CN101200720B - 线粒体膜电位下降相关的多核苷酸及其编码多肽和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了yi,gif类新的编码具有引起线粒体膜电位下降功能的人蛋白的多核苷酸，及其编码的多肽，多肽的抗体。本发明还公开了这类新的多核苷酸在宿主细胞中外源表达引起线粒体膜电位下降的应用。

Description

线粒体膜电位下降相关的多核苷酸及其编码多肽和用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及基因表达调控领域，具体地说，本发明涉及一类新的编码具有引起线粒体膜电位下降功能的人蛋白的多核苷酸，及其编码的多肽，多肽的抗体。本发明还涉及这类新的多核苷酸在宿主细胞中外源表达引起线粒体膜电位下降的应用。

背景技术

细胞凋亡属于细胞程序化死亡，是细胞内涉及到许多生化反应的复杂过程。凋亡过程中的多种关键事件与线粒体有关，包括caspase激活物的释放(如细胞色素C)、电子转移功能的丧失、线粒体跨膜电位的降低乃至消失及Bcl-2家族蛋白的参与。线粒体跨膜电位的下降是细胞凋亡级联反应过程中较早发生的事件。随着线粒体跨膜电位的下降，线粒体膜上的PT通道(Permeability transiton pore)开放。PT通道可以无选择性地允许≤1.5kD分子通过，造成线粒体基质内的高渗透压，使线粒体内外H⁺梯度消失，呼吸链脱偶联，能量产生中断；由于水和溶质的进入，基质肿胀并导致外膜破裂，释放出包括细胞色素C在内的各种活性蛋白。正因为线粒体在凋亡中的重要性，线粒体跨膜电位是常用的早期凋亡的检测指标之一。

JC-1是一种阳离子染料，在线粒体中表现出膜电位依赖性聚集，能灵敏地反映细胞线粒体跨膜电位改变情况。当线粒体跨膜电位未降低时，JC-1聚合而被检测到红色发射光；当线粒体跨膜电位下降时，JC-1以单体形式存在，被检测到绿色发射光。因此，JC-1作为一种线粒体探针，应用于凋亡早期线粒体跨膜电位下降的检测。基于JC-1染料对线粒体膜电位下降的诱导剂和阻滞剂进行筛选的模型早在数年前就已被提出，近年来也有不少研究者提出将JC-1与其它染料相结合进行筛选的方法，但尚未有真正应用JC-1进行大规模筛选的报道。

发明内容

人基因组学研究目前是国际上的热点，除大规模测序的方法外，还缺少从功能研究开始的高通量筛选具有一定功能的基因的方法。针对这种现状及现有药物或试剂的不足，本发明的目的是提供一类新的编码具有引起线粒体膜电位下降的人蛋白的多核苷酸MMPRG1、2、3、4。

本发明的另一目的是提供这类多核苷酸所编码的多肽。

本发明的另一目的是提供含有这类多核苷酸的载体，和这类多核苷酸及其载体转化或转导的宿主细胞。

本发明的另一目的是提供这类多核苷酸所编码的多肽的抗体和用于检测的核酸分子。

本发明的另一目的是提供这类新的多核苷酸在宿主细胞中外源表达引起线粒体膜电位下降的应用。

本发明的另一目的是提供生产这些多核苷酸和其编码的多肽的方法以及该多核苷酸及其编码的多肽的用途。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

在本发明的第一方面，提供新颖的分离的多核苷酸，它包含编码具有引起线粒体膜电位下降功能的蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列选自：(a)与编码含有SEQID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8的氨基酸序列的多肽的多核苷酸有至少70％相似性的多核苷酸；(b)编码含有与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8的氨基酸序列有至少70％相似性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(c)与(a)或(b)的多核苷酸互补的多核苷酸。

