WO2004013325A1 - マウスインターフェロン産生細胞の検出方法 - Google Patents

マウスインターフェロン産生細胞の検出方法 Download PDF

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WO2004013325A1
WO2004013325A1 PCT/JP2003/009809 JP0309809W WO2004013325A1 WO 2004013325 A1 WO2004013325 A1 WO 2004013325A1 JP 0309809 W JP0309809 W JP 0309809W WO 2004013325 A1 WO2004013325 A1 WO 2004013325A1
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mouse
ipc
antibody
cell
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PCT/JP2003/009809
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Yumiko Kamogawa
Jun Ohkawa
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Ginkgo Biomedical Research Institute Co., Ltd.
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Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/555—Interferons [IFN]

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting or separating mouse interferon producing cells (IPC).
  • IPC mouse interferon producing cells
  • Interferon (iFNa) and interferon ⁇ (iFNp) are known as type 1 interferons having antiviral activity or antitumor activity. IPC was identified as a cell producing a large amount of these interferons following virus infection. IPC is sometimes referred to as:
  • Interferon a / jS producing cell IFN-a I ⁇ producing Cell (IPC)
  • Type 2 dendritic cell precursor cells type 2 pre-DC (pDC2),
  • IPC is only slightly present in the blood. The percentage of IPC in peripheral blood lymphocytes is thought to be less than 1%. However, IPC has a very high ability to produce interferon. The IFN-producing ability of IPC reaches, for example, 3000 pg / mL / 10 6 cells. In other words, although the number of cells is small, it can be said that most of the blood IFNa or ⁇ ? ⁇ is provided by IPC.
  • IPCs are undifferentiated lymphoid-derived dendritic cells that are positioned as progenitors of dendritic cells. IPC differentiates into mature dendritic cells upon viral stimulation, promotes T cell differentiation, and induces the production of IFN- ⁇ and IL-10. IPC also divides into mature dendritic cells upon stimulation with IL-3 or the like. Tree differentiated by IL-3 stimulation Dendritic cells induce Th2 differentiation of T cells and promote the production of Th2 cytokins (IL-4, IL-5, IL-10). Thus, IPCs have the property of differentiating into dendritic cells having different functions depending on the stimulus.
  • IPCs are cells that have two aspects: interferon-producing cells and dendritic cell progenitor cells. Both play important roles in the immune system. In other words, IPC is one of the important cells that have various functions to support the immune system.
  • IPC Information supporting the importance of the IPC in the immune system has been linked to the incidence and severity of AIDS. For example, IPC cells are reduced in AIDS patients. On the other hand, the number of peripheral blood IPCs is increasing in patients who survive long without developing HIV infection. In other words, it has been shown that IPC plays an important role in preventing the development of opportunistic infections and cancer. ⁇ Depletion of circulation type I interferon-producing cells m HIV-infected AIDS patients (2001) Blood 98; 906 o ) Thus, IPCs are thought to have an important role in the immune system.
  • IPC is an important research target. As mentioned earlier, its low abundance in peripheral blood is a major factor that has hindered research on IPC. It goes without saying that blood cells that can be collected from humans are limited. In particular, rare cells such as IPC are valuable as research materials. Disclosure of the invention
  • IPC When it is difficult to obtain research materials derived from humans, it is common to ask laboratory animals for alternative materials. For example, if IPC can be obtained from experimental animals that can be easily supplied in a stable manner, such as mice, the research on IPC can be facilitated.
  • a cell-specifically expressed molecule is used as a marker.
  • the present invention has clarified a molecule that can be a marker of mouse IPC, It is an object of the present invention to provide a method for detecting or separating mouse IPC to be used.
  • an anti-BDCA-2 monoclonal antibody or an anti-BDCA-4 monoclonal antibody is a human IPC-specific monoclonal antibody.
  • anti-BDCA-2 monoclonal antibody has been shown to have an effect of suppressing interferon production of human IPC.
  • the cDNA encoding the BDCA-2 antigen recognized by the anti-BDCA-2 monoclonal antibody has been cloned as an IPC-specific antigen.
  • the present inventors have established a hybridoma that produces a monoclonal antibody that specifically recognizes mouse IPC by immunizing rats with mouse IPC. We also found that among the monoclonal antibodies recognizing mouse IPC produced by the hybridomas obtained in this way, those that did not interfere with the IPF-interfering ability were produced. The inventors have confirmed that the molecules recognized by these monoclonal antibodies are useful as a marker for mouse IPC, and completed the present invention. That is, the present invention relates to the following mouse IPC detection method or separation method.
  • a method for detecting mouse interferon-producing cells comprising the following steps:
  • the step of detecting a cell expressing Ly-49Q comprises a step of binding an antibody that recognizes Ly-49Q or an antigen-binding region thereof to the cell.
  • the method of [2], wherein the antibody that recognizes Ly-49Q is a monoclonal antibody;
  • the monoclonal antibody is a monoclonal antibody that binds to an antigenic determinant recognized by a monoclonal antibody produced by hybridoma 2E6 deposited under accession number FERM BP-8445.
  • a step of detecting at least one type of dendritic cell selected from mouse lymphoid dendritic cells, mouse CD4 + myeloid dendritic cells, and mouse CD4-myeloid dendritic cells The method according to [1].
  • a reagent for detecting mouse interface-producing cells comprising an antibody that recognizes Ly-49Q or an antigen-binding region thereof.
  • [11] recognizes at least one dendritic cell marker selected from mouse lymphoid dendritic cells, mouse CD4 + myeloid dendritic cells, and mouse CD4-myeloid dendritic cells
  • the antibody according to (10) comprising the antibody or its antigen-binding region.
  • mouse lymphoid dendritic cells mouse CD4 + myeloid dendritic cells
  • mouse CD4-myeloid dendritic cells are CD4 and CD8.
  • a method for isolating mouse interferon-producing cells comprising the following steps.
  • a reagent for isolating mouse interferon-producing cells comprising an antibody that recognizes Ly-49Q or an antigen-binding region thereof.
  • [17] additionally contains either or both of an antibody recognizing a granulocyte marker or an antigen-binding region thereof, and an antibody recognizing a macula phage marker or an antigen-binding region thereof; ] The reagent according to [1].
  • a method for producing a monoclonal antibody comprising culturing hybridoma 2E6 deposited under accession number FERM BP-8445, and collecting immnoglobulin contained in the culture.
  • the present invention relates to a method for detecting or separating mouse IPC.
  • Mouse IPC is a cell population characterized by the following characteristics: Therefore, an object of the present invention is to detect or separate cells having the following characteristics derived from mouse peripheral blood or blood cells such as spleen and bone marrow.
  • the mouse IPC can be detected using the mouse IPC marker molecule found by the present inventors as an index. That is, the present invention relates to a method for detecting mouse interferogen-producing cells, comprising the following steps.
  • a marker refers to a molecule that can be used for identifying cells. Specifically, when a certain molecule A is detected in a certain cell A and not detected in another cell B, the molecule A is a marker of the cell A. Desirably, the marker is cell specific. However, even molecules that are commonly detected between different types of cells can be used as markers. For example, it is useful as a marker if it can be distinguished from most coexisting cells.
  • the marker can be selected from any molecule present on the cell. Among them, proteins and sugar chains present on the cell surface can be preferable markers that can be easily detected by an antibody or the like.
  • the mouse IPC detection method of the present invention can be used for counting, identifying, and separating mouse IPC.
  • IPC the number of cells is increased by activation. Therefore, 2003/009809
  • the mouse IPC can be identified based on the mouse IPC detection method according to the present invention. Identification of mouse IPCs also provides important information in studying such cells. For example, when searching for a new molecule specifically found in mouse IPC, the method for identifying mouse IPC according to the present invention is useful. That is, if a candidate molecule is specifically detected in the cell identified by the present invention, it can be confirmed that the molecule is specifically expressed in mouse IPC.
  • the present invention relates to a method for isolating mouse IPC using Ly-49Q as a marker. That is, the present invention provides a method for separating mouse interferon-producing cells, comprising the following steps.
  • the present inventors identified a cDNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 as a gene encoding a recognition antigen of monoclonal antibody 2E6 that specifically binds to mouse IPC.
  • the base sequence encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the homology between the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequence of a receptor expressed in Gr-1 + cells (SEQ ID NO: 8) reported as Ly-49Q is about 97.5%. Met. Fig. 7 shows the result of comparison between the two.
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or a protein comprising the amino acid sequence having high homology to the amino acid sequence is used as a mouse IPC marker in the present invention as long as expression in mouse IPC is observed. can do.
  • the mouse IPC marker Ly-490 of the present invention includes a protein described in any of a) to e) described below. a) a protein containing an amino acid sequence encoded by the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1
  • the polynucleotide of d) above can be identified, for example, by detecting hybridization of a probe prepared based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the probe is composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, preferably the nucleotide sequence of the protein coding region.
  • the probe can be composed of any continuous partial sequence of the base sequence.
  • the length of the nucleotide sequence constituting the probe may be, for example, 50, 80, 100, 120, 150, or 200 bases. Furthermore, the full length of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 can be used as a probe.
  • the polynucleotide of d) includes a polynucleotide that hybridizes with the probe under stringent conditions.
  • Stringent conditions for hybridization include, for example, a solution containing 5X SSC, 7% (W / V) SDS, lOO ⁇ tg / ml denatured salmon sperm DNA, 5X Denhardt's solution, at 48 ° C.
  • hybridization at 50 ° C, more preferably at 52 ° C, can be used.
  • hybrida At the same temperature as the temperature, more preferably at 60 ° C., even more preferably at 65 ° C., most preferably at 68 ° C. in 2 ⁇ SSC, preferably in 1 ⁇ SSC, more preferably in 0.5 ⁇ SSC, more preferably Wash for 1 hour in 0.1 X SSC with shaking.
  • Ly-49Q of the present invention includes a protein having high identity to SEQ ID NO: 2 and expressed in mouse IPC.
  • High identity in the present invention means, for example, identity of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 97% or more.
  • the identity of the amino acid sequence can be determined, for example, using the BLAST program (Altschul, SF et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410). Specifically, the blastn program is used to determine the identity of the base sequence, and the blastp program is used to determine the identity of the amino acid sequence.
  • Polymorphisms can often be observed in the nucleotide sequences of genes encoding eukaryotic proteins such as Ly-49Q.
  • Polymorphism is a small-scale base substitution found in the base sequence of a gene, and the substitution usually has a small effect on the activity of a protein.
  • Ly-49Q having a small mutation in the amino acid sequence amino acid due to such polymorphism and the like is also included in Ly-49Q in the present invention as long as it is expressed in mouse IPC.
  • the difference between the known amino acid sequence (GenBank Acc # .AB033769) and the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 is predicted to be due to polymorphism.
  • Ly-49Q a protein having high identity to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, is already known (GenBank Acc # .AB033769).
  • Ly-49Q can be used as a marker for mouse IPC is a novel finding revealed by the present inventors.
  • a method for detecting a marker is arbitrary.
  • a marker can be detected by a ligand that can specifically bind to the marker.
  • Ly-49Q is a protein isolated as a molecule homologous to the NK receptor. Therefore, a ligand that binds to the receptor can also be used for Ly-49Q detection.
  • Ly-49Q expression can also be detected by detecting mRNA containing a base sequence encoding Ly-49Q.
  • the mRNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or the nucleotide sequence known as GenBank Acc # .AB033769 can be detected by hybridization-PCR.
  • WYM hybridization or wYi / RT-PCR for detecting intracellular mRNA is known.
  • Those skilled in the art can design the nucleotide sequence of a probe necessary for hybridization or the primer for RT-PCR based on the nucleotide sequence of mRNA to be detected.
  • an antibody that recognizes and binds to a marker is preferable as the ligand in the present invention.
  • a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or a fragment containing the antigen-binding region thereof can be used as the antibody.
  • Monoclonal antibodies are preferred as ligands in the present invention because they can be expected to have high homogeneity and reaction specificity.
  • the monoclonal antibody in the present invention can be collected from an antibody-producing cell that produces the monoclonal antibody.
  • the cells producing the monoclonal antibody in the present invention can be obtained by administering mouse IPC or Ly-49Q to an immunized animal as an immunogen, and closing the antibody-producing cells. According to a general method for producing monoclonal antibodies, cell fusion between immune cells and tumor cells is performed. 2003/009809
  • the hybridoma obtained by the method is used as antibody-producing cells.
  • the immunogen in the present invention is mouse IPC.
  • Mouse IPC is a cell that satisfies the above conditions. Such cells can be obtained in large quantities, for example, by culturing mouse hematopoietic stem cells and differentiating them into IPCs. The conditions for dividing mouse hematopoietic stem cells into IPC in vitro are known.
  • mouse IPC differentiated in vitro is advantageous as an immunogen for obtaining a monoclonal antibody recognizing IPC.
  • differentiation into IPC is induced by culturing a cell population containing hematopoietic stem cells in the presence of an IPC inducer.
  • a cell population containing hematopoietic stem cells for example, bone marrow cells can be used.
  • FLT-3 ligand can be used as the IPC inducer.
  • the concentration of FLT-3 in the medium can be generally 1 to 10 O ng / mL, 5 to 5 O ng / mL, preferably 10 to 3 O ng / mL.
  • general blood cell culture conditions may be applied. That is, RPMI1640 or the like is used as a basal medium, and about 10% of fetal calf serum can be further added.
  • the culture period required for differentiation into IPC is, for example, 5 to 20 days, usually about 7 to 15 days.
  • IPCs for immunogens can be obtained.
  • several cell surface markers are used to sort cells having cell surface antigens characteristic of IPC. That is, the IP11-positive, CD11-negative, and B220-positive cell fractions can be collected using a cell sorter to obtain IPC.
  • the antibody-positive cells can be sorted as IPC using an antibody that is already known to be mouse IPC-specific.
  • the monoclonal antibody produced by the hybridoma 2E6 producing the monoclonal antibody of the present invention can be used for fractionating mouse IPC.
  • the deposit information of Hypri-Doma 2E6 will be described later.
  • IPC can also be obtained from peripheral blood of mice.
  • the population of IPC in peripheral blood is extremely low, so a large amount of mouse blood is required to collect IPC from peripheral blood. Therefore, it is advantageous to use cells differentiated from hematopoietic stem cells for IPC as an immunogen.
  • mouse IPC is immunized to a suitable immunized animal.
  • Mouse IPC can be administered to an immunized animal with an appropriate adjuvant. Any non-human vertebrate that recognizes mouse IPC as a foreign substance can be used as the immunized animal in the present invention.
  • an animal in which a fusion partner for making a hybridoma is easily available is advantageous. For example, the establishment of hybridomas derived from cells of rats, rabbits, sea lions, and goats has been established. These immunized animals can be used in the present invention.
  • the adjuvant Freund's complete adjuvant / Freund's incomplete adjuvant is used.
  • the immunized animal is immunized multiple times at 3- to 10-day intervals.
  • the number of IPCs used for one immunization is arbitrary. Usually, 1 0 3 to 1 0 8, for example 1 0 6 IPC is immunized.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by collecting immunocompetent cells from immunized animals that have undergone multiple immunizations and cloning cells that produce the desired antibody.
  • an antibody necessary for the present invention can be obtained using the IPC marker Ly-49Q identified by the present inventors as an immunogen.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by using, as an immunogen, a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or an oligonucleotide consisting of a continuous amino acid sequence selected from the amino acid sequence. Protein or oligopeptide as required Conjugated with a carrier, and further administered to an immunized animal together with an adjuvant. Also, transformed cells in which Ly-49Q is forcibly expressed can be used as an immunogen.
  • the immunocompetent cells are recovered from the immunized animal that has undergone multiple immunizations, and the cells producing the desired antibody are isolated. By cloning, the monoclonal antibody of the present invention can be obtained.
  • the immunocompetent cell refers to a cell capable of producing an antibody in an immunized animal.
  • Immunocompetent cells can be cloned, for example, by the hybridoma method.
  • immunocompetent cells one cell produces one type of antibody. Therefore, if a cell population derived from one cell can be established (ie, cloned), a monoclonal antibody can be obtained.
  • the hybridoma method refers to a method in which an immunocompetent cell is fused with an appropriate cell line, immortalized, and then cloned. Many cell lines useful for the hybridoma method are known. These cell lines are excellent in the efficiency of immortalizing lymphoid cells and have various genetic markers necessary for selection of cells that have successfully undergone cell fusion. Further, when the purpose is to obtain antibody-producing cells, a cell line lacking the antibody-producing ability can be used.
  • mouse myeloma P3x / 63Ag8.653 is widely used as a useful cell line for mouse-rat cell fusion.
  • the immunized animal is an animal other than the mouse.
  • hybridomas are produced by fusion of cells of the same kind, but monoclonal antibodies can also be obtained from heterogeneous hybridomas between closely related species.
  • the immunocompetent cells of the immunized animal are mixed with an appropriate fusion partner to cause cell fusion.
  • an appropriate fusion partner to cause cell fusion.
  • the immunocompetent cells spleen cells and peripheral blood B cells are used.
  • the fusion partner the various cell lines described above can be used.
  • polyethylene glycol method An electrofusion method is used.
  • cells that have successfully undergone cell fusion are selected based on the selection marker possessed by the fused cells. For example, when a HAT-sensitive cell line is used for cell fusion, cells that have succeeded in cell fusion are selected by selecting cells that grow in the HAT medium. Furthermore, confirm that the antibodies produced by the selected cells have the desired reactivity.
  • Each hybridoma is screened based on antibody reactivity. That is, a hybridoma that produces an antibody having specific binding activity to IPC is selected. Preferably, the selected hybridoma is subcloned, and when the production of the desired antibody is finally confirmed, the hybridoma is selected as a hybridoma that produces the monoclonal antibody of the present invention.
  • the monoclonal antibody of interest in the present invention binds to Ly-49Q.
  • the binding activity of the antibody to a specific antigen can be confirmed by any method.
  • a method for screening an antibody having a desired reactivity by ELISA is known. Specifically, prepare a microplate containing Ly-49Q or its domain peptide. Next, the culture supernatant of the hybridoma is dispensed to this plate. More efficient screening can be expected if the supernatant from which mouse immunoglobulin is detected is targeted for screening. If the culture supernatant contains an antibody with the desired reactivity, it will bind to Ly-49Q bound to the microplate. Rat immunoglobulin bound to the plate can be detected by an anti-rat immunoglobulin antibody.
