JP5650038B2 - インテグリンヘテロ二量体およびそのサブユニット - Google Patents
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Description
a)インテグリンサブユニットα10をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、または類似の生物学的活性を示すその相同体もしはフラグメントを単離し;
b)単離したポリヌクレオチドを含む発現ベクターを構築し;
c)上記発現ベクターを用いて宿主細胞をトランスフオームし;
d)トランスフオームされた宿主細胞を、インテグリンサブユニットα10 の発現に適する条件下の培地中で、または類似の生物学的活性をトランフオームされた宿主細胞中で示すそれらの相同体もしくはフラグメントの発現に適する条件下の培地中で培養し;かつ任意に、
e)インテグリンサブユニットα10、または類似の生物学的活性を示すその相同体もしくはフラグメントを上記トランスフオームされ宿主主細胞または上記培地から単離する工程;
を包含する。
このインテグリンα10、または類似活性を示すそれらの相同体もしくはフラグメントも、それらが天然に存在する細胞からの単離により提供され得る。
a)インテグリンヘテロ二量体のサブユニットα10をコードするヌクレオチド配列を含む一つのポリヌクレオチド、および任意に、インテグリンヘテロ二量体のサブユニットβまたは類似の生物学的活性を示すその相同体またはフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む他のポリヌクレオチドを単離し;
b)上記サブユニットβをコードする上記単離ヌクレオチドを含む発現ベクターとの組み合わせで、上記サブユニットα10をコードする上記単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを構築し;
c)上記発現ベクターを用いて宿主細胞をトランスフオームし;
d)トランスフオームされた上記宿主細胞を、サブユニットα10およびβを含むインテグリンヘテロ二量体の発現に適する条件下の培地中で、または類似の生物学的活性を上記トランスフオームされた宿主細胞中で示すその相同体またはフラグメントの発現に適する条件下の培地中で培養し;かつ任意に、
e)サブユニットα10 おょびβを含むインテグリンヘテロ二量体、または同じ生物学的活性を示すその相同体またはフラグメントを上記トランスフオームされた宿主細胞または上記培地から単離する工程;
を包含する。
本発明において、以下のような発明が関連する。
(1) 配列番号1もしくは配列番号2で示されるアミノ酸配列の断片であってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片を含んでなる組換え型または単離型のII型コラーゲン結合インテグリンサブユニットα10。
(2) 配列番号1もしくは配列番号2で示されるアミノ酸配列の断片であってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片を含んでなる組換えインテグリンサブユニットα10の製造方法であって、
a)インテグリンサブユニットα10の上記断片をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドを単離し、
b)単離されたポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターを構築し、
c)宿主細胞をその発現ベクターで形質転換し、
d)形質転換宿主細胞においてインテグリンサブユニットα10の上記断片を発現するに好適な条件下の培地で形質転換宿主細胞を培養し、さらに所望により、
e)形質転換宿主細胞または培養培地からインテグリンサブユニットα10の上記断片を単離する工程を含んでなる方法。
(3) インテグリンサブユニットα10の断片であってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片を製造し、それによりサブユニットがそれが天然に存在する細胞から単離される方法。
(4) インテグリンサブユニットα10の断片であってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、ポリヌクレオチドが配列番号1もしくは配列番号2で示されるヌクレオチド配列の一部を含んでなる、単離ポリヌクレオチド。
(5) インテグリンサブユニットα10の断片であってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片をコードするDNAまたはRNAとハイブリダイズするが、インテグリンサブユニットα1をコードするDNAまたはRNAとはハイブリダイズできない、単離ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
(6) インテグリンサブユニットα10の断片であってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片をコードし、配列番号1もしくは配列番号2で示されるヌクレオチド配列の一部を含むポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含んでなるベクター。
(7) インテグリンサブユニットα10の断片であってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片をコードするDNAまたはRNAとハイブリダイズするが、インテグリンサブユニットα1をコードするDNAまたはRNAとはハイブリダイズできない、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含んでなるベクター。
(8) 上記6および7のいずれか1項で定義されたベクターを含む細胞。
(9) インテグリンサブユニットα10の断片であってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片をコードし、配列番号1もしくは配列番号2で示されるヌクレオチド配列の一部を含んでなるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが細胞ゲノムに安定的に組み込まれている、上記2で定義された方法の工程a)〜d)により作出される細胞。
(10) 配列番号1もしくは配列番号2のアミノ酸配列を含んでなるインテグリンサブユニットα10の断片であってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片に特異的に結合する能力を有する抗体である結合物。
(12) ポリクローナルまたはモノクローナル抗体またはその断片である、上記10記載の結合物。
(13) サブユニットα10およびサブユニットβを含んでなり、サブユニットα10が配列番号1または配列番号2で示されるアミノ酸配列の断片であってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片を含んでなる、組換え型または単離型インテグリンヘテロ二量体。
(14) サブユニットβがβ1である、上記13記載の組換え型または単離型インテグリンヘテロ二量体。
(15) サブユニットα10およびサブユニットβを含んでなり、サブユニットα10が配列番号1または配列番号2で示されるアミノ酸配列の断片であってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片を含んでなる組換えインテグリンヘテロ二量体の製造方法であって、
a)インテグリンヘテロ二量体のサブユニットα10の断片をコードするヌクレオチド配列を含む一つのポリヌクレオチドと、所望によりインテグリンヘテロ二量体のサブユニットβをコードするヌクレオチド配列を含むもう1つのポリヌクレオチドを単離し、
b)サブユニットα10をコードする単離ポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターを、所望によりサブユニットβをコードする単離ヌクレオチドを含んでなる発現ベクターと組み合わせて構築し、
c)宿主細胞を発現ベクターで形質転換し、
d)形質転換宿主細胞においてサブユニットα10の断片およびサブユニットβを含んでなるインテグリンヘテロ二量体を発現させるのに好適な条件下の培地で形質転換宿主細胞を培養し、さらに所望により、
e)形質転換宿主細胞または培地から、サブユニットα10の断片およびサブユニットβを含んでなるインテグリンヘテロ二量体、あるいはそのα10サブユニットの断片を単離する工程を含んでなる方法。
(16) サブユニットα10およびサブユニットβを含むインテグリンヘテロ二量体であってサブユニットα10がアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片を含んでなるインテグリンヘテロ二量体を製造し、それによりインテグリンヘテロ二量体がそれが天然に存在する細胞から単離される方法。
(17) インテグリンヘテロ二量体のサブユニットα10の断片であってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片をコードし、配列番号1もしくは配列番号2で示されるヌクレオチド配列の一部を含むポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドを含んでなる第1のベクターと、インテグリンヘテロ二量体のサブユニットβ、またはその同等の生物学的活性を有する断片をコードするポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドを含む第2のベクターとを含む細胞。
(18) サブユニットα10およびサブユニットβを含むインテグリンヘテロ二量体であってサブユニットα10がアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される本質的に同等の生物学的活性を有する断片を含んでなるインテグリンヘテロ二量体と特異的に結合する能力を有する抗体である結合物。
(19) サブユニットβがβ1である、上記18記載の抗体である結合物。
(21) ポリクローナルまたはモノクローナル抗体である、上記18または19記載の結合物。
(22) 細胞質ドメイン、Iドメインおよびスプライシングドメインのペプチドであってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列からなる群から選択されるペプチドである、インテグリンサブユニットα10の断片。
(23) アミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQからなるペプチドである、上記22記載の断片。
(24) 配列番号1のアミノ酸952番付近からアミノ酸986番付近までのアミノ酸配列からなる、上記22記載の断片。
(25) 配列番号1のアミノ酸140番付近からアミノ酸337番付近までのアミノ酸配列からなるペプチドである、上記22記載の断片。
(26) 上記22〜25のいずれか1項で定義されたインテグリンサブユニットα10の断片の製造方法であって、保護基を含むアミノ酸の一連の付加を含んでなる方法。
(27) 上記22〜25のいずれか1項で定義されたインテグリンサブユニットα10の断片をコードするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
(28) 上記22〜25のいずれか1項で定義されたヒトインテグリンサブユニットα10の断片と特異的に結合する能力を有する抗体である結合物。
(30) ポリクローナルまたはモノクローナル抗体またはその断片である、上記28記載の結合物。
(31) 配列番号1もしくは配列番号2で示されるアミノ酸配列を含んでなるインテグリンサブユニットα10、またはサブユニットα10およびサブユニットβを含むインテグリンヘテロ二量体、またはそのインテグリンもしくはサブユニットの断片であってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片を、インテグリンサブユニットα10を発現する細胞または組織(この細胞またはヒトをはじめとする動物起源のものである)のマーカーもしくは標的分子としてin vitroにおいて使用する方法。
(32) 断片が細胞質ドメイン、Iドメインおよびスプライシングドメインのペプチドからなる群から選択されるペプチドである、上記31記載のin vitroにおける方法。
(33) 断片がアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQを含んでなるペプチドである、上記31記載のin vitroにおける方法。
(34) 断片が配列番号1のアミノ酸952番付近からアミノ酸986付近までのアミノ酸配列を含んでなる、上記31記載のin vitroにおける方法。
(35) 断片が配列番号1のアミノ酸140番付近からアミノ酸337付近までのアミノ酸配列を含んでなる、上記31記載のin vitroにおける方法。
(36) サブユニットβがβ1である、上記31記載のin vitroにおける方法。
(37) 細胞が軟骨細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、骨芽細胞および繊維芽細胞からなる群から選択される、上記31記載のin vitroにおける方法。
(38) サブユニットα10に関与する軟骨の損傷を含む病状の際に使用される、上記31〜37のいずれか1項に記載のin vitroにおける方法。
(39) 病状が外傷、慢性関節リウマチおよび変形性関節症を含む、上記38記載のin vitroにおける方法。
(40) 胚発達中の軟骨の形成を検出する方法である、上記31〜37のいずれか1項に記載のin vitroにおける方法。
(41) 軟骨の生理学上または治療上の修復を検出する方法である、上記31〜37のいずれか1項に記載のin vitroにおける方法。
(42) 軟骨細胞の選択および分析、または選別、単離もしくは精製する方法である、上記31〜37のいずれか1項に記載のin vitroにおける方法。
(43) 軟骨または軟骨細胞の移植の際の軟骨または軟骨細胞の再生を検出する方法である、上記31〜37のいずれか1項に記載のin vitroにおける方法。
(44) 軟骨細胞の分化のin vitro研究のための方法である、上記31〜37のいずれか1項に記載の方法。
(45) 配列番号1もしくは配列番号2で示されるアミノ酸配列を含んでなるインテグリンサブユニットα10、またはサブユニットα10およびサブユニットβを含んでなるインテグリンヘテロ二量体、またはその断片であってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片と特異的に結合する能力を有する抗体である結合物を、インテグリンサブユニットα10を発現する細胞または組織(この細胞またはヒトをはじめとする動物起源のものである)のマーカーもしくは標的として使用するin vitroにおける方法。
(46) 断片が細胞質ドメイン、Iドメインおよびスプライシングドメインのペプチドからなる群から選択されるペプチドである、上記45記載のin vitroにおける方法。
(47) 断片がアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQを含んでなるペプチドである、上記45記載のin vitroにおける方法。
(48) 断片が配列番号1のアミノ酸952番付近からアミノ酸986番付近までのアミノ酸配列を含んでなる、上記45記載のin vitroにおける方法。
(49) 断片が配列番号1のアミノ酸140番付近からアミノ酸337番付近までのアミノ酸配列を含んでなる、上記45記載のin vitroにおける方法。
(50) サブユニットβがβ1である、上記45記載のin vitroにおける方法。
(51) 配列番号1もしくは配列番号2で示されるアミノ酸配列を含んでなるインテグリンサブユニットα10、またはサブユニットα10およびサブユニットβを含んでなるインテグリンヘテロ二量体、もしくは本質的に同等の生物学的活性を有するその相同体もしくは断片の存在を検出する方法である、上記45〜50のいずれか1項に記載のin vitroにおける方法。
(52) 胚発達中の細胞の分化段階を決定する方法である、上記45〜50のいずれか1項に記載のin vitroにおける方法。
