CN108341853B - 人血清白蛋白特异性识别多肽及其应用 - Google Patents

人血清白蛋白特异性识别多肽及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种多肽。根据本发明的实施例，所述多肽包括至少一个人血清白蛋白亲水片段的反义肽，所述人血清白蛋白亲水片段的反义肽具有SEQ ID NO:1～3所示的氨基酸序列。本申请所提出的多肽与HSA具有高选择性和强亲和力，相较于抗体等生物制剂，具有制备合成方法简单，性质稳定，价格低廉等优点，适用于商业化生产。可应用于人血清白蛋白特异性检测，检测准确度、可信度高。

Description

人血清白蛋白特异性识别多肽及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体的，本发明涉及人血清白蛋白特异性识别多肽及其应用。
背景技术
人血清白蛋白(HSA)是血清中含量最多的蛋白质，具有维持血液渗透压和调节血浆pH等重要作用，除此之外，它还是一种可以运输内源、外源物质的转运蛋白。近年来研究表明，具有较长半衰期的HSA易在实体瘤中积累，成为癌症治疗的新思路。[Li,R.；Yang,H.；Jia,D.；Nie,Q.；Cai,H；Fan,Q.；Wan,L.；Li,L.；Lu,X.J.Control.Release2016,228,96-106.]因此发展针对HSA的探针，不仅仅可用来分析HSA含量及构象变化，而且可作为抗癌药物的载体。多肽以其化学结构简单、性质稳定，易于改造和修饰，具有良好的生物相容性，可作为HSA的特异性识别探针。
多肽与蛋白质之间的相互作用广泛存在于生物体的生命过程中，例如信号转导，DNA复制机制，蛋白运输，免疫应答等；同时多肽也可调控蛋白质与蛋白质间的相互作用。目前研究多肽与蛋白质间的相互作用已受到化学、生物及医药领域的广泛关注。了解多肽与蛋白质间的作用机制，发现新的相互作用分子对，在药物检测，疾病治疗及生命分析领域具有极其重要的作用，通过合理化设计多肽可以获得预期的功能，成为分析检测的有力工具。[Healy,A.R.；Houston,D.R.；Remnant,L.；Huart,A.；Brychtova,V.；Maslon,M.M.；Meers,O.；Muller,P.；Krejci,A.；Blackburn,E.A.；Vojtesek,B.；Hernychova,L.；Walkinshaw,M.D.；Westwood,N.J.；Hupp,T.R.Chem.Sci.,2015,6,3109-3116.]
目前，噬菌体展示，肽库和阵列技术为多肽鉴定提供了丰富的资源。核磁共振谱，蛋白质组学以及荧光分子转子等技术已经对已知的蛋白与多肽相互作用进行了有效阐释。以多肽为介导的相互作用具有结合界面小的特点，对外界刺激具有快速而灵敏的响应，这对于操控细胞过程，阻断疾病传播及目标物检测具有重要意义。然而，多肽与蛋白间的亲和力与特异性仍难以与抗原抗体间相互作用相比拟，为多肽在复杂的生物体系中的应用带来挑战。
为了提高分子间的亲和力及特异性，模拟天然蛋白间的相互作用，树枝状分子提供了有效的解决途径。将多个识别单元通过共价键组装于骨架结构，可增强分子间的结合力。目前，多分支多肽已成功应用于小分子抗体模拟、生物成像及药物递送中[Wan,J.；Alewood,P.F.Angew.Chem.Int.Ed.2016,55,5124-5134.]。聚赖氨酸、聚甘油以及聚酰胺的结构可为化学耦合提供分子骨架并可控制分子组装过程的有序进行。多肽配基以及它们的空间取向与表面排列是影响其与目标蛋白亲和力和选择性的关键因素。与针对一个靶点的多分支肽相较，多靶向多肽与目标蛋白质的识别行为仍然是个有待探究的问题，在构建高亲和力、高选择性新型多肽识别探针中具有广阔的前景。
发明内容
本发明的目的是发展对HSA具有高亲和力和高选择性的多肽探针及其应用。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种多肽。根据本发明的实施例，所述多肽包括至少一个人血清白蛋白亲水片段的反义肽，所述人血清白蛋白亲水片段的反义肽具有SEQ ID NO:1～3所示的氨基酸序列。
SHFTIG(SEQ ID NO:1)。
TGDRIL(SEQ ID NO:2)。
SIKLFG(SEQ ID NO:3)。
本申请所提出的多肽与HSA具有高选择性和强亲和力，相较于抗体等生物制剂，具有制备合成方法简单，性质稳定，价格低廉等优点，适用于商业化生产。
根据本发明的实施例，上述多肽还可以进一步具有如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述多肽进一步包括连接肽，具有合适长度和柔性的连接肽可有效增加多肽的自由度，使反义肽与HSA的结合具有更多有效空间；由连接肽偶联的反义肽产生的多靶点协同识别作用可进一步增强对HSA的亲和力与选择性。