  • a target cell can be selected using a transformed cell in which Ly-49Q is forcibly expressed. Specifically, first, the transformed cells in which Ly-49Q is forcibly expressed are brought into contact with the culture supernatant of the hybridoma. Antibodies having the desired reactivity bind to transformed cells. The antibody bound to the cells is detected by a labeled anti-rat immunoglobulin antibody.
  • the IPC does not interfere with the ability of the IPC to produce interfering proteins during the isolation process. It is desirable not to induce IPC proliferation or cell damage during the separation process.
  • the IPC can be said to be of greatest scientific and industrial interest in regulating its ability to produce interferons.
  • mouse IPC isolated according to the present invention is ideal as research material. .
  • antibodies that do not interfere with the cell growth potential of IPC are also useful as tools for isolating cells.
  • the anti-Ly-49Q antibody is useful in isolating IPC, since it has no effect on cell proliferation of IPC.
  • the activity of the monoclonal antibody to regulate interferon production can be confirmed by actually allowing the monoclonal antibody to act on IPC.
  • IPCs produce large amounts of interferon upon virus stimulation.
  • the amount of IPC interferon production changes as compared to a control to which no antibody is added.
  • the monoclonal antibody does not interfere with the ability of IPC to produce interferon, the activity of IPC for producing interferon is substantially unaffected.
  • the mouse IPC when cells that are infectious to mouse cells, such as the influenza virus, are added to the IPC, the mouse IPC produces interferon.
  • the interferon produced can be measured, for example, by Imnoassay. Those skilled in the art can easily measure interferon based on principles such as ELISA. Wear.
  • the regulation of interferon producing activity, active I 1 production inhibition, or refers to promotion. It can be confirmed as follows that the monoclonal antibody has a function of regulating the IPF production activity of IPC.
  • IPCs produce large amounts of interferon upon viral stimulation.
  • a monoclonal antibody is given before, after, or simultaneously with virus stimulation of IPC, and the interferon-producing ability is compared with IPC without monoclonal antibody as a control.
  • the interferon-producing ability can be evaluated by measuring IFN- ⁇ and IFN- ⁇ contained in the culture supernatant of IPC. As a result of the comparison, if the amount of interferon in the supernatant is significantly changed by the addition of the monoclonal antibody, it can be confirmed that the monoclonal antibody has an effect of regulating the interferon-producing ability. Methods for measuring these interferons are known. When the effect of Ly-49Q-recognizing antibody on the production of interferon in this way is compared, no significant difference is found in the level of interferon production as compared to the control.
  • IPC produces several types of interferons, such as IFN and IFN i3.
  • the monoclonal antibody when the IPC does not substantially affect the ability to produce interferon, substantially has the effect of regulating the ability of IPC to produce interferon. Say not.
  • the monoclonal antibody that recognizes the IPC marker Ly-49Q discovered by the present inventors does not particularly interfere with the ability to produce IFN ⁇ and IFN] 3. Substantially no effect on interferon production is supported by the absence of a significant difference in IPC interferon production after virus stimulation with and without the monoclonal antibody.
  • antibodies that recognize the IPC marker Ly-49Q bind to IPC and do not induce IPC proliferation.
  • the proliferative ability of IPC conjugated with the monoclonal antibody can be confirmed by observing cell proliferation. Methods for confirming cell proliferation are known. For example, as an index uptake by cells H 3 thymidine, evaluating the proliferation activity of the cells Can be. If there is no significant difference in the cell proliferation ability between the IPC contacted with the monoclonal antibody and the control, the monoclonal antibody has a substantial effect on the proliferation ability of the IPC. It can be confirmed that there is no. As a control, rat IgG or the like that is clearly not bound to IPC can be used.
  • Preferred monoclonal antibodies of the present invention include monoclonal antibodies produced by the following hybridomas.
  • the hybridoma 2E6 producing a monoclonal antibody that does not affect the IFN production of the present invention was deposited as follows.
  • 2E6 is a rat-mouse mouse hybridoma that produces a monoclonal antibody having a subclass IgG 2a ⁇ chain.
  • the present invention also provides a monoclonal antibody having the same binding activity as the monoclonal antibody produced by the hybridoma established by the present inventors. That is, the present invention provides a monoclonal antibody that binds to a mouse interferogen-producing cell-specific antigen recognized by a monoclonal antibody produced by hybridoma 2E6 or an antigenic determinant thereof, or a fragment containing the antigen-binding region thereof.
  • Such a monoclonal antibody can be expressed by obtaining a cDNA encoding the antigen-binding region of the antibody from the hybridoma and inserting the cDNA into an appropriate expression vector.
  • Techniques for obtaining cDNA encoding the variable region of an antibody and expressing it in a suitable host cell are known.
  • a technique for making a chimeric antibody by binding a variable region containing an antigen-binding region to a constant region is also known.
  • the antigen-binding activity of the monoclonal antibody of the present invention can be transferred to other immunoglobulins. 03 009809
  • CDR CDR
  • the antigen-binding properties of each immunoglobulin are determined by CDRs, and the frame maintains the structure of the antigen-binding region. While the amino acid sequences of CDRs are extremely diverse, the amino acid sequences in the frame are highly conserved. It is known that antigen-binding activity can also be transplanted by incorporating the CDR antigen into the frame region of another immunoglobulin molecule. Using this method, a method has been established for transplanting the antigen-binding properties of heterologous immunoglobulins into human immunoglobulins.
  • a monoclonal antibody comprising an immunoglobulin containing an antigen-binding region encoded by a polynucleotide derived from a cDNA encoding the antigen-binding region of the monoclonal antibody of the present invention is included in the present invention.
  • the mouse IPC-specific antigen Ly-49Q recognized by the monoclonal antibody produced by hybridoma 2E6 or a monoclonal antibody that binds to its antigenic determinant, or a fragment containing the antigen-binding region thereof, regardless of its origin It can be used for That is, even if the immunoglobulin is derived from a substance other than these specific hybridomas, a monoclonal antibody that binds to the above antigen or antigenic determinant can be used in the present invention.
  • a monoclonal antibody can be obtained, for example, as follows.
  • a monoclonal antibody that binds to Ly-49Q is obtained in the same manner as described above. Then, it may be confirmed that the obtained monoclonal antibody binds to the same antigen as the monoclonal antibody produced by the hybridoma.
  • Reactions I 1 of monoclonal antibodies can be compared, for example, by competition or absorption. That is, when monoclonal antibody 2E6 binds to IPC or Ly-49Q and is competitively inhibited by this antibody, it is considered that this antibody recognizes the same antigen as monoclonal antibody 2E6.
  • the IPC that binds to an antibody is monoclonal antibody 2E6 When the antibody loses its binding activity, it recognizes the same antigen as monoclonal antibody 2E6.
  • the present invention provides a hybridoma producing the monoclonal antibody included in the present invention.
  • the hybrids established by the present inventors have been deposited as described above. However, irrespective of these specific hybridomas, the hybridomas producing the monoclonal antibody of the present invention are included in the present invention.
  • the present invention relates to a method for producing a monoclonal antibody, which comprises a step of culturing the hybridoma and recovering a monoclonal antibody from the culture.
  • Hybridomas can be cultured in z ' «7ro or vz'w. In Tro,
  • the hybrid can be cultured using a known medium such as RPMI1640.
  • a known medium such as RPMI1640.
  • the immunoglobulin secreted by the hybridoma is accumulated. Therefore, the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by collecting the culture supernatant and purifying it as necessary. It is easier to purify immunoglobulin if no serum is added to the medium. However, about 10% of fetal calf serum can be added to the medium for the purpose of rapidly growing hybridomas and promoting antibody production.
  • the hybrid can also be cultured in '. Specifically, by inoculating the abdominal cavity of a nude mouse with the hybrid, the hybridoma can be cultured in the abdominal cavity. Monoclonal antibodies accumulate in ascites. Therefore, the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by collecting the ascites fluid and purifying it as needed. The obtained monoclonal antibody can be appropriately modified or processed according to the purpose.
  • the detection of mouse IPC refers to confirming that the cells constituting the sample contain mouse IPC. Therefore, by detecting mouse IPC, a certain cell can be identified as mouse IPC. In addition, the number of mouse IPCs in a cell population composed of a plurality of types of cells can be quantified. IPC detection, IPC It is useful for grasping the numerical fluctuation of. For example, I mentioned earlier that the number of IPCs has been linked to the incidence and severity of AIDS. In other words, it was reported that the incidence of opportunistic infections in AIDS patients was increased by a decrease in IPC as well as CD4 + T cells.
  • the detection method of the present invention can be implemented, for example, as follows.
  • the cell sample is contacted with the anti-Ly-49Q antibody, and the anti-Ly-49Q antibody is bound to the mouse IPC in the sample.
  • a fragment containing the antigen-binding region can also be used as the anti-Ly-49Q antibody.
  • the anti-Ly-49Q antibody also includes a fragment containing the antigen-binding region thereof.
  • the cell sample and the anti-Ly-49Q antibody are contacted under conditions that maintain the immunological binding activity of the antibody. Specifically, it is desirable that the contact be made at a weakly acidic to weakly alkaline pH and at a salt concentration close to that of physiological saline. Any sample that may contain mouse IPC can be used as the cell sample.
  • peripheral blood lymphocyte populations, lymph nodes, spleen, or lymphoid tissues such as bone marrow can be used as a sample. Methods for preparing these cell samples are known.
  • hematopoietic stem cells can be differentiated into IPCs and used as cell samples. Methods for differentiating a cell population containing hematopoietic stem cells into IPCs in vitro or / and / or are known. The detection or identification of an artificially divided IPC is useful in searching for conditions necessary for dividing into an IPC.
  • the anti-Ly-49Q antibody bound to the cells is detected.
  • mouse IPC can be detected by labeling an anti-Ly-49Q antibody and tracking the label.
  • Antibodies can be labeled by components such as enzymes, fluorescent materials, luminescent materials, binding affinity materials, microbeads, or radioisotopes. Methods for binding these components to antibodies are also known. For example, using a bifunctional reagent such as a maleimide derivative, an enzyme, a fluorescent substance, or microbeads can be directly bound to the antibody.
  • the anti-Lv-49Q antibody can be physically adsorbed on the surface of the microbead.
  • an anti-Ly-49Q antibody can be bound to an appropriate solid phase.
  • the inner wall of a plate or tube, the inner wall of a column or cavity, or the surface of a bead-like solid phase is used as the solid phase.
  • Anti-Ly-49Q antibodies can also be labeled indirectly.
  • a rat-derived monoclonal antibody can be indirectly labeled with a labeled antibody that recognizes rat immunoglobulin.
  • a labeled antibody for indirectly labeling the monoclonal antibody of the present invention is generally called a secondary antibody.
  • the label of the anti-Ly-49Q antibody can be traced by using a method corresponding to each label component.
  • a method corresponding to each label component for example, in the case of a fluorescent substance, fluorescence can be detected by irradiation with excitation light.
  • labeling can be traced using the product of the enzyme reaction as an index.
  • cells that have reacted with the antibody can be separated.
  • antibodies that recognize different cell surface antigens can be used. That is, a combination of a mouse IPC-specific anti-Ly-49Q antibody and any antibody that recognizes mouse IPC is used. For example, a certain cell population is brought into contact with an anti-Ly-49Q antibody immobilized on beads to specifically capture mouse IPC. Next, any antibody that recognizes mouse IPC is bound to the captured mouse IPC. If any antibody that recognizes mouse IPC is used as a labeled antibody, mouse IPC can be detected.
  • mouse IPC is a cell positive for CD11c, B220, Ly6c and CD45RB. Therefore, any antibody that recognizes these cell surface antigens can be used as any antibody that recognizes mouse IPC. These cell surface antigens are not mouse IPC specific markers. However, the specificity for mouse IPC in the separation method of the present invention is ensured by the reactivity with the anti-Ly-49Q antibody.
  • anti-Ly-490 antibody anti Ly-49Q antibodies in reagent for detecting mouse IPC of c present invention which may be a reagent for detecting mouse IPC, the above-described labels formed Can be labeled in minutes. Alternatively, it can be supplied in combination with a secondary antibody.
  • the anti-Ly-49Q antibody used for detection of mouse IPC of the present invention can be any fragment containing the antigen-binding region. Therefore, not only the complete immunoglobulin molecule but also a fragment retaining the antigen binding activity of the immunoglobulin can be used. Such fragments include, for example, F (ab) 2, Fab and the like.
  • Mouse IPC detection methods can be used to identify subtypes of mouse dendritic cells.
  • mouse dendritic cells containing IPC have the following subtypes.
  • CD4 + myeloid dendritic cells CD4 positive "Myeloid” DCs
  • CD4 myeloid dendritic cells CD4 negative "Myeloid” DCs
  • Fig. 8 summarizes the differentiation process of these dendritic cells.
  • IPCs are classified as lymphoid dendritic cells, while all other dendritic cells are myeloid cells. Both cells are thought to play an important role in the immune response. However, there is not much information on the mechanism. Changes in the population of these subtypes in mice given various stimuli and disease model mice with abnormal immune functions provide important information in elucidating the mechanism. Therefore, discrimination of dendritic cell subtypes using the IPC detection method according to the present invention is useful for elucidation of the immune system in mice.
  • each subtype can be identified using a cell surface marker of the subtype of the dendritic cell to be identified.
  • Each of the dendritic cells (1) to (4) shown in FIG. 8 has the cell surface marker described in the figure. Therefore, by appropriately combining these cell surface markers, They can be distinguished from each other.
  • two markers, Ly-49Q and CDllc are used to identify IPCs as positive cells ( Figure 9B, top).
  • two markers, CD8 and CD4 are applied to cells in which only CDl lc is positive, three types of dendritic cells can be identified using the following combinations (Fig. 9B lower).
  • Ly-49Q as a marker for IPC makes it possible to easily identify dendritic cell subtypes.
  • CD4-myeloid dendritic cells--At least one antibody used to identify these subtypes is combined with an antibody that recognizes Ly-49Q and supplied as a dendritic cell identification reagent.
  • an antibody that recognizes Ly-49Q can be
  • at least one antibody selected from antibodies recognizing CD11, CD4, and CD8 is preferable as an antibody constituting a reagent for identifying dendritic cells.
  • the localization of mouse IPC in a tissue or a living body can be clarified by the mouse IPC detection method according to the present invention.
  • the population of IPC in vivo is small. As a result, information on IPC functions and localization is very limited. Therefore, it is important to clarify the localization of IPC by labeling the anti-Ly-49Q antibody and tracking its behavior in the tissue or in vivo.
  • the present invention provides a method for analyzing the localization of IPC, including the following steps.
  • anti-Ly-490 antibodies are Marked by The localization of radioisotopes can be imaged by tracking their radioactivity.
  • magnetic metal labels can be imaged by nuclear magnetic resonance imaging (MR-I).
  • MR-I nuclear magnetic resonance imaging
  • Methods for modifying antibodies with such labeling substances are known.
  • the antibody that recognizes the mouse IPC marker, Ly-49Q, in the present invention does not interfere with the IFN-producing ability or proliferation of mouse IPC, and therefore does not interfere with the activity of IPC even when administered to a living body. Therefore, in analyzing the localization in a living body, the possibility of interference caused by antibody binding can be excluded.
  • an antibody labeled with a fluorescent dye or an enzyme active substance can be used.
  • Such an analysis method is known as an immunostaining method.
  • the anti-Ly-49Q antibody When the anti-Ly-49Q antibody is administered to a host different from the species from which the antibody is derived, it is desirable to process the antibody into a rat shape that is difficult to recognize as a foreign substance. For example, by processing into the following molecules, it is possible to make it difficult for the immunoglobulin to be recognized as a foreign substance.
  • CDR-substituted antibody in which the complementarity-determining region (CDR) of one host immunoglobulin is replaced by the monoclonal antibody CDR
  • the anti-Ly-49Q antibody can bind to a label component or a solid phase in the same manner as the antibody in the detection method.
  • the mouse IPC can be isolated by sorting the cells bound to the antibody. For example, when using an anti-Ly-49Q antibody conjugated to a labeling component, the labeling component is tracked and the cells to which the labeling component is bound are sorted to obtain a mouse IPC can be separated.
  • mouse IPC can be separated by collecting the solid phase.
  • an anti-Ly-49Q antibody is immobilized on a water-insoluble carrier and cells are directly or indirectly bound to the anti-Ly-49Q antibody.
  • a water-insoluble carrier beads or a matrix made of cellulose derivative agarose or the like is used.
  • the water-insoluble carrier on which the anti-Ly-49Q antibody is immobilized can also be packed into a column to form an immunoadsorption column.
  • Mouse IPC captured by a monoclonal antibody on an insoluble carrier can be eluted with a buffer that dissociates immunological binding.
  • a separation method using fluorescent antibody-labeled cells or a separation method using immunomagnetic beads can be used.
  • this is a method in which cells to which the anti-Ly-49Q antibody is bound are separated from target cells one by one using fluorescent labels or magnetic labels as markers.
  • a cell sorter such as FACS or MACS. Methods for separating cells using a cell sorter are known.
  • an anti-Ly-49Q antibody is contacted with a cell population containing mouse IPC. After washing the cells with PBS, the cells are then reacted with a biotinylated anti-rat IgG antibody (secondary antibody). Alternatively, if an anti-Ly-49Q antibody that has been previously biotinylated is used, a secondary antibody is not required. After washing the cells with PBS, react with streptavidin magnetic beads. Thus, the magnetic beads are bound to the mouse IPC. By passing the obtained cells through a magnetic column, they can be captured by the column.
  • mice IPC mouse IPC After washing the column, the cells remaining on the column can be eluted to recover mouse IPC.
  • the present inventors have developed a mouse based on such a method.
  • IPC can be separated with high yield.
  • the population of IPC in the mouse peripheral blood lymphocyte population is less than 1%. Enhance IPC population to more than 70% by cell separation method using anti-Ly-49Q antibody Can be.
