KR20120093151A

KR20120093151A - 개선된 바이오폴리머의 스크리닝

Info

Publication number: KR20120093151A
Application number: KR1020127003914A
Authority: KR
Inventors: 제임스 알. 히스; 이수성; 임재홍; 차준회; 실비아 탄; 쉬 윤 여; 이 리 앙; 이란 장
Original assignee: 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치
Priority date: 2009-07-15
Filing date: 2010-07-15
Publication date: 2012-08-22
Also published as: CN102498123A; EP2454269A4; WO2011008173A1; EP2454269A1

Abstract

본 발명은 바이오폴리머의 샘플링, 특히 바이오폴리머의 분획 샘플링과 관련한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 요지에 따라, 실시양태는 일반적으로 독특한 바이오폴리머 종에 관한 것이고, 여기서 각 바이오폴리머 종의 분획은 절단 가능한 링커를 함유한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 바이오폴리머 종은 표면에 부착될 수 있다. 예를 들면, 바이오폴리머 종은 비드에 부착될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 독특한 바이오폴리머 종의 일부는 절단 가능한 링커를 절단함으로써 샘플링될 수 있다. 어떤 경우에, 샘플은 바이오폴리머의 서열을 결정하기 위해 분석될 수 있다.

Description

개선된 바이오폴리머의 스크리닝{IMPROVED SCREENING OF BIOPOLYMERS}

본 특허출원은, 히드(Heath) 일행에 의해 "Differentiation of Isobaric Amino Acids and Other Species"란 명칭으로 2009년 7월 22일 출원된 국제출원 번호 PCT/SG2009/000258 및 "Method for the Improved Screening of Bead-Based Peptide and Peptide Mimetic Libraries Using Partially Cleavable Peptides"란 명칭으로 2009년 7월 15일 출원된 미국 임시 특허출원 번호 61/225,881의 내용을 청구하며, 상기 두 출원은 본 명세서에서 참고로 하고 있다.

본 발명은 바이오폴리머의 샘플링, 특히 바이오폴리머의 분획 샘플링 (fractional sampling)과 관련한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

분할-혼합 (split-and-mix) 합성법은 개별적인 펩티드 분자를 함유하는 각각의 작은 비드 상에 펩티드 라이브러리 (libraries)를 생성하는 데 이용되어 왔다. 이러한 라이브러리는 1-비드-1-화합물 (one-bead-one-compound, OBOC) 라이브러리라 불리운다. OBOC 라이브러리는 관심있는 일부 기능을 수행하는 라이브러리로부터 분자를 확인하는 데 일반적으로 이용된다. 일 예로서, OBOC 라이브러리는 단백질과 연합되는 비드 ("히트(hit)" 비드)에 대한 라이브러리를 스크리닝함으로써 특정 단백질에 결합하는 분자 (즉 펩티드)를 확인하는 데 사용될 수 있다. 히트 비드는 라이브러리의 잔류물 (rest)로부터 분리될 수 있고, 그리고 특정 히트 비드 상의 펩티드는 펩티드 서열화 전략 (sequencing strategy)을 이용함으로써 결정될 수 있다.

본 발명은 바이오폴리머의 샘플링, 특히 바이오폴리머의 분획 샘플링에 관한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

본 발명의 하나의 특징에 의하면 조성물이 제공된다. 본 발명의 조성물은 제1 바이오폴리머와 제2 바이오폴리머의 혼합물을 포함하는 데, 여기서 제2 바이오폴리머는, 제2 바이오폴리머가 절단 가능한 링커를 함유하는 1 또는 그 이상의 부위(location)를 제외하고는 제1 바이오폴리머와 동일하다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 제1 바이오폴리머와 제2 바이오폴리머는 각각 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 제1 바이오폴리머와 제2 바이오폴리머는 각각 핵산 서열을 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 제1 바이오폴리머와 제2 바이오폴리머는 각각 다당류를 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 메티오닌이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 제1 바이오폴리머와 제2 바이오폴리머는 표면에 부착된다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 표면은 입자의 외부 표면이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 제1 바이오폴리머 대 제2 바이오폴리머의 비는 1:1보다 크다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 조성물은 각 혼합물이 별도의 입자에 부착되는 다수의 상기 혼합물을 더 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 제1 바이오폴리머는 앵커(anchor) 아미노산 서열과 N-말단 아미노산 서열 연장(extension)을 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 제1 바이오폴리머는 앵커 아미노산 서열과 C-말단 아미노산 서열 연장을 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 제2 바이오폴리머는 제1 바이오폴리머보다 더 긴 적어도 하나의 서브유닛(subunit)이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 제2 바이오폴리머는 제1 바이오폴리머보다 적어도 1 이상의 아미노산을 더 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 제2 바이오폴리머는 제1 바이오폴리머와 동일한 수의 아미노산을 갖는다.

본 발명의 또 다른 특징에 의하면 바이오폴리머의 샘플링, 특히 바이오폴리머의 분획 샘플링에 관한 방법이 제공된다. 본 발명의 방법은 표면상에 바이오폴리머를 성장시키는 것을 포함하는데, 이 성장 단계에서 절단 가능한 링커 전구체가 바이오폴리머를 함유하는 배지에 첨가되고 바이오폴리머 속으로 혼입되어, 표면상에 성장된 바이오폴리머의 일부만이 절단 가능한 링커 전구체로부터 유도된 절단 가능한 링커를 함유하게 된다.

본 발명의 또 다른 특징의 방법에 의하면, 표면에 부착된 바이오폴리머의 일부만이 절단 가능한 링커를 함유하도록, 다수의 바이오폴리머를 적어도 하나의 표면과 혼합하고 다수의 바이오폴리머를 적어도 하나의 표면에 부착하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커 전구체는 적어도 하나의 아미노산을 포함한다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 서열상의 반응 중심(center)과 관련하여 1 당량 미만의 절단 가능한 링커 전구체가 배지에 첨가된다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 배지는 절단 가능한 링커와 분별할 수 있는 아미노산 전구체를 더 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 아미노산 전구체 대 절단 가능한 링커 전구체의 비는 1:1보다 크다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 아미노산 전구체 대 절단 가능한 링커 전구체의 비는 5:1보다 크다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 아미노산 전구체는 제1 보호기를 포함하고, 그리고 절단 가능한 링커 전구체는 제1 보호기와 다른 제2 보호기를 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 다수의 개별 입자상에서 바이오폴리머를 성장시키는 것을 포함하는데, 여기서 각 입자는 독특한 바이오폴리머를 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징에 의하면 조성물이 제공되는데, 이 조성물은 결합 영역(binding region)과 절단 가능한 링커를 함유하는 바이오폴리머를 포함하며, 여기서 결합 영역과 절단 가능한 링커는 표적 종(target species)에 대한 결합 영역의 결합 친화력을 감소하는 데 충분한 거리를 20% 미만까지 분리된다.

본 발명의 또 다른 특징에 의하여 제공되는 조성물은, 결합 영역과 절단 가능한 링커를 함유하는 바이오폴리머를 포함하며, 여기서 결합 영역과 절단 가능한 링커가 2 이상의 바이오폴리머 서브유닛에 의해 분리된다.