根据本发明的实施例，所述连接肽具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
GGGCGGG(SEQ ID NO:8)。
发明人发现，采用具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的连接肽与单分支肽相连，对HSA具有更强的结合力。
根据本发明的实施例，所述多肽进一步包括分子骨架。分子骨架可为多肽的化学合成提供耦合支架，可使化学偶联有序可控进行，并可影响多肽的氨基酸残基的空间取向和分布进而影响其与目标蛋白的结合能力。
根据本发明的实施例，所述分子骨架包括选自聚赖氨酸、聚甘油、聚酰胺和聚乙二醇的至少之一。根据本发明的具体实施例，所述分子骨架优选聚乙二醇。发明人发现，通过聚乙二醇将人血清白蛋白亲水片段的反义肽相连，所得多肽与人血清白蛋白的特异性结合力进一步显著提高。
根据本发明的实施例，所述多肽进一步包括炔丙基甘氨酸。需要说明的是，本申请的炔丙基甘氨酸为炔丙基功能化的甘氨酸，通过在多肽合成过程中直接引入炔丙基功能化的甘氨酸可用于click反应连接具有叠氮基团的手臂分子，如叠氮化的聚乙二醇，用于对多肽进行进一步功能化。
根据本发明的实施例，所述多肽具有SEQ ID NO:4～7所示的氨基酸序列。
TGDRILGGGCGGGTGDRIL(SEQ ID NO:4)。
SIKLFGGGGCGGGSIKLFG(SEQ ID NO:5)。
SIKLFGGGGCGGGTGDRIL(SEQ ID NO:6)。
LIRDGTG-PEG-SIKLFG(SEQ ID NO:7)。
其中，SEQ ID NO：7所示氨基酸序列中，PEG两侧多肽均为N端与PEG相连。具有SEQID NO:4～7所示的氨基酸序列的多肽分别为相同两个人血清白蛋白亲水片段的反义肽或不同两个人血清白蛋白亲水片段的反义肽相连获得的，相比于对应的仅具有一个人血清白蛋白亲水片段的反义肽的多肽，与HSA亲和力进一步显著提高。
根据本发明的实施例，所述多肽具有式I～式VII所示的结构。
Figure GDA0003172901920000031
Figure GDA0003172901920000041
Figure GDA0003172901920000051
其中，SEQ ID NO:1所示氨基酸序列对应式I所示的结构的多肽，SEQ ID NO:2所示氨基酸序列对应式II所示的结构的多肽，SEQ ID NO:3所示氨基酸序列对应式III所示的结构的多肽，SEQ ID NO:4所示氨基酸序列对应式IV所示的结构的多肽，SEQ ID NO:5所示氨基酸序列对应式V所示的结构的多肽，SEQ ID NO:6所示氨基酸序列对应式VI所示的结构的多肽，SEQ ID NO:7所示氨基酸序列对应式VII所示的结构的多肽。具有式I～式VII所示的结构的多肽具有与HSA的高亲和力和高选择性。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种多肽偶联物。根据本发明的实施例，所述多肽偶联物包括前面任一项所述的多肽和载体。利用根据本发明实施例的多肽偶联物，可特异性检测人血清白蛋白。
根据本发明的实施例，上述多肽偶联物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述载体的类型不受特别限制，可根据具体的实验目的进行选择。如本发明的载体可包括选自药物、毒素、细胞因子、放射性元素、载体蛋白、酶、凝集素、荧光基团和量子点的至少之一。
根据本发明的具体实施例，所述载体为药物。
根据本发明的具体实施例，所述药物为阿霉素。当药物为阿霉素时，可通过HSA的结合延长阿霉素药效时间。
根据本发明的具体实施例，所述荧光基团可为异硫氰酸荧光素(FITC)，用异硫氰酸荧光素为载体获得的偶联物可以通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测HSA蛋白。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括前面所述的多肽或前面所述的多肽偶联物。利用本发明的试剂盒，可高效、特异性地检测人血清白蛋白。
在本发明的第四方面，本发明提出了前面所述的多肽或前面所述的多肽偶联物在制备药物中的用途，所述药物用于结合人血清白蛋白或检测人血清白蛋白。如前所述，本发明所提出的多肽具有与HSA的高亲和力和高选择性。利用本申请所提出的多肽或多肽偶联物所制备的药物，用于检测人血清白蛋白具有准确性高、可信度高的特点。