(53) インテグリンサブユニットα10、またはそのインテグリンサブユニットの断片であってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片の存在を細胞において検出するin vitroにおける方法であって、配列番号1で示されるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、これらがインテグリンサブユニットα1をコードするDNAもしくはRNAとはハイブリダイズできないハイブリダイゼーション条件下でマーカーとして使用される方法。
(54) 細胞が軟骨細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、骨芽細胞および繊維芽細胞からなる群から選択される、上記53記載のin vitroにおける方法。
(55) 断片が細胞質ドメイン、Iドメインおよびスプライシングドメインのペプチドからなる群から選択されるペプチドである、上記53記載のin vitroにおける方法。
(56) 断片がアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQを含んでなるペプチドである、上記53記載のin vitroにおける方法。
(57) 断片が配列番号1のアミノ酸952番付近からアミノ酸986番付近までのアミノ酸配列を含んでなる、上記53記載のin vitroにおける方法。
(58) 断片が配列番号1のアミノ酸140番付近からアミノ酸337番付近までのアミノ酸配列を含んでなる、上記53記載のin vitroにおける方法。
(59) 組織の再生または治療上の、また生理学上の軟骨の再生における病状において、発達中の細胞の分化段階を決定する方法である、上記53〜58のいずれか1項に記載のin vitroにおける方法。
(60) 病状がインテグリンサブユニットα10に関与する慢性関節リウマチ、変形性関節炎または癌のいずれかの病状である、上記59記載のin vitroにおける方法。
(61) 細胞が軟骨細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、骨芽細胞および繊維芽細胞からなる群から選択される、上記59記載のin vitroにおける方法。
(62) 組織の再生および治療上の、また生理学上の軟骨の再生における病状において、発達中の細胞の分化段階を決定するin vitroにおける方法であって、配列番号1で示されるヌクレオチド配列から選択されるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、インテグリンサブユニットα1をコードするDNAまたはRNAとはハイブリダイズできないハイブリダイゼーション条件下でマーカーとして使用される方法。
(63) ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、細胞質ドメイン、Iドメインおよびスプライシングドメインのペプチドからなる群から選択されるペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである、上記62記載のin vitroにおける方法。
(64) ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドがアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQを含んでなるペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである、上記63記載のin vitroにおける方法。
(65) ペプチドが配列番号1のアミノ酸952番付近からアミノ酸986番付近までのアミノ酸配列を含んでなる、上記63記載のin vitroにおける方法。
(66) ペプチドが配列番号1のアミノ酸140番付近からアミノ酸337番付近までのアミノ酸配列を含んでなる、上記63記載のin vitroにおける方法。
(67) 病状がインテグリンサブユニットα10に関与するいずれかの病状である、上記63記載のin vitroにおける方法。
(68) 病状が慢性関節リウマチ、変形性関節炎または癌である、上記67記載のin vitroにおける方法。
(69) 病状がアテローム性動脈硬化症または炎症である、上記67記載のin vitroにおける方法。
(70) 細胞が軟骨細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、骨芽細胞および繊維芽細胞からなる群から選択される、上記62〜69のいずれか1項に記載のin vitroにおける方法。
(71) サブユニットα10およびサブユニットβを含んでなるインテグリンヘテロ二量体、またはそのサブユニットα10、またはインテグリンまたはサブユニットα10の断片であってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片を標的分子として使用できる抗体を有効成分として含んでなる医薬組成物。
(72) 軟骨、骨および血管の形成を刺激、阻害またはブロックするのに用いられる、上記71記載の医薬組成物。
(73) サブユニットα10およびサブユニットβを含んでなるインテグリンヘテロ二量体、またはそのサブユニットα10、またはインテグリンもしくはサブユニットα10の相同体もしくは断片であってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片、またはインテグリンサブユニットα10をコードするDNAもしくはRNAを有効成分として含んでなるワクチン。
(74) 軟骨または軟骨細胞の移植におけるインテグリンサブユニットα10の、マーカーまたは標的としてのin vitroにおける使用。
(75) 軟骨細胞および/または骨芽細胞の、移植片の表面への接着を促進して骨の組み込みを刺激するために、配列番号1もしくは配列番号2で示されるアミノ酸配列を含んでなるインテグリンサブユニットα10、またはサブユニットα10およびサブユニットβを含んでなるインテグリンヘテロ二量体、またはその断片であってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片と特異的に結合する能力を有する抗体である結合物を使用するin vitroにおける方法。
(76) インテグリン結合物の存在をin vitroで検出する方法であって、サブユニットα10およびサブユニットβを含んでなるインテグリンヘテロ二量体、またはそのサブユニットα10、またはインテグリンもしくはサブユニットの断片であってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片とサンプルとを相互作用させ、それによりインテグリン、サブユニットα10またはその断片を活性化させて、サンプル中に存在するその天然のリガンドまたはその他のインテグリン結合タンパク質への結合を変調することを含んでなる方法。
(77) サブユニットα10およびサブユニットβを含んでなるヒトヘテロ二量体インテグリン、またはそのサブユニットα10、またはインテグリンもしくはサブユニットの断片であってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片とインテグリン結合物との相互作用の結果をin vitroで研究し、それにより細胞反応を誘導する方法。
(78) 相互作用の結果が細胞機能の変化として測定される、上記77記載の方法。
(79) インテグリンサブユニットα10またはその相同体もしくは断片をコードするDNAまたはRNAを標的分子として使用するin vitroにおける方法。
(80) ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、インテグリンサブユニットα10の断片であってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片をコードするDNAまたはRNAとハイブリダイズするが、インテグリンサブユニットα1をコードするDNAまたはRNAとはハイブリダイズできない、上記79記載のin vitroにおける方法。
(81) 配列番号1もしくは配列番号2で示されるアミノ酸配列を含んでなるコラーゲン結合インテグリンサブユニットα10、またはサブユニットα10およびサブユニットβを含むインテグリンヘテロ二量体、またはそのインテグリンもしくはサブユニットの断片であってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片を含む、インテグリンサブユニットα10を発現する細胞または組織(この細胞またはヒトをはじめとする動物起源のものである)のマーカーもしくは標的分子。
(82) 断片が細胞質ドメイン、Iドメインおよびスプライシングドメインのペプチドからなる群から選択されるペプチドである、上記81記載のマーカーもしくは標的分子。
(83) 断片がアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQを含んでなるペプチドである、上記81記載のマーカーもしくは標的分子。
(84) 断片が配列番号1のアミノ酸952番付近からアミノ酸986付近までのアミノ酸配列を含んでなる、上記81記載のマーカーもしくは標的分子。
(85) 断片が配列番号1のアミノ酸140番付近からアミノ酸337付近までのアミノ酸配列を含んでなる、上記81記載のマーカーもしくは標的分子。
(86) サブユニットβがβ1である、上記81記載のマーカーもしくは標的分子。
(87) 細胞が軟骨細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、骨芽細胞および繊維芽細胞からなる群から選択される、上記81記載のマーカーもしくは標的分子。
(88) マーカーもしくは標的が該サブユニットα10に関与する病状の際に使用される、上記81〜87のいずれか1項に記載のマーカーもしくは標的分子。
(89) 病状が軟骨の損傷を含む、上記88記載のマーカーもしくは標的分子。
(90) 病状が外傷、慢性関節リウマチおよび変形性関節症を含む、上記88記載のマーカーもしくは標的分子。
(91) 胚発達中の軟骨の形成を検出するものである、上記81〜87のいずれか1項に記載のマーカーもしくは標的分子。
(92) 軟骨の生理学上または治療上の修復を検出するものである、上記81〜87のいずれか1項に記載のマーカーもしくは標的分子。
(93) 軟骨または軟骨細胞の移植の際の軟骨または軟骨細胞の再生を検出するものである、上記81〜87のいずれか1項に記載のマーカーもしくは標的分子。
(94) 配列番号1もしくは配列番号2で示されるアミノ酸配列を含んでなるインテグリンサブユニットα10、またはサブユニットα10およびサブユニットβを含んでなるインテグリンヘテロ二量体、またはその断片であってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片と特異的に結合する能力を有する抗体である結合物を含む、インテグリンサブユニットα10を発現する細胞または組織(この細胞またはヒトをはじめとする動物起源のものである)のマーカーもしくは標的分子。
(95) 断片が細胞質ドメイン、Iドメインおよびスプライシングドメインのペプチドからなる群から選択されるペプチドである、上記94記載のマーカーもしくは標的分子。
(96) 断片がアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQを含んでなるペプチドである、上記94記載のマーカーもしくは標的分子。
(97) 断片が配列番号1のアミノ酸952番付近からアミノ酸986番付近までのアミノ酸配列を含んでなる、上記94記載のマーカーもしくは標的分子。
(98) 断片が配列番号1のアミノ酸140番付近からアミノ酸337付近までのアミノ酸配列を含んでなる、上記94記載のマーカーもしくは標的分子。
(99) サブユニットβがβ1である、上記94記載のマーカーもしくは標的分子。
(100) 配列番号1もしくは配列番号2で示されるアミノ酸配列を含んでなるインテグリンサブユニットα10、またはサブユニットα10およびサブユニットβを含むインテグリンヘテロ二量体であってサブユニットα10がアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片を含むものの存在を検出するものである、上記94〜99のいずれか1項に記載のマーカーもしくは標的分子。
(101) 胚発達中の細胞の分化段階を決定するものである、上記94〜99のいずれか1項に記載のマーカーもしくは標的分子。
(102) インテグリンサブユニットα10、またはそのインテグリンサブユニットの断片であってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片の存在を細胞において検出する方法であって、配列番号1で示されるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、これらがインテグリンサブユニットα1をコードするDNAもしくはRNAとはハイブリダイズできないハイブリダイゼーション条件下でマーカーとして使用される方法。
(103) 細胞が軟骨細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、骨芽細胞および繊維芽細胞からなる群から選択される、上記102記載の方法。
(104) 断片が細胞質ドメイン、Iドメインおよびスプライシングドメインのペプチドからなる群から選択されるペプチドである、上記102記載の方法。
(105) 断片がアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQを含んでなるペプチドである、上記102記載の方法。
(106) 断片が配列番号1のアミノ酸952番付近からアミノ酸986番付近までのアミノ酸配列を含んでなる、上記102記載の方法。
(107) 断片が配列番号1のアミノ酸140番付近からアミノ酸337番付近までのアミノ酸配列を含んでなる、上記102記載の方法。
(108) 組織の再生または治療上の、また生理学上の軟骨の再生における病状において、発達中の細胞の分化段階を決定する方法である、上記102〜107のいずれか1項に記載の方法。
(109) 病状が慢性関節リウマチ、変形性関節炎および癌である、上記108記載の方法。
(110) 細胞が軟骨細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、骨芽細胞および繊維芽細胞からなる群から選択される、上記108記載の方法。
(111) 組織の再生および治療上の、また生理学上の軟骨の再生における病状において、発達中の細胞の分化段階を決定する方法であって、配列番号1で示されるヌクレオチド配列から選択されるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、それらがインテグリンサブユニットα1をコードするDNAまたはRNAとはハイブリダイズできないハイブリダイゼーション条件下でマーカーとして使用される方法。
(112) ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、細胞質ドメイン、Iドメインおよびスプライシングドメインのペプチドからなる群から選択されるペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである、上記111記載の方法。
(113) ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドがアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQを含んでなるペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである、上記111記載の方法。
(114) ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが配列番号1のアミノ酸952番付近からアミノ酸986番付近までのアミノ酸配列を含んでなるペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである、上記111記載の方法。
(115) ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが配列番号1のアミノ酸140番付近からアミノ酸337番付近までのアミノ酸配列を含んでなるペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである、上記111記載の方法。
(116) 病状がインテグリンサブユニットα10に関与するいずれかの病状である、上記111記載の方法。
