CN1952134A

CN1952134A - 促进人体转录因子NF－κB活化的多核苷酸及其编码多肽和用途

Info

Publication number: CN1952134A
Application number: CNA200510112974XA
Authority: CN
Inventors: 石太平; 高霞; 马大龙; 邓唯唯; 王欣宇; 张晨颖; 高鹏; 郭金海; 程华玲; 于鹏; 童郁蓉; 马进京; 陆阳; 李娜; 蔡恬静; 王峰; 王平章
Original assignee: Sinogenomax Co Ltd
Current assignee: Sinogenomax Co Ltd
Priority date: 2005-10-18
Filing date: 2005-10-18
Publication date: 2007-04-25

Abstract

本发明公开了一类新的编码具有促进人体细胞转录因子NF－кB活化功能的蛋白的多核苷酸，及其编码的多肽，多肽的抗体。本发明还公开了所述多肽、抗体在制备预防和治疗与人体细胞转录因子NF－кB相关的疾病，尤其炎症、过敏性疾病、自身免疫病和肿瘤的药物以及在开发调节淋巴细胞的活化、增殖和凋亡药物上的用途。

Description

促进人体转录因子NF-κB活化的多核苷酸及其编码多肽和用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及基因表达调控领域，具体地说，本发明涉及一类新的编码具有促进人体细胞转录因子NF-κB活化功能的蛋白的多核苷酸，及其编码的多肽，多肽的抗体。本发明还涉及所述多肽、抗体在制备预防和治疗与人体细胞转录因子NF-κB相关的疾病，尤其炎症、过敏性疾病、自身免疫病和肿瘤的药物以及在开发调节淋巴细胞的活化、增殖和凋亡药物上的用途。

背景技术

细胞核因子NF-κB是人体最重要的转录因子之一，它参与诱导多种细胞及病毒化基因的表达，在多种类型细胞的基因表达调节中起多效性作用。这些基因对炎症、免疫和凋亡信号进行应答而被激活，其中包括许多细胞因子、趋化因子、受体、粘附分子等。NF-κB也参与病毒启动子转录的起始，例如I型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)。

哺乳动物的NF-κB包含5种蛋白：p65(RelA)、p50(NF-κB-1)、RelB、c-Rel、p52(NF-κB-2、p50B)，它们在氨基末端区有300个氨基酸相似，称为Rel同源区。5种NF-κB蛋白质分子可以形成同源或异源二聚体，以不同的结合特异性与特定的DNA识别部位结合，具有不同的反式激活活性。

由于NF-κB的活化能够促进许多前炎症因子的转录表达，所以，NF-κB的过度活化会引起炎症的发生、过敏性疾病以及自身免疫病；由于NF-κB的活化能够促进细胞生长抑制凋亡，所以其在肿瘤的发生发展过程中起重要的作用；此外，NF-κB的活化能够阻断一些细胞的凋亡，所以其在调节细胞的生长分化方面也具有重要的功能。

TNFα(肿瘤坏死因子α)、PMA(十四酸波沸酯)、IL-1(白细胞介素-1)、LPS(脂多糖)均可以促进NF-κB活化；MEKK(有丝分裂原活化蛋白激酶的激酶的激酶)、TRAF(肿瘤坏死因子受体相关因子)等NF-κB信号通路正调节基因的表达也可以促进NF-κB活化；而IL-10(白细胞介素-10)、FK506(藤霉素)、糖皮质激素、阿司匹林等则能明显地抑制NF-κB的活化。

鉴于NF-κB在调节人体生理功能，以及在多种疾病的发生、发展中所起的重要作用(BurkeJ.R.Curr Opin Drug Discov Devel.2003 6(5)，720-8)，NF-κB的抑制剂和抑制基因在炎性疾病和肿瘤性疾病的治疗中必将有着重要应用。目前NF-κB活化调节领域已经成为基础医学、临床医学研究以及药物开发的一个焦点，例如I-KappaB-α、I-KappaB-β等与NF-κB活化有关的调节蛋白(美国专利5,597,898)。此外，NF-κB的许多负向调节物如抗白细胞介素-1的治疗，抗肿瘤坏死因子的治疗，激素治疗，阿斯匹林，非激素类抗炎药物等(参考综述文章Nature ReviewImmunology，2002，2∶725；J Clin Invest，January 2001，Volume 107，Number 2，135-142)已被广泛应用于临床，但这些药物存在有特异性不强、抑制不够明显、不够稳定的缺点，而且往往有副作用。因此，有必要进一步探索抑制NF-κB活化的新的调控基因，并研究其在细胞内的表达对NF-κB活化的调节功能，从而为开发治疗炎症、过敏性疾病、自身免疫病以及肿瘤的药物提供必要的依据。

发明内容

人基因组学研究目前是国际上的热点，除大规模测序的方法外，还缺少从功能研究开始的高通量筛选具有功能的基因的方法。针对这种现状及现有药物或试剂的不足，本发明的目的是提供一类新的编码具有促进人体转录因子NF-κB活化的蛋白的多核苷酸NFAF1、2、3、4、5、6这类多核苷酸的表达产物转入细胞后具有明显稳定的促进NF-κB活化的作用。

本发明的另一目的是提供这类多核苷酸所编码的多肽。

本发明的另一目的是提供含有这类多核苷酸的载体，和这类多核苷酸及其载体转化或转导的宿主细胞。

本发明的另一目的是提供这类多核苷酸所编码的多肽的抗体和用于检测的核酸分子。

本发明的另一目的是提供这类新的多核苷酸在宿主细胞中外源表达促进NF-κB活化的应用。

本发明的另一目的是提供生产这些多核苷酸和其编码的多肽的方法以及该多核苷酸及其编码的多肽的用途。

本发明的技术方案包括以下内容：

在本发明的第一方面，提供新颖的分离的多核苷酸，它包含编码具有促进人体转录因子NF-κB活化功能的蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列选自：(a)与编码含有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8的氨基酸序列的多肽的多核苷酸有至少70％相似性的多核苷酸；(b)编码含有与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO：10、SEQID NO：12的氨基酸序列有至少70％相似性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(c)与(a)或(b)的多核苷酸互补的多核苷酸。

较佳地，该多核苷酸编码的多肽具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12。

较佳地，该多核苷酸的序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少85％相似性：(a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11的编码区序列或全长序列；(b)在遗传密码简并范围内相应于(a)中提到的序列的至少一个序列；(c)与(a)或(b)中提到的序列互补的序列杂交的至少一个序列。

更佳地，该多核苷酸的序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11的编码区序列或全长序列。

在本发明的第二方面，提供了上述核苷酸所编码的多肽，它包含具有选自下组中的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQID NO：12；或与以上任一氨基酸序列具有至少90％以上相似性的多肽，或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

较佳地，该多肽是具有选自下组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体；以及被该载体转化或转导的宿主细胞，还提供了被上述多核苷酸转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了与上述多肽特异性结合的抗体，还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述任一多核苷酸中8-100个连续的核苷酸。

在本发明的第五方面，提供了上述多核苷酸在宿主细胞中外源表达促进NF-κB活化的应用。

在本发明的第六方面，提供了上述多核苷酸和多肽在制备预防和/或治疗与人体细胞转录因子NF-κB有关的疾病的药物中的用途，或在制备调节细胞增殖、凋亡、存活、分化、癌变等的药物或试剂中的用途。较佳地，在制备预防和/或治疗与人体细胞转录因子NF-κB有关的炎症和肿瘤。

在本发明地第七方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明中的具有促进人体转录因子NF-κB活化功能的多肽及药学上可接受的载体。

在本发明的第八方面，提供了一种神经性退行疾病或肿瘤的体外检测方法，利用上述抗体或核酸片段来检测宿主样品中的多肽的存在或水平。

本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域技术人员而言是显而易见的。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如果从天然状态中与共同存在的其他物质分开，则为分离纯化的。这样的多核苷酸可能是某一载体的一部分，也可能这样的多核苷酸或多肽是某一组合物的一部分，既然载体或组合物不是它们的天然环境的成分，这些多核苷酸或多肽仍然是分离的。

如本文所用，“相似性”是指核苷酸或多肽序列比对过程中用来描述检测序列和目标序列之间相同DNA碱基或氨基酸残基顺序所占比例的高低，是一种直接的数量关系，通过部分相同或相似的百分比来度量核苷酸序列或者多肽序列之间相似的程度，此相似性百分比可以通过本领域已有的比对方法来计算，例子有两两序列间的比对方法FASTA程序(Pearson，W.R.and Lipman，D.J.1988.Improved tools for biological sequence comparison.Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448)，BLAST程序(Altschul，S.F.，et al.1990 Basic local alignment search tool.J.Mol.Biol.215：403-410)等等，或多序列比对方法CLUSTAL W(CORPET，F.1998 Multiplesequence alignment with hierarchical clustering.Nucleic Acids Res.，16：10881-10890)等。同源序列是指从某一共同祖先经趋异进化而形成的不同序列，根据相似性百分比可以判断比对序列间的同源性。当基因或蛋白质间相似程度很高时，表示它们具有一段共同的进化历程，从而判断它们会具有相似的生物学功能。当具有至少50％的相似程度时，比较容易推测检测序列和目标序列可能是同源序列。较佳地，具有至少70％的相似程度；更佳地，具有至少85％的相似程度，最佳地，具有至少90％的相似程度。而当相似性程度低于20％时，就难以确定或者根本无法确定其是否具有同源性。

本发明的多核苷酸包括其互补链可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。如本文所用，“编码具有促进人体转录因子NF-κB活化功能的多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码序列和/或非编码序列的多核苷酸。以多肽NM166-402为例(在本申请中，蛋白质的命名采用其克隆编号)，编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：13所示的编码区序列相同或者是遗传密码简并的变异体。如本文所用，“遗传密码简并”是指一个氨基酸有几个密码子的现象。例如在本发明中编码多肽NM166-402的遗传密码简并的变异体指编码具有SEQ ID NO：12的多肽的核苷酸，且此核苷酸与SEQ ID NO：11所示的编码区序列有差别。对于其他具有激活人体转录因子NF-κB表达功能的多肽，可依此类推。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，它编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。该多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与本发明所述的多核苷酸序列的互补序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与此多核苷酸序列的互补序列可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，更好的是在97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与本发明所述的多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明的多核苷酸序列能用本领域已有的方法获得。这些技术包括但不局限于：(1)通过杂交技术分离DNA序列；(2)人工化学合成DNA序列；(3)通过构建cDNA文库大规模获得所需的多核苷酸；(4)PCR扩增技术。