在本发明的第五方面，本发明提出了制备前面所述的多肽的方法。该制备方法具有操作简单，所得多肽性质稳定，制备材料价格低廉等优点，适用于商业化生产。
附图说明
图1是根据本发明实施例的多肽7的合成路线图；
图2是根据本发明实施例的单分支肽(1,2,3)与HSA相互作用的SPRi传感谱图；
图3是根据本发明实施例的单分支肽2,3及同分支肽4,5与HSA相互作用的SPRi传感谱图；
图4是根据本发明实施例的各多肽与anti-HSA-FITC竞争结合HSA的荧光统计柱状图；
图5是根据本发明实施例的生物活性物质与异分支肽7相互作用的SPRi传感谱图；
图6是根据本发明实施例的HSA与BSA分子模拟结构分析图；
图7是根据本发明实施例的异分支肽7抑制anti-HSA-FITC与HSA结合的抑制活性图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
HSA的晶体结构数据表明，HSA具有三个结构域，进而发明人选择位于HSA三个不同区域的三个表面片段T1-T3(London,N.；Movshovitz-Attias,D.；Schueler-Furman,Ora.Structure,2010,18,188-199.)(82-87；268-273；499-504)作为靶标，通过正反义肽识别原理(Heal,J.R.；Roberts,G.W.；Raynes,J.G.；Bhakoo,A.；Miller,A.D.ChemBioChem.2002,3,136-151.)，设计合成了一系列线性多肽，分别命名为1,2,3；同分支肽命名为4,5及异分支肽命名为6,7。其序列见表1。
表1：人血清白蛋白亲水片段三个位点和各特异性多肽序列
Figure GDA0003172901920000061
Figure GDA0003172901920000071
采用化学合成的方法制备本发明设计的多肽，即固相合成的方法(Boc方法或FMOC方法)[E.Atherton,R.C.Sheppard,“Solid Phase Peptide Synthesis:A PracticalApproach”,IRL Press,Oxford,England,1989]。对于多肽1-6具体合成法：将侧链保护的氨基酸通过酰胺键逐个偶联在固相树脂上，利用强酸将合成的多肽从树脂上裂解，同时去除侧链保护基团。
多肽7由炔基、叠氮基团耦合的click方法实现。利用固相合成法分别在多肽2,3的氨基端连接带有Fmoc保护的炔丙基甘氨酸和带有叠氮基团的24聚聚乙二醇(PEG)，强酸裂解，得到炔丙基甘氨酸-2及PEG-3，利用常规的click反应将功能化的多肽炔丙基甘氨酸-2的炔基及PEG-3的PEG功能化的叠氮基偶联，得到多肽7，合成路线如图1所示。
下述实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例 与人血清白蛋白特异性结合的多肽
1)单分支线性肽与HSA相互作用表征
将修饰了半胱胺(带有巯基)的单分支肽1,2,3溶解于pH＝7.40磷酸盐缓冲液(150mMPBS)中，配置为浓度是0.0013mol/L的多肽溶液，将3种多肽溶液滴在SPRi芯片表面，每种肽平行滴三个样品点，4℃孵育12h，利用Au-S键将多肽固定于SPRi芯片表面，用PBS、水清洗未反应的多肽溶液后，将芯片投入到5％(m/v)牛奶/PBS溶液中，4℃孵育12h用以封闭裸露芯片未反应的位点。使用前用PBS和水再次清洗芯片。
利用Plexarray HT系统进行SPRi的数据采集，溶液的流速为2μL/s，首先通入PBS溶液得基线，随后将溶于PBS不同浓度的HSA溶液(9.4μM,18.8μM,37.5μM,75.3μM)通入到修饰单分支肽的芯片表面300秒用以考察单分支肽(1,2,3)与HSA的结合情况，再依次通PBS及0.5％(v/v)磷酸溶液各300秒，用以解离及洗脱结合的HSA。利用PlexArray HT软件记录实时数据，结果如图2所示，传感图谱表明，1,2,3与HSA结合引起不同强度的信号响应，表明三条肽与HSA相互作用力强弱不同，2,3与HSA结合相比于1具有更强的信号响应；通过BIAevalution 4.1软件拟合，可知2,3与HSA具有较强的结合能力。结果如表2所示。
表2：各肽与HSA结合常数
多肽 k<sub>a</sub>(×10<sup>2</sup>M·s<sup>-1</sup>) k<sub>d</sub>(×10<sup>-3</sup>s<sup>-1</sup>) K<sub>D</sub>(μM)
1 0.72±0.04 31.4±5 432.5±48.5
2 1.60±0.01 11.6±0.2 72.15±2.05
3 2.35±0.03 4.66±0.35 19.75±0.45