  • MACS cell separation method using anti-Ly-49Q antibody
  • the operation is completed in about 30 minutes. That is, the separation method of the present invention is useful as a method for preparing a large amount of IPC which can be found only in a small amount in a living body.
  • any cell population having a possible life including IPC can be used.
  • a cell population derived from a living body such as peripheral blood, spleen tissue, and bone marrow can be used.
  • a cell population containing an artificially derived IPC in vitro can be used.
  • the cells can be removed in advance.
  • granulocytes and macrophages can be separated in advance by utilizing the difference in cell size from IPC.
  • a separation method based on the difference in cell size a density gradient centrifugation method or the like can be used.
  • Separation of cells using cell surface markers can also be used. For example, selection of (1) B220, (2) CD45RB, and (3) CDllc positive cells selects IPC and excludes granulocytes and macrophages (positive selection). Alternatively, removal of 1 lb CD cells can specifically remove granulocytes and macrophages contaminated with IPC (negative selection). In addition, when a spleen-derived cell group is targeted, B cells and T cells are eliminated by excluding CD19-positive cells and CD3-positive cells, respectively.
  • the purity of the IPC separated by the method for separating IPC of the present invention can be further increased by combining a step of removing other cells.
  • other cells can be excluded by using a marker capable of discriminating cells mixed with IPC.
  • a marker capable of discriminating cells mixed with IPC for example, granulocyte-mace phage may be mixed. Therefore, IPCs can be purified using the advantages of these cells but not found in IPC (negative selection). Such power is called a negative selection marker.
  • a negative selection tool is CDl lb. -21-That is, before or after the separation method of the present invention, cells having a negative selection marker contained in the cell population containing IPC may be separated.
  • cells having a negative selection marker can be separated by a method similar to the above-described IPC separation method.
  • the method for separating IPC of the present invention can be applied to a cell population from which cells having a negative selection marker have been removed in advance.
  • the purity of IPC can be further increased by further removing cells having a negative selection marker from the cell population containing IPC separated by the method of the present invention. That is, by dual staining of Ly-49Q and CD11 lb, IPC is capable of isolating IPC as Ly-49Q (+) and CDllb (-) cells (FIG. 9A).
  • IPC which is not found in these cells, can be purified using markers possessed by IPC (positive selection).
  • a marker is called a positive selection marker.
  • B220, CD45RB, and CD11c can be indicated as positive selection markers. If a positive selection marker is used, cells with that marker are separated as IPC
  • the negative selection marker or the positive selection marker may be used alone or in combination of two or more. Further, both markers can be used.
  • the antibody that recognizes Ly-49Q used in the IPC separation method of the present invention can be used as an IPC separation reagent. That is, the present invention relates to a mouse IPC separation reagent containing an antibody that recognizes Ly-49Q or an antigen-binding region thereof.
  • the antibody that recognizes Ly-49Q or the antigen-binding region thereof, which constitutes the separation reagent of the present invention can be bound to a label or a solid phase.
  • antibodies bound to magnetic beads are useful for separation by MACS.
  • the antibody bound to the solid phase can be packed into a column to form an IPC separation column.
  • the separation reagent of the present invention can be combined with an element for detecting one or both of a negative selection marker and a positive selection marker.
  • a reagent combining antibodies recognizing these markers is useful as a reagent for obtaining higher purity IPC.
  • an IPC separation reagent can be constituted by combining elements for separating cells other than IPC which are likely to coexist in a cell population. Specifically, the element for density gradient centrifugation to remove granulocytes and macula phage based on cell size differences is combined with an antibody that recognizes Ly-49Q. it can.
  • IPCs are cells that produce most of the interferon in living organisms. Therefore, it is of great significance to study how to isolate IPC and regulate its ability to produce IPC. Interferons such as IFN- ⁇ and IFN- ⁇ produced by IPC are thought to have important effects in the cure of cancer and viral diseases. Therefore, promotion of the interferon production activity is useful as a method for treating these diseases.
  • Human IPC is also said to differentiate into DC2 (Dendritic Cell type 2) via IL-3 produced in mast cells by stimulation of allergens and parasites. DC2 is a cell that induces T cells to differentiate into Th2. If suppression of IFN production or TNF production of IPC by allergen stimulation, differentiation into Th2 may be suppressed.
  • Figure 1 shows a FACS analysis image of the cell surface of mouse bone marrow cells (enriched in IPC) cultured for 10 days after addition of FLT-3 ligand, stained with the prepared antibody and other IPC markers.
  • the culture supernatant positive fraction and the negative fraction were designated as R2 and R3, respectively.
  • R1 & R2 represents a cell population positive for the 2E6 antibody
  • R1 & R3 represents a cell population negative for the 2E6 antibody.
  • FIG. 2 is a micrograph (X400) showing the morphology of cells extracted with each monoclonal antibody.
  • A shows the form before infection with influenza virus PR8, and
  • b shows the form after 2 days of culture with influenza virus PR8. After infection, the cells had dendrites and exhibited a morphology typical of dendritic cells.
  • FIG. 3 is a graph showing the interferon-producing ability of cells to which the monoclonal antibody 2E6 of the present invention has bound.
  • the graph shows the results of 2E6 positive cells, 2E6 negative cells, 2E6 negative cells, and whole spleen cells in order from the bottom.
  • For each cell the amount of IFN- ⁇ production (ng / mL) when the cells were infected with PR8 (PR8) and when they were not infected (-) were shown.
  • FIG. 4 is a graph showing the effect of monoclonal antibody 2E6 on interferon-producing ability of IPC.
  • FIG. 5 is a graph showing the effect of monoclonal antibody 2E6 on cell growth ability of IPC.
  • 2E6 (0. 1 g / mL)
  • the center rat IgG in (0. 1 g / mL) and if added, the amount uptake of H 3 thymidine 2E6-positive cells cultured under CpG presence ( cpm).
  • the leftmost (-) shows the measurement results without CpG.
  • FIG. 6 is a photograph showing the result of confirming the expression level of the gene (top) having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (SEQ ID: 1). Each lane shows the result of the next cell in order from the left.
  • T cells CD3-positive cells (T cells)
  • 3 mouse IPC
  • FIG. 7 is a view showing the results of alignment of the amino acid sequence of the receptor (SEQ ID NO: 8, GenBank Acc #. AB033769; bottom).
  • FIG. 8 is a diagram showing the differentiation process of dendritic cells. Haematopoietic Stem Cell) differentiates into lymphoid progenitor cells (CLP: Common Lymphoid Progenitors) and myeloid progenitor cells (CMP: Common Myeloid Progenitors).
  • CLP Common Lymphoid Progenitors
  • CMP Common Myeloid Progenitors
  • IPCs are cells differentiated from lymphoid progenitor cells together with lymphocytes and the like.
  • lymphoid dendritic cells or myeloid dendritic cells differentiate from myeloid precursor cells.
  • FIG. 9 is a graph showing an IPC and other identification methods using various cell surface markers. A shows that IPC can be separated using two markers, Ly-49Q and CD11b. B shows examples of combinations of cell surface markers for identifying various dendritic cells. That is, IPC is first identified as a positive cell using both markers, Ly-49Q and CDl lc (top).
  • FIG. 10 shows the results of double staining of Balb mouse spleen-derived cells with monoclonal antibody 2E6 that recognizes Ly-49Q and antibodies that recognize various cell surface markers.
  • the vertical axis indicates the fluorescence intensity of the fluorescent dye labeled with the various antibodies combined, and the horizontal axis indicates the fluorescence intensity of the fluorescent dye labeled with the monoclonal antibody 2E6.
  • FIG. 11 shows the results of double staining using a monoclonal antibody 2E6 that recognizes Ly-49Q and an antibody that recognizes Gr-1 (left) or CD11b (right).
  • the upper part shows the results of analysis of spleen-derived cells derived from C57B6 mice, and the lower part shows the results of analysis of spleen-derived cells.
  • the vertical axis and the horizontal axis indicate the fluorescence intensity of the fluorescent dye labeled with the antibody indicated on each axis. Fig.
  • FIG. 13 shows micrographs of Gr-1 and monoclonal antibody 2E6-positive cells (IPC; lower), Gr-1 strongly positive and monoclonal antibody 2E6-positive cells (granulocytes; upper) derived from the spleen of Balb / c mice. Photos shown.
  • the cells used as the immunogen were prepared as follows. Bone marrow cells of Balb / c mouse females (4 to 6 weeks old) were cultured for 10 days in 1 O ng / mL of 10% FCS-RPMI 1640 containing FLT-3 ligand (penicillin, streptomycin). On day 10, about 40% of cells are IPC
  • P3x / 63Ag8.653 and rat lymphocytes were mixed at a ratio of 4: 5, and polyethylene glycol (PEG) was added to fuse the cells.
  • the cells after the fusion were washed for + minutes, dispersed in HAT medium, and spread on a 96-well plate so as to contain 5 ⁇ 10 4 cells / well.
  • the cells in the wells with increased cells were collected and diluted, and the culture supernatant was screened.
  • the culture supernatant was screened using the response of mouse spleen cells and cultured bone marrow cells as an index. Details are as follows.
  • Bone marrow cells of female Balb / c mice (4-6 weeks old) were prepared by adding 10% FCS-RPMI with FLT-3 ligand. The cells were cultured in 1640 (penicillin, streptomycin) for 10 days. On day 10, about 40% of the cells became IPCs (Interferon producing cells). The cells were stained using the hybridoma culture supernatant as the primary antibody and FITC-labeled anti-rat IgG as the secondary antibody. Thereafter, double staining was performed with various antibodies (CD11, CD11, CD3, CD19, CD45RB, B220, Ly6C).
  • the positive fraction of the culture supernatant and the negative fraction were designated as R2 and R3, respectively, and the expression of various antigens in each Gate was shown by histogram (Fig. 1).
  • the cell group stained with the several types of antibodies produced had the same cell surface antigen profile of mouse IPC (Nature Immunol. 2001.pl 144-1150) defined in the literature. Therefore, these antibodies were considered to be antibodies that specifically bind to mouse IPC.
  • Bone marrow cells cultured in the same manner as in Example 2 were stained using the culture supernatant as a primary antibody and FITC-labeled anti-rat IgG as a secondary antibody. Then, positive cells were separated using a cell sorter. After cytospin, Giemsa staining and microscopic examination revealed a specific morphology for IPC (Fig. 2 (a)). That is, the shape of this cell had a large round nucleus.
  • ⁇ 5 cells were cultured with influenza virus (PR8) in a 96-well round bottom plate for 24 hours, stained with Giemsa in the same manner, and observed under a microscope. The cells were classified into morphologically typical dendritic cells. I drew (Fig. 2 (b)). From these results, it was confirmed that the cells separated by the above antibody had the characteristic of mouse IPC that differentiated into dendritic cells by viral infection. 2E6 was selected as a mouse IPC-specific monoclonal antibody and used in subsequent experiments. The hybridoma 2E6, which produces the monoclonal antibody 2E6, was deposited on August 1, 2002 at the Patent Organism Depositary of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Accession No. FERM BP-8445).
  • Bone marrow cells cultured in the same manner as in Example 2 were stained with the culture supernatant of 2E6 and a secondary antibody, and positive and negative cells were separated using a cell sorter. l ⁇ l0 5 2E6-positive cells in a 96-well circle The solution was dispensed to the bottom plate ( ⁇ / well), infected with influenza virus PR8, and IFNa in the culture supernatant 24 hours later was measured by ELISA. Each reaction was performed by triplicate, and the average value was calculated. Instead of 2E6-negative cells, spleen cells or 2E6-negative cells were similarly treated and the results were compared.
  • the operation of the ELISA is as follows. First, a 96-well plate was coated with an anti-IFNa antibody over night. After washing the plate, the culture supernatant ( ⁇ ) was added and reacted at 4 ° C overnight. After washing the plate, a labeled anti-interferon antibody recognizing IFN a and IFN] 3 was added and incubated for 1 hour. 2E6 positive cells showed higher interferon production than other cells. Therefore, the antigen recognized by monoclonal antibody 2E6 was confirmed to be a surface antigen specific to IPC.
  • the bone marrow cells were cultured in the same manner as in Example 2 IX 10 5 cells each, were dispensed into 96 well round bottom plate. Next, lg / mL of 2E6 monoclonal antibody and ⁇ of ODN-CpG (Phosphorothioate CpG ODN 1668; 5, -TCCATGACGTTCCTGATGCT-3) were added to each well and thymidine incorporation was measured 24 hours later. As a control, the proliferation ability of cells treated in the same manner using rat IgG instead of the monoclonal antibody was measured. Figure 5 shows the results. Cell growth when monoclonal antibody 2E6 was added No significant difference was observed.
  • CDNA is synthesized from the purified inRA by the Gubler-Hoffinan method, and EcoRI-Notl adapter (Invitrogen) is attached to both ends. After that, unreacted EcoRI adapter and 500 are attached by a span column (Chromaspin 400, Clontech). Short cDNAs of less than bases were removed.
  • the obtained cDNA having EcoRI sites at both ends was ligated to the EcoRI site of an expression vector for animal cells pME18s (excluding the XhoI fragment) by T4 ligase, and Escherichia coli DH10 was transformed by an electoral poration method.
  • This was cultured at 30 ° C with LB ⁇ carbenicillin (10 (g / ml) 50 Oml) at 30 ° C, and the plasmid was extracted and purified by QIA filter plasmid maxikit (manufactured by Qiagen) according to the protocol of the kit.
  • a cDNA library was obtained.
  • Plasmids were extracted and purified by a modified Hirt method (BioTechniques Vol. 24, 760-762, 1998).
  • the resulting plasmid was transformed into Escherichia coli DH10 by electroporation, cultivated in 100 ml of LB ⁇ carbenicillin (10 ( ⁇ g / ml) at 30 ° C, and incubated at 30 ° C.
  • the plasmid was extracted and purified using the plasmid midi kit (manufactured by Qiagen) according to the protocol of the kit.The above procedure was repeated for one cycle, and the same procedure was repeated four times.
  • the nucleotide sequence of the cDNA cloned on the obtained plasmid was determined, and the gene was determined by blast search with the nucleotide sequence information registered in the mouse gene database.
  • the clone to which the monoclonal antibody 2E6 had bound had the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence encoded by these nucleotide sequences is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 was almost identical to the nucleotide sequence of a molecule isolated as an NK receptor called Ly-49Q (GenBank Acc # .AB033769). The difference in the nucleotide sequences between the two was considered to be due to the difference in mouse species.
  • the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 encoded the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • FIG. 7 shows an alignment result of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) known as GenBank Acc # .AB033769.
  • Amino acid set forth in SEQ ID NO: 8 The sequence has the following mutation with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. 1 position Met deletion, 5 1 3 4 position lie replaced by Val,
  • the plasmid obtained by the above expression cloning method was again highly purified from Escherichia coli using the QIA filter plasmid midi kit (manufactured by Qiagen), and transfected again into COS cells. 48 hours later, the corresponding IPC-specific antibody and FITC-labeled anti-Rat secondary antibody were reacted according to the usual method, and FACS analysis was performed. The cDNA cloned on the plasmid was able to encode the antigen. I checked whether it was.
  • PCR was performed according to a standard method to confirm whether the antigen gene was specifically expressed in IPC.
  • the nucleotide sequences of the primers used for PCR are as follows.
  • Antisense primer SEQ ID NO: 4
  • Antisense primer SEQ ID NO: 6
  • the cells whose expression levels were compared are as follows. Cells, cell sorter
  • T cells CD3-positive cells (T cells), mouse IPC, and
  • CD8 positive cells CD8 positive cells, myeloid dendritic cells ("Myeloid" DC)
  • Blood cells were extracted from spleen cells and bone marrow of C57B6 and Balb / c mice.
  • the extracted blood cells were double-stained with anti-Ly-49Q monoclonal antibody 2E6 and antibodies recognizing various cell markers. The following markers were used as cell markers.
  • FIGS. 10 and 11 Cells stained for B220, Ly6c, Gr-1, CD4, CD19, CD3, CDllc, CDllb, and CD45RB were analyzed by FACScan. Some of the results are shown in FIGS. 10 and 11.
  • the vertical axis represents each marker
  • the horizontal axis represents the population of Ly-49Q positive cells.
  • IPC a group of cells positive for Ly-49Q-positive CD3 or CD1 lc
  • granulocytes derived from Balb / c mice in which Ly-49Q expression is observed can be distinguished from IPC as cells (R5) strongly stained for Gr-1.
  • the results of analysis of cells derived from C57B6 mice show that the monoclonal antibody 2E6 used in this example is not bound to granulocytes (FIG. 11). -Regarding IPC, regardless of the strain of the mouse, they are all monochrome. It can be detected by the null antibody 2E6 (R6 and R7). This result indicates that when targeting a cell group derived from a C57B6 mouse, the monoclonal antibody 2E6 can be used to specifically detect IPC in a cell group in which granulocytes coexist. That is, in the cell group derived from the C57B6 mouse, the monoclonal antibody 2E6 positive cells can be identified as IPC.
  • Ly-49Q is also expressed on granulocytes of C57B6 mice, it was suggested that the recognition epitope of 2E6 might be a site with a different structure between mouse strains. For example, differences in the sugar chains of Ly-49Q or the presence of polymorphism between C57B6 and Balb / c mice can be predicted as the reason for the difference in structure.
  • Gr-1 positive cells were extracted from bone marrow cells using AutoMACS. The following cells were separated from the obtained cells by double staining of Gr-1 and 2E6. A cell sorter was used for cell isolation.
  • the present invention provides a molecule useful as a mouse IPC marker.
  • No marker specifically found in mouse IPC was previously known.
  • the markers discovered by the present inventors make it possible to easily identify, detect, or separate mouse IPC.
  • the population of IPC in peripheral blood is extremely small. Therefore, identification and isolation of mouse IPC using a known monoclonal antibody required multiple stainings using multiple antibodies.
  • the marker provided by the present invention is a mouse
  • IPC differentiates into dendritic cells upon stimulation with virus or IL-3. Each of these stimuli induces differentiation into different dendritic cells. In other words, IPC has the ability to differentiate into various cells.
  • IPCs are progenitors that map to key cells in the immune system.
  • the marker of the present invention that facilitates the separation and identification of such IPCs has high industrial utility.
  • the induction mechanism of IPC differentiation can be elucidated using mouse IPC isolated using the marker according to the present invention as an indicator. If the mechanism of differentiation of human IPC can be elucidated based on the elucidated mechanism, there is a possibility that human IPC can be artificially regulated.
  • the antibody that recognizes the marker provided by the present invention has substantially no action of regulating the interferon-producing ability of mouse IPC.
  • IPC produces large amounts of interferon in the blood. Therefore, the marker of the present invention that enables the isolation of IPC without affecting the ability of the IPC to produce an interface contributes to the isolation of IPC as a research material.
  • a known monoclonal antibody that recognizes the BDCA-2 antigen has an action of suppressing the interferon-producing ability of human IPC. Provided monoclonal antibody that does not interfere with IPC's ability to produce interferon The value of the present invention is great.

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Abstract

本発明は、マウスのIPCのマーカーLy-49Qを提供する。Ly-49Qを指標として、マウスIPCを分離あるいは同定することができる。本発明におけるマーカーを認識する抗体は、マウスIPCのインターフェロン(IFN)産生能を調節する作用を有しない。この抗体により、IPCのIFNの産生能に干渉することなく、IPCを単離することが可能となった。

Description

マウスインターフェロン産生細胞の検出方法 技術分野
本発明は、 マウスのインターフヱロン産生細胞 (Interferon producing Cells;IPC)の 検出方法、 あるいは分離方法に関する。 背景技術
インターフェロンお (iFNa) やインターフェロン β (iFNp) は、 抗ウィルス活 性、 あるいは抗腫瘍活性を有する typelインターフェロンとして知られている。 ゥ ィルス感染に伴って、 これらのインターフヱロンを大量に産生する細胞として同 定されたのが IPCである。 IPCは、 次のように呼ばれることもある。
インターフェロン a / jS産生細胞 ；IFN- a I β producing Cell (IPC),
プラズマ細胞様樹状細胞 ； Plasmacytoid Dendritic Cell (PDC)、
タイプ 2樹状細胞前駆細胞 ； type 2 pre-DC (pDC2)、
ナチユラルインターフェ口ン産生細胞 ； Natural IFN producing Cell
IPCは血中にわずかしか存在していない。 末梢血リンパ球に占める IPCの割合は、 1 %以下と考えられている。 しかし IPCは、 きわめて高いインターフェロンの産生 能を有する。 IPCの IFN産生能は、 たとえば 3000pg/mL/106cellsに達する。 つまり、 細胞の数は少ないが、 血中 IFNaあるいは Π?Νβの大部分は、 IPCによってもたらさ れていると言って良い。
—方 IPCは、 樹状細胞 (dendritic cell)の前駆細胞に位置付けられる未分化のリンパ 球系由来の樹状細胞である。 IPCは、 ウィルス刺激によって成熟した樹状細胞に分 化し、 T細胞の分ィヒを促進し、 IFN-γと IL-10の産生を誘導する。 また IPCは、 IL-3 等の刺激によっても成熟した樹状細胞に分ィ匕する。 IL-3刺激によつて分化した樹 状細胞は、 T細胞の Th2分化を誘導し Th2サイ卜力イン (IL-4、 IL-5、 IL-10)の産生 を促進する。 このように IPCは、 刺激の違いによって異なる機能をもつ樹状細胞に 分化する性質を有している。
したがって IPCは、 インターフェロン産生細胞としての側面と、 樹状細胞の前駆 細胞としての 2つの側面を有する細胞である。 いずれも、 免疫システムにおいて 重要な役割を担っている。 つまり IPCは、 免疫システムを支えるための多様な機能 を有する重要な細胞の一つである。
IPCの免疫システムにおける重要性を裏付ける情報として、 AIDSの発症や重症 度との関連性が指摘されている。 たとえば AIDS患者では IPC細胞が減少している。 一方 HIVの感染があつても発症せずに長期間生存している患者では、 末梢血 IPCの 数は増加している。 つまり IPCが日和見感染や癌の発症予防に重要な役割を果たし てレヽること力示されてレ、る ^Depletion of circulation type I interferon-producing cells m HIV-infected AIDS patients (2001) Blood 98; 906)o このように、 IPCは、 免疫システ ムにおける重要な役割を有すると考えられている。
IPCは重要な研究対象である力 先に述べたように末梢血中にわずかしか存在し ないこと力 IPCの研究を妨げる大きな要因になっている。 ヒトから採取できる血 液細胞が限られていることは言うまでも無い。 特に IPCのようなわずかしか存在し ていない細胞は、 研究材料として貴重である。 発明の開示
ヒト由来の研究材料を得るのが難しいとき、 実験動物に代替材料を求めるのが 一般的である。 たとえば、 マウスのような安定供給が容易な実験動物に IPCを求め ることができれば、 IPCの研究を容易に進めることができる。 一般に、 細胞の検出 や分離のためには、 細胞特異的に発現している分子がマーカーとして利用される。 しかしマウス IPCの検出や分離を可能とするマーカーは知られていない。 本発明は、 マウス IPCのマーカーとすることができる分子を明らかにし、 更にそのマーカーを 利用するマウス IPCの検出方法あるいは分離方法の提供を課題とする。
ヒトにおいては、 既に IPCを認識する抗体が報告されている。 たとえば、 抗 BDCA-2モノクローナル抗体、 あるいは抗 BDCA-4モノクローナル抗体 (Dzionek A. et al. J. Immunol. 165:6037-6046,2000)は、 ヒト IPC特異モノクローナル抗体である。 このうち抗 BDCA-2モノクローナル抗体は、 ヒト IPCのインターフェロン産生を抑 制する作用を有することが明らかにされている。 また抗 BDCA-2モノクロ一ナル抗 体によつて認識される BDCA-2抗原をコ一ドする cDNAは、 IPC特異抗原としてク ローエングされている。 これら既知のモノクローナル抗体は、 ヒトの IPCのリサ一 チツールとしては有用である。 ところがヒト IPCに対するモノクローナル抗体はマ ウスの IPCを認識しない。 したがってマウスの IPCの解析には、 マウスの IPCのマ 一力一が必要である。
本発明者らは、 マウス IPCをラットに免疫することによって、 マウス IPCを特異 的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを樹立した。 またこ うして得られたハイプリ ドーマが産生するマウス IPCを認識するモノクローナル抗 体の中に、 IPCのィンターフェ口ン産生能に干渉しないものがあることを見出した。 そしてこれらのモノクローナル抗体によつて認識される分子がマウス IPCのマーカ 一として有用であることを確認して本発明を完成した。 すなわち本発明は、 以下 のマウス IPCの検出方法、 あるいは分離方法に関する。
〔1〕 次の工程を含む、 マウスのインターフヱロン産生細胞の検出方法。
(1) マウス血液細胞を含む生物学的試料に含まれる、 Ly-49Qを発現している 細胞を検出する工程、 および
(2) Ly-49Qの発現が検出された細胞をマウスのインターフエ口ン産生細胞と して検出する工程
〔2〕 Ly-49Qを発現している細胞を検出する工程が、 Ly-49Qを認識する抗体また はその抗原結合領域を細胞に結合させる工程を含む、 〔1〕 に記載の方法。 〔3〕 Ly-49Qを認識する抗体が、 モノクローナル抗体である 〔2〕 に記載の方法。 〔4〕 モノクローナル抗体が、 受託番号 FERM BP-8445として寄託されたハイプリ ドーマ 2E6が産生するモノクローナル抗体が認識する抗原決定基に結合するモ ノクローナル抗体である 〔3〕 に記載の方法。
〔 5〕 モノクローナル抗体が、 受託番号 FERM BP-8445として寄託されたハイブリ ドーマ 2E6が産生するモノクローナル抗体である 〔4〕 に記載の方法。
〔6〕 付加的に、 マウスリンパ球系榭状細胞、 マウス CD4+骨髄系樹状細胞、 およ ぴマウス CD4-骨髄系樹状細胞から選択された少なくとも 1種類の榭状細胞を 検出する工程を含む 〔1〕 に記載の方法。
〔7〕 マウスリンパ球系樹状細胞が、 CDl l c陰性、 CD4陰性、 および CD8陽性細 胞として同定される工程を含む 〔6〕 に記載の方法。
〔8〕 マウス CD4+骨髄系樹状細胞が、 CDl l c陰性、 CD4陽性、 および CD8陰性 細胞として同定される工程を含む 〔6〕 に記載の方法。
〔9〕 マウス CD4-骨髄系樹状細胞が、 CDl l c陰性、 CD4陰性、 および CD8陰性細 胞として同定される工程を含む 〔6〕 に記載の方法。
〔1 0〕 Ly-49Qを認識する抗体またはその抗原結合領域を含む、 マウスインター フエ口ン産生細胞検出用試薬。
〔1 1〕 付加的に、 マウスリンパ球系榭状細胞、 マウス CD4+骨髄系樹状細胞、 お よびマウス CD4-骨髄系樹状細胞から選択された少なくとも 1種類の樹状細胞 のマーカーを認識する抗体またはその抗原結合領域を含む 〔1 0〕 に記載の
〔1 2〕 マウスリンパ球系樹状細胞、 マウス CD4+骨髄系榭状細胞、 およびマウス CD4-骨髄系樹状細胞の細胞マーカーが、 CD4および CD8である 〔1 1〕 に記
〔1 3〕 次の工程を含む、 マウスのインターフェロン産生細胞の分離方法。
(1) マウスインターフェロン産生細胞を含む細胞集団に含まれる、 Ly-49Qを 発現している細胞を検出する工程、 および (2) Ly-49Qの発現が検出された細胞をマウスのインターフエ口ン産生細胞と して取得する工程
〔1 4〕 マウスインターフエ口ン産生細胞を含む細胞集団が、 顆粒球およぴマク 口ファージのいずれか、 または両方を含まない細胞集団である 〔1 3〕 に記 載の方法。
〔1 5〕 付加的に、 （3)顆粒球およびマクロファージのいずれか、 または両方を分 離する工程、 を含む 〔1 3〕 に記載の方法。
〔1 6〕 Ly-49Qを認識する抗体またはその抗原結合領域を含む、 マウスインター フヱロン産生細胞分離用試薬。
〔1 7〕 付加的に、 顆粒球のマーカーを認識する抗体またはその抗原結合領域、 およぴマク口ファージのマーカーを認識する抗体またはその抗原結合領域の いずれか、 または両方を含む 〔1 6〕 に記載の試薬。
〔1 8〕 受託番号 FERM BP-8445として寄託されたハイブリ ドーマ 2E6が産生する モノクローナル抗体が認識する抗原決定基に結合するモノクローナル抗体、 またはその抗原結合領域を含む断片。
〔1 9〕 受託番号 FERM BP-8445として寄託されたハイプリ ドーマ 2E6が産生する モノクローナル抗体、 またはその抗原結合領域を含む断片。
〔2 0〕 受託番号 FERM BP-8445として寄託されたハイプリ ドーマ 2E6を培養し、 培養物に含まれるィムノグロブリンを採取する工程を含む、 モノクローナル 抗体の製造方法。
本発明は、 マウスの IPCの検出方法あるいは分離方法に関する。 マウスの IPCは 次のような性状によって特徴付けられる細胞集団である。 したがって本発明は、 マウスの末梢血あるいは脾臓や骨髄などの血液細胞に由来する下記のような特徴 を有する細胞の検出あるいは分離を目的とする。
[細胞表面抗原のプロファイル]
_CDl lc、 B220、 Ly6C、 および CD45RBが陽性 — CDllb、 CD3、 CD19が陰性
[細胞の形態上の特徴]
一プラズマ細胞に似ている
一細胞表面が平滑な丸い細胞
一核が比較的大きい
[細胞の機能的な特徴]
—ウィルス感染時に、 短期間に大量の Type-1 interferonを産生する
一ウィルス感染後、 成熟した樹状細胞に分ィヒする
本発明らが見出したマウス IPCのマーカー分子を指標としてマウス IPCを検出す ることができる。 すなわち本発明は、 次の工程を含む、 マウスのインターフエ口 ン産生細胞の検出方法に関する。
(1)マウス血液細胞集団に含まれる、 Ly-49Qを発現している細胞を検出する 工程、 および
(2) Ly-49Qの発現が検出された細胞をマウスのィンターフェ口ン産生細胞とし て検出する工程
本発明において、 マーカーとは、 細胞の識別に利用することができる分子を言 う。 具体的には、 ある分子 Aが、 ある細胞 Aに検出され、 他の細胞 Bに検出され ないとき、 分子 Aは細胞 Aのマーカーである。 マーカーは、 細胞に特異的である ことが望ましい。 しかし、 異なる種類の細胞の間で、 共通して検出される分子で あってもマーカーとして利用することはできる。 たとえば、 共存する大部分の細 胞との識別が可能であれば、 マーカーとしては有用である。 マーカーは、 細胞に 存在するあらゆる分子の中から選択することができる。 中でも、 細胞表面に存在 する蛋白質や糖鎖は、 抗体などによって容易に検出できる好ましいマーカーとな りうる。
本発明のマウス IPCの検出方法は、 マウス IPCの計数、 同定、 並びに分離などに 利用することができる。 IPCは、 活性ィ匕によって細胞数が増加する。 したがって、 2003/009809
- 7 - その数を計数することによって、 IPCの活性を調節するための重要な情報を得るこ とができる。 たとえば、 生体内のマウス IPCの計数によって、 ある薬剤候補化合物 の IPCの増殖に対する影響を、 評価することができる。
本発明によるマウス IPCの検出方法に基いて、 マウス IPCを同定することができ る。 マウス IPCの同定も、 当該細胞の研究における重要な情報を与える。 たとえば、 マウス IPCに特異的に見出される新たな分子を探索するときに、 本発明によるマウ ス IPCの同定方法が有用である。 すなわち、 候補分子が本発明によって同定された 細胞に特異的に検出されれば、 当該分子はマウス IPC特異的に発現していることが 確認できる。
更に本発明は、 Ly-49Qをマーカーとして利用するマウス IPCの分離方法に関す る。 すなわち本発明は、 次の工程を含む、 マウスのインターフェロン産生細胞の 分離方法を提供する。
(1)マウス血液細胞集団に含まれる、 Ly-49Qを発現している細胞を検出する 工程、 および
(2) Ly-49Qの発現が検出された細胞をマウスのィンターフェ口ン産生細胞とし て取得する工程
本発明者らは、 マウス IPCに特異的に結合するモノクローナル抗体 2E6の認識抗 原をコードする遺伝子として、 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる cDNAを同 定した。 当該塩基配列は、 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列をコードしている。 更に配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と、 Ly-49Qとして報告されている Gr-1+ 細胞に発現するレセプターのァミノ酸配列 （配列番号： 8 ) との相同性は約 9 7 . 5 %であった。 両者の比較結果を図 7に示した。 したがって、 配列番号： 2に記 載のアミノ酸配列、 あるいは当該アミノ酸配列と高い相同性を有するアミノ酸配 列からなる蛋白質は、 マウス IPCにおける発現が見られる限り、 本発明におけるマ ウス IPCのマーカーとして利用することができる。 より具体的には、 本発明のマウ ス IPCマーカー Ly-490は、 以下に記載の a)-e)のいずれかに記載の蛋白質を含む。 a)配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域によってコードされたァミノ 酸配列を含む蛋白質
b)配列番号： 2または配列番号： 8に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質 c)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において、 1位 Metの欠失、 若しくは
9 4位 Serの Asnへの、 1 0 3位 Proの Leuへの、 1 1 4位 Asnの Aspへの、 1 3 4位 lieの Valへの、 2 3 0位 Lysの Thrへの、 そして 2 5 4位 Pheの Valへ の置換から選択される少なくとも一つのアミノ酸の置換を含むアミノ酸配 列を含む蛋白質
d)配列番号： 1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェ ントな条件でハイブリダィズし、 マウス IPCにおいて発現しているポリヌ クレオチドによってコードされる蛋白質
e)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と 9 5 %以上のホモロジ一を有するァ ミノ酸配列を含む蛋白質であって、 マウス IPCにおいて発現している蛋白 質
上記 d)のポリヌクレオチドは、 たとえば配列番号： 1に記載の塩基配列をもと に作製されたプローブのハイブリダイズを検出することにより同定することがで きる。 プローブには、 配列番号： 1に記載の塩基配列中、 好ましくは蛋白質コー ド領域の塩基配列で構成する。 プローブは、 当該塩基配列の任意の連続する部分 配列によって構成することができる。 プローブを構成する塩基配列の長さとして は、 例えば 50, 80, 100, 120， 150， または 200塩基を示すことができる。 更に、 配列 番号： 1に記載の塩基配列の全長をプローブとすることもできる。
d)のポリヌクレオチドは、 プローブとストリンジ工ントな条件でハイブリダイ ズするポリヌクレオチドを含む。 ハイブリダィゼーションのためのストリンジェ ントな条件としては、 例えば 5 X SSC、 7%(W/V) SDS、 lOO ^t g/ml変性サケ精子 DNA、 5 Xデンハルト液を含む溶液中、 48°C、 好ましくは 50°C、 より好ましくは 52°Cにおけるハイプリダイゼーシヨンを用いることができる。 その後ハイブリダ ィゼーシヨンと同じ温度、 より好ましくは 60°C、 さらにこの好ましくは 65°C、 最 も好ましくは 68°Cで 2 X SSC中、 好ましくは 1 X SSC中、 より好ましくは 0.5 X SSC中、 より好ましくは 0.1 X SSC中で、 振蘯しながら 1時間洗浄する。
あるいは本発明の Ly-49Qは、 配列番号： 2と高い同一性を有し、 かつマウス IPCで発現している蛋白質を含む。 本発明における高い同一性とは、 たとえば 9 0 %以上、 好ましくは 9 5 %以上、 更に好ましくは 9 7 %以上の同一性を言う。 ァミノ酸配列の同一性は、 例えば BLASTプログラム （Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410) を用いて決定することができる。 具体的には、 塩基配列 の同一性を決定するには blastnプログラム、 ァミノ酸配列の同一性を決定するには blastpプログラムが用いられる。 例えほ TCBI (National Center for Biothchnology Information) の BLASTのウェブページにおいて Low complexityを含むフィルターは 全て OFFにして、 デフォルトのパラメータを用いて検索を行う （Altschul, S.F. et al. (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L. et al. (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. (1997) Genome Res. 7:649-656) 。 例えば 2つの配列の比較を行う blast2sequencesプ ログラム （Tatiana A et al. (1999) FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) により、 2配 列のァライメントを作成し、 配列の同一性を決定することができる。 ギャップは ミスマッチと同様に扱い、 例えば蛋白質コード配列全体に対する同一性の値を計 算する。
Ly-49Qのような真核生物のタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列には、 し ばしば多型現象が認められることがある。 多型現象は遺伝子の塩基配列に見出さ れる小規模な塩基の置換で、 通常、 塩基の置換がタンパク質の活性に与える影響 は小さい。 このような多型等によつて塩基配列ゃァミノ酸に小規模な変異を生じ た Ly-49Qも、 それがマウス IPCにおいて発現している限り、 本発明における Ly- 49Qに含まれる。 たとえば既知のァミノ酸配列 (GenBank Acc#.AB033769)と配列番 号： 2に記載のアミノ酸配列の相違は、 多型によるものと予測される。 03 009809
- 1 0 - 配列番号： 2に記载のァミノ酸配列と高い同一性を有する蛋白質である Ly-49Q の構造は、 既に公知である (GenBank Acc#.AB033769)。 しかし Ly-49Qがマウス IPC のマーカーとして利用できることは、 本発明者らによって明らかにされた新規な 知見である。
本発明の検出方法あるいは分離方法において、 マーカーを検出するための方法 は任意である。 たとえば、 マーカーと特異的に結合することができるリガンドに よって、 マーカーを検出することができる。 Ly-49Qは、 NKレセプターとホモロジ 一のある分子として単離された蛋白質である。 したがって、 当該レセプターに結 合するリガンドも、 Ly-49Qの検出に利用することができる。 あるいは Ly-49Qをコ 一ドする塩基配列を含む mRNAの検出によって、 Ly-49Qの発現を検出することも できる。 配列番号： 1に記載の塩基配列、 あるいは GenBank Acc#.AB033769とし て公知の塩基配列を含む mRNAは、 ハイプリダイゼーションゃ PCRによつて検出 することができる。 細胞内の mRNAを検出するための、 WYMハイブリダィゼー シヨン、 あるいは wYi/ RT-PCRが公知である。 当業者は、 検出すべき mRNAの塩 基配列に基いて、 ハイブリダィゼーションに必要なプローブや RT-PCRのためのプ ライマーの塩基配列をデザィンすることができる。
更に、 マーカーを認識して結合する抗体は、 本発明におけるリガンドとして好 ましい。 抗体としては、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体、 あるいはそ れらの抗原結合領域を含む断片を用いることができる。 モノクローナル抗体は、 高度な均質性と反応特異性を期待できることから、 本発明におけるリガンドとし て好ましい。
本発明におけるモノクローナル抗体は、 当該モノクローナル抗体を産生する抗 体産生細胞から採取することができる。 本発明おけるモノクローナル抗体の産生 細胞は、 マウス IPCあるいは Ly-49Qを免疫原として免疫動物に投与し、 その抗体 産生細胞をクローユングすることによって取得することができる。 一般的なモノ ク口ーナル抗体の製造方法にぉレ、ては、 免疫細胞と腫瘍細胞との細胞融合によつ 2003/009809
- 1 1 - て得られるハイプリ ドーマが抗体産生細胞として利用される。
本発明における免疫原はマウス IPCである。 マウス IPCとは上記条件を満たす細 胞である。 このような細胞は、 たとえばマゥスの造血幹細胞を培養し、 IPCに分化 させることによって大量に得ることができる。 マウス造血幹細胞を in Wtroで IPCに 分ィ匕させるための条件は公知である
たとえば、 Troにおける造血幹細胞からのマウスの IPCの誘導が報告されてい る (Gilliet et al 2002, J. Exp. Med. 195: 953-958)。 あるいは m での IPCの誘導も公 知である (Bjorck らの Blood 2001, 98: 3520-3526)。 ただし、 これらの方法によって 誘導されたマウス IPCを免疫原に用いた報告は無い。 しかし本発明者らは、 in vitro で分化させたマウス IPCが、 IPCを認識するモノクローナル抗体を得るための免疫 原として有利であることを見出した。 特に、 この免疫原の使用によって、 マウス IPCのィンターフェロン産生能に影響を与えないモノクローナル抗体が得られるこ とは、 まったく予想されなかった。
具体的には、 造血幹細胞を含む細胞集団を IPC誘導剤の存在下で培養することに より、 IPCへの分化が誘導される。 造血幹細胞を含む細胞集団としては、 たとえば 骨髄細胞を用いることができる。 また IPC誘導剤には、 FLT-3リガンドを用いるこ とができる。 培地中の FLT-3の濃度は、 通常 1〜 1 0 O ng/mL、 5— 5 O ng/mL, 好ましくは 1 0— 3 O ng/mLとすることができる。 その他の培養条件は、 一般的 な血液細胞の培養条件を応用すればよい。 すなわち基礎培地としては、 RPMI1640 等を用い、 更に 10%程度の牛胎児血清を加えることができる。 IPCへの分化に要す る培養期間は、 たとえば 5— 2 0日、 通常 7— 1 5日程度である。
培養された造血幹細胞から、 IPCに分化した細胞を取得すれば、 免疫原のための IPCを得ることができる。 実際には、 いくつかの細胞表面マーカーを利用して、 IPCに特徴的な細胞表面抗原を有する細胞を分取する。 すなわち、 CDl lc陽性、 CDl lb陰性、 および B220陽性の細胞分画をセルソーターで分取し IPCを得ることが できる。 P T/JP2003/009809
- 1 2 - あるいは、 既にマウス IPC特異的であることが明らかな抗体を利用して、 当該抗 体陽性の細胞を IPCとして分取することもできる。 本発明のモノクローナル抗体を 産生するハイプリ ドーマ 2E6が産生するモノクローナル抗体は、 マウス IPCの分取 に利用することができる。 ハイプリ ドーマ 2E6の寄託情報は後に述べる。
IPCは、 マウスの末梢血から分取することもできる。 しかし先に述べたように IPCの抹消血におけるポピュレーションは極めて低いので、 末梢血から IPCを採集 するには多量のマウスの血液が必要となる。 したがって、 免疫原とする IPCには、 造血幹細胞から分化させた細胞を利用するのが有利である。
続いて分離されたマウス IPCを、 適当な免疫動物に免疫する。 マウス IPCは適当 なアジュパントとともに免疫動物へ投与することができる。 本発明における免疫 動物は、 マウス IPCを異物と認識するあらゆる非ヒト脊椎動物を利用することがで きる。 モノクローナル抗体を得るためには、 ハイブリ ドーマとするための融合パ 一トナーの入手が容易な動物が有利である。 たとえば、 ラット、 ラビット、 ゥシ、 ャギなどの細胞に由来するハイプリ ドーマの樹立が確立されている。 これらの免 疫動物を、 本発明に用いることができる。 一方アジュバントには、 フロイントの 完全アジュバントゃフロイントの不完全アジュバント等が用いられる。
免疫動物は、 3〜1 0日間隔で複数回免疫される。 1回の免疫に用いられる IPC の数は、 任意である。 通常、 1 0 3〜1 0 8、 たとえば 1 0 6の IPCが免疫される。 複数回の免疫を経た免疫動物から免疫担当細胞を回収し、 目的とする抗体を産生 する細胞をクローニングすることにより、 本発明のモノクローナル抗体を得るこ とができる。
あるいは、 本発明者らによって明らかにされた IPCマーカー Ly-49Qを免疫原と して、 本発明に必要な抗体を得ることができる。 たとえば配列番号： 2に記載の アミノ酸配列からなる蛋白質、 または当該アミノ酸配列から選択された連続する ァミノ酸配列からなるオリゴぺプチドを免疫原として、 本発明におけるモノク口 ーナル抗体を得ることができる。 蛋白質あるいはオリゴペプチドは、 必要に応じ て担体に結合し、 更にアジュパントとともに免疫動物に投与することができる。 また、 Ly-49Qを強制発現させた形質転換細胞を免疫原として利用することもで きる。 たとえばラットを免疫動物とするときには、 ラット由来の細胞を Ly-49Qを コードする DNAで形質転換して免疫原とすることができる。 形質転換細胞による 免疫操作は、 上記のマウス IPCを免疫原とする場合と同様である 次いで、 複数回 の免疫を経た免疫動物から免疫担当細胞を回収し、 目的とする抗体を産生する細 胞をクローニングすることにより、 本発明のモノクローナル抗体を得ることがで きる。 免疫担当細胞とは、 免疫動物において抗体産生能を有する細胞を言う。
免疫担当細胞は、 たとえばハイプリ ドーマ法によってクローニングすることが できる。 免疫担当細胞は、 1つの細胞が 1種類の抗体を産生している。 したがつ て、 1つの細胞に由来する細胞集団を確立する （すなわちクロー-ング） ことが できれば、 モノクローナル抗体を得ることができる。 ハイブリ ドーマ法とは、 免 疫担当細胞を適当な細胞株と融合させ、 不死化 (immortalize)した後にクローニング する方法を言う。 ハイプリ ドーマ法に有用な多くの細胞株が知られている。 これ らの細胞株は、 リンパ球系細胞の不死ィヒ効率に優れ、 かつ細胞融合に成功した細 胞の選択に必要な各種の遺伝マーカーを有している。 更に抗体産生細胞の取得を 目的とする場合には、 抗体産生能を欠落した細胞株を用いることもできる。
たとえばマウスミエローマ P3x/63Ag8.653は、 マウスゃラットの細胞融合法に有 用な細胞株として広く用いられている。 本発明においては、 マウスの IPCを免疫原 としているので、 免疫動物はマウス以外の動物となる。 一般にハイブリ ドーマは、 同種の細胞の融合によって作成されるが、 近縁の異種間でのヘテロハイブリ ドー マからモノクローナノレ抗体を取得することもできる。
細胞融合の具体的なプロトコルは公知である。 すなわち、 免疫動物の免疫担当 細胞を適当な融合パートナーと混合し、 細胞融合させる。 免疫担当細胞には、 脾 細胞や末梢血 B細胞などが用いられる。 融合パートナーとしては、 先に述べた各種 の細胞株を利用することができる。 細胞融合には、 ポリエチレングリコール法や、 電気融合法が用いられる。
次に、 融合細胞が有する選択マーカーに基づいて、 細胞融合に成功した細胞が 選択される。 たとえば HAT感受性の細胞株を細胞融合に用いた場合には、 HAT培 地において成育する細胞を選択することによって、 細胞融合に成功した細胞が選 択される。 更に選択された細胞が産生する抗体が、 目的とする反応性を有してい ることを確認する。
各ハイプリ ドーマは、 抗体の反応性に基づいて、 スクリーニングされる。 すな わち、 IPCに対して特異的な結合活性を有する抗体を産生するハイプリ ドーマが選 択される。 好ましくは、 選択されたハイプリ ドーマをサブクローニングし、 最終 的に目的とする抗体の産生が確認された場合に、 本発明のモノクローナル抗体を 産生するハイプリ ドーマとして選択する。
本発明において目的とするモノクローナル抗体は、 Ly-49Qに結合する。 抗体の 特定の抗原に対する結合活性は、 任意の方法によって確認することができる。 た とえば ELISAによって目的とする反応性を有する抗体をスクリーニングする方法 が公知である。 具体的には、 Ly-49Qあるいはそのドメインペプチドを結合したマ イク口プレートを用意する。 次に、 ハイプリ ドーマの培養上清をこのプレートに 分注する。 マウスのィムノグロプリンが検出された上清をスクリーユングの対象 とすれば、 より効率的なスクリーニングが期待できる。 もしも培養上清中に目的 とする反応性を有する抗体が含まれていれば、 それはマイクロプレートに結合さ れた Ly-49Qに結合する。 プレートに結合したラットイムノグロブリンは、 抗ラッ トイムノグロブリン抗体によって検出することができる。
更に、 Ly-49Qを強制発現させた形質転換細胞を用いて、 目的とする細胞を選択 することもできる。 具体的には、 まず Ly-49Qを強制発現させた形質転換細胞を、 ハイプリドーマの培養上清と接触させる。 目的とする反応性を有する抗体は、 形 質転換細胞に結合する。 細胞に結合した抗体は、 標識された抗ラットイムノグロ プリン抗体によって検出される。 マウス IPCの分離においては、 分離の過程で IPCのィンターフェ口ン産生能に干 渉しないことが重要である。 カロえて、 分離の過程で IPCの增殖や細胞障害を誘導し ないことが望ましい。 IPCは、 そのインターフェロンの産生能の調節が科学的にも、 また産業上も最も大きな興味の対象であると言って良い。 つまり、 IPCのインター フエロンの産生能を調節するための研究が、 IPC単離の大きな目的となる。 したが つて、 単離の段階で IPCのィンターフェロン産生能に影響を与えない抗体を用いる ことは、 重要な条件である。 逆にインターフェロン産生能に干渉する抗体によつ て単離された IPCは、 分離の段階で既にそのインターフェロンの産生能を抗体によ つて調節されてしまっている可能性がある。 このような IPCは、 インターフェロン の産生能の調節に関する研究のための材料としては適切とは言えない。 他方、 抗
Ly-49Q抗体は IPCのインターフェロン産生に干渉しないので、 本発明によって分 離されたマウス IPCは、 研究材料として理想的である。 。
同様に、 IPCの細胞増殖能に対して干渉しない抗体も、 細胞の単離のためのツー ルとして有用である。 抗 Ly-49Q抗体は、 IPCの細胞増殖に対しても影響を与えな いことから、 IPCの単離において有用である。
モノクローナル抗体のィンターフェロン産生を調節する活性は、 実際に IPCにモ ノクローナル抗体を作用させることによって確認することができる。 IPCは、 ウイ ルスの刺激によってインターフェロンを大量に産生する。 このとき、 インターフ ェ口ン産生能を調節する作用を有する抗体が存在すれば、 抗体を加えない対照と 比較して、 IPCのインターフェロンの産生量が変化する。 またもしもモノクローナ ル抗体が IPCのィンターフェロン産生能に干渉しない場合には、 IPCのィンターフ ェ口ン産生活性は実質的に影響を受けない。
たとえば、 インフルエンザウイルスなどの、 マウス細胞に感染性を有する細胞 を IPCに加えると、 マウス IPCはインターフェロンを産生する。 産生されたインタ 一フエロンは、 たとえばィムノアッセィによって測定することができる。 当業者 は、 ELISAなどの原理に基づいて、 容易にインターフェロンを測定することがで きる。
本発明において、 インターフェロン産生活性の調節とは、 活 I1生の抑制、 または 促進を言う。 モノクローナル抗体が IPCのィンターフェ口ン産生活性の調節作用を 有することは次のようにして確認することができる。
IPCはウィルスの刺激によってインターフェロンを大量に産生する。 IPCに対す るウィルス刺激の前、 後、 あるいはウィルス刺激と同時にモノクローナル抗体を 与え、 モノクローナル抗体を与えない IPCを対照として、 インターフェロンの産生 能を比較する。 インターフェロン産生能は、 IPCの培養上清中に含まれる IFN-αや IFN-βを測定することによって評価することができる。 比較の結果、 モノクローナ ル抗体の添加によって、 上清中のインターフヱロンの量が有意に変化すれば、 当 該モノクローナル抗体は、 ィンターフェロン産生能を調節する作用を有すること が確認できる。 これらインターフェロンの測定方法は公知である。 Ly-49Qを認識 する抗体は、 このようにしてィンターフヱロンの産生能に対する影響を比較した ときに、 対照と比較してインターフエ口ンの産生レベルに有意な差が見られない。
IPCは IFNひ、 および IFN i3などの複数種のインターフェロンを産生する。 本発 明においては、 これら IPCが産生するィンターフェ口ンの産生能に対して実質的に 影響を与えない場合に、 そのモノクローナル抗体が IPCのィンターフェロン産生能 を調節する作用を実質的に有しないと言う。 本発明者らが見出した IPCマーカー Ly-49Qを認識するモノクローナル抗体は、 特に IFN αおよぴ IFN ]3の産生能に干渉 しない。 インターフェロンの産生能に対して実質的に影響を与えないとは、 当該 モノクローナル抗体の有無によって、 ウィルス刺激を受けた後の IPCのィンターフ エロン産生能に有意な差が見られないことによって裏付けられる。
更に IPCマーカー Ly-49Qを認識する抗体は、 IPCに結合して IPCの増殖を誘導し ない。 モノクローナル抗体と結合した IPCの増殖能は、 細胞の増殖を観察すること によって確認することができる。 細胞増殖の確認方法は公知である。 たとえば、 H3チミジンの細胞による取りこみを指標として、 細胞の増殖活性を評価すること ができる。 モノクローナル抗体を接触させた IPCと、 対照とを比較して、 細胞の増 殖能に有意な差が見られなければ、 当該モノクローナル抗体は、 IPCの増殖能に実 質的に影響を有していないことが確認できる。 対照としては、 IPCに対して結合し ないことが明らかなラット IgGなどを用いることができる。
本発明の望ましいモノクローナル抗体として、 次のハイブリドーマが産生する モノクローナル抗体を示すことができる。 本発明の IFN産生に影響を与えないモノ クローナル抗体を産生するハイブリドーマ 2E6は、 次のとおり寄託した。 2E6は、 サプクラス IgG 2a κ鎖を有するモノクローナル抗体を産生するラットーマウスへテ 口ハイプリドーマである。
(A)寄託機関の名称 ·あて名
名 称：独立行政法人産業技術総合研究所内特許生物寄託センター あて名： 郵便番号 305- 8566
日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 1号中央第 6
(B)寄託日 （原寄託日） ： 2002年 8月 1日
(C)受託番号： FERM BP-8445
また本発明は、 本発明者らが樹立したハイプリ ドーマが産生する前記モノクロ ーナル抗体と同様の結合活性を有するモノクローナル抗体を提供する。 すなわち 本発明は、 ハイブリドーマ 2E6が産生するモノクローナル抗体が認識するマウスの インターフエ口ン産生細胞特異抗原またはその抗原決定基に結合するモノクロー ナル抗体、 またはその抗原結合領域を含む断片を提供する。
このようなモノクローナル抗体は、 当該ハイプリ ドーマから抗体の抗原結合領 域をコードする cDNAを取得し、 これを適当な発現ベクターに揷入することによつ て発現させることができる。 抗体の可変領域をコードする cDNAを取得し、 適当な 宿主細胞に発現させる技術は公知である。 また抗原結合領域を含む可変領域を、 定常領域と結合させることによってキメラ抗体とする手法も公知である。
更に、 本発明のモノクローナル抗体の抗原結合活性を他のィムノグロプリンに 03 009809
- 1 8 - 移植することもできる。 ィムノグロプリンの抗原結合領域は、 相補性決定領域
(CDR)と、 フレーム領域で構成されている。 各ィムノグロプリンの抗原結合特性 は CDRによって決定されており、 フレームは抗原結合領域の構造を維持している。 CDRのァミノ酸配列がきわめて多様性に富むのに対して、 フレーム部分のァミノ 酸配列は高度に保存されている。 CDRの抗原を他のィムノグロブリン分子のフレ ーム領域に組み込むことによって、 抗原結合活性も移植できることが知られてい る。 この方法を利用して、 異種のィムノグロブリンが有する抗原結合特性をヒ ト ·ィムノグロブリンに移植する方法が確立されている。
このようにして作成された、 様々なモノクローナル抗体はいずれも本発明に含 まれる。 すなわち、 本発明のモノクローナル抗体の抗原結合領域をコードする cDNAに由来するポリヌクレオチドによってコードされた抗原結合領域を含むィム ノグロブリンからなるモノクローナル抗体は本努明に含まれる。
更に、 ハイブリ ドーマ 2E6が産生するモノクローナル抗体が認識するマウスの IPC特異抗原 Ly-49Qまたはその抗原決定基に結合するモノクローナル抗体、 また はその抗原結合領域を含む断片は、 その由来に関わらず本発明に利用することが できる。 すなわち、 これら特定のハイブリ ドーマ以外に由来するィムノグロプリ ンであっても、 上記抗原または抗原決定基に結合するモノクローナル抗体は本発 明に利用することができる。 このようなモノクローナル抗体は、 たとえば次のよ うにして得ることができる。
まず上記と同様の手法によつて Ly-49Qと結合するモノクローナル抗体を得る。 そして得られたモノクローナル抗体が、 上記ハイプリ ドーマが産生するモノクロ ーナル抗体と同一の抗原に結合していることを確認すればよい。 モノクローナル 抗体の反応 I1生は、 たとえば、 競合や吸収によって比較することができる。 すなわ ち、 モノクローナル抗体 2E6と IPCまたは Ly-49Qとの結合がある抗体によって競合 阻害を受けるとき、 この抗体はモノクローナル抗体 2E6と同一の抗原を認識してい ると考えられる。 あるいは、 ある抗体と結合した IPCが、 モノクローナル抗体 2E6 との結合活性を失うとき、 この抗体はモノクローナル抗体 2E6と同一の抗原を認識 している。
本発明は、 上記本発明に含まれるモノクローナル抗体を産生するハイプリ ドー マを提供する。 本発明者らが樹立したハイプリ ド は、 先に述べたように寄託 されている。 しかしこれらの特定のハイブリ ドーマに関わらず、 上記本発明のモ ノクローナノレ抗体を産生するハイプリ ドーマは本発明に含まれる。
更に本発明は上記ハイプリ ドーマを培養しその培養物からモノクローナル抗体 を回収する工程を含む、 モノクローナ 抗体の製造方法に関する。 ハイプリ ドー マは、 z'« 7roまたは vz'wで培養することができる。 Troにおいては、
RPMI1640などの公知の培地を用いて、 ハイプリ ド を培養することができる。 培養上清には当該ハイプリ ドーマが分泌したィムノグロプリンが蓄積される。 し たがって、 培養上清を採取し、 必要に応じて精製することにより、 本発明のモノ クローナル抗体を得ることができる。 培地には、 血清を添加しない方が、 ィムノ グロブリンの精製が容易である。 し力 し、 ハイプリ ドーマのより迅速な増殖と、 抗体産生の促進を目的として、 1 0 %程度のゥシ胎児血清を培地に加えることもで きる。
ハイプリ ド は、 ' において培養することもできる。 具体的には、 ヌー ドマウスの腹腔にハイプリド を接種することにより、 腹腔内でハイプリ ドー マを培養することができる。 モノクローナル抗体は、 腹水中に蓄積する。 したが つて、 腹水を採取し、 必要に応じて精製すれば、 本発明のモノクローナル抗体を 得ることができる。 得られたモノクローナル抗体は、 目的に応じて適宜、 修飾、 あるいは加工することができる。
本発明において、 マウス IPCの検出とは、 試料を構成する細胞にマウス IPCが含 まれることを確認することを言う。 したがって、 マウス IPCの検出により、 ある細 胞がマウス IPCであると同定することができる。 また、 複数種類の細胞で構成され る細胞集団に占めるマウス IPCの数を定量することができる。 IPCの検出は、 IPC の数的な変動の把握に有用である。 たとえば IPCの数と、 AIDSの発症や重症度と の関連性が指摘されていることを先に述べた。 すなわち、 AIDS患者における日和 見感染の発症率は、 CD4+ T細胞のみならず IPCの減少によっても上昇することが 報告された。 本発明の検出方法は、 たとえば次のようにして実施することができ る。
細胞試料を抗 Ly-49Q抗体と接触させ、 試料中のマウス IPCに抗 Ly-49Q抗体を結 合させる。 抗 Ly-49Q抗体としては、 その抗原結合領域を含む断片を用いることも できる。 本明細書においては、 特に断らない限り、 抗 Ly-49Q抗体とは、 その抗原 結合領域を含む断片も含む。 細胞試料と抗 Ly-49Q抗体は、 抗体の免疫学的結合活 性が維持できる条件下で接触させられる。 具体的には、 弱酸性〜弱アルカリ性の p Hで、 かつ生理食塩水に近い塩濃度のもとで接触させるのが望ましい。 細胞試 料には、 マウス IPCを含む可能性があるあらゆる試料を用いることができる。 たと えば、 末梢血のリンパ球集団、 リンパ節、 脾臓、 あるいは骨髄等のリンパ系組織 を試料とすることができる。 これらの細胞試料の調製方法は公知である。 あるい は、 造血幹細胞を、 IPCに分化させて細胞試料とすることもできる。 造血幹細胞を 含む細胞集団を、 in vitroで、 あるいは// において IPCに分化させる方法は公知 である。 人為的に分ィ匕させた IPCの検出あるいは同定は、 IPCへの分ィ匕に必要な条 件の探索において有用である。
次いで、 細胞に結合した抗 Ly-49Q抗体が検出される。 例えば抗 Ly-49Q抗体を標 識し、 当該標識を追跡することによりマウス IPCを検出することができる。 抗体を 標識する方法は公知である。 抗体は、 たとえば酵素、 蛍光物質、 発光物質、 結合 親和性物質、 マイクロビーズ、 あるいはラジオアイソトープ等の成分によって標 識することができる。 これらの成分を抗体に結合する方法も公知である。 たとえ ば、 マレイミド誘導体等の 2官能性試薬を用いて、 酵素、 蛍光物質、 あるいはマ イク口ビーズ等を抗体に直接結合させることができる。 あるいは、 マイクロビー ズの表面に抗 Lv- 49Q抗体を物理吸着させることもできる。 その他、 抗 Ly-49Q抗体を、 適当な固相に結合しておくこともできる。 プレート やチューブの内壁、 カラムやキヤビラリ一の内壁、 あるいはビーズ状の固相の表 面などが固相として利用される。
抗 Ly-49Q抗体は、 間接的に標識することもできる。 たとえば、 ラット由来のモ ノクローナル抗体は、 ラットイムノグロプリンを認識する標識抗体によって、 間 接的に標識することができる。 本発明のモノクローナル抗体を間接的に標識する ための標識抗体は、 一般に二次抗体と呼ばれる。
本発明によるマウス IPCの検出方法において、 抗 Ly-49Q抗体の標識は、 各標識 成分に応じた手法を利用することにより、 追跡することができる。 たとえば、 蛍 光物質であれば、 励起光の照射により、 蛍光を検知することができる。 酵素標識 の場合には、 酵素反応の生成物を指標として、 標識の追跡が可能である。
標識の検知に先立ち、 抗体と反応した細胞を分離することもできる。 細胞の分 離には、 異なる細胞表面抗原を認識する抗体を利用することもできる。 すなわち、 マウス IPC特異的な抗 Ly-49Q抗体と、 マウス IPCを認識する任意の抗体の組み合せ が利用される。 たとえば、 ある細胞集団をビーズに固定ィ匕した抗 Ly-49Q抗体と接 触させて、 マウス IPCを特異的に捕捉する。 次に、 捕捉したマウス IPCに対して、 マウス IPCを認識する任意の抗体を結合させる。 マウス IPCを認識する任意の抗体 を標識抗体としておけば、 マウス IPCの検出が可能である。
マウス IPCを認識する任意の抗体は必ずしもマウス IPCに特異的な抗体でなくて も良い。 たとえば、 マウス IPCは CD11 c、 B220、 Ly6cおよび CD45RBが陽性の細 胞である。 したがってこれらの細胞表面抗原を認識する任意の抗体を、 マウス IPC を認識する任意の抗体として利用することができる。 これらの細胞表面抗原はマ ウス IPCに特異的なマーカーではない。 しかし、 本発明における分離方法における マウス IPCに対する特異性は、 抗 Ly-49Q抗体との反応性によつて保障される。
本発明において、 抗 Ly-49Q抗体はマウス IPCの検出用試薬とすることができる c 本発明のマウス IPCの検出用試薬における抗 Ly-490抗体は、 上記のような標識成 分で標識しておくことができる。 あるいは、 二次抗体と組み合せて供給すること もできる。 本発明のマウス IPCの検出に用いる抗 Ly-49Q抗体は、 その抗原結合領 域を含む任意の断片とすることができる。 したがって、 完全なィムノグロプリン 分子のみならず、 ィムノグロプリンの抗原結合活性を保持した断片を用いること ができる。 このような断片としては、 たとえば F(ab)2や、 Fab等を示すことができ る。
マウス IPCの検出方法を利用して、 マウスの樹状細胞のサブタイプを識別するこ とができる。 現在のところ、 IPCを含むマウスの榭状細胞には、 以下のようなサブ タイプがあるとされている。
(1) IPC
(2) リンパ球系樹状細胞（"Lymphoid" DCs)
(3) CD4+骨髄系樹状細胞（CD4 positive "Myeloid" DCs)
(4) CD4-骨髄系樹状細胞（CD4 negative "Myeloid" DCs)
これらの榭状細胞の分化過程を図 8にまとめた。 IPCがリンパ球系の樹状細胞と 位置づけられるのに対して、 その他の樹状細胞はいずれも骨髄系の細胞である。 いずれの細胞も免疫応答において重要な役割を有すると考えられている。 しかし、 そのメカニズムに関する情報は多ぐない。 様々な刺激を与えたマウスや、 免疫機 能に異常を有する疾患モデルマゥスにおける、 これらのサブタィプのポピュレー シヨンの変化は、 メカニズムの解明における重要な情報となる。 したがって、 本 発明に基く IPCの検出方法を利用した榭状細胞のサブタイプの識別は、 マウスにお ける免疫システムの解明に有用である。
本発明を利用して、 樹状細胞のサブタイプを識別するための方法として、 次の ような方法を示すことができる。 たとえば、 識別すべき榭状細胞のサブタイプの 細胞表面マーカーを利用して、 各サブタイプを識別することができる。 図 8に示 した (1)-(4)の各樹状細胞は、 それぞれ図中に記載した細胞表面マーカーを有して いる。 したがって、 これらの細胞表面マーカーを適宜組み合わせることによって、 相互に識別することができる。 まず、 Ly-49Qと CDllcの 2つのマーカーを使って、 両者がポジティブな細胞として IPCが同定される （図 9 B上） 。 次に CDl l cのみ がポジティブである細胞に対して、 CD8と CD4の 2つのマーカーを適用すると、 以下のような組み合わせにより 3種類の樹状細胞を同定することができる （図 9 B下） 。 このように、 Ly-49Qを IPCのマーカーとして利用することによって、 樹 状細胞のサブタイプを容易に識別できることが明らかである。
CD4 CD8
(2) リンパ球系樹状細胞 - +
(3) CD4+骨髄系樹状細胞 + -
(4) CD4-骨髄系樹状細胞 - - これらのサブタイプの識別のために用いられる少なくとも 1つの抗体を、 Ly- 49Qを認識する抗体とともに組み合わせて、 樹状細胞の識別用試薬として供給す ることができる。 たとえば、 CDl lc、 CD4、 および CD8を認識する抗体から選択さ れる少なくとも 1つの抗体は、 樹状細胞識別用の試薬を構成する抗体として好ま しい。
更に、 本発明によるマウス IPCの検出方法によって、 組織や生体内におけるマウ ス IPCの局在を明らかにすることもできる。 IPCの生体内におけるポピユレーショ ンは小さい。 そのため、 IPCの機能や局在に関する情報は、 きわめて限られている。 そこで抗 Ly-49Q抗体を標識し、 糸且織あるいは生体内における挙動を追跡すること によって、 IPCの局在を明らかにすることは重要である。
すなわち本発明は、 次の工程を含む、 IPCの局在の解析方法を提供する。
(1)生体または生体から採取された組織試料に抗 Ly-49Q抗体を投与または接触 させる工程、 および
(2)抗 Ly-49Q抗体を追跡し、 抗体が局在した領域に IPCが局在していると判定す る工程
生体内の局在の解析においては、 抗 Ly-490抗体は、 放射性同位元素や磁性金属 によって標識される。 放射性同位元素は、 その放射活性を追跡することによって、 局在を画像化することができる。 一方、 磁性金属標識は核磁気共鳴イメージング (MR-I)によつて画像化することができる。 抗体をこのような標識物質で修飾する 方法は公知である。 本発明におけるマウス IPCマーカ一 Ly-49Qを認識する抗体は、 マウス IPCの IFN産生能あるいは増殖に干渉しないため、 生体に投与しても IPCの 举動に干渉しない。 したがって、 生体内局在の解析に当たって、 抗体の結合に起 因する干渉の可能性を排除することができる。
あるいは生体外に取り出した試料における IPCの局在を知るためには、 蛍光色素 や酵素活性物質で標識された抗体を用いることもできる。 このような解析方法は、 免疫染色法として公知である。
抗 Ly-49Q抗体を、 抗体が由来する生物種とは異なる宿主に投与する場合には、 当該宿主にとつて異物と認識されにくレヽ形に加工するのが望ましレ、。 たとえば、 次のような分子に加工することにより、 ィムノグロプリンを異物として認識され にくくすることができる。 ィムノグロプリン分子を以下のように加:!:する手法は 公知である。
一定常領域を欠失した抗原結合領域を含む断片
—モノクローナル抗体の抗原結合領域と宿主のィムノグロプリンの定常領域 とで構成されるキメラ抗体
一宿主のィムノグロプリンにおける相補性決定領域 (CDR)をモノク口ーナル 抗体の CDRに置換した CDR置換抗体
続いて、 本発明によるマウス IPCの分離方法について述べる。 本発明の分離方法 において、 抗 Ly-49Q抗体は、 前記検出方法における抗体と同様に、 標識成分や固 相に結合することができる。 マウス IPCを含む細胞集団と抗 Ly-49Q抗体を結合さ せた後に、 抗体と結合した細胞を分取することによって、 マウス IPCを分離するこ とができる。 たとえば、 標識成分と結合させた抗 Ly-49Q抗体を用いる場合には、 標識成分を追跡し、 標識成分が結合している細胞を分取することによって、 マウ ス IPCを分離することができる。 固相と結合させた抗 Ly-49Q抗体を利用する場合 には、 固相を回収すれば、 マウス IPCが分離される。
続いて、 抗 Ly-49Q抗体を利用したマウス IPCの分離手法を、 具体的に述べる。 たとえば、 水不溶性担体に抗 Ly-49Q抗体を固定化し、 これに細胞を直接的または 間接的に結合させる方法を利用することができる。 水不溶性担体には、 セルロー ス誘導体ゃァガロース等からなるビーズやマトリックス等が利用される。 抗 Ly- 49Q抗体を固定化した水不溶性担体は、 カラムに充填して免疫吸着力ラムとする こともできる。 不溶性担体上のモノクローナル抗体に捕捉されたマウス IPCは、 免 疫学的な結合を解離させる緩衝液によって溶出することができる。
あるいは蛍光抗体標識細胞分離法や、 免疫磁気ビーズによる分離法を利用する こともできる。 すなわち、 抗 Ly-49Q抗体が結合した細胞を蛍光標識や磁気標識を 目印に、 目的とする細胞を一つ一つ分離する方法である。 これらの分離法には、 FACSや MACSなどのセルソーターを用いるのが有利である。 セルソーターを用い た細胞の分離方法は公知である。
例えば AutoMACSによる細胞の分離においては、 マウス IPCを含む細胞集団に、 抗 Ly-49Q抗体を接触させる。 細胞を PBSで洗浄後、 次いでピオチン化抗ラット IgG 抗体 （二次抗体） を反応させる。 あるいは、 予めピオチン化した抗 Ly-49Q抗体を 利用すれば、 二次抗体は不要である。 さらに、 細胞を PBSで洗浄後、 ストレプト アビジンマグネティックビーズを反応させる。 こうしてマウス IPCには、 マグネテ イツクビーズが結合される。 得られた細胞を磁気カラムに通すことにより、 カラ ムに捕捉することができる。
このカラムを洗浄した後、 カラムに残った細胞を溶出させれば、 マウス IPCを回 収することができる。 実際に本発明者らは、 このような方法に基づいて、 マウス
IPCを高い収率で分離できることを確認している。 たとえばマウス末梢血リンパ球 集団における IPCのポピュレーシヨンは 1 %以下である。 抗 Ly-49Q抗体を利用し た細胞分離方法によって、 IPCのポピュレーションを 7 0 %以上にまで高めること ができる。 しかも、 MACSを利用した場合には、 操作は 3 0分間程度で完了する。 つまり本発明の分離方法は、 生体中にはわずかしか見出すことのできない IPCを大 量に調製するための方法として有用である。
マウス IPCを分離するための細胞集団としては、 IPCを含む可能十生のあるあらゆ る細胞集団を利用することができる。 具体的には、 たとえば、 末梢血、 脾臓組織、 骨髄などの生体由来の細胞集団を利用することができる。 あるいは、 生体外で人 為的に誘導された IPCを含む細胞集団を利用することもできる。 細胞集団が IPC以 外の、 Ly-49Q陽性細胞を含む場合には、 予め当該細胞を除去することができる。 たとえば、 顆粒球 (Granulocyte)やマクロファージ (Macrophage)は、 IPCとの細胞の 大きさの違いを利用して予め分離しておくことができる。 細胞の大きさの違いに 基く分離方法としては、 密度勾配遠心分離法などを利用することができる。
また細胞表面マーカーを利用した細胞の分離を利用することもできる。 たとえ ば (1)B220、 （2)CD45RB、 および (3)CDllc陽性の細胞の選択によって IPCが選択さ れ、 顆粒球およびマクロファージが除かれる （ポジティブセレクション） 。 ある いは、 CD1 lb細胞を除去すれば、 IPCに混在する顆粒球おょぴマクロファージを特 異的に除去することができる （ネガティブセレクション） 。 その他、 脾臓由来の 細胞群を対象とする場合には、 CD19陽性細胞と CD3陽性細胞を除くことによって、 それぞれ B細胞と T細胞が除カゝれる。
本発明の IPCの分離方法によつて分離された IPCは、 他の細胞を除く工程を組み 合わせることによって、 更に純度を高めることができる。 たとえば、 IPCと混在す る細胞との識別が可能なマーカーを利用して、 他の細胞を除くことができる。 本 発明による IPCの分離方法においては、 たとえば、 顆粒球ゃマク口ファージが混在 する可能性がある。 したがって、 これらの細胞は有するが、 IPCには見出せないマ 一力一を利用して、 IPCを精製することができる (negative selection)。 このようなマ 一力一を、 ネガティブセレクションマーカーと言う。 ネガティブセレクションマ 一力一として、 たとえば CDl lbを示すことができる。 - 2 1 - すなわち本発明の分離方法の前、 または後に、 IPCを含む細胞集団に含まれる、 ネガティブセレクションマーカーを有する細胞を分離すればよい。 具体的には、 先に述べた IPCの分離方法と同様の手法によって、 ネガティブセレクションマーカ 一を有する細胞を分離することができる。 たとえば、 予めネガティブセレクショ ンマーカーを有する細胞を除去した細胞集団に対して、 本発明の IPCの分離方法を 適用することができる。 あるいは、 本発明の方法によって分離された IPCを含む細 胞集団から、 更にネガティブセレクションマーカーを有する細胞を除去すること によって、 IPCの純度を更に高めることができる。 すなわち、 Ly-49Qと CDl lbの二 重染色によって、 IPCは Ly-49Q(+)および CDllb (-)細胞として IPCを単離すること力 S できる （図 9 A)。
また、 逆に、 これらの細胞には見出せないが、 IPCが有しているマーカーを利用 して、 IPCを精製することもできる (positive selection)。 このようなマーカーを、 ポ ジティブセレクションマーカーと言う。 ポジティブセレクションマーカーとして は、 B220、 CD45RB、 および CD11 cを示すことができる。 ポジティブセレクショ ンマーカーを利用する場合は、 当該マーカーを有する細胞が IPCとして分離される
(図 9 B) 。
ネガティブセレクションマーカーあるいはポジティブセレクションマーカーは、 単独で用いても良いし、 複数を組み合わせることもできる。 更に、 両方のマーカ 一を利用することもできる。
本発明の IPC分離方法に用いる Ly-49Qを認識する抗体は、 IPC分離用試薬とする ことができる。 すなわち本発明は、 Ly- 49Qを認識する抗体またはその抗原結合領 域を含む、 マウス IPC分離用試薬に関する。 本発明の分離用試薬を構成する Ly- 49Qを認識する抗体またはその抗原結合領域は、 標識や固相に結合しておくこと ができる。 たとえば磁気ビーズに結合した抗体は、 MACSによる分離に有用であ る。 あるいは、 固相に結合した抗体をカラムに充填して、 IPC分離カラムを構成す ることもできる。 P T/JP2003/009809
- 2 8 - 本発明の分離用試薬には、 ネガティプセレクションマーカーおよびポジティブ セレクションマーカーのいずれか、 または両方を検出するための要素を組み合わ せることができる。 たとえば、 これらのマーカーを認識する抗体を組み合わせた 試薬は、 より高純度の IPCを得るための試薬として有用である。 あるいは、 細胞集 団に共存する可能性の高い IPC以外の細胞を分離するための要素を組み合わせて IPC分離用試薬を構成することもできる。 具体的には、 細胞の大きさの違いに基い て顆粒球およぴマク口ファージを除去するための、 密度勾配遠心分離のための要 素を Ly-49Qを認識する抗体と組み合わせることができる。
IPCは、 生体におけるインターフェロンの大部分を産生する細胞である。 したが つて、 IPCを単離し、 その IPC産生能を調節する方法を研究することには大きな意 義がある。 IPCが産生する IFN-αや IFN-β等のインターフェロンは、 ガンやウィルス 性疾患の治癒において重要な作用を有すると考えられている。 したがって、 イン ターフェロンの産生活性の促進は、 これらの疾患の治療方法として有用である。 ヒト IPCは、 アレルゲンや寄生虫などの刺激により肥満細胞で産生された IL-3を 介して DC2 (Dendritic Cell type2)へ分化するとも言われている。 DC2 は、 T細胞の Th2への分化を誘導する細胞である。 了レルゲン刺激による IPCの IFN産生あるい は TNF産生を抑制できれば、 Th2への分化も抑制できる可能性がある。 したがって、 IFN産生を抑制する方法は、 各種アレルギー疾患の治療効果も期待できる。 このよ うな研究を進めるためには、 IPCのインターフェロン産生能に干渉しない抗体を用 いて単離された IPCが必要である。 図面の簡単な説明
図 1は、 FLT-3リガンド添加後、 10日間培養したマウスの骨髄細胞 （IPCが濃縮 されている） の細胞表面を、 作製抗体および他の IPC マーカーで染色した FACS解 析像である。 培養上清陽性分画、 陰性分画をそれぞれ R2、 R3とした。 グラフ内の、 R1 &R2は 2E6抗体陽性の細胞集団、 R1 &R3は 2E6抗体陰性の細胞集団をあらわす。 P T/JP2003/009809
- 2 9 - 図 2は、 各モノクローナル抗体で抽出した細胞の形態を表わす顕微鏡写真 （X 4 0 0 ) である。 （a)はインフルエンザウイルス PR8に感染させる前の形態、 （b)はィ ンフルェンザウィルス PR8と 2日間培養した後の形態を示す。 感染後の細胞は樹 状突起を持ち、 樹状細胞に典型的な形態を示した。
図 3は、 本発明のモノクローナル抗体 2E6が結合した細胞のインターフェロン産 生能を示すグラフである。 グラフは下から順に、 2E6陽性細胞 (2E6 positive), 2E6 陰性細胞 (2E6 negative), そして全脾細胞 (whole spleen cell)の結果を示す。 各細胞に ついて、 PR8感染させたもの (PR8)と、 感染させなかった場合 (-)の IFN-α産生量 (ng/mL)を示した。
図 4は、 モノクローナル抗体 2E6の、 IPCのインターフェロン産生能への影響を 示すグラフである。 下が 2E6( 0 . 0 1— l g/mL)を、 また上がラット IgG( 0 . 0 1一 l g/mL)を加えた場合の、 PR8を感染させた 2E6陽性細胞の IFN-α産生量
(ng/mL)を示した。 一番下の (-)は、 2E6陽性細胞無しの場合の測定結果である。
図 5は、 モノクローナル抗体 2E6の、 IPCの細胞増殖能への影響を示すグラフで ある。 右が 2E6( 0 . 1 g/mL)を、 また中央がラット IgG( 0 . 1 g/mL)を加えた場 合の、 CpG存在下で培養した 2E6陽性細胞の H3チミジンの取りこみ量 (cpm)を示し た。 一番左の (-)は、 CpG無しの場合の測定結果である。
図 6は、 配列番号： 1に記載の塩基配列 (SEQ ID:1)を有する遺伝子 （上） の発 現レベルを確認した結果を示す写真。 各レーンは左から順に次の細胞の結果を示 す。
1 ： CD3陽性細胞 （T細胞） 、 3 ：マウス IPC、 および
2 ： CD8陽性細胞、 4 ：骨髄系樹状細胞 （myeloid DC) 図 7は、 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列 （上） と、 Ly-49Qとして報告され ている Gr-1+細胞に発現するレセプターのアミノ酸配列 （配列番号： 8、 GenBank Acc#. AB033769；下） をァライメントした結果を示す図である。 図 8は、 樹状細胞の分化過程を示す図である。 造血幹細胞 (Haematopoietic Stem Cell)は、 リンパ球系前駆細胞 (CLP: Common Lymphoid Progenitors)およぴ骨髄系前 駆細胞 (CMP: Common Myeloid Progenitors)とに分化する。 IPCはリンパ球などとと もにリンパ球系前駆細胞から分化した細胞である。 一方、 骨髄系前駆細胞からは、 リンパ球系樹状細胞あるいは骨髄系樹状細胞が分化する。 図 9は、 各種の細胞表面マーカーを利用する IPC他の識別方法を示すグラフであ る。 Aは、 Ly-49Qと CDl lbの 2つのマーカーを利用して、 IPCの分離が可能なこと を示す。 また Bには、 各種の樹状細胞の識別を行うための細胞表面マーカーの組 み合わせの例を示す。 すなわち、 まず Ly-49Qと CDl lcの 2つのマーカーを使って、 両者がポジティブな細胞として IPCが同定される （上） 。 次に CDl l cのみがポジ ティブである細胞に対して、 CD8と CD4の 2つのマーカーを適用すると、 いずれ か一方がポジティブな細胞と、 両者がネガティプな細胞の 3種類の細胞として各 種の樹状細胞を同定することができる （下） 。 図 1 0は、 Ly-49Qを認識するモノクローナル抗体 2E6と、 各種の細胞表面マー カーを認識する抗体による、 Balbんマウスの脾臓由来の細胞の二重染色の結果を示 す。 縦軸が組み合わせた各種の抗体を標識した蛍光色素の蛍光強度、 横軸がモノ クローナル抗体 2E6を標識した蛍光色素の蛍光強度を示す。 図 1 1は、 Ly-49Qを認識するモノクローナル抗体 2E6と、 Gr-1 (左側） または CDl lb (右側） を認識する抗体による、 二重染色の結果を示す。 上力 ¾alb/cマウス の、 下が C57B6マウスに由来する脾臓由来細胞の分析結果である。 縦軸と横軸は、 それぞれの軸に示した抗体を標識した蛍光色素の蛍光強度を示す。 図 1 2は、 Balb/cマゥスの脾臓由来の Gr-1およびモノクローナル抗体 2E6陽性細 胞 （IPC/R2;カラム左） 、 Gr-1強陽性おょぴモノクローナル抗体 2E6陽性細胞 （顆 粒球/ R3；カラム中） 、 並びに Gr-1陽性およびモノクローナル抗体 2E6陰性細胞
(マクロファージ/ R5;カラム右） の、 インターフェロンの産生能を確認した結果 を示す。 縦軸はインターフェロンまたは IL-12の産生量 (pg/mL)を、 横軸が刺激剤の 種類を示す （-:刺激剤無し、 PR8:インフルエンザウイルス、 CpG:ODN-CpG) 。 図 1 3は、 Balb/cマウスの脾臓由来の Gr-1およびモノクローナル抗体 2E6陽性細 胞 （IPC;下） 、 Gr-1強陽性およびモノクローナル抗体 2E6陽性細胞 （顆粒球；上） の顕微鏡写真を示す写真。
発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。
〔実施例 1〕 モノクローナル抗体作成プロトコル
免疫原とする細胞は以下のようにして調製した。 Balb/cマウス雌 （4〜6週 令） の骨髄細胞を 1 O ng/mLの FLT-3リガンド添カ卩 10%FCS-RPMI 1640 (ぺニシリン、 ストレプトマイシン)にて 10日間培養した。 10日目には約 40%の細胞が IPC
(Interferon producing cell) となった。 10日後、 CDl lc陽性、 CDl lb陰性、 B220陽 性分画を、 セルソーターで分離した。
0、 4、 11日目の上記の分離した細胞 l xlO6個 （/片足） を、 完全フロインドアジ ュバント （CFA) と共にラットのフットパッド （foot pad) へ注入した。 12日目に 免疫ラットのリンパ節を分離し、 リンパ球を採取した。 マウスのミエローマ
P3x/63Ag8.653 とラットのリンパ球を、 4 ： 5の割合で混合し、 ポリエチレング リコール (PEG)を加えて細胞を融合した。 融合後の細胞は+分に洗浄して HAT培地 に分散させ、 1ゥエル当たり 5 xl04個の細胞を含むように 96 well plateにまいた。 細胞が増えたゥエルの細胞を回収し希釈して、 その培養上清をスクリーニング した。 培養上清は、 マウス脾臓細胞、 および培養骨髄細胞に対する反応†生を指標 としてスクリーニングした。 詳細は以下のとおりである。
〔実施例 2〕 培養上清のスクリーニング
Balb/c マウス雌 （ 4〜 6週令） の骨髄細胞を FLT-3リガンド添カ卩 10%FCS-RPMI 1640 (ペニシリン、 ストレプトマイシン)にて 10日間培養した。 1 0日目には約 40%の細胞が IPC (Interferon producing cell) となった。 ハイプリ ドーマ培養上清を 1次抗体とし、 2次抗体に FITC標識抗ラット IgGを用いてこの細胞を染色した。 その後、 各種抗体 (CDl lb, CDl lc, CD3, CD19, CD45RB, B220, Ly6C) により二重 染色した。
培養上清陽性分画、 陰性分画をそれぞれ、 R2、 R3とし各々の Gate内での各種抗 原の発現をヒストグラムで示した （図 1 ) 。 作製した数種類の抗体によって染色 される細胞群は、 文献上で定義されているマウス IPC(Nature Immunol.2001.pl 144- 1150)の細胞表面抗原プロファイルが一致した。 したがって、 これらの抗体はマウ ス IPCを特異的に結合する抗体であると考えられた。
〔実施例 3〕 抗体で分離した細胞の形態
実施例 2と同様に培養した骨髄細胞を、 培養上清を 1次抗体とし、 2次抗体に FITC標識抗ラット IgGを用いて染色した。 その後セルソーターを使って、 陽性細胞 を分離した。 サイトスピン後、 ギムザ染色し、 検鏡したところ IPCに特異的な形態 を示した （図 2 (a)) 。 すなわち、 この細胞の形は丸く大きな核を有していた。
ΙχΙΟ5の細胞を 96 well丸底プレートにてインフルエンザウイルス (PR8)と共に 24 時間培養し、 同様にギムザ染色した後、 顕微鏡下にて観察したところ、 形態的に 典型的な樹状細胞に分ィ匕した （図 2 (b)) 。 この結果から、 上記抗体によって分離 された細胞は、 ウィルス感染によつて樹状細胞に分化するというマウス IPCの特徴 を有していることが確認された。 マウス IPC特異的なモノクローナル抗体として 2E6を選択し以降の実験に用いた。 モノクローナル抗体 2E6を産生するハイプリ ド 一マ 2E6は、 2002年 8月 1日に独立行政法人産業技術総合研究所内特許生物寄託セン ターに寄託されている （受託番号 FERM BP-8445) 。
〔実施例 4〕 抗体で分離した細胞のィンターフェ口ン産生能
実施例 2と同様に培養した骨髄細胞を 2E6の培養上清、 および 2次抗体で染色後、 セルソーターにて陽性、 陰性細胞を分離した。 lχl05個の2E6陽性細胞を96 well丸 底プレートに分注し （ΙΟΟμΙ/well) 、 インフルエンザウイルス PR8を感染させ、 24 時間後の培養上清中の IFNaを ELISAにて測定した。 それぞれの反応は、 triplicateで 行ない、 平均値を求めた。 2E6陰性細胞に代えて、 脾細胞または 2E6陰性細胞を同 様に処理して結果を比較した。
ELISAのオペレーションは次のとおりである。 まず抗 IFNa抗体を 96 well plateに over nightで coatした。 プレートを洗浄後培養上清 ΙΟΟμΙをいれ、 4°C over nightにて 反応させた。 プレートを洗浄後、 IFN aと IFN ]3を認識する標識化抗インターフエ ロン抗体を添加し、 1時間インキュベートした。 2E6陽性細胞では、 その他の細胞 と比べて、 高いインターフェロンの産生が認められた。 したがってモノクローナ ル抗体 2E6が認識する抗原は、 IPCに特異的な表面抗原であることが確認できた
(図 3 ) 。
〔実施例 5〕 抗体のィンターフヱロン産生能に対する影響
実施例 2と同様に培養した骨髄細胞を 1 X 105個ずつ、 96 well丸底プレートに分 注した。 これにハイプリ ドーマ 2E6の培養上清、 またはラット IgG (コントロー ル） を添加し、 37°C にて、 30分間培養後、 インフルエンザウイルス (PR8)を添カロ し、 24時間、 37°Cにて培養後、 培養上清の IFN aを ELISAで測定した。 結果を図 4 に示した。 0 . 0 1— l g/mLのいずれの抗体濃度においても、 対照との間で、 IFN-aの産生量に有意な差は見られなかった。 すなわち、 IPCの IFNa産生能に対す るモノクロ一ナル抗体 2E6の影響は観察されなかつた。