(117) 病状が慢性関節リウマチ、変形性関節炎または癌である、上記111記載の方法。
(118) 病状がアテローム性動脈硬化症または炎症である、上記111記載の方法。
(119) 細胞が軟骨細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、骨芽細胞および繊維芽細胞からなる群から選択される、上記111〜118のいずれか1項に記載の方法。
(121) 配列番号1もしくは配列番号2で示されるアミノ酸配列を含んでなるインテグリンサブユニットα10、またはサブユニットα10およびサブユニットβを含むインテグリンヘテロ二量体、またはその断片であってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片と特異的に結合する能力を有する抗体である結合物を含む軟骨細胞および/または骨芽細胞の、移植片の表面への接着を促進して骨の組み込みを刺激するための剤。
(122) サブユニットα10およびサブユニットβを含んでなるインテグリンヘテロ二量体、またはそのサブユニットα10、またはインテグリンもしくはサブユニットα10の断片であってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片を標的分子として使用できる抗体の好適量を含んでなる軟骨または骨の形成を刺激、阻害またはブロックするための剤。
(123) サブユニットα10およびサブユニットβを含んでなるインテグリンヘテロ二量体、またはそのサブユニットα10、またはインテグリンもしくはサブユニットα10の断片であってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片の活性化または阻害により細胞外マトリックス合成および修復を刺激するための刺激剤。
(124) インテグリンサブユニットα10の断片であってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片をコードするDNAまたはRNAを含んでなる標的分子。
(125) ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、インテグリンサブユニットα10の断片であってアミノ酸配列KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ、配列番号1におけるアミノ酸番号162〜359、974〜1008、1121〜1145および23〜1120のアミノ酸配列から選択される断片をコードするDNAまたはRNAとハイブリダイズするが、インテグリンサブユニットα1をコードするDNAまたはRNAとはハイブリダイズできない、上記124記載の標的分子。
II型コラーゲン−「Sepharose 」上でのα10インテグリンサブユニットの親和精製
材料および方法
ウシ軟骨細胞、ヒト軟骨細胞またはヒト軟骨腫瘍細胞を前記のように単離した[Holmval らの Exp Cell Res, 221, 496-503 (1995), Camper らの JBC, 273, 20383-20389 (1998) ]。ウシ軟骨細胞の「Triton X-100」リゼイトを、フイブロネクチン−「Sepharose 」プレカラム、次いでII型コラーゲン−「Sepharose 」上に施し、このインテグリンサブユニットα10をII型コラーゲンカラムから EDTA により溶離した(Camper らの JBC, 273, 20383-20389(1998)。溶離タンパク質をメタノール/クロロホルムで沈殿させ、還元型条件下に SDS-PAGE により分離し、クーマシーブルーで染色した(Camper らの JBC, 273, 20383-20389 (1998) 。α10 タンパク質バンドからのペプチドをトリプシンおよび相液クロマトグラフイーを用いた in-gel 消化により単離し、Edman 分解(Camper らの JBC, 273, 20383-20389 (1998)により配列決定した。
図1は、フイブロネクチン−「Sepharose 」からの EDTA 溶離タンパク質(A)、II型コラーゲン−「Sepharose 」カラムからの 流動物(B)およびII型コラーゲン−「Sepharose 」からの EDTA 溶離タンパク質(C)を示す。II型コラーゲン−「Sepharose 」カラムから特異的に溶離したα10インテグリンサブユニット(160 kDa) を矢印で示す。図2は、ウシインテグリンサブユニットα10から溶離した6種のペプチドのアミノ酸配列を示す。図3a、bおよびcは,α10インテグリンサブユニットがウシ軟骨細胞(3a)、ヒト軟骨細胞(3b)上に存在することを示す。
II型コラーゲンに対する親和性、β1 インテグリンサブユニットとの共沈殿および還元型条件下の分子量 160 kDaにより、異なった細胞上でのα10インテグリンサブユニットを確認する。これらの結果は、α10が軟骨細胞および軟骨肉腫細胞から単離され得ることを示す。
ウシα10インテグリンサブユニットに対応するPCRフラグメントの増幅
材料および方法
ウシペプチド1(図2)に対応するポリヌクレオチド配列を増幅するために、縮重プライマー GAY AAY ACI GCI CAR AC ( DNTAQT, forward ) および TIA TIS WRT GRT GIG GYT (EPHHSI, reverse) をPCRに用いた (Camper らの JBC, 273, 20383-20389 (1998) 。次いで ペプチド1のクローン化ヌクレオチド配列に対応する内部特異プライマー TCA GCC TAC ATT CAG TAT (SAYIQY, forward)をウシペプチド2(図2) に対応するICK RTC CC, RTG ICC IGG (PGHWDR, reverse) と共に用いて 900 bp PCRフラグメントをウシcDNAから増幅した。2倍縮重の位置には混合塩基を使用し、3または4倍縮重の位置にはイノシンを使用した。mRNA単離およびcDNA合成を文献記載(Camper らの
JBC, 273, 20383-20389 (1998) に準拠して実施した。精製フラグメントをクーローン化し、精製し、文献記載に従って配列決定した(Camper らの JBC, 273, 20383-20389 (1998) )。
結果
ペプチド1のヌクレオチド配列(図2)が、ウシcDNAのPCR増幅、クローン化および配列決定により得られた。このヌクレオチド配列から正確なプライマーを設計し、ペプチド2−6に対応する縮重プライマーを用いるPCR増幅に応用した。ペプチド1および2に対応するプライマーがウシcDNAからの 900 bp フラグメントを増幅した(図4)。
ヒトα10インテグリンサブユニットのクローン化および配列分析
材料および方法
ウシα10インテグリンに対応するクローン化 900 bp PCRフラグメントを、DIG DNA ラベル化キット(Boehringer Mannheim) に準拠してジゴキシゲニン−ラベル化し、ヒト間節軟骨細胞λ ZapII cDNAライブラリー(Michael Bayliss, TheRoyal Veterinary Basic Sciences, London, UK により提供)(52) のスクリーニング用のプローブとして用いた。cDNA挿入断片を伴う pBluescript SK + プラスミドを含むポジテイブクローンを、ZAP-cDNA R合成キット(Stratagene) 記載のように in vivo で切除することにより ZAP ベクターからレスキユーした。選択プラスミドを精製し、文献に準拠して、T3 、T7 および内部特異プライマーを用いて配列決定した(Camper らの JBC, 273, 20383-20389 (1998)。α10の5’末端をコードするcDNAを得る目的で、出願人らはプライマー AAC TCG TCT TCC AGT GCC ATT CGT GGG (reverse; α10 cDNAにおける残基 1254-1280)を設計し、これを 「MarathonTM」cDNA増幅キット(Clontech INC., Palo Alto, CA) の記載に準拠してcDNA5’末端(RACE) の急速増幅に用いた。
二つの重複クローン hc1 および hc2 (図5)を単離し、サブクローン化し、配列決定した。これらのクローンは、cDNAの3’末端を含むヌクレオチド配列の2/3を含んでいた。α10cDNAの5’末端を含む第3クローン(race1; 図5)が RACE 技法を用いて得られた。α10 cDNA、3884 ヌクレオチドの三つの重複クローンを配列決定した。このポリヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を図6に示す。この配列は、1167 アミノ酸成熟タンパク質をコードすると予測される 3504 ヌクレオチドオープンリーデイング枠を含む。シグナルペプチド開裂サイトは矢印で示し、ウシペプチド配列に対するヒト相同体は下線を施し、I領域は四角で囲んだ(boxed) 。金属イオン結合サイトは下波線で示し、潜在的N−グリコシル化サイトは星印で示し、推定トランスメンブラン領域は2重下線で示す。正常に保存された細胞質配列はドットおよびダッシュ下波線で示す。
α10のスプライス変種を含むクローンの確認
ヒト軟骨細胞ライブラリー(実施例3参照)から単離した一つのクローンは
nt 位置 2942 および 3055 間のヌクレオチドが削除さた以外は,α10インテグリンサブユニットの配列と同一の配列を含んでいた。α10のスプライス変種は、このスプライス領域をフランキングするプライマーを用いたPCR実験において証明された(図14参照)。
ノーザンブロットによるα10インテグリンサブユニットの同定
材料および方法
ウシ軟骨細胞 mRNAを 「QuickPrep R Micro 」mRNA精製キット(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden )を用いて精製し、1%アガロース−ホルムアルデヒドゲル上で分離し、ナイロン膜に移し、IV架橋により固定化した。Random Primed DNAラベル化キット(Boehringer Mannheim) を用いてcDNAプローブを32Pラベル化した。フイルターを 5x SSE, 5X Denharts 溶液、0.1% SDS, 50μg/mlサケ精子DNAおよび50%ホルムアミド中、42℃で2〜4時間予備交配し、次いで特異プローブ(0.5〜1 × 106 cpm/ml)を含む同一溶液を用いて42℃で一昼夜交配した。特異的に結合したcDNAプローブをリン光イメージャー装置(Fuji)を用いて分析した。再プローブに先立ちフイルターを0.1% SDS 中、80℃で1間洗浄してストリップした。このα10インテグリンcDNAプローブを、制限酵素 BamHI (GIBCO BRL) および NcoI (Boehringer Mannheim) を用いて racel含有プラスミドから単離した。ラットβ1 インテグリンcDNAプローブは Staffan Johansson, Uppsala, Sweden から寄贈された。
ウシ軟骨細胞からのmRNAのノーザンブロット分析によれば、ヒトα10 cDNAプローブが約 5.4 kb (図7)の単一mRNAと交配した。比較として、インテグリンサブユニットα1に対応するcDNAプローブを用いた。このcDNAプローブは同一フイルター上の約 3.5 kb のmRNAバンドと交配した。これらの結果は、α10に対するcDNAプローブがmRNAレベルでα10インテグリンサブユニットを同定するのに使用できることを示す。
インテグリンサブユニットα10に対する抗体の調製
α10細胞質領域の一部 Ckkipeeekreekle に対応するペプチド(図6参照)を合成し、鍵穴カサガイヘモシアニン(KLH) に複合させた。ペプチド/KLH 複合体を用いてラビットを免疫化しインテグリンサブユニットα10に対する抗血清を生じさせた。α10を認識する抗体はペプチド結合カラム(Innovagen AB) 上で親和精製した。
軟骨細胞からのインテグリンサブユニットα10の免疫沈殿
材料および方法
ヒト軟骨細胞を 125 Iラベル化し「Triton X-100」 を用いて溶菌し、文献(Holmvall らの Exp. Cell Res, 221, 496-503 (1995) 、Camper らの JBC, 273, 20383-20389 (1998) )記載のように免疫沈殿した。125I ラベル化ヒト軟骨細胞の「Triton X-100」 リゼイトを、インテグリンサブユニットβ1 、α1 、α2 、α3 、α10に対するポリクローナル抗体を用いて免疫沈殿した。この免疫沈殿タンパク質を非還元型条件下に SDS-PAGE (4−12%)により分離し、リン光イメージャーにより肉視した。α10またはβ1 で免疫沈殿したヒト軟骨細胞の「Triton X-100」 リゼイトを非還元型条件下に SDS-PAGE (8%)により分離し、ポリクローナルβ1 抗体を使用するウエスターンブロットおよび Camper らによる JBC, 273, 20383-20389 (1998) 記載のように化学発光検出法を用いて分析した。
α10の細胞質領域に対して高めたポリクローナルペプチド抗体は、 Mr が約 160 kD (α10)および 125 kD (β1 )を有する二つのタンパク質バンドを非還元型条件下に沈殿した。α10会合β鎖はβ1 インテグリンサブユニットのように移動した(図8a)。軟骨細胞におけるα10会合β鎖が実際にβ1 であることを実証するために、軟骨細胞ライゼイトをα10 orb β1 に対する抗体を用いて免疫沈殿し、次いでβ1 サブユニットに対する抗体を用いたウエスターンブロットに処した(図8b)。これらの結果は、α10がβ1 インテグリンフアミリーの1員であることを明瞭に示した。しかし、これらの結果は、α10が他の状況下に他のβ鎖と会合できる可能性を排除はしない。
ヒトおよびマウス軟骨におけるインテグリンサブユニットα10の免疫組織化学的染色
手術期間に得られた成人軟骨(trochlear groove ) の凍結部分(Anders Lindahl, Salgrenska Hospital, Gothenburg, Sweden 提供)および生後3日のマウス手足からの凍結部分を固定し、文献記載(Camper らの JBC, 273, 20383-20389 (1998) のように免疫組織かがく用に調製した。α10インテグリンサブユニットの発現は一次抗体(実施例6参照)およびペルオキシダーゼに複合した二次 抗体として、細胞質領域に対するポリクローナル抗体を用いて分析した。
図9はヒト成人間節の軟骨の染色を示す。
α10の細胞質領域を認識するα10抗体は、ヒト間節軟骨の組織部分における軟骨細胞を染色した(A)。この染色は、α10ペプチドを用いて抗体を予備保温すると減少した(B)。α10インテグリンサブユニットを認識する対照抗体は軟骨細胞に結合しなかった(C)。
マウスの発生期におけるインテグリンサブユニットα10の免疫組織化学的染色材料および方法
マウス胚(13.5日)からの凍結部分を、 Camper らの JBC, 273, 20383-20389 (1998) 記載に準拠して免疫組織化学によるα10発現用に研究した。α10インテグリンサブユニットの発現は、一次抗体(実施例6参照)およびペルオキシダーゼに複合した二次抗体としての細胞質領域に対するポリキローナル抗体を用いて分析した。この胚部分もインテグリンサブユニットα10(Pharmingen からのモノクローナル抗体)およびII型コラーゲン(モノクローナル抗体、Dr John Mo, Lund University, Sweden から寄贈)の発現のために研究した。
間節軟骨以外の組織におけるα10のmRNA発現
材料および方法
α10インテグリンサブユニットの発現を、異なったヒト組織中でのmRNAレベルで試験した。図12に示した組織からの固定化mRNAを用いるノーザンドットブロットを、制限酵素 BamH1 およびNcol を用いて race 1-含有プラスミドから単離したα10インテグリンcDNAプローブを用いて交配した。交配の程度をリン発光イマージヤーを用いて分析した。次の記号は増加順序:−、+、++、+++、++++で表示するmRNAレベルを示す。
交配mRNAの分析によれば、α10は大動脈、気管、心臓、肺、および腎臓に発現された(図2)。他の全ての組織はα10発現に対しネガテイブのように見えた。これらの結果は、α10インテグリンサブユニットの制限的分布を暗示する。
腱および骨格筋周りの筋膜および心臓弁内の腱構築体におけるα10の免疫組織化学的染色
材料および方法