较佳地，该多核苷酸编码的多肽具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8。

较佳地，该多核苷酸的序列与选自下组的核苷酸序列有至少85％相似性：(a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7的编码区序列或全长序列；(b)在遗传密码简并范围内相应于(a)中提到的序列的至少一个序列；(c)与(a)或(b)中提到的序列互补的序列杂交的至少一个序列。

更佳地，该多核苷酸的序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7的编码区序列或全长序列。

在本发明的第二方面，提供了上述核苷酸所编码的多肽，它包含具有选自下组中的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8；或与以上任一氨基酸序列具有至少90％以上相似性的多肽，或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

较佳地，该多肽是具有选自下组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞，还提供了被上述多核苷酸转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了与上述多肽特异性结合的抗体，还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述任一多核苷酸中8-100个连续的核苷酸。

在本发明的第五方面，提供了上述多核苷酸在宿主细胞中外源表达引起线粒体膜电位下降的应用。

在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明中的具有引起线粒体膜电位下降功能的多肽及药学上可接受的载体。

本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域技术人员而言是显而易见的。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如果从天然状态中与共同存在的其他物质分开，则为分离纯化的。这样的多核苷酸可能是某一载体的一部分，也可能这样的多核苷酸或多肽是某一组合物的一部分，既然载体或组合物不是它们的天然环境的成分，这些多核苷酸或多肽仍然是分离的。

如本文所用，“相似性”是指核苷酸或多肽序列比对过程中用来描述检测序列和目标序列之间相同DNA碱基或氨基酸残基顺序所占比例的高低，是一种直接的数量关系，通过部分相同或相似的百分比来度量核苷酸序列或者多肽序列之间相似的程度，此相似性百分比可以通过本领域已有的比对方法来计算，例子有两两序列间的比对方法FASTA程序(Pearson，W.R.and Lipman，D.J.1988.Improved tools for biological sequence comparison.Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448)，BLAST程序(Altschul，S.F.，et al.1990Basic local alignment search tool.J.Mol.Biol.215：403-410)等，或多序列比对方法CLUSTAL W(CORPET，F.1998Multiple sequencealignment with hierarchical clustering.Nucleic Acids Res.，16：10881-10890)等。同源序列是指从某一共同祖先经趋异进化而形成的不同序列，根据相似性百分比可以判断比对序列间的同源性。当基因或蛋白质间相似程度很高时，表示它们具有一段共同的进化历程，从而判断它们会具有相似的生物学功能。当具有至少50％的相似程度时，比较容易推测检测序列和日标序列可能是同源序列。较佳地，具有至少70％的相似程度；更佳地，具有至少85％的相似程度；最佳地，具有至少90％的相似程度。而当相似性程度低于20％时，就难以确定或者根本无法确定其是否具有同源性。

本发明的多核苷酸包括其互补链可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。如本文所用，“编码具有引起线粒体膜电位下降功能的多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码序列和/或非编码序列的多核苷酸。以MMPRG1所编码的多肽为例，编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是遗传密码简并的变异体。如本文所用，“遗传密码简并”是指一个氨基酸有几个密码子的现象。例如在本发明中MMPRG1所编码的多肽的遗传密码简并的变异体指编码具有SEQ ID NO：2的多肽的核苷酸，且此核苷酸与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别。对于其他具有引起线粒体膜电位下降功能的多肽，可依此类推。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，它编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。该多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与本发明所述多核苷酸序列的互补序列杂交且两个序列间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与此多核苷酸序列的互补序列可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，更好的是在97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与本发明所述的多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明的多核苷酸序列能用本领域已有的方法获得。这些技术包括但不局限于：(1)通过杂交技术分离DNA序列；(2)人工化学合成DNA序列；(3)通过构建cDNA文库大规模获得所需的多核苷酸；(4)PCR扩增技术。

第一种方法是先构建基因组文库或者cDNA文库，然后通过分子杂交等技术从基因组文库或cDNA文库中筛选出目的基因或序列。当生物基因组比较小时，此方法较易成功；当生物基因组很大时，构建其完整的基因组文库较困难，再从庞大的文库中去克隆目的基因的工程量也很大。