4 13.7±1.65 29.7±0 21.9±2.7
5 39.4±0.18 22.7±1.7 5.38±0.68
6 7.67±0.02 2.55±0.005 3.32±0.02
7 126.3±13.7 0.91±0.02 0.073±0.01
2)同分支肽与HSA相互作用表征
实例一、1)中方法将单分支肽2,3，同分支肽4,5固定于SPRi芯片表面，获得多肽功能化修饰的SPRi传感芯片。整个体系的溶液流速为2μL/s。通入PBS溶液得基线，随后在表面通入2.4μM的HSA/PBS溶液300秒，记录HSA与各肽结合信号，而后通入300秒PBS及300秒0.5％(v/v)磷酸水溶液分别用于解离及洗脱与多肽相互作用的HSA。PlexArray HT软件记录实时数据，结果如图3所示。传感数据结果表明HSA与同分支肽4,5的信号响应强度分别强于单分支肽2,3，通过BIAevalution 4.1软件拟合结果如表2，与HSA的结合：KD4<KD2；KD5<KD3，表明同分支肽相比于单分支肽具有更强的结合能力。
3)异分支肽与HSA相互作用表征
将HSA溶于碳酸盐溶液(0.1M,pH＝9.6)中，浓度为5％(w/v)。在96孔板加入HSA碳酸盐溶液，每孔100μL，4℃孵育12h。之后分别用含0.05％Tween-20(v/v)PBS溶液、PBS清洗96孔板1次及2次(250μL/孔)。将0.15mM的相关多肽(100μL/孔)，加入到包被有HSA的96孔板中，每个样品平行3个孔，37℃孵育2h，随后用PBS溶液清洗3次，将100μL浓度为10μg/mL的FITC标记的HSA抗体(anti-HSA-FITC)加入到上述孔中，37℃条件下避光孵育1h,使anti-HSA-FITC与不同种的多肽竞争性结合HSA，用PBS清洗3次。利用SpectraMax M5 Microplatereader采集525nm处各个孔的荧光强度(激发波长为490nm，发射波长为525nm)。将HSA与anti-HSA-FITC孵育的荧光值定义为100％，各孔读出的荧光强度与之相比。如图4，a,b,c,d,e,f,g,h,i,j,k分别为anti-HSA-FITC，1,2,3,4,5,6,PEG链，炔丙基甘氨酸-2，PEG-3及7。各多肽均能使anti-HSA-FITC荧光产生不同程度的降低，其中以PEG为手臂的异分支多肽7使anti-HSA-FITC荧光降低为原值的28％，显示出与HSA最强的结合能力。
利用SPRi进一步测定异分支肽与HSA的相互作用。
将11-巯基烷酸(MUA)配制浓度为10mM的乙醇溶液。将SPRi芯片浸没在MUA乙醇溶液中，4℃孵育12h，MUA通过Au-S键自组装于SPRi芯片表面。在乙醇清洗掉未反应的MUA后，用0.2M的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)全称及0.05M的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(均溶于pH＝6，10mM磷酸盐缓冲液)在室温下活化羧基15min，用水清洗芯片表面，将7滴在羧基活化区域，4℃反应12h。经PBS、水清洗后，用1M pH＝7的乙醇胺4℃封闭12h。制备异分支肽7修饰的SPRi芯片。
按照实例一中的步骤1)通入不同浓度的HSA溶液，并计算7与HSA结合的KD值，结果为0.073±0.01μM(如表2所示)，而异分支肽6与HSA平衡解离常数KD为3.32±0.02μM。可能的原因：Autodock测定HSA中的靶点2(T2)和靶点3(T3)间距离为
Figure GDA0003172901920000091
以此长度作为直径，其半圆的周长为
Figure GDA0003172901920000092
而PEG的长度为
Figure GDA0003172901920000093
为7与HSA的结合提供了足够的自由度，7可同时与HSA的两个位点T2和T3识别，结合速率加快的同时减慢了解离速率，故7与HSA具有较高的亲和力。而6的GGGCGGG的长度只有
Figure GDA0003172901920000094
其距离不能满足同时结合一个HSA分子上T2与T3的要求，故结合能力弱于7。
实例二、7对HSA的高选择性