第一种方法是先构建基因组文库或者cDNA文库，然后通过分子杂交等技术从基因组文库或cDNA文库中筛选出目的基因或序列。当生物基因组比较小时，此方法较易成功：当生物基因组很大时，构建其完整的基因组文库较困难，再从庞大的文库中去克隆目的基因的工程量也很大。

第二种方法是按设计好的序列一次合成100-200bp长的DNA片段，再用这些合成的片段组合连接成完整的基因。这种合成长的基因序列的方法的价格十分昂贵。此方法主要用于合成作为引物、接头等的核酸片段。

第三种方法是用本领域通常的方法构建cDNA文库，多次测序后，结合生物信息学分析技术(Ota et al.Nat Genet.2004 Jan；36(1)：40-5)，大规模获得目的cDNA克隆。生物信息学分析技术包括但不限于用BLAST或BLAT与已有的公共数据库比对，如refseq数据库等；用Phred算法评估测序质量；用计算转录起始密码子ATG的出现概率的ATGpr算法筛选全长cDNA序列等。

第四种方法用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。本发明优选应用的方法是两步法通量化RT-PCR技术在混合cDNA文库中扩增得到大量的cDNA克隆。混合cDNA文库包括现有的cDNA文库和肿瘤文库。

本发明的基因，或者各种DNA片段等核苷酸序列的测定可用常规方法，如双脱氧链终止法(Sanger et al.PNAS，1977，74：5463-5467)；也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列，测序需要反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接成全长的cDNA序列。

本发明还涉及从大量的cDNA克隆中筛选本发明的多核苷酸，利用本领域熟知的方法即可。这些方法包括但不限于：(1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交，如Southern印迹法、Northern印迹法或原位杂交等；(2)标志基因功能的出现或丧失；(3)测定具有促进人体细胞转录因子NF-κB活化作用的蛋白的转录本的水平；(4)通过免疫学技术和测定生物学活性来检测基因表达的蛋白产物，如Western印迹法，放射免疫沉淀法，酶联免疫吸附法(ELISA)等。上述方法可以单独使用，也可以联合使用。本发明优选双荧光素酶报告基因法来筛选具有促进NF-κB活化作用的基因。

双荧光素酶报告基因法采用的是体内信号转导途径顺式报导系统，其中所用的NF-κB-luc报告质粒载有萤火虫荧光素酶基因，该基因的表达由合成的启动子所调控，其中包含基本的启动子元件(TATA box)，以及转录因子NF-κB的结合位点， NF-κB-luc报告质粒的结构图如图2所示。当细胞内的NF-κB通过某种信号转导途径而被活化时，NF-κB便会结合于报告质粒NF-κB-luc的增强子元件，从而启动报告基因萤火虫荧光素酶基因的转录，进一步胞内翻译成荧光素酶，导致细胞内荧光素酶数量增加，活性增强；相反，当细胞内的NF-κB活化受到抑制的时候，荧光素酶的表达量及活性就低。所以，通过检测荧光素酶的活性，便可以反映不同刺激物以及共转染的目的基因对细胞内NF-κB是否具有促进活化或者抑制活化的功能。pRL-SV40报告质粒载体含有水母荧光素酶基因，该基因的表达由猿猴病毒40(SV40)增强子/启动子所调控，转染哺乳动物细胞后可以产生较强的基本水平的水母荧光素酶的表达，且表达的活性不受NF-κB活化与否的调节，所以在实验中用作内对照报告基因。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本发明的多肽可以是糖基化的，也可以是非糖基化的。本发明的多肽可以包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括具有促进人体细胞转录因子NF-κB活化的多核苷酸编码的人蛋白多肽的片段、衍生物和类似物。术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持与本发明的天然具有激活人体细胞转录因子NF-κB活化功能的人蛋白多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物和类似物可以是：(a)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优先保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(b)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(c)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物)融合所形成的多肽，或(d)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。

本发明的多肽可以通过常规的重组DNA技术，利用本发明的多核苷酸序列来表达或生产重组的具有促进人体细胞转录因子NF-κB活化功能的蛋白多肽(Science，1984；224：1431)。包括以下步骤：

(1)用本发明的多核苷酸(或其变异体)，或用含有此多核苷酸的表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养步骤(1)得到的宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化所需的蛋白多肽。

本发明中的多核苷酸和多肽优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明也涉及包含本发明所述多核苷酸的载体。本发明中，编码具有促进人体细胞转录因子NF-κB活化功能的人蛋白多肽的多核苷酸序列可以插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒，如腺病毒、逆转录病毒，或者其他载体。在本发明中适用的载体可以是原核表达载体，也可以是真核表达载体，如在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)，在哺乳动物细胞中高表达的真核表达载体pcDNA^TM3.1/myc-hisB(-)(Invitrogen，以下缩写为pcDB)，pcDNA3.1/V5-His-TOPO(Invitrogen，以下缩写为pcDT)。本发明优选pcDT，它可以直接与PCR产物连接来构建真核表达载体，大大提高了规模化生产的效率。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以应用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。用本领域的技术人员熟知的方法来构建含有本发明所述多核苷酸序列和转录/翻译控制信号的表达载体即可。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组DNA技术等(Sambrook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory.New York，1989)。

本发明的多核苷酸序列可有效地连接到表达载体中的适当的启动子上来指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体优选的包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性、或真核细胞培养用的绿色荧光蛋白(GFP)、新霉素抗性及二氢叶酸还原酶。

本发明还涉及用上述载体或者本发明的多核苷酸经基因工程产生的宿主细胞。本发明的载体和多核苷酸可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达具有促进人体细胞转录因子NF-κB活化功能的蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞；T293、hella细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常有10-300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。例子有：在复制起始点下游的100-270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点下游的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域的普通技术人员都知道如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主细胞为原核细胞如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收集，用CaCl₂法处理，所用步骤是本领域众所周知的。可供选择的是MgCl₂处理。也可用电穿孔的方法处理。当宿主是真核细胞时，可选择以下转染方法：磷酸钙共沉淀法、常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，来表达本发明的多核苷酸所编码的多肽。根据所选的宿主细胞选择合适的常规培养基，在适于宿主细胞生长的条件下培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用适当的方法如温度转化或化学诱导，来诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

上述方法中的重组多肽可包被于细胞内、细胞外或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其他特性通过各种分离方法分离和纯化重组多肽。这些方法是本领域技术人员所熟知的，如常规的复性处理，用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析和其它各种液相层析技术或这些方法的结合。

本发明还涉及与本发明多核苷酸的任何一部分同源的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含有15个核苷酸，较好的是至少30个核苷酸，更好的是至少50个核苷酸，最好的是至少100个核苷酸。此核酸片段通常是在本发明的核苷酸序列信息的基础上化学合成的DNA序列。上述核酸片段可以用于PCR扩增技术(如作为引物)以确定和/或分离编码具有促进人体细胞转录因子NF-κB活化功能的多核苷酸；也可以作为杂交所用的探针。本发明的多核苷酸的一部分或全部也可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片上，用于分析组织中基因的差异表达和基因诊断。探针的标记可用放射性同位素，荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。

NF-κB是一种有重要生理功能的转录因子，其与免疫应答调节、胚胎和细胞系的发育、细胞凋亡、炎症、细胞周期、肿瘤发生、病毒复制及多种自身免疫性疾病相关。本发明的多核苷酸和多肽具有促进人体细胞转录因子NF-κB活化的功能，可以阻止与NF-κB相关疾病的发生和发展，可以用于制备预防和治疗治疗炎症、和肿瘤以及调节细胞增殖、凋亡、存活、分化、癌变等的新药物，为开创新的临床诊断、疗效评价及预后指标奠定必要的基础。

本发明的多肽可以直接作为药物治疗疾病，如炎症和肿瘤等；还可用于筛选促进或对抗具有促进NF-κB活化功能的蛋白的抗体、多肽或其它配体，例如，筛选可用于促进或抑制本发明的蛋白的功能的抗体。用表达的重组的本发明的蛋白来筛选多肽库，用于寻找有治疗价值的能够促进或抑制本发明的蛋白的功能的多肽分子。

本发明的多肽可以单独使用或者与合适的药物载体组合后使用。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂及不影响药物效果的载体和赋型剂。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油及它们的组合。药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。给药于患者的用量取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。

本发明的多肽也可以通过在活体表达这些多肽来使用。例如患者的细胞可以通过在体外用编码本发明多肽的基因进行基因工程操作，然后将工程细胞提供给患者，使工程细胞在体内高表达这种多肽，从而达到治疗的目的。

具有促进NF-κB活化功能的人蛋白的多核苷酸也可用于多种治疗目的。可用在基因治疗技术中来治疗由于具有促进NF-κB活化功能的人蛋白表达异常或活性异常导致的疾病。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的具有促进NF-κB活化功能的人蛋白，来抑制内源性的具有促进NF-κB活化功能的人蛋白的活性。重组的具有促进NF-κB活化功能的人蛋白基因也可包装到脂质体中转移至细胞内。

抑制本发明多肽mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。反义RNA和DNA以及核酶可用本领域已有的方法合成。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷间的连接用磷酸硫酯键或肽键。

本发明的多肽及其片段、衍生物、类似物或表达它们的细胞可以作为抗原来生产抗体。这些抗体包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的抗体。本发明的多肽的抗体可用本领域公知的抗体制备方法来生产。例子有：单克隆抗体可用杂交瘤技术生产(Kohler and Milstein.Nature，1975，256：495-497)。多克隆抗体的生产可用本发明的多肽免疫动物，如家兔、小鼠、大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术产生(Morrison etal.PNAS，1985，81：6851)。单链抗体也可用已有的技术生产(U.S.Pat No.4946778)。

本发明的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活体标本中的具有促进人体细胞转录因子NF-κB活化功能的蛋白。还可以在临床上用于炎症性疾病、过敏性疾病、自身免疫病以及肿瘤的临床诊断、治疗、疗效评价等。例如用放射性同位素标记与本发明的多肽结合的单克隆抗体，然后注入体内跟踪其位置和分布，可以作为一种非创伤性诊断方法来定位肿瘤细胞，或判断肿瘤细胞是否转移。本发明中的抗体还可以用于治疗或预防与具有促进人体细胞转录因子NF-κB活化功能的人蛋白相关的炎症或肿瘤疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断具有促进细胞转录因子NF-κB活化功能的人蛋白的产生或活性。

本发明还涉及定量和定位检测具有促进NF-κB活化功能的蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中检测的具有促进NF-κB活化功能的蛋白水平，可以用作解释具有促进NF-κB活化功能的蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断具有促进NF-κB活化功能的蛋白起作用的疾病。