본 발명의 또 다른 특징에 의하여 제공되는 조성물은, 결합 영역과 절단 가능한 링커를 함유하는 바이오폴리머를 포함하며, 여기서 절단 가능한 링커가 바이오폴리머의 말단에 있는 5개의 바이오폴리머 서브유닛 내에 위치하고 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 결합 영역은 항원결정인자(epitope)이다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 결합 영역과 절단 가능한 링커는 적어도 2개의 바이오폴리머 서브유닛에 의해 분리된다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 바이오폴리머는 아미노산 서열을 포함하는 데, 여기서 절단 가능한 링커는 아미노산 서열의 C-말단에 있는 5개의 아미노산 내에 위치한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 제1 다수의 바이오폴리머는 표면에 부착된다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 제2 다수의 바이오폴리머는 표면에 부착되고, 여기서 제2 다수의 바이오폴리머는, 제2 다수의 바이오폴리머들 중 바이오폴리머가 절단 가능한 링커를 함유하는 1 또는 그 이상의 부위를 제외하고는, 제1 다수의 바이오폴리머와 동일하다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 조성물은 각 바이오폴리머가 별도의 입자에 부착되는 독특한 바이오폴리머의 라이브러리를 더 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징에 의하면, 바이오폴리머의 라이브러리를 스크리닝하는 방법이 제공된다. 이 방법은, 다수의 입자들 중 각 입자가 독특한 제1 바이오폴리머와 절단 가능한 링커를 갖는 독특한 제2 바이오폴리머를 포함하는 다수의 입자를 제공하는 단계와, 상기 다수의 입자를 표적과 접촉하는 단계와, 임계치 이상으로 표적과 결합하는 다수의 입자의 멤버를 분리하는 단계와, 다수의 입자들의 분리된 멤버 상에 있는 절단 가능한 링커를 절단하여 제2 바이오폴리머의 단편 (fragment)을 방출하는 단계와, 제2 바이오폴리머의 단편의 서열을 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징에 의하면 라이브러리가 제공된다. 라이브러리는 다수의 입자를 포함하며, 여기서 각 입자에는 제1 바이오폴리머와 제2 바이오폴리머가 부착되며, 제2 바이오폴리머는, 제2 바이오폴리머가 절단 가능한 링커를 함유하는 1 또는 그 이상의 부위를 제외하고 제1 바이오폴리머와 동일하다.

이하, 본 발명의 기타 장점과 신규한 특징들을 첨부 도면을 참고로 본 발명의 여러 실시양태를 통해 설명하는 데, 이러한 실시양태는 본 발명을 제한하는 것은 아니다. 별도 언급이 없는 한, 본 명세서에서 인용된 모든 참고문헌은 본 발명에서 참고로 하는 것뿐이다. 본 명세서와 참고문헌에 인용된 서류가 모순되거나 불일치하는 경우에, 본 명세서가 우선한다.

첨부 도면을 참고로, 본 발명의 실시양태를 실시예에 의해 비제한적으로 설명한다. 도면은 개략적인 것이며 일정 비율로 작성된 것이 아니다. 도면에서 도시된 동일하거나 거의 동일한 각각의 요소는 통상적으로 단순한 숫자로 나타냈다. 의미를 분명하게 하기 위해서, 모든 도면에서 매 요소마다 칭호를 붙이지 않고, 본 발명의 각 실시양태의 매 요소마다 표시를 하지 않았다. 본 기술 분야의 숙련자가 본 발명을 이해할 수 있도록 하기 위해서 도해는 필요하지 않다.
도 1은 절단 가능한 링커(cleavable linker)를 갖는 제1 바이오폴리머와 제2 바이오폴리머가 부착된 입자를 나타낸다.
도 2는, 본 발명의 일 실시양태에 따라, 첨가된 시약을 한정함으로써 특정 위치에서 메티오닌의 분획량(fractional amounts)을 함유하는 비드를 생성하는 2 가지 방법을 나타낸다.
도 3은, 본 발명의 일 실시양태에 따라, 미리 혼합된 아미노산 시약을 사용함으로써 특정 위치에서 메티오닌의 분획량을 함유하는 비드를 생성하는 2 가지 방법을 나타낸다.
도 4는, 본 발명의 일 실시양태에 따라, 펩티드 Ac-Phe-Leu-호모세린 락톤의 양을 달리하여 액체 크로마토그라피(LC)를 수행함으로써 얻어진 표준 측정 곡선을 나타내며, 여기서 상기 락톤은 완전 포화(=100%)에 대해 정확한 분획 커플링 (fractional coupling)을 달성하는데 사용되었다.
도 4A는 표준 펩티드의 상대 량의 함수로서 얻어진 액체 크로마토그라피 데이터를 나타낸다. 각 크로마토그램에서, 합쳐진 피크 영역 ("Area" 아래의 수), 뿐만 아니라 사용된 % 펩티드("펩티드" 아래의 수)는 표준 펩티드 용액을 희석함으로써 얻어진 것이다.
도 4B는 액체크로마토그래피(LC) 실행을 위해 % 펩티드에 대해 절단된 펩티드 (상대적 측정)의 측정 양을 나타낸 그래프이다. 상기 영역은 이중 결합법에 의해 얻어진 완전 포화도(=100%)의 값에 대해 표준 치로 하였다.
도 5는, 본 발명의 일 실시양태에 따라, 3 형태의 비드에서 메티오닌의 가변적 분획(variable fractions)으로부터 CNBr 절단에 의해 얻어진 펩티드 Ac-Phe-Leu-호모세린 락톤의 크로마토그램을 나타낸다.
도 6은, 본 발명의 일 실시양태에 따라, 10% 절단 가능한 링커를 갖는 단일 비드로부터 서열화하는 것을 나타내는데,
도 6A는 N-말단 (선형의 경우)에서, 10% 메티오닌을 통해 골격 (HLYFLR) (SEQ ID NO. 1)에 연결된 6 펜타머 펩티드로부터 얻어진 대표적인 MS 스펙트럼 및 서열화 결과를 나타내며,
도 6B는 중간 지점 (부기된 경우)에서, 10% 메티오닌을 통해 골격 (HLYFLR) (SEQ ID NO. 1)에 연결된 6 펜타머 펩티드로부터 얻어진 대표적인 MS 스펙트럼 및 서열화 결과를 나타낸다.
도 7A는, 본 발명의 일 실시양태에 따라, 15% 메티오닌 링커의 펩티드 라이브러리로 스크린된 45 히트 비드로부터 얻어진 위치-의존 히스토그램을 나타내고,
도 7B는, 본 발명의 일 실시양태에 따라, 100% 메티오닌 링커의 펩티드 라이브러리로 스크린된 48 히트 비드로부터 얻어진 위치-의존 히스토그램을 나타낸다. 도 7에서 각 히스토그램은 100 mg의 비드를 스크리닝함으로써 얻어졌다.
도 8A는, 본 발명의 일 실시양태에 따라, 15% 메티오닌 링커의 펩티드 라이브러리로 스크린된 37 히트 비드로부터 얻어진 위치-의존 히스토그램을 나타내고,
도 8B는, 본 발명의 일 실시양태에 따라, 100% 메티오닌 링커의 펩티드 라이브러리로 스크린된 32 히트 비드로부터 얻어진 위치-의존 히스토그램을 나타낸다. 도 8에서 각 히스토그램은 100 mg의 비드를 스크리닝함으로써 얻어졌다.
도 9는, 본 발명의 일 실시양태에 따라, bCAII 및 hCAII를 향한 헥사머-1 및 데카머-Nl의 구조 (도 9A); SPR 센서그램(sensograms) (도 9B); 및 도트 블롯(dot blot) 실험(도 9C)을 나타낸다.
도 10A는, 본 발명의 일 실시양태에 따라, 초기 앵커 헥사머-2로부터 3개의 N-말단 연장된 데카머 펩티드로의 전체적인 플로우를 나타내고,
도 10B는, 본 발명의 일 실시양태에 따라, CAII에 대해 헥사머-2 및 시중 상품의 폴리클론 항체와 비교한 3개의 데카머 펩티드의 도트 블롯 실험을 나타낸다.
도 11A는, 본 발명의 일 실시양태에 따라, 초기 앵커 헥사머-2로부터 3 C-말단 연장된 데카머 펩티드까지의 전체적인 플로우를 나타내고,
도 11B는, 본 발명의 일 실시양태에 따라, CAII에 대해 헥사머-2 및 시중 상품의 폴리클론 항체와 비교한 3개의 데카머 펩티드의 도트 블롯 실험을 나타낸다.
도 12A는, 본 발명의 일 실시양태에 따라, 초기 앵커 헥사머-2로부터 2개의 연장된 펩티드 데카머-N2 및 데카머-C2를 통해 조합된 펩티드 테트라데카머-N2C까지의 전체적인 플로우를 나타내고,
도 12B는, 본 발명의 일 실시양태에 따라, 앵커 모티프를 갖지 않는 2개의 펩티드 및 CAII에 대한 시중 상품의 폴리클론 항체와 함께, 헥사머-2, 데카머-N2, 데카머-C2와 비교한 테트라데카머-N2C의 도트 블롯 실험을 나타낸다.
도 13은, 본 발명의 일 실시양태에 따라, 항체를 대체할 수 있는 멀티 리간드-형 포획제(captures agents)를 효과적으로 생성하기 위해 여러 지점에서 동시 연장(synchronous elongation)의 플로우차트를 나타낸다.
도 14는, 본 발명의 일 실시양태에 따라, 헥사머-2의 SPR 센서그램 (도 14A); 데카머-C2의 SPR 센서그램(도 14B); 데카머-N2의 SPR 센서그램(도 14C); 및 테트라데카머-N2C의 SPR 센서그램(도 14D)을 나타낸다. 부동화를 위한 R_max 는 RU=1,000이었다. 농도는 l μM 내지 8 nM이었다.
도 15는, 본 발명의 일 실시양태에 따라, RYRR-G₆-WRYP (SEQ ID NO. 2)의 SPR 센서그램(도 15A); RYRR-PEG₄-WRYP (SEQ ID NO. 3)의 SPR 센서그램(도 15B); RYRR (SEQ ID NO. 4)의 SPR 센서그램(도 15C); 및 WRYP (SEQ ID NO. 5)의 SPR 센서그램(도 15D)을 나타낸다. 부동화를 위한 R_max 는 RU=1,000이었다. 농도는 l μM 내지 8 nM이었다.

