CN101952426B

CN101952426B - 抗bst2抗体

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Publication number: CN101952426B
Application number: CN200880122043.XA
Authority: CN
Inventors: 鸭川由美子; 并木佐穗理; 赵民权; 石田晃司
Original assignee: SBI Biotech Co Ltd
Current assignee: SBI Biotech Co Ltd
Priority date: 2007-10-16
Filing date: 2008-10-16
Publication date: 2014-04-16
Anticipated expiration: 2028-10-16
Also published as: CN101952426A; AU2008312858A1; IL205073A; JP5558825B2; BRPI0817427A8; MX2010004251A; US8529896B2; UA105760C2; KR20100090258A; US20100278832A1; WO2009051201A1; CN104031150A; EP2210939A1; EP2210939A4; BRPI0817427A2; IL205073A0; US20130336967A1; NZ585394A; CA2702939A1; JPWO2009051201A1

Abstract

以BST2抗体与人BST2抗原的各种剪接变体的结合性为指标来选择BST2抗体。其结果，成功得到了BST2抗体，该抗体特异性识别据报道在癌细胞中高度表达的BST2D。本发明的抗体与BST2D表达细胞进行特异性结合。通过在治疗中使用本发明的抗体，可以防止导致血中抗体浓度降低的、与靶组织以外的非特异性结合。或者，根据本发明的抗体，提供特异性检测BST2D表达组织的诊断药。

Description

抗BST2抗体

技术领域

本发明涉及与人BST2抗原结合的抗体及其用途。

背景技术

已知BST2是在以骨髓瘤为代表的各种癌细胞中高度表达的跨膜糖蛋白(非专利文献1～4)。迄今为止，有人报道了BST2抗原中存在多种剪接变体(专利文献1、专利文献5)。有报道称：在这些变体中，BST2D在肿瘤中高度表达(非专利文献1)。更进一步已知：抗BST2单克隆抗体通过与在细胞表面表达的BST2 (分子种相当于BST2D)结合，对该细胞具有细胞毒性(非专利文献2)。于是，应用该原理，人们尝试着开发以体内的肿瘤细胞为靶向的抗肿瘤药。例如，在人骨髓瘤细胞移植小鼠模型中得到了可以期待肿瘤的缩小或治愈的优异的抗肿瘤效果(非专利文献3、4)。

专利文献1：WO1999/043803

专利文献2：WO1998/035698

专利文献3：WO2002/064159

专利文献4：WO2005/034994

专利文献5：WO2006/008886

专利文献6：WO2006/013923

非专利文献1：Goto T.等人，Blood 84(6)：1922-30，1994

非专利文献2：Ohtomo T.等人.Biochem Biophys Res Commun；258(3)：583-91，1999

非专利文献3：Ozaki S.等人.Blood 90(8)：3 179-86，1997

非专利文献4：Koishihara Y.等人.Blood 92(s)：107，1998

发明内容

发明所要解决的课题

迄今为止，有人报道了：人BST2抗原中存在以下几种剪接变体。

核苷酸序列氨基酸序列氨基酸序列的长度

人BST2D SEQ ID NO：1 SEQ ID NO：2 (180)

人BST2H SEQ ID NO：20 SEQ ID NO：21 (158)

人BST2HS SEQ ID NO：22 SEQ ID NO：23 (100)

在这些剪接变体中，有人报道了尝试着将识别人BST2D的抗体用于治疗骨髓瘤等部分肿瘤。例如，作为抗BST2单克隆抗体的“HM1.24抗体”是确认对骨髓瘤具有疗效的代表性的单克隆抗体。“HM1.24抗体”是以人骨髓瘤细胞作为免疫原而建立的单克隆抗体。通过之后的表位分析，确认“HM1.24抗体”识别SEQ ID NO：2所示的人BST2D的氨基酸序列号116～127(SEQ ID NO：24)。然而该区由与人BST2H共通的氨基酸序列构成(图1)。

具有这样的抗原识别特性的抗体可能还与表达BST2H的细胞或组织结合。即，例如在诊断中除了检测表达人BST2D的肿瘤外，可能还要检测表达BST2H的细胞。或者，在治疗中由于抗体还与表达BST2H的细胞结合，所以血中的抗体浓度有可能容易降低。本发明将解决该课题。即，本发明的课题在于提供：与人BST2D特异性结合的抗体及其用途。

解决课题的方法

本发明人等考虑：将HM1.24抗体给予人时，通过使其非特异性地吸附在人体内的肿瘤外组织上来降低血中的HM1.24抗体浓度，尝试着找出识别HM1.24抗体所识别的表位以外的序列的抗体，并进行了深入研究，从而完成了本发明。

即，本发明人等以BST2抗体与人BST2抗原的各种剪接变体的结合性为指标来选择BST2抗体，抑制其与治疗及诊断目标外组织的非特异性吸附，成功得到了特异性的抗BST2抗体。通过使用该抗体来防止给药后血中浓度的降低，可以期待着以少于以往的抗体给药量得到目标治疗效果、或者得到能够可以有效预测该治疗效果的诊断的效果。

即，本发明涉及下述抗人BST2抗体、其制备方法以及其用途。

[1]抗人BST2抗体或包含其抗原结合区的片段，所述抗人BST2抗体的特征在于：与人BST2D抗原结合、且实质上不与人BST2H抗原结合。

[2][1]所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体的特征在于：识别包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的多肽。

[3]抗体或包含其抗原结合区的片段，所述抗体是以具有SEQ IDNO：3中的全部或至少5个以上连续的氨基酸序列的肽作为免疫原而制作的。

[4]抗体或包含其抗原结合区的片段，所述抗体与[1]～[3]中任一项所述的抗体所结合的BST2D蛋白的表位相同的表位相结合。

[5][1]～[4]中任一项所述的抗体、或包含其抗原结合区的片段，所述抗体为单克隆抗体。

[6]单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，所述单克隆抗体是由以保藏号FERM AP-21303保藏的杂交瘤BST2#4LD产生的。

[7][1]所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，其中在重链可变区和轻链可变区中含有下述氨基酸序列作为CDR1、CDR2和CDR3：

重链可变区的CDR1：SGYYWN(SEQ ID NO：4)；

重链可变区的CDR2：YISYDGSNNYNPSLKNR(SEQ ID NO：5)；以及

重链可变区的CDR3：ILGRGY(SEQ ID NO：6)；

轻链可变区的CDR1：RASQSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO：7)；

轻链可变区的CDR2：YASNLES(SEQ ID NO：8)；以及

轻链可变区的CDR3：QHSWEIPYT(SEQ ID NO：9)。

[8][1]所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体包含下述氨基酸序列作为重链可变区和轻链可变区：

SEQ ID NO：11的重链可变区和SEQ ID NO：13的轻链可变区。

[9]抗体或包含其抗原结合区的片段，所述抗体是在下述(A)或(B)任一项所述的抗体中1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的抗体，该抗体与(A)或(B)中任一项所述的抗体具有同等的活性；

(A)抗体，该抗体在重链可变区和轻链可变区中包含下述氨基酸序列作为CDR1、CDR2和CDR3：

重链可变区的CDR1：SGYYWN(SEQ ID NO：4)；

重链可变区的CDR2：YISYDGSNNYNPSLKNR(SEQ ID NO：5)；以及

重链可变区的CDR3：ILGRGY(SEQ ID NO：6)；

轻链可变区的CDR1：RASQSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO：7)；

轻链可变区的CDR2：YASNLES(SEQ ID NO：8)；以及

轻链可变区的CDR3：QHSWEIPYT(SEQ ID NO：9)；或

(B)抗体，该抗体包含下述氨基酸序列作为重链可变区和轻链可变区：

SEQ ID NO：11的重链可变区和SEQ ID NO：13的轻链可变区。

[10]抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体与[7]～[9]中任一项所述的抗体所结合的BST2D蛋白的表位相同的表位相结合。

[11][7]～[10]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体为单克隆抗体。

[12][1]～[11]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体的特征在于：对在细胞表面表达人BST2D抗原的细胞具有CDC活性。

[13][1]～[11]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体的特征在于：对在细胞表面表达人BST2D抗原的细胞具有ADCC活性。

[14]多核苷酸，该多核苷酸编码[7]～[9]中任一项所述的抗体、或包含其抗原结合区的片段。

[15]载体，该载体包含编码[7]～[9]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段的多核苷酸。

[16]转化细胞，该转化细胞保持能够表达[15]所述的载体。

[17][7]～[9]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段的制备方法，该制备方法包括以下步骤：培养[16]所述的转化细胞，之后从其培养物中回收抗体或包含其抗原结合区的片段。

[18]杂交瘤，该杂交瘤产生[1]～[5]中任一项所述的抗体。

[19]杂交瘤BST2#4LD，其以保藏号FERM AP-21303进行保藏。

[20]抗体的制备方法，该方法包括以下步骤：培养[19]所述的杂交瘤，之后从培养物中采集抗体。

[21]抗人BST2D特异性抗体的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)使抗人BST2D抗体与人BST2H和/或人BST2HS接触的步骤；以及

(2)回收具有下述i和/或ii的反应特性的抗人BST2D抗体作为抗人BST2D特异性抗体的步骤；

i.不与人BST2H结合的抗体；以及

ii.不与人BST2HS结合的抗体。

[22]抗人BST2D特异性抗体的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)用肽免疫非人动物的步骤，所述肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列、或选自SEQ ID NO：3的氨基酸序列的至少5个以上连续的氨基酸序列；以及

(2)从(1)的非人动物中回收抗体，或者回收抗体产生细胞、再回收该抗体产生细胞所产生的抗体的步骤。

[23]治疗药，其为由表达人BST2D抗原的组织增殖而引起的疾病的治疗药，该治疗药含有[1]～[13]中任一项所述的抗体、或包含其抗原结合区的片段作为有效成分。

[24]治疗药，其为表达人BST2D抗原的肿瘤的治疗药，该治疗药含有[1]～[13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段作为有效成分。

[25][24]所述的治疗药，其特征在于：肿瘤是源自骨髓细胞的肿瘤。

[26][25]所述的治疗药，其特征在于：源自骨髓细胞的肿瘤为骨髓瘤。

[27][26]所述的治疗药，其特征在于：骨髓瘤为多发性骨髓瘤。

[28]检测表达人BST2D抗原的组织的诊断药，该诊断药含有[1]～[13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段。

[29]用于检测表达人BST2D抗原的肿瘤的诊断药，该诊断药含有[1]～[13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段。

[30][29]所述的诊断药，其特征在于：肿瘤是源自骨髓细胞的肿瘤。

[31][30]所述的诊断药，其特征在于：源自骨髓细胞的肿瘤为骨髓瘤。

[32][31]所述的诊断药，其特征在于：骨髓瘤为多发性骨髓瘤。

[33]表达人BST2D抗原的肿瘤的治疗方法，该治疗方法包括：给予[1]～[13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段的步骤。

[34][1]～[13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段在制备用于治疗表达人BST2D抗原的肿瘤的药物组合物中的应用。

或者，本发明涉及[1]～[13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段在治疗表达人BST2D抗原的肿瘤中的应用。本发明还涉及[1]～[13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段在制备用于治疗表达人BST2D抗原的肿瘤的药物组合物中的应用。本发明还提供用于治疗表达人BST2D抗原的肿瘤的方法，该方法包括：对患者给予[1]～[13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段的步骤。

本发明还涉及[1]～[13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段在诊断表达人BST2D抗原的肿瘤中的应用。或者，本发明涉及[1]～[13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段在制备用于诊断表达人BST2D抗原的肿瘤的诊断药中的应用。本发明还提供用于在体内检测表达人BST2D抗原的肿瘤的方法，该方法包括：对患者给予[1]～[13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段的步骤。

此外，本发明还提供用于治疗表达人BST2D抗原的肿瘤的药物组合物的制备方法，该方法包括将[1]～[13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段与药学上可接受的载体混合的步骤。或者，本发明涉及用于在体内检测表达人BST2D抗原的肿瘤的诊断药的制备方法，该方法包括：将[1]～[13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段与药学上可接受的载体混合的步骤。

发明效果

通过本发明提供抗人BST2D特异性抗体。本发明的抗体与人BST2的多个变体中表达人BST2D的细胞进行特异性结合。已知人体内有BST2H等剪接变体，但本发明的抗体实质上不与人BST2H表达细胞结合。因此，通过在治疗中使用本发明的抗体，可以以更少量的抗体达到治疗效果。或者，在诊断中使用本发明的抗体时，可以进一步特异性检测骨髓瘤等BST2D表达细胞。

附图说明

图1是显示BST2的剪接变体蛋白结构的图。

图2是显示人BST2抗体的特异性研究结果的图，所述特异性研究包括：制作强制表达人BST2蛋白的剪接变体BST2(D)和BST2(H)的CHO细胞株，利用流式细胞术测定HM1.24、小鼠#4LD、小鼠 #19LD抗体的结合。

图3是显示HM1.24、小鼠#4LD抗体对BST2表达细胞的CDC活性的测定结果的图。测定CDC活性时使用BST2(D)-CHO、BST2(H)-CHO、来自人骨髓瘤的RPMI8226。添加兔补体，在抗体浓度为0.01-10μg/mL下于37℃培养2小时，之后测定释放到培养液中的LDH量，作为细胞毒性(％)。

图4是显示HM1.24、小鼠#4LD、嵌合#4LD、小鼠#19LD抗体对BST2表达细胞的ADCC活性的测定结果的图。测定ADCC活性时，靶细胞使用BST2(D)-CHO和RPMI8226细胞。以人PBMC作为效应细胞，测定在E/T比为12.5-100之间作为细胞杀伤的结果渗漏到上清中的LDH量，以此作为ADCC活性(％)。加入人源化抗体HM1.24(AHM抗体)以进行比较。

图5是显示将人脾脏组织的冻结切片用#4LD抗体或#19LD抗体进行免疫染色时组织染色图像的照片。

图6是显示用#4LD抗体(上)或抗His tag抗体(下)检测带有His tag的重组人BST2蛋白的蛋白质印迹法的结果的照片。

图7是显示在移植了RPMI8226细胞株的小鼠模型中给予4LD时肿瘤体积的变化的图。箭头表示给予抗体。使用最终测定日的肿瘤体积，通过Dunnett型多重比较法进行统计分析。**：P＜0.005，*：P＜0.05。

图8是显示在移植了ARH77细胞株的小鼠模型中给予4LD时的生存期间的图。通过Kaplan-Meier法logrank检验进行统计分析。*：P＜0.05。

具体实施方式

迄今为止已报道的人BST2抗原的剪接变体的例子见图1。各变体的氨基酸序列分别见以下各SEQ ID NO。

核苷酸序列氨基酸序列氨基酸序列的长度

人BST2D SEQ ID NO：1 SEQ ID NO：2 (180)

人BST2H SEQ ID NO：20 SEQ ID NO：21 (158)

人BST2HS SEQ ID NO：22 SEQ ID NO：23 (100)

在本发明使用的单克隆抗体的制备中，可以使用包含SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列的蛋白或其片段作为免疫原。已经明确：本发明的单克隆抗体识别包含SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列的蛋白作为抗原。因此，通过使用这些蛋白作为免疫原，可以得到本发明的单克隆抗体。