具有促进NF-κB活化功能的蛋白的多核苷酸可用于具有促进NF-κB活化功能的蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，具有促进NF-κB活化功能的蛋白的多核苷酸可用于检测具有促进NF-κB活化功能的蛋白的表达与否，或在疾病状态下具有促进NF-κB活化功能的蛋白的异常表达。如具有促进NF-κB活化功能的蛋白的DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断具有促进NF-κB活化功能的蛋白的表达异常。杂交技术是本领域已公开的成熟技术，包括Southern印迹法、Northern印迹法、原位杂交等，相关的试剂盒可以从商业途径获得。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片上，用于分析组织中基因的差异表达和基因诊断。用具有促进NF-κB活化功能的蛋白特异的引物进RNA-聚合酶链式反应(RT-PCR)体外扩增也可以检测具有促进NF-κB活化功能的蛋白的转录产物。

检测具有促进NF-κB活化功能的蛋白基因的突变也可用于诊断具有促进NF-κB活化功能的蛋白相关的疾病。具有促进NF-κB活化功能的蛋白基因的突变形式包括与正常野生型的具有促进NF-κB活化功能的蛋白的DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用本领域已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Westen印迹法可间接判断基因有无突变。

基因NFAF1、2、3、4、5、6在实验中所有用到的正常组织、胎儿组织、肿瘤组织中都有表达，说明其为人体自身重要的NF-κB影响因子；在不同的组织中表达量高低有差别，说明其在不同的组织中发挥功能的程度不同。

以下对本发明的实施方案进一步详细说明。

本发明通过对NCBI的refseq数据库进行人功能未知预测基因检索，获得人未知功能基因序列，进一步利用Human_est数据库通过BLASTn方法进行序列校正，根据校正后得到的序列设计基因特异引物，从混合人组织cDNA文库中通过两步法通量化RT-PCR技术扩增得到目的基因的编码区cDNA片段。此编码区cDNA片段与pcDT重组构建真核表达载体。采用双荧光素酶报告基因法检测本发明中的基因对NF-κB的促进活化功能。试验证明，本发明的多肽具有显著、稳定的促进人体细胞转录因子NF-κB活化的作用。

本发明的优点：

1、提供了规模化克隆和筛选新基因的技术平台。

2、提供了人类新基因NFAF1、2、3、4、5、6的cDNA序列及其编码多肽，并首次发现该类基因具有促进NF-κB活化的功能；

3、基因NFAF1、2、3、4、5、6具有促进NF-κB活化的作用，并且高效、稳定，表明它们在细胞内有比较高的亲和力和效力；

4、NFAF1、2、3、4、5、6在机体多数正常细胞表达，说明其为自身重要的NF-κB调控分子。

5、基于上述的4个优点，本发明为进一步研究NFAF1、2、3、4、5、6与NF-κB之间的调控关系，以及开发治疗炎症、和肿瘤以及调节细胞增殖、凋亡、存活、分化、癌变等的新药物，为开创新的临床诊断、疗效评价及预后指标奠定必要的基础。

附图说明

图1 真核表达载体pcDT-NFAFx的构建示意图，其中x为1、2、3、4、5、6之一。

图2 pNF-κB-luc荧光素酶基因报告质粒的结构图。

图3 NFAF1、2、3、4、5、6促进NF-κB的活化。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南》(2002年第三版[美]萨姆布鲁克等箸，科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、两步法通量化RT-PCR技术扩增目的基因

(1)对NCBI的refseq数据库进行人功能未知预测基因检索，获得人未知功能基因序列，并利用Human_est数据库通过BLASTn方法进行序列校正，最终得到的序列设定为下组序列：SEQID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11。根据此类序列设计基因NFAF1、2、3、4、5、6的特异引物：

基因名称	上游引物(5′-3′)	下游引物(5′-3′)
基因名称	上游引物(5′-3′)	下游引物(5′-3′)	NFAF1NFAF2NFAF3NFAF4NFAF5NFAF6	gcacgagggtctcatccatgcggcgattttcccttctgtcgctctggcttccacaggtccggagatggtccggcctaagaagtggtccctgaatgggtccagtgccctgttgctgtcggag	ccaggtcttgtgctttagagctgctttgattatgggaatacatctcacacctccgcctcctggttcaagggctcaccaggcgaagaggcttcgctgctgagggtatttctcttagggatgaaagatcaatgagtgc

(2)用上述引物，按目的基因的表达谱在现有的cDNA文库和肿瘤文库中选择模板，进行初扩。现有的文库包括12种人体正常组织(心、胰、睾丸、卵巢、前列腺、结肠、小肠、骨骼肌、胸腺、淋巴结、扁桃体、白细胞)；6种人肿瘤组织(肺癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌)；和8种胎儿组积(胎肺、胎心、胎肝、胎脾、胎肾、胎脑、胎骨骼肌、胎胸腺)的cDNA文库(Clonetch，K1420-1，1241-1)。初扩反应条件如下：50μl PCR反应：

cDNA混合库	各1.0μl
cDNA混合库	各1.0μl	5’，3’引物	终浓度为2pmol/μl
10×Pyrobest buffer	5μl	5’，3’引物	终浓度为2pmol/μl
10×Pyrobest buffer	5μl	2.5mM dNTPs	4μl
Pyrobest	1μl	2.5mM dNTPs	4μl
Pyrobest	1μl	双蒸水	补足至50μl

PCR延伸时间根据所扩目的基因的最长片段，按50sec/Kb的原则进行扩增：

初扩产物纯化到30μl，以去除PCR反应体系中大量的引物及dNTPs等，并浓缩整个体系，得到对应目的基因序列的二级扩增库，可作为二扩(大扩)的模板。

(3)将(2)中的纯化产物作为模板，对每个目的基因进行二扩，反应条件如下：50μl PCR(每个基因)反应：

一扩纯化产物	1.6μl
一扩纯化产物	1.6μl	5’，3’引物	终浓度为2pmol/μl
10×Ex-Taq buffer	5μl	5’，3’引物	终浓度为2pmol/μl
10×Ex-Taq buffer	5μl	2.5mM dNTP	4μl
Ex-Taq	0.5μl	2.5mM dNTP	4μl
Ex-Taq	0.5μl	双蒸水	补足至50μl

得到的PCR产物取10μl上样电泳，挑选有扩增条带的PCR产物，进行等体积纯化(40μl)。

通过两步PCR反应扩增出非单一条带的基因用Qiagen胶回收试剂盒切胶回收目的片段。扩增的结果表明，这些组织的细胞中都存在基因NFAF1、2、3、4、5、6的cDNA，说明NFAF1、2、3、4、5、6在这些组织的细胞中都产生了基因NFAF1、2、3、4、5、6的转录产物，有较广的表达图谱，在多种组织中参与转录因子的调节。

实施例2、基因NFAF1、2、3、4、5、6真核表达载体的构建

将二扩纯化产物和真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO(Invitrogen，)，按照试剂盒制造厂商建议的条件进行连接反应。电击法转化大肠杆菌DH5α，转化物在含氨苄青霉素的固体LB平板培养基上生长，挑选生长的单一克隆菌落，提取质粒，用EcoRI酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定，挑选有插入片段的阳性克隆，通过测序(使用ABI PRISM 3700 DNA分析仪)，选出正确的正向插入克隆，各自命名为pcDT-NFAF1、2、3、4、5、6。

同时收集培养液，用SDS-PAGE分析沉淀蛋白，获得NFAF1、2、3、4、5、6多肽。

NFAF1、2、3、4、5、6蛋白分析结果显示：NFAF1、2、3、4、5、6蛋白序列如下组序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12所示。

实施例3、双荧光素酶报告基因法测定目的基因对NF-κB活化的促进作用

用目的基因和报告基因NF-κB-luc，pRL-SV40共转染人胚胎肾293T细胞，通过分别检测两种荧光素酶活性来测定NF-κB的活性。共转染的方法为脂质体转染法，采用LipfectanineTM2000(Invitrogen，11668027)，按产品说明书所述进行。

转染操作步骤如下：

(1)细胞培养：将293T细胞(ATCC Number：CRL-11268)(2.0×104)用含10％胎牛血清的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)培养基(Hyclone，SH0022.02)铺在96孔细胞培养板(Costar，3599)上，在5％CO₂，37℃的培养箱中培养16小时。

(2)制备DNA-LipfectamineTM2000复合物：用25μl不含血清的DMEM培养基稀释20ng NF-κB-luc，2ng pRL-SV40和20ng pcDT-NFAF1、2、3、4、5、6，缓慢混合均匀；同样用25μl DMEM培养基稀释适当量的LipfectaminTM2000，缓慢混合均匀，在室温下保温5分钟后，与稀释的DNA缓慢混合，室温放置20分钟，以形成DNA-Lipofectamine 2000复合物。

(3)转染：将DNA-Lipofectamine 2000复合物缓慢滴入细胞培养板(50μl/孔)，轻微摇匀。5％CO₂，37℃的培养箱中培养24小时。

检测时加入Reporter Lysis Buffer(Promega，E4030)，在-80℃下放置30分钟以上，取出后在室温自然融化，使细胞裂解，然后将细胞裂解液移入荧光板(Gronier，655075)，用Dual-Luciferase Reporter Assay System 10-Pack(Promaga，E1960)，通过GENios Pro(TECAN)检测荧光素酶活性。

设定转染pcDT空载体、不加刺激物时细胞内的荧光素酶活性比值(萤火虫荧光素酶荧光强度/水母荧光素酶荧光强度表示)为1，其他条件下细胞内的荧光素酶活性比值以此为标准，用相对值表示。结果参照图3，分别用20ng pcDT-NFAF1、2、3、4、5、6和20ng NF-κB-luc共转染293T细胞，待检质粒可明显促进NF-κB的活化，pNF-κB-luc荧光素酶活性明显上调，与阳性对照MEKK效果相似，表明NFAF1、2、3、4、5、6在293T细胞中的表达产物对NF-κB活化有强的促进作用。

实施例4、抗体制备

抗原选用原核细胞或真核细胞表达的NFAF1、2、3、4、5、6蛋白全长或部分肽段，也可以合成多肽作为抗原。

多克隆抗体的制备：免疫动物选用成年雄性新西兰兔或BALb/c小鼠，初次免疫用200ug(新西兰兔)或20ug(BALb/c小鼠)抗原与等体积弗氏完全佐剂(FCA)充分乳化后，于背部皮下多点注射。初次免疫后21、42、63天，用弗氏不完全佐剂(FIA)完全乳化的抗原蛋白，各加强免疫1次，用量同前。每次免疫后7~10天，ELISA方法检测血清效价，达到1×10-4时，放血分离血清.Western blot鉴定抗体特异性。