본 발명은 바이오폴리머의 샘플링, 특히 바이오폴리머의 분획 샘플링과 관련된 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 일 요지에서, 실시양태는 일반적으로 각 바이오폴리머 종의 분획이 절단 가능한 링커를 함유하는 독특한 바이오폴리머 종과 관련된다. 바이오폴리머 종은, 본 발명의 일부 실시양태에서, 표면에 부착될 수 있다. 예를 들면, 바이오폴리머 종은 비드에 부착될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 독특한 바이오폴리머 종의 일부는 절단 가능한 링커를 절단함으로써 샘플링될 수 있다. 어떤 경우에, 샘플은 바이오폴리머의 서열을 결정하기 위해 분석될 수 있다.

본 발명의 일 요지에서, 바이오폴리머 종의 일 부분을 절단하는 실시양태를 제공한다. 예를 들면, 어떤 경우에는 바이오폴리머 종의 기타 분자들을 절단 가능한 링커가 거의 없는 상태로 남겨 놓으면서 절단 가능한 링커를 바이오폴리머 종의 일부 분자들 속으로 혼입하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 절단 가능한 링커는, 본 발명의 일부 실시양태에서, 표적 종에 대한 바이오폴리머 종의 결합 강도에 영향을 미칠 수 있다. 그러므로 바이오폴리머 종의 샘플이 수집되고 나머지 바이오폴리머 종으로 하여금 절단 가능한 링커가 거의 없게 하여 바이오폴리머 종과 표적 종의 결합에 사실상 영향을 미치지 않도록 하기 위해, 바이오폴리머 종의 적어도 일부로 하여금 절단될 수 있도록 하는 것이 바람직할 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 바이오폴리머 종을 절단하면 바이오폴리머 종의 샘플을 수집할 수 있게 한다. 바이오폴리머 종의 정체, 또는 바이오폴리머 종 내에 있는 영역의 정체가 알려져 있지 않을 때, 바이오폴리머 종을 절단하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 바이오폴리머 종의 샘플은 바이오폴리머 종의 정체를 결정하기 위해 분석될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 일부 실시양태에서, 바이오폴리머 종은 하기에서 더욱 상세히 설명되는 바와 같이 서열화될 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 바이오폴리머 종은 표면에 부착될 수 있다. 표면은 적당한 표면이라면 어떠한 것도 무방하다. 어떤 경우에, 표면은 금속, 메탈로이드, 세라믹 또는 폴리머를 포함해도 좋다. 예를 들면, 어떤 경우에 표면은 금, 은, 실리콘, 또는 유리(예를 들면, 조절된 기공 유리)를 포함해도 좋다. 일부 실시양태에서, 표면은 중합성이 있어도 좋다. 예를 들면, 표면은 비분해성(non-degradable) 또는 분해성 폴리머를 포함해도 좋다. 본 발명의 일 실시양태에서, 표면은 폴리스티렌을 포함해도 좋다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 표면은 입자 (즉, 비드)의 표면이어도 좋다. 어떤 경우에, 비드는 직경 100 미크론 미만, 특정 실시양태에서는 10 미크론 미만, 또는 특정 실시양태에서는 1 미크론 미만을 가질 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 표면은 모노머 또는 바이오폴리머가 결합(couple)될 수 있는 반응성 기로 관능화될 수 있다. 어떤 경우에, 반응성 기는 표면에 직접 부착될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 반응성 기는 링커 (예를 들면, PEG)를 사용하여 표면에 간접적으로 부착될 수 있다. 반응성 기의 예로는 카르복실류, 알코올류, 아민류, 및 티올류가 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다.

바이오폴리머 종은 표적 종과 상호작용할 수 있는 것이라면 어떠한 폴리머도 적당하다. 표적 종은 유기물, 세포, 멤브레인, 단백질, 효소, 항체, 수용체, 전사인자(transcription factor), 성장인자 핵산, 앱타머(aptamer), 리보짐, 다당류 등이면 어떠한 생물학적 표적이라도 좋으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 바이오폴리머는 천연물이거나 합성물이어도 좋다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 바이오폴리머 종은 1 또는 그 이상의 천연 서브유닛을 포함한다. 천연 서브유닛의 예로는 뉴클레오티드, 아미노산, 및 슈가가 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다. 어떤 경우에, 바이오폴리머 종은 합성 서브유닛, 이를테면 합성 뉴클레오티드, 합성 아미노산, 및 합성 슈가를 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 바이오폴리머 종은 천연 및 합성 서브유닛의 혼합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 바이오폴리머는 링커, 사슬 연장제, 반응성 센터, 용해 촉진제, 분해(degradation) 센터 등으로서 작용하는 서브유닛을 혼입할 수 있다.

폴리머는 매달린 사이드 기(예를 들면, 핵염기 및/또는 아미노산 사이드 기)를 임의적으로 함유하는 골격을 포함하는 일반적으로 연장된 분자 구조이다. 본 명세서에서, "골격"이란 용어는 본 기술 분야에서 사용되는 일반적인 의미로서, 예를 들면, 원자의 기타 사슬이 매달린 것으로 간주될 수 있는 폴리머 분자 내에 있는 원자들의 선형 사슬을 의미한다. 항상 그렇지는 않지만, 통상적으로, 골격은 폴리머 내에서 원자들의 가장 긴 사슬이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 폴리머는 1 또는 그 이상의 분기된 지점에서 분기될 수 있다. 이러한 경우에, 가지(branch)는 매달린 사이드 기로 간주되는 것이 아니고, 분기 점(branch point)에서 폴리머 사슬에 자체적으로 연결되는 별도의 폴리머 사슬로 간주될 수 있다. 예를 들면, 아미노산 서열은 단일 아미노산 서열이 분기점에서 2개의 아미노산 서열에 분기되는 "Y" 구조를 가질 수 있다. 폴리머는 공중합체, 예를 들면, 블록, 교대, 또는 랜덤 공중합체이어도 좋다.