本发明的单克隆抗体可以是包含其抗原结合区的片段。包含抗原结合区的片段是指包含抗体的抗原结合位点、维持其抗原结合活性的片段。例如，IgG的经酶消化而生成的、包含抗原结合位点的抗体片段也可用作本发明中的抗体。具体而言，通过木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化，可以得到Fab或F(ab′)₂等抗体片段。这些抗体片段能够用作具有抗原结合亲和性的抗体分子，这已众所周知。

包含抗原结合区的片段不仅可以通过酶的切断而得到，还可以通过基因工程学方法而得到。例如，分离编码抗原结合区的基因，使该基因表达，从而可以得到包含抗原结合区的抗体片段。即，在本发明中，只要维持所需的抗原结合活性即可，还可以使用通过基因重组构建的抗体。

例如，通过酶消化得到的片段按照酶所识别的特定的氨基酸序列被切断。另一方面，通过基因工程学方法得到的抗体片段可以在抗体的任意位置形成片段。因此，即使是在不同于Fab或F(ab′)₂等抗体片段的位置形成片段的抗体片段，只要维持其抗原结合活性即可，也包括在本发明的包含抗原结合区的片段中。并且，本发明的抗体还包括：将包含抗原结合区的片段与恒定区再次连接而重构的抗体分子。因此，通过基因重组构建的抗体可以例示：例如嵌合抗体、CDR移植抗体、信号链Fv、双抗体、线状抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体等。由单克隆抗体或产生其的抗体产生细胞得到这些抗体的方法是公知的。

显示出强效应子功能的抗体的亚纲是公知的。因此，在基于本发明的嵌合抗体及CDR移植抗体中，通过选择效应子功能优异的亚纲作为恒定区，可以提高其治疗效果。

包含SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列的蛋白可以以重组体的形式得到。例如，SEQ ID NO：1记载的核苷酸序列编码SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列。因此，如果使用适当的宿主-载体使包含这些核苷酸序列的DNA表达，则可以得到目标蛋白。或者，还可以以包含选自SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列的连续氨基酸序列的寡肽作为免疫原。适合选作免疫原的氨基酸序列例如包含7-50个氨基酸、优选约5-20个氨基酸。

在本发明中，作为免疫原特别优选的寡肽是包含选自人BST2D特异性序列(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列的寡肽。人BST2D特异性序列是指：在BST2D氨基酸序列(SFQ ID NO：2)中特征性发现的、而在其他BST2剪接变体、具体有BST2H氨基酸序列(SEQ ID NO：21)和BST2HS氨基酸序列(SEQ ID NO：23)中没有发现的氨基酸序列。更具体而言，包含选自SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列(19个残基)的至少5个以上连续的氨基酸序列的寡肽是用于得到本发明的人BST2D特异性抗体的优选的免疫原。作为免疫原的肽只要能够诱导BST2D特异性抗体即可，相对于选自BST2D的氨基酸序列可以包括进一步添加的氨基酸序列。即，本发明涉及抗人BST2D特异性抗体的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

(1)用包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或选自SEQ ID NO：3的氨基酸序列的至少5个以上连续的氨基酸序列的肽免疫非人动物的步骤；以及

(2)从(1)的非人动物体内回收抗体，或者回收抗体产生细胞、之后回收该抗体产生细胞所产生的抗体的步骤。

人BST2D特异性序列(SEQ ID NO：3)通过使用ClustalW算法 (http://www.ebi.ac.uk/clustalW/)的BST2D、BST2H、BST2HS蛋白的氨基酸序列的多重对比来确定。成熟BST2D蛋白C末端的予测使用GPI修饰位点预测程序((1)GPI modification site prediction：http://mendel.imp.ac.at/sat/gpi/gpi_server.html；

(2)DGPI：http://129.194.185.165/dgpi/DGPI_demo_en.html；

(3)GPI-SOM：http://gpi.unibe.ch/)。

得到具有任意氨基酸序列的寡肽的方法是公知的。例如，使氨基酸进行化学结合，可以得到具有目标氨基酸序列的寡肽。或者，通过切断上述以重组体形式得到的、具有全长氨基酸序列的蛋白，也可以得到具有预定氨基酸序列的片段。得到的寡肽通过与适当的载体蛋白结合，可以进一步提高免疫原性。载体蛋白可以使用匙孔血蓝蛋白和牛血清白蛋白等。

之后，用免疫原免疫适当的免疫动物。可以将SEQ ID NO：2记载的蛋白或包含其部分氨基酸序列的肽和佐剂一同给予免疫动物。

并且，可以使用保持能够表达编码SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列的DNA的转化细胞作为免疫原。例如，作为上述DNA，优选包含构成SEQ ID NO：1记载的核苷酸序列的编码区的核苷酸序列的DNA。如果将这些DNA整合到适当的表达载体中，之后转化宿主细胞，则可得到作为免疫原有用的转化细胞。

用于作为免疫原的宿主细胞可以是与免疫动物来源于相同的种的细胞。通过使用相同的种的细胞，可以诱导对外来性蛋白的特异性免疫应答。例如，使用大鼠作为免疫动物时，可以使用来自大鼠的宿主细胞。还可以使用包含上述蛋白的转化细胞的组分作为免疫原。如实施例所示，在SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列中发现了跨膜结构域(图1的跨膜区：transmembrane region)。因此，具有这些氨基酸序列的蛋白可以在细胞膜上表达。可以利用表达上述蛋白的、细胞的细胞膜组分作为免疫原。

如图1所示，BST2D的胞外域在表达BST2D的细胞表面被提示。该区还包括与BST2的其他变体共通的结构。因此，使用BST2D表达细胞作为免疫原时，还可能产生与其他变体结合的抗体。但是，通过以与各变体的结合特异性为指标来选择抗体，可以得到目标抗体。即，本发明提供抗人BST2D特异性抗体的制备方法，该方法包括以下步骤。抗体与各变体的反应特异性可以通过另外说明的方法来确认。

(1)使抗人BST2D抗体与人BST2H和/或人BST2HS接触的步骤；以及

(2)回收具有以下i和/或ii的反应特异性的抗人BST2D抗体作为抗人BST2D特异性抗体的步骤；

i.不与人BST2H结合的抗体；和

ii.不与人BST2HS结合的抗体。

本发明中的免疫动物可以使用所有非人脊椎动物。为了得到单克隆抗体，容易获取用于形成杂交瘤的融合伙伴的动物是有利的。例如，来自小鼠、大鼠、兔、牛、山羊等的细胞的杂交瘤的建立已经确立。在本发明中可以使用这些免疫动物。另一方面，佐剂可以使用弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂等。

以3～10天的间隔对免疫动物进行多次免疫。每次免疫所使用的转化细胞数是任意的。通常每次使用10³～10⁸、例如10⁶个转化细胞进行免疫。另外，在利用蛋白或肽进行免疫时，通常是使用1～100μg进行免疫。自经过多次免疫的免疫动物体内回收免疫活性细胞，之后克隆产生目标抗体的细胞，从而可以得到本发明的单克隆抗体。免疫活性细胞是指免疫动物体内具有产生抗体的能力的细胞。

免疫活性细胞例如可以通过杂交瘤法进行克隆。1个免疫活性细胞产生1种抗体。因此，只要能够确立来自单细胞的细胞集团(即克隆)，即可得到单克隆抗体。杂交瘤法是指使免疫活性细胞与适当的细胞株融合，永生化(immortalize)后进行克隆的方法。已知有许多可用于杂交瘤法的细胞株。这些细胞株中，淋巴细胞系细胞的永生化效率优异，并且具有选择细胞融合成功的细胞所必需的各种遗传标记。并且，为了取得抗体产生细胞，还可以使用失去了抗体产生能力的细胞株。

例如，小鼠骨髓瘤P3x63Ag8.653(ATCC CRL-1580)在进行小鼠或大鼠的细胞融合时被广泛用作有用的细胞株。通常是通过同种细胞的融合来制作杂交瘤，但也可以由近缘的异种间的异源杂交瘤取得单克隆抗体。

细胞融合的具体方案是公知的。即，将免疫动物的免疫活性细胞与适当的融合伙伴混合来进行细胞融合。免疫活性细胞使用脾细胞或末梢血B细胞等。作为融合伙伴，可以使用之前叙述的各种细胞株。进行细胞融合时采用聚乙二醇法或电融合法。

接下来，根据融合细胞所具有的选择标记选择细胞融合成功的细胞。例如，在细胞融合中使用HAT感受性细胞株时，通过选择在HAT培养基中成长的细胞，来选择细胞融合成功的细胞。进一步确认所选择的细胞产生的抗体具有目标反应性。

根据抗体的反应性来筛选各杂交瘤。即，选择不识别SEQ ID NO：2所示的人BST2D的氨基酸编号116～127(SEQ ID NO：24)来作为表位的、产生抗人BST2D单克隆抗体的杂交瘤。选择杂交瘤时，首先确认杂交瘤所产生的抗体与人BST2D抗原结合，再确认其不识别SEQID NO：24所示的表位来作为结合区。在本申请中，“不作为表位识别”或“不以表位作为结合区识别”，这可以通过如下操作评价与具有SEQID NO：24所示的氨基酸序列的多肽的结合活性来确认。

具体而言，作为评价与具有SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列的多肽的结合活性的方法，可以适当采用本领域技术人员所周知的方法，例如ELISA法(酶联免疫吸附测定法)、RIA法(放射免疫测定法)、EIA法(酶免疫测定法)、FACS(流式细胞术法)等。

更具体的例示有：确认其不具有与BST2H的结合性、或确认具有与BST2HS的结合性的方法。作为采用使用酶标记抗体的ELISA法的该方法，还可以使BST2D或BST2H抗原与适当的固相结合，通过识别免疫动物的免疫球蛋白的标记抗体来检测与抗原结合的单克隆抗体。使BST2D或BST2H抗原与微板的内壁结合，利用ELISA法可以快速筛选产生单克隆抗体的杂交瘤。再通过与上述同样按照ELISA法测定与结合在适当的固相上的BST2H的结合性，可以从与BST2D抗原结合的单克隆抗体中选择产生具有所期望的结合活性的单克隆抗体的杂交瘤。

如上操作，可以选择与人BST2D结合、而实质上不与人BST2H结合的抗体。在本发明中，实质上不与人BST2H结合的抗体更具体是指实质上不与人BST2H表达细胞结合的抗体。某抗体实质上不与人BST2H表达细胞结合，这可以通过另外说明的方法来确认。

当所选择的杂交瘤被确认优选通过进一步亚克隆而最终产生目标抗体时，可以选择其作为产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤。作为测定、评价抗体的抗原结合活性的方法，除上述ELISA法以外，还可以适当采用FACS法等方法。作为测定、评价抗体与在悬浮于缓冲液等中的细胞表面上表达的抗原结合的方法，特别优选采用FACS的方法。作为FACS法中使用的流式细胞仪，例如已知有下述装置。

FACSCanto^TM II

FACSAria^TM

FACSArray^TM

FACSVantage^TM SE

FACSCalibur^TM

(均为BD Biosciences公司的商品名)

EPICS ALTRA HyPerSort

Cytomics FC 500

EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC

Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC

(均为Beckman Coulter公司的商品名)

作为BST2抗体的抗原结合活性的优选的测定方法之一例，有下述方法。首先，使受检抗体与表达BST2D、BST2H或BST2HS的细胞反应，之后用识别该受检抗体的、FITC标记的二次抗体将该受检抗体染色。接下来，使用FACSCalibur(BD公司)测定荧光强度和细胞数。抗体与该细胞的结合量反映为通过使用CELL QUEST软件(BD公司)进行分析而得到的荧光强度、即几何平均值。即，通过得到该几何平均值，可以测定以抗体的结合量表示的抗体的结合活性。

在本方法中，例如可以通过下述方法判断“实质上不与BST2H表达细胞结合”。首先，将上述与表达BST2H分子的细胞结合的受检抗体用二次抗体进行染色。例如，当受检抗体为小鼠抗体时，可以使用FITC标记的抗小鼠免疫球蛋白抗体作为二次抗体。之后测定细胞的荧光强度。在荧光测定中使用FACSCalibur作为流式细胞术时，所得的荧光强度可以使用CELL QUEST软件来分析。根据下式由受检抗体存在下和不存在下的几何平均值算出该比(ΔGeo-Mean)，从而可以求出由受检抗体的结合引起的荧光强度的增加比例。

ΔGeo-Mean＝Geo-Mean(受检抗体存在下)/Geo-Mean(受检抗体不存在下)

将通过分析得到的、反映受检抗体与BST2H表达细胞的结合量的几何平均比值(BST2HΔGeo-Mean值)与反映受检抗体与BST2D或BST2H表达细胞的结合量的ΔGeo-Mean比值进行比较。作为对照抗体，可以使用HM1.24抗体。

在本发明中，当受检抗体与BSH2H表达细胞的ΔGeo-Mean比值小于受检抗体与BST2D或BST2HS表达细胞的ΔGeo-Mean比值的至少50％、优选30％、进一步优选20％、特别优选10％时，则“实质上不与BST2H表达细胞结合”。计算Geo-Mean值(几何平均值)的算式记载在CELL QUEST软件用户指南(BD biosciences公司)中。与BST2H表达细胞的结合活性也可以同样评价。公知的用于评价结合活性的表达BST2HS分子、BST2H分子、或BST2D分子的细胞均利用同样的表达载体和宿主细胞来制备，优选在各细胞中的表达量为同等程度。

本发明的单克隆抗体包括：与BST2D表达细胞结合、且与表达BST2H分子的细胞的结合活性低于其与上述BST2D表达细胞的结合活性的单克隆抗体。或者，本发明的优选的单克隆抗体包括：与上述BST2D表达细胞结合、且实质上不与表达BST2H分子的细胞结合的单克隆抗体。

本发明还提供与本申请发明中公开的单克隆抗体所结合的表位相同的表位相结合的抗体。即，本发明涉及识别与本发明的单克隆抗体所识别的表位相同的表位的抗体及其用途。例如，本发明中优选的单克隆抗体4LD识别SEQ ID NO：37、EVERLRRENQVLSVR的氨基酸序列作为表位。更具体而言，在由选自构成SEQ ID NO：2所示的人BST2D的全长氨基酸序列中的胞外结构域的氨基酸序列(47-180)的连续的氨基酸序列构成的合成肽中，虽然K(47)---R(147)被本发明的4LD抗体识别，但在相同条件下无法测定4LD抗体与K(47)--V(146)的结合。此外，虽然E(133)---Q(180)被本发明的4LD抗体识别，但在相同条件下无法测定4LD抗体与V(134)----Q(180)的结合。

因此，作为本发明的单克隆抗体，优选识别由SEQ ID NO：37、EVERLRRENQVLSVR构成的表位的单克隆抗体。更具体而言，在由选自构成SEQ ID NO：2所示的人BST2D的全长氨基酸序列中的胞外结构域的氨基酸序列(47-180)的连续的氨基酸序列构成的合成肽中，作为本发明的BST2D抗体，优选与包含K(47)---R(147)和E(133)---Q(180)的肽结合、但在相同条件下无法测定与K(47)--V(146)和V(134)---Q(180)的结合的抗体。这样的抗体例如可以通过以下方法而得到。

受检抗体与某抗体所结合的表位相同的表位相结合、即受检抗体与某抗体共有同样的表位，这可以通过两者对相同表位的竞争来确认。在本发明中，抗体间的竞争可以通过FACS或交叉封闭分析等来测定。在FACS中，首先使本发明的单克隆抗体与BST2D表达细胞结合，测定荧光信号。接下来，使细胞与候选竞争抗体反应，之后使同一细胞与本发明的单克隆抗体反应，同样通过FACS来分析。或者，还可以使本发明的单克隆抗体和受检竞争抗体同时与相同的细胞反应。使竞争抗体反应时，若本发明的单克隆抗体的FACS分析模式(pattern)发生变化，即可确认竞争抗体与本发明的单克隆抗体识别相同的表位。

此外，例如竞争ELISA分析为优选的交叉封闭分析。具体而言，在交叉封闭分析中，将表达BST2D的细胞固定在微量滴定板的孔上。在候选竞争抗体的存在下或不存在下进行预培养，之后添加本发明的单克隆抗体。与孔中的BST2D表达细胞结合的本发明的单克隆抗体的量和竞争与同一表位结合的候选竞争抗体(受检抗体)的结合能力逆相关。即，受检抗体与同一表位的亲和性越大，本发明的单克隆抗体与固定有BST2D蛋白表达细胞的孔的结合量越低。或者，反之受检抗体与同一表位的亲和性越大，受检抗体与固定有BST2D蛋白表达细胞的孔的结合量越高。

通过预先标记抗体，可以容易地测定与孔结合的抗体量。例如，生物素标记的抗体可以通过使用亲和素-过氧化物酶共轭物和适当的底物来测定。将利用了过氧化酶等酶标记的交叉封闭分析特别称作竞争ELISA分析。抗体可以用可检测或测定的其他标记物进行标记。具体而言，放射标记或荧光标记等是公知的。

并且，当受检抗体具有来自与本发明的单克隆抗体不同种的恒定区时，还可以通过特异性识别来自任意的种的恒定区的标记抗体来测定与孔结合的任一种抗体。或者，即使是来自相同的种的抗体，当纲不同时，可以通过特异性识别各纲的抗体来测定与孔结合的抗体。

与在候选竞争抗体不存在下实施的对照试验中得到的结合活性相比，候选抗体可以封闭至少20％、优选至少20-50％、进一步优选至少50％的本发明的单克隆抗体的结合时，该候选竞争抗体是与本发明的单克隆抗体实质上与同一表位结合或者竞争与同一表位结合的抗体。

作为与单克隆抗体所结合的表位相同的表位相结合的抗体，例如有上述[4]或[10]所述的抗体。

如上所述，上述[4]或[10]所述的抗体不仅包括一价抗体，还包括多价抗体。本发明的多价抗体包括具有完全相同的抗原结合位点的多价抗体、或具有一部分或完全不同的抗原结合位点的多价抗体。

作为本发明的抗体，可以使用识别BST2D的任意抗体。例如，作为优选的抗体，可以例示以下(1)～(5)所述的抗体。这些抗体例如可以是全长抗体、小分子抗体、动物抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

(1)抗体或包含其抗原结合区的片段，所述抗体的重链可变区和轻链可变区中包含下述氨基酸序列作为CDR1、CDR2和CDR3；

重链可变区的CDR1：SGYYWN(SEQ ID NO：4)；

重链可变区的CDR2：YISYDGSNNYNPSLKNR(SEQ ID NO：5)；以及

重链可变区的CDR3：ILGRGY(SEQ ID NO：6)；

轻链可变区的CDR1：RASQSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO：7)；

轻链可变区的CDR2：YASNLES(SEQ ID NO：8)；以及

轻链可变区的CDR3：QHSWEIPYT(SEQ ID NO：9)。

(2)上述[1]所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体包括下述记载的氨基酸序列作为重链可变区和轻链可变区；

SEQ ID NO：11的重链可变区和SEQ ID NO：13的轻链可变区。

(3)抗体，该抗体与(1)或(2)中任一项所述的抗体具有同等活性，其是在(1)或(2)中任一项所述的抗体中1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入而得到的抗体；

(4)抗体或包含其抗原结合区的片段，所述抗体结合在与(1)～(3)中任一项所述的抗体所结合的BST2D蛋白的表位相同的表位上；

(5) (1)～(4)中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体为单克隆抗体。

上述(3)所述的抗体的优选方式为：CDR中没有发生改变的抗体。例子有：上述(3)所述的抗体中，“抗体，该抗体与(1)所述的抗体具有同等活性，是在(1)所述的抗体中1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入而得到的抗体”的优选方式为：“抗体，该抗体包含重链和轻链，所述重链具有作为CDR1的SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：5记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列，所述轻链具有作为CDR1的SEQ IDNO：7记载的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：8记载的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：9记载的氨基酸序列，该抗体与(1)所述的抗体具有同等活性，是在(1)所述的抗体中1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入而得到的抗体”。上述(3)所述的抗体中，其他抗体的优选方式也可以同样描述。

在本发明中，“具有同等活性的抗体”是指“功能同等的抗体”。“同等活性”或“功能同等”是指例如抗体与BST2D或BST2H的结合活性、结合亲和性或抗体对表达BST2D蛋白的细胞的CDC活性(补体依赖性细胞毒性)或ADCC活性(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)等同等。

向多肽中导入突变的方法是用于制备与某多肽功能同等的多肽的、本领域技术人员所熟知的方法之一。例如，本领域技术人员可以利用位点特异性诱变法(Hashimoto-Gotoh，T.等人.(1995)Gene 152，271-275、Zoller，MJ，and Smith，M.(1983)Methods Enzymol.100，468-500、Kramer，W.等人.(1984)Nucleic Acids Res.12，9441-9456、Kramer W，and Fritz HJ(1987)Methods.Enzymol.154，350-367、Kunkel，TA(1985)Proc Natl Acad Sci USA.82，488-492、Kunkel(1988)MethodsEnzymol.85，2763-2766)等，通过向本发明的抗体中导入适当的突变，可以制备与该抗体功能同等的抗体。另外，氨基酸突变也可在自然界中产生。如上所述，本发明的抗体还包括：在本发明抗体的氨基酸序列中具有1个或多个氨基酸发生突变的氨基酸序列、且与该抗体功能同等的抗体。

在这样的突变体中，发生突变的氨基酸数通常为50个氨基酸以内，优选为30个氨基酸以内，进一步优选为10个氨基酸以内(例如5 个氨基酸以内)。

在发生突变的氨基酸残基中，希望突变成保有氨基酸侧链的性质的其他氨基酸。例如，根据氨基酸侧链的性质确立以下分类。

疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)；

亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)；

具有脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)；

具有含羟基的侧链的氨基酸(S、T、Y)；

具有含硫原子的侧链的氨基酸(C、M)；

具有含羧酸和酰胺的侧链的氨基酸(D、N、E、Q)；

具有含碱基的侧链的氨基酸(R、K、H)；

具有含芳族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)

(括弧内均表示氨基酸的单字母符号)。

已知具有对某氨基酸序列进行修饰而得到的氨基酸序列的多肽维持其生物学活性，所述修饰是指使某氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、添加和/或取代成其他氨基酸(Mark，D.F.等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666、Zoller，M.J.and Smith，M.，Nucleic Acids Research(1982)10，6487-6500、Wang，A.等人.，Science224，1431-1433、Dalbadie-McFarland，G.等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79，6409-6413)。即，通常在构成某多肽的氨基酸序列中，当分为各组的氨基酸相互取代时，该多肽活性得以维持的可能性高。本发明中将上述氨基酸组的组内氨基酸间的取代称作保存性取代。

作为本发明的抗体，可以使用下述抗体：将抗体基因整合到适当的载体中，之后将其导入宿主中，利用基因重组技术而产生的基因重组型抗体(例如参照Carl，A.K.Borrebaeck，James，W.Larrick，THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES，Published in theUnited Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD，1990)。具体而言，由该杂交瘤取得编码抗体的抗原结合区的cDNA，之后将其插入适当的表达载体中而使之表达。取得编码抗体可变区的cDNA，将其整合到表达载体中，接下来利用该载体转化适当的宿主细胞，使抗体表达，此技术是公知的。另外，通过使包含抗原结合区的可变区与恒定区结合而形成嵌合抗体的方法也是公知的。

本发明还提供导入有本发明的载体的宿主细胞。对导入有本发明的载体的宿主细胞没有特别限定，例如可以使用大肠杆菌或各种动物细胞等。本发明的宿主细胞例如可以用作用于制备或表达本发明的抗体的产生系统。用于制备多肽的产生系统有：体外产生系统和体内产生系统。体外产生系统的例子有：使用真核细胞的产生系统和使用原核细胞的产生系统。

使用真核细胞时，例如可以使用动物细胞、植物细胞、真菌细胞作为宿主。动物细胞已知有：哺乳动物细胞、例如CHO(J.Exp.Med.(1995)108，945)、COS、NIH3T3、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾)、HeLa、Vero；两栖动物细胞、例如非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)(Valle等人，Nature(1981)291，338-340)；或昆虫细胞、例如Sf9、Sf21、Tn5。作为CHO细胞，特别优选使用缺失了DHFR基因的CHO细胞、即dhfr-CHO(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77，4216-4220)或CHO K-1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1968)60，1275)。为了在动物细胞中进行大量表达时，特别优选CHO细胞。关于向宿主细胞内导入载体，例如可以通过以下方法来进行：磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、使用阳离子脂质体DOTAP(Boehringer Mannheim公司制)的方法、电穿孔法、脂质转染法等方法。

作为真菌细胞，已知有：酵母、例如酵母菌(Saccharomyces)属的细胞(例如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))；丝状菌、例如曲霉(Aspergillus)属的细胞(例如黑曲霉(Aspergillus niger))。

使用原核细胞时，有使用细菌细胞的产生系统。作为细菌细胞，有大肠杆菌(E.coli)、例如JM109、DH5α、HB101等，此外还已知枯草杆菌。

利用目标多核苷酸转化这些细胞，再将转化的细胞在体外培养，从而得到抗体。可以按照公知方法进行培养。例如，作为动物细胞的培养液，例如可以使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM。此时，既可以结合使用胎牛血清(FCS)等血清补充液，也可以进行无血清培养。培养时的pH优选为约6～8。通常是在约30～40℃下培养约15～200小时，根据需要可以交换培养基或进行通气、搅拌。

如此操作而得到本发明的抗体，可以将其从宿主细胞内或细胞外(培养基等)分离，纯化成实质上纯粹且均匀的抗体。抗体的分离、纯化可以使用通常抗体的纯化中所使用的分离、纯化方法，但并不限于这些方法。例如，可以适当选择、组合层析柱、过滤器、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳法、透析、重结晶等来分离和纯化抗体。

层析例如有：亲合层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析、反相层析、吸附层析等(Strategies for Protein Purification andCharacterization(蛋白质纯化与鉴定实验指南)：A Laboratory CourseManual.Ed Daniel R.Marshark等人，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1996)。上述层析可以使用液相层析、例如HPLC、FPLC等液相层析来进行。用于亲合层析的柱有：蛋白A柱、蛋白G柱。使用蛋白A的柱例如有：Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(Pharmacia)等。本发明还包含利用上述纯化方法进行高度纯化的抗体。

并且，还可以将单克隆抗体的抗原结合区移植到其他免疫球蛋白中。免疫球蛋白的抗原结合区由互补性决定区(CDR)和构架区构成。各免疫球蛋白的抗原结合特性由CDR决定，构架维持抗原结合区的结构。CDR的氨基酸序列极富多样性，而构架部分的氨基酸序列则被高度保存。已知通过将构成CDR的氨基酸序列整合到其他免疫球蛋白分子的构架区中可以移植抗原结合特性。已经确立了利用该方法将异种免疫球蛋白所具有的抗原结合特性赋予给人免疫球蛋白的方法。

如此操作制成的单克隆抗体均可用于本发明。即，可以将包含免疫球蛋白的单克隆抗体用于本发明，所述免疫球蛋白包含由来自编码该单克隆抗体的抗原结合区的cDNA的多核苷酸编码的抗原结合区。

[作为可用于本发明的、产生单克隆抗体的杂交瘤，可以例示如杂交瘤#4LD、#3LD、#9LD。杂交瘤#4LD于2007年6月6日以保藏号FERM AP-21303保藏在独立行政法人产业技术综合研究所内特许生物寄托中心，并且根据布达佩斯条约作为国际保藏赋予保藏号为FERM BP-10964。以下记载特定保藏的内容。

(a)保藏机构的名称、地址

名称：独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心

地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番1号中央第6(邮政编号305-8566)

(b)保藏日：2007年6月6日

(c)保藏号：FERM BP-10964(杂交瘤#4LD)]

用于本发明的单克隆抗体，可以通过培养产生这些单克隆抗体的杂交瘤，之后从该培养物中回收。杂交瘤可以在体外或体内培养。在体外可以使用RPMI1640等公知的培养基来培养杂交瘤。该杂交瘤分泌的免疫球蛋白蓄积在培养上清中。因此，采集培养上清，根据需要进行纯化，从而可以得到本发明的单克隆抗体。在没有添加血清的培养基中容易纯化免疫球蛋白。但为了使杂交瘤更迅速地增殖和促进抗体的产生，还可以向培养基中加入约10％的胎牛血清。

杂交瘤还可以在体内进行培养。具体而言，可以通过将杂交瘤接种在裸鼠的腹腔中，在腹腔内培养杂交瘤。单克隆抗体蓄积在腹水中。因此，采集腹水，根据需要进行纯化，即可得到所需的单克隆抗体。根据目的可以对所得的单克隆抗体进行适当的修饰或加工。

抗体可以是嵌合抗体，也可以是单克隆抗体。

在本发明中，作为特异性识别BST2D的单克隆抗体，可以使用识别具有SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列的蛋白、而不识别具有SEQID NO：21记载的氨基酸序列的蛋白的单克隆抗体。这样的抗体例如可以通过选择在某条件下与包含SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列的多肽结合、而在相同条件下与包含SEQ ID NO：21记载的氨基酸序列的多肽的结合无法检测的抗体而得到。更具体而言，例如可以通过比较抗体与细胞的结合特性来选择目标抗体，所述细胞已用包含编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：21的氨基酸序列的DNA的表达载体进行转化。为了比较抗体与转化细胞的结合特性，可以利用FACS等公知方法。

将特异性识别BST2D的抗体给予与该抗体所来自的生物种不同的宿主时，希望将该抗体加工成不易被该宿主识别为异物的形式。例如有为了降低对人的异种抗原性等而人为修饰的基因重组型抗体、例如嵌合(chimeric)抗体、人源化(humanized)抗体等。这些修饰抗体可以利用已知的方法进行制备。嵌合抗体是包含人以外的哺乳动物、例如小鼠抗体的重链、轻链的可变区和人抗体的重链、轻链的恒定区的抗体，连接编码小鼠抗体可变区的DNA和编码人抗体恒定区的DNA，将其整合到表达载体中，之后导入宿主中而得到嵌合抗体。

人源化抗体又称重构(reshaped)人抗体，是将人以外的哺乳动物、例如小鼠抗体的互补性决定区(CDR；complementarity determiningregion)移植到人抗体的互补性决定区而得到的抗体，其一般的基因重组方法也已知。通过加工成下述那样的分子，可以使免疫球蛋白不易被识别为异物。将免疫球蛋白分子进行如下加工的方法是公知的。

-包含缺失了恒定区的抗原结合区的片段(MonoclonalAntibodies：Principles and Practice，第三版，Academic Press Limited.1995；Antibody Engineering，A Practical Approach，IRL PRESS，1996)

-由单克隆抗体的抗原结合区与宿主的免疫球蛋白的恒定区构成的嵌合抗体(遺伝子発現実験マニユアル(基因表达实验指南)講談社1994年(石田功、安東民衛编)

-将宿主免疫球蛋白中的互补性决定区(CDR)取代成单克隆抗体的CDR的CDR取代抗体(遺伝子発現実験マニユアル講談社 1994年(石田功、安東民衛编)

此外，还已知对人不具有异种抗原性的人抗体的取得方法。例如，通过使用整合有人抗体基因的非人动物作为免疫动物，可以由非人动物得到人抗体。更具体而言，例如整合有人抗体基因的转基因小鼠作为用于制备人抗体的免疫动物已实际应用(Ishida等人，Cloning andStem Cells，4：85-95，2002)。通过使用这样的动物，以人的BST2作为抗原，可以得到识别BST2的人抗体。作为给予人的抗体，人抗体是优选的抗体。

或者，还已知使用人抗体文库，通过淘选取得人抗体的技术。即，通过噬菌体展示法(McCafferty J.等人，Nature 348：552-554，1990；Kretzschmar T等人，Curr Opin Biotechnol.2002 Dec；13(6)：598-602.)，也可以取得人的免疫球蛋白可变区基因。在噬菌体展示法中，编码人免疫球蛋白可变区的基因被整合到噬菌体基因中。也可以以各种免疫球蛋白基因为来源制成噬菌体文库。噬菌体作为构成自身的蛋白的融合蛋白来表达该可变区。通过噬菌体表达的噬菌体表面的可变区维持着抗原结合活性。因此，通过选择与抗原或表达抗原的细胞等结合的噬菌体，可以从噬菌体文库中筛选表达具有目标结合活性的可变区的噬菌体。并且，在如此选择的噬菌体颗粒中保有编码具有目标结合活性的可变区的基因。即，在噬菌体展示法中，以可变区的结合活性为指标，可以取得编码具有目标结合活性的可变区的基因。

本发明所使用的抗体优选为具有细胞毒性的抗体。

作为本发明中的细胞毒性，例如有：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC)、补体依赖性细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity：CDC)等。在本发明に中，CDC活性是指由补体系统产生的细胞毒性。而ADCC活性是指当特异性抗体与抗原在靶细胞的细胞表面结合时，Fcγ受体保有细胞(免疫细胞等)经由Fcγ受体结合在其Fc部分，给靶细胞带来伤害的活性。

抗BST2D抗体是否具有ADCC活性、或者是否具有CDC活性，这可以利用公知的方法进行测定(例如Current protocols in Immunology，Chapter 7.Immunologic studies in humans，Editor，John E，Coligan等人，John Wiley & Sons，Inc.，(1993)等)。

具体而言，首先制备效应细胞、补体溶液、靶细胞。

(1)效应细胞[人末梢单核细胞]的制备

使用末梢单核细胞作为效应细胞，所述末梢单核细胞是将由健康人供血者得到的末梢血通过Ficoll法进行分离而获得的。

(2)补体溶液的制备

用CDC培养基稀释幼兔补体(CEDARLANE公司制)使最终补体浓度为6％，即可使用。

(3)靶细胞的制备

可以使用表达BST2D蛋白或BST2H蛋白的CHO细胞、或来自人骨髓瘤的RPMI8226细胞等的表达BST2蛋白的细胞作为靶细胞。

作为表达BST2蛋白的细胞，可以使用经编码BST2蛋白的基因转化的细胞、各种肿瘤细胞等。

CDC活性或ADCC活性可以通过下述方法来测定。

测定CDC活性时，向96孔U底板的每孔中加入50μL靶细胞和50μL抗BST2抗体，之后加入50μL补体溶液，在二氧化碳培养箱内于37℃培养2小时。使抗体的终浓度达到0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL或10μg/mL。培养后，回收培养上清，利用CytoTox96(注册商标)Assay(PROMEGA公司)测定培养上清中的LDH量，作为“由于补体活性而自靶细胞中漏出的LDH量(实验样品)”。

关于CDC活性，设定以下对照来进行分析。

(1)实验区中的LDH释放量(补体对靶细胞的毒性)

(2)靶细胞的自然LDH释放量

(3)靶细胞的最大LDH释放量

(4)添加有裂解液的液量校正用对照

(5)仅有培养液的背景(空白)

从(1)、(2)、(3)中得到的各吸光值的平均值中减去(5)的空白的平均值。之后根据下式算出CDC活性。

CDC活性(％)＝(实验区中的释放量-靶细胞自然释放量)/(靶细胞最大释放量-靶细胞液量校正对照-靶细胞自然释放量)×100

测定ADCC活性时，向96孔U底板的每孔中分别注入50mL靶细胞(BST2(D)-CHO细胞、来自人骨髓瘤的RPMI8226株)(4×10⁵/mL)。加入抗BST2抗体溶液使其最终浓度达到10μg/mL，在4℃下培养30分钟，加入靶细胞的12.5、25、50、100倍量的效应细胞(PBMC)，在37℃下培养4小时。测定细胞上清中的LDH量，由此测定由于细胞毒性而自靶细胞中漏出的LDH量(ExperimentalSample，试样)。设定与CDC活性的测定相同的对照，分析ADCC活性。

通过给予本发明的BST2D特异性抗体，可以治疗或预防表达BST2D的各种肿瘤。即，本发明提供用于治疗表达人BST2D的肿瘤的方法，该方法包括以下步骤：对患者给予与BST2D结合且实质上不与BST2H结合的抗体或包含其抗原结合区的片段。作为可以按照本发明来治疗的血液肿瘤，可以例示下述肿瘤。需要说明的是，血液肿瘤包括造血系统肿瘤。

白血病(leukemia)、

骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome；MDS)、

恶性淋巴瘤(malignant lymphoma)、

慢性骨髓性白血病(chronic myeloid leukemia)、

浆细胞病(plasma cell dyscrasia)、

骨髓增殖性疾病(myeloproliferative disorder)

上述血液肿瘤中，浆细胞病包括：骨髓瘤(myeloma)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma)、巨球蛋白血症(macroglobulinemia)。骨髓增殖性疾病包括：原发性红细胞增多症(primary polycythemia)、原发性血小板增多症(essential thrombocythemia)、特发性骨髓纤维症(agnogenic myeloid metaplasia)等。在这些血液肿瘤中，作为治疗对象，优选为骨髓瘤、更具体的是多发性骨髓瘤。另外，认为本发明的抗体在体内不会发生与治疗和诊断目标外组织的非特异性吸附，可以与治疗和诊断目标细胞特异性结合，所以认为对机体给予本发明的抗体时特别有效。

本发明人等发现本发明的抗体具有CDC活性和ADCC活性。基于此发现，本发明提供含有本发明的抗体作为有效成分的肿瘤治疗药。并且，在为了治疗或预防目的而使用本发明的抗体时，根据需要还可以对抗体进行修饰。根据本发明，特异性识别人BST2D的胞外结构域的抗体对表达BST2D的细胞具有细胞毒性。或者，通过用细胞毒性物质(cytotoxic agent)修饰抗体，可以进一步增强该抗体对表达BST2D的细胞的毒性。作为细胞毒性物质，可以例示以下物质。

毒素类：绿脓杆菌毒素(假单胞菌内毒素(Pseudomonas Endotoxin)；PE)、白喉毒素、蓖麻毒素

放射性同位素：^99mTc、⁸⁹Sr、¹³¹I、⁹⁰Y

抗癌药：加利车霉素、丝裂霉毒、紫杉醇

包含蛋白的毒素类可以通过双官能性试剂与抗体或其片段等结合。或者，将编码毒素类的基因与编码抗体的基因连接，也可得到两者的融合蛋白。使放射性同位素与抗体结合的方法也是公知的。例如，使用螯合剂，用放射性同位素标记抗体的方法是公知的。并且，可以通过使用糖链或双官能性试剂等，使抗癌药与抗体结合。

本发明提供肿瘤治疗药，该肿瘤治疗药含有本发明的抗体作为有效成分。由于本发明的抗体具有CDC活性和ADCC活性，所以认为其对癌症等肿瘤(特别是血液肿瘤)的治疗和预防特别有效。

使用本发明的抗体作为治疗药时，例如考虑将本抗体的溶液制剂单独或与其他治疗药结合使用，进行静脉内或皮下等给药的形态。作为结合使用中所用的治疗药，例如可以组合用于治疗多发性骨髓瘤的公知的治疗药。例如，在骨髓瘤的治疗中使用下述治疗药。

硼替佐米沙利度胺来那度胺

美法仑地塞米松长春新碱

多柔比星干扰素-α 利妥昔单抗

并且，除骨髓瘤治疗药外，还可以结合使用用于增强抗体的作用的治疗药。例如，可以将免疫增强剂(作为提高效应子功能的药物)与本发明的抗体一同给药。具体而言，通过将抗体与干扰素-γ、白介素-2、白介素-12等一同给药，可以期待抗体的效应子功能的增强作用。或者，与包含CpG寡核苷酸等的Toll样受体激动剂一同给药，也可期待免疫增强作用。

在本发明的肿瘤治疗药中，特异性识别BST2D的抗体或其片段、或至少包含其抗原结合区的抗体可以以蛋白或编码该蛋白的多核苷酸的形式进行给药。给予多核苷酸时，优选利用在适当的启动子的控制下配置有编码目标蛋白的多核苷酸的载体，使能够表达目标蛋白。载体中还可以配置增强子和终止子。保持构成免疫球蛋白的重链和轻链的基因、可以表达免疫球蛋白分子的载体是公知的。

可表达免疫球蛋白的载体可以通过将其导入细胞内来进行给药。对机体给药时，通过对机体给药可感染细胞的载体可以直接给药。或者，还可以将载体导入暂且自机体分离的淋巴细胞中，然后使该淋巴细胞再次返回到机体内(先体外后体内)。

并且，对机体给予表达免疫球蛋白的载体时，为了使重链和轻链作为分别的质粒进行共转染，每1kg体重可以给予0.1～10mg、例如1～5mg的各质粒。另外，为了使载体在体外也能导入细胞，可以使用1～5μg/10⁶细胞的载体。

本发明的治疗药可以以药物的形式进行给药，可以通过口服或胃肠外给药的途径进行全身或局部给药。例如可以选择点滴等静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、栓剂、灌肠剂、口服肠溶剂等，可以根据患者的年龄、症状选择适当的给药方法。给予机体的治疗药的量为单克隆抗体量时，以免疫球蛋白计，每1kg体重通常为 0.5mg～100mg、例如1mg～50mg、优选为2mg～10mg的免疫球蛋白。对机体给予抗体的给药间隔可以适当调节，使在治疗期间能够维持体内免疫球蛋白的有效浓度。具体而言，例如可以以1～2周的间隔进行给药。

给药途径是任意的。本领域技术人员可以在治疗时适当选择有效的给药途径。具体可以例示：口服或胃肠外给药。例如，可以通过静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射或皮下注射等将抗体进行全身或局部给药。作为本发明的适合胃肠外给药的制剂，有注射剂、栓剂、喷雾剂等。另外，对细胞进行给药时，通常向培养液中添加1μg/mL、优选10μg/mL以上、更优选50μg/mL以上、进一步优选0.5mg/mL以上的免疫球蛋白。

可以通过任意方法将本发明中的肿瘤治疗药给予机体。通常将单克隆抗体与药学上可接受的载体混合用作治疗药。在本发明的治疗药中，根据需要可以混合增稠剂、稳定剂、防腐剂和增溶剂等添加剂。这样的载体或添加剂的例子有：乳糖、枸橼酸、硬脂酸、硬脂酸镁、蔗糖、淀粉、滑石粉、明胶、琼脂、植物油、乙二醇等。

“药学上可接受的”用语是指由各国政府的监督当局承认的、或者关于在动物、哺乳动物、以及特别是人中的应用而载入各国的药典或通常认可的药典中。本发明的治疗药还可以以1次或多次用量的冻干粉末或片剂的形式供给。给药前还可以将冻干粉末或片剂与用于溶解该组合物的注射用灭菌水、生理盐水或缓冲液组合，使该组合物达到所期望的浓度。

由本发明提供的、特异性识别人BST2D的抗体可用于检测表达人BST2D的细胞。例如，在从人体内采取的组织或机体中，通过检测人BST2D表达细胞，可以诊断由BST2D表达细胞引起的疾病。即，本发明涉及检测表达人BST2D抗原的组织的诊断药，该诊断药中含有本发明的特异性识别人BST2D的抗体或包含其抗原结合区的片段。或者，本发明涉及本发明的特异性识别人BST2D的抗体或包含其抗原结合区的片段在制备用于检测表达人BST2D抗原的组织的诊断药中的应用。本发明还涉及本发明的特异性识别人BST2D的抗体或包含其抗原结合区的片段在用于检测表达人BST2D抗原的组织的诊断中的应用。

在本发明中，表达人BST2D抗原的组织可以例示如：表达人BST2D抗原的肿瘤。确认人BST2D抗原在源自骨髓细胞的肿瘤、更具体的是骨髓瘤中高度表达。在本发明中，作为诊断对象而特别优选的骨髓瘤为多发性骨髓瘤。

在本发明中，特异性识别人BST2D的抗体或包含其抗原结合区的片段在体外或体内可用于诊断。例如，以从患者体内采取的试样作为对象，在体外可以同定骨髓瘤等表达人BST2D抗原的细胞或组织。这样的诊断中使用的机体组织的例子有骨髓组织。或者，对患者给予特异性识别人BST2D的抗体，通过追踪其聚积，可以明确表达人BST2D抗原的细胞或组织在体内的分布。

在体外检测抗体与细胞或组织的结合的方法众所周知。例如，预先用荧光色素或酶标记抗体，以标记作为指标可以追踪该抗体与固定标本的结合。或者，还可以利用亲和素-生物素系统来间接标记抗体。另一方面，在体内可以采用下述方法：用放射性核素标记抗体，之后追踪抗体在体内的行为。例如，利用识别用锝99m(^99mTc)等放射性核素标记的肿瘤抗原的抗体来诊断体内肿瘤组织的图像诊断法已实际应用。抗体或包含其抗原结合位点的片段可以通过还原用^99mTc直接进行标记。给予体内的放射性核素可以通过闪烁照相机或单光子CT(SPECT)装置形成图像。将这样的方法用于本发明，可以明确表达人BST2D的肿瘤组织的分布。更具体而言，该方法可用于诊断骨髓瘤的原发灶或转移灶。

例如，用^99mTc等标记本发明的特异性识别人BST2D的抗体或包含其抗原结合区的片段，将该已标记的抗体或抗体片段给予受试者，从体外追踪^99mTc的放射线，从而可以检测体内的BST2表达组织(闪烁照相法)。通过确认人BST2D抗原在肿瘤中的表达，根据治疗目的还可以将标记的抗体或片段用于选择适于给予本发明的特异性识别人BST2D的抗体或包含其抗原结合区的片段的患者。

本发明的单克隆抗体特异性识别表达人BST2D的细胞或组织。因此，在体外可以特异性同定骨髓瘤等表达BST2D的细胞或组织。或者，在体内也可以同样选择性地检测表达BST2D的组织或细胞。BST2中也存在BST2H等被确认在骨髓瘤以外的细胞中表达的变体。因此，特别是在体内通过使用BST2D特异性抗体，可以防止背景噪音或非特异性信号。

需要说明的是，本说明书中引用的所有在先技术文献均作为参照而纳入本说明书中。

以下，根据实施例进一步详细说明本发明，但这些实施例并不限制本发明的范围。

实施例

实施例1 产生小鼠抗人BST2抗体的杂交瘤的制作

A.免疫原的制作

如下所示，将人BST2D基因导入293T细胞中，来制作作为免疫原的细胞。向100mm/胶原包被的皿(IWAKI)中添加4μg带有导入基因的表达载体pCDNA3.1-hBST2D，与覆盖皿的整个底面的3mLopti-MEM(GIBCO)混合。接下来，与该表达载体溶液分开，另用3mLopti-MEM稀释58μL Lipofectamine^TM2000(Invitrogen)，在室温下静置5分钟，制备脂质转染胺溶液。之后，向装有该表达载体溶液的皿中轻轻地添加脂质转染胺溶液，混合。在室温下静置20分钟，之后向皿中轻轻地添加10mL用含有10％FBS(胎牛血清)的DMEM培养基(SIGMA)稀释至1×10⁶个细胞/mL的293T细胞。在37℃的CO₂培养箱中静置培养48小时后，通过移液来回收细胞，作为免疫原用转染子。

B.杂交瘤的制作

B-1)免疫

在对导入有人BST2D基因的293T细胞进行免疫的前一天，将200μL PBS与200μL佐剂(完全佐剂(FREUND)三菱化学Iatron RM606-1)混合制成乳液，在4只雌性Balb/c小鼠(4周龄)的两脚掌各给予50μL所得乳液进行免疫。第二天，将2×10⁷个细胞悬浮于400μL PBS中，对两脚掌各给予50μL所得的悬浮液进行免疫。每隔3日进行第2次、第3次免疫，在第3次免疫的3天后如下进行细胞融合。

B-2)细胞融合

从已免疫的小鼠的两脚淋巴结采集细胞，与用含有10％FBS的RPMI1640培养基(SIGMA)培养的小鼠骨髓瘤细胞P3-X63-Ag8-U1混合，使P3-X63-Ag8-U1与来自小鼠淋巴结的细胞之比为2∶1～10∶1，之后通过离心回收细胞。向所得的细胞组分中加入用RPMI1640培养基进行等量稀释的PEG4000(MERCK)，进行细胞融合。清洗细胞，之后将其悬浮于160mL含有补充物(supplement)的15％FBS-HAT培养基中，按200μL/孔接种在16块96孔平板中。3天后交换培养基，在确认集落形成的1～2周后进行1次筛选。

C.利用Cell ELISA法进行杂交瘤的1次筛选

产生目标抗体的杂交瘤的第一次筛选采用Cell ELISA法如下进行。将实施例1之A中制作的1×10⁷个细胞悬浮于10mL 0.5％BSA/2mM EDTA/PBS中，使用Cell ELISA用板(NUNC 249570 96V NW PS)向每孔中分别注入100μL。以2000rpm的转速离心2分钟以除去上清，之后向各孔中添加50μL杂交瘤培养上清，使之在室温下反应30分钟。进行2次清洗操作(0.5％BSA/2mM·EDTA/PBS)，向清洗后的孔中添加50μL稀释了10000倍的过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG抗体(MBL；Code330)，使之反应30分钟。进行3次清洗操作，之后添加显色溶液，测定OD 450nm-620nm，选择呈阳性反应的孔。

D.通过流式细胞术(FCM)分析来研究抗体的结合性

通过流式细胞术(FCM)分析来进行杂交瘤培养上清的分析。将实施例1之A中制作的细胞悬浮于0.5％BSA/2mM EDTA/PBS中，回收到离心管中(1×10⁵个细胞/样品)，之后添加各40μL的杂交瘤培养上清，在室温下使之反应30分钟。之后，向各管中分别添加1mL0.5％BSA/2mM·EDTA/PBS，以1200rpm的转速在4℃下离心3分钟后舍弃上清，重复此清洗操作2次。向清洗后的管中分别添加40μL稀释了100倍的FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体(Beckman coulter；IM0819)，在室温下使之反应30分钟。进行2次清洗操作，之后使用流式细胞仪FC500(Beckman coulter)分析杂交瘤培养上清中所含的抗体是否特异性识别人BST2D。在FCM分析中选择产生不与未表达人BST2D的293T细胞结合、但与表达人BST2D的293T细胞特异性结合的抗体的杂交瘤。通过有限稀释法克隆已选择的杂交瘤，获得产生小鼠抗人BST2抗体的杂交瘤#3LD、#4LD、#7LD、#9LD、#19LD。

实施例2 小鼠抗人BST2单克隆抗体的制作和特异性研究

A.杂交瘤的培养

用具有下述组成的、添加有5％FBS的RPMI培养基培养实施例1中得到的产生小鼠抗人BST2抗体的杂交瘤#3LD、#4LD、#7LD、#9LD、#19LD。培养温度为37℃，培养时间为96小时。

添加有5％FBS的RPMI培养基：

RPMI1640培养基(Sigma公司、商品目录号：R8758)

5％FBS

0.01M HEPES

1mM丙酮酸钠

2mM L-谷氨酰胺

100U/mL青霉素

100μg/mL链霉素

55μM 2-巯基乙醇

pH7.2～pH7.4

培养96小时后收集各杂交瘤的培养上清，通过离心除去细胞碎片，得到粗抗体液。

B.抗体的纯化

将A中得到的粗抗体液分别用蛋白A亲和柱(rProtein A SepharoseFF，Amershram Pharmacia公司、商品目录号：17-1279-01)进行纯化。纯化条件如下。按照柱所附带的说明书，使用下述组成的PBS(-)缓冲液作为吸附缓冲液、使用0.1M枸橼酸钠缓冲液(pH3)作为洗脱缓冲液，进行亲和纯化。向洗脱组分中添加1M Tris-HCl(pH8.0)，调整至pH7.2左右。使用透析膜(截断值为10000、PIERCE公司制)将调整的抗体溶液置换成PBS(-)，得到纯化小鼠抗人BST2单克隆抗体#3LD、#4 LD、#7 LD、#9 LD、#19 LD(以下简记作“小鼠#3LD抗体”、“小鼠#4LD抗体”等)。测定280nm的吸光度，以1mg/mL作为1.38OD，算出纯化抗体的浓度。

PBS(-)缓冲液：

0.2g/L磷酸二氢钾

0.2g/L氯化钾

8g/L氯化钠

1.15g/L无水磷酸氢二钠

C.抗体的特异性研究

C-1)靶细胞株(BST2D-CHO细胞株)的制作

使用Effectene转染试剂(QIAGEN公司)将带有人BST2D基因的表达载体导入CHO-K1细胞中，所述CHO-K1细胞在载体导入的前1 天事先按6×10⁵个细胞/皿接种在6cmφ皿中。进行800μg/mL Zeocin(invitrogen公司)处理，选择导入有载体的Zeocin耐性株。

导入的人BST2D表达载体：pCDNA3.1-hBST2D 2μg

之后，再使用细胞分选仪(BD FACSAria(Becton Dickinson公司))得到高度表达BST2D的细胞株(BST2D-CHO细胞株)。通过FCM分析确认选择的细胞株高度表达BST2D。除了在FCM中使用BDFACSCaliber(BD公司)以外，FCM分析操作按照实施例1之D来进行。分析用抗体使用下述抗体。

FCM分析用抗体：488-缀合大鼠抗人BST2-5C11抗体(人BST2-5C11抗体记载在WO2006/013923中)

C-2)靶细胞株(BST2H-CHO细胞株)的制作

除了导入人BST2H表达载体(pCDNA3.1-hBST2H)以外，进行与C-1)相同的操作，得到高度表达BST2H的细胞株(BST2H-CHO细胞株)。FCM分析用抗体使用下述抗体。

FCM分析用抗体：488-缀合大鼠抗人BST2-3D3抗体(人BST2-3D3抗体是保藏号为FERM BP-10339的杂交瘤产生的抗体，其记载在WO2006/013923中)

C-3)纯化小鼠抗人BST2单克隆抗体的结合特异性的研究

使用C-1)中得到的BST2D-CHO细胞株和C-2)中得到的BST2H-CHO细胞株，研究上述B中得到的5种纯化小鼠抗人BST2单克隆抗体的结合特异性。按照常规方法通过FCM分析来进行研究。由FCM分析结果确认：小鼠#3LD抗体、小鼠#4LD抗体、小鼠#9LD抗体与BST2D-CHO细胞结合，但不与BST2H-CHO细胞结合。另一方面，确认小鼠#7LD抗体、小鼠#19LD抗体既与BST2D-CHO细胞结合又与BST2H-CHO细胞结合。因此，在以下实验中，将小鼠#3LD抗体、小鼠#4LD抗体、小鼠#9LD抗体作为仅与D型的BST2结合的抗体(以下记作“抗人BST2(D+/H-)抗体”)来处理，将小鼠#7LD抗体、小鼠#19LD抗体作为与D型、H型的BST2均结合的抗体(以下记作“抗人BST2(D+/H+)抗体”)来处理。小鼠#4LD抗体和小鼠#19LD抗体的FCM分析结果见图2。

C-4)小鼠抗人HM1.24抗体的反应性的确认

对于作为小鼠抗人BST2抗体的HM1.24抗体(中外制药公司制)，与C-3)的方法一样通过FCM分析来确认其结合特异性。FCM分析结果和C-3)的结果均见图2。确认小鼠抗人HM1.24抗体也是与BST2D-CHO细胞株和BST2H-CHO细胞株两者结合的抗体。

实施例3 抗人BST2(D+/H-)抗体的CDC活性和ADCC活性的测定

A.抗体

使用实施例2中得到的小鼠#4LD抗体，如下测定CDC活性。

B.CDC活性的测定

B-1)靶细胞株

使用下述细胞作为靶细胞株。

·BST2D-CHO细胞株：与实施例2之C-1)同样来制作

·BST2H-CHO细胞株：与实施例2之C-2)同样来制作

来自人骨髓瘤的RPMI8226细胞株

B-2)靶细胞与抗人BST2(D+/H-)抗体的反应

使用5mM EDTA/PBS溶液分别回收上述B-1)所述的BST2D-CHO细胞和BST2H-CHO细胞，之后悬浮于下述组成的CDC培养基中，使达到4×10⁵个细胞/mL。另外，将来自人骨髓瘤的RPMI8226细胞也悬浮于下述组成的CDC培养基中，使达到4×10⁵个细胞/mL。向U底96孔板的每孔中分别注入50μL上述悬浮液。

CDC培养基：

RPMI1640

0.1％BSA

100单位/mL青霉素

100μg/mL链霉素

10mM Hepes(pH7.6)

2mM L-谷氨酰胺

向其中加入50μL用CDC培养基调整的抗BST2(D+/H-)抗体溶液(小鼠#4LD抗体溶液)进行混合，使抗体的最终浓度达到0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL和10μg/mL。再加入50μL下述组成的含有补体的CDC培养基进行混合，使最终补体浓度达到6％，之后在37℃下培养2小时。此时，同时制成用小鼠IgG2a代替抗BST2(D+/H-)抗体的溶液，将其用作对照。还使用抗BST(D+/H+)抗体、即HM1.24抗体作为小鼠#4LD抗体的比较对象，同时进行CDC活性测定。

含有补体的CDC培养基：

1mL幼龄兔补体(CEDARLANE公司制、商品目录号：CL3441)

CDC培养基(参照上述)

之后，将装有悬浮液的U底96孔板离心(离心条件：250G、4分钟)，边留意不混入细胞边回收培养上清。利用CytoTox96(注册商标)Assay(PROMEGA公司)测定该培养上清中的LDH量，作为“由于补体活性而自靶细胞中漏出的LDH量(Experimental Sample，试样)”。

为了求出CDC活性，还准备下述参数。

·自靶细胞中自然释放的LDH量(Target Cell Spontaneous LDHRelease；靶细胞自然LDH释放量)：如下制备，即只培养与试样相同容量的靶细胞。

·靶细胞所释放的最大LDH量(Target Cell Maximum LDH Release；靶细胞最大LDH释放量)：如下制备，即只培养与试样相同容量的靶细胞，在回收上清的60分钟前添加试剂盒所附带的TritonX-100溶液，使最终浓度达到0.8％。

·液量校正用对照(体积校正对照)：如下制备，即向与试样相同容量的培养液中加入与制备靶细胞所释放的最大LDH量时所添加的相同量的TritonX-100。需要说明的是，在用于计算CDC活性(％)的下式中，将“体积校正对照”记作“体积对照”。

·培养液的背景对照(培养基背景)：如下制备，即向与试样相同容量的培养液中加入含有补体的CDC培养基来制备与试样相同容量的溶液。

从Target Maximum和Target Spontaneous的吸光度中减去与试样相同容量的培养液，从Experimental Sample的吸光度中减去向培养液中加入含有补体的CDC培养基使达到与试样相同容量的溶液，进行校正。

根据下式由测定的各LDH量算出CDC活性。

式1

结果见图3。小鼠#4LD抗体(抗人BST2(D+/H-)抗体)对BST2(H)-CHO细胞几乎不显示CDC活性，但对BST2(D)-CHO细胞显示出强CDC活性。

C.ADCC活性的测定

C-1)靶细胞株和效应细胞

使用下述细胞作为靶细胞株。

·BST2D-CHO细胞株：与实施例2之C-1)同样来制作

·来自人骨髓瘤的RPMI8226株

使用下述细胞作为效应细胞。

·人末梢单核细胞：使用通过Ficoll法从人末梢血中分离的末梢单核细胞。

C-2)靶细胞、抗人BST2(D)抗体和效应细胞的反应

使用5mM EDTA/PBS溶液分别回收上述B-1)记载的BST2D-CHO细胞和来自人骨髓瘤的RPMI8226细胞，之后悬浮于下述组成的、添加有10％FBS的RPMI培养基中，使达到4×10⁵个细胞/mL。向U底96孔板的每孔中分别注入50μL上述悬浮液。

向其中加入50μL用添加有10％FBS的RPMI培养基调整的抗BST2抗体溶液进行混合，使抗体的最终浓度达到10μg/mL，在4℃下培养30分钟。之后加入50μL制备成效应细胞为靶细胞的25、50、100倍的细胞混合液进行混合，之后将该板离心(离心条件：250G、4分钟)，使靶细胞与效应细胞接近。之后在37℃下培养4小时。作为抗BST2抗体，使用小鼠#4LD抗体(抗人BST2(D+/H-)抗体)、嵌合#4LD抗体(嵌合抗人BST2(D+/H-)抗体，参照实施例5、6)、HM1.24小鼠抗体、HM1.24人源化抗体(专利文献3：WO2002/064159、专利文献4：WO2005/034994)。此时，同时制成使用小鼠IgG2a来代替抗BST2抗体的样品，将其用作对照。

之后，将悬浮液离心(离心条件：250G、4分钟)，边留意不使细胞混入边回收上清。按照常规方法测定该上清中的LDH，作为“因细胞毒性而自靶细胞中漏出的LDH量(Experimental Sample，试样)”。

为了计算ADCC活性，还制备与B-2)相同的下述参数。

·自效应细胞中自然释放的LDH量(Effector Cell Spontaneous LDHRelease；效应细胞自然LDH释放量)：如下制备，即只培养与试样相同容量的效应细胞。

·液量校正用对照(体积校正对照)：如下制备，即向与试样相同容量的培养液中加入与制备靶细胞所释放的最大LDH量时所添加的相同量的TritonX-100。需要说明的是，在用于计算ADCC活性(％)的下式中，将“体积校正对照”记作“体积对照”。

·培养液的背景对照(培养基背景)：如下制备，即加入与试样相同容量的培养液。

从Target Spontaneous、Target Maximum、Effector Spontaneous和Experimental Sample的吸光度中减去培养液的背景对照，进行校正。

由下式算出ADCC活性。

式2

结果见图4。小鼠#4LD抗体对BST2D-CHO细胞显示出强ADCC活性，其强度与HM1.24人源化抗体几乎相同。另一方面，可知：小鼠#4LD抗体对PRMI8266细胞几乎不显示ADCC活性，而嵌合#4LD抗体对PRMI8266细胞显示出与HM1.24人源化抗体相同程度的强ADCC活性。

比较例1 抗人BST2(D+/H+)抗体的CDC活性

使用小鼠抗人HM1.24抗体，进行与实施例3相同的操作，来测定CDC活性。

其结果与实施例3的结果均见图3。小鼠抗人HM1.24抗体(抗人BST2(D+/H+)抗体)对BST2(H)-CHO细胞和BST2(D)-CHO细胞均显示出相同程度的强CDC活性。另一方面，虽然小鼠抗人BST2 #4LD抗体(抗人BST2(D+/H-)对BST2(D)-CHO细胞显示出特异性的CDC活性，但对BST2(H)-CHO细胞没有显示出杀伤活性。

实施例4 抗人BST2(D+/H-)抗体与各种机体组织的结合性

A.与人和食蟹猴的末梢血单核细胞组分(以下记作“PBMC”)的结合性

用PE-标记山羊抗小鼠抗体标记小鼠#4LD抗体，并将PBMC染色，按照常规方法通过流式细胞术法进行分析。所用试剂、装置如下。

流式细胞术(FACSCalibur etc)[Becton Dickinson]

二次抗体R-PE-缀合山羊抗小鼠免疫球蛋白特异性多克隆抗体

(Multiple Adsorption)；(BD Biosciences：550589)

HISTOPAQUE-1077(SIGMA H8889)

FcR封闭试剂(Milteny Biotec 130-059-901)

RPMI1640培养基5％FCS/青霉素-链霉素/L-谷氨酰胺

ACK裂解液(0.15M NH₄Cl、10mM KHCO₃、0.1mM Na₂EDTA、pH7.2～7.4)

将血液用RPMI1640(无FCS)稀释，添加在HISTOPAQUE-1077上，之后以1800rpm的转速离心20分钟。回收中间层，加入RPMI1640培养基，以1800rpm的转速离心10分钟。吸取上清，向细胞团块中加入1mL ACK裂解液将其悬浮，再在冰上静置3分钟，之后加入RPMI1640培养基，以1200rpm的转速离心5分钟。吸取上清，以细胞团块作为PBMC，向其中加入RPMI1640培养基进行悬浮，计算细胞数，以1200rpm的转速离心5分钟。用20％FCR封闭试剂/1％FCS/PBS进行调整使PBMC达到5×10⁷个细胞/mL，向U底96孔板的每孔中加入10μL(5×10⁵个细胞)，再向每孔中加入25μL 1μg/mL的小鼠#4LD抗体，在4℃下避光静置15分钟，之后加入150μL1％FCS/PBS，以2000rpm的转速离心2分钟。舍弃上清后加入1％FCS/PBS，以2000rpm的转速离心2分钟，舍弃上清。分别加入20μL二次抗体，在4℃下避光静置15分钟，之后加入150μL1％FCS/PBS，以2000rpm的转速离心2分钟，舍弃上清。加入150μL1％FCS/PBS，以2000rpm的转速离心2分钟，舍弃上清。将团块悬浮于150μL 1％FCS/PBS溶液中，之后移入FACS管中，再加入150μL1％FCS/PBS，用FACSCalibur进行分析。再使用FlowJo软件求出PBMC的染色率(％)，结果见表1。

B.对人脾脏组织的冷冻切片进行组织染色

用高分子试剂(DAKO K5007)标记小鼠#4LD抗体，按照常规方法将人脾脏组织的冷冻切片染色。组织的显微镜照片见图5。小鼠#4LD抗体几乎不与人脾脏组织结合，而比较例的小鼠#19LD抗体与人脾脏组织充分结合。由此表明：与#19LD抗体相比，小鼠#4LD抗体的特异性高。

C.与来自骨髓瘤的RPMI8226细胞的结合性

使用小鼠#4LD、小鼠#19LD、HM1.24抗体，以0.01、0.1、1、10μg/mL的浓度对RPMI8226细胞进行染色，使用Prism 4软件，由此时的染色率算出Kd值(平衡解离常数)。

所用试剂、装置如下。

Prism 4软件[GraphPad Software，Inc.]

·FlowJo软件[Tree Star，Inc.]

·流式细胞术(FACSCalibur etc)[Becton Dickinson]

·二次抗体(小鼠Ig-FITC[异硫氰酸荧光素-缀合山羊抗小鼠免疫球蛋白特异性多克隆抗体(Multiple Adsorption)；BD Biosciences：554001]等)

回收细胞，计算细胞数，将细胞悬浮于1％FCS/PBS中，使细胞数达到1×10⁶个细胞/mL。向96孔v底板的每孔中分别加入100μL(1×10⁵个细胞/孔)，以2000rpm的转速离心2分钟，舍弃上清。分别加入25μL 0.01、0.1、1、10μg/mL的小鼠#4LD、小鼠#19LD、HM1.24抗体，在4℃下避光静置15分钟，之后加入150μL 1％FCS/PBS，以2000rpm的转速离心2分钟，舍弃上清。加入1％FCS/PBS，以2000rpm的转速离心2分钟，舍弃上清。分别加入20μL二次抗体，在4℃下避光静置15分钟，之后加入150μL 1％FCS/PBS，以2000rpm的转速离心2分钟，舍弃上清。加入150μL 1％FCS/PBS，以2000rpm的转速离心2分钟，舍弃上清。将团块悬浮于150μL 1％FCS/PBS溶液中，之后移入FACS管中，再用150μL 1％FCS/PBS清洗孔，之后移至管中，用FACSCalibur进行分析。再使用FlowJo软件求出染色率的比例。此外，使用Prism 4软件，由此时的染色率算出Kd值。其结果见表2。与HM1.24抗体和小鼠#19LD抗体相比，小鼠#4LD抗体对RPMI8226细胞显示出高的结合亲和性。

比较例2 抗人BST2(D+/H+)抗体与各种机体组织的结合性

使用小鼠#19LD抗体或HM1.24抗体代替小鼠#4LD抗体，进行与实施例4相同的操作。其结果与实施例4的结果均见表1、表2和图5。

[表1]人和食蟹猴的PBMC与抗人BST2抗体的结合性

[表2]与来自人骨髓瘤的RPMI8226细胞的结合能力(Kd值)

由结果确认：作为抗人BST2(D+/H-)抗体的小鼠#4LD抗体与PBMC和HUVEC等在本发明中不作为治疗靶向的细胞的结合非常弱，但与骨髓瘤细胞这种作为治疗靶向的细胞的结合强。因此，当使用抗人BST2(D+/H-)抗体作为抗人BST2抗体时，可以防止给药后抗体血中浓度的降低，推测可以向治疗的靶组织供应更高浓度的抗体。

实施例5 嵌合抗BST2(D+/H-)抗体(嵌合#4LD抗体)的制作

A.确认恒定区的同种型

使用市售的小鼠单克隆抗体同种型试剂盒(Serotec Product公司、商品目录号：MMT1)，确认杂交瘤培养上清所产生的小鼠#4LD抗体恒定区的同种型。重链恒定区为Igγ2a，轻链恒定区为Igκ。

B.编码小鼠#4LD抗体可变区的cDNA的克隆

B-1)使用的杂交瘤

使用产生小鼠抗人BST2D抗体的杂交瘤#4LD作为杂交瘤。

B-2)总RNA的分离

使用市售的试剂盒“RNeasy Mini试剂盒”(Qiagen公司、商品目录号：74106)，按照试剂盒所附带的说明书自上述A-1)所示的杂交瘤中分离总RNA。从1×10⁷个杂交瘤中均得到了约200μg的总RNA。

B-3)编码小鼠重链可变区的cDNA的扩增和片段化

使用5μg B-2)中分离的总RNA，按照5’RACE法扩增编码小鼠重链可变区的cDNA。扩增中使用市售试剂盒“cDNA ENDs快速扩增用5’RACE系统，第2.0版试剂盒”(Invitrogen公司、商品目录号：18374-058)。细节如下。首先，利用逆转录酶由A-2)中得到的总RNA合成第1链cDNA。此时，反义引物(GSP1)使用下述引物(SEQ ID NO：14)。接下来，用RNaseH分解总RNA，通过1.5％低熔点琼脂糖法纯化残留作为单链的第1链cDNA。再使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)在第1链cDNA的3’-末端添加核苷酸同聚物dC。然后，使用在3’-末端具有与dC(锚定序列)互补的核苷酸聚合物的锚定引物(SEQ IDNO：16)和下述反义引物(GSP2)(SEQ ID NO：15)，通过PCR法扩增cDNA。再以所得的PCR产物为模板，使用AUAP引物(SEQ ID NO：17)和反义引物(GSP2)(SEQ ID NO：15)，通过Nested PCR法扩增cDNA。再通过1.5％低熔点琼脂糖法纯化该PCR产物。

Mu IgG2aVH5RACE-GSP1(SEQ ID NO：14)

5’TCC AGA GTT CCA GGT CAA GGT CAC 3’(24-mer)

Mu IgG2aVH5RACE-GSP2(SEQ ID NO：15)

5’GCC AGT GGA TAG ACC GAT GG 3’(20-mer)

5’RACE用锚定引物(SEQ ID NO：16)

5’-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGGIIG-3’(36-mer)

5’RACE用AUAP引物(SEQ ID NO：17)

5’-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3’(20-mer)

B-4)编码小鼠轻链可变区的cDNA的扩增和片段化

进行与B-3)相同的操作，由在B-2)中分离的总RNA扩增编码小鼠轻链可变区的cDNA。此时，反义引物使用下述引物。通过1.5％低熔点琼脂糖法纯化所得的PCR产物。

Mu IgVL5RACE-GSP1(SEQ ID NO：18)

5’TTC ACT GCC ATC AAT CTT CCA CTT 3’(24-mer)

Mu IgVL5RACE-GSP2(SEQ ID NO：19)

5’GAT GGA TAC AGT TGG TGC AGC 3’(21-mer)

B-5)cDNA的核苷酸序列的确认和CDR区的确定

使用市售试剂盒“Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒”(Invitrogen公司、商品目录号：1325137)，按照试剂盒所附带的说明书将B-3)中得到的重链可变区和B-4)中得到的轻链可变区的cDNA片段分别克隆到pCR4Blunt-TOPO载体中，之后将其导入大肠杆菌感受态细胞中，得到大肠杆菌转化体。由该转化体得到上述质粒，使用自动DNA序列分析仪“PCR-based ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer”(AppliedBiosystems公司)来确认质粒中的cDNA核苷酸序列。由于在互补性决定区(以下记作“CDR区”)周围发生移码、无义突变等，所以除去失活RNA转录物，提取序列正确的转录物。再进行该质粒中所含的cDNA核苷酸序列与Kabat数据库的同源性检索，确定各可变区内的CDR区和可变区的序列。

B-3)中得到的小鼠#4LD抗体重链可变区的核酸序列见SEQ IDNO：10、氨基酸序列见SEQ ID NO：11。小鼠#4LD抗体重链可变区内的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别见SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6。

B-4)中得到的小鼠#4LD抗体的轻链可变区的核酸序列见SEQ IDNO：12、氨基酸序列见SEQ ID NO：13。小鼠#4LD抗体轻链可变区内的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别见SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9。

C.编码人IgG恒定区的cDNA的克隆

从人干扰素产生细胞(Interferon Producing cells；IPC)的cDNA文库中选择人IgG1重链恒定区和人Igκ轻链恒定区，使用市售试剂盒“Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒”(Invitrogen公司、商品目录号：1325137)，按照试剂盒所附带的说明书将它们分别克隆到pCR4Blunt-TOPO载体中，再导入大肠杆菌感受态细胞中，得到大肠杆菌转化体。由该转化体得到上述质粒，使用自动DNA序列分析仪“PCR-based ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer”(Applied Biosystems公司)确认质粒中的cDNA核苷酸序列。

D.可变区与恒定区的连接和克隆

B-5)中得到的小鼠#4LD抗体重链可变区和C中得到的人IgG重链恒定区具有DNA序列重叠的区。于是，使用该区通过重叠序列延伸法得到双链DNA。详细的方法如下。

D-1)制备编码嵌合#4LD抗体重链的cDNA

将B-5)中得到的“具有编码小鼠#4LD抗体重链可变区的cDNA的质粒”用限制酶NotI和XbaI消化，再通过1.5％琼脂糖凝胶法进行纯化。将其溶于下述组成的TE缓冲液中，使分别达到100pmol/μL，作为编码小鼠#4LD抗体重链可变区的cDNA片段的溶液。

TE缓冲液：

10mM Tris-HCl

1mM EDTA

pH7.5～8.0

此外，对C中得到的“具有编码人IgG重链恒定区的cDNA的质粒”也进行同样的处理，制成100pmol/μL的溶液。接下来，将两者混合，首先在70℃下保持10分钟，之后在37℃下保持5分钟，从而在重叠区形成氢键。之后，通过PCR法扩增cDNA，然后将得到的cDNA用限制酶NotI和XbaI进行处理，之后通过1.5％低熔点琼脂糖法进行纯化。

为了制作嵌合#4LD抗体重链和轻链cDNA表达用载体，PCR扩增中使用的引物序列分别如下。

嵌合#4LD抗体重链用PCR引物

4LD-VH NotI-1F(SEQ ID NO：29)

5’AAA GCG GCC GCG CCG CCA CCA TGA AAG TGT TGA GTCTGT TGT ACC TGT TG 3’(50-mer)

4LD-VH XbaI-2R(SEQ ID NO：30)

5’CTA GTC TAG ATG AGG AGA CTG TGA GAG TGG TGC CTTGGC 3’(39-mer)

4LD-VH-3F(SEQ ID NO：31)

5’GTC TCC TCA GCC TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC 3’(33-mer)

4LD-VH-4R(SEQ ID NO：32)

5’TGA TCA TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA GAG GCT CTT C3’(37-mer)

嵌合#4LD抗体轻链用PCR引物

4LD-VL NotI-1F(SEQ ID NO：33)

5’AAA GCG GCC GCG CCG CCA CCA TGG AGA CAG ACA CACTCC TGC 3’(42-mer)

4LD-VL XbaI-2R(SEQ ID NO：34)

5’CTA GTC TAG ACG TTT TAT TTC CAG CTT GGT CCC CCC TCCG 3’(40-mer)

4LD-VL-3F(SEQ ID NO：35)

5’AAA TAA AAC GAA CTG TGG CTG CAC CAT CTG TCT TCATCT TCC C 3’(43-mer)

4LD-VL-4R(SEQ ID NO：36)

5’TGA TCA CTA GCA CTC TCC CCT GTT GAA GCT CTT TGTGAC 3’(39-mer)

D-2)编码嵌合#4LD抗体轻链的cDNA的制备

对B-5)中得到的小鼠#4LD抗体轻链可变区和C中得到的人Igκ轻链恒定区也进行与D-1)相同的操作，得到编码嵌合#4LD抗体轻链的cDNA。

D-3)克隆

以NotI和XbaI作为克隆位点，将D-1)中得到的cDNA克隆到质粒载体pcDNA3.1-博来霉素(Invitrogen公司)中，作为嵌合#4LD抗体重链表达载体。另外，以NotI和XbaI作为克隆位点，将D-2)中得到的cDNA克隆到质粒载体pcDNA3.1-潮霉素(Invitrogen公司)中，作为嵌合#4LD抗体轻链表达载体。各载体的名称如下。

嵌合#4LD抗体重链表达用载体：pcDNA-4LDVH

嵌合#4LD抗体轻链表达用载体：pcDNA-4LDVL

E.嵌合#4LD抗体的表达

E-1)一过性转化

使用effectine转染试剂盒(Qiagen公司、商品目录号：301427)，将1μg D-3)中得到的嵌合#4LD抗体重链表达载体(pcDNA-4LDVH)和1μg嵌合#4LD抗体轻链表达载体(pcDNA-4LDVL)共转染到293T细胞中。之后，使用下述组成的、添加有2％Low IgG FBS的DMEM培养基在37℃下培养。

添加有2％Low IgG FBS的DMEM培养基：

DMEM培养基(Sigma公司、商品目录号：D5796)

2％Low IgG FBS(HyClone公司、商品目录号：SH30151.03)

2mM L-谷氨酰胺

100U/mL青霉素

100μg/mL链霉素

pH7.2～pH7.4

导入载体后培养96小时，收集培养上清，通过离心除去细胞碎片，得到粗抗体液。

F.抗体的纯化

将E-1)中得到的粗抗体液分别用蛋白A亲和柱(rProtein ASepharose FF，Amershram Pharmacia公司、商品目录号：17-1279-01)进行纯化。柱纯化条件如下。按照柱所附带的说明书，使用下述组成的PBS(-)缓冲液作为吸附缓冲液、使用0.1M枸橼酸钠缓冲液(pH3)作为洗脱缓冲液，对抗体进行亲和纯化。向洗脱组分中添加1MTris-HCl(pH8.0)，调节至pH7.2左右。使用透析膜(截断值为10000、PIERCE公司制)将调整的抗体溶液置换成PBS(-)，得到纯化抗嵌合#4LD抗体。

测定280nm的吸光度，通过将1mg/mL转化成1.38OD，算出纯化抗体的浓度。

PBS(-)缓冲液：

0.2g/L磷酸二氢钾

0.2g/L氯化钾

8g/L氯化钠

1.15g/L无水磷酸氢二钠

制成的嵌合#4LD抗体的重链和轻链的核苷酸序列与氨基酸序列分别见下述SEQ ID NO。

重链轻链

SEQ ID NO：25(核苷酸序列) SEQ ID NO：27(核苷酸序列)

SEQ ID NO：26(氨基酸序列) SEQ ID NO：28(氨基酸序列)

实施例6 抗人BST2(D+)抗体的表位的确定

A.人BST2蛋白的表达载体的构建和重组人BST2蛋白的制作

以人BST2D的全长序列(SEQ ID NO：2)中胞外结构域47位-180位的氨基酸序列为对象，通过PCR法合成编码从其N末端侧或C末端侧各删除1个氨基酸残基的氨基酸序列的cDNA。目标氨基酸序列的设计方法如下。

N末端侧分析用氨基酸序列的设计：

(47)---------------------------------(180)

(47)--------------------------------(179)

(47)-------------------------------(178)

：

(47)---------------(140)

C末端侧分析用氨基酸序列的设计：

(47)---------------------------------(180)

(48)--------------------------------(180)

(49)-------------------------------(180)

：

(140)----------------(180)

在PCR法中，使用编码人BST2D的cDNA的核苷酸序列(SEQ IDNO：1)的、在编码目标氨基酸序列的区的两端退火的引物。向各引物中添加EcoR I和XhoI位点。以整合有全长人BST2的cDNA的载体为模板，利用东洋纺公司制的KOD DNA聚合酶进行PCR反应。将得到的PCR产物用EcoR I和Xho I(TaKaRa公司制)切断，通过琼脂糖凝胶进行电泳，之后用Qiagen公司制的MinElute进行纯化。将该纯化的PCR产物克隆到带有His tag的pET32表达载体(Novagen公司制)的EcoR I/Xho I位点中。将这些表达载体导入大肠杆菌(BL21(DE3)) 中以进行转化，利用Novagen公司的Ovemight表达系统由各自的大肠杆菌制成N末端添加有His tag的各人BST2蛋白。

B.抗体

使用实施例2中得到的小鼠#4LD抗体，利用蛋白质印迹法如下确定表位。

C.蛋白质印迹法

用样品缓冲液溶解带有His tag的各人BST2蛋白(A中合成的蛋白)，在70℃下加热10分钟。使用4-20％梯度SDS-PAGE凝胶(Invitrogen公司制)分离该溶解的蛋白，转录到PVDF膜(Millipore公司制)上。之后，用BSA封闭该膜，使其在1μg/mL 4LD抗体或稀释2000倍的抗His tag抗体(Novagen公司制)中反应。使该膜与用HRP标记的抗小鼠IgG抗体(Jackson公司制)反应后，使用ECL检测试剂(GE Healthcare公司制)使其化学发光，使用富士Film公司制的LAS-1000检测带有His tag的人BST2蛋白。

使用灭菌蒸馏水制备样品缓冲液：

NuPAGE LDS样品缓冲液(4X)[Invitrogen公司制]

NuPAGE还原试剂(10X)[Invitrogen公司制]。

结果见图6。各泳道的重组人BST2蛋白的氨基酸序列如下。下述显示氨基酸位置的数字是以SEQ ID NO：2中N末端的M为1时的数值。在N末端侧(上左)的泳道3-9和C末端侧(上右)的泳道4-10中，利用#4LD抗体检测到信号的泳道以“+”表示，没有检测到信号的泳道以“-”表示。

N末端侧

1：K(47)-Q(180) 2：K(47)-D(159) 10：K(47)-E(140)

+3：K(47)----------P(155)

+4：K(47)------D(150)

+5：K(47)-----A(149)

+6：K(47)----I(148)

+7：K(47)---R(147)

-8：K(47)--V(146)

-9：K(47)-S(145)

C末端侧

1：M(96)-Q(180) 2：L(116)-Q(180) 3：Q(128)-Q(180)

+4： S(131)-Q(180)

+5： A(132)--Q(180)

+6： E(133)---Q(180)

-7： V(134)----Q(180)

-8： E(135)-----Q(180)

-9： R(136)------Q(180)

-10：L(137)-------Q(180)

由图6可知：虽然检测到4LD抗体与K(47)---R(147)/N末端侧的泳道7结合，但没有检测到其与K(47)--V(146)/N末端侧的泳道8结合。由此确认：4LD抗体识别抗原时147位的R是必需的。另一方面，由C末端侧的结果(图6上右)可知：虽然4LD抗体与E(133)---Q(180)/泳道6结合，但检测不到其与V(134)----Q(180)结合。由此确认：4LD抗体识别抗原时133位的E是必需的。已经明确：4LD的表位是EVERLRRENQVLSVR(SEQ ID NO：37)的15个氨基酸。SEQ ID NO：37的氨基酸序列相当于BST2D的全长氨基酸序列(SEQ ID NO：2)中的133-147位。如图1所示，该表位由人BST2D特异性氨基酸序列构成。

实施例7 体内药效试验

(1)细胞株

使用来自人骨髓瘤的细胞株RPMI8226细胞(ATCC)和人B细胞株ARH77细胞(ATCC)。细胞在含有10％FBS(BIONET公司制)的RPMI1640培养基(SIGMA公司制)中维持传代。

(2)RPMI8226人癌细胞株移植小鼠模型的制作

将细胞用传代用培养基调整成5×10⁷个细胞/mL。将100μL(5×10⁶ 个细胞/小鼠)该细胞悬浮液移植到SCID小鼠(雄、5周龄)(日本CLEA)的腹部皮下，所述SCID小鼠在细胞移植的前1天预先向其腹腔内给予了100μL抗asialo GM1抗体(和光纯药公司制、1小瓶用5mL溶解)。通过下式算出肿瘤体积，当肿瘤体积达到140～240mm³时模型成立。

肿瘤体积＝长径×短径×短径/2

根据肿瘤体积进行分组。

(3)ARH77人癌细胞株移植小鼠模型的制作

将细胞用传代用培养基调整成2.5×10⁷个细胞/mL。从SCID小鼠(雄、5周龄)(日本CLEA)的尾静脉向其体内移植200μL(5×10⁶个细胞/小鼠)该细胞悬浮液，所述SCID小鼠在细胞移植前1天预先向其腹腔内给予了100μL抗asialo GM1抗体(和光纯药公司制、1小瓶用5mL溶解)。在肿瘤移植后的第10天，通过ELISA测定小鼠血清中ARH77细胞产生的人IgG(M蛋白)量(参照血清M蛋白量的测定项)，由于检测到了M蛋白，所以模型成立。根据血清M蛋白量进行分组。

(4)血清M蛋白量的测定

从背中足静脉采血，分离血清，小鼠血清中M蛋白量的测定通过使用抗人IgG抗体的夹层ELISA来进行。即，将固定有抗人IgG抗体(Biosource)的96孔板(Nunc)用稀释缓冲液(D.B.)进行封闭处理，之后添加用D.B.适当稀释的血清样品。D.B的组成如下。

稀释缓冲液：含1mmol/L MgCl₂、

150mmol/L NaCl、

0.02％(w/v)NaN₃、

0.05％(vol)Tween20、

1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的

50mmol/L Tris-HCl缓冲液pH8.1

另外，作为用于计算抗体浓度的标准品，同样添加从1000ng/mL 起以2倍系列进行11步稀释的人IgG(ICN/cappel)。使其与碱性磷酸酶标记抗人IgG抗体(Biosource)反应后，以Sigma104(Sigma-Aldrich)作为底物使其显色，利用Absorbance Reader(吸光度读出机)测定405nm的吸光度(参比波长为635nm)。由标准人IgG的标准曲线算出血清样品中的人IgG(M蛋白)量。需要说明的是，此ELISA的检测限根据标准曲线判断为1ng/mL。

(5)给药抗体的制备

在给药当天使用已过滤灭菌的PBS(-)将4LD抗体制备成0.5mg/mL(5mg/kg给药组)、0.15mg/mL(1.5mg/kg给药组)、0.1mg/mL(1mg/kg给药组)和0.05mg/mL(0.5mg/kg给药组)，作为给药试样。

(6)抗体给予

对于(2)中制作的RPMI8226细胞移植小鼠模型，从移植后第27天起每周2次、连续三周以10mL/kg从尾静脉给予上述(5)中制备的给药试样(给药量：5mg/kg、1.5mg/kg、0.5mg/kg)。作为阴性对照，同样每周2次、连续三周以10mL/kg从尾静脉给予PBS(-)(溶媒)。每组6只进行试验。此外，对于(3)中制作的ARH77细胞移植小鼠模型，从移植后第10天起，每周1次、连续三周以10mL/kg从尾静脉给予上述(5)中制备的给药试样(给药量：5mg/kg、0.5mg/kg、0.05mg/kg)。作为阴性对照，同样每周1次、连续三周以10mL/kg从尾静脉给予PBS(-)(溶媒)。每组5只进行试验。

(7)抗肿瘤效果的评价

根据肿瘤体积随时间的变化(图7)来评价4LD抗体在RPMI8226细胞移植小鼠模型中的抗肿瘤效果。由结果可知：与溶媒给药组相比，在4LD抗体给药组中确认到肿瘤的增殖抑制。另外，在小鼠存活期间(图8)评价4LD抗体在ARH77细胞移植小鼠模型中的抗肿瘤效果。由结果可知：与溶媒给药组相比，确认在4LD抗体给药组中小鼠存活时间延长。

以上研究显示了4LD抗体所具有的对人骨髓瘤细胞移植小鼠模型的抗肿瘤效果。

产业实用性

根据本发明，提供在人BST2抗原的各种剪接变体中特异性识别BST2D的抗体。与现有HM1.24抗体相比，对BST2D特异性高的本发明的抗BST2抗体可用于治疗或诊断骨髓瘤等表达BST2D的组织和细胞。例如，在骨髓瘤的治疗中，与在免疫学上不识别BST2H和BST2D的抗体相比，本发明的抗体在血中以更长的期间维持抗体的血中浓度。因此，可以以更低的给药量达到治疗效果。或者，本发明的抗体可以用作能够特异性检测骨髓瘤等表达BST2D的细胞的诊断药。特别是在体内骨髓瘤的图像诊断中，在免疫学上识别BST2分子的其他变体的本发明的抗体作为提供背景噪音低、病灶特异性更高的图像的诊断工具是有用的。

序列表

<110>SBI生物技术有限公司

中外制药株式会社

<120>抗BST2抗体

<130>G2-A0701P

<150>JP 2007-269470

<151>2007-10-16

<160>37

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>866

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>CDS

<222>(4)..(546)

<400>1

tgg atg gca tct act tcg tat gac tat tgc aga gtg ccc atg gaa gac 48

Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys Arg Val Pro Met Glu Asp

1 5 10 15

ggg gat aag cgc tgt aag ctt ctg ctg ggg ata gga att ctg gtg ctc 96

Gly Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly Ile Gly Ile Leu Val Leu

20 25 30

ctg atc atc gtg att ctg ggg gtg ccc ttg att atc ttc acc atc aag 144

Leu Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu Ile Ile Phe Thr Ile Lys

35 40 45

gcc aac agc gag gcc tgc cgg gac ggc ctt cgg gca gtg atg gag tgt 192

Ala Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala Val Met Glu Cys

50 55 60

cgc aat gtc acc cat ctc ctg caa caa gag ctg acc gag gcc cag aag 240

Arg Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu Leu Thr Glu Ala Gln Lys

65 70 75

ggc ttt cag gat gtg gag gcc cag gcc gcc acc tgc aac cac act gtg 288

Gly Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val

80 85 90 95

atg gcc cta atg gct tcc ctg gat gca gag aag gcc caa gga caa aag 336

Met Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu Lys Ala Gln Gly Gln Lys

100 105 110

aaa gtg gag gag ctt gag gga gag atc act aca tta aac cat aag ctt 384

Lys Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr Thr Leu Asn His Lys Leu

115 120 125

cag gac gcg tct gca gag gtg gag cga ctg aga aga gaa aac cag gtc 432

Gln Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Arg Glu Asn Gln Val

130 135 140

tta agc gtg aga atc gcg gac aag aag tac tac ccc agc tcc cag gac 480

Leu Ser Val Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr Tyr Pro Ser Ser Gln Asp

145 150 155

tcc agc tcc gct gcg gcg ccc cag ctg ctg att gtg ctg ctg ggc ctc 528

Ser Ser Ser Ala Ala Ala Pro Gln Leu Leu Ile Val Leu Leu Gly Leu

160 165 170 175

agc gct ctg ctg cag tga gatcccaggaagctggcaca tcttggaagg 576

Ser Ala Leu Leu Gln

180

tccgtcctgc tcggcttttc gcttgaacat tcccttgatc tcatcagttc tgagcgggtc 636

atggggcaac acggttagcg gggagagcac ggggtagccg gagaagggcc tctggagcag 696

gtctggaggg gccatggggc agtcctgggt gtggggacac agtcgggttg acccagggct 756

gtctccctcc agagcctccc tccggacaat gagtcccccc tcttgtctcc caccctgaga 816

ttgggcatgg ggtgcggtgt ggggggcatg tgctgcctgt tgttatgggt 866

<210>2

<211>180

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys Arg Val Pro Met Glu Asp Gly

1 5 10 15

Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly Ile Gly Ile Leu Val Leu Leu

20 25 30

Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu Ile Ile Phe Thr Ile Lys Ala

35 40 45

Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala Val Met Glu Cys Arg

50 55 60

Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu Leu Thr Glu Ala Gln Lys Gly

65 70 75 80

Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val Met

85 90 95

Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu Lys Ala Gln Gly Gln Lys Lys

100 105 110

Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr Thr Leu Asn His Lys Leu Gln

115 120 125

Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Arg Glu Asn Gln Val Leu

130 135 140

Ser Val Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr Tyr Pro Ser Ser Gln Asp Ser

145 150 155 160

Ser Ser Ala Ala Ala Pro Gln Leu Leu Ile Val Leu Leu Gly Leu Ser

165 170 175

Ala Leu Leu Gln

180

<210>3

<211>19

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>3

Asn Gln Val Leu Ser Val Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr Tyr Pro Ser

1 5 10 15

Ser Gln Asp

<210>4

<211>6

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>4

Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn

1 5

<210>5

<211>17

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>5

Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn

1 5 10 15

Arg

<210>6

<211>6

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>6

Ile Leu Gly Arg Gly Tyr

1 5

<210>7

<211>15

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>7

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His

1 5 10 15

<210>8

<211>7

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>8

Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210>9

<211>9

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>9

Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Tyr Thr

1 5

<210>10

<211>396

<212>DNA

<213>小家鼠

<400>10

atgaaagtgt tgagtctgtt gtacctgttg acagccattc ctggtatcct gtctgatgta 60

cagcttcagg agtcaggacc tggcctcgtg aaaccttctc agtctctgtc tctcacctgc 120

tctgtcactg gctactccat caccagtggt tattactgga actggatccg gcagtttcca 180

ggaaacaaac tggaatggat gggctacata agctacgacg gtagcaataa ctacaaccca 240

tctctcaaaa atcgaatctc catcactcgt gacacatcta agaaccagtt tttcctgaag 300

ttgaattctg tgactactga ggacacagct acatattact gtgcaattct gggacgcggc 360

tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctca 396

<210>11

<211>114

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>11

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ile Leu Gly Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210>12

<211>393

<212>DNA

<213>小家鼠

<400>12

atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 120

atctcatgca gggccagcca aagtgtcagt acatctagct atagttatat gcactggtac 180

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatcaagt atgcatccaa cctagaatct 240

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 300

cctgtggagg aggaggatac tgcaacatat tactgtcagc acagttggga gattccgtac 360

acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 393

<210>13

<211>111

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>13

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp

85 90 95

Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210>14

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成引物序列

<400>14

tccagagttc caggtcaagg tcac 24

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成引物序列

<400>15

gccagtggat agaccgatgg 20

<210>16

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成引物序列

<220>

<221>修饰的_碱基

<222>(24)..(25)

<223>n为肌苷

<220>

<221>misc_feature

<222>(24)..(25)

<223>n为a，c，g或t

<220>

<221>修饰的_碱基

<222>(29)..(30)

<223>n为肌苷

<220>

<221>misc_feature

<222>(29)..(30)

<223>n为a，c，g或t

<220>

<221>修饰的_碱基

<222>(34)..(35)

<223>n为肌苷

<220>

<221>misc_feature

<222>(34)..(35)

<223>n为a，c，g或t

<400>16

ggccacgcgt cgactagtac gggnngggnn gggnng 36

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成引物序列

<400>17

ggccacgcgt cgactagtac 20

<210>18

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成引物序列

<400>18

ttcactgcca tcaatcttcc actt 24

<210>19

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成引物序列

<400>19

gatggataca gttggtgcag c 21

<210>20

<211>480

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>CDS

<222>(4)..(480)

<400>20

tgg atg gca tct act tcg tat gac tat tgc aga gtg ccc atg gaa gac 48

Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys Arg Val Pro Met Glu Asp

1 5 10 15

ggg gat aag cgc tgt aag ctt ctg ctg ggg ata gga att ctg gtg ctc 96

Gly Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly Ile Gly Ile Leu Val Leu

20 25 30

ctg atc atc gtg att ctg ggg gtg ccc ttg att atc ttc acc atc aag 144

Leu Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu Ile Ile Phe Thr Ile Lys

35 40 45

gcc aac agc gag gcc tgc cgg gac ggc ctt cgg gca gtg atg gag tgt 192

Ala Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala Val Met Glu Cys

50 55 60

cgc aat gtc acc cat ctc ctg caa caa gag ctg acc gag gcc cag aag 240

Arg Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu Leu Thr Glu Ala Gln Lys

65 70 75

ggc ttt cag gat gtg gag gcc cag gcc gcc acc tgc aac cac act gtg 288

Gly Phe Gln Asp ValGlu Ala Gln Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val

80 85 90 95

atg gcc cta atg gct tcc ctg gat gca gag aag gcc caa gga caa aag 336

Met Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu Lys Ala Gln Gly Gln Lys

100 105 110

aaa gtg gag gag ctt gag gga gag atc act aca tta aac cat aag ctt 384

Lys Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr Thr Leu Asn His Lys Leu

115 120 125

cag gac gcg tct gca gag gtg gag cga ctg agg tca gag ata gcc ttc 432

Gln Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Ser Glu Ile Ala Phe

130 135 140

ccc cgc tac cct cca cct gcc aca ttc ctc tca ccc cca cat ccc tag 480

Pro Arg Tyr Pro Pro Pro Ala Thr Phe Leu Ser Pro Pro His Pro

145 150 155

<210>21

<211>158

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>21

Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys Arg Val Pro Met Glu Asp Gly

1 5 10 15

Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly Ile Gly Ile Leu Val Leu Leu

20 25 30

Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu Ile Ile Phe Thr Ile Lys Ala

35 40 45

Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala Val Met Glu Cys Arg

50 55 60

Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu Leu Thr Glu Ala Gln Lys Gly

65 70 75 80

Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val Met

85 90 95

Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu Lys Ala Gln Gly Gln Lys Lys

100 105 110

Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr Thr Leu Asn His Lys Leu Gln

115 120 125

Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Ser Glu Ile Ala Phe Pro

130 135 140

Arg Tyr Pro Pro Pro Ala Thr Phe Leu Ser Pro Pro His Pro

145 150 155

<210>22

<211>314

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>CDS

<222>(4)..(306)

<400>22

tgg atg gca tct act tcg tat gac tat tgc aga gtg ccc atg gaa gac 48

Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys Arg Val Pro Met Glu Asp

1 5 10 15

ggg gat aag cgc tgt aag ctt ctg ctg ggg ata gga att ctg gtg ctc 96

Gly Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly Ile Gly Ile Leu Val Leu

20 25 30

ctg atc atc gtg att ctg ggg gtg ccc ttg att atc ttc acc atc aag 144

Leu Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu Ile Ile Phe Thr Ile Lys

35 40 45

gcc aac agc gag gcc tgc cgg gac ggc ctt cgg gca gtg atg gag tgt 192

Ala Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala Val Met Glu Cys

50 55 60

cgc aat gtc acc cat ctc ctg caa caa gag ctg acc gag gcc cag aag 240

Arg Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu Leu Thr Glu Ala Gln Lys

65 70 75

ggc ttt cag gat gtg gag gcc cag gcc gcc acc tgc aac cac act gtg 288

Gly Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val

80 85 90 95

gag aga tca cta cat taa accataag 314

Glu Arg Ser Leu His

100

<210>23

<211>100

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>23

Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys Arg Val Pro Met Glu Asp Gly

1 5 10 15

Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly Ile Gly Ile Leu Val Leu Leu

20 25 30

Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu Ile Ile Phe Thr Ile Lys Ala

35 40 45

Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala Val Met Glu Cys Arg

50 55 60

Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu Leu Thr Glu Ala Gln Lys Gly

65 70 75 80

Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val Glu

85 90 95

Arg Ser Leu His

100

<210>24

<211>12

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>24

Leu Glu Gly Glu Ile Thr Thr Leu Asn His Lys Leu

1 5 10

<210>25

<211>1389

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成核苷酸序列

<400>25

atgaaagtgt tgagtctgtt gtacctgttg acagccattc ctggtatcct gtctgatgta 60

cagcttcagg agtcaggacc tggcctcgtg aaaccttctc agtctctgtc tctcacctgc 120

tctgtcactg gctactccat caccagtggt tattactgga actggatccg gcagtttcca 180

ggaaacaaac tggaatggat gggctacata agctacgacg gtagcaataa ctacaaccca 240

tctctcaaaa atcgaatctc catcactcgt gacacatcta agaaccagtt tttcctgaag 300

ttgaattctg tgactactga ggacacagct acatattact gtgcaattct gggacgcggc 360

tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc 420

ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct gggctgcctg 480

gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc 540

ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg 600

gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag 660

cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca 720

tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca 780

aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 840

gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 900

aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 960

ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1020

aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1080

ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 1140

acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1200

cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1260

ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1320

tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1380

ggtaaatga 1389

<210>26

<211>462

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成肽序列

<400>26

Met Lys Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala Ile Pro Gly Ile

1 5 10 15

Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro

20 25 30

Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr

35 40 45

Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro

65 70 75 80

Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln

85 90 95

Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Ile Leu Gly Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

115 120 125

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

130 135 140

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

145 150 155 160

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

165 170 175

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

180 185 190

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

195 200 205

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

210 215 220

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

225 230 235 240

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

245 250 255

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

275 280 285

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

305 310 315 320

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

355 360 365

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

370 375 380

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

385 390 395 400

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210>27

<211>717

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成核苷酸序列

<400>27

atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 120

atctcatgca gggccagcca aagtgtcagt acatctagct atagttatat gcactggtac 180

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatcaagt atgcatccaa cctagaatct 240

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 300

cctgtggagg aggaggatac tgcaacatat tactgtcagc acagttggga gattccgtac 360

acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc 420

atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480

aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540

ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600

agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660

acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgctag 717

<210>28

<211>238

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成肽序列

<400>28

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser

65 70 75 80

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

165 170 175

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

195 200 205

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

210 215 220

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210>29

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成引物序列

<400>29

aaagcggccg cgccgccacc atgaaagtgt tgagtctgtt gtacctgttg 50

<210>30

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成引物序列

<400>30

ctagtctaga tgaggagact gtgagagtgg tgccttggc 39

<210>31

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成引物序列

<400>31

gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg gtc 33

<210>32

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成引物序列

<400>32

tgatcatcat ttacccggag acagggagag gctcttc 37

<210>33

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成引物序列

<400>33

aaagcggccg cgccgccacc atggagacag acacactcct gc 42

<210>34

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成引物序列

<400>34

ctagtctaga cgttttattt ccagcttggt cccccctccg 40

<210>35

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成引物序列

<400>35

aaataaaacg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt ccc 43

<210>36

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成引物序列

<400>36

tgatcactag cactctcccc tgttgaagct ctttgtgac 39

<210>37

<211>15

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>37

Glu Val Glu Arg Leu Arg Arg Glu Asn Gln Val Leu Ser Val Arg

1 5 10 15

Claims

1.单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，所述单克隆抗体是由以保藏号FERM BP-10964保藏的杂交瘤BST2#4LD产生的。

2.与人BST2D抗原结合、且实质上不与人BST2H抗原结合的抗人BST2抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体在重链可变区和轻链可变区含有下述氨基酸序列作为CDR1、CDR2和CDR3：

重链可变区的CDR1：SGYYWN、即SEQ ID NO：4；

重链可变区的CDR2：YISYDGSNNYNPSLKNR、即SEQ ID NO：5；以及

重链可变区的CDR3：ILGRGY、即SEQ ID NO：6；

轻链可变区的CDR1：RASQSVSTSSYSYMH、即SEQ ID NO：7；

轻链可变区的CDR2：YASNLES、即SEQ ID NO：8；以及

轻链可变区的CDR3：QHSWEIPYT、即SEQ ID NO：9。

3.与人BST2D抗原结合、且实质上不与人BST2H抗原结合的抗人BST2抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体包含下述氨基酸序列作为重链可变区和轻链可变区：

SEQ ID NO：11所示的重链可变区和SEQ ID NO：13所示的轻链可变区。

4.权利要求2所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体为单克隆抗体。

5.多核苷酸，该多核苷酸编码权利要求2所述的抗体或包含其抗原结合区的片段。

6.载体，该载体包含编码权利要求2所述的抗体或包含其抗原结合区的片段的多核苷酸。

7.转化细胞，该转化细胞保持能够表达权利要求6所述的载体。

8.权利要求2所述的抗体或包含其抗原结合区的片段的制备方法，该制备方法包括以下步骤：培养权利要求7所述的转化细胞，以及从其培养物中回收抗体或包含其抗原结合区的片段。

9.杂交瘤BST2#4LD，其保藏号为FERM BP-10964。

10.抗体的制备方法，该制备方法包括以下步骤：培养权利要求9所述的杂交瘤，以及从培养物中采集抗体。