、 FERM BP-10339として寄託されたハイブリドーマ 3D3#7、または FERM BP-1 0340として寄託されたハイブリドーマ 3G7#6が産生するモノクローナル抗体の、少なくとも抗原結合領域を含む抗体である請求項 9に記載の治療方法。

[II] 次の工程を含む、被験化合物の自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果の検出方法 (1)インターフェロン産生細胞とインターフェロン産生細胞のインターフェロン産生誘導物質を、以下の i)-iii)の、ずれかの順序で接触させる工程、

[12] 細胞刺激剤がウィルス、ウィルスの構成要素、およびバクテリアの DNAカゝらなる群から選択される少なくとも 1つの細胞刺激剤である請求項 11に記載の方法。

[13] 被験化合物が、インターフロン産生細胞を認識する抗体またはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片である請求項 11に記載の方法。

[14] 請求項 11に記載の方法によって自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果が検出された被験化合物を選択する工程を含む、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果を有する化合物のスクリーニング方法。

[15] 請求項 14に記載のスクリーニング方法によって選択された化合物を有効成分として含有する自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤。