JP2004016084A - 新規蛋白質およびそれをコードするｄｎａ - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、２型ヘルパーＴ細胞に発現するが、１型には発現しない蛋白質およびそれをコードするＤＮＡ等を提供する。
【解決手段】ナイーブＴ細胞を種々のサイトカインおよびその抗体等の存在下で培養することにより、１型および２型ヘルパーＴ細胞を分化させ、両細胞中に発現するｍＲＮＡを網羅的に比較し、２型ヘルパーＴ細胞のみに発現するものを取得する。本発明のＤＮＡの検体細胞内での発現量を指標として、該検体が由来する個体のＴｈ１／Ｔｈ２バランスを解析することができる。
【解決手段】ナイーブＴ細胞を種々のサイトカインおよびその抗体等の存在下で培養することにより、１型および２型ヘルパーＴ細胞を分化させ、両細胞中に発現するｍＲＮＡを網羅的に比較し、２型ヘルパーＴ細胞のみに発現するものを取得する。本発明のＤＮＡの検体細胞内での発現量を指標として、該検体が由来する個体のＴｈ１／Ｔｈ２バランスを解析することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は２型ヘルパーＴ細胞またはその分化途上に発現するが、１型ヘルパーＴ細胞には発現しない蛋白質およびそれをコードするＤＮＡ、該蛋白質に対する抗体等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫応答において中心的な役割を担っているヘルパーＴ細胞と呼ばれるリンパ球は、産生するサイトカインのパターンにより、少なくとも２つのサブセットに 分類される（Ｍｏｓｍａｎｎ ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９８６） １３６ ： ２３４８−２３５７ ）。１型ヘルパーＴ細胞（以下、これを「Ｔｈ１」と称することがある）は、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）やインターロイキン２（ＩＬ−２）を産生し、マクロファージやナチュラルキラー細胞を活性化することで、主にウイルス、バクテリア等に対する感染防御などの細胞性免疫に関与することが知られている（Ｈｏｗａｒｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ３ｅｄ．， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３））。一方、２型ヘルパーＴ細胞（以下、これを「Ｔｈ２」と称することがある）は、ＩＬ−４、ＩＬ−５等のサイトカイン（以下、これを「Ｔｈ２型サイトカイン」と称することがある）を産生し、主にＩｇＥ抗体産生などの液性免疫に関与することが知られている。ヒトにおいてもＴｈ１様細胞及びＴｈ２様細胞がクローン化されて研究が進み、前述のような考え方がおおむねヒトにおいてもあてはまることが確認されている（Ｒｏｍａｇｎａｎｉ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １２， ２２７−２５７（１９９４））。
【０００３】
Ｔｈ１及びＴｈ２の比率は恒常性（ＴＨ１／Ｔｈ２バランス）を保っており、そのバランスが破綻すると以下に述べるとおり疾患に対する感受性が高くなると考えられている。
すなわち、Ｔｈ２型サイトカインは、アレルギー反応に関与すると考えられており、Ｔｈ２はアレルギー反応の誘導細胞として重要視されている。Ｔｈ２型サイトカインの代表であるＩＬ−４は、Ｂ細胞に対してＩｇＥ抗体の産生を誘導するとともに、肥満細胞の活性化及び増殖を誘導する作用を有している。また、好酸球が血管内皮細胞に接着し、組織浸潤する際に機能する重要な分子であるＶＣＡＭ−１の遺伝子発現も誘導する（ファルマシア、（１９９３）２９：１１２３−１１２８）。さらに、ＩＬ−４はＴｈ２自身の分化増殖因子でもある。このようなＩＬ−４で代表されるＴｈ２型サイトカインの特性から、Ｔｈ２は、ＩｇＥ抗体や肥満細胞が関与するアレルギーの即時型反応、及び好酸球が関与するアレルギーの遅発型反応という二つのアレルギー反応のいずれをも誘導する中心的な細胞であると認識されている。従って、アレルギー性疾患は、Ｔｈ２の病的な機能亢進に起因した疾患であるものと推測されている。実際にアレルギー性疾患の病変部である気道や皮膚において、ＩＬ−４やＩＬ−５等のＴｈ２型サイトカインの産生、あるいはＴｈ２の存在等が確かめられていることもあり、アレルギー性疾患を治療あるいは予防するためにはＴｈ２の活性化の制御、ひいてはＴｈ２型サイトカインの産生制御が重要であるとする考え方が、広く一般に受け入れられている（Ｎａｔｕｒｅ （１９９６） ３８３ ： ７８７−７９３ ）。
【０００４】
線虫などの寄生虫感染症においてもＴｈ２機能が著しく亢進することが知られている（臨床免疫（１９９５）２７：６５２−６５６）。また、全身性エリテマトーデス等の、抗体産生あるいは液性免疫が異常に亢進した状態にある自己免疫疾患においても、やはりＴｈ２が病的に機能亢進した状態にあると推定されている（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （１９８８） １５ ： ４０１）。さらに最近の研究において、エイズの発症後期においてＴｈ２がＴｈ１に比べて優位になるバランス異常状態が確認されており、このバランス異常状態を経過することが、最終的な免疫不全状態に移行する上で重要な段階である可能性が示唆されている。そして、このバランス異常状態を改善できればエイズの発症を遅らせる、あるいは発症を止めることができるとの指摘もなされている（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ （１９９３） １４ ： １０７−１１１）。
【０００５】
また、Ｔｈ１細胞はＬＴ−α、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γを産生する。これらＴｈ１型サイトカイン は、マクロファージおよび特定の炎症性応答（例えば、ＩＶ型「遅延型」過敏症）を活性化する傾向にある。また、Ｔｈ１型サイトカインは組織移植片および器官移植 物の細胞性拒絶において重要な役割を担う。これらのことからＴｈ１の優性な機能亢進は、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、多発性硬化症、インスリン依存性 Ｉ 型糖尿病、および炎症性腸疾患等の自己免疫疾患の発症を誘導すると考えられる。
【０００６】
上記ヘルパーＴ細胞サブセットＴｈ１およびＴｈ２への機能分化は、抗原刺激を受けていないＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞（以下、これを「ナイーブＴ細胞」と称することがある）が活性化されることにより誘導される。この機能分化に際してサイトカイン発現パターンは変化する。
本発明者らは、先にナイーブＴ細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、Ｔｈ１／Ｔｈ２へ分化させる方法を報告している（Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ （１９９６） ２６ ：２０８１−２０８６， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ （２００２） １６３ ： １０８７−１０９４）。従来は、Ｔｈ１機能の指標としてＩＦＮ−γ産生能、Ｔｈ２機能の指標としてＩＬ−４およびＩＬ−５を主に用いていた。また、Ｔｈ１細胞の分化に必至な転写因子としてＴ−ｂｅｔ、Ｔｈ２細胞の分化に必至な転写因子としてＧＡＴＡ−３、ｃ−Ｍａｆなどが知られており、そのｍＲＮＡの発現を検出することによってもそれぞれのタイプの存在を確認することが可能である。
【０００７】
【発明が解決使用とする課題】
本発明は、Ｔｈ１およびＴｈ２またはその分化途上に発現する蛋白質をコードするｍＲＮＡ（ＤＮＡ）を網羅的に比較し、Ｔｈ２に発現するが、Ｔｈ１には発現しない蛋白質およびそれをコードするＤＮＡを取得することを目的とする。さらに該ＤＮＡがコードする蛋白質、該蛋白質に特異的に結合する抗体等を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、未分化なＴ細胞にイオノマイシン及びＰｈｏｒｏｂｏｌ Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ Ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）により刺激を与え培養することによりヘルパーＴ細胞系に分化させ、さらにＩＬ−２、ＩＬ−４、抗ＩＦＮ−γ抗体、抗ＩＬ−１２抗体を添加して培養し、Ｔｈ２を分化させた。また、上記ヘルパーＴ細胞に、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、抗ＩＬ−４抗体を添加して培養し、Ｔｈ１を誘導した。この２つのＴ細胞サブセットに発現しているｍＲＮＡをディファレンシャル・ディスプレイ法により比較したところ、Ｔｈ２またはその分化途上に発現するが、１型ヘルパーＴ細胞には発現しないｍＲＮＡおよびその転写産物である蛋白質を見いだした。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
【０００９】
即ち、本発明によれば、
（１）以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠質、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ２型ヘルパーＴ細胞に発現するが、１型ヘルパーＴ細胞には発現しない蛋白質、
（２）上記（１）に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、
（３）ＤＮＡが、以下の（ａ）または（ｂ）である上記（２）に記載のＤＮＡ、
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列またはその相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列を有し、かつ２型ヘルパーＴ細胞に発現するが、１型ヘルパーＴ細胞には発現しない蛋白質をコードするＤＮＡ、
（４）ＤＮＡが、配列番号３に示すヒト由来の塩基配列を有するものである上記（３）に記載のＤＮＡ、
（５）上記（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡを含む組換えベクター、
（６）上記（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡまたは上記（５）に記載の組み換えベクターを導入したＤＮＡ導入細胞または該細胞からなる個体、
（７）上記（６）に記載の細胞により産生される、上記（１）に記載の組み換え蛋白質、
（８）上記（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列中の連続した５〜５００塩基と同じ配列を有するセンスオリゴヌクレオチド、当該センスオリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び、当該センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体からなる群から選ばれるオリゴヌクレオチド、
（９）上記（１）または（７）に記載の蛋白質に特異的に結合する抗体、あるいはその部分フラグメント、
（１０）上記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列から選択される少なくとも１以上のアミノ酸配列情報、および／または上記（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列から選択される少なくとも１以上の塩基配列情報を
保存したコンピュータ読み取り可能記録媒体、
（１１）上記（１）に記載のタンパク質、および／または上記（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡを結合させた担体、
が提供される。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の蛋白質、それをコードするＤＮＡ、蛋白質発現組換ベクター、および形質転換体は、例えば以下の様にして調製される。
１型、及び２型ヘルパーＴ細胞で特異的に発現する蛋白質を網羅的に探索するために、未分化なＴ細胞から上記２つのサブセットをそれぞれ同調的に大量に分化誘導する系を用いる。この分化誘導する系を用いる発現蛋白質／ｃＤＮＡの解析は、例えば、（１−ｉ）均一で未分化な分化段階でとどまっているＴ細胞を大量に調製し、（１−ｉｉ）このＴ細胞についてＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）を介した刺激を模倣する刺激を与え、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に分化させる、さらに（２）該ＣＤ４陽性Ｔ細胞に種々のサイトカインまたはその抗体を組み合わせて添加して培養し、各サブセット中に発現しているｍＲＮＡについてｃＤＮＡライブラリーを作製する、（３）このｃＤＮＡライブラリー中にあるｃＤＮＡを比較する（ディファレンシャル・ディスプレイ等）ことにより行うことができる。この系により、２型ヘルパーＴ細胞に発現するが、１型ヘルパーＴ細胞には発現しない蛋白質をコードするＤＮＡの網羅的探索が可能となる。
【００１１】
さらに、（４、５）上記（３）で得られたＤＮＡを含む組換えベクターを作製し、これを適当な宿主に導入し、該蛋白質を発現する細胞または個体を作製することができる。また、（６）上記（４）で得られたＤＮＡの塩基配列と同じ配列を含むセンスオリゴヌクレオチド、あるいはアンチセンスオリゴヌクレオチドを取得することもでき、さらには（７）上記（４）で得られたＤＮＡがコードする蛋白質の抗体を取得することもできる。
以下、本発明のＤＮＡ、および蛋白質並びにその調製方法について更に詳述す
る。
【００１２】
（１）１型及び２型ヘルパーＴ細胞の調製
Ｔｈ１及びＴｈ２を調製する方法としては、このような特徴を示すＴ細胞を大量に取得できる方法であればいかなるものであってもよい。具体的には、例えば、大量に調製した未分化なＴ細胞をＴＣＲを介した刺激、またはこれを模倣する刺激を２度与えて分化させた後に、さらに種々のサイトカインまたはその抗体を添加して各サブセットへ機能分化させる方法等が好ましく用いられる。上記の未分化Ｔ細胞は、内因性のＴＣＲの発現がなく、トランスジェニックＴＣＲのみを発現する動物を作製し、この主要組織適合抗原（ＭＨＣ）拘束性を利用することにより、該動物の胸腺細胞の大部分を未分化な状態に保ち、この動物の胸腺細胞を使用する方法が挙げられる。具体的には、Ｉｗａｔａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２６， ２０８１（１９９６）に記載されているように、ＲＡＧ−２遺伝子欠損マウス（Ｓｈｉｎｋａｉ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ６８， ８５５（１９９２））と、ＴＣＲ遺伝子を導入したマウスの交配により作製したマウスに対して、このＴＣＲのＭＨＣ拘束性を利用する方法（Ｏｈｏｋａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ８， ２９７（１９９６））を用いることができる。
【００１３】
ここで得られた未分化Ｔ細胞について、さらに分化を誘導する。この誘導法は、未分化なＴ細胞が分化誘導され、かつその分化の各段階において経時的に細胞を取得できる方法であれば如何なるものであってもよいが、例えば、Ｉｗａｔａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２６， ２０８１（１９９６）に示されている方法によりＣＤ４／ＣＤ８両陽性の未熟胸腺細胞の懸濁液を調製し、これに細胞の分化を誘導する最適濃度、例えば０．１〜０．３ｎｇ／ｍｌのＰｈｏｒｂｏｌ Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ Ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）と０．１〜０．３ μｇ／ｍｌのイオノマイシンの存在下で１５〜２０時間細胞を培養した後に、ＰＭＡ、イオノマイシンを洗い去ってさらに１８〜２４時間培養する。次に該細胞を１．０〜６．０ ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ及び０．１〜０．３ μｇ／ｍｌのイオノマイシンの存在下で１５〜２０時間培養して細胞を取得する方法を用いることができる。
【００１４】
かくして得られたＴ細胞は、Ｔｈ１及びＴｈ２への分化誘導に用いることができる。この誘導法も上記サブセットへの分化が誘導される方法であれば如何なるものであってもよいが、例えば、Ｉｗａｔａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２６， ２０８１（１９９６）に示されている方法等が好ましく用いられる。具体的には、Ｔｈ２への分化方法としては、５０〜１００ユニット／ｍｌのＩＬ−２、１００〜１０００ユニット／ｍｌのＩＬ−４、１〜５ μｇ／ｍｌの抗ＩＦＮ−γ抗体、及び１〜５ μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−１２抗体を添加した培地で２４〜９６時間培養する方法が挙げられる。また、１型ヘルパーＴ細胞への分化方法としては、５０〜１００ユニット／ｍｌのＩＬ−２、１〜１０ ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２、及び１〜５ μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−４抗体を添加した培地で２４〜９６時間培養する方法等が挙げられる。
【００１５】
（２）Ｔｈ１及びＴｈ２ ｃＤＮＡライブラリーの調製
このようにして取得されたＴｈ１及びＴｈ２から、全ＲＮＡを調製する。全ＲＮＡの調製方法としては、例えばＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ． ，ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １６２， １５６−１５９（１９８７）に記載されているように、細胞懸濁液にグアニジウムチオシアネートを加えた後にフェノール抽出により精製し、調製する方法等が挙げられる。また、全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製して用いてもよい。ｍＲＮＡの調製方法としては、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用いた液体クロマトグラフィにかける方法、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ２．０ Ｋｉｔ（インビトロジェン社）等の市販のキットを用いる方法等も用いられる。
【００１６】
得られた全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素やＰＣＲ法等を用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成する。具体的にはＭｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ３， ２８０（１９８３）やＧｅｎｅ， ２５， ２６３（１９８３）およびＰｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５， ８９９８（１９８８）に記載の方法や、ＳＭＡＲＴ ＰＣＲ ｃＤＮＡ ＳｙｎＴｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（クロンテック社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ ＳｙｎＴｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）等の市販のキットを用いる方法が挙げられる。
【００１７】
（３）Ｔｈ２またはその分化途上に発現する蛋白質をコードするＤＮＡの取得
（２）で得られた、Ｔｈ１及びＴｈ２のｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡ断片を網羅的に比較することにより、Ｔｈ２の分化に伴って発現してくるが、Ｔｈ１の場合には発現しない蛋白質をコードするＤＮＡを検出する。具体的には、ディファレンシャル・ディスプレイ法等が好ましく用いられる。ディファレンシャル・ディスプレイの方法としては、Ｌｉａｎｇ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７， ９６７ （１９９２）， Ｌｉａｎｇ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２１， ３２６９ （１９９３）， ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．， １１， ２４２ （１９９５）等に記載の方法を挙げることができる。使用するオリゴヌクレオチドプライマー・セットとしては、例えばＯｐｅｒｏｎ １０−ｍｅｒ Ｋｉｔｓ（オペロン社製）等を用いることができ、このような市販キットを用いて行うこともできる。ディファレンシャル・ディスプレイにより得られたｃＤＮＡ断片については、通常、複数回の解析を行うことにより、解析の精度を更に上げることができる。また、取得されたｃＤＮＡ断片の発現が、ディファレンシャル・ディスプレイの発現パターンと同じであることを確認することによって解析の精度を向上させることができる。具体的には、Ｓｌｏｔ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｖｏｇｅｌｉ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．， ２４， １３８５−１３８６（１９９６））を用いて行うことができる。
【００１８】
（４）Ｔｈ２またはその分化途上に発現する蛋白質をコードするＤＮＡの解析
上記（３）で得られたｃＤＮＡ断片をクローニングベクター、例えばｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ等にＴ４−ＤＮＡリガーゼ等を用いて挿入し、このプラスミドを適当な宿主、例えば大腸菌等に形質転換する。この形質転換した細胞株を培養し、形質転換体の細胞懸濁液から適当な方法を用いてプラスミドを調製する。次に、このプラスミド中に挿入されているＤＮＡの塩基配列を解析する。塩基配列の解析法は、例えばクローニングベクターについて適当なシーケンス用プライマー、具体的にはＭ１３Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）やＲｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等とオートシーケンサー用ＰＣＲシーケンスキット、例えばダイデオキシチェーンターミネーション法シーケンスキット（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等を用いて反応を行い、これを適当なオートＤＮＡシーケンサー、例えば日立蛍光式ＤＮＡシーケンサーＳＱ３０００（日立電子エンジニアリング社製）等で解析する。
【００１９】
取得されたｃＤＮＡ断片がＯＲＦの全長を含んでいない場合には、得られたＤＮＡ断片をプローブとして、上記（２）で得られたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによりＯＲＦの全長を含むＤＮＡを取得することもできる。
得られたＤＮＡが新規のものであるか否かは、これをＢｌａｓｔ ｓｅａｒｃｈ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）等の検索サイト等を利用して検索することによって確認することができる。
【００２０】
かくして得られるＴｈ２に発現するが、Ｔｈ１には発現しない蛋白質をコードするＤＮＡとして、例えば配列番号１に示す配列を有するものを挙げることができる。またこのｃＤＮＡクローンは蛋白質のコーディング領域を全て含むことが確認されている。本発明のＴｈ２に発現するが、Ｔｈ１には発現しない蛋白質およびそれをコードするＤＮＡとは、上記したディファレンシャルディスプレイにおいて、Ｔｈ２において発現するが、Ｔｈ１には発現しないことが確認されるもの、あるいは下述の実施例２に記載するようなｍＲＮＡ量の測定において、Ｔｈ２に発現するがＴｈ１には発現しないものを意味し、必ずしもＴｈ１で完全に発現しないことを意味するものではない。
【００２１】
本発明のＤＮＡは、配列番号１に示される塩基配列を含むもののみならず、配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＴｈ２に発現するがＴｈ１には発現しない蛋白質をコードし得るＤＮＡであれば如何なる塩基配列を有するものであってもよい。これらの塩基配列には、配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴｈ２に発現するが、Ｔｈ１には発現しない蛋白質をコードし得るＤＮＡも含有される。
【００２２】
ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列番号１に示される塩基配列と７０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡ等が挙げられる。また、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとは、通常のハイブリダイゼーション緩衝液中で、温度が４０〜７０℃、好ましくは６０〜６５℃等で反応を行い、塩濃度が１５〜３００ｍＭ、好ましくは１５〜６０ｍＭ等の洗浄液中で洗浄する方法に従って行うことができる。
【００２３】
また、アミノ酸残基の置換、欠失、付加等を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等から調製されたものでも、合成ＤＮＡでもよい。ＤＮＡの塩基配列の置換は、例えばサイトダイレクテドミュータジェネシスキット（宝酒造）や、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等の市販キットを用いることができる。
【００２４】
また、配列番号１に記載の塩基配列は、マウスを由来とするものであるが、上記したｃＤＮＡライブラリーの作製法に従ってヒトのｃＤＮＡライブラリーを作製し、該ライブラリーに対して配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしたハイブリダイゼーションを行うことにより、配列番号１に記載の塩基配列がコードする蛋白質のヒトのホモログ蛋白質をコードするＤＮＡを取得することもできる。本発明の配列番号１に記載の塩基配列またはその相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡには、このようなヒトのホモログをコードするＤＮＡも含まれる。このようなヒト由来の配列を有する本発明のＤＮＡとしては、例えば、配列番号３または９に記載の塩基配列を含むもの等が挙げられる。
【００２５】
（５）組み換え蛋白質の取得
本発明のＴｈ２に発現するが、Ｔｈ１には発現しない蛋白質の組み換え体を作製する方法としては、例えば、上記（３）で得られた該蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを作製し、これを適当な宿主に導入し、該導入宿主を適当な条件下で培養した培養物から組み換え蛋白質を抽出する方法等が挙げられる。組み換え蛋白質を発現するためのベクターとしてはこれを導入する宿主内で（３）で得られたＤＮＡまたはそれを含むＤＮＡ断片が発現されるものであれば特に制限はないが、通常宿主に適したプロモーターが挿入されている市販の蛋白質発現ベクターを用いる。また、プラスミドベクター、ファージベクターともに使うことができる。
【００２６】
具体的には、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ストラタジーン社製）、ｐＳＶＫ３（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）等が挙げられる。また、ｐＭＫＩＴＮｅｏ（丸山和夫、細胞工学別冊８，新細胞工学実験プロトコール、ｐ．２５９，
秀潤社、（１９９３））等も好ましく用いられる。
本発明のＤＮＡを発現させるためのプロモーターとしては、宿主が保有するプロモーターを一般に用いることができるが、これに限られるものではなく、具体的には宿主微生物が大腸菌の場合にはＴ３、Ｔ７、ｔａｃ、ｌａｃプロモーター等を用いることができ、酵母の場合にはｎｍｔ１プロモーター、Ｇａｌ１プロモーター等が挙げられる。また動物培養細胞の場合にはＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター等が挙げられる。またほ乳類由来のプロモーターが機能可能な宿主を用いる場合には、本発明のＤＮＡに固有のプロモーターを用いることもできる。
【００２７】
これらのベクターへの（３）で得られた遺伝子ＤＮＡの挿入は、該ＤＮＡまたはこれを含むＤＮＡ断片をベクター中のプロモーターの下流にプロモーターの制御下におかれるように連結して行う。また、プロモーターと本発明のＤＮＡとの間にコザック配列（Ｋｏｚａｋ， Ｍ．， Ｇｅｎｅ， ２３４， １８７， （１９９９））を挿入したり、本発明のＤＮＡの下流にタグとなるポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入した構造を有するベクターも好ましく用いられる。タグとなるポリペプチドとしては特に制限はないが、例えば、ＦＬＡＧタグ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ７， ５８０， （１９８９））等が挙げられる。
【００２８】
このようにして得られた本発明の組換えベクターは、リン酸カルシウム法（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２１， ５５１（１９８３））、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２１５， １６６（１９８２））、電気パルス法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１， ７１６１（１９８４））、インビトロパッケージング法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７２， ５８１（１９７５））、ウィルスベクター法（Ｃｅｌｌ， ３７， １０５３（１９８４））、あるいはリポフェクション法（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製））等によって適当な宿主に導入される。
【００２９】
このとき、該組み換えベクターを導入する宿主としては、該ベクターが体内で複製可能であり、かつ該ＤＮＡがコードする蛋白質が生成されるものであれば特に限定されないが、例えば大腸菌、酵母、バキュロウィルス（節足動物多角体ウイルス）−昆虫細胞、動物細胞等が挙げられる。具体的には、大腸菌ではＢＬ２１、ＸＬ−２Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社製）等、酵母では例えばＳＰ−Ｑ０１（ストラタジーン社製）等、バキュロウィルスでは例えばＡｃＮＰＶ（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６３， ７４０６（１９８８））とその宿主であるＳｆ−９（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６３， ７４０６（１９８８））等が挙げられる。また動物細胞としてはマウス繊維芽細胞Ｃ１２７（Ｊ． Ｖｉｏｌ． ， ２６， ２９１（１９７８））やチャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７， ４２１６（１９８０））やアフリカミドリザル腎臓由来ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１：アメリカン タイプ カルチャー コレクション）等が挙げられる。
【００３０】
上記したような組み換えベクターを用いる発現方法の他に、プロモーターを連結した本発明のＤＮＡ断片を宿主の染色体中に直接挿入する相同組換え技術（Ａ． Ａ．Ｖｅｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ５７， ２０３６（１９９３））、あるいはトランスポゾンや挿入配列（Ａ． Ａ． Ｖｅｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １１，
７３９（１９９４））等を用いて発現させることができる。
【００３１】
組み換えベクターを導入した導入体は、それぞれに適した培地により培養される。培地中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物、ビタミン、血清および耐性スクリーニングに用いられる薬剤などが含有される。具体的には、形質転換体の宿主が大腸菌の場合には、例えばＬＢ培地（ナカライテスク社製）等、酵母の場合には、ＹＰＤ培地（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， １， １１７， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ（１９７９））等、宿主が昆虫細胞および動物細胞の場合は、２０％以下のウシ胎児血清を含有するＨａｍ−１２培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ社製）等を挙げることができる。また、培養は通常温度２０℃〜４５℃、ＣＯ２濃度２〜１０％の範囲で行うことが好ましい。培養時間は、宿主及び組み換えベクター等によって適宜選択することができるが、好ましくは１２〜８０時間である。さらに、必要に応じて通気、攪拌が行われる。これら以外の培地組成あるいは培養条件下でも導入宿主が生育し、挿入された本発明のＤＮＡがコードする蛋白質が生成されればいかなるものであってもよい。
【００３２】
このようにして培養された導入体の回収方法は、例えば宿主が細胞である場合には、培養物を遠心分離等により細胞を分離した後、細胞体あるいは培養上清として回収する方法等が用いられる。回収された細胞体からの組み換え蛋白質の抽出方法としては、それ自体既知の通常用いられる方法が挙げられるが、例えば、細胞をリン酸バッファー（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）に懸濁した後に、等量のサンプルバッファー（０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％ ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ）、２０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１０％ β−ｍｅｒｃａｐｔｏ ｅＴｈａｎｏｌ（２−ＭＥ）、０．２％ ｂｒｏｍｏｐｈａｎｏｌ ｂｌｕｅ（ＢＰＢ））を添加して９８℃で１〜１０分間ボイルする方法等が挙げられる。
【００３３】
抽出された蛋白質は、ＳＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳動等により分離し、適当な染色試薬、例えば、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）等によりゲルを染色することにより確認することができる。また、後述する本発明の蛋白質の抗体との結合性を解析することによってもその発現状態を確認することができる。
また一般的に、発現された蛋白質は生体内に存在する蛋白質分解酵素により切断されること（プロセッシング）が知られている。本発明の蛋白質も当然のことながら切断されたアミノ酸配列の部分断片であっても、Ｔｈ２に発現するがＴｈ１には発現しないものであれば、本発明の蛋白質に含まれる。
【００３４】
かくして得られる蛋白質が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には遊離体または他の塩に変換することができる。この様な塩も本発明の蛋白質に含まれる。また、上記した導入宿主が産生する蛋白質を、精製前または後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することにより修飾蛋白質とすることができる。これらの修飾蛋白質も上記したＴｈ２に発現するが、Ｔｈ１には発現しないものであれば本発明の範囲に含まれる。
【００３５】
（６）オリゴヌクレオチドの調製
上記（３）で取得した本発明のＤＮＡまたはその断片を用いて、ＤＮＡ合成機などを用いる常法により、本発明のＤＮＡの一部の配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチド、センス・オリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドを調製することができる。該オリゴヌクレオチドとしては、上記ＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５〜５００塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡを挙げることができる。具体例としては、配列番号１で表される塩基配列中の連続した５〜５００塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡを挙げることができる。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用いる場合には、両者の融解温度（Ｔｍ）および塩基数が極端に変わることのない上記のオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００３６】
また、本発明のＤＮＡの部分断片は、例えばこれをプローブ、またはＰＣＲプライマーとして用いることにより、本発明の蛋白質の発現異常により免疫系の異常を来す疾患の、遺伝子診断に使用することができる。具体的には、例えば検体中の本発明の蛋白質のｍＲＮＡの発現量や、損傷の程度を本発明のＤＮＡをプローブとした通常のノーザンハイブリダイゼーションや半定量的なリバースＰＣＲ（Ｓｏｕｒｖｉｎｏｓ， Ｇ．ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， １８， ４９６８（１９９９））により解析したり、あるいは検体中の本発明の蛋白質をコードする遺伝子の変異の有無や、変異の位置をＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， ８６， ２７６６（１９８９））等で検知することができる。ＤＮＡプローブまたはプライマーの大きさは、上記解析または検知が可能な長さであれば特に制限されないが、通常ＤＮＡプローブとしては例えば２０〜５００塩基対のものが用いられ、ＰＣＲプライマーとしては１５〜１００塩基、好ましくは２０〜４０塩基程度の長さが適当である。ハイブリダイゼーションプローブとして用いる場合には、ハイブリダイゼーションの条件等にあわせて適宜選択することができる。
【００３７】
また、これらオリゴヌクレオチドの誘導体も本発明のオリゴヌクレオチドとして利用することができる。該オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等を挙げることができる。
【００３８】
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、これを２本鎖ＲＮＡとして調製することにより、ＲＮＡインターフェアレンス法に適用することができる。２本鎖ＲＮＡの作製方法、及びＲＮＡインターフェアレンス法については、例えば、（Ｅｌｂａｓｈｉｒ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４１１， ４９４−４９８（２００１））に記載の方法等を用いることができる。上記２本鎖ＲＮＡは、そのすべてがＲＮＡである必要はない。具体的には、その一部がＤＮＡであるものとして、ＷＯ０２／１０３７４公報に記載のものを用いることができる。
【００３９】
２本鎖ポリヌクレオチドを導入する被導入体としては、標的遺伝子がその細胞内でＲＮＡに転写、または蛋白質に翻訳を受け得るものであれば如何なるものであってもよいが、具体的には、植物、動物、原生動物、ウィルス、バクテリア、または真菌種に属するものが挙げられる。植物は単子葉植物、双子葉植物または裸子植物であってよく、動物は、脊椎動物または無脊椎動物であってよい。好ましい微生物は、農業、林業、水産業、または工業によって使用されるものであり、そして植物または動物に対して病原性のものである。真菌には、カビ及び酵母形態両方での生物体が含まれる。脊椎動物の例には、魚類、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ハムスター、マウス、ラット及びヒトを含む哺乳動物が含まれ、無脊椎動物には、線虫類及び他の虫類、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、及び他の昆虫が含まれる。
【００４０】
被導入体は、細胞、組織、あるいは個体を意味する。ここで細胞とは、生殖系列または体性、分化全能、または多分化能、分割または非分割、実質組織または上皮、不滅化したものまたは形質転換したもの等からであってよい。細胞は、配偶子または胚であってよく、胚の場合、単一細胞胚または構成性細胞、または多重細胞胚からの細胞であり、胎児組織を含む。さらには、幹細胞のような未分化細胞、または胎児組織を含む器官または組織の細胞からのような分化細胞、または生物内に存在する任意の他の細胞であってよい。分化している細胞型には、脂肪細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチン生成細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞及び内分泌線または外分泌腺の細胞が含まれる。
【００４１】
被導入体への２本鎖ポリヌクレオチドの導入法としては、被導入体が細胞、あるいは組織の場合は、カルシウムフォスフェート法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウィルス感染、２本鎖ポリヌクレオチド溶液への浸漬、あるいは形質転換法等が用いられる。また、胚に導入する方法としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション法、あるいはウィスル感染等が挙げられる。被導入体が植物の場合には、植物体の体腔または間質細胞等への注入または灌流、あるいは噴霧による方法が用いられる。また、動物個体の場合には、経口、局所、（皮下、筋肉内及び静脈内投与を含む）非経口、経膣、経直腸、経鼻、経眼、腹膜内投与等によって全身的に導入する方法、あるいはエレクトロポレーション法やウィルス感染等が用いられる。経口導入のための方法には、２本鎖ポリヌクレオチドを生物の食物と直接混合することができる。さらに、個体に導入する場合には、例えば埋め込み長期放出製剤等として投与することや、２本鎖ポリヌクレオチドを導入した導入体を摂取させることにより行うこともできる。
【００４２】
導入する２本鎖ポリヌクレオチドの量は、導入体や、標的遺伝子によって適宜選択することができるが、細胞あたり少なくとも１コピー導入されるに充分量を導入することが好ましい。具体的には、例えば、被導入体がヒト培養細胞で、カルシウムフォスフェート法により２本鎖ポリヌクレオチドを導入する場合、０．１〜１０００ｎＭが好ましい。
【００４３】
（７）本発明の蛋白質に特異的に結合する抗体
本発明の蛋白質と特異的に結合する抗体の調製方法としては、通常用いられる公知の方法を用いることができ、抗原として用いられるポリペプチドについても、公知の方法に従って抗原性が高くエピトープ（抗原決定基）として適した配列を選択して用いることができる。エピトープの選択方法としては、例えばＥｐｉｔｏｐｅ Ａｄｖｉｓｅｒ（富士通九州システムエンジニアリング社製）等の市販のソフトウェア等を用いて行うことができる。
【００４４】
上記の抗原として用いるポリペプチドは、公知の方法に従って合成した合成ペプチドでも、また本発明の蛋白質そのものを用いることもできる。抗原となるポリペプチドは、公知の方法に従って適当な溶液等に調製して、哺乳動物、例えばウサギ、マウス、ラット等に免疫を行えばよいが、安定的な免疫を行ったり抗体価を高めるために抗原ペプチドを適当なキャリア蛋白質とのコンジュゲートにして用いたり、アジュバント等を加えて免疫を行うのが好ましい。
【００４５】
免疫に際しての抗原の投与経路は特に限定されず、例えば皮下、腹腔内、静脈内、あるいは筋肉内等のいずれの経路を用いてもよい。具体的には、例えばＢＡＬＢ／ｃマウスに抗原ポリペプチドを数日〜数週間おきに数回接種する方法等が用いられる。また、抗原の摂取量としては、抗原がポリペプチドの場合０．３〜０．５ｍｇ／１回程度が好ましいが、ポリペプチドの種類、また免疫する動物種によっては適宜調節される。
【００４６】
免疫後、適宜試験的に採血を行って固相酵素免疫検定法（以下、これを「ＥＬＩＳＡ法」と称することがある）やウエスタンブロッティング等の方法で抗体価の上昇を確認し、十分に抗体価の上昇した動物から採血を行う。これに抗体の調製に用いられる適当な処理を行えばポリクローナル抗体を得ることができる。具体的には、例えば、公知の方法に従い血清から抗体成分を精製した精製抗体を取得する方法等が挙げられる。抗体成分の精製は、遠析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法を用いることができる。
【００４７】
また、該動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを用いて公知の方法に従って融合させたハイブリドーマを用いる（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６， ４９５（１９７５））ことによりモノクローナル抗体を作製することもできる。モノクローナル抗体は、例えば以下の方法により取得することができる。
まず、上記した抗原の免疫により抗体価の高まった動物から抗体産生細胞を取得する。抗体産生細胞は、形質細胞、及びその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体の何れから取得してもよいが、好ましくは脾臓、リンパ節、末梢血等から取得する。これらの細胞と融合させるミエローマとしては、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来等）ミエローマ細胞株であるＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８０）とＰ３−ＮＳ１／１Ａｇ４．１（理研セルバンク：ＲＣＢ００９５）、あるいはＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３由来のハイブリドーマＳＰ２／０−Ａｇ１４ （ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８１）等が好ましく用いられる。細胞の融合は、抗体産生細胞とミエローマ細胞を適当な割合で混合し、適当な細胞融合培地、例えばＲＰＭＩ１６４０やイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、あるいはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等に、５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を溶解したもの等を用いることにより行うことができる。また電気融合法（Ｕ． Ｚｉｍｍｅｒ− ｍａｎｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ， ６８， ５７７（１９８１））によっても行うことができる。
【００４８】
ハイブリドーマは、用いたミエローマ細胞株が８−アザグアニン耐性株であることを利用して適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）液を含む正常培地（ＨＡＴ培地）中で５％ＣＯ２、３７℃で適当時間培養することにより選択することができる。この選択方法は用いるミエローマ細胞株によって適宜選択して用いることができる。選択されたハイブリドーマが産生する抗体の抗体価を上記した方法により解析し、抗体価の高い抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等により分離し、分離した融合細胞を適当な培地で培養して得られる培養上清から硫安分画、アフィニティクロマトググラフィー等の適当な方法により精製してモノクローナル抗体を得ることができる。また精製には市販のモノクローナル抗体精製キットを用いることもできる。さらには、免疫した動物と同系統の動物、またはヌードマウス等の腹腔内で上記で得られた抗体産生ハイブリドーマを増殖させることにより、本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることもできる。
【００４９】
また、本発明の蛋白質としてヒト由来のものを取得した場合には、かかるポリペプチド、あるいはその部分ペプチドを抗原として、ヒト末梢血リンパ球を移植したＳｅｖｅｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（ＳＣＩＤ）マウスに上記した方法と同様にして免疫し、該免疫動物の抗体産生細胞とヒトのミエローマ細胞とのハイブリドーマを作製することによってもヒト型抗体を作製することができる（Ｍｏｓｉｅｒ， Ｄ． Ｅ．， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ， ３３５， ２５６−２５９ （１９８８）； Ｄｕｃｈｏｓａｌ， Ｍ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３５５， ２５８−２６２（ １９９２）。
【００５０】
また、取得したヒト型抗体を産生するハイブリドーマからＲＮＡを抽出し、目的のヒト型抗体をコードする遺伝子ＤＮＡをクローニングして、この遺伝子ＤＮＡを適当なベクターに挿入し、これを適当な宿主に導入して発現させることにより、さらに大量にヒト型抗体を作製することができる。ここで、抗原との結合性の低い抗体は、それ自体既知の進化工学的手法を用いることによりさらに結合性の高い抗体として取得することもできる。一価性抗体等の部分フラグメントは、例えばパパイン等を用いてＦａｂ部分とＦｃ部分を切断し、アフィニティカラム等を用いてＦａｂ部分を回収することによって作製することができる。
【００５１】
かくして得られる本発明の蛋白質と特異的に結合する抗体は、本発明の蛋白質に特異的に結合することによって該蛋白質が発現している組織あるいは細胞等を特定すること等に用いられる。
【００５２】
（８）本発明の蛋白質またはそれをコードするＤＮＡ、特異抗体の利用方法
本発明の蛋白質またはこれをコードするｍＲＮＡ等の生成の有無、またはそれらの体液中またはＴ細胞内の濃度の高低を測定することでＴｈ２機能のレベルを推定することができる。Ｔｈ２機能は花粉症や食物アレルギーの発症に必須の機能であり、この機能レベルを知ることにより、アトピー素因の有無やアレルギー患者の発症原因の特定に役立つ。また、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの自己免疫病においてもＴｈ２機能が異常に亢進していると考えられ、逆に慢性関節リウマチやシェグレン症候群などの自己免疫病ではＴｈ１機能に比してＴｈ２機能が低下していると考えられる。従って、特にＴ細胞による該蛋白質等の生成能とＩＦＮ−γの生成能を合わせて測定することにより、Ｔｈ１機能とＴｈ２機能のバランスを推定することができ、これらの疾患の有無、または罹患し易さを推定することができる。また、線虫などの寄生虫の感染の際にはＴｈ２機能が抗原非特異的に亢進することが知られており、該蛋白質等はこれらの寄生虫感染の有無を知るための指標としても役立つ。さらに、妊娠期においてはＴｈ１機能に比してＴｈ２機能が亢進することが知られており、該蛋白質等の生成が正常な妊娠維持の指標の一つとして役立つ。
【００５３】
また、該蛋白質等はサイトカインとしての性質を持つので、その受容体が存在すると考えられ、その受容体を探索するために該蛋白質、およびそれをコードするＤＮＡの導入体等を用いることができる。受容体のスクリーニング方法としては、本発明の蛋白質と相互作用する物質を、それ自体既知の方法により選抜する方法や、被検物質の本発明の蛋白質に対する結合性を本発明の蛋白質に特異的に結合する抗体との競合実験によって解析する方法等が挙げられる。
【００５４】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
実施例１ マウス Ｔ 細胞の２型ヘルパーＴ細胞への機能分化の際に誘導されるが、１型ヘルパー Ｔ 細胞の場合には発現しない蛋白質をコードする ＤＮＡ の取得（ ＰＣＲ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｉｓｐｌａｙ ＭｅＴｈｏｄ ）
（１）２型ヘルパーＴ細胞への機能分化を誘導したＴ細胞からのｃＤＮＡ調製
遺伝子源となるマウスは、ＲＡＧ−２遺伝子欠損マウスと、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）を遺伝子導入したマウスの、交配により作成した。ＲＡＧ−２遺伝子欠損マウスは、常法に従って作成されたもの（Ｓｈｉｎｋａｉ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ６８， ８５５ （１９９２））を用いた。また、ＴＣＲ遺伝子導入マウスは、卵白アルブミン（ＯＶＡ）に特異的なＴＣＲ遺伝子を定法（発生工学実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７））に従って導入、作製した（Ｏｈｏｋａ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ８， ２９７， （１９９６））。両マウスを交配することにより、ＲＡＧ−２を欠損した遺伝的背景に、単一のＴＣＲを発現する、つまり内因性のＴＣＲ発現がなく、導入されたＴＣＲのみを発現するマウスが作製された。このマウスでは主要組織適合抗原（ＭＨＣ）拘束性を利用することにより、胸腺においてＴ細胞の分化をＣＤ４／ＣＤ８両陽性細胞の段階で停止させることができ、大部分の胸腺細胞が未熟なＣＤ４／ＣＤ８両陽性細胞となる特徴がある。
【００５５】
上記マウスをＳＰＦ条件下にて飼育し、この胸腺を無菌的に取り出し、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）に記載の方法により、１０％非働化ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（シグマ社製）で４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度の細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液に、Ｉｗａｔａ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２６， ２０８１（１９９６）に記載の方法によって、試験管内で、Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ（カルビオケム社製）０．２μｇ／ｍｌとＰｈｏｒｏｂｏｌ Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ Ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ、シグマ社製）０．２ｎｇ／μｌを加え、１０％ＣＯ２、３７℃の環境で２０時間刺激培養した。培養後、細胞を洗浄し、新しい培養液中でＩｏｎｏｍｙｃｉｎとＰＭＡを加えずにさらに２４時間培養した。この時点でほとんどの細胞はＣＤ４陽性Ｔ細胞系列にコミットしていた。
【００５６】
これらの細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で新たな培地に懸濁し、Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ、０．２μｇ／ｍｌとＰＭＡ、３．０ｎｇ／ｍを加え、２度目の刺激培養を１７時間行なった後、細胞を洗浄した。
これらの細胞をＴｈ２に分化させるために、新たな培地中に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で懸濁し、２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのリコンビナント・マウス・ＩＬ−２：Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社製、１，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのリコンビナント・マウス・ＩＬ−４：Ｇｅｎｚｙｍｅ社製、１μｇ／ｍｌのモノクローナル抗マウス・ＩＦＮ−γ抗体（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製：クローンＸＭＧ１．２）、および１μｇ／ｍｌのモノクローナル抗マウス・ＩＬ−１２
抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製：クローンＣ１７．８）を添加して２４〜９６時間培養した。
【００５７】
一方、Ｔｈ１に分化させるためには、２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのリコンビナント・マウス・ＩＬ−２：Ｇｅｎｚｙｍｅ社製、１０ｎｇ／ｍｌのリコンビナント・マウスＩＬ−１２（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）、および１μｇ／ｍｌのモノクローナル抗マウスＩＬ−４抗体（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製：クローン１１Ｂ１１）を添加して２４〜９６時間培養した。
【００５８】
これらの培養で得た細胞からＡｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｕｍ Ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍｍｅＴｈｏｄ（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １６２（１）， １５６−９（１９８７））によりＴｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。調製したＴｏｔａｌ ＲＮＡのうち０．５μｇを、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）１０ｍＭ、ＭＭＬＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）３００Ｕ、ＲＮＡｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（プロメガ社製）１１７Ｕ、アンカープライマー（配列番号４）２．５μＭ、ｄＮＴＰ２０μＭを含む逆転写反応液に供してインキュベートを行った。
【００５９】
この逆転写反応液０．５μｌを、ｄＮＴＰ２μＭ、０．６Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）、６７ｎＭ［α−３３Ｐ］ｄＣＴＰ、アンカープライマー（配列番号４）２．５μＭ、及びアービトラリープライマー（配列番号５）０．５μＭを含むポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）緩衝液（ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに添付）４．５μｌに供し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃−３分、４０℃−５分、７２℃−５分を１サイクル、９４℃−３０秒、４０℃−２分、７２℃−３０秒を３５サイクル、さらに７２℃−５分の条件で行った。
【００６０】
（２）２型ヘルパーＴ細胞への機能分化に伴い発現誘導されるが、１型ヘルパーＴ細胞の場合には発現しない蛋白質をコードするＤＮＡの取得
上記（１）でＴｈ２及びＴｈ１より調製したＲＮＡより得られたｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片を、６％ポリアクリルアミドシークエンスゲルを用いた電気泳動により分離し、オートラジオグラフィーによって可視化し、両ＤＮＡ断片を比較した。ここで、Ｔｈ２への分化過程でのみ観察されるＤＮＡ断片が含まれるゲルを切り出し、１００μｌの沸騰水中でＤＮＡを抽出した。この抽出液に含まれるＤＮＡを５０μｇのＧｌｙｃｏｇｅｎを含むエタノールにて沈殿させ、これを１０μｌの水に溶解した。
【００６１】
このうち４μｌをｄＮＴＰ２５μＭ、２．５Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）、アンカープライマー（配列番号４）１．０μＭ、及びアービトラリープライマー（配列番号５）０．５μＭを含むＰＣＲ緩衝液（ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに添付）１９μｌに供し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃−３０秒、４０℃−２分、７２℃−３０秒を３５サイクル、さらに７２℃−５分の条件で行った。このＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片が１種類のものであることを、２％アガロースゲルによる電気泳動で分離し確認した。
【００６２】
この増幅されたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に、ベクターに添付のマニュアルに準じてクローニングした。さらに、このＤＮＡ断片をＳｌｏｔ ｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓ（Ｖｏｇｅｌｉ， Ｌ． Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．， ２４， １３８５−１３８６（１９９６））に供し、上記で行ったオリジナルのｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙの発現パターンと同じであることを確認した。
【００６３】
ここで増幅されたＤＮＡ断片は２５３ｂｐで、コーディング領域を含んでいなかったので、これをプローブとして、上記（１）で取得したＴｈ２由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、さらに選抜されたクローンに含まれる３種類のＤＮＡ断片をシーケンスして、配列番号１の塩基番号１５１９〜４０２０にあたる２５００ｂｐのクローン、３４５８〜４０２１にあたる５６４ｂｐのクローン、および３７３７〜４０２０にあたる２８４ｂｐのクローンを取得した。この３つはコンティグを形成した。
【００６４】
得られたＤＮＡ断片の塩基配列を種々のデータベースでホモロジー検索したところ、１）ＥＳＴマウスデータベース（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＡＡ４７２１１４）、２）ＥＳＴラットデータベース（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＡＩ１１２３７４）、３）ＥＭＢＬヒトデータベース（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＨＳＭ８０１０５４）、４）ヒトゲノムデータベース（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＸＭ ０４６２６４）、及び５）ヒトゲノムデータベース（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＡＣ０９２０４２．２）に相同性を有するＤＮＡが登録されていた。しかし、１）および２）はコーディング領域を含まないｃＤＮＡの３’端断片であり、３）および４）はＣ末端側のコーディング領域の一部とその下流の一部を含むｃＤＮＡ断片であった。５）に関しては、Ｎ末端側のコーディング領域が同定されていなかった。また、いずれのＤＮＡ断片についてもそれがコードする蛋白質の機能については記載がされていなかった。
【００６５】
上記で得られた２５００ｂｐ中の２４３ｂｐのＤＮＡ断片（配列番号１の塩基番号３７７８〜４０２０に相当する）をプローブとして、正常マウス脳由来のｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）からコーディング領域の大部分を含み、Ｎ末端部分をコードする領域を欠く３７１５ｂｐのクローンを得た。そこで、さらにこれに基づき、コーディング領域の一部を含む３７３ｂｐのＤＮＡ断片（配列番号１の塩基番号５６３〜９３５に相当する）をプローブとして、上記した正常マウス脳由来のｃＤＮＡライブラリーから９６１ｂｐのＤＮＡ断片（配列番号１の塩基番号１〜９６１に相当する）を単離した。これらはコンティグを形成し、これらを用いてコーディング領域（配列番号１のアミノ酸連記部分）を含む配列番号１に示したｃＤＮＡの全長（以下、これを「２４２Ｃ ｃＤＮＡ」、これと対応するｍＲＮＡを「２４２Ｃ ｍＲＮＡ」と称することがある）が得られた。
【００６６】
該ＤＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は５３３アミノ酸（配列番号１の塩基番号５４８〜２２４２）に渡っており、Ｎ末端側アミノ酸の約３３〜４３残基はシグナル配列を形成していた（図１）。従って、該ＤＮＡがコードする蛋白質（以下これを「２４２Ｃ蛋白質」と称することがある）は分泌性蛋白質または新規サイトカインであると考えられた。
【００６７】
該ＤＮＡを、上記ヒトゲノムデータベースによりさらに解析したところ、このｃＤＮＡのヒトホモログは少なくとも５つのエキソンから成っており、ヒトでは第３染色体ｐ２１．３２の付近に位置していた。しかし、マウスｃＤＮＡのＮ末端の５アミノ酸をコードする塩基配列のヒト相同部位については、今の所、同定できない。このヒト由来のｃＤＮＡ配列を配列番号３に示す。
【００６８】
実施例２ Ｔｈ２ 細胞への分化誘導に伴う ２４２Ｃ ｍＲＮＡ 発現の解析
実施例１（１）に記載の方法により、胸腺細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで２度のｉｏｎｏｍｙｃｉｎ／ＰＭＡ刺激を加えた後、新たな培地中でサイトカインと抗体を添加して培養し、Ｔｈ１とＴｈ２を誘導した。このサイトカインと抗体を添加した培養において、経時的に細胞を回収し、細胞中の２４２Ｃ ｍＲＮＡの発現レベルをコントロールのβ−ａｃｔｉｎ ｍＲＮＡレベルとＲＴ−ＰＣＲを用いて比較した（図２）。その結果、２４２Ｃ ｍＲＮＡの発現はＴｈ２への分化に伴って誘導されるが、Ｔｈ１の場合には発現しないことが見出された。
【００６９】
この結果を他のＴｈ１／Ｔｈ２分化誘導系において確認するために、ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア社製）の脾臓細胞からＭｉｙａｕｒａ， Ｈ．， ＆ Ｉｗａｔａ， Ｍ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６８， １０８７， （２００２）に記載の方法により、ＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞を調製し、この細胞からＴｈ１およびＴｈ２を分化誘導した。Ｔｈ２に分化させるためには、新たな培地中に５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で懸濁し、２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのリコンビナント・マウスＩＬ−２（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）、１，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのリコンビナント・マウスＩＬ−４（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）、２μｇ／ｍｌのモノクローナル抗マウス・インターフェロン−γ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製：クローンＸＭＧ１．２）、および１μｇ／ｍｌのモノクローナル抗マウスＩＬ−１２抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製：クローンＣ１７．８）を添加して、ハムスター・モノクローナル抗マウスＣＤ３抗体（クローン１４５−２Ｃ１１、Ｌｅｏ， Ｏ．， ｅｔ
ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８４， １３７４， （１９８７））とハムスター・モノクローナル抗マウスＣＤ２８抗体（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製：クローン３７．５１）をコートしたプレート中で、２４〜９６時間培養した。
【００７０】
一方、Ｔｈ１に分化させるためには、２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのリコンビナント・マウスＩＬ−２（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）、１０ｎｇ／ｍｌのリコンビナント・マウスＩＬ−１２（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）、および１μｇ／ｍｌのモノクローナル抗マウスＩＬ−４抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製：クローン１１Ｂ１１）を添加して、Ｔｈ２の場合と同様に抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体をコートしたプレート中で、２４〜９６時間培養した。経時的に細胞を回収し、細胞中の２４２Ｃ ｍＲＮＡの発現レベルをコントロールのβ−ａｃｔｉｎ ｍＲＮＡレベルとＲＴ−ＰＣＲを用いて比較した（図２）。その結果、２４２Ｃ ｍＲＮＡの発現はやはりＴｈ２への分化に伴って誘導されることが確認された。
【００７１】
実施例３ 抗２４２Ｃ抗体の作製
配列番号２のアミノ酸番号３６５〜３７８の部分ペプチドのＮ末端にシステインを付加した１５残基のペプチドＡ（配列番号６）を合成し（サワディーテクノロジー社に依頼）、Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎｅにコンジュゲートしてウサギに免疫した（サワディーテクノロジー社に依頼）。初回免疫は０．１５ｍｇをフロイント完全アジュバンドとともに行い、その後２週間ごとに２回目から４回目まで０．３ｍｇをフロイント不完全アジュバンドとともに皮下に注射した。５回目の免疫は４回目から４週間後に行い、その１０日後に血液を採取し、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｈａｒｌｏｗ Ｅ．， ａｎｄ Ｌａｎｅ Ｄ．）に記載の方法により血清を精製した（以下、これを「抗２４２ＣペプチドＡ血清」と称することがある）を取得した。得られた抗血清は公知の固相酵素免疫検定法（以下、これを「ＥＬＩＳＡ法」と称することがある）を用いてその抗体価を確認した。
【００７２】
同様に、配列番号２のアミノ酸番号９５〜１１４に相当する２０残基のペプチドＢ（２４２ＣペプチドＢ：配列番号７）を合成し、同様の方法でウサギ抗２４２ＣペプチドＢ血清を取得し、同様にその抗体価を確認した。
モノクローナル抗体を得るため、Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎｅにコンジュゲートした０．１ｍｇの２４２ＣペプチドＢをフロイント完全アジュバンドと混合し、２カ所に分けてメスのＷＫＹ／ＮＣｒｊラット（ＳＪＬ社製）の皮下に注射した。３週間後、リンパ節を集め、そのリンパ球と、８−アザグアニン耐性マウス由来ハイブリドーマＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８１；ＢＡＬＢ／ｃ由来ミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３とＢＡＬＢ／ｃ脾細胞のバイブリッドを２〜３：１の割合で混合し、ＤＭＥＭ培地等に、Ｈｙｂｒｉｍａｘ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ Ｅ．， ａｎｄ Ｌａｎｅ Ｄ．）に記載の方法により細胞融合を行った。
【００７３】
ハイブリドーマは、用いたミエローマ細胞株が８−アザグアニン耐性株であることを利用して適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）液を含む正常培地（ＨＡＴ培地）中で５％ＣＯ２、３７℃で１０〜１４日培養することにより選択した。選択されたハイブリドーマが産生する抗体の抗体価は、上記した２４２ＣペプチドＢまたはそれを含む２４２Ｃ蛋白質の部分ポリペプチド断片（アミノ酸残基４４〜１８２に相当する：配列番号８）を平底９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートにコートして、ＥＬＩＳＡ法により解析した。
【００７４】
抗体価の高い抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法により分離し、分離した融合細胞を培養して得られる培養上清からプロテインＧアガロース・カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いてＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｈａｒｌｏｗ Ｅ．， ａｎｄ Ｌａｎｅ Ｄ．）に記載の方法により精製した。さらに、ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡ Ｊｃｌ−ｎｕ：日本クレア社製）の腹腔内において、上記で得られた抗体産生ハイブリドーマを増殖させ、本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水からＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ Ｅ．， ａｎｄ Ｌａｎｅ Ｄ．）に記載の方法により、硫安分画、カプリル酸分画を利用して抗２４２Ｃモノクローナル抗体を精製した。
【００７５】
実施例４ 動物細胞系での２４２Ｃ蛋白質の強制発現、及び２４２Ｃ蛋白質の細胞内外での発現の解析
（１）ＣＨＯ細胞への２４２Ｃ ｃＤＮＡの導入
上記実施例１で得られた２４２Ｃ ｃＤＮＡ断片を鋳型として、動物細胞用発現ベクターｐＭＫＩＴｎｅｏ（東京医科歯科大学医学部、丸山和夫助教授より供与）に挿入することにより動物細胞発現ベクター、ａ）ｐＭＫＩＴ−２４２ＣＫＳＰＦ、ｂ）ｐＭＫＩＴ−２４２ＣＫＳＰ、ｃ）ｐＭＫＩＴ−２４２ＣＳＰＦ、およびｄ）ｐＭＫＩＴ−２４２ＣＳＰを作製した。ａ）には翻訳開始点近傍上流にコザック配列、下流にＦＬＡＧタグをコードする配列を挿入した。ｂ）には翻訳開始点近傍上流にコザック配列を、ｃ）にはＦＬＡＧタグをコードする配列を、それぞれ挿入した。ｄ）にはコザック配列もＦＬＡＧタグをコードする配列も挿入しなかった。得られたＤＮＡを精製後、制限酵素ＳｍａＩで切断して線状ＤＮＡとし、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）を用いてチャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， ７７， ４２１６（１９８０））に導入した。
【００７６】
（２）ウェスタンブロッティング解析
実施例４（１）で得られた導入細胞を、ウシ胎児血清を１０％含むＨａｍ−１２培地（Ｓｉｇｍａ社製）中で増殖させた。培養上清を除去後、培養器に接着した細胞を血清を含まないＨａｍ−１２で洗浄し、同じ培地中で、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間培養した。培養後、培養上清と細胞を回収分離し、該細胞を氷中でＰＢＳに懸濁し、等量のサンプルバッファー（０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％ ＳＤＳ、２０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１０％ β−ｍｅｒｃａｐｔｏ ｅｔｈａｎｏｌ、０．２％ ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ）を加えて９８℃で５分間ボイルした。培養上清については、５０％アセトンを加えて蛋白質を沈殿させた。沈殿蛋白質に５０％濃度の上記サンプルバッファーを加えて９８℃で５分間ボイルした。
【００７７】
これらのサンプルを１０％ ＳＤＳアクリルアミドゲルにより電気泳動し、４８ｍＭ Ｔｒｉｓ、３９ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ、０．０３７％ ＳＤＳ、２０％ ｅｔｈａｎｏｌの存在下でニトロセルロースメンブレン（ＮｉｔｒｏＢｉｎｄ：Ｏｓｍｏｎｉｃｓ社製）に電気的にトランスファーした。このメンブレンを５％スキムミルクを含むＴ−ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）に１時間浸透し、その後Ｔ−ＴＢＳで２５０倍希釈した上記実施例３で取得した抗ペプチドＡ血清と室温で２時間反応させた。また、対象実験として動物細胞用発現ベクターｐＭＫＩＴｎｅｏのみを導入したＣＨＯ細胞から得た蛋白質を用いて同様に反応を行った。
【００７８】
さらにＴ−ＴＢＳで３回洗浄後、それぞれＴ−ＴＢＳで５，０００倍希釈したＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ結合型ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）と室温で４０分間反応させた。Ｔ−ＴＢＳで３回洗浄後、ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて化学発光によるシグナル検出を行った。
【００７９】
この結果を図３に示す。コントロールベクターのみを導入した細胞では、２４２Ｃ蛋白質の発現は認められなかった。２４２Ｃ ｃＤＮＡを導入したＣＨＯ細胞では、コザック配列またはＦＬＡＧタグの有無による発現量の違いは認められるものの、２４２Ｃ蛋白質は主に培養上清中に産生されていることが確認された。この蛋白質は２つのサイズのバンドとして検出され、２４２Ｃ蛋白質のアミノ酸配列のシグナル部分を除く全長およびその一部を欠く蛋白質に相当すると思われる。
【００８０】
【発明の効果】
本発明によれば、アレルギーの即時反応及び遅発型反応のいずれをも制御する中心的な細胞であると考えられているＴｈ２に発現するが、Ｔｈ１には発現しない蛋白質、及びそれをコードするＤＮＡが提供される。ある個体、またはその組織中で発現する該蛋白質の量を定量比較することにより、該個体または組織がアレルギーを発症し易い状態にあるか等を解析することができる。
【００８１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の蛋白質をコードするｃＤＮＡの構造を示す図である。
【図２】本発明の蛋白質をコードするｍＲＮＡがＴｈ２への分化に伴い発現するが、Ｔｈ１の場合には発現しないことを示す図である。
【図３】本発明のＤＮＡを導入したＣＨＯ細胞中およびその培養上清中の本発明の蛋白質の発現をウェスタンブロッティング解析により示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は２型ヘルパーＴ細胞またはその分化途上に発現するが、１型ヘルパーＴ細胞には発現しない蛋白質およびそれをコードするＤＮＡ、該蛋白質に対する抗体等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫応答において中心的な役割を担っているヘルパーＴ細胞と呼ばれるリンパ球は、産生するサイトカインのパターンにより、少なくとも２つのサブセットに 分類される（Ｍｏｓｍａｎｎ ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９８６） １３６ ： ２３４８−２３５７ ）。１型ヘルパーＴ細胞（以下、これを「Ｔｈ１」と称することがある）は、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）やインターロイキン２（ＩＬ−２）を産生し、マクロファージやナチュラルキラー細胞を活性化することで、主にウイルス、バクテリア等に対する感染防御などの細胞性免疫に関与することが知られている（Ｈｏｗａｒｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ３ｅｄ．， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３））。一方、２型ヘルパーＴ細胞（以下、これを「Ｔｈ２」と称することがある）は、ＩＬ−４、ＩＬ−５等のサイトカイン（以下、これを「Ｔｈ２型サイトカイン」と称することがある）を産生し、主にＩｇＥ抗体産生などの液性免疫に関与することが知られている。ヒトにおいてもＴｈ１様細胞及びＴｈ２様細胞がクローン化されて研究が進み、前述のような考え方がおおむねヒトにおいてもあてはまることが確認されている（Ｒｏｍａｇｎａｎｉ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １２， ２２７−２５７（１９９４））。
【０００３】
Ｔｈ１及びＴｈ２の比率は恒常性（ＴＨ１／Ｔｈ２バランス）を保っており、そのバランスが破綻すると以下に述べるとおり疾患に対する感受性が高くなると考えられている。
すなわち、Ｔｈ２型サイトカインは、アレルギー反応に関与すると考えられており、Ｔｈ２はアレルギー反応の誘導細胞として重要視されている。Ｔｈ２型サイトカインの代表であるＩＬ−４は、Ｂ細胞に対してＩｇＥ抗体の産生を誘導するとともに、肥満細胞の活性化及び増殖を誘導する作用を有している。また、好酸球が血管内皮細胞に接着し、組織浸潤する際に機能する重要な分子であるＶＣＡＭ−１の遺伝子発現も誘導する（ファルマシア、（１９９３）２９：１１２３−１１２８）。さらに、ＩＬ−４はＴｈ２自身の分化増殖因子でもある。このようなＩＬ−４で代表されるＴｈ２型サイトカインの特性から、Ｔｈ２は、ＩｇＥ抗体や肥満細胞が関与するアレルギーの即時型反応、及び好酸球が関与するアレルギーの遅発型反応という二つのアレルギー反応のいずれをも誘導する中心的な細胞であると認識されている。従って、アレルギー性疾患は、Ｔｈ２の病的な機能亢進に起因した疾患であるものと推測されている。実際にアレルギー性疾患の病変部である気道や皮膚において、ＩＬ−４やＩＬ−５等のＴｈ２型サイトカインの産生、あるいはＴｈ２の存在等が確かめられていることもあり、アレルギー性疾患を治療あるいは予防するためにはＴｈ２の活性化の制御、ひいてはＴｈ２型サイトカインの産生制御が重要であるとする考え方が、広く一般に受け入れられている（Ｎａｔｕｒｅ （１９９６） ３８３ ： ７８７−７９３ ）。
【０００４】
線虫などの寄生虫感染症においてもＴｈ２機能が著しく亢進することが知られている（臨床免疫（１９９５）２７：６５２−６５６）。また、全身性エリテマトーデス等の、抗体産生あるいは液性免疫が異常に亢進した状態にある自己免疫疾患においても、やはりＴｈ２が病的に機能亢進した状態にあると推定されている（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （１９８８） １５ ： ４０１）。さらに最近の研究において、エイズの発症後期においてＴｈ２がＴｈ１に比べて優位になるバランス異常状態が確認されており、このバランス異常状態を経過することが、最終的な免疫不全状態に移行する上で重要な段階である可能性が示唆されている。そして、このバランス異常状態を改善できればエイズの発症を遅らせる、あるいは発症を止めることができるとの指摘もなされている（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ （１９９３） １４ ： １０７−１１１）。
【０００５】
また、Ｔｈ１細胞はＬＴ−α、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γを産生する。これらＴｈ１型サイトカイン は、マクロファージおよび特定の炎症性応答（例えば、ＩＶ型「遅延型」過敏症）を活性化する傾向にある。また、Ｔｈ１型サイトカインは組織移植片および器官移植 物の細胞性拒絶において重要な役割を担う。これらのことからＴｈ１の優性な機能亢進は、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、多発性硬化症、インスリン依存性 Ｉ 型糖尿病、および炎症性腸疾患等の自己免疫疾患の発症を誘導すると考えられる。
【０００６】
上記ヘルパーＴ細胞サブセットＴｈ１およびＴｈ２への機能分化は、抗原刺激を受けていないＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞（以下、これを「ナイーブＴ細胞」と称することがある）が活性化されることにより誘導される。この機能分化に際してサイトカイン発現パターンは変化する。
本発明者らは、先にナイーブＴ細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、Ｔｈ１／Ｔｈ２へ分化させる方法を報告している（Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ （１９９６） ２６ ：２０８１−２０８６， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ （２００２） １６３ ： １０８７−１０９４）。従来は、Ｔｈ１機能の指標としてＩＦＮ−γ産生能、Ｔｈ２機能の指標としてＩＬ−４およびＩＬ−５を主に用いていた。また、Ｔｈ１細胞の分化に必至な転写因子としてＴ−ｂｅｔ、Ｔｈ２細胞の分化に必至な転写因子としてＧＡＴＡ−３、ｃ−Ｍａｆなどが知られており、そのｍＲＮＡの発現を検出することによってもそれぞれのタイプの存在を確認することが可能である。
【０００７】
【発明が解決使用とする課題】
本発明は、Ｔｈ１およびＴｈ２またはその分化途上に発現する蛋白質をコードするｍＲＮＡ（ＤＮＡ）を網羅的に比較し、Ｔｈ２に発現するが、Ｔｈ１には発現しない蛋白質およびそれをコードするＤＮＡを取得することを目的とする。さらに該ＤＮＡがコードする蛋白質、該蛋白質に特異的に結合する抗体等を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、未分化なＴ細胞にイオノマイシン及びＰｈｏｒｏｂｏｌ Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ Ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）により刺激を与え培養することによりヘルパーＴ細胞系に分化させ、さらにＩＬ−２、ＩＬ−４、抗ＩＦＮ−γ抗体、抗ＩＬ−１２抗体を添加して培養し、Ｔｈ２を分化させた。また、上記ヘルパーＴ細胞に、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、抗ＩＬ−４抗体を添加して培養し、Ｔｈ１を誘導した。この２つのＴ細胞サブセットに発現しているｍＲＮＡをディファレンシャル・ディスプレイ法により比較したところ、Ｔｈ２またはその分化途上に発現するが、１型ヘルパーＴ細胞には発現しないｍＲＮＡおよびその転写産物である蛋白質を見いだした。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
【０００９】
即ち、本発明によれば、
（１）以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠質、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ２型ヘルパーＴ細胞に発現するが、１型ヘルパーＴ細胞には発現しない蛋白質、
（２）上記（１）に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、
（３）ＤＮＡが、以下の（ａ）または（ｂ）である上記（２）に記載のＤＮＡ、
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列またはその相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列を有し、かつ２型ヘルパーＴ細胞に発現するが、１型ヘルパーＴ細胞には発現しない蛋白質をコードするＤＮＡ、
（４）ＤＮＡが、配列番号３に示すヒト由来の塩基配列を有するものである上記（３）に記載のＤＮＡ、
（５）上記（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡを含む組換えベクター、
（６）上記（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡまたは上記（５）に記載の組み換えベクターを導入したＤＮＡ導入細胞または該細胞からなる個体、
（７）上記（６）に記載の細胞により産生される、上記（１）に記載の組み換え蛋白質、
（８）上記（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列中の連続した５〜５００塩基と同じ配列を有するセンスオリゴヌクレオチド、当該センスオリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び、当該センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体からなる群から選ばれるオリゴヌクレオチド、
（９）上記（１）または（７）に記載の蛋白質に特異的に結合する抗体、あるいはその部分フラグメント、
（１０）上記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列から選択される少なくとも１以上のアミノ酸配列情報、および／または上記（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列から選択される少なくとも１以上の塩基配列情報を
保存したコンピュータ読み取り可能記録媒体、
（１１）上記（１）に記載のタンパク質、および／または上記（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡを結合させた担体、
が提供される。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の蛋白質、それをコードするＤＮＡ、蛋白質発現組換ベクター、および形質転換体は、例えば以下の様にして調製される。
１型、及び２型ヘルパーＴ細胞で特異的に発現する蛋白質を網羅的に探索するために、未分化なＴ細胞から上記２つのサブセットをそれぞれ同調的に大量に分化誘導する系を用いる。この分化誘導する系を用いる発現蛋白質／ｃＤＮＡの解析は、例えば、（１−ｉ）均一で未分化な分化段階でとどまっているＴ細胞を大量に調製し、（１−ｉｉ）このＴ細胞についてＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）を介した刺激を模倣する刺激を与え、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に分化させる、さらに（２）該ＣＤ４陽性Ｔ細胞に種々のサイトカインまたはその抗体を組み合わせて添加して培養し、各サブセット中に発現しているｍＲＮＡについてｃＤＮＡライブラリーを作製する、（３）このｃＤＮＡライブラリー中にあるｃＤＮＡを比較する（ディファレンシャル・ディスプレイ等）ことにより行うことができる。この系により、２型ヘルパーＴ細胞に発現するが、１型ヘルパーＴ細胞には発現しない蛋白質をコードするＤＮＡの網羅的探索が可能となる。
【００１１】
さらに、（４、５）上記（３）で得られたＤＮＡを含む組換えベクターを作製し、これを適当な宿主に導入し、該蛋白質を発現する細胞または個体を作製することができる。また、（６）上記（４）で得られたＤＮＡの塩基配列と同じ配列を含むセンスオリゴヌクレオチド、あるいはアンチセンスオリゴヌクレオチドを取得することもでき、さらには（７）上記（４）で得られたＤＮＡがコードする蛋白質の抗体を取得することもできる。
以下、本発明のＤＮＡ、および蛋白質並びにその調製方法について更に詳述す
る。
【００１２】
（１）１型及び２型ヘルパーＴ細胞の調製
Ｔｈ１及びＴｈ２を調製する方法としては、このような特徴を示すＴ細胞を大量に取得できる方法であればいかなるものであってもよい。具体的には、例えば、大量に調製した未分化なＴ細胞をＴＣＲを介した刺激、またはこれを模倣する刺激を２度与えて分化させた後に、さらに種々のサイトカインまたはその抗体を添加して各サブセットへ機能分化させる方法等が好ましく用いられる。上記の未分化Ｔ細胞は、内因性のＴＣＲの発現がなく、トランスジェニックＴＣＲのみを発現する動物を作製し、この主要組織適合抗原（ＭＨＣ）拘束性を利用することにより、該動物の胸腺細胞の大部分を未分化な状態に保ち、この動物の胸腺細胞を使用する方法が挙げられる。具体的には、Ｉｗａｔａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２６， ２０８１（１９９６）に記載されているように、ＲＡＧ−２遺伝子欠損マウス（Ｓｈｉｎｋａｉ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ６８， ８５５（１９９２））と、ＴＣＲ遺伝子を導入したマウスの交配により作製したマウスに対して、このＴＣＲのＭＨＣ拘束性を利用する方法（Ｏｈｏｋａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ８， ２９７（１９９６））を用いることができる。
【００１３】
ここで得られた未分化Ｔ細胞について、さらに分化を誘導する。この誘導法は、未分化なＴ細胞が分化誘導され、かつその分化の各段階において経時的に細胞を取得できる方法であれば如何なるものであってもよいが、例えば、Ｉｗａｔａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２６， ２０８１（１９９６）に示されている方法によりＣＤ４／ＣＤ８両陽性の未熟胸腺細胞の懸濁液を調製し、これに細胞の分化を誘導する最適濃度、例えば０．１〜０．３ｎｇ／ｍｌのＰｈｏｒｂｏｌ Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ Ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）と０．１〜０．３ μｇ／ｍｌのイオノマイシンの存在下で１５〜２０時間細胞を培養した後に、ＰＭＡ、イオノマイシンを洗い去ってさらに１８〜２４時間培養する。次に該細胞を１．０〜６．０ ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ及び０．１〜０．３ μｇ／ｍｌのイオノマイシンの存在下で１５〜２０時間培養して細胞を取得する方法を用いることができる。
【００１４】
かくして得られたＴ細胞は、Ｔｈ１及びＴｈ２への分化誘導に用いることができる。この誘導法も上記サブセットへの分化が誘導される方法であれば如何なるものであってもよいが、例えば、Ｉｗａｔａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２６， ２０８１（１９９６）に示されている方法等が好ましく用いられる。具体的には、Ｔｈ２への分化方法としては、５０〜１００ユニット／ｍｌのＩＬ−２、１００〜１０００ユニット／ｍｌのＩＬ−４、１〜５ μｇ／ｍｌの抗ＩＦＮ−γ抗体、及び１〜５ μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−１２抗体を添加した培地で２４〜９６時間培養する方法が挙げられる。また、１型ヘルパーＴ細胞への分化方法としては、５０〜１００ユニット／ｍｌのＩＬ−２、１〜１０ ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２、及び１〜５ μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−４抗体を添加した培地で２４〜９６時間培養する方法等が挙げられる。
【００１５】
（２）Ｔｈ１及びＴｈ２ ｃＤＮＡライブラリーの調製
このようにして取得されたＴｈ１及びＴｈ２から、全ＲＮＡを調製する。全ＲＮＡの調製方法としては、例えばＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ． ，ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １６２， １５６−１５９（１９８７）に記載されているように、細胞懸濁液にグアニジウムチオシアネートを加えた後にフェノール抽出により精製し、調製する方法等が挙げられる。また、全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製して用いてもよい。ｍＲＮＡの調製方法としては、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用いた液体クロマトグラフィにかける方法、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ２．０ Ｋｉｔ（インビトロジェン社）等の市販のキットを用いる方法等も用いられる。
【００１６】
得られた全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素やＰＣＲ法等を用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成する。具体的にはＭｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ３， ２８０（１９８３）やＧｅｎｅ， ２５， ２６３（１９８３）およびＰｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５， ８９９８（１９８８）に記載の方法や、ＳＭＡＲＴ ＰＣＲ ｃＤＮＡ ＳｙｎＴｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（クロンテック社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ ＳｙｎＴｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）等の市販のキットを用いる方法が挙げられる。
【００１７】
（３）Ｔｈ２またはその分化途上に発現する蛋白質をコードするＤＮＡの取得
（２）で得られた、Ｔｈ１及びＴｈ２のｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡ断片を網羅的に比較することにより、Ｔｈ２の分化に伴って発現してくるが、Ｔｈ１の場合には発現しない蛋白質をコードするＤＮＡを検出する。具体的には、ディファレンシャル・ディスプレイ法等が好ましく用いられる。ディファレンシャル・ディスプレイの方法としては、Ｌｉａｎｇ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７， ９６７ （１９９２）， Ｌｉａｎｇ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２１， ３２６９ （１９９３）， ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．， １１， ２４２ （１９９５）等に記載の方法を挙げることができる。使用するオリゴヌクレオチドプライマー・セットとしては、例えばＯｐｅｒｏｎ １０−ｍｅｒ Ｋｉｔｓ（オペロン社製）等を用いることができ、このような市販キットを用いて行うこともできる。ディファレンシャル・ディスプレイにより得られたｃＤＮＡ断片については、通常、複数回の解析を行うことにより、解析の精度を更に上げることができる。また、取得されたｃＤＮＡ断片の発現が、ディファレンシャル・ディスプレイの発現パターンと同じであることを確認することによって解析の精度を向上させることができる。具体的には、Ｓｌｏｔ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｖｏｇｅｌｉ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．， ２４， １３８５−１３８６（１９９６））を用いて行うことができる。
【００１８】
（４）Ｔｈ２またはその分化途上に発現する蛋白質をコードするＤＮＡの解析
上記（３）で得られたｃＤＮＡ断片をクローニングベクター、例えばｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ等にＴ４−ＤＮＡリガーゼ等を用いて挿入し、このプラスミドを適当な宿主、例えば大腸菌等に形質転換する。この形質転換した細胞株を培養し、形質転換体の細胞懸濁液から適当な方法を用いてプラスミドを調製する。次に、このプラスミド中に挿入されているＤＮＡの塩基配列を解析する。塩基配列の解析法は、例えばクローニングベクターについて適当なシーケンス用プライマー、具体的にはＭ１３Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）やＲｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等とオートシーケンサー用ＰＣＲシーケンスキット、例えばダイデオキシチェーンターミネーション法シーケンスキット（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等を用いて反応を行い、これを適当なオートＤＮＡシーケンサー、例えば日立蛍光式ＤＮＡシーケンサーＳＱ３０００（日立電子エンジニアリング社製）等で解析する。
【００１９】
取得されたｃＤＮＡ断片がＯＲＦの全長を含んでいない場合には、得られたＤＮＡ断片をプローブとして、上記（２）で得られたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによりＯＲＦの全長を含むＤＮＡを取得することもできる。
得られたＤＮＡが新規のものであるか否かは、これをＢｌａｓｔ ｓｅａｒｃｈ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）等の検索サイト等を利用して検索することによって確認することができる。
【００２０】
かくして得られるＴｈ２に発現するが、Ｔｈ１には発現しない蛋白質をコードするＤＮＡとして、例えば配列番号１に示す配列を有するものを挙げることができる。またこのｃＤＮＡクローンは蛋白質のコーディング領域を全て含むことが確認されている。本発明のＴｈ２に発現するが、Ｔｈ１には発現しない蛋白質およびそれをコードするＤＮＡとは、上記したディファレンシャルディスプレイにおいて、Ｔｈ２において発現するが、Ｔｈ１には発現しないことが確認されるもの、あるいは下述の実施例２に記載するようなｍＲＮＡ量の測定において、Ｔｈ２に発現するがＴｈ１には発現しないものを意味し、必ずしもＴｈ１で完全に発現しないことを意味するものではない。
【００２１】
本発明のＤＮＡは、配列番号１に示される塩基配列を含むもののみならず、配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＴｈ２に発現するがＴｈ１には発現しない蛋白質をコードし得るＤＮＡであれば如何なる塩基配列を有するものであってもよい。これらの塩基配列には、配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴｈ２に発現するが、Ｔｈ１には発現しない蛋白質をコードし得るＤＮＡも含有される。
【００２２】
ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列番号１に示される塩基配列と７０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡ等が挙げられる。また、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとは、通常のハイブリダイゼーション緩衝液中で、温度が４０〜７０℃、好ましくは６０〜６５℃等で反応を行い、塩濃度が１５〜３００ｍＭ、好ましくは１５〜６０ｍＭ等の洗浄液中で洗浄する方法に従って行うことができる。
【００２３】
また、アミノ酸残基の置換、欠失、付加等を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等から調製されたものでも、合成ＤＮＡでもよい。ＤＮＡの塩基配列の置換は、例えばサイトダイレクテドミュータジェネシスキット（宝酒造）や、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等の市販キットを用いることができる。
【００２４】
また、配列番号１に記載の塩基配列は、マウスを由来とするものであるが、上記したｃＤＮＡライブラリーの作製法に従ってヒトのｃＤＮＡライブラリーを作製し、該ライブラリーに対して配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしたハイブリダイゼーションを行うことにより、配列番号１に記載の塩基配列がコードする蛋白質のヒトのホモログ蛋白質をコードするＤＮＡを取得することもできる。本発明の配列番号１に記載の塩基配列またはその相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡには、このようなヒトのホモログをコードするＤＮＡも含まれる。このようなヒト由来の配列を有する本発明のＤＮＡとしては、例えば、配列番号３または９に記載の塩基配列を含むもの等が挙げられる。
【００２５】
（５）組み換え蛋白質の取得
本発明のＴｈ２に発現するが、Ｔｈ１には発現しない蛋白質の組み換え体を作製する方法としては、例えば、上記（３）で得られた該蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを作製し、これを適当な宿主に導入し、該導入宿主を適当な条件下で培養した培養物から組み換え蛋白質を抽出する方法等が挙げられる。組み換え蛋白質を発現するためのベクターとしてはこれを導入する宿主内で（３）で得られたＤＮＡまたはそれを含むＤＮＡ断片が発現されるものであれば特に制限はないが、通常宿主に適したプロモーターが挿入されている市販の蛋白質発現ベクターを用いる。また、プラスミドベクター、ファージベクターともに使うことができる。
【００２６】
具体的には、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ストラタジーン社製）、ｐＳＶＫ３（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）等が挙げられる。また、ｐＭＫＩＴＮｅｏ（丸山和夫、細胞工学別冊８，新細胞工学実験プロトコール、ｐ．２５９，
秀潤社、（１９９３））等も好ましく用いられる。
本発明のＤＮＡを発現させるためのプロモーターとしては、宿主が保有するプロモーターを一般に用いることができるが、これに限られるものではなく、具体的には宿主微生物が大腸菌の場合にはＴ３、Ｔ７、ｔａｃ、ｌａｃプロモーター等を用いることができ、酵母の場合にはｎｍｔ１プロモーター、Ｇａｌ１プロモーター等が挙げられる。また動物培養細胞の場合にはＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター等が挙げられる。またほ乳類由来のプロモーターが機能可能な宿主を用いる場合には、本発明のＤＮＡに固有のプロモーターを用いることもできる。
【００２７】
これらのベクターへの（３）で得られた遺伝子ＤＮＡの挿入は、該ＤＮＡまたはこれを含むＤＮＡ断片をベクター中のプロモーターの下流にプロモーターの制御下におかれるように連結して行う。また、プロモーターと本発明のＤＮＡとの間にコザック配列（Ｋｏｚａｋ， Ｍ．， Ｇｅｎｅ， ２３４， １８７， （１９９９））を挿入したり、本発明のＤＮＡの下流にタグとなるポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入した構造を有するベクターも好ましく用いられる。タグとなるポリペプチドとしては特に制限はないが、例えば、ＦＬＡＧタグ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ７， ５８０， （１９８９））等が挙げられる。
【００２８】
このようにして得られた本発明の組換えベクターは、リン酸カルシウム法（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２１， ５５１（１９８３））、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２１５， １６６（１９８２））、電気パルス法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１， ７１６１（１９８４））、インビトロパッケージング法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７２， ５８１（１９７５））、ウィルスベクター法（Ｃｅｌｌ， ３７， １０５３（１９８４））、あるいはリポフェクション法（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製））等によって適当な宿主に導入される。
【００２９】
このとき、該組み換えベクターを導入する宿主としては、該ベクターが体内で複製可能であり、かつ該ＤＮＡがコードする蛋白質が生成されるものであれば特に限定されないが、例えば大腸菌、酵母、バキュロウィルス（節足動物多角体ウイルス）−昆虫細胞、動物細胞等が挙げられる。具体的には、大腸菌ではＢＬ２１、ＸＬ−２Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社製）等、酵母では例えばＳＰ−Ｑ０１（ストラタジーン社製）等、バキュロウィルスでは例えばＡｃＮＰＶ（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６３， ７４０６（１９８８））とその宿主であるＳｆ−９（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６３， ７４０６（１９８８））等が挙げられる。また動物細胞としてはマウス繊維芽細胞Ｃ１２７（Ｊ． Ｖｉｏｌ． ， ２６， ２９１（１９７８））やチャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７， ４２１６（１９８０））やアフリカミドリザル腎臓由来ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１：アメリカン タイプ カルチャー コレクション）等が挙げられる。
【００３０】
上記したような組み換えベクターを用いる発現方法の他に、プロモーターを連結した本発明のＤＮＡ断片を宿主の染色体中に直接挿入する相同組換え技術（Ａ． Ａ．Ｖｅｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ５７， ２０３６（１９９３））、あるいはトランスポゾンや挿入配列（Ａ． Ａ． Ｖｅｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １１，
７３９（１９９４））等を用いて発現させることができる。
【００３１】
組み換えベクターを導入した導入体は、それぞれに適した培地により培養される。培地中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物、ビタミン、血清および耐性スクリーニングに用いられる薬剤などが含有される。具体的には、形質転換体の宿主が大腸菌の場合には、例えばＬＢ培地（ナカライテスク社製）等、酵母の場合には、ＹＰＤ培地（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， １， １１７， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ（１９７９））等、宿主が昆虫細胞および動物細胞の場合は、２０％以下のウシ胎児血清を含有するＨａｍ−１２培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ社製）等を挙げることができる。また、培養は通常温度２０℃〜４５℃、ＣＯ２濃度２〜１０％の範囲で行うことが好ましい。培養時間は、宿主及び組み換えベクター等によって適宜選択することができるが、好ましくは１２〜８０時間である。さらに、必要に応じて通気、攪拌が行われる。これら以外の培地組成あるいは培養条件下でも導入宿主が生育し、挿入された本発明のＤＮＡがコードする蛋白質が生成されればいかなるものであってもよい。
【００３２】
このようにして培養された導入体の回収方法は、例えば宿主が細胞である場合には、培養物を遠心分離等により細胞を分離した後、細胞体あるいは培養上清として回収する方法等が用いられる。回収された細胞体からの組み換え蛋白質の抽出方法としては、それ自体既知の通常用いられる方法が挙げられるが、例えば、細胞をリン酸バッファー（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）に懸濁した後に、等量のサンプルバッファー（０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％ ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ）、２０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１０％ β−ｍｅｒｃａｐｔｏ ｅＴｈａｎｏｌ（２−ＭＥ）、０．２％ ｂｒｏｍｏｐｈａｎｏｌ ｂｌｕｅ（ＢＰＢ））を添加して９８℃で１〜１０分間ボイルする方法等が挙げられる。
【００３３】
抽出された蛋白質は、ＳＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳動等により分離し、適当な染色試薬、例えば、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）等によりゲルを染色することにより確認することができる。また、後述する本発明の蛋白質の抗体との結合性を解析することによってもその発現状態を確認することができる。
また一般的に、発現された蛋白質は生体内に存在する蛋白質分解酵素により切断されること（プロセッシング）が知られている。本発明の蛋白質も当然のことながら切断されたアミノ酸配列の部分断片であっても、Ｔｈ２に発現するがＴｈ１には発現しないものであれば、本発明の蛋白質に含まれる。
【００３４】
かくして得られる蛋白質が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には遊離体または他の塩に変換することができる。この様な塩も本発明の蛋白質に含まれる。また、上記した導入宿主が産生する蛋白質を、精製前または後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することにより修飾蛋白質とすることができる。これらの修飾蛋白質も上記したＴｈ２に発現するが、Ｔｈ１には発現しないものであれば本発明の範囲に含まれる。
【００３５】
（６）オリゴヌクレオチドの調製
上記（３）で取得した本発明のＤＮＡまたはその断片を用いて、ＤＮＡ合成機などを用いる常法により、本発明のＤＮＡの一部の配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチド、センス・オリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドを調製することができる。該オリゴヌクレオチドとしては、上記ＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５〜５００塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡを挙げることができる。具体例としては、配列番号１で表される塩基配列中の連続した５〜５００塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡを挙げることができる。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用いる場合には、両者の融解温度（Ｔｍ）および塩基数が極端に変わることのない上記のオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００３６】
また、本発明のＤＮＡの部分断片は、例えばこれをプローブ、またはＰＣＲプライマーとして用いることにより、本発明の蛋白質の発現異常により免疫系の異常を来す疾患の、遺伝子診断に使用することができる。具体的には、例えば検体中の本発明の蛋白質のｍＲＮＡの発現量や、損傷の程度を本発明のＤＮＡをプローブとした通常のノーザンハイブリダイゼーションや半定量的なリバースＰＣＲ（Ｓｏｕｒｖｉｎｏｓ， Ｇ．ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， １８， ４９６８（１９９９））により解析したり、あるいは検体中の本発明の蛋白質をコードする遺伝子の変異の有無や、変異の位置をＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， ８６， ２７６６（１９８９））等で検知することができる。ＤＮＡプローブまたはプライマーの大きさは、上記解析または検知が可能な長さであれば特に制限されないが、通常ＤＮＡプローブとしては例えば２０〜５００塩基対のものが用いられ、ＰＣＲプライマーとしては１５〜１００塩基、好ましくは２０〜４０塩基程度の長さが適当である。ハイブリダイゼーションプローブとして用いる場合には、ハイブリダイゼーションの条件等にあわせて適宜選択することができる。
【００３７】
また、これらオリゴヌクレオチドの誘導体も本発明のオリゴヌクレオチドとして利用することができる。該オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等を挙げることができる。
【００３８】
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、これを２本鎖ＲＮＡとして調製することにより、ＲＮＡインターフェアレンス法に適用することができる。２本鎖ＲＮＡの作製方法、及びＲＮＡインターフェアレンス法については、例えば、（Ｅｌｂａｓｈｉｒ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４１１， ４９４−４９８（２００１））に記載の方法等を用いることができる。上記２本鎖ＲＮＡは、そのすべてがＲＮＡである必要はない。具体的には、その一部がＤＮＡであるものとして、ＷＯ０２／１０３７４公報に記載のものを用いることができる。
【００３９】
２本鎖ポリヌクレオチドを導入する被導入体としては、標的遺伝子がその細胞内でＲＮＡに転写、または蛋白質に翻訳を受け得るものであれば如何なるものであってもよいが、具体的には、植物、動物、原生動物、ウィルス、バクテリア、または真菌種に属するものが挙げられる。植物は単子葉植物、双子葉植物または裸子植物であってよく、動物は、脊椎動物または無脊椎動物であってよい。好ましい微生物は、農業、林業、水産業、または工業によって使用されるものであり、そして植物または動物に対して病原性のものである。真菌には、カビ及び酵母形態両方での生物体が含まれる。脊椎動物の例には、魚類、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ハムスター、マウス、ラット及びヒトを含む哺乳動物が含まれ、無脊椎動物には、線虫類及び他の虫類、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、及び他の昆虫が含まれる。
【００４０】
被導入体は、細胞、組織、あるいは個体を意味する。ここで細胞とは、生殖系列または体性、分化全能、または多分化能、分割または非分割、実質組織または上皮、不滅化したものまたは形質転換したもの等からであってよい。細胞は、配偶子または胚であってよく、胚の場合、単一細胞胚または構成性細胞、または多重細胞胚からの細胞であり、胎児組織を含む。さらには、幹細胞のような未分化細胞、または胎児組織を含む器官または組織の細胞からのような分化細胞、または生物内に存在する任意の他の細胞であってよい。分化している細胞型には、脂肪細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチン生成細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞及び内分泌線または外分泌腺の細胞が含まれる。
【００４１】
被導入体への２本鎖ポリヌクレオチドの導入法としては、被導入体が細胞、あるいは組織の場合は、カルシウムフォスフェート法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウィルス感染、２本鎖ポリヌクレオチド溶液への浸漬、あるいは形質転換法等が用いられる。また、胚に導入する方法としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション法、あるいはウィスル感染等が挙げられる。被導入体が植物の場合には、植物体の体腔または間質細胞等への注入または灌流、あるいは噴霧による方法が用いられる。また、動物個体の場合には、経口、局所、（皮下、筋肉内及び静脈内投与を含む）非経口、経膣、経直腸、経鼻、経眼、腹膜内投与等によって全身的に導入する方法、あるいはエレクトロポレーション法やウィルス感染等が用いられる。経口導入のための方法には、２本鎖ポリヌクレオチドを生物の食物と直接混合することができる。さらに、個体に導入する場合には、例えば埋め込み長期放出製剤等として投与することや、２本鎖ポリヌクレオチドを導入した導入体を摂取させることにより行うこともできる。
【００４２】
導入する２本鎖ポリヌクレオチドの量は、導入体や、標的遺伝子によって適宜選択することができるが、細胞あたり少なくとも１コピー導入されるに充分量を導入することが好ましい。具体的には、例えば、被導入体がヒト培養細胞で、カルシウムフォスフェート法により２本鎖ポリヌクレオチドを導入する場合、０．１〜１０００ｎＭが好ましい。
【００４３】
（７）本発明の蛋白質に特異的に結合する抗体
本発明の蛋白質と特異的に結合する抗体の調製方法としては、通常用いられる公知の方法を用いることができ、抗原として用いられるポリペプチドについても、公知の方法に従って抗原性が高くエピトープ（抗原決定基）として適した配列を選択して用いることができる。エピトープの選択方法としては、例えばＥｐｉｔｏｐｅ Ａｄｖｉｓｅｒ（富士通九州システムエンジニアリング社製）等の市販のソフトウェア等を用いて行うことができる。
【００４４】
上記の抗原として用いるポリペプチドは、公知の方法に従って合成した合成ペプチドでも、また本発明の蛋白質そのものを用いることもできる。抗原となるポリペプチドは、公知の方法に従って適当な溶液等に調製して、哺乳動物、例えばウサギ、マウス、ラット等に免疫を行えばよいが、安定的な免疫を行ったり抗体価を高めるために抗原ペプチドを適当なキャリア蛋白質とのコンジュゲートにして用いたり、アジュバント等を加えて免疫を行うのが好ましい。
【００４５】
免疫に際しての抗原の投与経路は特に限定されず、例えば皮下、腹腔内、静脈内、あるいは筋肉内等のいずれの経路を用いてもよい。具体的には、例えばＢＡＬＢ／ｃマウスに抗原ポリペプチドを数日〜数週間おきに数回接種する方法等が用いられる。また、抗原の摂取量としては、抗原がポリペプチドの場合０．３〜０．５ｍｇ／１回程度が好ましいが、ポリペプチドの種類、また免疫する動物種によっては適宜調節される。
【００４６】
免疫後、適宜試験的に採血を行って固相酵素免疫検定法（以下、これを「ＥＬＩＳＡ法」と称することがある）やウエスタンブロッティング等の方法で抗体価の上昇を確認し、十分に抗体価の上昇した動物から採血を行う。これに抗体の調製に用いられる適当な処理を行えばポリクローナル抗体を得ることができる。具体的には、例えば、公知の方法に従い血清から抗体成分を精製した精製抗体を取得する方法等が挙げられる。抗体成分の精製は、遠析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法を用いることができる。
【００４７】
また、該動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを用いて公知の方法に従って融合させたハイブリドーマを用いる（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６， ４９５（１９７５））ことによりモノクローナル抗体を作製することもできる。モノクローナル抗体は、例えば以下の方法により取得することができる。
まず、上記した抗原の免疫により抗体価の高まった動物から抗体産生細胞を取得する。抗体産生細胞は、形質細胞、及びその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体の何れから取得してもよいが、好ましくは脾臓、リンパ節、末梢血等から取得する。これらの細胞と融合させるミエローマとしては、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来等）ミエローマ細胞株であるＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８０）とＰ３−ＮＳ１／１Ａｇ４．１（理研セルバンク：ＲＣＢ００９５）、あるいはＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３由来のハイブリドーマＳＰ２／０−Ａｇ１４ （ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８１）等が好ましく用いられる。細胞の融合は、抗体産生細胞とミエローマ細胞を適当な割合で混合し、適当な細胞融合培地、例えばＲＰＭＩ１６４０やイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、あるいはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等に、５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を溶解したもの等を用いることにより行うことができる。また電気融合法（Ｕ． Ｚｉｍｍｅｒ− ｍａｎｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ， ６８， ５７７（１９８１））によっても行うことができる。
【００４８】
ハイブリドーマは、用いたミエローマ細胞株が８−アザグアニン耐性株であることを利用して適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）液を含む正常培地（ＨＡＴ培地）中で５％ＣＯ２、３７℃で適当時間培養することにより選択することができる。この選択方法は用いるミエローマ細胞株によって適宜選択して用いることができる。選択されたハイブリドーマが産生する抗体の抗体価を上記した方法により解析し、抗体価の高い抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等により分離し、分離した融合細胞を適当な培地で培養して得られる培養上清から硫安分画、アフィニティクロマトググラフィー等の適当な方法により精製してモノクローナル抗体を得ることができる。また精製には市販のモノクローナル抗体精製キットを用いることもできる。さらには、免疫した動物と同系統の動物、またはヌードマウス等の腹腔内で上記で得られた抗体産生ハイブリドーマを増殖させることにより、本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることもできる。
【００４９】
また、本発明の蛋白質としてヒト由来のものを取得した場合には、かかるポリペプチド、あるいはその部分ペプチドを抗原として、ヒト末梢血リンパ球を移植したＳｅｖｅｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（ＳＣＩＤ）マウスに上記した方法と同様にして免疫し、該免疫動物の抗体産生細胞とヒトのミエローマ細胞とのハイブリドーマを作製することによってもヒト型抗体を作製することができる（Ｍｏｓｉｅｒ， Ｄ． Ｅ．， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ， ３３５， ２５６−２５９ （１９８８）； Ｄｕｃｈｏｓａｌ， Ｍ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３５５， ２５８−２６２（ １９９２）。
【００５０】
また、取得したヒト型抗体を産生するハイブリドーマからＲＮＡを抽出し、目的のヒト型抗体をコードする遺伝子ＤＮＡをクローニングして、この遺伝子ＤＮＡを適当なベクターに挿入し、これを適当な宿主に導入して発現させることにより、さらに大量にヒト型抗体を作製することができる。ここで、抗原との結合性の低い抗体は、それ自体既知の進化工学的手法を用いることによりさらに結合性の高い抗体として取得することもできる。一価性抗体等の部分フラグメントは、例えばパパイン等を用いてＦａｂ部分とＦｃ部分を切断し、アフィニティカラム等を用いてＦａｂ部分を回収することによって作製することができる。
【００５１】
かくして得られる本発明の蛋白質と特異的に結合する抗体は、本発明の蛋白質に特異的に結合することによって該蛋白質が発現している組織あるいは細胞等を特定すること等に用いられる。
【００５２】
（８）本発明の蛋白質またはそれをコードするＤＮＡ、特異抗体の利用方法
本発明の蛋白質またはこれをコードするｍＲＮＡ等の生成の有無、またはそれらの体液中またはＴ細胞内の濃度の高低を測定することでＴｈ２機能のレベルを推定することができる。Ｔｈ２機能は花粉症や食物アレルギーの発症に必須の機能であり、この機能レベルを知ることにより、アトピー素因の有無やアレルギー患者の発症原因の特定に役立つ。また、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの自己免疫病においてもＴｈ２機能が異常に亢進していると考えられ、逆に慢性関節リウマチやシェグレン症候群などの自己免疫病ではＴｈ１機能に比してＴｈ２機能が低下していると考えられる。従って、特にＴ細胞による該蛋白質等の生成能とＩＦＮ−γの生成能を合わせて測定することにより、Ｔｈ１機能とＴｈ２機能のバランスを推定することができ、これらの疾患の有無、または罹患し易さを推定することができる。また、線虫などの寄生虫の感染の際にはＴｈ２機能が抗原非特異的に亢進することが知られており、該蛋白質等はこれらの寄生虫感染の有無を知るための指標としても役立つ。さらに、妊娠期においてはＴｈ１機能に比してＴｈ２機能が亢進することが知られており、該蛋白質等の生成が正常な妊娠維持の指標の一つとして役立つ。
【００５３】
また、該蛋白質等はサイトカインとしての性質を持つので、その受容体が存在すると考えられ、その受容体を探索するために該蛋白質、およびそれをコードするＤＮＡの導入体等を用いることができる。受容体のスクリーニング方法としては、本発明の蛋白質と相互作用する物質を、それ自体既知の方法により選抜する方法や、被検物質の本発明の蛋白質に対する結合性を本発明の蛋白質に特異的に結合する抗体との競合実験によって解析する方法等が挙げられる。
【００５４】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
実施例１ マウス Ｔ 細胞の２型ヘルパーＴ細胞への機能分化の際に誘導されるが、１型ヘルパー Ｔ 細胞の場合には発現しない蛋白質をコードする ＤＮＡ の取得（ ＰＣＲ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｉｓｐｌａｙ ＭｅＴｈｏｄ ）
（１）２型ヘルパーＴ細胞への機能分化を誘導したＴ細胞からのｃＤＮＡ調製
遺伝子源となるマウスは、ＲＡＧ−２遺伝子欠損マウスと、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）を遺伝子導入したマウスの、交配により作成した。ＲＡＧ−２遺伝子欠損マウスは、常法に従って作成されたもの（Ｓｈｉｎｋａｉ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ６８， ８５５ （１９９２））を用いた。また、ＴＣＲ遺伝子導入マウスは、卵白アルブミン（ＯＶＡ）に特異的なＴＣＲ遺伝子を定法（発生工学実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７））に従って導入、作製した（Ｏｈｏｋａ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ８， ２９７， （１９９６））。両マウスを交配することにより、ＲＡＧ−２を欠損した遺伝的背景に、単一のＴＣＲを発現する、つまり内因性のＴＣＲ発現がなく、導入されたＴＣＲのみを発現するマウスが作製された。このマウスでは主要組織適合抗原（ＭＨＣ）拘束性を利用することにより、胸腺においてＴ細胞の分化をＣＤ４／ＣＤ８両陽性細胞の段階で停止させることができ、大部分の胸腺細胞が未熟なＣＤ４／ＣＤ８両陽性細胞となる特徴がある。
【００５５】
上記マウスをＳＰＦ条件下にて飼育し、この胸腺を無菌的に取り出し、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）に記載の方法により、１０％非働化ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（シグマ社製）で４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度の細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液に、Ｉｗａｔａ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２６， ２０８１（１９９６）に記載の方法によって、試験管内で、Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ（カルビオケム社製）０．２μｇ／ｍｌとＰｈｏｒｏｂｏｌ Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ Ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ、シグマ社製）０．２ｎｇ／μｌを加え、１０％ＣＯ２、３７℃の環境で２０時間刺激培養した。培養後、細胞を洗浄し、新しい培養液中でＩｏｎｏｍｙｃｉｎとＰＭＡを加えずにさらに２４時間培養した。この時点でほとんどの細胞はＣＤ４陽性Ｔ細胞系列にコミットしていた。
【００５６】
これらの細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で新たな培地に懸濁し、Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ、０．２μｇ／ｍｌとＰＭＡ、３．０ｎｇ／ｍを加え、２度目の刺激培養を１７時間行なった後、細胞を洗浄した。
これらの細胞をＴｈ２に分化させるために、新たな培地中に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で懸濁し、２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのリコンビナント・マウス・ＩＬ−２：Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社製、１，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのリコンビナント・マウス・ＩＬ−４：Ｇｅｎｚｙｍｅ社製、１μｇ／ｍｌのモノクローナル抗マウス・ＩＦＮ−γ抗体（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製：クローンＸＭＧ１．２）、および１μｇ／ｍｌのモノクローナル抗マウス・ＩＬ−１２
抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製：クローンＣ１７．８）を添加して２４〜９６時間培養した。
【００５７】
一方、Ｔｈ１に分化させるためには、２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのリコンビナント・マウス・ＩＬ−２：Ｇｅｎｚｙｍｅ社製、１０ｎｇ／ｍｌのリコンビナント・マウスＩＬ−１２（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）、および１μｇ／ｍｌのモノクローナル抗マウスＩＬ−４抗体（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製：クローン１１Ｂ１１）を添加して２４〜９６時間培養した。
【００５８】
これらの培養で得た細胞からＡｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｕｍ Ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍｍｅＴｈｏｄ（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １６２（１）， １５６−９（１９８７））によりＴｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。調製したＴｏｔａｌ ＲＮＡのうち０．５μｇを、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）１０ｍＭ、ＭＭＬＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）３００Ｕ、ＲＮＡｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（プロメガ社製）１１７Ｕ、アンカープライマー（配列番号４）２．５μＭ、ｄＮＴＰ２０μＭを含む逆転写反応液に供してインキュベートを行った。
【００５９】
この逆転写反応液０．５μｌを、ｄＮＴＰ２μＭ、０．６Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）、６７ｎＭ［α−３３Ｐ］ｄＣＴＰ、アンカープライマー（配列番号４）２．５μＭ、及びアービトラリープライマー（配列番号５）０．５μＭを含むポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）緩衝液（ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに添付）４．５μｌに供し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃−３分、４０℃−５分、７２℃−５分を１サイクル、９４℃−３０秒、４０℃−２分、７２℃−３０秒を３５サイクル、さらに７２℃−５分の条件で行った。
【００６０】
（２）２型ヘルパーＴ細胞への機能分化に伴い発現誘導されるが、１型ヘルパーＴ細胞の場合には発現しない蛋白質をコードするＤＮＡの取得
上記（１）でＴｈ２及びＴｈ１より調製したＲＮＡより得られたｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片を、６％ポリアクリルアミドシークエンスゲルを用いた電気泳動により分離し、オートラジオグラフィーによって可視化し、両ＤＮＡ断片を比較した。ここで、Ｔｈ２への分化過程でのみ観察されるＤＮＡ断片が含まれるゲルを切り出し、１００μｌの沸騰水中でＤＮＡを抽出した。この抽出液に含まれるＤＮＡを５０μｇのＧｌｙｃｏｇｅｎを含むエタノールにて沈殿させ、これを１０μｌの水に溶解した。
【００６１】
このうち４μｌをｄＮＴＰ２５μＭ、２．５Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）、アンカープライマー（配列番号４）１．０μＭ、及びアービトラリープライマー（配列番号５）０．５μＭを含むＰＣＲ緩衝液（ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに添付）１９μｌに供し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃−３０秒、４０℃−２分、７２℃−３０秒を３５サイクル、さらに７２℃−５分の条件で行った。このＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片が１種類のものであることを、２％アガロースゲルによる電気泳動で分離し確認した。
【００６２】
この増幅されたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に、ベクターに添付のマニュアルに準じてクローニングした。さらに、このＤＮＡ断片をＳｌｏｔ ｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓ（Ｖｏｇｅｌｉ， Ｌ． Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．， ２４， １３８５−１３８６（１９９６））に供し、上記で行ったオリジナルのｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙの発現パターンと同じであることを確認した。
【００６３】
ここで増幅されたＤＮＡ断片は２５３ｂｐで、コーディング領域を含んでいなかったので、これをプローブとして、上記（１）で取得したＴｈ２由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、さらに選抜されたクローンに含まれる３種類のＤＮＡ断片をシーケンスして、配列番号１の塩基番号１５１９〜４０２０にあたる２５００ｂｐのクローン、３４５８〜４０２１にあたる５６４ｂｐのクローン、および３７３７〜４０２０にあたる２８４ｂｐのクローンを取得した。この３つはコンティグを形成した。
【００６４】
得られたＤＮＡ断片の塩基配列を種々のデータベースでホモロジー検索したところ、１）ＥＳＴマウスデータベース（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＡＡ４７２１１４）、２）ＥＳＴラットデータベース（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＡＩ１１２３７４）、３）ＥＭＢＬヒトデータベース（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＨＳＭ８０１０５４）、４）ヒトゲノムデータベース（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＸＭ ０４６２６４）、及び５）ヒトゲノムデータベース（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＡＣ０９２０４２．２）に相同性を有するＤＮＡが登録されていた。しかし、１）および２）はコーディング領域を含まないｃＤＮＡの３’端断片であり、３）および４）はＣ末端側のコーディング領域の一部とその下流の一部を含むｃＤＮＡ断片であった。５）に関しては、Ｎ末端側のコーディング領域が同定されていなかった。また、いずれのＤＮＡ断片についてもそれがコードする蛋白質の機能については記載がされていなかった。
【００６５】
上記で得られた２５００ｂｐ中の２４３ｂｐのＤＮＡ断片（配列番号１の塩基番号３７７８〜４０２０に相当する）をプローブとして、正常マウス脳由来のｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）からコーディング領域の大部分を含み、Ｎ末端部分をコードする領域を欠く３７１５ｂｐのクローンを得た。そこで、さらにこれに基づき、コーディング領域の一部を含む３７３ｂｐのＤＮＡ断片（配列番号１の塩基番号５６３〜９３５に相当する）をプローブとして、上記した正常マウス脳由来のｃＤＮＡライブラリーから９６１ｂｐのＤＮＡ断片（配列番号１の塩基番号１〜９６１に相当する）を単離した。これらはコンティグを形成し、これらを用いてコーディング領域（配列番号１のアミノ酸連記部分）を含む配列番号１に示したｃＤＮＡの全長（以下、これを「２４２Ｃ ｃＤＮＡ」、これと対応するｍＲＮＡを「２４２Ｃ ｍＲＮＡ」と称することがある）が得られた。
【００６６】
該ＤＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は５３３アミノ酸（配列番号１の塩基番号５４８〜２２４２）に渡っており、Ｎ末端側アミノ酸の約３３〜４３残基はシグナル配列を形成していた（図１）。従って、該ＤＮＡがコードする蛋白質（以下これを「２４２Ｃ蛋白質」と称することがある）は分泌性蛋白質または新規サイトカインであると考えられた。
【００６７】
該ＤＮＡを、上記ヒトゲノムデータベースによりさらに解析したところ、このｃＤＮＡのヒトホモログは少なくとも５つのエキソンから成っており、ヒトでは第３染色体ｐ２１．３２の付近に位置していた。しかし、マウスｃＤＮＡのＮ末端の５アミノ酸をコードする塩基配列のヒト相同部位については、今の所、同定できない。このヒト由来のｃＤＮＡ配列を配列番号３に示す。
【００６８】
実施例２ Ｔｈ２ 細胞への分化誘導に伴う ２４２Ｃ ｍＲＮＡ 発現の解析
実施例１（１）に記載の方法により、胸腺細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで２度のｉｏｎｏｍｙｃｉｎ／ＰＭＡ刺激を加えた後、新たな培地中でサイトカインと抗体を添加して培養し、Ｔｈ１とＴｈ２を誘導した。このサイトカインと抗体を添加した培養において、経時的に細胞を回収し、細胞中の２４２Ｃ ｍＲＮＡの発現レベルをコントロールのβ−ａｃｔｉｎ ｍＲＮＡレベルとＲＴ−ＰＣＲを用いて比較した（図２）。その結果、２４２Ｃ ｍＲＮＡの発現はＴｈ２への分化に伴って誘導されるが、Ｔｈ１の場合には発現しないことが見出された。
【００６９】
この結果を他のＴｈ１／Ｔｈ２分化誘導系において確認するために、ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア社製）の脾臓細胞からＭｉｙａｕｒａ， Ｈ．， ＆ Ｉｗａｔａ， Ｍ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６８， １０８７， （２００２）に記載の方法により、ＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞を調製し、この細胞からＴｈ１およびＴｈ２を分化誘導した。Ｔｈ２に分化させるためには、新たな培地中に５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で懸濁し、２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのリコンビナント・マウスＩＬ−２（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）、１，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのリコンビナント・マウスＩＬ−４（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）、２μｇ／ｍｌのモノクローナル抗マウス・インターフェロン−γ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製：クローンＸＭＧ１．２）、および１μｇ／ｍｌのモノクローナル抗マウスＩＬ−１２抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製：クローンＣ１７．８）を添加して、ハムスター・モノクローナル抗マウスＣＤ３抗体（クローン１４５−２Ｃ１１、Ｌｅｏ， Ｏ．， ｅｔ
ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８４， １３７４， （１９８７））とハムスター・モノクローナル抗マウスＣＤ２８抗体（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製：クローン３７．５１）をコートしたプレート中で、２４〜９６時間培養した。
【００７０】
一方、Ｔｈ１に分化させるためには、２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのリコンビナント・マウスＩＬ−２（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）、１０ｎｇ／ｍｌのリコンビナント・マウスＩＬ−１２（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）、および１μｇ／ｍｌのモノクローナル抗マウスＩＬ−４抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製：クローン１１Ｂ１１）を添加して、Ｔｈ２の場合と同様に抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体をコートしたプレート中で、２４〜９６時間培養した。経時的に細胞を回収し、細胞中の２４２Ｃ ｍＲＮＡの発現レベルをコントロールのβ−ａｃｔｉｎ ｍＲＮＡレベルとＲＴ−ＰＣＲを用いて比較した（図２）。その結果、２４２Ｃ ｍＲＮＡの発現はやはりＴｈ２への分化に伴って誘導されることが確認された。
【００７１】
実施例３ 抗２４２Ｃ抗体の作製
配列番号２のアミノ酸番号３６５〜３７８の部分ペプチドのＮ末端にシステインを付加した１５残基のペプチドＡ（配列番号６）を合成し（サワディーテクノロジー社に依頼）、Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎｅにコンジュゲートしてウサギに免疫した（サワディーテクノロジー社に依頼）。初回免疫は０．１５ｍｇをフロイント完全アジュバンドとともに行い、その後２週間ごとに２回目から４回目まで０．３ｍｇをフロイント不完全アジュバンドとともに皮下に注射した。５回目の免疫は４回目から４週間後に行い、その１０日後に血液を採取し、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｈａｒｌｏｗ Ｅ．， ａｎｄ Ｌａｎｅ Ｄ．）に記載の方法により血清を精製した（以下、これを「抗２４２ＣペプチドＡ血清」と称することがある）を取得した。得られた抗血清は公知の固相酵素免疫検定法（以下、これを「ＥＬＩＳＡ法」と称することがある）を用いてその抗体価を確認した。
【００７２】
同様に、配列番号２のアミノ酸番号９５〜１１４に相当する２０残基のペプチドＢ（２４２ＣペプチドＢ：配列番号７）を合成し、同様の方法でウサギ抗２４２ＣペプチドＢ血清を取得し、同様にその抗体価を確認した。
モノクローナル抗体を得るため、Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎｅにコンジュゲートした０．１ｍｇの２４２ＣペプチドＢをフロイント完全アジュバンドと混合し、２カ所に分けてメスのＷＫＹ／ＮＣｒｊラット（ＳＪＬ社製）の皮下に注射した。３週間後、リンパ節を集め、そのリンパ球と、８−アザグアニン耐性マウス由来ハイブリドーマＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８１；ＢＡＬＢ／ｃ由来ミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３とＢＡＬＢ／ｃ脾細胞のバイブリッドを２〜３：１の割合で混合し、ＤＭＥＭ培地等に、Ｈｙｂｒｉｍａｘ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ Ｅ．， ａｎｄ Ｌａｎｅ Ｄ．）に記載の方法により細胞融合を行った。
【００７３】
ハイブリドーマは、用いたミエローマ細胞株が８−アザグアニン耐性株であることを利用して適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）液を含む正常培地（ＨＡＴ培地）中で５％ＣＯ２、３７℃で１０〜１４日培養することにより選択した。選択されたハイブリドーマが産生する抗体の抗体価は、上記した２４２ＣペプチドＢまたはそれを含む２４２Ｃ蛋白質の部分ポリペプチド断片（アミノ酸残基４４〜１８２に相当する：配列番号８）を平底９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートにコートして、ＥＬＩＳＡ法により解析した。
【００７４】
抗体価の高い抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法により分離し、分離した融合細胞を培養して得られる培養上清からプロテインＧアガロース・カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いてＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｈａｒｌｏｗ Ｅ．， ａｎｄ Ｌａｎｅ Ｄ．）に記載の方法により精製した。さらに、ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡ Ｊｃｌ−ｎｕ：日本クレア社製）の腹腔内において、上記で得られた抗体産生ハイブリドーマを増殖させ、本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水からＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ Ｅ．， ａｎｄ Ｌａｎｅ Ｄ．）に記載の方法により、硫安分画、カプリル酸分画を利用して抗２４２Ｃモノクローナル抗体を精製した。
【００７５】
実施例４ 動物細胞系での２４２Ｃ蛋白質の強制発現、及び２４２Ｃ蛋白質の細胞内外での発現の解析
（１）ＣＨＯ細胞への２４２Ｃ ｃＤＮＡの導入
上記実施例１で得られた２４２Ｃ ｃＤＮＡ断片を鋳型として、動物細胞用発現ベクターｐＭＫＩＴｎｅｏ（東京医科歯科大学医学部、丸山和夫助教授より供与）に挿入することにより動物細胞発現ベクター、ａ）ｐＭＫＩＴ−２４２ＣＫＳＰＦ、ｂ）ｐＭＫＩＴ−２４２ＣＫＳＰ、ｃ）ｐＭＫＩＴ−２４２ＣＳＰＦ、およびｄ）ｐＭＫＩＴ−２４２ＣＳＰを作製した。ａ）には翻訳開始点近傍上流にコザック配列、下流にＦＬＡＧタグをコードする配列を挿入した。ｂ）には翻訳開始点近傍上流にコザック配列を、ｃ）にはＦＬＡＧタグをコードする配列を、それぞれ挿入した。ｄ）にはコザック配列もＦＬＡＧタグをコードする配列も挿入しなかった。得られたＤＮＡを精製後、制限酵素ＳｍａＩで切断して線状ＤＮＡとし、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）を用いてチャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， ７７， ４２１６（１９８０））に導入した。
【００７６】
（２）ウェスタンブロッティング解析
実施例４（１）で得られた導入細胞を、ウシ胎児血清を１０％含むＨａｍ−１２培地（Ｓｉｇｍａ社製）中で増殖させた。培養上清を除去後、培養器に接着した細胞を血清を含まないＨａｍ−１２で洗浄し、同じ培地中で、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間培養した。培養後、培養上清と細胞を回収分離し、該細胞を氷中でＰＢＳに懸濁し、等量のサンプルバッファー（０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％ ＳＤＳ、２０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１０％ β−ｍｅｒｃａｐｔｏ ｅｔｈａｎｏｌ、０．２％ ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ）を加えて９８℃で５分間ボイルした。培養上清については、５０％アセトンを加えて蛋白質を沈殿させた。沈殿蛋白質に５０％濃度の上記サンプルバッファーを加えて９８℃で５分間ボイルした。
【００７７】
これらのサンプルを１０％ ＳＤＳアクリルアミドゲルにより電気泳動し、４８ｍＭ Ｔｒｉｓ、３９ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ、０．０３７％ ＳＤＳ、２０％ ｅｔｈａｎｏｌの存在下でニトロセルロースメンブレン（ＮｉｔｒｏＢｉｎｄ：Ｏｓｍｏｎｉｃｓ社製）に電気的にトランスファーした。このメンブレンを５％スキムミルクを含むＴ−ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）に１時間浸透し、その後Ｔ−ＴＢＳで２５０倍希釈した上記実施例３で取得した抗ペプチドＡ血清と室温で２時間反応させた。また、対象実験として動物細胞用発現ベクターｐＭＫＩＴｎｅｏのみを導入したＣＨＯ細胞から得た蛋白質を用いて同様に反応を行った。
【００７８】
さらにＴ−ＴＢＳで３回洗浄後、それぞれＴ−ＴＢＳで５，０００倍希釈したＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ結合型ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）と室温で４０分間反応させた。Ｔ−ＴＢＳで３回洗浄後、ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて化学発光によるシグナル検出を行った。
【００７９】
この結果を図３に示す。コントロールベクターのみを導入した細胞では、２４２Ｃ蛋白質の発現は認められなかった。２４２Ｃ ｃＤＮＡを導入したＣＨＯ細胞では、コザック配列またはＦＬＡＧタグの有無による発現量の違いは認められるものの、２４２Ｃ蛋白質は主に培養上清中に産生されていることが確認された。この蛋白質は２つのサイズのバンドとして検出され、２４２Ｃ蛋白質のアミノ酸配列のシグナル部分を除く全長およびその一部を欠く蛋白質に相当すると思われる。
【００８０】
【発明の効果】
本発明によれば、アレルギーの即時反応及び遅発型反応のいずれをも制御する中心的な細胞であると考えられているＴｈ２に発現するが、Ｔｈ１には発現しない蛋白質、及びそれをコードするＤＮＡが提供される。ある個体、またはその組織中で発現する該蛋白質の量を定量比較することにより、該個体または組織がアレルギーを発症し易い状態にあるか等を解析することができる。
【００８１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の蛋白質をコードするｃＤＮＡの構造を示す図である。
【図２】本発明の蛋白質をコードするｍＲＮＡがＴｈ２への分化に伴い発現するが、Ｔｈ１の場合には発現しないことを示す図である。
【図３】本発明のＤＮＡを導入したＣＨＯ細胞中およびその培養上清中の本発明の蛋白質の発現をウェスタンブロッティング解析により示す図である。
Claims (11)
- 以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠質、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ２型ヘルパーＴ細胞に発現するが１型ヘルパーＴ細胞には発現しない蛋白質。 - 請求項１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
- ＤＮＡが、以下の（ａ）または（ｂ）である請求項２に記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列またはその相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列を有し、かつ２型ヘルパーＴ細胞に発現するが、１型ヘルパーＴ細胞には発現しない蛋白質をコードするＤＮＡ。 - ＤＮＡが、配列番号３に示すヒト由来の塩基配列を有するものである請求項３に記載のＤＮＡ。
- 請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
- 請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡまたは請求項５に記載の組み換えベクターを導入したＤＮＡ導入細胞または該細胞からなる個体。
- 請求項６に記載の細胞により産生される、請求項１に記載の組み換え蛋白質。
- 請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列中の連続した５〜５００塩基と同じ配列を有するセンスオリゴヌクレオチド、当該センスオリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び、当該センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体からなる群から選ばれるオリゴヌクレオチド。
- 請求項１または７に記載の蛋白質に特異的に結合する抗体、あるいはその部分フラグメント。
- 請求項１に記載のタンパク質のアミノ酸配列から選択される少なくとも１以上のアミノ酸配列情報、および／または請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列から選択される少なくとも１以上の塩基配列情報を保存したコンピュータ読み取り可能記録媒体。
- 請求項１に記載のタンパク質、および／または請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡを結合させた担体。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016516071A (ja) * | 2013-03-15 | 2016-06-02 | ユベンタス セラピューティクス，インコーポレイテッド | 瘢痕形成を軽減するためのｓｄｆ−１の使用 |
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2002
- 2002-06-14 JP JP2002175001A patent/JP2004016084A/ja active Pending
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