폴리머 종의 예로는 다음과 같은 것들이 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다: 다당류; 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, DNA 및/또는 RNA); 폴리펩티드 (즉, 아미노산 서열); 펩티드 핵산; 폴리우레탄; 폴리아미드; 폴리카보네이트; 폴리안하이드라이드; 폴리디옥사논; 폴리아세틸렌 및 폴리디아세틸렌; 폴리포스파젠; 폴리실옥산; 폴리올레핀; 폴리아민; 폴리에스테르; 폴리에테르; 폴리(에테르 케톤); 폴리(알칼리성 산화물); 폴리(에틸렌 테레프탈레이트); 폴리(메틸 메타크릴레이트); 폴리스티렌; 폴리(락트산)/폴리락티드; 폴리(글리콜산); 폴리(젖산-코-글리콜산); 폴리(카프로락톤); 폴리(오르토에스테르); 폴리(에테르 에스테르), 이를테면 폴리디옥산; 폴리(아미노 카보네이트); 및 폴리(히드록시알카노에이트), 이를테면 폴리(3-히드록시부티레이트) 및 폴리(3-히드록시부티레이트-코-3-히드록시발레레이트); 및 상기 화합물들의 유도체 및 블록, 랜덤, 라디알, 선형 또는 텔레블록(teleblock) 공중합체.

비제한적인 예를 다음과 같이 설명한다. 도 1은 입자의 표면에 부착된 제1 바이오폴리머 종 (110) 및 제2 바이오폴리머 종 (120)를 갖는 입자(100)를 나타낸다. 입자가 도 1에 기술되어 있을지라도, 이것은 어디까지나 예시에 지나지 않으며, 기타 실시양태에서 다른 시스템이 이용될 수도 있다는 것으로 이해해야 한다. 예를 들면, 제1 바이오폴리머 종 및 제2 바이오폴리머 종은 용액 중에서 편평한(planar) 섭스트레이트 등에 부착될 수 있다. 입자는 제1 바이오폴리머 종 및 제2 바이오폴리머 종이 각각의 독특한 입자 상에 유일한 독특한 입자의 라이브러리의 일부일 수 있다. 라이브러리는 1 또는 그 이상의 독특한 입자의 다수 복제를 함유할 수 있는 것으로 이해하여야 한다. 제1 바이오폴리머 종 (110)는 서브유닛의 풀(pool)로부터 선택된 아미노산 서브유닛의 서열을 포함한다. 제2 바이오폴리머 종(120)은, 절단 가능한 링커 (130)가 제2 바이오폴리머 종의 2 서브유닛들 사이에 삽입되는 것을 제외하고는, 제1 바이오폴리머 종 (110)와 동일한 아미노산 서브유닛의 서열을 포함한다. 도 1에 나타낸 비제한적인 실시양태에서, 절단 가능한 링커 (130)는 메티오닌 서브유닛이다. 제1 바이오폴리머 종은 가변 서열(140) 및 앵커 서열 (150)을 포함한다. 가변 서열 (140)은 각각의 독특한 입자 상에서 유일하지만, 앵커 서열 (150)은 각각의 독특한 입자 상에서 동일하다. 제2 바이오폴리머 종의 부분(160)은, 하기에서 자세히 설명되는 바와 같이, 예를 들면, 절단 가능한 링커(130)를 통해 입자로부터 절단되어, 가변 서열 (140)의 서열을 결정하기 위해서 질량 분석법(mass spectrometry) (또는 기타 기술)에 의해 즉시 분석될 수 있는 혼합물을 형성할 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 제1 바이오폴리머 종 및 제2 바이오폴리머 종은 동일한 수의 서브유닛을 가질 수 있다. 어떤 경우에, 제2 바이오폴리머 종은 제1 바이오폴리머 종보다 더 많은 서브유닛을 가질 수 있다. 일부 예에서, 제2 바이오폴리머 종은 제1 바이오폴리머 종보다 더 적은 서브유닛을 가질 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 제2 바이오폴리머 종은 적어도 하나보다 많은 서브유닛, 특정 실시양태에서는 적어도 2 개 많은 서브유닛, 특정 실시양태에서는 적어도 3 개 많은 서브유닛, 또한 특정 실시양태에서는 적어도 4 개 많은 서브유닛을 가질 수 있다. 어떤 경우에, 제1 바이오폴리머 종 및 제2 폴리머 종은, 제2 바이오폴리머 종이 변형되는 1 또는 그 이상의 부위를 제외하고는, 동일할 수 있다. 예를 들면, 상술한 바와 같이, 제2 바이오폴리머 종은 절단 가능한 링커를 함유할 수 있지만, 제1 바이오폴리머 종은 절단 가능한 링커를 함유하지 않을 수 있다. 어떤 경우에, 제1 바이오폴리머 종과 제2 바이오폴리머 종은, 절단 가능한 링커가 제2 바이오폴리머 종의 2 서브유닛들 사이에 삽입될 수 있는 것을 제외하고는, 동일한 서열을 가질 수 있고, 그에 따라 제2 바이오폴리머 종의 길이를 제1 바이오폴리머 종에 대해 하나의 서브유닛만큼 증가시킬 수 있다. 어떤 경우에, 제1 바이오폴리머 종 및 제2 바이오폴리머 종은, 제2 바이오폴리머 종의 서브유닛이 절단 가능한 링커로 교체되는 1 또는 그 이상의 부위를 제외하고는, 동일한 서열과 동일한 길이를 가질 수 있다.

바이오폴리머는 적당한 길이를 가질 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 바이오폴리머는 적어도 5 개의 서브유닛, 특정 실시양태에서는 적어도 10 개의 서브유닛, 또한 특정 실시양태에서는 적어도 15 개의 서브유닛, 또한 특정 실시양태에서는 적어도 20 개의 서브유닛, 또한 특정 실시양태에서는 적어도 25 개의 서브유닛, 또한 특정 실시양태에서는 적어도 30 개의 서브유닛, 또한 특정 실시양태에서는 적어도 35 개의 서브유닛, 그리고 또한 특정 실시양태에서는 적어도 40 개의 서브유닛을 가질 수 있다.

제1 바이오폴리머 종 대 제2 바이오폴리머 종의 비는 어떠한 원하는 비로 해도 좋다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 1:1 보다 큰 비, 특정 실시양태에서 2:1 보다 큰 비, 특정 실시양태에서 5:1 보다 큰 비, 그리고 특정 실시양태에서 9:1 보다 큰 비, 특정 실시양태에서 20:1 보다 큰 비, 그리고 특정 실시양태에서는 50:1 보다 큰 비를 갖는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 그 비는, 분석을 위해 충분한 양의 제2 바이오폴리머 종이 제2 바이오폴리머 종을 절단함으로써 샘플링될 수 있도록 선택될 수 있다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 바이오폴리머 종의 혼합물이 사용되지 않을 수 있고, 그리고 대신에 단일 바이오폴리머 종만이 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 단일 바이오폴리머 종의 모두는 절단될 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 일부 실시양태에서, 제2 바이오폴리머 종 내에 절단 가능한 링커가 존재하면 표적 종에 대한 제2 바이오폴리머 종의 결합 친화력에 영향을 미칠 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커가 존재하면, 표적 종에 대한 제1 바이오폴리머 종의 결합 친화력과 비교되는 바와 같이, 표적 종에 대한 제1 바이오폴리머 종과 제2 바이오폴리머 종의 조합물의 효과적인 결합 친화력을 변경할 수 있다. 물론, 조합물의 효과적인 결합 친화력은 제1 바이오폴리머 종 대 제2 바이오폴리머 종의 비, 그리고 표적 종에 대한 제2 바이오폴리머 종의 결합 친화력에 미치는 절단 가능한 링커의 효과의 정도와 같은 요소에 따라 달라질 수 있다. 어떤 경우에, 효과의 정도는, 절단 가능한 링커의 구조, 절단 가능한 링커에 근접한 부위 내 (즉, 2개의 서브유닛 내, 3개의 서브유닛 내, 4개의 서브유닛 내, 5개의 서브유닛 내에 인접하는 등)의 바이오폴리머 서브유닛의 정체, 및 바이오폴리머 (예를 들면, 항원결정인자) 내의 결합 영역에 근접한 절단 가능한 링커의 근접성에 따라 달라질 수 있다. 이와 같이, 제1 바이오폴리머 종 대 제2 바이오폴리머 종의 소망하는 비는 이들 및 기타 성질에 따라 달라질 수 있다.