第二种方法是按设计好的序列一次合成100-200bp长的DNA片段，再用这些合成的片段组合连接成完整的基因。这种合成长的基因序列的方法的价格十分昂贵。此方法主要用于合成作为引物、接头等的核酸片段。

第三种方法是用本领域通常的方法构建cDNA文库，多次测序后，结合生物信息学分析技术(Ota et al.Nat Genet.2004Jan；36(1)：40-5)，大规模获得目的cDNA克隆。生物信息学分析技术包括但不限于用BLAST或BLAT与已有的公共数据库比对，如refseq数据库等；用Phred算法评估测序质量；用计算转录起始密码子ATG的出现概率的ATGpr算法筛选全长cDNA序列等。

第四种方法用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science1985；230：1350-1354)。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。本发明优选应用的方法是两步法通量化RT-PCR技术在混合cDNA文库中扩增得到大量的cDNA克隆。混合cDNA文库包括现有的cDNA文库和肿瘤文库。

本发明的基因，或者各种DNA片段等核苷酸序列的测定可用常规方法，如双脱氧链终止法(Sanger et al.PNAS，1977，74：5463-5467)；也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列，测序需要反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接成全长的cDNA序列。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本发明的多肽可以是糖基化的，也可以是非糖基化的。本发明的多肽可以包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括具有引起线粒体膜电位下降功能的多核苷酸编码的人蛋白多肽的片段、衍生物和类似物。术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持与本发明的天然具有引起线粒体膜电位下降功能的人蛋白多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物和类似物可以是：(a)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优先保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(b)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(c)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物)融合所形成的多肽，或(d)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。

本发明的多肽可以通过常规的重组DNA技术，利用本发明的多核苷酸序列来表达或生产重组的具有引起线粒体膜电位下降功能的蛋白多肽(Science，1984；224：1431)。包括以下步骤：

(1)用本发明的多核苷酸(或其变异体)，或用含有此多核苷酸的表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养步骤(1)得到的宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化所需的蛋白多肽。

本发明中的多核苷酸和多肽优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明也涉及包含本发明所述多核苷酸的载体。本发明中，编码具有引起线粒体膜电位下降功能的人蛋白多肽的多核苷酸序列可以插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒，如腺病毒、逆转录病毒，或者其他载体。在本发明中适用的载体可以是原核表达载体，也可以是真核表达载体，如在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)，在哺乳动物细胞中高表达的真核表达载体pcDNA^TM3.1/myc-hisB(-)(Invitrogen)，pcDNA3.1/V5-His-TOPO(Invitrogen，以下缩写为pcDT)。本发明优选pcDT，它可以直接与PCR产物连接来构建真核表达载体，大大提高了规模化生产的效率。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以应用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。用本领域的技术人员熟知的方法来构建含有本发明所述多核苷酸序列和转录/翻译控制信号的表达载体即可。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组DNA技术等(Sambrook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。

本发明的多核苷酸序列可有效地连接到表达载体中的适当的启动子上来指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的P_L启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体优选的包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性、或真核细胞培养用的绿色荧光蛋白(GFP)、新霉素抗性及二氢叶酸还原酶。

本发明还涉及用上述载体或者本发明的多核苷酸经基因工程产生的宿主细胞。本发明的载体和多核苷酸可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达具有引起线粒体膜电位下降功能的蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞；293T、Hela细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常有10-300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。例子有：在复制起始点下游的100-270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点下游的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域的普通技术人员都知道如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主细胞为原核细胞如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收集，用CaCl₂法处理，所用步骤是本领域众所周知的。可供选择的是MgCl₂处理，也可用电穿孔的方法处理。当宿主是真核细胞时，可选择以下转染方法：磷酸钙共沉淀法、常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，来表达本发明的多核苷酸所编码的多肽。根据所选的宿主细胞选择合适的常规培养基，在适于宿主细胞生长的条件下培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用适当的方法如温度转化或化学诱导，来诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