单克隆抗体制备：免疫BALb/c小鼠同前，取脾脏制成B细胞悬液，与对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0融合，通过HAT(H，次黄嘌呤；A，氨基喋呤；T，胸腺嘧啶核苷)选择性培养，获得杂交细胞系，再通过ELISA方法检测抗体效价，筛选出特定的杂交瘤细胞系，并得到单克隆抗体。

序列表

<110>北京诺赛基因组研究中心有限公司

<120>促进人体转录因子NF-κB活化的多核苷酸及其编码多肽和用途

<130>

<160>12

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1358

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(20)..(835)

<400>1

tggcacgagg gtctcatcc atg gct tcc gcg gac tcg cgc cgg gtg gca gat 52

Met Ala Ser Ala Asp Ser Arg Arg Val Ala Asp

1 5 10

ggc ggc ggt gcc ggg ggc acc ttc cag ccc tac cta gac acc ttg cgg 100

Gly Gly Gly Ala Gly Gly Thr Phe Gln Pro Tyr Leu Asp Thr Leu Arg

15 20 25

cag gag ctg cag cag acg gac cca acg ctg ttg tca gta gtg gtg gcg 148

Gln Glu Leu Gln Gln Thr Asp Pro Thr Leu Leu Ser Val Val Val Ala

30 35 40

gtt ctt gcg gtg ctg ctg acg cta gtc ttc tgg aag tta atc cgg agc 196

Val Leu Ala Val Leu Leu Thr Leu Val Phe Trp Lys Leu Ile Arg Ser

45 50 55

aga agg agc agt cag aga gct gtt ctt ctt gtt ggc ctt tgt gat tcc 244

Arg Arg Ser Ser Gln Arg Ala Val Leu Leu Val Gly Leu Cys Asp Ser

60 65 70 75

ggg aaa acg ttg ctc ttt gtc agg ttg tta aca ggc ctt tat aga gac 292

Gly Lys Thr Leu Leu Phe Val Arg Leu Leu Thr Gly Leu Tyr Arg Asp

80 85 90

act cag acg tcc att act gac agc tgt gct gta tac aga gtc aac aat 340

Thr Gln Thr Ser Ile Thr Asp Ser Cys Ala Val Tyr Arg Val Asn Asn

95 100 105

aac agg ggc aat agt ctg acc ttg att gac ctt ccc ggc cat gag agt 388

Asn Arg Gly Asn Ser Leu Thr Leu Ile Asp Leu Pro Gly His Glu Ser

110 115 120

ttg agg ctt cag ttc tta gag cgg ttt aag tct tca gcc agg gct att 436

Leu Arg Leu Gln Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Ser Ala Arg Ala Ile

125 130 135

gtg ttt gtt gtg gat agg gca cca ttc cag cga gag cgg aaa gat gtg 484

Val Phe Val Val Asp Arg Ala Pro Phe Gln Arg Glu Arg Lys Asp Val

140 145 150 155

gct gag ttt ctg tat caa gcc ctc att gac agt atg ggt ctg aag aat 532

Ala Glu Phe Leu Tyr Gln Ala Leu Ile Asp Ser Met Gly Leu Lys Asn

160 165 170

aca cca tca ttc tta ata gcc tgc aat aag caa gat att gca atg gca 580

Thr Pro Ser Phe Leu Ile Ala Cys Asn Lys Gln Asp Ile Ala Met Ala

175 180 185

aaa tca gca aag tta att caa cag cag ctg gag aaa gaa ctc aac acc 628

Lys Ser Ala Lys Leu Ile Gln Gln Gln Leu Glu Lys Glu Leu Asn Thr

190 195 200

tta cga gtt acc cgt tct gct gcc ccc agc aca ctg gac agt tcc agc 676

Leu Arg Val Thr Arg Ser Ala Ala Pro Ser Thr Leu Asp Ser Ser Ser

205 210 215

act gcc cct gct cag ctg ggg aag aaa ggc aaa gag ttt gaa ttc tca 724

Thr Ala Pro Ala Gln Leu Gly Lys Lys Gly Lys Glu Phe Glu Phe Ser

220 225 230 235

cag ttg ccc ctc aaa gtg gag ttc ctg gag tgc agt gcc aag ggt gga 772

Gln Leu Pro Leu Lys Val Glu Phe Leu Glu Cys Ser Ala Lys Gly Gly

240 245 250

aga ggg gac gtg ggc tct gct gac atc cag gac ttg gag aaa tgg ctg 820

Arg Gly Asp Val Gly Ser Ala Asp Ile Gln Asp Leu Glu Lys Trp Leu

255 260 265

gct aaa att gcc tga gaggcagctc taaagcacaa gacctggatg tgtgacacac 875

Ala Lys Ile Ala

270

agttttggaa aaaggtctgt ggtagtctgg agttgatgag gaaggggtac aagatgtggt 935

tagaaacatt tctttgttct ggaaacaaag tactgttgaa accagcttgg aatttttttt 995

tttttttttt tttaagttca gttctccctt atggctgcct ttcaaacaag taccttttat 1055

ctgatgcctg tatcttccct ttgttaaggt gtaacttgat gtagggtcaa ggtttttgtg 1115

acaacaggca gactccacac agagaggata tgatgagaat atggccatca cctgaaaagt 1175

tttcttatct tctgtgcttt tggtccctgg aaacaaatcc gcctatgtat gaagctagtt 1235

gatttccagt tgcactattt ccagttgcct ctgaagttca caggcaatac attgtctagt 1295

cctttgcgaa tttctctgat ttgtgggcac agttatgaag tttccccaca tgtgaagaca 1355

ggt 1358

<210>2

<211>271

<212>PRT

<213>人

<400>2

Met Ala Ser Ala Asp Ser Arg Arg Val Ala Asp Gly Gly Gly Ala Gly

1 5 10 15

Gly Thr Phe Gln Pro Tyr Leu Asp Thr Leu Arg Gln Glu Leu Gln Gln

20 25 30

Thr Asp Pro Thr Leu Leu Ser Val Val Val Ala Val Leu Ala Val Leu

35 40 45

Leu Thr Leu Val Phe Trp Lys Leu Ile Arg Ser Arg Arg Ser Ser Gln

50 55 60

Arg Ala Val Leu Leu Val Gly Leu Cys Asp Ser Gly Lys Thr Leu Leu

65 70 75 80

Phe Val Arg Leu Leu Thr Gly Leu Tyr Arg Asp Thr Gln Thr Ser Ile

85 90 95

Thr Asp Ser Cys Ala Val Tyr Arg Val Asn Asn Asn Arg Gly Asn Ser

100 105 110

Leu Thr Leu Ile Asp Leu Pro Gly His Glu Ser Leu Arg Leu Gln Phe

115 120 125

Leu Glu Arg Phe Lys Ser Ser Ala Arg Ala Ile Val Phe Val Val Asp

130 135 140

Arg Ala Pro Phe Gln Arg Glu Arg Lys Asp Val Ala Glu Phe Leu Tyr

145 150 155 160

Gln Ala Leu Ile Asp Ser Met Gly Leu Lys Asn Thr Pro Ser Phe Leu

165 170 175

Ile Ala Cys Asn Lys Gln Asp Ile Ala Met Ala Lys Ser Ala Lys Leu

180 185 190

Ile Gln Gln Gln Leu Glu Lys Glu Leu Asn Thr Leu Arg Val Thr Arg

195 200 205

Ser Ala Ala Pro Ser Thr Leu Asp Ser Ser Ser Thr Ala Pro Ala Gln

210 215 220

Leu Gly Lys Lys Gly Lys Glu Phe Glu Phe Ser Gln Leu Pro Leu Lys

225 230 235 240

Val Glu Phe Leu Glu Cys Ser Ala Lys Gly Gly Arg Gly Asp Val Gly

245 250 255

Ser Ala Asp Ile Gln Asp Leu Glu Lys Trp Leu Ala Lys Ile Ala

260 265 270

<210>3

<211>1909

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(123)..(842)

<400>3

agatgcaagg cggcgatttt cccttctgtc agatcttgat gaacaaagca gtcataattc 60

atctctagaa agatttatat cctggcattt gaaatgcttt ttatttagaa tagtagtaaa 120

aa atg gaa aaa gaa aaa gga aat gat gat gga ata cca gac caa gag 167

Met Glu Lys Glu Lys Gly Asn Asp Asp Gly Ile Pro Asp Gln Glu

1 5 10 15

aat tcc ttg gat ttt tct gaa cac ttt aac caa ctt gaa ttg ttg gaa 215

Asn Ser Leu Asp Phe Ser Glu His Phe Asn Gln Leu Glu Leu Leu Glu

20 25 30

aca cat gga cac ctt att cct act ggt act caa agt ctt tgg gta ggc 263

Thr His Gly His Leu Ile Pro Thr Gly Thr Gln Ser Leu Trp Val Gly

35 40 45

aat tct gat gaa gat gag gag caa gat gac aaa aat gaa gag tgg tat 311

Asn Ser Asp Glu Asp Glu Glu Gln Asp Asp Lys Asn Glu Glu Trp Tyr

50 55 60

cga ttg caa gaa aaa aaa atg gaa aaa gac cca agc aga ttg ctt ctt 359

Arg Leu Gln Glu Lys Lys Met Glu Lys Asp Pro Ser Arg Leu Leu Leu

65 70 75

tgg gct gct gaa aaa aat cgg ctt acc aca gtg cgg aga ctc ctt tct 407

Trp Ala Ala Glu Lys Asn Arg Leu Thr Thr Val Arg Arg Leu Leu Ser

80 85 90 95

gaa aag gcc act cac gtg aac act agg gat gaa gat gag tat acc cct 455

Glu Lys Ala Thr His Val Asn Thr Arg Asp Glu Asp Glu Tyr Thr Pro

100 105 110

ctt cat cga gca gcc tac agt gga cac tta gat att gtt cag gag ctc 503

Leu His Arg Ala Ala Tyr Ser Gly His Leu Asp Ile Val Gln Glu Leu

115 120 125

att gca cag ggg gcc gat gtt cat gca gtg act gtg gat ggc tgg acg 551

Ile Ala Gln Gly Ala Asp Val His Ala Val Thr Val Asp Gly Trp Thr

130 135 140

ccc ctg cac agt gct tgt aag tgg aat aat acc aga gtg gct tct ttc 599

Pro Leu His Ser Ala Cys Lys Trp Asn Asn Thr Arg Val Ala Ser Phe

145 150 155

tta ctg cag cat gat gca gat atc aat gcc caa aca aaa ggc ctc ttg 647

Leu Leu Gln His Asp Ala Asp Ile Asn Ala Gln Thr Lys Gly Leu Leu

160 165 170 175

acc ccc ttg cat ctt gct gct ggg aac aga gac agc aag gat acc cta 695

Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Gly Asn Arg Asp Ser Lys Asp Thr Leu

180 185 190

gaa ctc ctc ctg atg aac cgt tac gtc aga cca ggg ctg aaa aac aac 743

Glu Leu Leu Leu Met Asn Arg Tyr Val Arg Pro Gly Leu Lys Asn Asn

195 200 205

ttg gaa gaa act gca ttt gat att gcc agg agg aca agt atc tat cac 791

Leu Glu Glu Thr Ala Phe Asp Ile Ala Arg Arg Thr Ser Ile Tyr His

210 215 220

tac ctc ttt gaa att gtg gaa ggc tgt aca aat tct tca cct cag tct 839

Tyr Leu Phe Glu Ile Val Glu Gly Cys Thr Asn Ser Ser Pro Gln Ser

225 230 235

taa caattctagt aattttccta agtttctaaa taccagtgcc tcctgtgtgt 892

gagatgtatt cccataatca aagttgacgt caaacatctt actacaaaaa ttcagtgaca 952

ttcattataa cattcttcca agtgaattgc ctgactttga tgtcaaaatg tatttgaaag 1012

taatttgcat atatctttaa ttatttctgt ggagtttgtg atttttttat cagaaataat 1072

tttaatgtgt gtatacttaa aaacttgaca cgggttgtac agaaactggt atttttggtg 1132

ctgatacaag agaaatgtat ttttaaatat cccacatcct ggatctttgt tgggtattta 1192

gtatattgac atatattttt ataaggtgag gtaactcaga acttaattta aaagtcttaa 1252

atattctgat acaatccagc tgtcttctct accttaccat agccagttgc tttcatttta 1312

aaccagagca agtaacatat tagtgacttg aatcttcata agttaaagta aaaaacagca 1372

aaaaacctag atctttgtct tttagaacac agaccatttt caggaaagca gttagctaag 1432

tgtttaattc atgaatattg tatactgcat cccctaccac aatttacaca atcctgtgga 1492

tagtcctacc tcaccctggt caacctacat gatccttaag ctaatggcga atcacgatga 1552

ccttgtagac atgcacacaa ctataccttt gtccaacaga tcataatata tctgctatcc 1612

aactggtttt acctgcctaa tcctactgat ttgggcactg cttgtatagt ctctcaagtt 1672

cacaggaaat gttgattttc taaggtcctc atttttacag agtatacagg caaagtgaca 1732

ggggaaaagg aattagtcta agagtaaggg gatgattatt atattgaggc taaaaccaca 1792

aagtggctca ggctttaaaa aaaaaacact gtggataatg acaaaaagca taagtaaaaa 1852

tatttgagaa aaataaagta caagttttga acaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1909

<210>4

<211>239

<212>PRT

<213>人

<400>4

Met Glu Lys Glu Lys Gly Asn Asp Asp Gly Ile Pro Asp Gln Glu Asn

1 5 10 15

Ser Leu Asp Phe Ser Glu His Phe Asn Gln Leu Glu Leu Leu Glu Thr

20 25 30

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35 40 45

Ser Asp Glu Asp Glu Glu Gln Asp Asp Lys Asn Glu Glu Trp Tyr Arg

50 55 60

Leu Gln Glu Lys Lys Met Glu Lys Asp Pro Ser Arg Leu Leu Leu Trp

65 70 75 80

Ala Ala Glu Lys Asn Arg Leu Thr Thr Val Arg Arg Leu Leu Ser Glu

85 90 95

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100 105 110

His Arg Ala Ala Tyr Ser Gly His Leu Asp Ile Val Gln Glu Leu Ile

115 120 125

Ala Gln Gly Ala Asp Val His Ala Val Thr Val Asp Gly Trp Thr Pro

130 135 140

Leu His Ser Ala Cys Lys Trp Asn Asn Thr Arg Val Ala Ser Phe Leu

145 150 155 160

Leu Gln His Asp Ala Asp Ile Asn Ala Gln Thr Lys Gly Leu Leu Thr

165 170 175

Pro Leu His Leu Ala Ala Gly Asn Arg Asp Ser Lys Asp Thr Leu Glu

180 185 190

Leu Leu Leu Met Asn Arg Tyr Val Arg Pro Gly Leu Lys Asn Asn Leu

195 200 205

Glu Glu Thr Ala Phe Asp Ile Ala Arg Arg Thr Ser Ile Tyr His Tyr

210 215 220

Leu Phe Glu Ile Val Glu Gly Cys Thr Asn Ser Ser Pro Gln Ser

225 230 235

<210>5

<211>4067

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(3309)..(3923)