어떠한 적절한 절단 가능한 링커도 사용될 수 있다. 이러한 링커는 본 기술 분야의 숙련자, 예를 들면 고상(solid-phase) 펩티드 합성 및 고상 올리고뉴클레오티드 합성 분야의 숙련자에게 알려져 있다. 어떤 경우에, 메티오닌 잔기(residue)는 링커로서 사용될 수 있다. 메티오닌 링커는 메티오닌 잔기의 C-말단에서 펩티드 본드를 절단하는 CNBr과 같은 시약에 의해 절단될 수 있다. 사용될 수 있는 링커의 기타 형태의 예로는 산-절단 가능한 링커, 염기-절단 가능한 링커, 광-절단 가능한 링커, 및 레독스-절단 가능한 링커, 이를테면 과요오드산염, 2,3-디클로로-5,6-디시아노벤조퀴논(DDQ), 세륨(IV), 질산암모늄(CAN) 등에 의해 매개된 것들이 있다. 절단 가능한 링커는 바이오폴리머에 본질적으로 양성인 조건 하에서 절단되기 쉬울 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 바이오폴리머 서열 내에 위치할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 바이오폴리머를 표면 (즉, 입자)에 연결하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 절단 가능한 링커는 펩티드의 C-말단에 위치할 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 표적을 위한 결합 항원결정인자의 결합 친화력을 특정량 미만으로 감소하는데 충분한 거리로 바이오폴리머의 결합 영역 (예를 들면, 항원결정인자)으로부터 분리될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 일부 실시양태에서, 결합 친화력의 감소는 20% 미만, 특정 실시양태에서 15% 미만, 특정 실시양태에서 10% 미만, 및 특정 실시양태에서 5% 미만일 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 결합 영역은 바이오폴리머 내에 있는 서브유닛의 특수 서열에 의해 형성될 수 있다. 어떤 경우에, 결합 영역과 절단 가능한 링커는 적어도 하나의 바이오폴리머 서브유닛, 특정 실시양태에서 적어도 2 개의 바이오폴리머 서브유닛, 특정 실시양태에서 적어도 3 개의 바이오폴리머 서브유닛, 특정 실시양태에서 적어도 4 개의 바이오폴리머 서브유닛, 특정 실시양태에서 적어도 5 개의 바이오폴리머 서브유닛, 특정 실시양태에서 적어도 6 개의 바이오폴리머 서브유닛, 특정 실시양태에서 적어도 7 개의 바이오폴리머 서브유닛, 특정 실시양태에서 적어도 8 개의 바이오폴리머 서브유닛, 특정 실시양태에서 적어도 9 개의 바이오폴리머 서브유닛, 및 특정 실시양태에서 적어도 10 개의 바이오폴리머 서브유닛에 의해 분리될 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 바이오폴리머의 말단의 근처 내에 위치할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는, 바이오폴리머의 말단에, 특정 실시양태에서 말단으로부터 하나의 바이오폴리머 서브유닛을 떨어져서, 특정 실시양태에서 말단의 2개의 바이오폴리머 서브유닛 내에, 특정 실시양태에서 말단의 3개의 바이오폴리머 서브유닛 내에, 특정 실시양태에서 말단의 4개의 바이오폴리머 서브유닛 내에, 특정 실시양태에서 말단의 5개의 바이오폴리머 서브유닛 내에, 특정 실시양태에서 말단의 10개의 바이오폴리머 서브유닛 내에, 및 특정 실시양태에서 말단의 20 개의 바이오폴리머 서브유닛 내에 위치할 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 바이오폴리머 내에 있는 절단 가능한 링커의 위치는, 절단시 생성된 바이오폴리머 단편이 특정 기를 갖도록 선택될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 일부 실시양태에서, 분석을 용이하게 하는 길이를 갖는 단편을 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 바이오폴리머 단편들은, 6, 7, 또는 8개의 바이오폴리머 서브유닛의 길이를 갖는 단편들을 분석함으로써 용이하게 서열화될 수 있다. 물론, 상기 범위 밖에 있는 길이를 갖는 바이오폴리머 단편들도 마찬가지로 분석될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 바이오폴리머 단편은 적어도 4 개의 바이오폴리머 서브유닛, 특정 실시양태에서 적어도 6 개의 바이오폴리머 서브유닛, 특정 실시양태에서 적어도 8 개의 바이오폴리머 서브유닛, 또는 특정 실시양태에서 적어도 10 개의 바이오폴리머 서브유닛의 길이를 가질 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 바이오폴리머 종의 라이브러리를 제공할 수 있다. 상술한 바와 같이, 어떤 경우에, 바이오폴리머 종은 표면 (예를 들면, 입자의 표면)에 부착될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 라이브러리는 다수의 독특한 바이오폴리머 종을 포함할 수 있는데, 여기서 각 독특한 바이오폴리머 종은 표면의 독특한 영역에 부착될 수 있다. 예를 들면, 상기 독특한 다수의 바이오폴리머 종은 표면 상의 배열로서 정렬될 수 있다. 어떤 경우에, 각각의 독특한 바이오폴리머 종은 별도 입자의 표면에 부착될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 각 영역에서 또는 각 입자 상에서 바이오폴리머 종 중 적어도 일부는 절단 가능한 링커를 포함할 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 라이브러리는 적어도 100 개의 독특한 바이오폴리머, 특정 실시양태에서 적어도 500 개의 독특한 바이오폴리머, 특정 실시양태에서 적어도 1,000 개의 독특한 바이오폴리머, 특정 실시양태에서 적어도 5,000 개의 독특한 바이오폴리머, 및 특정 실시양태에서 적어도 10,000 개의 독특한 바이오폴리머를 포함할 수 있다.

어떤 경우에, 바이오폴리머의 라이브러리의 각 멤버는 고정된 서열 영역 (예를 들면, 앵커 서열) 및 가변적 서열 영역을 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 앵커 서열은 표적 종에 대한 적어도 약간의 결합 친화력을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 하기에서 더욱 상세히 설명하는 바와 같이, 본 발명의 일부 실시양태에서, 이를테면 가변적 서열 영역을 갖는 앵커 서열의 연장은, 연장 서열에 따라 달라지는 바이오폴리머 종의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다. 어떤 경우에, 독특한 바이오폴리머 종의 라이브러리는 특수 표적 종에 대해 개선된 결합 친화력을 갖는 특수 서열을 확인하기 위해 스크린될 수 있다. 앵커 서열은 어떠한 적당한 길이를 가져도 좋다. 예를 들면, 앵커 영역은 적어도 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 개의 서브유닛의 길이를 가질 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 가변적 서열 영역은 적어도 1, 2, 4, 또는 8 개의 서브유닛의 길이를 가질 수 있다. 앵커 서열 및 가변적 서열 영역은 직접 연결되거나 적당한 링커에 의해 연결될 수 있다. 예를 들면, 링커는 바이오폴리머에서 모노머의 대다수보다 서로 다른 종일 수 있다(예를 들면, 링커는 PEG 또는 4-아미노부티레이트를 포함할 수 있는 반면, 바이오폴리머의 나머지는 펩티드일 수 있음). 본 발명의 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열(예를 들면, 폴리글리신)일 수 있다. 앵커 서열은 말단들 중 하나나 모두에 의해 연장될 수 있다. 예를 들면, 아미노산 앵커 서열은 N-말단 및/또는 C-말단에서 연장될 수 있다. 연장은 가변적이거나 고정될 수 있다.