手術期中に得られた成人軟骨(trochlear groove )の凍結部分(Anders Lindahl, Salgrenska Hospital, Gothenburg, Sweden により提供)および生後3日マウス手足からの凍結部分を固定し、文献記載のように免疫組織化学用に調製した(Camper らの JBC, 273, 20383-20389 (1998)。α10インテグリンサブユニットの発現は、一次抗体(実施例6参照)およびペルオキシザーゼに複合した第二抗体としての細胞質領域に対するポリクローナル抗体を用いて分析した。
図13に見られるように、α10の発現は腱を取り巻く筋膜(a)および骨格筋(b)中および心臓弁の腱構造(c)に見いだされた。この局在化は、α10が軟骨特異的II型コラーゲン以外にも他のマトリックス分子にも結合し得ることを暗示する。腱表面上へのインテグリンα10の局在化は、α10が、感染、障害後または手術後の腱/靭帯間および組織周辺にしばしば起きる好ましからぬ癒着に関与し得ることを示す。
軟骨細胞、内皮細胞および繊維芽細胞におけるα10インテグリンサブユニットのmRNA発現
材料および方法
mRNAの単離、cDNAの合成およびPCR増幅は文献記載のように行った(Camper らの JBC, 273, 20383-20389 (1998) ) 。
結果
図14は、ヒト間節軟骨細胞(レーンA6 およびB1 )、ヒトへその緒静脈内皮細胞(レーンA2)、ヒト繊維芽細胞(レーンA4 )、およびラット腱(図14b、レーンB2 )からのα10cDNAのPCR増幅を示す。レーン1、3および5(図14A)は、内皮細胞、繊維芽細胞および軟骨細胞それぞれにおけるインテグリンサブユニットα10に対応する増幅フラグメントを示す。α10配列位置 nt 2919-2943 (forward) および nt 3554-3578 (reverse) (図6参照)の対応するcDNAプライマーは異なった細胞からのα10cDNAの増幅に使用された。この図は、α10が三種の全ての細胞型で増幅されたことを示す。α10の二つのフラグメントは増幅され、このものはα10の元来の形態で(一層大きなフラグメント)、かつスプライス変異(一層小さなフラグメント)の形態で存在した。この一層大きなフラグメントは軟骨細胞中で大勢を占め、一方、一層小さなフラグメントは腱中に一層顕著であった(B2 )。
α10哺乳類発現ベクターの構築
α10の等身大タンパク質コード配列(三つのクローンからの併合;図6参照)を哺乳類発現ベクターpcDNA3.1/Zeo (Invitrogen) 中に挿入た。このベクターは SV40 プロモーターおよび Zeosin 選択配列を含む。このα10含有発現ベクターを、β1 インテグリンサブユニットは発現するがα10サブユニットの発現に欠く細胞中にトランスフエクトした。細胞表面上のα10インテグリンサブユニットの発現は、免疫沈殿法および/またはα10に対して特異的な抗体を用いたフロー血球計算により分析できる。リガンド結合能力および挿入されたα10インテグリンサブユニットの機能は細胞付着実験およびシグナル化実験で実証できる。
α10のスプライス変種を含む哺乳類発現ベクターの構築
α10のスピライス変種の等身大タンパク質コード配列を哺乳類発現ベクター pc DNA3 (実施例13参照)中に挿入した。このスプライス変種の発現および機能は実施例13記載のように分析でき、かつ、無傷のα10インテグリンサブユニットと比較できる。
α10インテグリンゲノムDNAの部分単離および特性化
材料および方法
制限酵素 EamHI (GIBCO BRI) およびNcoI(Boehringer Mannheim ) を用いたracel 含有プラスミドから単離したヒトαcDNAを、32Pラベル化し、マウス 129 コスミドライブラリー(Reinhard Fassler, Lund University 提供)のスクリーニン用プローブとして用いた。ポジテイブクローンを単離し、サブクローンした。選択プラスミドを精製し、文献(Camper らの JBC,273, 20383-20389 (1998) に準拠してT3 、T7 および内部特異プライマーを用いて配列決定した。次いでマウスゲノムDNAに対応するプライマーを構築し、PCRに用いて増幅し、コスミドクローンからα10のゲノム配列を同定した。
アルギン酸塩(alginate)ビーズ中で培養したα10インテグリンサブユニットのアップレギュレーション(upregulation)
単層で2週間培養したヒト軟骨細胞をトリプシン−EDTAで脱離し、アルギン酸塩ビーズ中に導入した。アルギン酸塩ビーズ中で培養した軟骨細胞は、単層中で培養された軟骨細胞の脱分化間、それらの表現型を保存することは既知である。アルギン酸塩もしくは単層中いずれかで培養した軟骨細胞を11日後に単離し、125 Iで表面ラベル化した。このα10インテグリンサブユニットを次いで細胞質領域を認識するポリクローナル抗体を用いて免疫沈殿した(実施例6参照および Camper らの JBC, 273, 20383-20389 (1989) ) 。
図16に見られるように、アルギン酸塩ビーズ中で培養した軟骨細胞(レーン3および4)はα10 β1 のそれらのタンパク質発現を上方調節アップレギュレーションした。このことは、極めて低いα10β1 発現を示す、単層中で培養(レーン1および2)した軟骨細胞とは対照的であった。ab対照抗体を用いた免疫沈殿をレーン1および3に示す。軟骨細胞はアルギン酸塩中でそれらの軟骨特異的マトリクス生産を保持するが、単層中で培養したものは保持せず、この事実はアルギン酸塩が軟骨細胞の表現型を保持することを示す。これらの結果は、α10インテグリンサブユニットが分化軟骨細胞に対するマーカーとして使用できることを支持する。
ヒト平滑筋細胞からのα10インテグリンサブユニットの免疫沈殿
材料および方法
ヒト平滑筋細胞をヒト大動脈から単離した。培養1週間後、細胞を125 Iラベル化し、溶菌し、かつインテグリンサブユニットβ1 (レーン1)、α1 (レーン2)、α2 (レーン3)、α10(レーン4)、α 3(レーン5)、対照(レーン6)’図17)に対する抗体を用いて免疫沈殿させた。この実験は実施例7記載のように実施した。α10抗体は、α10およびβ1 インテグリンサブユニットに対応する平滑菌細胞から二つのバンドを沈殿した(図17)。
α10スライス領域に対する配列を含む細菌性発現ベクターの構築
交互スプライスド領域(アミノ酸 pos. 952-986, SEQ. ID 1) の E.coli 中での細胞内発現のためのプラスミドを文献記載のように構築した。この交互スプライスド領域をE. coli 高頻度コドンテーブルを用いてバック翻訳し、元の配列(SEQ. ID 1 ヌクレオチド pos. 2940-3044) と96%同一性のcDNA配列を創った。配列重複エクステンシン(Horon らの Biotechniques 8:528, 1990) を用いてプライマーα10pfor (表I)およびα10prev (表I)を、α10アミノ酸配列をコードする2重鎖フラグメントの創造に用いた。ブドウ状球菌タンパク質AのZ領域を含むPETベクター中でサブクローンするための制限酵素サイトを創る目的で、このフラグメントをプライマ−α10pfor2 (表I)およびα10prev2 (表I)を用いるPCR鋳型として用て、トロンビン開裂サイトを中間に有するZ領域のアミノ末端とα10スプライスド領域との融合体を創った。第2PCR反応で生じたフラグメントを示し(SEQ ID No. 3)、また発現ベクター中でのサブクローンに使用した新規制限酵素も示す。
SEQUENCE LISTING
(1) 一般的情報:
(i) 配列の総数: 2
(2) 配列番号1の情報:
(i) 配列特徴:
(A) 配列の長さ: 3884 塩基対
(B) 配列の型: 核酸およびアミノ酸
(C) 鎖の数: 二本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: cDNA
(vi) 起源:
(E) 生物名: ヒト
(F) 細胞の種類: 軟骨細胞
(xi) 配列の記載: 配列番号1:
CAGGTCAGAAACCGATCAGGCATGGAACTCCCCTTCGTCACTCACCTGTTCTTGCCCCTG
1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60
GTCCAGTCTTTGGCTAGTCCGTACCTTGAGGGGAAGCAGTGAGTGGACAAGAACGGGGAC
a M E L P F V T H L F L P L -
GTGTTCCTGACAGGTCTCTGCTCCCCCTTTAACCTGGATGAACATCACCCACGCCTATTC
61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120
CACAAGGACTGTCCAGAGACGAGGGGGAAATTGGACCTACTTGTAGTGGGTGCGGATAAG
a V F L T G L C S P F N L D E H H P R L F -
CCAGGGCCACCAGAAGCTGAATTTGGATACAGTGTCTTACAACATGTTGGGGGTGGACAG
121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180
GGTCCCGGTGGTCTTCGACTTAAACCTATGTCACAGAATGTTGTACAACCCCCACCTGTC
a P G P P E A E F G Y S V L Q H V G G G Q -
CGATGGATGCTGGTGGGCGCCCCCTGGGATGGGCCTTCAGGCGACCGGAGGGGGGACGTT
181 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240
GCTACCTACGACCACCCGCGGGGGACCCTACCCGGAAGTCCGCTGGCCTCCCCCCTGCAA
a R W M L V G A P W D G P S G D R R G D V -
TATCGCTGCCCTGTAGGGGGGGCCCACAATGCCCCATGTGCCAAGGGCCACTTAGGTGAC
241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300
ATAGCGACGGGACATCCCCCCCGGGTGTTACGGGGTACACGGTTCCCGGTGAATCCACTG
a Y R C P V G G A H N A P C A K G H L G D -
TACCAACTGGGAAATTCATCTCATCCTGCTGTGAATATGCACCTGGGGATGTCTCTGTTA
301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 360
ATGGTTGACCCTTTAAGTAGAGTAGGACGACACTTATACGTGGACCCCTACAGAGACAAT
a Y Q L G N S S H P A V N M H L G M S L L -
GAGACAGATGGTGATGGGGGATTCATGGCCTGTGCCCCTCTCTGGTCTCGTGCTTGTGGC
361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420
CTCTGTCTACCACTACCCCCTAAGTACCGGACACGGGGAGAGACCAGAGCACGAACACCG
a E T D G D G G F M A C A P L W S R A C G -
AGCTCTGTCTTCAGTTCTGGGATATGTGCCCGTGTGGATGCTTCATTCCAGCCTCAGGGA
421 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 480
TCGAGACAGAAGTCAAGACCCTATACACGGGCACACCTACGAAGTAAGGTCGGAGTCCCT
a S S V F S S G I C A R V D A S F Q P Q G -
AGCCTGGCACCCACTGCCCAACGCTGCCCAACATACATGGATGTTGTCATTGTCTTGGAT
481 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 540
TCGGACCGTGGGTGACGGGTTGCGACGGGTTGTATGTACCTACAACAGTAACAGAACCTA
a S L A P T A Q R C P T Y M D V V I V L D -
GGCTCCAACAGCATCTACCCCTGGTCTGAAGTTCAGACCTTCCTACGAAGACTGGTAGGG
541 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600
CCGAGGTTGTCGTAGATGGGGACCAGACTTCAAGTCTGGAAGGATGCTTCTGACCATCCC
a G S N S I Y P W S E V Q T F L R R L V G -
AAACTGTTTATTGACCCAGAACAGATACAGGTGGGACTGGTACAGTATGGGGAGAGCCCT
601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 660
TTTGACAAATAACTGGGTCTTGTCTATGTCCACCCTGACCATGTCATACCCCTCTCGGGA
a K L F I D P E Q I Q V G L V Q Y G E S P -
GTACATGAGTGGTCCCTGGGAGATTTCCGAACGAAGGAAGAAGTGGTGAGAGCAGCAAAG
661 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 720
CATGTACTCACCAGGGACCCTCTAAAGGCTTGCTTCCTTCTTCACCACTCTCGTCGTTTC
a V H E W S L G D F R T K E E V V R A A K -
AACCTCAGTCGGCGGGAGGGACGAGAAACAAAGACTGCCCAAGCAATAATGGTGGCCTGC
721 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 780
TTGGAGTCAGCCGCCCTCCCTGCTCTTTGTTTCTGACGGGTTCGTTATTACCACCGGACG
a N L S R R E G R E T K T A Q A I M V A C -
ACAGAAGGGTTCAGTCAGTCCCATGGGGGCCGACCCGAGGCTGCCAGGCTACTGGTGGTT
781 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 840
TGTCTTCCCAAGTCAGTCAGGGTACCCCCGGCTGGGCTCCGACGGTCCGATGACCACCAA
a T E G F S Q S H G G R P E A A R L L V V -
GTCACTGATGGAGAGTCCCATGATGGAGAGGAGCTTCCTGCAGCACTAAAGGCCTGTGAG
841 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900
CAGTGACTACCTCTCAGGGTACTACCTCTCCTCGAAGGACGTCGTGATTTCCGGACACTC
a V T D G E S H D G E E L P A A L K A C E -
GCTGGAAGAGTGACACGCTATGGGATTGCAGTCCTTGGTCACTACCTCCGGCGGCAGCGA
901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 960
CGACCTTCTCACTGTGCGATACCCTAACGTCAGGAACCAGTGATGGAGGCCGCCGTCGCT
a A G R V T R Y G I A V L G H Y L R R Q R -
GATCCCAGCTCTTTCCTGAGAGAAATTAGAACTATTGCCAGTGATCCAGATGAGCGATTC
961 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1020
CTAGGGTCGAGAAAGGACTCTCTTTAATCTTGATAACGGTCACTAGGTCTACTCGCTAAG
a D P S S F L R E I R T I A S D P D E R F -
TTCTTCAATGTCACAGATGAGGCTGCTCTGACTGACATTGTGGATGCACTAGGAGATCGG
1021 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1080
AAGAAGTTACAGTGTCTACTCCGACGAGACTGACTGTAACACCTACGTGATCCTCTAGCC
a F F N V T D E A A L T D I V D A L G D R -
ATTTTTGGCCTTGAAGGGTCCCATGCAGAAAACGAAAGCTCCTTTGGGCTGGAAATGTCT
1081 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1140
TAAAAACCGGAACTTCCCAGGGTACGTCTTTTGCTTTCGAGGAAACCCGACCTTTACAGA
a I F G L E G S H A E N E S S F G L E M S -
CAGATTGGTTTCTCCACTCATCGGCTAAAGGATGGGATTCTTTTTGGGATGGTGGGGGCC
1141 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200
GTCTAACCAAAGAGGTGAGTAGCCGATTTCCTACCCTAAGAAAAACCCTACCACCCCCGG
a Q I G F S T H R L K D G I L F G M V G A -
TATGACTGGGGAGGCTCTGTGCTATGGCTTGAAGGAGGCCACCGCCTTTTCCCCCCACGA
1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1260
ATACTGACCCCTCCGAGACACGATACCGAACTTCCTCCGGTGGCGGAAAAGGGGGGTGCT
a Y D W G G S V L W L E G G H R L F P P R -
ATGGCACTGGAAGACGAGTTCCCCCCTGCACTGCAGAACCATGCAGCCTACCTGGGTTAC
1261 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1320
TACCGTGACCTTCTGCTCAAGGGGGGACGTGACGTCTTGGTACGTCGGATGGACCCAATG
a M A L E D E F P P A L Q N H A A Y L G Y -
TCTGTTTCTTCCATGCTTTTGCGGGGTGGACGCCGCCTGTTTCTCTCTGGGGCTCCTCGA
1321 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1380
AGACAAAGAAGGTACGAAAACGCCCCACCTGCGGCGGACAAAGAGAGACCCCGAGGAGCT
a S V S S M L L R G G R R L F L S G A P R -
TTTAGACATCGAGGAAAAGTCATCGCCTTCCAGCTTAAGAAAGATGGGGCTGTGAGGGTT
1381 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1440
AAATCTGTAGCTCCTTTTCAGTAGCGGAAGGTCGAATTCTTTCTACCCCGACACTCCCAA
a F R H R G K V I A F Q L K K D G A V R V -
GCCCAGAGCCTCCAGGGGGAGCAGATTGGTTCATACTTTGGCAGTGAGCTCTGCCCATTG
1441 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500
CGGGTCTCGGAGGTCCCCCTCGTCTAACCAAGTATGAAACCGTCACTCGAGACGGGTAAC
a A Q S L Q G E Q I G S Y F G S E L C P L -
GATACAGATAGGGATGGAACAACTGATGTCTTACTTGTGGCTGCCCCCATGTTCCTGGGA
1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1560
CTATGTCTATCCCTACCTTGTTGACTACAGAATGAACACCGACGGGGGTACAAGGACCCT
a D T D R D G T T D V L L V A A P M F L G -
CCCCAGAACAAGGAAACAGGACGTGTTTATGTGTATCTGGTAGGCCAGCAGTCCTTGCTG
1561 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1620
GGGGTCTTGTTCCTTTGTCCTGCACAAATACACATAGACCATCCGGTCGTCAGGAACGAC
a P Q N K E T G R V Y V Y L V G Q Q S L L -
ACCCTCCAAGGAACACTTCAGCCAGAACCCCCCCAGGATGCTCGGTTTGGCTTTGCCATG
1621 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1680
TGGGAGGTTCCTTGTGAAGTCGGTCTTGGGGGGGTCCTACGAGCCAAACCGAAACGGTAC
a T L Q G T L Q P E P P Q D A R F G F A M -
GGAGCTCTTCCTGATCTGAACCAAGATGGTTTTGCTGATGTGGCTGTGGGGGCGCCTCTG
1681 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1740
CCTCGAGAAGGACTAGACTTGGTTCTACCAAAACGACTACACCGACACCCCCGCGGAGAC
a G A L P D L N Q D G F A D V A V G A P L -
GAAGATGGGCACCAGGGAGCACTGTACCTGTACCATGGAACCCAGAGTGGAGTCAGGCCC
1741 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800
CTTCTACCCGTGGTCCCTCGTGACATGGACATGGTACCTTGGGTCTCACCTCAGTCCGGG
a E D G H Q G A L Y L Y H G T Q S G V R P -
CATCCTGCCCAGAGGATTGCTGCTGCCTCCATGCCACATGCCCTCAGCTACTTTGGCCGA
1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1860
GTAGGACGGGTCTCCTAACGACGACGGAGGTACGGTGTACGGGAGTCGATGAAACCGGCT
a H P A Q R I A A A S M P H A L S Y F G R -
AGTGTGGATGGTCGGCTAGATCTGGATGGAGATGATCTGGTCGATGTGGCTGTGGGTGCC
1861 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1920
TCACACCTACCAGCCGATCTAGACCTACCTCTACTAGACCAGCTACACCGACACCCACGG
a S V D G R L D L D G D D L V D V A V G A -
CAGGGGGCAGCCATCCTGCTCAGCTCCCGGCCCATTGTCCATCTGACCCCATCACTGGAG
1921 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1980
GTCCCCCGTCGGTAGGACGAGTCGAGGGCCGGGTAACAGGTAGACTGGGGTAGTGACCTC
a Q G A A I L L S S R P I V H L T P S L E -
GTGACCCCACAGGCCATCAGTGTGGTTCAGAGGGACTGTAGGCGGCGAGGCCAAGAAGCA
1981 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2040
CACTGGGGTGTCCGGTAGTCACACCAAGTCTCCCTGACATCCGCCGCTCCGGTTCTTCGT
a V T P Q A I S V V Q R D C R R R G Q E A -
GTCTGTCTGACTGCAGCCCTTTGCTTCCAAGTGACCTCCCGTACTCCTGGTCGCTGGGAT
2041 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100
CAGACAGACTGACGTCGGGAAACGAAGGTTCACTGGAGGGCATGAGGACCAGCGACCCTA
a V C L T A A L C F Q V T S R T P G R W D -
CACCAATTCTACATGAGGTTCACCGCATCACTGGATGAATGGACTGCTGGGGCACGTGCA
2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2160
GTGGTTAAGATGTACTCCAAGTGGCGTAGTGACCTACTTACCTGACGACCCCGTGCACGT
a H Q F Y M R F T A S L D E W T A G A R A -
GCATTTGATGGCTCTGGCCAGAGGTTGTCCCCTCGGAGGCTCCGGCTCAGTGTGGGGAAT
2161 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2220
CGTAAACTACCGAGACCGGTCTCCAACAGGGGAGCCTCCGAGGCCGAGTCACACCCCTTA
a A F D G S G Q R L S P R R L R L S V G N -
GTCACTTGTGAGCAGCTACACTTCCATGTGCTGGATACATCAGATTACCTCCGGCCAGTG
2221 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2280
CAGTGAACACTCGTCGATGTGAAGGTACACGACCTATGTAGTCTAATGGAGGCCGGTCAC
a V T C E Q L H F H V L D T S D Y L R P V -
GCCTTGACTGTGACCTTTGCCTTGGACAATACTACAAAGCCAGGGCCTGTGCTGAATGAG
2281 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2340
CGGAACTGACACTGGAAACGGAACCTGTTATGATGTTTCGGTCCCGGACACGACTTACTC
a A L T V T F A L D N T T K P G P V L N E -
GGCTCACCCACCTCTATACAAAAGCTGGTCCCCTTCTCAAAGGATTGTGGCCCTGACAAT
2341 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2400
CCGAGTGGGTGGAGATATGTTTTCGACCAGGGGAAGAGTTTCCTAACACCGGGACTGTTA
a G S P T S I Q K L V P F S K D C G P D N -
GAATGTGTCACAGACCTGGTGCTTCAAGTGAATATGGACATCAGAGGCTCCAGGAAGGCC
2401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2460
CTTACACAGTGTCTGGACCACGAAGTTCACTTATACCTGTAGTCTCCGAGGTCCTTCCGG
a E C V T D L V L Q V N M D I R G S R K A -
CCATTTGTGGTTCGAGGTGGCCGGCGGAAAGTGCTGGTATCTACAACTCTGGAGAACAGA
2461 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2520
GGTAAACACCAAGCTCCACCGGCCGCCTTTCACGACCATAGATGTTGAGACCTCTTGTCT
a P F V V R G G R R K V L V S T T L E N R -
AAGGAAAATGCTTACAATACGAGCCTGAGTATCATCTTCTCTAGAAACCTCCACCTGGCC
2521 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2580
TTCCTTTTACGAATGTTATGCTCGGACTCATAGTAGAAGAGATCTTTGGAGGTGGACCGG
a K E N A Y N T S L S I I F S R N L H L A -
AGTCTCACTCCTCAGAGAGAGAGCCCAATAAAGGTGGAATGTGCCGCCCCTTCTGCTCAT
2581 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2640
TCAGAGTGAGGAGTCTCTCTCTCGGGTTATTTCCACCTTACACGGCGGGGAAGACGAGTA
a S L T P Q R E S P I K V E C A A P S A H -
GCCCGGCTCTGCAGTGTGGGGCATCCTGTCTTCCAGACTGGAGCCAAGGTGACCTTTCTG
2641 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2700
CGGGCCGAGACGTCACACCCCGTAGGACAGAAGGTCTGACCTCGGTTCCACTGGAAAGAC
a A R L C S V G H P V F Q T G A K V T F L -
CTAGAGTTTGAGTTTAGCTGCTCCTCTCTCCTGAGCCAGGTCTTTGGGAAGCTGACTGCC
2701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2760
GATCTCAAACTCAAATCGACGAGGAGAGAGGACTCGGTCCAGAAACCCTTCGACTGACGG
a L E F E F S C S S L L S Q V F G K L T A -
AGCAGTGACAGCCTGGAGAGAAATGGCACCCTTCAAGAAAACACAGCCCAGACCTCAGCC
2761 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2820
TCGTCACTGTCGGACCTCTCTTTACCGTGGGAAGTTCTTTTGTGTCGGGTCTGGAGTCGG
a S S D S L E R N G T L Q E N T A Q T S A -
TACATCCAATATGAGCCCCACCTCCTGTTCTCTAGTGAGTCTACCCTGCACCGCTATGAG
2821 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2880
ATGTAGGTTATACTCGGGGTGGAGGACAAGAGATCACTCAGATGGGACGTGGCGATACTC
a Y I Q Y E P H L L F S S E S T L H R Y E -
GTTCACCCATATGGGACCCTCCCAGTGGGTCCTGGCCCAGAATTCAAAACCACTCTCAGG
2881 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2940
CAAGTGGGTATACCCTGGGAGGGTCACCCAGGACCGGGTCTTAAGTTTTGGTGAGAGTCC
a V H P Y G T L P V G P G P E F K T T L R -
GTTCAGAACCTAGGCTGCTATGTGGTCAGTGGCCTCATCATCTCAGCCCTCCTTCCAGCT
2941 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3000
CAAGTCTTGGATCCGACGATACACCAGTCACCGGAGTAGTAGAGTCGGGAGGAAGGTCGA
a V Q N L G C Y V V S G L I I S A L L P A -
GTGGCCCATGGGGGCAATTACTTCCTATCACTGTCTCAAGTCATCACTAACAATGCAAGC
3001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3060
CACCGGGTACCCCCGTTAATGAAGGATAGTGACAGAGTTCAGTAGTGATTGTTACGTTCG
a V A H G G N Y F L S L S Q V I T N N A S -
TGCATAGTGCAGAACCTGACTGAACCCCCAGGCCCACCTGTGCATCCAGAGGAGCTTCAA
3061 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3120
ACGTATCACGTCTTGGACTGACTTGGGGGTCCGGGTGGACACGTAGGTCTCCTCGAAGTT
a C I V Q N L T E P P G P P V H P E E L Q -
CACACAAACAGACTGAATGGGAGCAATACTCAGTGTCAGGTGGTGAGGTGCCACCTTGGG
3121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3180
GTGTGTTTGTCTGACTTACCCTCGTTATGAGTCACAGTCCACCACTCCACGGTGGAACCC
a H T N R L N G S N T Q C Q V V R C H L G -
CAGCTGGCAAAGGGGACTGAGGTCTCTGTTGGACTATTGAGGCTGGTTCACAATGAATTT
3181 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3240
GTCGACCGTTTCCCCTGACTCCAGAGACAACCTGATAACTCCGACCAAGTGTTACTTAAA
a Q L A K G T E V S V G L L R L V H N E F -
TTCCGAAGAGCCAAGTTCAAGTCCCTGACGGTGGTCAGCACCTTTGAGCTGGGAACCGAA
3241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3300
AAGGCTTCTCGGTTCAAGTTCAGGGACTGCCACCAGTCGTGGAAACTCGACCCTTGGCTT
a F R R A K F K S L T V V S T F E L G T E -
GAGGGCAGTGTCCTACAGCTGACTGAAGCCTCCCGTTGGAGTGAGAGCCTCTTGGAGGTG
3301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3360
CTCCCGTCACAGGATGTCGACTGACTTCGGAGGGCAACCTCACTCTCGGAGAACCTCCAC
a E G S V L Q L T E A S R W S E S L L E V -
GTTCAGACCCGGCCTATCCTCATCTCCCTGTGGATCCTCATAGGCAGTGTCCTGGGAGGG
3361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3420
CAAGTCTGGGCCGGATAGGAGTAGAGGGACACCTAGGAGTATCCGTCACAGGACCCTCCC
a V Q T R P I L I S L W I L I G S V L G G -
TTGCTCCTGCTTGCTCTCCTTGTCTTCTGCCTGTGGAAGCTTGGCTTCTTTGCCCATAAG
3421 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3480
AACGAGGACGAACGAGAGGAACAGAAGACGGACACCTTCGAACCGAAGAAACGGGTATTC
a L L L L A L L V F C L W K L G F F A H K -
AAAATCCCTGAGGAAGAAAAAAGAGAAGAGAAGTTGGAGCAATGAATGTAGAATAAGGGT
3481 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3540
TTTTAGGGACTCCTTCTTTTTTCTCTTCTCTTCAACCTCGTTACTTACATCTTATTCCCA
a K I P E E E K R E E K L E Q
CTAGAAAGTCCTCCCTGGCAGCTTTCTTCAAGAGACTTGCATAAAAGCAGAGGTTTGGGG
3541 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3600
GATCTTTCAGGAGGGACCGTCGAAAGAAGTTCTCTGAACGTATTTTCGTCTCCAAACCCC
GCTCAGATGGGACAAGAAGCCGCCTCTGGACTATCTCCCCAGACCAGCAGCCTGACTTGA
3601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3660
CGAGTCTACCCTGTTCTTCGGCGGAGACCTGATAGAGGGGTCTGGTCGTCGGACTGAACT
CTTTTGAGTCCTAGGGATGCTGCTGGCTAGAGATGAGGCTTTACCTCAGACAAGAAGAGC
3661 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3720
GAAAACTCAGGATCCCTACGACGACCGATCTCTACTCCGAAATGGAGTCTGTTCTTCTCG
TGGCACCAAAACTAGCCATGCTCCCACCCTCTGCTTCCCTCCTCCTCGTGATCCTGGTTC
3721 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3780
ACCGTGGTTTTGATCGGTACGAGGGTGGGAGACGAAGGGAGGAGGAGCACTAGGACCAAG
CATAGCCAACACTGGGGCTTTTGTTTGGGGTCCTTTTATCCCCAGGAATCAATAATTTTT
3781 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3840
GTATCGGTTGTGACCCCGAAAACAAACCCCAGGAAAATAGGGGTCCTTAGTTATTAAAAA
TTGCCTAGGAAAAAAAAAAGCGGCCGCGAATTCGATATCAAGCT
3841 ---------+---------+---------+---------+---- 3884
AACGGATCCTTTTTTTTTTCGCCGGCGCTTAAGCTATAGTTCGA
(2) 配列番号2の情報:
(i) 配列特徴:
(A) 配列の長さ: 3779 塩基対
(B) 配列の型: 核酸およびアミノ酸
(C) 鎖の数: 二本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(E)
(i) 配列の種類: cDNA
(vi) 起源:
(A) 生物名: ヒト
(B) 細胞の種類: 軟骨細胞
(xi) 配列の記載: 配列番号2:
CAGGTCAGAAACCGATCAGGCATGGAACTCCCCTTCGTCACTCACCTGTTCTTGCCCCTG
1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60
GTCCAGTCTTTGGCTAGTCCGTACCTTGAGGGGAAGCAGTGAGTGGACAAGAACGGGGAC
M E L P F V T H L F L P L -
GTGTTCCTGACAGGTCTCTGCTCCCCCTTTAACCTGGATGAACATCACCCACGCCTATTC
61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120
CACAAGGACTGTCCAGAGACGAGGGGGAAATTGGACCTACTTGTAGTGGGTGCGGATAAG
a V F L T G L C S P F N L D E H H P R L F -
CCAGGGCCACCAGAAGCTGAATTTGGATACAGTGTCTTACAACATGTTGGGGGTGGACAG
121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180
GGTCCCGGTGGTCTTCGACTTAAACCTATGTCACAGAATGTTGTACAACCCCCACCTGTC
a P G P P E A E F G Y S V L Q H V G G G Q -
CGATGGATGCTGGTGGGCGCCCCCTGGGATGGGCCTTCAGGCGACCGGAGGGGGGACGTT
181 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240
GCTACCTACGACCACCCGCGGGGGACCCTACCCGGAAGTCCGCTGGCCTCCCCCCTGCAA
a R W M L V G A P W D G P S G D R R G D V -
TATCGCTGCCCTGTAGGGGGGGCCCACAATGCCCCATGTGCCAAGGGCCACTTAGGTGAC
241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300
ATAGCGACGGGACATCCCCCCCGGGTGTTACGGGGTACACGGTTCCCGGTGAATCCACTG
a Y R C P V G G A H N A P C A K G H L G D -
TACCAACTGGGAAATTCATCTCATCCTGCTGTGAATATGCACCTGGGGATGTCTCTGTTA
301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 360
ATGGTTGACCCTTTAAGTAGAGTAGGACGACACTTATACGTGGACCCCTACAGAGACAAT
a Y Q L G N S S H P A V N M H L G M S L L -
GAGACAGATGGTGATGGGGGATTCATGGCCTGTGCCCCTCTCTGGTCTCGTGCTTGTGGC
361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420
CTCTGTCTACCACTACCCCCTAAGTACCGGACACGGGGAGAGACCAGAGCACGAACACCG
a E T D G D G G F M A C A P L W S R A C G -
AGCTCTGTCTTCAGTTCTGGGATATGTGCCCGTGTGGATGCTTCATTCCAGCCTCAGGGA
421 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 480
TCGAGACAGAAGTCAAGACCCTATACACGGGCACACCTACGAAGTAAGGTCGGAGTCCCT
a S S V F S S G I C A R V D A S F Q P Q G -
AGCCTGGCACCCACTGCCCAACGCTGCCCAACATACATGGATGTTGTCATTGTCTTGGAT
481 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 540
TCGGACCGTGGGTGACGGGTTGCGACGGGTTGTATGTACCTACAACAGTAACAGAACCTA
a S L A P T A Q R C P T Y M D V V I V L D -
GGCTCCAACAGCATCTACCCCTGGTCTGAAGTTCAGACCTTCCTACGAAGACTGGTAGGG
541 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600
CCGAGGTTGTCGTAGATGGGGACCAGACTTCAAGTCTGGAAGGATGCTTCTGACCATCCC
a G S N S I Y P W S E V Q T F L R R L V G -
AAACTGTTTATTGACCCAGAACAGATACAGGTGGGACTGGTACAGTATGGGGAGAGCCCT
601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 660
TTTGACAAATAACTGGGTCTTGTCTATGTCCACCCTGACCATGTCATACCCCTCTCGGGA
a K L F I D P E Q I Q V G L V Q Y G E S P -
GTACATGAGTGGTCCCTGGGAGATTTCCGAACGAAGGAAGAAGTGGTGAGAGCAGCAAAG
661 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 720
CATGTACTCACCAGGGACCCTCTAAAGGCTTGCTTCCTTCTTCACCACTCTCGTCGTTTC
a V H E W S L G D F R T K E E V V R A A K -
AACCTCAGTCGGCGGGAGGGACGAGAAACAAAGACTGCCCAAGCAATAATGGTGGCCTGC
721 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 780
TTGGAGTCAGCCGCCCTCCCTGCTCTTTGTTTCTGACGGGTTCGTTATTACCACCGGACG
a N L S R R E G R E T K T A Q A I M V A C -
ACAGAAGGGTTCAGTCAGTCCCATGGGGGCCGACCCGAGGCTGCCAGGCTACTGGTGGTT
781 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 840
TGTCTTCCCAAGTCAGTCAGGGTACCCCCGGCTGGGCTCCGACGGTCCGATGACCACCAA
a T E G F S Q S H G G R P E A A R L L V V -
GTCACTGATGGAGAGTCCCATGATGGAGAGGAGCTTCCTGCAGCACTAAAGGCCTGTGAG
841 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900
CAGTGACTACCTCTCAGGGTACTACCTCTCCTCGAAGGACGTCGTGATTTCCGGACACTC
a V T D G E S H D G E E L P A A L K A C E -
GCTGGAAGAGTGACACGCTATGGGATTGCAGTCCTTGGTCACTACCTCCGGCGGCAGCGA
901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 960
CGACCTTCTCACTGTGCGATACCCTAACGTCAGGAACCAGTGATGGAGGCCGCCGTCGCT
a A G R V T R Y G I A V L G H Y L R R Q R -
GATCCCAGCTCTTTCCTGAGAGAAATTAGAACTATTGCCAGTGATCCAGATGAGCGATTC
961 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1020
CTAGGGTCGAGAAAGGACTCTCTTTAATCTTGATAACGGTCACTAGGTCTACTCGCTAAG
a D P S S F L R E I R T I A S D P D E R F -
TTCTTCAATGTCACAGATGAGGCTGCTCTGACTGACATTGTGGATGCACTAGGAGATCGG
1021 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1080
AAGAAGTTACAGTGTCTACTCCGACGAGACTGACTGTAACACCTACGTGATCCTCTAGCC
a F F N V T D E A A L T D I V D A L G D R -
ATTTTTGGCCTTGAAGGGTCCCATGCAGAAAACGAAAGCTCCTTTGGGCTGGAAATGTCT
1081 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1140
TAAAAACCGGAACTTCCCAGGGTACGTCTTTTGCTTTCGAGGAAACCCGACCTTTACAGA
a I F G L E G S H A E N E S S F G L E M S -
CAGATTGGTTTCTCCACTCATCGGCTAAAGGATGGGATTCTTTTTGGGATGGTGGGGGCC
1141 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200
GTCTAACCAAAGAGGTGAGTAGCCGATTTCCTACCCTAAGAAAAACCCTACCACCCCCGG
a Q I G F S T H R L K D G I L F G M V G A -
TATGACTGGGGAGGCTCTGTGCTATGGCTTGAAGGAGGCCACCGCCTTTTCCCCCCACGA
1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1260
ATACTGACCCCTCCGAGACACGATACCGAACTTCCTCCGGTGGCGGAAAAGGGGGGTGCT
a Y D W G G S V L W L E G G H R L F P P R -
ATGGCACTGGAAGACGAGTTCCCCCCTGCACTGCAGAACCATGCAGCCTACCTGGGTTAC
1261 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1320
TACCGTGACCTTCTGCTCAAGGGGGGACGTGACGTCTTGGTACGTCGGATGGACCCAATG
a M A L E D E F P P A L Q N H A A Y L G Y -
TCTGTTTCTTCCATGCTTTTGCGGGGTGGACGCCGCCTGTTTCTCTCTGGGGCTCCTCGA
1321 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1380
AGACAAAGAAGGTACGAAAACGCCCCACCTGCGGCGGACAAAGAGAGACCCCGAGGAGCT
a S V S S M L L R G G R R L F L S G A P R -
TTTAGACATCGAGGAAAAGTCATCGCCTTCCAGCTTAAGAAAGATGGGGCTGTGAGGGTT
1381 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1440
AAATCTGTAGCTCCTTTTCAGTAGCGGAAGGTCGAATTCTTTCTACCCCGACACTCCCAA
a F R H R G K V I A F Q L K K D G A V R V -
GCCCAGAGCCTCCAGGGGGAGCAGATTGGTTCATACTTTGGCAGTGAGCTCTGCCCATTG
1441 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500
CGGGTCTCGGAGGTCCCCCTCGTCTAACCAAGTATGAAACCGTCACTCGAGACGGGTAAC
a A Q S L Q G E Q I G S Y F G S E L C P L -
GATACAGATAGGGATGGAACAACTGATGTCTTACTTGTGGCTGCCCCCATGTTCCTGGGA
1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1560
CTATGTCTATCCCTACCTTGTTGACTACAGAATGAACACCGACGGGGGTACAAGGACCCT
a D T D R D G T T D V L L V A A P M F L G -
CCCCAGAACAAGGAAACAGGACGTGTTTATGTGTATCTGGTAGGCCAGCAGTCCTTGCTG
1561 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1620
GGGGTCTTGTTCCTTTGTCCTGCACAAATACACATAGACCATCCGGTCGTCAGGAACGAC
a P Q N K E T G R V Y V Y L V G Q Q S L L -
ACCCTCCAAGGAACACTTCAGCCAGAACCCCCCCAGGATGCTCGGTTTGGCTTTGCCATG
1621 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1680
TGGGAGGTTCCTTGTGAAGTCGGTCTTGGGGGGGTCCTACGAGCCAAACCGAAACGGTAC
a T L Q G T L Q P E P P Q D A R F G F A M -
GGAGCTCTTCCTGATCTGAACCAAGATGGTTTTGCTGATGTGGCTGTGGGGGCGCCTCTG
1681 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1740
CCTCGAGAAGGACTAGACTTGGTTCTACCAAAACGACTACACCGACACCCCCGCGGAGAC
a G A L P D L N Q D G F A D V A V G A P L -
GAAGATGGGCACCAGGGAGCACTGTACCTGTACCATGGAACCCAGAGTGGAGTCAGGCCC
1741 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800
CTTCTACCCGTGGTCCCTCGTGACATGGACATGGTACCTTGGGTCTCACCTCAGTCCGGG
a E D G H Q G A L Y L Y H G T Q S G V R P -
CATCCTGCCCAGAGGATTGCTGCTGCCTCCATGCCACATGCCCTCAGCTACTTTGGCCGA
1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1860
GTAGGACGGGTCTCCTAACGACGACGGAGGTACGGTGTACGGGAGTCGATGAAACCGGCT
a H P A Q R I A A A S M P H A L S Y F G R -
AGTGTGGATGGTCGGCTAGATCTGGATGGAGATGATCTGGTCGATGTGGCTGTGGGTGCC
1861 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1920
TCACACCTACCAGCCGATCTAGACCTACCTCTACTAGACCAGCTACACCGACACCCACGG
a S V D G R L D L D G D D L V D V A V G A -
CAGGGGGCAGCCATCCTGCTCAGCTCCCGGCCCATTGTCCATCTGACCCCATCACTGGAG
1921 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1980
GTCCCCCGTCGGTAGGACGAGTCGAGGGCCGGGTAACAGGTAGACTGGGGTAGTGACCTC
a Q G A A I L L S S R P I V H L T P S L E -
GTGACCCCACAGGCCATCAGTGTGGTTCAGAGGGACTGTAGGCGGCGAGGCCAAGAAGCA
1981 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2040
CACTGGGGTGTCCGGTAGTCACACCAAGTCTCCCTGACATCCGCCGCTCCGGTTCTTCGT
a V T P Q A I S V V Q R D C R R R G Q E A -
GTCTGTCTGACTGCAGCCCTTTGCTTCCAAGTGACCTCCCGTACTCCTGGTCGCTGGGAT
2041 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100
CAGACAGACTGACGTCGGGAAACGAAGGTTCACTGGAGGGCATGAGGACCAGCGACCCTA
a V C L T A A L C F Q V T S R T P G R W D -
CACCAATTCTACATGAGGTTCACCGCATCACTGGATGAATGGACTGCTGGGGCACGTGCA
2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2160
GTGGTTAAGATGTACTCCAAGTGGCGTAGTGACCTACTTACCTGACGACCCCGTGCACGT
a H Q F Y M R F T A S L D E W T A G A R A -
GCATTTGATGGCTCTGGCCAGAGGTTGTCCCCTCGGAGGCTCCGGCTCAGTGTGGGGAAT
2161 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2220
CGTAAACTACCGAGACCGGTCTCCAACAGGGGAGCCTCCGAGGCCGAGTCACACCCCTTA
a A F D G S G Q R L S P R R L R L S V G N -
GTCACTTGTGAGCAGCTACACTTCCATGTGCTGGATACATCAGATTACCTCCGGCCAGTG
2221 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2280
CAGTGAACACTCGTCGATGTGAAGGTACACGACCTATGTAGTCTAATGGAGGCCGGTCAC
a V T C E Q L H F H V L D T S D Y L R P V -
GCCTTGACTGTGACCTTTGCCTTGGACAATACTACAAAGCCAGGGCCTGTGCTGAATGAG
2281 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2340
CGGAACTGACACTGGAAACGGAACCTGTTATGATGTTTCGGTCCCGGACACGACTTACTC
a A L T V T F A L D N T T K P G P V L N E -
GGCTCACCCACCTCTATACAAAAGCTGGTCCCCTTCTCAAAGGATTGTGGCCCTGACAAT
2341 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2400
CCGAGTGGGTGGAGATATGTTTTCGACCAGGGGAAGAGTTTCCTAACACCGGGACTGTTA
a G S P T S I Q K L V P F S K D C G P D N -
GAATGTGTCACAGACCTGGTGCTTCAAGTGAATATGGACATCAGAGGCTCCAGGAAGGCC
2401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2460
CTTACACAGTGTCTGGACCACGAAGTTCACTTATACCTGTAGTCTCCGAGGTCCTTCCGG
a E C V T D L V L Q V N M D I R G S R K A -
CCATTTGTGGTTCGAGGTGGCCGGCGGAAAGTGCTGGTATCTACAACTCTGGAGAACAGA
2461 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2520
GGTAAACACCAAGCTCCACCGGCCGCCTTTCACGACCATAGATGTTGAGACCTCTTGTCT
a P F V V R G G R R K V L V S T T L E N R -
AAGGAAAATGCTTACAATACGAGCCTGAGTATCATCTTCTCTAGAAACCTCCACCTGGCC
2521 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2580
TTCCTTTTACGAATGTTATGCTCGGACTCATAGTAGAAGAGATCTTTGGAGGTGGACCGG
a K E N A Y N T S L S I I F S R N L H L A -
AGTCTCACTCCTCAGAGAGAGAGCCCAATAAAGGTGGAATGTGCCGCCCCTTCTGCTCAT
2581 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2640
TCAGAGTGAGGAGTCTCTCTCTCGGGTTATTTCCACCTTACACGGCGGGGAAGACGAGTA
a S L T P Q R E S P I K V E C A A P S A H -
GCCCGGCTCTGCAGTGTGGGGCATCCTGTCTTCCAGACTGGAGCCAAGGTGACCTTTCTG
2641 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2700
CGGGCCGAGACGTCACACCCCGTAGGACAGAAGGTCTGACCTCGGTTCCACTGGAAAGAC
a A R L C S V G H P V F Q T G A K V T F L -
CTAGAGTTTGAGTTTAGCTGCTCCTCTCTCCTGAGCCAGGTCTTTGGGAAGCTGACTGCC
2701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2760
GATCTCAAACTCAAATCGACGAGGAGAGAGGACTCGGTCCAGAAACCCTTCGACTGACGG
a L E F E F S C S S L L S Q V F G K L T A -
AGCAGTGACAGCCTGGAGAGAAATGGCACCCTTCAAGAAAACACAGCCCAGACCTCAGCC
2761 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2820
TCGTCACTGTCGGACCTCTCTTTACCGTGGGAAGTTCTTTTGTGTCGGGTCTGGAGTCGG
a S S D S L E R N G T L Q E N T A Q T S A -
TACATCCAATATGAGCCCCACCTCCTGTTCTCTAGTGAGTCTACCCTGCACCGCTATGAG
2821 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2880
ATGTAGGTTATACTCGGGGTGGAGGACAAGAGATCACTCAGATGGGACGTGGCGATACTC
a Y I Q Y E P H L L F S S E S T L H R Y E -
GTTCACCCATATGGGACCCTCCCAGTGGGTCCTGGCCCAGAATTCAAAACCACTCTCAGG
2881 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2940
CAAGTGGGTATACCCTGGGAGGGTCACCCAGGACCGGGTCTTAAGTTTTGGTGAGAGTCC
a V H P Y G T L P V G P G P E F K T T L R -
ACTAACAATGCAAGCTGCATAGTGCAGAACCTGACTGAACCCCCAGGCCCACCTGTGCAT
2941 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3000
TGATTGTTACGTTCGACGTATCACGTCTTGGACTGACTTGGGGGTCCGGGTGGACACGTA
a T N N A S C I V Q N L T E P P G P P V H -
CCAGAGGAGCTTCAACACACAAACAGACTGAATGGGAGCAATACTCAGTGTCAGGTGGTG