<400>5

gcctagtaga gatctggagc cagaagccca gagacagccg agtgcgccgt gcggtctccg 60

gacgctcgct gctcagcccg atccccgcca actgtgcagg cggctgaccc gcagcggcag 120

cggcagcagc gaggactcga gcgctggctg cagcgacacc atggatctct cctttatggc 180

cgcgcagctg cccatgatgg ggggagcttt catggactcg cccaacgagg acttcagcac 240

cgagtactcc ctgtttaact cctctgccaa tgtccacgcg gctgccaatg gccagggcca 300

gccggaagat cctcctcggt cctccaacga cgccgtcttg ctatggattg ccatcatagc 360

tacgctgggg aacatcgtgg tggtgggcgt ggtgtatgcc ttcaccttct gaggacggca 420

caccctgcac caccatgggg tgaggcttgg cacgtagctc tgacttgctg tcggcctttg 480

gcttctcctg tgttctagaa ccaggagttt tgaccagggg cggcggccgt ccttctggaa 540

tttctcccca gcagccctga tttcaaatat cccatgttgt ggtcaagctg agtcagaaga 600

catggaagta tgggcctcct gcccctagag gcatgacggg gcaaggcctt cagagggcag 660

attggggatc cttgaaacta cattccagga acatgggacc agatgagaca gctagttaag 720

tttaaaacat agacatgatt tgatgatcgc ttgctggtgg taaataatca ctcgtgtgtc 780

ttgtttttat gcaaacttat cgaacctagg gcgtggggtg ctggggcaag agcagccctc 840

agaacttcag tgttcctgac ccaattctgg tttcacattc agtcccttgg ccatctagta 900

gggccattgg atgttcctag tttgactttg aaatggcacc tttgccacca gacacctggt 960

cccttccaag acccaagtgc attgggagac ccagggatgg ggggttactg gtaataggtg 1020

gggtttctgg gggtgttgtt ggtggttttt atctcctggt cggactttct cttcttttta 1080

agaagaggag aggatgtctt taagagctag atgtgccagg cagtggactc ttcaggccac 1140

ccacgtgaga atgctgtttc ttctctgagg aatcgtggaa ttttaaagat gaacaagatt 1200

cacatccact gaattattca acggatgggt cagaaagggg ggtgatttgc ctgtggtcac 1260

caggcaggtt tgtggaggag tcggaacaga aagatgtgtc ctcactctca gctcactgag 1320

ctctctgccc caactaagca cttccctgag gaggttgctg agaagctgcc ctcaggagaa 1380

tgtccaggca tcttgaaggt gggtgcgaga ttggcaggct gctcagatac ccgtccttta 1440

cattcagtgt ggataccgtg cattctcctg aagctgtgaa agtgcttctg cccaagccac 1500

ttccttaaat tctgaaatat cagcatctgg ggtcctggca agcaaggaag cttccaagta 1560

aaaaccagag agaagggcac acttttcttt cttcattagg aaatcttatt gcacaggaac 1620

cacccccacc cccacccccc acaccttccc aaggcagcat cccagtgcag atagagtggg 1680

aaaggtccca gaagggggct cactcacctc taggcccaga gaggctttct cctcacttta 1740

tacactgcaa aaacagaaga attgtgtcaa taacaccctc tgtagtggag aaacttaaaa 1800

agctggttag gaagctctcg tgtatattta gagacaatta caagaaagct ggacttgccg 1860

ctgtggtctc aggagaaatg agtgttcttg atgacaggca aagggacatc ttagttgtcc 1920

agaagcggca ctcttccctg gaagccgcca tgttaatagg attactagcc tggctccaga 1980

cagtgcctgc tcatggctgc cagttcttac cgatcacatc tgtcactgcc accgtatatc 2040

atctgccagt gcatcagctt aaggggaggt cacgagtgca aaagaacctg acccttgaca 2100

atgagggaga agggacatgg accacctgtc tggaattcct ggaatcactg gcagggtgga 2160

ggctgggctg gggagttagc cgcggtgtgc gtgaatggct ctgtctccag caagtctctc 2220

tccatcaaac cccaggtctg ccccataagc aagatcttta acagatggat gtctccatga 2280

gaaaacccaa ggcgagaagc ccagagccat ggcggggttg cttgacgtcc tcatggagtc 2340

actctgcccc acatgctcaa atcttccctc tggccccaca tccctaggag ggcctgaccc 2400

ctgtaaagat acaggaggca gctccctggc ctccaaatgg cccatggaga tggcagtcgg 2460

gagacagggt tctgtgtttg ctgcggtgaa gggaggagaa ggcaggagga aaaaggatgg 2520

cttctagccc tgaagaggac tccagcatcc caggcaccgg gtgcttctgg ctgcagtttt 2580

ccctatggag gcccctcagc ctccagccct aacataaatg tcggttaaat tcagttttca 2640

agcctctctc ccttttcagt gtcagagcag tagatggtcc agggcattgg aggcctcgac 2700

cactctgcat tgcagattac agtgacttcc tcggggttgc cccatcttgg tctcctgtgg 2760

tttcttcatc agcttttttt ttaccagcat ctctcaaata acaatgaaga tagatatgcc 2820

cattagtgtc tgattaagga gcaaaggctg gatttctggc cacagcgagc tgcactctcc 2880

ctcctgcctc agccggggtc cgtcttagca gtttggaaag gggaaaaaga tgccggtcct 2940

cactgcttaa gttttgtgtc caggtgccac tagacttgca tgcacactaa ctccttacaa 3000

tcaccacaca gcatcatcgc cccagtgcac agatgaggaa ccagaggctc agaggagtga 3060

agttgccttc ctgaggtcac acagcatgaa agtgatgagc taggatttga atctgggaag 3120

ttgggctcta gagccagact gtactgcctt ctgccacact gtactgcctt ctgtgactgg 3180

gtggcacctc cagggcacat ttacacaagg ccctgaatct gcagaggctg tttctcaaga 3240

tgcccgtcat ggtgtggcct gggccagctc tggcttccac aggtccctga ctgtcctcag 3300

agtggaac atg ctc aac ctc ccg ccc act gct ctc tct ctg ccc aga ttt 3350

Met Leu Asn Leu Pro Pro Thr Ala Leu Ser Leu Pro Arg Phe

1 5 10

cag ggg tgc cgg tcc cca agg cct gcc ccc ttc ttt aag act gaa ctc 3398

Gln Gly Cys Arg Ser Pro Arg Pro Ala Pro Phe Phe Lys Thr Glu Leu

15 20 25 30

aag tct cct tgg aag gcc ccg gtg aag ctc cca gag act ggt ttt ctt 3446

Lys Ser Pro Trp Lys Ala Pro Val Lys Leu Pro Glu Thr Gly Phe Leu

35 40 45

ggg atg cag gca gaa ggg gac cct ccc tgg cca aca ccc agg agc cca 3494

Gly Met Gln Ala Glu Gly Asp Pro Pro Trp Pro Thr Pro Arg Ser Pro

50 55 60

gca gaa gca ccc aca cgt aga aag agg ctc act aca gcc aga agt gca 3542

Ala Glu Ala Pro Thr Arg Arg Lys Arg Leu Thr Thr Ala Arg Ser Ala

65 70 75

gag tca gag tcc tgg gac cat ctt gtt ctg caa ggt gac ccc agg ctc 3590

Glu Ser Glu Ser Trp Asp His Leu Val Leu Gln Gly Asp Pro Arg Leu

80 85 90

ccc agg aca ggg gag agg gat cgt cct cat tca gac tct agc tgg ggc 3638

Pro Arg Thr Gly Glu Arg Asp Arg Pro His Ser Asp Ser Ser Trp Gly

95 100 105 110

ctc tgt act ggc ttc tcc ctg ggt ggg gtt gcc tgt tac ata gct gtg 3686

Leu Cys Thr Gly Phe Ser Leu Gly Gly Val Ala Cys Tyr Ile Ala Val

115 120 125

cct cag aga aag ggt cct gca ttt tct gga atg ttc tct gtg ctt acc 3734

Pro Gln Arg Lys Gly Pro Ala Phe Ser Gly Met Phe Ser Val Leu Thr

130 135 140

cct ctg tgt gcc cct cca ttg ctc ctc tac aag caa tta ggt gat tca 3782

Pro Leu Cys Ala Pro Pro Leu Leu Leu Tyr Lys Gln Leu Gly Asp Ser

145 150 155

aaa gag caa ctt agg ctg ggt gca gtg act cac acc cgt aat ccc ggc 3830

Lys Glu Gln Leu Arg Leu Gly Ala Val Thr His Thr Arg Asn Pro Gly

160 165 170

act ttg gga ggc cga ggc ggg cag gga cag gag ttc aag acc agc ctg 3878

Thr Leu Gly Gly Arg Gly Gly Gln Gly Gln Glu Phe Lys Thr Ser Leu

175 180 185 190

gcc aac atg gtg aaa ccc tgt ctc tac aaa aaa tac aaa aat taa 3923

Ala Asn Met Val Lys Pro Cys Leu Tyr Lys Lys Tyr Lys Asn

195 200

ccagacattg tggcatgtgc ctgtaatccc agctactcag gaggctgaca caggagaatt 3983

gcttgaacca ggaggcggag gctgcagtga gctgagattg tgccactgca ctccagcctg 4043

ggcaacagaa cgagactctg tctc 4067

<210>6

<211>204

<212>PRT

<213>人

<400>6

Met Leu Asn Leu Pro Pro Thr Ala Leu Ser Leu Pro Arg Phe Gln Gly

1 5 10 15

Cys Arg Ser Pro Arg Pro Ala Pro Phe Phe Lys Thr Glu Leu Lys Ser

20 25 30

Pro Trp Lys Ala Pro Val Lys Leu Pro Glu Thr Gly Phe Leu Gly Met

35 40 45

Gln Ala Glu Gly Asp Pro Pro Trp Pro Thr Pro Arg Ser Pro Ala Glu

50 55 60

Ala Pro Thr Arg Arg Lys Arg Leu Thr Thr Ala Arg Ser Ala Glu Ser

65 70 75 80

Glu Ser Trp Asp His Leu Val Leu Gln Gly Asp Pro Arg Leu Pro Arg

85 90 95

Thr Gly Glu Arg Asp Arg Pro His Ser Asp Ser Ser Trp Gly Leu Cys

100 105 110

Thr Gly Phe Ser Leu Gly Gly Val Ala Cys Tyr Ile Ala Val Pro Gln

115 120 125

Arg Lys Gly Pro Ala Phe Ser Gly Met Phe Ser Val Leu Thr Pro Leu

130 135 140

Cys Ala Pro Pro Leu Leu Leu Tyr Lys Gln Leu Gly Asp Ser Lys Glu

145 150 155 160

Gln Leu Arg Leu Gly Ala Val Thr His Thr Arg Asn Pro Gly Thr Leu

165 170 175

Gly Gly Arg Gly Gly Gln Gly Gln Glu Phe Lys Thr Ser Leu Ala Asn

180 185 190

Met Val Lys Pro Cys Leu Tyr Lys Lys Tyr Lys Asn

195 200

<210>7

<211>1173

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(377)..(937)

<400>7

cacgcgtccg ctgccgtacg tcccttccca tgaggatgag atgacccatc tgttgcatcc 60

cggctgctga taaaacaaga ccctcggagc caagaaacaa cactgagttc cagatttcgg 120

aaggttcacg agtgttgccg acacgccctc ccaactgcag acatcctccc tggaggacct 180

gctgtgctca catgcccccc tgtccagcga ggacgacacc tccccgggct gtgcagcccc 240

ctcccaggca cccttcaagg ccttcctcag tcccccagag ccacatagcc accgaggcac 300

cgacaggaag ctgtccccgc tcctgagccc cttgcaagac tcactggtgg acaagaccct 360

gctggagccc agggag atg gtc cgg cct aag aag gtg tgt ttc tcg gag agc 412

Met Val Arg Pro Lys Lys Val Cys Phe Ser Glu Ser

1 5 10

agc ctg ccc acc ggg gac agg acc agg agg agc tac tac ctc aat gag 460

Ser Leu Pro Thr Gly Asp Arg Thr Arg Arg Ser Tyr Tyr Leu Asn Glu

15 20 25

atc cag agc ttc gcg ggc gcc gag aag gac gcg cgc gtg gtg ggc gag 508

Ile Gln Ser Phe Ala Gly Ala Glu Lys Asp Ala Arg Val Val Gly Glu

30 35 40

atc gcc ttc cag ctg gac cgc cgc atc ctg gcc tac gtg ttc ccg ggc 556

Ile Ala Phe Gln Leu Asp Arg Arg Ile Leu Ala Tyr Val Phe Pro Gly

45 50 55 60

gtg acg cgg ctc tac ggc ttc acg gtg gcc aac atc ccc gag aag atc 604

Val Thr Arg Leu Tyr Gly Phe Thr Val Ala Asn Ile Pro Glu Lys Ile

65 70 75

gag cag acc tcc acc aag tct ctg gac ggc tcc gtg gac gag agg aag 652

Glu Gln Thr Ser Thr Lys Ser Leu Asp Gly Ser Val Asp Glu Arg Lys

80 85 90

ctg cgc gag ctg acg cag cgc tac ctg gcc ctg agc gcg cgc ctg gag 700

Leu Arg Glu Leu Thr Gln Arg Tyr Leu Ala Leu Ser Ala Arg Leu Glu

95 100 105

aag ctg ggc tac agc cgc gac gtg cac ccg gcg ttc agc gag ttc ctc 748

Lys Leu Gly Tyr Ser Arg Asp Val His Pro Ala Phe Ser Glu Phe Leu

110 115 120

atc aac acc tac gga atc ctg aag cag cgg ccc gac ctg cgc gcc aac 796

Ile Asn Thr Tyr Gly Ile Leu Lys Gln Arg Pro Asp Leu Arg Ala Asn

125 130 135 140

ccc ctg cac agc agc ccg gcc gcg ctg cgc aag ctg gtc atc gac gtg 844

Pro Leu His Ser Ser Pro Ala Ala Leu Arg Lys Leu Val Ile Asp Val

145 150 155

gtg ccc ccc aag ttc ctg ggc gac tcg ctg ctg ctg ctc aac tgc ctg 892

Val Pro Pro Lys Phe Leu Gly Asp Ser Leu Leu Leu Leu Asn Cys Leu

160 165 170

tgc gag ctc tcc aag gag gac ggc aag ccc ctc ttc gcc tgg tga 937

Cys Glu Leu Ser Lys Glu Asp Gly Lys Pro Leu Phe Ala Trp

175 180 185

gccgccccgc gcccgccgcc ttgcctgcag taaacgcgtt tgttccaacc cggggccgcg 997

gtgcctcctg cgcgtccccc cggaggggaa agggccgcgt cccccgcgcg cgaggccaga 1057

gaaggccccg ctcccaccgg tgctgggccc cgaccgcagc ccgccgctgc ccgcacctgc 1117

ggagtgcttc tcacccctca ttaaaatcat ccgtttgcaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1173

<210>8

<211>186

<212>PRT

<213>人

<400>8

Met Val Arg Pro Lys Lys Val Cys Phe Ser Glu Ser Ser Leu Pro Thr

1 5 10 15

Gly Asp Arg Thr Arg Arg Ser Tyr Tyr Leu Asn Glu Ile Gln Ser Phe

20 25 30

Ala Gly Ala Glu Lys Asp Ala Arg Val Val Gly Glu Ile Ala Phe Gln

35 40 45

Leu Asp Arg Arg Ile Leu Ala Tyr Val Phe Pro Gly Val Thr Arg Leu

50 55 60

Tyr Gly Phe Thr Val Ala Asn Ile Pro Glu Lys Ile Glu Gln Thr Ser

65 70 75 80

Thr Lys Ser Leu Asp Gly Ser Val Asp Glu Arg Lys Leu Arg Glu Leu

85 90 95

Thr Gln Arg Tyr Leu Ala Leu Ser Ala Arg Leu Glu Lys Leu Gly Tyr

100 105 110

Ser Arg Asp Val His Pro Ala Phe Ser Glu Phe Leu Ile Asn Thr Tyr

115 120 125

Gly Ile Leu Lys Gln Arg Pro Asp Leu Arg Ala Asn Pro Leu His Ser

130 135 140

Ser Pro Ala Ala Leu Arg Lys Leu Val Ile Asp Val Val Pro Pro Lys

145 150 155 160

Phe Leu Gly Asp Ser Leu Leu Leu Leu Asn Cys Leu Cys Glu Leu Ser

165 170 175

Lys Glu Asp Gly Lys Pro Leu Phe Ala Trp

180 185

<210>9

<211>1530

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(289)..(966)