바이오폴리머는 어떠한 표준 방법, 이를테면 표준 자동화 고상 합성법을 이용하여 구성될 수 있다. 어떤 경우에, 바이오폴리머는 효소적으로 구성될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 바이오폴리머는 단계별(step-wise) 형식, 즉 1 또는 그 이상의 서브유닛을 성장하는 바이오폴리머 사슬에 첨가함으로써 구성될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 별도로 구성된 바이오폴리머 단편들은 충분한 길이의 바이오폴리머를 형성하도록 연결될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 바이오폴리머는 표면 (예를 들면, 입자의 표면) 상에서 직접 성장될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 바이오폴리머는 먼저 구성된 후 표면에 부착될 수 있다. 어떤 경우에, 다수의 바이오폴리머는, 바이오폴리머가 적어도 하나의 표면 상에 1 또는 그 이상의 관능기와 반응하여 부착되도록, 적어도 하나의 표면과 혼합될 수 있다. 바이오폴리머를 표면에 부착하기 위해서 수많은 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 어떤 경우에, 바이오폴리머는, 금속 표면, 이를테면 금과 반응하여 바이오폴리머를 표면에 부착하는 티올기를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 바이오폴리머는 표면 상에서 아민과 반응하여 바이오폴리머를 표면에 부착할 수 있는 카르복시기를 포함할 수 있다. 수많은 링커와 시약은 이들 반응을 실시하기 위한 기술 분야에서 공지되어 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 바이오폴리머 모노머는 바이오폴리머의 합성 과정 또는 합성 후에 전환 또는 제거되는 1 또는 그 이상의 기를 포함할 수 있다. 즉, 바이오폴리머 모노머는 "전구체"이어도 좋다. 예를 들면, 아미노산 모노머는 후속 모노머의 첨가 전에 제거되는 아미노 말단 상에 fmoc 보호기를 포함할 수 있다. 즉, 아미노산 모노머는 "아미노산 전구체"일 수 있다. 또 다른 예에서, 뉴클레오시드 포스포르아미다이트는 올리고뉴클레오티드 합성 과정에서 인산염으로 전환되는 3' 위치에서 포스포르아미다이트를 포함한다.

마찬가지로, 절단 가능한 링커의 전구체는 절단 가능한 링커를 바이오폴리머 속으로 혼입하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커 전구체는 단일 모노머일 수 있다. 어떤 경우에, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커에 부착된 1 또는 그 이상의 추가 모노머를 포함할 수 있다. 예를 들면, 절단 가능한 링커 전구체는 1 또는 그 이상의 아미노산에 부착된 메티오닌 절단 가능한 링커를 포함할 수 있다. 이러한 절단 가능한 링커 전구체를 혼입하면, 절단 가능한 링커에 부착된 1 또는 그 이상의 아미노산에 더하여 절단 가능한 링커의 바이오폴리머에 첨가할 수 있게 된다.

절단 가능한 링커는 적당한 방법에 의해 성장하는 바이오폴리머 사슬의 분획 속으로 혼입될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 도2에 나타낸 바와 같이, 제한시약법(limiting reagent approach)이 이용될 수 있다. 예를 들면, 다수의 바이오폴리머 사슬이 제공되는 경우, 절단 가능한 링커 전구체는, 절단 가능한 링커 전구체가 다수의 바이오폴리머 사슬의 일 분획에만 첨가되는 양으로 첨가될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 이러한 결과를 얻는데 필요한 절단 가능한 링커 전구체의 양은 절단 가능한 링커 전구체의 반응성에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 어떤 경우에, 절단 가능한 링커를 함유하는 바이오폴리머의 원하는 분획은, 성장하는 바이오폴리머 사슬을 본질적으로 당량의 절단 가능한 링커 전구체와 접촉함으로써, 즉, 성장하는 바이오폴리머 사슬을 약 0.1 당량의 절단 가능한 링커 전구체와 접촉함으로써 얻어져서 절단 가능한 링커 등을 갖는 바이오폴리머 사슬 10%를 얻게 된다. 그러나, 다른 경우에, 본질적으로 동일한 결과를 얻기 위해서 더 많은 양의 절단 가능한 링커 전구체를 사용할 필요가 있을 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 10 당량 미만의 절단 가능한 링커 전구체는 바이오폴리머 사슬과 혼합되는 데, 특정 실시양태에서는 5 당량 미만의 절단 가능한 링커 전구체가 바이오폴리머 사슬과 혼합되고, 특정 실시양태에서는 1 당량 미만의 절단 가능한 링커 전구체가 바이오폴리머 사슬과 혼합되고, 특정 실시양태에서는 0.5 당량 미만의 절단 가능한 링커 전구체가 바이오폴리머 사슬과 혼합되고, 그리고 특정 실시양태에서는 0.1 당량 미만의 절단 가능한 링커 전구체가 바이오폴리머 사슬과 혼합된다. 절단 가능한 링커 전구체를 첨가한 후, 모노머를 바이오폴리머 사슬에 추가로 첨가할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 바이오폴리머 모노머 전구체와 절단 가능한 링커 전구체의 혼합물은, 도 3에 나타낸 바와 같이, 절단 가능한 링커를 바이오폴리머 사슬의 일 분획 속으로 혼입하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 일 실시양태에서, 바이오폴리머 사슬은 바이오폴리머 모노머 전구체와 절단 가능한 링커 전구체의 혼합물과 반응될 수 있으며, 상기 절단 가능한 링커 전구체는 바이오폴리머 모노머 전구체와 동일한 모노머에 부착된 절단 가능한 링커를 포함한다. 이러한 방법은, 바이오폴리머 사슬의 일부가 절단 가능한 링커를 부가적으로 함유하는 것을 제외하고, 모든 사슬이 동일한 서열을 갖는 바이오폴리머 사슬들의 혼합물을 얻을 수 있다. 한편, 바이오폴리머 모노머 전구체와 절단 가능한 링커 전구체는 각각 단일 모노머만을 함유할 수 있다. 이러한 방법에서, 바이오폴리머 모노머 전구체와 절단 가능한 링커 전구체 상에 직교(orthogonal) 보호 기(protecting groups)를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 직교 보호 기를 이용하면, 바이오폴리머 모노머와 절단 가능한 링커의 선택적인 보호해제(deprotection)를 가능하게 할 수 있다. 이와 같이, 도 3에 나타낸 바와 같이, 절단 가능한 링커 전구체 alloc-Met-OH는, 바이오폴리머 모노머 전구체 fmoc-AA-OH를 원상태로 유지하면서, 이를테면 Pd 촉매를 사용하여, 선택적으로 보호해제를 할 수 있다. 1 또는 그 이상의 모노머는 절단 가능한 링커에 첨가될 수 있다. 바이오폴리머 모노머 전구체와 절단 가능한 링커 전구체 모두가 바이오폴리머 서브유닛 (예를 들면, 두 전구체는 아미노산 전구체, 뉴클레오티드 전구체, 슈가 전구체 등임)의 동일한 범주에 속하는 경우에, 그들은 차별이 있음을 알아야 한다. 또한 바이오폴리머 모노머 전구체 대 절단 가능한 링커 전구체의 비는, 절단 가능한 링커를 함유하는 바이오폴리머 사슬의 소망하는 분획을 얻기 위해 조절될 수 있는 것으로 이해하여야 한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 바이오폴리머 모노머 전구체 대 절단 가능한 링커 전구체의 비는 1:1 보다 크고, 특정 실시양태에서 5:1 보다 크고, 특정 실시양태에서 9:1 보다 크고, 특정 실시양태에서 20:1 보다 크고, 그리고 특정 실시양태에서 50:1 보다 클 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 바이오폴리머는 표면과 혼합될 수 있고 표면에 부착되도록 할 수 있다. 즉, 미리 합성된 바이오폴리머는 표면에 부착될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 바이오폴리머의 일 분획은 절단 가능한 링커를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서, 입자는 바이얼에 저장될 수 있으며, 독특한 바이오폴리머가 절단 가능한 링커를 포함하는 독특한 바이오폴리머의 일 분획은 각 바이얼에 첨가되고 입자의 표면에 부착되도록 할 수 있다. 이와 같이, 입자에 부착된 독특한 바이오폴리머의 라이브러리가 생성될 수 있다.