〔実施例 6〕 抗体の IPC増殖能に対する影響
実施例 2と同様に培養した骨髄細胞を I X 105個ずつ、 96 well丸底プレートに分 注した。 次いで、 各ゥエルに l g/mLの 2E6モノクローナル抗体および ΙμΜの ODN-CpG (Phosphorothioate CpG ODN 1668； 5，-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3，）を 添加し、 24時間後のサイミジン取り込みを計測した。 対照として、 モノクローナ ル抗体に代えてラット IgGを用いて同じ処理をした細胞の増殖能を測定した。 結果 を図 5に示した。 モノクローナル抗体 2E6を添加した場合の細胞の増殖は、 対照と 有意な差は認められなかつた。
〔実施例 7〕 発現クローニング
1 ) IPC-cDNAラィプラリ一の作製
FL3-Tリガンドで Balb/cマウスの骨髄細胞から誘導した IPCより全 RNAをフエノ ール-グァ-ジン法により抽出し、 oligo-dTカラムにより mRNAを精製した。 精製 した inR Aから Gubler-Hoffinan法により cDNAを合成し、 両端に EcoRI-Notlァダプ ター (インビトロジェン社製)を結合後、 スパンカラム (クロマスピン 400、 ク ロンテック社製） により未反応の EcoRIアダプターおよび 500塩基以下の短い cDNAを除去した。 得られた両端に EcoRIサイトを有する cDNAを動物細胞用発現 用ベクター pME18s(XhoI断片を除いたもの)の EcoRIサイトに T4リガーゼにより結 合し、 大腸菌 DH10にエレク ト口ポーレーシヨン法により形質転換した。 これ を LB ·カルべニシリン （10( g/ml) 50 Omlで 30°Cでー晚培養し、 QIA filter plasmidmaxikit(Qiagen社製)により 同キットのプロトコールに従って plasmidを抽 出、 精製し、 IPC-cDNAライブラリーを得た。
2) COS細胞による発現クローニング
6 cmディシュに COS細胞を 5 x l 05で 10枚まき、 37 °C、 5 %C02下で培養 した。 20時間の培養の後、 Effectintrasfection Reagent(Qiagen社製)により同製品 のプロトコールに従 ヽ IPC cDNAライプラリーを transfectionした。 48時間、 3 7°C、 5%C02下で培養後、 PBSで洗浄、 PBS/5mMEDTAで細胞をデイシュから 剥離し、 さらに PBSで洗浄後、 セルストレナー （70μπι, ファルコン社製） を通し た。 遠心後 （1300rpm,5分） 上清を除去し、 PBS/0.5%BSA/2mM EDTAを 1 mLに懸 濁し、 Fc block (ファーミンジヱン社製) 4 Ομίを加え 4。Cで 20分置いた。 これ にビォチン化した IPC特異的抗体 30〜50μ§を加え、 氷上で 30分間保持した。 PBS で洗浄後、 100 の P B Sに懸濁し、 ストレプトァビジンマイク口ビーズ
(Miltenyi Biotec社製） 10〜20μίを加え 10°Cで 15分静置した。 PBS/
0.5%BSA/2mM EDTAで洗浄することにより過剰なストレプトアビジンマイクロビ ーズを除去し、 1 mlの PBS/0.5%BSA/2mM EDTAに懸濁した。
AutoMACS (Miltenyi Biotec社製） で posseldsの条件で細胞を分取した。 改良 Hirt 法 （BioTechniques Vol.24，760-762, 1998) により plasmidを抽出、 精製した。 得られ た plasmidを大腸菌 D H 1 0にェレクトロポーレーション法により形質転換し、 L B ·カルべニシリン （10(^g/ml) 1 0 0 mlで 3 0 °Cでー晚培養し、 QIA filter plasmid midi kit (Qiagen社製)により 同キットのプロトコールに従って plasmidを抽 出、 精製した。 以上操作を 1クールとして、 この後同じ操作を 4回繰り返し、 IPC 特異的抗体に反応する抗原をコードする plasmidを濃縮した。 最後に、 AutoMACS のかわりにセルソーター （FACSVantage, Becton Dekinson社製） により陽性細胞を 分取し、 これらより抽出した plasmidを形質転換した大腸菌 DH10を適量 L B 'カル ベ-シリン （lOO g/ml) プレートに塗布し、 3 0 °Cでー晚培養し、 現れたコロニ 一を 3 0個ピックアップし、 それぞれより plasmidを抽出した。 これらを、 それぞ れ、 COS細胞に transfectionし、 対応する IPC特異的抗体で F ACS解析することによ り陽性 plasmidを選抜した。
得られた plasmid上にクローン化されている cDNAの塩基配列を決定し、 マウス 遺伝子データベースに登録されている塩基配列情報と blastサーチすることにより、 その遺伝子を決定した。
その結果、 モノクローナル抗体 2E6が結合したクローンは、 配列番号： 1に記載 の塩基配列を有していた。 これらの塩基配列によってコードされるアミノ酸配列 を、 配列番号： 2に示した。
配列番号： 1に記載の塩基配列は、 Ly-49Qと呼ばれる NKレセプターとして単離 された分子の塩基配列 (GenBank Acc#.AB033769)とほぼ一致した。 両者の塩基配列 の違いは、 マウスの種の違いによるものと考えられた。 配列番号： 1に記載の塩 基配列は配列番号： 2に示すァミノ酸配列をコードしていた。 配列番号： 2に記 載のアミノ酸配列と、 GenBank Acc#.AB033769として既知のァミノ酸配列 （配列 番号： 8 ) のァライメント結果を図 7に示した。 配列番号： 8に記載のアミノ酸 配列は、 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列に対して、 以下の変異を有する。 1位 Metの欠失、 5 1 3 4位 lieの Valへの置換、
9 4位 Serの Asnへの置換、 2 3 0位 Lysの Thrへの置換、 そして
1 0 3位 Proの Leuへの置換、 2 5 4位 Pheの Valへの置換
1 1 4位 Asnの Aspへの置換、
したがって、 これらの変異のいずれかを含むアミノ酸配列は、 本発明における Ly-49Qとして有用である。
3 ) FACSによる確認
上記発現クロー-ング法により得られた plasmidを QIA filter plasmid midi kit (Qiagen社製)により再度大腸菌より高度に精製し、 もう一度 COS細胞に transfection した。 4 8時間後、 定法に従って、 対応する IPC特異的抗体および FITC標識抗ラ ット 2次抗体を反応させ FACS解析を行うことで、 プラスミド上にクローン化され ている cDNAが、 抗原をコードしているかどうかを確認した。
その結果、 上記モノクローナル抗体 2E6は、 いずれもプラスミ ドを導入した COS 細胞に対する結合が観察された。 したがって、 プラスミド上にクローン化されて Vヽる cDNAは、 レ、ずれもこれらのモノクローナル抗体によつて認識された抗原をコ ードしていることが確認された。 '
4 ) R T— P C R法による確認
各細胞より抽出した RNAより合成した cDNAを錶型として、 定法に従って PCRを 行い、 抗原遺伝子が IPCに特異的に発現しているかどうかを確認した。 PCRに用い たプライマーの塩基配列は次のとおりである。
配列番号： 1用センスプライマー （配列番号： 3 ) ：
5'-GAGCAGGAGGTCACTTATTCAAC-3'
アンチセンスプライマー （配列番号： 4 ) ：
5'-AACCAGTGTATTTCCAGGCTTCC-3' j3ァクチン用センスプライマー （配列番号： 5 ) ：
5'-GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3'
アンチセンスプライマー （配列番号： 6 ) ：
5'-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3*
発現レベルを比較した細胞は次のとおりである。 細胞は、 セルソーター
(FACSVantage, Becton Dekinson社製） により高度に分離したものを用いた。 結果 は図 6に示した。 配列番号： 1 (上） に示した塩基配列を有する遺伝子は、 IPCに おける高い発現が観察された。 したがって、 この遺伝子はマウス IPCのマーカーと して有用であることが裏付けられた。
CD3陽性細胞 （T細胞） 、 マウス IPC、 および
CD8陽性細胞、 骨髄系榭状細胞 ("Myeloid" DC)
〔実施例 8〕 二重染色による樹状細胞の識別
C57B6および Balb/cマウスの脾臓細胞おょぴ骨髄より血球細胞を抽出した。 抽出した血球細胞に対して、 抗 Ly-49Qモノクローナル抗体 2E6、 および各種細 胞マーカーを認識する抗体による二重染色を行った。 細胞マーカーとして、 次の マーカーを利用した。
B220、 Ly6 c、 Gr-1、 CD4、 CD19、 CD3、 CDll c、 CDl lb、 および CD45RB 染色後の細胞を FACScanによって、 解析した。 結果の一部を図 1 0およぴ図 1 1に示した。 図 1 0の各グラフにおいて、 縦軸が各マーカーの、 そして横軸が Ly-49Qの陽性細胞のポピュレーションを示す。 たとえば CD3や CDllcとの二 重染色によって、 Ly-49Q陽性おょぴ CD3若しくは CD1 lcが陽性の細胞群 (IPC) を識別できる。 また Ly-49Qの発現が見られる Balb/cマウス由来の顆粒球は、 Gr-1に強く染色される細胞 (R5)として IPCと識別できることがわかる。
更に C57B6マウスに由来する細胞の解析結果において、 この実施例で用いた モノクローナル抗体 2E6が顆粒球に結合していないことがわかる （図 1 1 ) 。 —方 IPCについては、 マウスの系統の違いにかかわらず、 いずれもモノクロ一 ナル抗体 2E6によって検出できている （R6および R7) 。 この結果は、 C57B6 マウス由来の細胞群を対象とする場合には、 モノクローナル抗体 2E6を利用し て、 顆粒球が共存している細胞群の中の IPCを特異的に検出できることを示し ている。 すなわち、 C57B6マウス由来の細胞群においては、 モノクローナル抗 体 2E6ポジティブ細胞を IPCと同定することができる。 Ly-49Qは C57B6マウス の顆粒球でも発現しているので、 2E6の認識ェピトープが、 マウスの系統間で構 造の異なる部位である可能性が考えられた。 たとえば、 C57B6および Balb/cマ ウスの間で Ly-49Qの糖鎖の違い、 あるいは多型の存在等を構造の違いの理由と して予測することができる。
〔実施例 9〕 分離した細胞の IFN産生能の確認
Ly-49Q陽性細胞として単離された細胞が IPCであることを確認するために、 細胞の IFN産生能を確認した。 まず、 AutoMACSを用い、 骨髄細胞から Gr-1陽 性細胞を抽出した。 得られた細胞を対象として、 Gr-1と 2E6の二重染色により 以下の細胞群を分離した。 細胞の単離にはセルソーターを用いた。
(1) Gr-1 強陽性 (high positive), 2E6陽性細胞（R3)、
(2) Gr-1 弱陽性 (lo positeve)、 2E6 陽性（R2)、
(3) 2E6陰性 (lo positeve)、 Gr-1弱陽性 (lo positeve) (R5) 次レ、で分離した細胞を各種刺激剤で刺激し、 IFN-αおよび IL-12の産生レベルを 測定した。 刺激剤には、 インフルエンザウイルス PR8、 および ODN-CpGを用いた。 結果を図 1 2に示した。 （2) Gr-1 陽性かつ 2E6陽性の細胞群 (R2)は、 PR8刺激によ つて IFN- a産生能が強く誘導された。 この細胞群は IPCであることが裏付けられた。 実際に AutoMACSで分離された細胞の形態学的な特徴を確認した。 その結果、 (2) Gr-1 陽性かつ 2E6陽性の細胞 (R2)は IPC (図 1 3下の写真） に、 そして (1) Gr-1 強陽性かつ 2E6陽性細胞 (R3)は顆粒球 （図 1 3上の写真） に特徴的な形態をそれぞ れ有していた。 産業上の利用の可能十生
本発明は、 マウス IPCのマーカーとして有用な分子を提供する。 マウス IPCに特 異的に見出されるマーカーは、 これまで知られていなかった。 本発明らが見出し たマーカーにより、 マウスの IPCの同定、 検出、 あるいは分離を容易に行うことが できる。 IPCの末梢血におけるポピュレーションは極めて小さい。 したがって、 公 知のモノクローナル抗体を使ったマウス IPCの同定や分離には、 複数の抗体を用い た多重染色が必要であった。 一方本発明によって提供されたマーカーは、 マウス
IPCに対する特異性を有するので、 1種類のモノクローナル抗体によって、 マウス IPCの検出や分離が可能である。
マウス IPCは、 ウィルスや IL- 3の刺激によって樹状細胞に分化する。 これらの刺 激はそれぞれ異なる樹状細胞への分化を誘導する。 つまり、 IPCは多様な細胞への 分化能を有する。 したがって IPCは、 免疫システムにおける重要な細胞に位置付け られる前駆細胞である。 このような IPCの分離や同定を容易にする本発明のマーカ —は、 高い産業上の有用性を有する。
より具体的には、 本発明に基くマーカーを指標としてに分離されたマウスの IPC を利用して、 IPCの分化の誘導機構を解明することができる。 解明された機構に基 づいてヒトの IPCの分化機構を解明することができれば、 ヒト IPCの分ィ匕を人為的 に調節できる可能性がある。
更に本発明によって提供されたマーカーを認識する抗体は、 マウス IPCのインタ '一フエロン産生能を調節する作用を実質的に有しない。 IPCは、 血中において大量 のインターフェロンを産生する。 したがって IPCのインターフエ口ン産生能に影響 を与えることなく IPCの単離を可能とする本発明のマーカーは、 研究材料としての IPCの単離に貢献する。 先に述べたように、 BDCA- 2抗原を認識する公知のモノクロ ーナル抗体は、 ヒ ト IPCに対してそのインターフェロン産生能を抑制する作用を有 する。 IPCのィンターフェロン産生能に干渉しないモノクローナル抗体を提供した 本発明の価値は大きい。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、 参照として本明細書 に組み入れられる。

Claims

請求の範囲
1 . 次の工程を含む、 マウスのインターフェロン産生細胞の検出方法。
(1) マウス血液細胞を含む生物学的試料に含まれる、 Ly-49Qを発現している 細胞を検出する工程、 および
(2) Ly-49Qの発現が検出された細胞をマウスのインターフエ口ン産生細胞とし て検出する工程
2 . Ly-49Qを発現している細胞を検出する工程が、 Ly-49Qを認識する抗体または その抗原結合領域を細胞に結合させる工程を含む、 請求項 1に記載の方法。
3 . Ly-49Qを認識する抗体が、 モノクローナル抗体である請求項 2に記載の方法。
4 . モノクローナル抗体が、 受託番号 FERM BP-8445として寄託されたハイプリド 一マ 2E6が産生するモノクローナル抗体が認識する抗原決定基に結合するモノ ク口ーナノレ抗体である請求項 3に記載の方法。
5 . モノクローナル抗体が、 受託番号 FERM BP-8445として寄託されたハイブリド —マ 2E6が産生するモノクローナル抗体である請求項 4に記載の方法。
6 . 付加的に、 マウスリンパ球系樹状細胞、 マウス CD4+骨髄系樹状細胞、 および マウス CD4-骨髄系樹状細胞から選択された少なくとも 1種類の樹状細胞を検 出する工程を含む請求項 1に記載の方法。
7 . マウスリンパ球系樹状細胞が、 CDll c陰性、 CD4陰性、 および CD8陽性細胞 として同定される工程を含む請求項 6に記載の方法。
8 . マウス CD4+骨髄系樹状細胞が、 CDll c陰性、 CD4陽性、 および CD8陰性細 胞として同定される工程を含む請求項 6に記載の方法。
9. マウス CD4-骨髄系樹状細胞が、 CDllc陰性、 CD4陰性、 および CD8陰性細胞 として同定される工程を含む請求項 6に記載の方法。
10. Ly-49Qを認識する抗体またはその抗原結合領域を含む、 マウスインターフ 口ン産生細胞検出用試薬。
11. 付加的に、 マウスリンパ球系榭状細胞、 マウス CD4+骨髄系樹状細胞、 およ ぴマウス CD4-骨髄系樹状細胞から選択された少なくとも 1種類の樹状細胞の マーカーを認識する抗体またはその抗原結合領域を含む請求項 10に記載の試
12. マウスリンパ球系樹状細胞、 マウス CD4+骨髄系樹状細胞、 およびマウス CD4-骨髄系樹状細胞の細胞マーカーが、 CD4および CD8である請求項 1 1に記 載の試薬。
13. 次の工程を含む、 マウスのインターフェロン産生細胞の分離方法。
(1)マウスインターフェロン産生細胞を含む細胞集団に含まれる、 Ly-49Qを 発現している細胞を検出する工程、 および
(2) Ly-49Qの発現が検出された細胞をマウスのインターフェロン産生細胞とし て取得する工程
14. マウスインターフェロン産生細胞を含む細胞集団が、 顆粒球おょぴマクロ ファージのいずれか、 または両方を含まない細胞集団である請求項 13に記载 の方法。
15. 付加的に、 （3)顆粒球おょぴマクロファージのいずれか、 または両方を分離 する工程、 を含む請求項 13に記載の方法。
16. Ly-490を認識する抗体またはその抗原結合領域を含む、 マウスインターフ ヱロン産生細胞分離用試薬。
1 7 . 付加的に、 顆粒球のマーカーを認識する抗体またはその抗原結合領域、 お よびマクロファージのマーカーを認識する抗体またはその抗原結合領域のいず れか、 または両方を含む請求項 1 6に記載の試薬。
1 8 . 受託番号 FERM BP-8445として寄託されたハイプリ ドーマ 2E6が産生するモ ノクローナル抗体が認識する抗原決定基に結合するモノクローナル抗体、 また はその抗原結合領域を含む断片。
1 9 . 受託番号 FERM BP-8445として寄託されたハイブリ ドーマ 2E6が産生するモ ノクローナル抗体、 またはその抗原結合領域を含む断片。
2 0 . 受託番号 FERM BP-8445として寄託されたハイブリ ドーマ 2E6を培養し、 培 養物に含まれるィムノグロプリンを採取する工程を含む、 モノクローナル抗体 の製造方法。
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