上述方法中的重组多肽可包被于细胞内、细胞外或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其他特性通过各种分离方法分离和纯化重组多肽。这些方法是本领域技术人员所熟知的，如常规的复性处理，用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析和其它各种液相层析技术或这些方法的结合。

本发明还涉及与本发明多核苷酸的任何一部分同源的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含有15个核苷酸，较好的是至少30个核苷酸，更好的是至少50个核苷酸，最好的是至少100个核苷酸。此核酸片段通常是在本发明的核苷酸序列信息的基础上化学合成的DNA序列。上述核酸片段可以用于PCR扩增技术(如作为引物)以确定和/或分离编码具有引起线粒体膜电位下降功能的多核苷酸；也可以作为杂交所用的探针。也可以用于RNA干扰技术。本发明的多核苷酸的一部分或全部也可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片上，用于分析组织中基因的差异表达和基因诊断。探针的标记可用放射性同位素，荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。

本发明的多肽可以直接作为药物治疗疾病；还可用于筛选促进或对抗具有引起线粒体膜电位下降的功能的蛋白的抗体、多肽或其它配体，例如，筛选可用于促进或抑制本发明的蛋白的功能的抗体。用表达的重组的本发明的蛋白来筛选多肽库，用于寻找有治疗价值的能够促进或抑制本发明的蛋白的功能的多肽分子。

本发明的多肽可以单独使用或者与合适的药物载体组合后使用。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂及不影响药物效果的载体和赋型剂。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油及它们的组合。药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。给药于患者的用量取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。

本发明的多肽也可以通过在活体表达这些多肽来使用。例如患者的细胞可以通过在体外用编码本发明多肽的基因进行基因工程操作，然后将工程细胞提供给患者，使工程细胞在体内高表达这种多肽，从而达到治疗的目的。

具有引起线粒体膜电位下降功能的人蛋白的多核苷酸也可用于多种治疗目的。可用在基因治疗技术中来治疗由于具有引起线粒体膜电位下降的功能的人蛋白表达异常或活性异常导致的疾病。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的具有引起线粒体膜电位下降功能的人蛋白，来抑制内源性的具有引起线粒体膜电位下降功能的人蛋白的活性。重组的具有引起线粒体膜电位下降功能的人蛋白基因也可包装到脂质体中转移至细胞内。

抑制本发明多肽mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酸也在本发明的范围之内。反义RNA和DNA以及核酸可用本领域已有的方法合成。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷间的连接用磷酸硫酯键或肽键。

本发明的多肽及其片段、衍生物、类似物或表达它们的细胞可以作为抗原来生产抗体。这些抗体包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的抗体。本发明的多肽的抗体可用本领域公知的抗体制备方法来生产。例子有：单克隆抗体可用杂交瘤技术生产(Kohler and Milstein.Nature，1975，256：495-497)。多克隆抗体的生产可用本发明的多肽免疫动物，如家兔、小鼠、大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术产生(Morrison etal.PNAS，1985，81：6851)。单链抗体也可用已有的技术生产(U.S.Pat No.4946778)。

本发明的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活体标本中的具有引起线粒体膜电位下降功能的蛋白。还可以在临床上用于与具有引起线粒体膜电位下降功能的人蛋白相关的疾病的临床诊断、治疗、疗效评价等。例如用放射性同位素标记与本发明的多肽结合的单克隆抗体，然后注入体内跟踪其位置和分布，可以作为一种非创伤性诊断方法来定位肿瘤细胞，或判断肿瘤细胞是否转移。本发明中的抗体还可以用于治疗或预防与具有引起线粒体膜电位下降功能的人蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断具有引起线粒体膜电位下降功能的人蛋白的产生或活性。

本发明还涉及定量和定位检测具有引起线粒体膜电位下降功能的蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。实验中检测的具有引起线粒体膜电位下降功能的蛋白水平，可以用作解释具有引起线粒体膜电位下降功能的蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断具有引起线粒体膜电位下降功能的蛋白起作用的疾病。

具有引起线粒体膜电位下降功能的蛋白的多核苷酸可用于具有引起线粒体膜电位下降功能的蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，具有引起线粒体膜电位下降功能的蛋白的多核苷酸可用于检测具有引起线粒体膜电位下降功能的蛋白的表达与否，或在疾病状态下具有引起线粒体膜电位下降功能的蛋白的异常表达。如具有引起线粒体膜电位下降功能的蛋白的DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断具有引起线粒体膜电位下降功能的蛋白的表达异常。杂交技术是本领域已公开的成熟技术，包括Southern印迹法、Northern印迹法、原位杂交等，相关的试剂盒可以从商业途径获得。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片上，用于分析组织中基因的差异表达和基因诊断。用具有引起线粒体膜电位下降功能的蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链式反应(RT-PCR)体外扩增也可以检测具有引起线粒体膜电位下降功能的蛋白的转录产物。

检测具有引起线粒体膜电位下降功能的蛋白基因的突变也可用于诊断具有引起线粒体膜电位下降功能的蛋白相关的疾病。具有引起线粒体膜电位下降功能的蛋白基因的突变形式包括与正常野生型的具有引起线粒体膜电位下降功能的蛋白的DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用本领域已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Westen印迹法可间接判断基因有无突变。

基因MMPRG1、2、3、4在实验中所有用到的正常组织、胎儿组织、肿瘤组织中都有表达，说明其为人体自身重要的线粒体膜电位相关调节基因；在不同的组织中表达量高低有差别，说明其在不同的组织中发挥功能的程度不同。

以下对本发明的实施方案进一步详细说明。

本发明通过对NCBI的refseq数据库进行人功能未知预测基因检索，获得人未知功能基因序列，进一步利用Human_est数据库通过BLASTn方法进行序列校正，根据校正后得到的序列设计基因特异引物，从混合人组织cDNA文库中通过两步法通量化RT-PCR技术扩增得到目的基因的编码区cDNA片段。此编码区cDNA片段与pcDT重组构建真核表达载体。利用JC-1染料检测本发明中的基因引起线粒体膜电位下降的功能。JC-1是一种阳离子染料，在线粒体中表现出膜电位依赖性聚集，能灵敏地反映细胞线粒体跨膜电位改变情况。当线粒体跨膜电位未降低时，JC-1聚合而被检测到红色发射光；当线粒体跨膜电位下降时，JC-1以单体形式存在，被检测到绿色发射光。因此，JC-1作为一种线粒体探针，应用于凋亡早期线粒体跨膜电位下降的检测。通过荧光显微镜观察红绿荧光的比例即可反映出细胞线粒体跨膜电位的下降情况。进而通过流式细胞实验检测所选基因对细胞的影响，其中MMPRG1和MMPRG2获得阳性结果，对所转染细胞有诱导凋亡的效果。实验表明本发明的多肽具有显著、稳定的引起线粒体膜电位下降作用。

由于采用了以上技术方案，本发明具有如下优点：

1、提供了规模化克隆和筛选新基因的技术平台。

2、提供了人类新功能基因MMPRG1、2、3、4的cDNA序列及其编码多肽；

3、首次发现人类新功能基因MMPRG1、2、3、4具有引起线粒体膜电位下降的作用；

4、MMPRG1、2、3、4在机体多数正常细胞表达，说明其为自身重要的线粒体膜电位相关调控分子。

5、基于上述的4个优点，本发明为进一步研究凋亡机制，以及开发治疗如艾滋病、神经系统的退行性病变等自身免疫疾病和肿瘤等的新药物，为开创新的临床诊断、疗效评价及预后指标奠定必要的基础。

附图说明

图1、真核表达载体pcDT-MMPRGx的构建示意图(MMPRGx选自MMPRG1、2、3、4)

图2、MMPRG2、4外源表达对细胞存活的影响(JC-1染色)

图3、MMPRG1、2、3、4外源表达对线粒体跨膜电位影响的荧光检测结果

图4、MMPRG2、4外源表达对细胞存活的影响(流式细胞计数实验)

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南》(2002年第三版[美]萨姆布鲁克等箸，科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、两步法通量化RT-PCR技术扩增目的基因

(1)对NCBI的refseq数据库进行人功能未知预测基因检索，获得人未知功能基因序列，并利用Human_est数据库通过BLASTn方法进行序列校正，最终得到的序列设定为下组序列：SEQID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7。根据此类序列设计基因MMPRG1、2、3、4、的特异引物：

(2)用上述引物，按目的基因的表达谱在现有的cDNA文库和肿瘤文库中选择模板，进行初扩。现有的文库包括12种人体正常组织(心、胰、睾丸、卵巢、前列腺、结肠、小肠、骨骼肌、胸腺、淋巴结、扁桃体、白细胞)；6种人肿瘤组织(肺癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌)；和8种胎儿组织(胎肺、胎心、胎肝、胎脾、胎肾、胎脑、胎骨骼肌、胎胸腺)的cDNA文库(Clonetch，K1420-1，1241-1)。初扩反应条件如下：

50μl PCR反应：

PCR延伸时间根据所扩目的基因的最长片段，按50sec/Kb的原则进行扩增：

初扩产物纯化到30μl，以去除PCR反应体系中大量的引物及dNTPs等，并浓缩整个体系，得到对应目的基因序列的二级扩增库，作为二扩(大扩)的模板。

(3)将(2)中的纯化产物作为模板，分别对每个目的基因进行二扩，反应条件如下：

50μl PCR(每个基因)反应：

PCR延伸时间根据所扩目的基因的最长片段，按50sec/Kb的原则进行扩增：

得到的PCR产物取10μl上样电泳，挑选有扩增条带的PCR产物，进行等体积纯化(40μl)。通过两步PCR反应扩增出非单一条带的基因用Qiagen胶回收试剂盒切胶回收目的片段。扩增的结果表明，这些组织的细胞中都存在基因MMPRG1、2、3、4的cDNA，说明MMPRG1、2、3、4在这些组织的细胞中都产生了基因MMPRG1、2、3、4的转录产物，有较广的表达图谱。

实施例2、目的基因真核表达载体的构建

将二扩纯化产物和真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO(Invitrogen，缩写为pcDT)，按照试剂盒制造厂商建议的条件进行连接反应。连接产物电击法转化大肠杆菌DH5α，转化物在含氨苄青霉素的固体LB平板培养基上生长，挑选生长的单一克隆菌落，提取质粒，用EcoRI酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定，挑选有插入片段的阳性克隆，通过测序(ABI PRISM 3700 DNA分析仪)选出正确的正向插入克隆，各自命名为MMPRG1、2、3、4。

同时收集培养液，用SDS-PAGE分析沉淀蛋白，获得MMPRG1、2、3、4多肽。

MMPRG1、2、3、4蛋白分析结果显示：MMPRG1、2、3、4蛋白序列如下组序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8所示。

实施例3、利用JC-1染料测定目的基因引起线粒体膜电位下降的作用

用目的基因转染Hela细胞后，利用JC-1染料对细胞进行染色，按产品说明书所述进行操作，于荧光显微镜下观察细胞形态的变化。具体操作步骤如下：

本实验用96孔细胞培养板操作，每个待检基因设置3个平行重复孔，分别以pcDT空质粒和Bax质粒做为空载体和阳性对照。下述步骤中的用量均为单孔用量。

(1)细胞培养：将1.2×10⁴个Hela细胞(ATCC Number：CRL-11268)用含10％胎牛血清的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)培养基(Hyclone，SH0022.02)铺在96孔细胞培养板(Costar，3599)上(100μl培养液/孔)，置37℃，5％CO₂的细胞培养箱(SANYO，MCO-15AC)中培养，取处于对数生长期的细胞进行所有实验。