상술한 바와 같이, 독특한 바이오폴리머의 라이브러리는 스크린될 수 있다. 스크린 분석의 일 실시양태는 다음과 같이 실시될 수 있다. 독특한 바이오폴리머의 라이브러리, 절단 가능한 링커를 함유하는 각 독특한 바이오폴리머의 분획을 제공할 수 있다. 각각의 독특한 바이오폴리머는 개별 입자에 부착될 수 있다. 각 입자의 다수 복제가 제공될 수 있음을 이해하여야 한다. 바이오폴리머의 라이브러리는 표적 종 (예를 들면, 단백질)과 접촉될 수 있으며, 및 비특이적으로 결합된 표적 종은, 이를테면 블로킹 용액을 사용함으로써 세척 제거될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 블로킹(blocking) 용액은, 표적 종이 임계치 이상의 결합 친화력을 나타내는 바이오폴리머에만 결합되도록 배합될 수 있다. 특이적으로 결합된 표적 종 (즉, "히트")를 갖는 상기 입자들을 확인하기 위해서 라이브러리의 입자가 분류될 수 있다. 예를 들면, 입자 상에서 바이오폴리머에 결합된 표적 종을 구체화(visualize) 하기 위해 항체 샌드위치 분석법이 이용될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 입자는 여러 번 분류될 수 있으며, 이 경우에 각 분류 라운드(round)에서 표적 종과 가장 약한 결합을 나타내는 입자를 근본적으로 제거하게 된다. 분류된 입자는, 바이얼 당 한 입자씩 바이얼에 저장될 수 있다. 각 비드 상의 절단 가능한 바이오폴리머 사슬은 절단되어 바이오폴리머 단편을 생성할 수 있다. 상술한 시약들 중 어느 하나 또는 어떠한 기타 적당한 시약을 사용하여 절단을 할 수 있다. 그 다음, 바이오폴리머 단편은 어떠한 적당한 분석을 거칠 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 바이오폴리머 단편은 서열화될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 질량 분석법은 바이오폴리머를 서열화하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들면, MALDI-TOF 질량 분석법 및 MS/MS는 바이오폴리머 단편을 분석(예를 들면, 서열화) 하는데 이용될 수 있다. 어떤 경우에, 바이오폴리머 단편은, 서열화를 위해 길이가 서로 다른 바이오폴리머 단편의 소위 "래더(ladder)"를 형성하기 위해서, 이를테면 효소를 이용하여, 부분적으로 분류(digest) 될 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 표적 종에 대한 히트(즉, 결합 친화력을 나타내는 바이오폴리머)의 결합 친화력을 측정하기 위해 추가 분석이 실시될 수 있다. 예를 들면, 히트 바이오폴리머는, 입자에 부착되지 않고 재합성된 다음, 결합 친화력을 측정하기 위해 표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR) 실험을 거칠 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 하기 실시예에서 설명되는 바와 같이, 결합 친화력을 측정하기 위해 도트 블롯 분석법이 이용될 수 있다.

"아미노산"이란 용어는 생화학 분야에서 통상적으로 사용되는 의미이다. 분리된 아미노산은 항상 그렇지는 않지만 통상적으로 (예를 들면 프롤린의 경우에서 처럼) 화학식 NH₂-CHR-COOH를 갖는다. 여기서 R은 어떠한 적당한 잔기, 예를 들면 수소 원자, 메틸기 또는 이소프로필기이어도 좋다. 일련의 분리된 아미노산들은 연결되어 한 아미노산의 -NH₂ 와 또 다른 아미노산의 -COOH와 반응하여 펩티드 결합 (-CO-NH-)을 형성하게 됨으로써 펩티드나 단백질을 형성하게 된다. 이러한 경우에, 펩티드 또는 단백질 상에 있는 R 기의 각각은 아미노산 잔기라 할 수 있다. 아미노산은 자연에서 일반적으로 발견할 수 있는 20 아미노산들("천연 아미노산") 중 하나, 또는 인조 아미노산, 즉 아미노산 천연 아미노산들 중 하나가 아닌 아미노산이어도 좋다. 인조 아미노산의 예로는 다음과 같은 것들이 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다: 알로이소류신, 알로트레오닌, 호모페닐알라닌, 호모세린, 호모시스테인, 5-히드록시리신, 4-히드록시프롤린, 4-카르복시글루탐산, 시스테인산, 시클로헥실알라닌, 에틸글리신, 노르류신, 노르발린, 3-아미노부티르산, 베타-아미노산 (예를 들면, 베타-알라닌), N-메틸화 아미노산류, 이를테면 N-메틸글리신, N-메틸알라닌, N-메틸발린, N-메틸류신, N-메틸이소류신, N-메틸노르류신, N-메틸-2-아미노부티르산, N-메틸-2-아미노펜타노산 등, 뿐만 아니라 천연 아미노산의 D-이성질체.

본 발명의 일 실시양태에서, 1 또는 그 이상의 상기 조성물들을 함유하는 키트를 제공할 수 있다. 본 명세서에서 "키트"란, 통상적으로 본 발명에 따른 1 또는 그 이상의 조성물, 및/또는 이를테면 상술한 바와 같은 본 발명과 관련된 기타 조성물을 포함하는 포장 또는 어셈블리를 의미한다. 키트의 각 조성물은 액체 형태 (예를 들면, 용액), 고체 형태(예를 들면, 건조 분말) 등으로 제공될 수 있다. 어떤 경우에, 본 발명의 키트는, 본 기술 분야의 숙련자가 본 발명의 조성물과 관련되는 지시서를 인식하는 방법으로, 본 발명의 조성물과 관련하여 제공되는 어떠한 형태로도 지시서를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 지시서는 조성물 및/또는 키트와 관련된 기타 조성물의 용도, 변형, 혼합, 희석, 보존, 투여, 조립, 저장, 포장 및/또는 제조에 대한 지시를 포함할 수 있다. 상기 지시서는 이를테면 기록 또는 공표된 지시를 포함하는 적당한 매체, 언어, 오디오 (예를 들면, 전화), 디지탈, 광학, 비주얼 (예를 들면, 비디오테이프, DVD 등) 또는 전자 통신 (인터넷 또는 웹-계통의 통신 포함)으로서 본 기술 분야에서 숙련된 자들에게 인식될 수 있는 형태로 제공될 수 있다.