<400>9

agattaggtc gctctggggc tatcaggcca gcatggacgc tggcaaagcg gggcagaccc 60

tgaagactca ctgctcagcc caggtgagag ccttctgagc tgtgcctggg gctgggggga 120

cagggccctg gaaccccagc agccggcggg tctgggagct gctgtccttg agttggttgg 180

gccctgggaa gctgggttct ggcagcctgg tccctgaatg ggtccagcct gtacagctgg 240

ggtcccaggt gggggtggga caggagccat gagatctgag tcccaaga atg ggg gct 297

Met Gly Ala

1

ggg ctg ggt ttc ggc tca gta gct ccc cac tcc cca aag cgc cca gat 345

Gly Leu Gly Phe Gly Ser Val Ala Pro His Ser Pro Lys Arg Pro Asp

5 10 15

gtc tgc agg tgg ctg agc ccc ttc atc ctc tcc tgc tgc gtg tac ttc 393

Val Cys Arg Trp Leu Ser Pro Phe Ile Leu Ser Cys Cys Val Tyr Phe

20 25 30 35

tgc ctc tgg att ccc gag gac cag ctg tcc tgg ttc gct gcc ctg gtc 441

Cys Leu Trp Ile Pro Glu Asp Gln Leu Ser Trp Phe Ala Ala Leu Val

40 45 50

aag tgc ctg ccc gtc ctc tgc ctg gct ggg ttc ctg tgg gtc atg tcc 489

Lys Cys Leu Pro Val Leu Cys Leu Ala Gly Phe Leu Trp Val Met Ser

55 60 65

cca agc ggg ggc tac acc cag ctc ctc cag gga gcc ctt gtg tgc tcg 537

Pro Ser Gly Gly Tyr Thr Gln Leu Leu Gln Gly Ala Leu Val Cys Ser

70 75 80

gct gtg ggg gac gct tgc ctc atc tgg ccg gca gcc ttc gtc cct ggc 585

Ala Val Gly Asp Ala Cys Leu Ile Trp Pro Ala Ala Phe Val Pro Gly

85 90 95

atg gcc gcc ttt gcc acc gcc cac ctc ctc tac gtc tgg gcc ttc ggc 633

Met Ala Ala Phe Ala Thr Ala His Leu Leu Tyr Val Trp Ala Phe Gly

100 105 110 115

ttc tct ccc ctg cag ccc ggc ctg ctg ctg ctc atc atc ctg gcc cct 681

Phe Ser Pro Leu Gln Pro Gly Leu Leu Leu Leu Ile Ile Leu Ala Pro

120 125 130

ggc ccc tac ctc agc ctt gtg ctc cag cac ctc gag ccg gat atg gtc 729

Gly Pro Tyr Leu Ser Leu Val Leu Gln His Leu Glu Pro Asp Met Val

135 140 145

ctg ccg gtg gca gcc tat ggg ctg atc ctg atg gcc atg ctg tgg cgc 777

Leu Pro Val Ala Ala Tyr Gly Leu Ile Leu Met Ala Met Leu Trp Arg

150 155 160

ggc ctg gcc cag ggc ggg agt gcc ggc tgg ggc gcg ctg ctc ttc acg 825

Gly Leu Ala Gln Gly Gly Ser Ala Gly Trp Gly Ala Leu Leu Phe Thr

165 170 175

ctc tct gat ggc gtg ctg gcc tgg gac acc ttc gcc cag ccc ctg ccc 873

Leu Ser Asp Gly Val Leu Ala Trp Asp Thr Phe Ala Gln Pro Leu Pro

180 185 190 195

cat gcc cgc ctg gtg atc atg acc acc tac tat gct gcc cag ctc ctc 921

His Ala Arg Leu Val Ile Met Thr Thr Tyr Tyr Ala Ala Gln Leu Leu

200 205 210

atc aca ctg tca gcc ctc agg agc ccg gtg ccc aag act gac tga 966

Ile Thr Leu Ser Ala Leu Arg Ser Pro Val Pro Lys Thr Asp

215 220 225

ctagggagct tgaagggccg gtgttcaggc cctctcctcc tgcaaggacc tgggcctccc 1026

agcccagccc agcctgagaa ataccctcag cagcgaagct tcctgacgcc tgtctgcagg 1086

cgccgctgcc gccgtcgctt ctggctgaag acgtttgagg acgatttgcg gaattccaag 1146

tccactactg ggttccagct gccttccccc ggttctgact ccagatccct ggctcctcag 1206

ccaggcccac atggagccct cccagccacc agcctgcctc catgttcact gtcggcccca 1266

cagcctgccc gccccctgct gctgctctga atccgttttc cctgtgggtg tggaaccgta 1326

gatgttgctg ttaccgtagg agaggcctcg gggagggtca tgattgtgat aaaccatcgc 1386

ggttaatgac agcagaaggt tctttgtcgc tccccatgga ccaggcctgg tgcccagtgg 1446

gaccctccat ggccctctgg tggggggatt cggggggata aagtgaggat tgtgcagaac 1506

tgaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1530

<210>10

<211>225

<212>PRT

<213>人

<400>10

Met Gly Ala Gly Leu Gly Phe Gly Ser Val Ala Pro His Ser Pro Lys

1 5 10 15

Arg Pro Asp Val Cys Arg Trp Leu Ser Pro Phe Ile Leu Ser Cys Cys

20 25 30

Val Tyr Phe Cys Leu Trp Ile Pro Glu Asp Gln Leu Ser Trp Phe Ala

35 40 45

Ala Leu Val Lys Cys Leu Pro Val Leu Cys Leu Ala Gly Phe Leu Trp

50 55 60

Val Met Ser Pro Ser Gly Gly Tyr Thr Gln Leu Leu Gln Gly Ala Leu

65 70 75 80

Val Cys Ser Ala Val Gly Asp Ala Cys Leu Ile Trp Pro Ala Ala Phe

85 90 95

Val Pro Gly Met Ala Ala Phe Ala Thr Ala His Leu Leu Tyr Val Trp

100 105 110

Ala Phe Gly Phe Ser Pro Leu Gln Pro Gly Leu Leu Leu Leu Ile Ile

115 120 125

Leu Ala Pro Gly Pro Tyr Leu Ser Leu Val Leu Gln His Leu Glu Pro

130 135 140

Asp Met Val Leu Pro Val Ala Ala Tyr Gly Leu Ile Leu Met Ala Met

145 150 155 160

Leu Trp Arg Gly Leu Ala Gln Gly Gly Ser Ala Gly Trp Gly Ala Leu

165 170 175

Leu Phe Thr Leu Ser Asp Gly Val Leu Ala Trp Asp Thr Phe Ala Gln

180 185 190

Pro Leu Pro His Ala Arg Leu Val Ile Met Thr Thr Tyr Tyr Ala Ala

195 200 205

Gln Leu Leu Ile Thr Leu Ser Ala Leu Arg Ser Pro Val Pro Lys Thr

2l0 215 220

Asp

225

<210>11

<211>3014

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(231)..(1439)

<400>11

caggtggccc tgaattcatt gcctgctcag caaaataaag gcccagtgtg gaagccggaa 60

cttgcatttg aagaaggatg ggaaggatgg gttgaggagg gcccatcccc agcagcccga 120

gagggaggag gccacggaga cttggagcat tcccgtttct tccagagcgc tgcgggataa 180

aggaggagcg tcctgcttcc cggctgccct gttgctgtcg gagtcacagg atg gcg 236

Met Ala

1

gct gtc atc ctg ccc tcg act gct gct ccg tct tcc ctg ttc cca gcc 284

Ala Val Ile Leu Pro Ser Thr Ala Ala Pro Ser Ser Leu Phe Pro Ala

5 10 15

tct cag caa aaa gga cac aca cag ggc gga gag ctg gtt aat gag ctc 332

Ser Gln Gln Lys Gly His Thr Gln Gly Gly Glu Leu Val Asn Glu Leu

20 25 30

ctg aca agc tgg cta cgg ggc ttg gta acc ttc gag gat gtg gcc gtg 380

Leu Thr Ser Trp Leu Arg Gly Leu Val Thr Phe Glu Asp Val Ala Val

35 40 45 50

gag ttc acc cag gag gag tgg gcg ttg ctg gac cct gcc caa agg aca 428

Glu Phe Thr Gln Glu Glu Trp Ala Leu Leu Asp Pro Ala Gln Arg Thr

55 60 65

ctg tac agg gat gtg atg ctg gag aac tgc agg aac ctg gcc tca cta 476

Leu Tyr Arg Asp Val Met Leu Glu Asn Cys Arg Asn Leu Ala Ser Leu

70 75 80

ggg tgt cgt gtt aat aaa ccc agt ctg ata tcc cag ttg gaa caa gac 524

Gly Cys Arg Val Asn Lys Pro Ser Leu Ile Ser Gln Leu Glu Gln Asp

85 90 95

aag aag gtg gtg aca gag gaa aga gga att cta cca agc acc tgt cca 572

Lys Lys Val Val Thr Glu Glu Arg Gly Ile Leu Pro Ser Thr Cys Pro

100 105 110

gat ttg gag act cta ctt aaa gcc aaa tgg tta act cct aag aag aat 620

Asp Leu Glu Thr Leu Leu Lys Ala Lys Trp Leu Thr Pro Lys Lys Asn

115 120 125 130

gtt ttc aga aaa gaa cag tct aaa ggt gta aaa acg gaa aga agt cat 668

Val Phe Arg Lys Glu Gln Ser Lys Gly Val Lys Thr Glu Arg Ser His

135 140 145

cgt gga gtg aaa ctc aat gaa tgt aat cag tgt ttt aaa gtc ttc agc 716

Arg Gly Val Lys Leu Asn Glu Cys Asn Gln Cys Phe Lys Val Phe Ser

150 155 160

acg aaa tct aac cta act cag cac aag aga att cat act gga gaa aaa 764

Thr Lys Ser Asn Leu Thr Gln His Lys Arg Ile His Thr Gly Glu Lys

165 170 175

ccc tat gac tgt agt caa tgt ggg aag tcc ttc agt agc aga tct tac 812

Pro Tyr Asp Cys Ser Gln Cys Gly Lys Ser Phe Ser Ser Arg Ser Tyr

180 185 190

ctt act att cat aag aga atc cat aat ggg gag aaa ccc tat gaa tgc 860

Leu Thr Ile His Lys Arg Ile His Asn Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys

195 200 205 210

aat cac tgt ggg aaa gca ttt agt gat ccc tca tcc ctt aga ctg cat 908

Asn His Cys Gly Lys Ala Phe Ser Asp Pro Ser Ser Leu Arg Leu His

215 220 225

ttg aga att cac act gga gaa aaa ccc tat gaa tgt aac cag tgt ttt 956

Leu Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Asn Gln Cys Phe

230 235 240

cac gtt ttc cgc acc agt tgt aac ctc aaa agc cac aag agg att cac 1004

His Val Phe Arg Thr Ser Cys Asn Leu Lys Ser His Lys Arg Ile His

245 250 255

acg ggg gag aat cac cat gaa tgt aat cag tgt gga aaa gct ttc agc 1052

Thr Gly Glu Asn His His Glu Cys Asn Gln Cys Gly Lys Ala Phe Ser

260 265 270

aca agg tcc tct ctc act ggg cac aat agc att cat aca ggg gag aaa 1100

Thr Arg Ser Ser Leu Thr Gly His Asn Ser Ile His Thr Gly Glu Lys

275 280 285 290

cct tat gaa tgt cac gat tgt ggg aaa acc ttc agg aag agc tcc tat 1148

Pro Tyr Glu Cys His Asp Cys Gly Lys Thr Phe Arg Lys Ser Ser Tyr

295 300 305

ctg aca cag cac gta aga act cat act gga gaa aaa ccc tat gaa tgt 1196

Leu Thr Gln His Val Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys

310 315 320

aac gag tgt ggg aaa tcc ttc agc agt agc ttt tct ctt act gtg cac 1244

Asn Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Ser Ser Phe Ser Leu Thr Val His

325 330 335

aag aga ata cat acc gga gag aaa ccc tac gag tgc agt gac tgt gga 1292

Lys Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Ser Asp Cys Gly

340 345 350

aaa gcc ttt aat aat ctc tca gct gtg aag aaa cac tta aga act cac 1340

Lys Ala Phe Asn Asn Leu Ser Ala Val Lys Lys His Leu Arg Thr His

355 360 365 370

act gga gaa aaa ccc tat gaa tgt aat cat tgt ggg aaa tcc ttc aca 1388

Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Asn His Cys Gly Lys Ser Phe Thr

375 380 385

agt aac tcc tat ctt tct gtg cac aag aga ata cat aat aga tgg ata 1436

Ser Asn Ser Tyr Leu Ser Val His Lys Arg Ile His Asn Arg Trp Ile

390 395 400

tga attactgcag gaacttctgg aggaaagcac tcattgatct ttcatcccta 1489

agatagtttg agagagctca cactggatat ataagttatt tgttgcagca taacaaatga 1549

tccccgcaaa ttttgtggct tcaaacacga aatgtttatt ctctaacaat ttctacagat 1609

caggaattca agaacagctt atctctgtag ttacactgca ggatctctca tgcctttact 1669

tacaatcaag atgtcagcca aagctatagt catctaacat ctttactgat gaacagtcca 1729

cttccaagat gacttattca catgcctgga aagttgatgt tggttgttgt caggggacct 1789

tcagtcatta ccatgtaggc ctctttacaa ggcccagctc cttgacaatt tggcaataag 1849

ttctcgccaa ggttagtgat ccaagagagg accaatacag aggccaaaat ggcttttatg 1909

acctatcctc aggaggactg ctaagctttc acttatttcc tattgtgttg gtctcacaac 1969

acaccaatcc tgatacaatg tgagagactg cagaaggtat gaataccagg aaacagataa 2029

ctcagaagca tctgggaaat ttgccatgga attaatgaag aaaagccctc agcacatcat 2089

ccttctactc taatcaatat gaaatagcat tcagtaactc ctattaattc actctgaaga 2149

gaaacctttt gaggacaatc tgtatggtaa agctctcagc tcgaattctc accttcatgg 2209

gcccagaaga ttatgtactg agagaatcct gaagaatgga acagctgtag aaagccttca 2269

gtgctatcag cagggattca tgtgacagct cacactaagg gagaaaacct gtgaaggtct 2329

cagaaggctt cagtgacagt catcccttaa gacacactgg aaatcacaca atggaacaac 2389

actcagaaat gcggaatacc ctgcagcaaa agtgttcaca ttactgagca aactatagtg 2449

tggtattctg cagtgactat gggaaagcct tgaatgttct atcggttttt aagggacttg 2509

agaattaatt ctggagagaa tgccccattg aacatcatca atattggaga gctttctgtt 2569

tttctacatt tgttaggaaa cttgtgagca ttcacactac agagaaactt gaaatataaa 2629

gaagaagaga aagccttcag tgatgcctct gtgttaggga aaatatggaa cttctccctg 2689

gatgcaaaac ctatgagtat attaatattg gaaaattttt cagtgattct tctctttctt 2749

gtatatgaga gaacttatat ggagaaaccc ctaggaatgt aatcagtgtt aggatgcctc 2809

agcctgaact cttcactgag tggccacaat tttcactggg aacaaaaagt ataatcactg 2869

ttttgagtgt gggatatcct ttatcagtgt ctcatctgta gattggactg ctggctcatt 2929

aattttttta gtcttttttt cttttaatat aaacatttgt gtatagctgt tccctaaaat 2989

aaacattaac atatttcata atttt 3014

<210>12

<211>402

<212>PRT

<213>人

<400>12

Met Ala Ala Val Ile Leu Pro Ser Thr Ala Ala Pro Ser Ser Leu Phe

1 5 10 15

Pro Ala Ser Gln Gln Lys Gly His Thr Gln Gly Gly Glu Leu Val Asn

20 25 30

Glu Leu Leu Thr Ser Trp Leu Arg Gly Leu Val Thr Phe Glu Asp Val

35 40 45

Ala Val Glu Phe Thr Gln Glu Glu Trp Ala Leu Leu Asp Pro Ala Gln

50 55 60

Arg Thr Leu Tyr Arg Asp Val Met Leu Glu Asn Cys Arg Asn Leu Ala

65 70 75 80

Ser Leu Gly Cys Arg Val Asn Lys Pro Ser Leu Ile Ser Gln Leu Glu

85 90 95

Gln Asp Lys Lys Val Val Thr Glu Glu Arg Gly Ile Leu Pro Ser Thr

100 105 110

Cys Pro Asp Leu Glu Thr Leu Leu Lys Ala Lys Trp Leu Thr Pro Lys

115 120 125

Lys Asn Val Phe Arg Lys Glu Gln Ser Lys Gly Val Lys Thr Glu Arg

130 135 140

Ser His Arg Gly Val Lys Leu Asn Glu Cys Asn Gln Cys Phe Lys Val

145 150 155 160

Phe Ser Thr Lys Ser Asn Leu Thr Gln His Lys Arg Ile His Thr Gly

165 170 175

Glu Lys Pro Tyr Asp Cys Ser Gln Cys Gly Lys Ser Phe Ser Ser Arg

180 185 190

Ser Tyr Leu Thr Ile His Lys Arg Ile His Asn Gly Glu Lys Pro Tyr

195 200 205

Glu Cys Asn His Cys Gly Lys Ala Phe Ser Asp Pro Ser Ser Leu Arg

210 215 220

Leu His Leu Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Asn Gln

225 230 235 240

Cys Phe His Val Phe Arg Thr Ser Cys Asn Leu Lys Ser His Lys Arg

245 250 255

Ile His Thr Gly Glu Asn His His Glu Cys Asn Gln Cys Gly Lys Ala

260 265 270

Phe Ser Thr Arg Ser Ser Leu Thr Gly His Asn Ser Ile His Thr Gly

275 280 285

Glu Lys Pro Tyr Glu Cys His Asp Cys Gly Lys Thr Phe Arg Lys Ser

290 295 300

Ser Tyr Leu Thr Gln His Val Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr

305 310 315 320

Glu Cys Asn Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Ser Ser Phe Ser Leu Thr

325 330 335

Val His Lys Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Ser Asp

340 345 350

Cys Gly Lys Ala Phe Asn Asn Leu Ser Ala Val Lys Lys His Leu Arg

355 360 365

Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Asn His Cys Gly Lys Ser

370 375 380

Phe Thr Ser Asn Ser Tyr Leu Ser Val His Lys Arg Ile His Asn Arg

385 390 395 400

Trp Ile

Claims

1.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸含有编码具有促进人体转录因子NF-κB活化功能的多肽的核苷酸序列，该核苷酸序列选自：

(a)与编码含有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12的氨基酸序列的多肽的多核苷酸有至少70％相似性的多核苷酸；

(b)编码含有与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12的氨基酸序列有至少70％相似性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

(c)与(a)或(b)的多核苷酸互补的多核苷酸。

2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码的多肽具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：12。

3.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少85％相似性：

(a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11的编码区序列或全长序列；

(b)在遗传密码简并范围内相应于(a)中提到的序列的至少一个序列；

(c)与(a)或(b)中提到的序列互补的序列杂交的至少一个序列；

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11的编码区序列或全长序列。

5.权利要求1所述的多核苷酸编码的多肽，其特征在于，所述多肽包含选自下组中的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQID NO：12；或与以上任一氨基酸序列具有至少90％相似性的多肽；或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

6.权利要求5所述的多肽，其特征在于，所述多肽具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12。

7.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的多核苷酸。

8.一种遗传工程宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自：

(a)用权利要求7所述的载体转化或转导的宿主细胞；

(b)用权利要求1所述的多核苷酸转化或转导的宿主细胞。

9.一种抗体，其特征在于，所述抗体是能与权利要求5所述的多肽特异性结合的抗体。

10.一种核酸片段，其特征在于，所述核酸片段含有权利要求1所述的任一多核苷酸中8-100个连续的核苷酸。

11.一种分离的多核苷酸在促进NF-κB活化中的应用，其特征在于所述多核苷酸选自权利要求1所述的多核苷酸，该多核苷酸在宿主细胞中外源表达会促进NF-κB的活化。

12.权利要求1所述的多核苷酸或权利要求5所述的多肽在制备预防和/或治疗与人体细胞转录因子NF-κB有关的疾病的药物中的用途，或在制备调节细胞增殖、凋亡、存活、分化、癌变等的药物或试剂中的用途。

13.根据权利要求11所述的用途，其中所述疾病选自炎症和肿瘤。

14.含有权利要求5所述的多肽和药学上可接受的载体的药物组合物。

15.一种炎症性疾病或肿瘤的体外检测方法，其特征在于，利用权利要求9所述的抗体或权力要求10所述的核酸片段来检测宿主样品中的多肽的存在或水平。