利用实例一、3)中的异分支肽7修饰的SPRi芯片对7与生物分子间的相互作用进行表征。体系的溶液、流速、基线的获得、解离及洗脱条件同实例一中3)。在7功能化的芯片表面通入3.76μM的葡萄糖、谷胱甘肽、脱氧核糖核苷、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、牛血清白蛋白(BSA)。其SPRi传感信号如图5。由此可知，7对HSA具有良好的选择性。值得一提的是BSA与HSA在结构上有76％相似度，如图6a，6b，但7对HSA仍有很好的选择性，通过分析可知，对于靶点2，HSA和BSA分别是QDSISS及QDTISS。虽然两段多肽在序列及结构上有很强的相似性，但晶体结构显示，HSA的靶点2呈伸展状，而BSA呈螺旋状，伸展态与多肽具有较大的结合面积。对于靶点3，HSA和BSA分别为PKEFNA及PKAFDE，虽然两段肽均呈伸展状态，但BSA中的天冬氨酸使肽段带有更多的负电荷。而且多肽中的谷氨酸(E)与丙氨酸(A)的不同，会影响多肽的识别能力。综上，7对HSA具有高选择性。
实例三、7对anti-HSA-FITC的半效抑制活性
在96孔板上包被10μg/mL的HSA碳酸盐溶液(0.1M,pH＝9.6)，4℃孵育12h，其清洗步骤同实例一、1)。将7以100μL/孔、浓度从5nM至100μM的磷酸盐缓冲溶液(PBS)加入至HSA包被的96孔板中，每个浓度平行三组，37℃孵育2h，清洗。而后将5μg/mL的anti-HSA-FITC磷酸盐缓冲液加入7孵育后的孔中，37℃避光孵育1h，清洗，设定激发波长为490nm，发射波长为525nm，利用SpectraMax M5 Microplate reader读出荧光值。如图7，纵坐标为各孔荧光强度值与anti-HSA-FITC与HSA结合后荧光强度比(I/I0)。当anti-HSA-FITC的荧光强度减弱至初始值0.5倍时，7的浓度为83nM，即半效抑制浓度IC50＝83nM。表明7与HSA具有良好的结合能力。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院化学研究所
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Ser Ile Lys Leu Phe Gly
1 5
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 多肽的氨基酸序列
<400> 4
Thr Gly Asp Arg Ile Leu Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Thr Gly Asp
1 5 10 15
Arg Ile Leu
<210> 5
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 多肽的氨基酸序列
<400> 5
Ser Ile Lys Leu Phe Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Ser Ile Lys
1 5 10 15
Leu Phe Gly
<210> 6
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 多肽的氨基酸序列
<400> 6
Ser Ile Lys Leu Phe Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Thr Gly Asp
1 5 10 15
Arg Ile Leu
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 连接有PEG的多肽的氨基酸序列，其中，PEG两侧多肽均为N端与PEG相连
<400> 7
Leu Ile Arg Asp Gly Thr Gly -PEG- Ser Ile Lys Leu Phe Gly
1 5 10

Claims (8)

1.一种化合物，其特征在于，所述化合物为式IV～式VII所示的结构，
Figure FDA0003503397110000011
2.一种偶联物，其特征在于，包括权利要求1所述的化合物和载体，所述化合物和所述载体偶联形成所述偶联物。
3.根据权利要求2所述的偶联物，其特征在于，所述载体包括选自药物、毒素、细胞因子、放射性元素、载体蛋白、酶、凝集素、荧光基团和量子点的至少之一。
4.根据权利要求2所述的偶联物，其特征在于，所述载体为药物。
5.根据权利要求2或3所述的偶联物，其特征在于，所述药物为阿霉素。
6.根据权利要求3所述的偶联物，其特征在于，所述荧光基团为异硫氰酸荧光素。
7.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的化合物或权利要求2～6任一项所述的偶联物。
8.权利要求1所述的化合物或权利要求2～6任一项所述的偶联物在制备药物中的用途，所述药物用于结合人血清白蛋白或检测人血清白蛋白。
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