(2)制备转染工作液：用2.5μl生理盐水稀释160ng待检基因，轻轻混匀，室温放置；同样用2.5μl生理盐水稀释0.04μl VigoFect转染试剂(威格拉斯生物技术(北京)有限公司)，轻轻混匀，室温放置5分钟；将稀释的VigoFect转染试剂逐滴加入至稀释的待检基因溶液中，轻轻混匀，是为转染工作液，室温放置15分钟。

(3)转染：将转染工作液轻轻混匀，逐滴加入至(1)中铺好细胞的96孔细胞培养板中，轻轻混匀，置37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24-28小时。

(4)镜检：将细胞置于荧光显微镜(Olympus IX70)下观察表型改变。结果如图2所示：转染了编码MMPRG1和MMPRG2表达载体的细胞形态发生了明显的改变。与阳性对照BAX组相似，镜下见典型的凋亡改变，如核皱缩、凋亡小体形成、贴壁细胞脱离培养瓶壁等，而转染了空载体的阴性对照没有发生这些改变。表明这2个新基因与细胞凋亡相关。

(5)染色：用无血清培养基稀释的JC-1染料(终浓度为10μg/ml，公司，批号)对细胞进行染色，37℃孵育30分钟后吸弃染料，PBS洗涤两遍。

(6)检测：将96孔板的细胞以800转/分钟(Eppendorf Centrifuge，5810R)离心5分钟，弃上清。每孔加入40μl细胞裂解液，混匀后将96孔板置于-80℃冰箱1小时以上。将96孔板从-80℃解冻后恢复至室温，每孔吸取10μl细胞裂解液移至白色酶标板，用微孔板酶标仪(GeniosPro，Tecan)检测。红色荧光强度值(RED)在590nm处检测，激发波长535nm。绿色荧光强度值(GREEN)在535nm处检测，激发波长484nm。以RED/GREEN表示细胞线粒体跨膜电位下降情况。阳性对照为编码BAX的表达载体。BAX是Bcl-2家族成员，当细胞受到凋亡因子的诱导时，BAX可以转位于线粒体并通过寡聚化形成跨膜通道，导致线粒体膜电位下降，细胞色素C释放，启动细胞凋亡途径。阴性对照为pcDT空载体。阳性基因的标准为：待筛基因RED/GREEN值低于阴性对照RED/GREEN值25％以上。结果如图2所示，MMPRG1、2、3、4在HeLa细胞中过表达能引起线粒体跨膜电位降低。

实施例4、流式细胞实验

用目的基因单独转染Hela细胞后，利用流式细胞仪检测待检质粒的诱导细胞凋亡的功能。具体操作步骤如下：

(1)细胞培养：将Hela细胞(1×10⁵)用含10％胎牛血清的DMEM培养基铺在24孔细胞培养板(Costar，3599)上，置37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养16小时。

(2)制备转染工作液：用8μl生理盐水稀释500ng待检质粒，轻轻混匀，室温放置；同样用8μl生理盐水稀释0.16μl VigoFect转染试剂，轻轻混匀，室温放置5分钟；将稀释的VigoFect转染试剂逐滴加入至稀释的待检质粒溶液中，轻轻混匀，室温放置15分钟。