3001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3060
GGTCTCCTCGAAGTTGTGTGTTTGTCTGACTTACCCTCGTTATGAGTCACAGTCCACCAC
a P E E L Q H T N R L N G S N T Q C Q V V -
AGGTGCCACCTTGGGCAGCTGGCAAAGGGGACTGAGGTCTCTGTTGGACTATTGAGGCTG
3061 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3120
TCCACGGTGGAACCCGTCGACCGTTTCCCCTGACTCCAGAGACAACCTGATAACTCCGAC
a R C H L G Q L A K G T E V S V G L L R L -
GTTCACAATGAATTTTTCCGAAGAGCCAAGTTCAAGTCCCTGACGGTGGTCAGCACCTTT
3121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3180
CAAGTGTTACTTAAAAAGGCTTCTCGGTTCAAGTTCAGGGACTGCCACCAGTCGTGGAAA
a V H N E F F R R A K F K S L T V V S T F -
GAGCTGGGAACCGAAGAGGGCAGTGTCCTACAGCTGACTGAAGCCTCCCGTTGGAGTGAG
3181 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3240
CTCGACCCTTGGCTTCTCCCGTCACAGGATGTCGACTGACTTCGGAGGGCAACCTCACTC
a E L G T E E G S V L Q L T E A S R W S E -
AGCCTCTTGGAGGTGGTTCAGACCCGGCCTATCCTCATCTCCCTGTGGATCCTCATAGGC
3241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3300
TCGGAGAACCTCCACCAAGTCTGGGCCGGATAGGAGTAGAGGGACACCTAGGAGTATCCG
a S L L E V V Q T R P I L I S L W I L I G -
AGTGTCCTGGGAGGGTTGCTCCTGCTTGCTCTCCTTGTCTTCTGCCTGTGGAAGCTTGGC
3301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3360
TCACAGGACCCTCCCAACGAGGACGAACGAGAGGAACAGAAGACGGACACCTTCGAACCG
a S V L G G L L L L A L L V F C L W K L G -
TTCTTTGCCCATAAGAAAATCCCTGAGGAAGAAAAAAGAGAAGAGAAGTTGGAGCAATGA
3361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3420
AAGAAACGGGTATTCTTTTAGGGACTCCTTCTTTTTTCTCTTCTCTTCAACCTCGTTACT
a F F A H K K I P E E E K R E E K L E Q
ATGTAGAATAAGGGTCTAGAAAGTCCTCCCTGGCAGCTTTCTTCAAGAGACTTGCATAAA
3421 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3480
TACATCTTATTCCCAGATCTTTCAGGAGGGACCGTCGAAAGAAGTTCTCTGAACGTATTT
AGCAGAGGTTTGGGGGCTCAGATGGGACAAGAAGCCGCCTCTGGACTATCTCCCCAGACC
3481 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3540
TCGTCTCCAAACCCCCGAGTCTACCCTGTTCTTCGGCGGAGACCTGATAGAGGGGTCTGG
AGCAGCCTGACTTGACTTTTGAGTCCTAGGGATGCTGCTGGCTAGAGATGAGGCTTTACC
3541 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3600
TCGTCGGACTGAACTGAAAACTCAGGATCCCTACGACGACCGATCTCTACTCCGAAATGG
TCAGACAAGAAGAGCTGGCACCAAAACTAGCCATGCTCCCACCCTCTGCTTCCCTCCTCC
3601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3660
AGTCTGTTCTTCTCGACCGTGGTTTTGATCGGTACGAGGGTGGGAGACGAAGGGAGGAGG
TCGTGATCCTGGTTCCATAGCCAACACTGGGGCTTTTGTTTGGGGTCCTTTTATCCCCAG
3661 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3720
AGCACTAGGACCAAGGTATCGGTTGTGACCCCGAAAACAAACCCCAGGAAAATAGGGGTC
GAATCAATAATTTTTTTGCCTAGGAAAAAAAAAAGCGGCCGCGAATTCGATATCAAGCT
3721 ---------+---------+---------+---------+---------+--------- 3779
CTTAGTTATTAAAAAAACGGATCCTTTTTTTTTTCGCCGGCGCTTAAGCTATAGTTCGA
(2) 配列番号3の情報:
(i) 配列特徴:
(A) 配列の長さ: 143 塩基対
(B) 配列の型: 核酸およびアミノ酸
(C) 鎖の数: 二本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(iii) 配列の種類: cDNA
(vi) 起源:
(A)生物名: ヒト
(B) 細胞の種類: 軟骨細胞
(xi) 配列の記載: 配列番号3:
NdeI
|
GGGGCATATGGTTCAGAACCTGGGTTGCTACGTTGTTTCCGGTCTGATCATCTCCGCTCT
1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60
CCCCGTATACCAAGTCTTGGACCCAACGATGCAACAAAGGCCAGACTAGTAGAGGCGAGA
b G H M V Q N L G C Y V V S G L I I S A L -
GCTGCCGGCTGTTGCTCACGGTGGTAACTACTTCCTAAGCTTGTCCCAGGTTATCAGCGG
61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120
CGACGGCCGACAACGAGTGCCACCATTGATGAAGGATTCGAACAGGGTCCAATAGTCGCC
b L P A V A H G G N Y F L S L S Q V I S G -
BamHI
|
CCTGGTGCCGCGCGGATCCCCCC
121 ---------+---------+--- 143
GGACCACGGCGCGCCTAGGGGGG
b L V P R G S P -
Claims (19)
- 配列番号1もしくは配列番号2で示されるアミノ酸配列の断片であって、アミノ酸配列がKLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQである断片からなる組換え型または単離型のインテグリンサブユニットα10の断片。
- 配列番号1もしくは配列番号2で示されるアミノ酸配列の断片であってアミノ酸配列がKLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQである断片からなる組換えインテグリンサブユニットα10の断片の製造方法であって、
a)インテグリンサブユニットα10の上記断片をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドを単離し、
b)単離されたポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターを構築し、
c)宿主細胞をその発現ベクターで形質転換し、
d)形質転換宿主細胞においてインテグリンサブユニットα10の上記断片を発現するに好適な条件下の培地で形質転換宿主細胞を培養し、さらに所望により、
e)形質転換宿主細胞または培養培地からインテグリンサブユニットα10の上記断片を単離する工程を含んでなる方法。 - 配列番号1もしくは配列番号2で示されるアミノ酸配列の断片であってアミノ酸配列がKLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQである断片からなるインテグリンサブユニットα10の断片を製造し、それによりサブユニットがそれが天然に存在する細胞から単離される方法。
- 配列番号1もしくは配列番号2で示されるアミノ酸配列の断片であってアミノ酸配列がKLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQである断片からなるインテグリンサブユニットα10の断片をコードするヌクレオチド配列を含んでなり、ポリヌクレオチドが配列番号1もしくは配列番号2で示されるヌクレオチド配列の一部を含んでなる、単離ポリヌクレオチド。
- インテグリンサブユニットα10の断片であってアミノ酸配列がKLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQである断片をコードするDNAまたはRNAとハイブリダイズするが、インテグリンサブユニットα1をコードするDNAまたはRNAとはハイブリダイズできない、単離ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
- インテグリンサブユニットα10の断片であってアミノ酸配列がKLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQである断片をコードし、配列番号1もしくは配列番号2で示されるヌクレオチド配列の一部からなるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含んでなり、または
インテグリンサブユニットα10の断片であってアミノ酸配列がKLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQである断片をコードするDNAまたはRNAとハイブリダイズするが、インテグリンサブユニットα1をコードするDNAまたはRNAとはハイブリダイズできない、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含んでなる、ベクター。 - 請求項6で定義されたベクターを含む細胞。
- インテグリンサブユニットα10の断片であってアミノ酸配列がKLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQである断片をコードし、配列番号1もしくは配列番号2で示されるヌクレオチド配列の一部からなるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが細胞ゲノムに安定的に組み込まれている、請求項2で定義された方法の工程a)〜d)により作出される細胞。
- 配列番号1もしくは配列番号2のアミノ酸配列を含んでなるインテグリンサブユニットα10の断片であってアミノ酸配列がKLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQである断片に特異的に結合する能力を有する抗体である結合物。
- 細胞質ドメイン、Iドメインおよびスプライシングドメインのペプチドであってアミノ酸配列がKLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQであるペプチドであるインテグリンサブユニットα10の断片の製造方法であって、保護基を含むアミノ酸の一連の付加を含んでなる方法。
- 細胞質ドメイン、Iドメインおよびスプライシングドメインのペプチドであってアミノ酸配列がKLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQであるペプチドであるインテグリンサブユニットα10の断片をコードするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
- 細胞質ドメイン、Iドメインおよびスプライシングドメインのペプチドであってアミノ酸配列がKLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQであるペプチドであるインテグリンサブユニットα10の断片と特異的に結合する能力を有する抗体である結合物。
- ポリクローナルまたはモノクローナル抗体またはその断片である、請求項12記載の結合物。
- 配列番号1もしくは配列番号2で示されるアミノ酸配列を含んでなるインテグリンサブユニットα10、またはサブユニットα10およびサブユニットβを含むインテグリンヘテロ二量体、またはそのインテグリンもしくはサブユニットの断片であってアミノ酸配列がKLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQである断片を、インテグリンサブユニットα10を発現する細胞または組織(この細胞または組織はヒトをはじめとする動物起源のものである)のマーカーもしくは標的分子としてin vitroにおいて使用する方法。
- 細胞が軟骨細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、骨芽細胞および繊維芽細胞からなる群から選択される、請求項14記載のin vitroにおける方法。
- 軟骨細胞の選択および分析、または選別、単離もしくは精製する方法である、請求項14〜15のいずれか1項に記載のin vitroにおける方法。
- インテグリンサブユニットα10、またはそのインテグリンサブユニットの断片であってアミノ酸配列がKLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQである断片の存在を細胞において検出するin vitroにおける方法であって、配列番号1で示されるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、これらがインテグリンサブユニットα1をコードするDNAもしくはRNAとはハイブリダイズできないハイブリダイゼーション条件下でマーカーとして使用される方法。
- インテグリンサブユニットα10またはその断片をコードするDNAまたはRNAを標的分子として使用するin vitroにおける方法であって、
ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、インテグリンサブユニットα10の断片であってアミノ酸配列がKLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQである断片をコードするDNAまたはRNAとハイブリダイズするが、インテグリンサブユニットα1をコードするDNAまたはRNAとはハイブリダイズできない、方法。 - インテグリンサブユニットα10の断片であってアミノ酸配列がKLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQである断片をコードするDNAまたはRNAを含んでなる標的分子であって、
ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、インテグリンサブユニットα10の断片であってアミノ酸配列がKLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQである断片をコードするDNAまたはRNAとハイブリダイズするが、インテグリンサブユニットα1をコードするDNAまたはRNAとはハイブリダイズできない、標的分子。
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