(3)转染：将转染工作液轻轻混匀，逐滴加入至细胞培养板(500μl培养液/孔)中，轻轻混匀，置37℃，5％CO₂培养箱中培养24-48小时。

(4)制备单细胞悬液，流式细胞仪检测

转染后24小时收获细胞。吸出培养基，加入100μl胰酶(Hyclone，SH30042.01)，37℃消化3分钟，再加入200μl含10％胎牛血清的DMEM培养基中和胰酶，吹吸数次使形成单细胞，移入流式管(FALCON，352052)，1500转每分钟(Eppendorf Centrifuge，5810R)室温离心5分钟，弃去上清。加入3ml PBS重悬细胞，1500转每分钟室温离心5分钟，弃去上清。重复上述洗细胞一次，并重悬于200μl Binding buffer(10mM Hepes，140mM NaCl，1mM MgCl₂，5mM KCl，2.5mM CaCl2)，加入终浓度为1μg/ml FITC-Annexin-V(北京宝赛生物技术有限公司，CX1001-2)，室温避光反应30分钟，再加入终浓度为1μg/ml PI(北京宝赛生物技术有限公司，CX1001-2)。检测使用流式细胞仪(FACSCalibur，BD，USA)。FITC标记的Annexin-V发绿色荧光，可以特异性结合于凋亡细胞特有的外翻于细胞膜外的磷脂酰丝氨酸，PI可以穿透死亡细胞的细胞膜，进而将细胞核染成红色。Annexin-V与PI双阴性的细胞即为活细胞，其余为死亡细胞。

结果如图4所示，MMPRG1、2与空载体比较均有阳性结果，与阳性对照Bax作用相似，只是两个基因作用程度不一，说明MMPRG1、2可以不同程度上诱导细胞凋亡。

实施例5、抗体制备

抗原选用原核细胞或真核细胞表达的MMPRG1、2、3、4蛋白全长或部分肽段，也可以合成多肽作为抗原。

多克隆抗体的制备：免疫动物选用成年雄性新西兰兔或BALb/c小鼠，初次免疫用200ug(新西兰兔)或20ug(BALb/c小鼠)抗原与等体积弗氏完全佐剂(FCA)充分乳化后，于背部皮下多点注射。初次免疫后21、42、63天，用弗氏不完全佐剂(FIA)完全乳化的抗原蛋白，各加强免疫1次，用量同前。每次免疫后7~10天，ELISA方法检测血清效价，达到1×10^-4时，放血分离血清.Western blot鉴定抗体特异性。

单克隆抗体制备：免疫BALb/c小鼠同前，取脾脏制成B细胞悬液，与对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0融合，通过HAT(H：次黄嘌呤；A：氨基喋呤；T：胸腺嘧啶核苷)选择性培养，获得杂交细胞系，再通过ELISA方法检测抗体效价，筛选出特定的杂交瘤细胞系，并得到单克隆抗体。

序列表

<110>北京诺赛基因组研究中心有限公司

<120>线粒体膜电位下降相关的多核苷酸及其编码多肽和用途

<130>

<160>8

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>2666

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(245)..(1093)

<400>1

<210>2

<211>282

<212>PRT

<213>人

<400>2

<210>3

<211>1414

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(105)..(1004)

<400>3

<210>4

<211>299

<212>PRT

<213>人

<400>4

<210>5

<211>3452

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(95)..(1624)

<400>5

<210>6

<211>509

<212>PRT

<213>人

<400>6

<210>7

<211>1656

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(34)..(639)

<400>7

<210>8

<211>201

<212>PRT

<213>人

<400>8

Claims (5)

1.一种分离的多核苷酸或其编码的多肽在引起线粒体膜电位下降中的应用，其中所述多核苷酸在宿主细胞中外源表达会引起线粒体膜电位下降；所述多核苷酸选自：

a)编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

b)与a)的多核苷酸互补的多核苷酸。

2.如权利要求1所述的应用，其中，所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的应用，其中，所述的多核苷酸序列选自SEQ ID NO：1的编码区序列或全长序列。

4.如权利要求1所述的应用，其中，所述的应用是利用所述的多核苷酸来表达或生产重组的具有引起线粒体膜电位下降功能的多肽。

5.如权利要求1所述的应用，其中，所述宿主细胞选自：

a)用含有权利要求1中所述多核苷酸的载体转化或转导的宿主细胞；

b)用权利要求1中所述多核苷酸转化或转导的宿主细胞。

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