히드(Heath) 일행에 의해 "Differentiation of Isobaric Amino Acids and Other Species" 란 명칭으로 2009년 7월 22일 출원된 국제특허출원 PCT/SG2009/000258 및 히드 일행에 의해 "Method for the Improved Screening of Bead-Based Peptide and Peptide Mimetic Libraries Using Partially Cleavable Peptides"란 명칭으로 2009년 7월 15일 출원된 미국 임시 특허출원 번호 61/225,881는 본 명세서에서 참고로 하고 있다.

다음 실시예는 본 발명의 특정 실시양태를 예증하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1

본 실시예는 메티오닌 절단 가능한 기를 함유하는 펩티드 라이브러리를 구성하는 여러 방법을 기술한다. 도 2는 절단 가능한 기로서 메티오닌을 이용하기 위한 실시양태를 설명하는 2가지 방법을 나타낸다.

제1 방법 (21)은 OBOC 펩티드 라이브러리를 구성하기 위한 표준 펩티드 결합에서 결합 단계의 변형을 나타낸다. 도 2에 나타낸 바와 같이, OBOC 라이브러리에 사용되는 비드 (11)에는 통상적으로 추가적인 화학 변형을 위해 분자 관능성을 미리 제공한다. 표준 예는, 도 2에 나타낸 바와 같이, 아민기(-NH₂)로 종결되는 폴리에틸렌 글리콜 올리고머이다. 이러한 방식으로, 아미노산을 연속적으로 결합하여 펩티드를 형성하는 데 사용되는 아미드 결합법이 비드 상(on-bead)에 이용될 수 있다. 아미노산이 비드에 결합될 때, 아미노산은 통상적으로 fmoc (플루오렌-9-일메톡시카르보닐) 기의 사용을 통해 후속적인 반응으로부터 보호된다. fmoc-보호 메티오닌 (fmoc-Met-OH)의 결합 정도는, 노출된 NH₂ 기의 분획만이 반응되도록, 첨가된 시약의 양을 제한함으로써 조절될 수 있다. 부분 결합이 종료된 후, OBOC 라이브러리는 표준 문헌 프로토콜에 따라 구성된다.

제2 방법 (22)은 N,N'-디이소프로필에틸아민 (DIPEA)의 존재 하에 아미드를 형성하는 fmoc-메티오닌의 활성화된 에스테르 형태를 이용한다. 활성화된 에스테르 형태를 이용함으로써 fmoc-보호 메티오닌의 혼입이 제어되므로, 노출된 NH₂ 기의 분획만이 반응된다. 활성화된 에스테르를 서서히 반응하면 비드-결합 NH₂ 기에 결합하는 부분 메티오닌의 범위(extent) 이상으로 더욱 용이하게 조절하게 될지라도, 상기 방법은 방법(21)과 유사하다. 그 결과 얻어진 비드는 fmoc 보호해제 및 fmoc-보호 아미노산 (fmoc-AA-OH)의 후속적인 결합을 가져온다. 피페리딘에 의한 또 다른 fmoc-보호해제 후, 비드는 제1 방법 (21)에 의해 정교하게 만들어지는 것과 동일한 펩티드의 분배(distribution)에 의해 부착된다. 두 방법은, 선형 펩티드의 분기점, 중간점, 또는 선형 펩티드의 C-말단을 포함한 어떠한 위치에서도 메티오닌을 OBOC 펩티드 라이브러리의 분획량으로 혼입하는 데 이용될 수 있다.

도 3은 2개의 미리 혼합된 아미노산 시약을 사용함으로써 비드 상에 아미노산 서열을 부착하기 위한 2가지 다른 방법들을 나타낸다. 제3 방법 (31)에서는 fmoc-보호 제2 아미노산에 부착된 메티오닌을 갖는 이합체성 펩티드를 사용한다. 예를 들면, C-말단의 아미노산이 류신인 경우, fmoc-Leu-Met-OH (류신-메티오닌)의 분획은 fmoc-Leu-OH와 미리 혼합되고 아미노 수지에 결합하기 위해 사용된다. fmoc-Leu-OH와 fmoc-Leu-Met-OH 모두의 결합 속도가 비슷할 경우, 메티오닌 기로 종결된 위치의 분획은, 단순히 초기에 혼합된 fmoc-Leu-OH 및 fmoc-Leu-Met-OH의 상대량과 관련된다. 한편, 첨가시켜야 할 이들 2 분자의 양은 이들 2 화합물의 상대 반응 속도에 대하여 측정되어야 한다. 상기 제1 단계가 종료되면, 후속적인 아미노산 (AA)은 표준 시약(fmoc-AA-OH)과 표준 펩티드 결합 화학 프로토콜을 이용하여 수지 상의 H₂N-Leu- 및 H₂N-Leu-Met-위치에 결합된다. 이러한 예로서, 아미노산 류신은 어떠한 천연 또는 인조 아미노산 (AA)으로도 대체될 수 있다. 이 방법 (31)은, 각 비드가 메티오닌을 통해 비드에 결합된 펩티드의 조절 가능한 분획을 갖는 라이브러리를 생성한다.

제4 방법 (32)은 아미노산의 후속적인 혼입을 위해 큰 신축성을 제공한다. 서로 다른 보호기를 이용함으로써, 이 방법은 미리 합성된 다이머를 필요로 하지 않는다. N-알릴옥시카르보닐(Alice) 기는 Pd 촉매를 사용하는 표준 프로토콜에 의해 쉽게 제거될 수 있고, 그리고 노출된 자유 아민 기는 상기 방법 (31)에 의해 얻어진 동일한 종을 정교하게 만들도록 들어오는 fmoc-보호 아미노산 (fruoc-AA-OH)와 결합된다.

단계 1. OBOC 라이브러리의 제조를 위한 화학적 확인:

비드 상에 부착될 수 있는 메티오닌의 분획량이 결정되었다. 이러한 측정을 위해서, 표준 측정 곡선은 모델 펩티드, Ac-Phe-Leu-호모세린 락톤의 서로 다른 농도에서 액체 크로마토그라피(LC)를 실행함으로써 얻어졌다 (도 4). 이러한 곡선을 이용하여, 메티오닌의 분획량은 자유 아미노 기, 선형 펩티드의 N-말단, 및 펩티드의 중간점에 있는 아미노 기를 갖는 비드의 어떠한 형태로도 결정될 수 있다. 이 방법은 도 5에 나타낸 바와 같이 표시되었다. 제1 예 (51)는 비드 상의 자유 아민기에 결합하는 분획 메티오닌으로부터 얻어졌다. fmoc-보호 메티오닌과 커플링제 (TBTU)의 첨가량은, 액체 크로마토그라피(LC)에 의한 분석을 위해 짧은 펩티드의 후속적인 구성 전에, 비드 상에 아민 기와의 초기 커플링을 위해 10%로부터 >100%까지 달라질 수 있다. TBTU가 제한제(limiting agent)일 때, 가장 높은 결합률(>90%)이 얻어졌다. 2 당량의 DIPEA 존재 하에서 비드에 첨가되기 전에, 2개의 시약이 NMP 중에서 10 분 동안 2:1의 비로 미리 혼합되었다. 링커로서 10% 메티오닌을 혼입하기 위해서, 예를 들면 fmoc-Met-OH 및 TBTU의 양은 각각 20 %t 및 10 %로 제한되었다. 짧은 펩티드의 후속 구성은 각 단계에서 이중 결합법을 이용하여 표준 펩티드 합성 프로토콜에 의해 실시되었다. N-말단은 무수 아세트산으로 아세틸화되었고, 그리고 비드는 펩티드 서열:Ac-Phe-Leu-Met을 가졌으며, 여기서 메티오닌의 분획은 10% 내지 100%이다. 이와 같이, 비드-결합 펩티드의 분획만이 C-말단에서 절단 가능한 링커로서 메티오닌을 함유하였다. 이러한 펩티드의 분획은 표준 CNBr-매개 절단 프로토콜을 사용하여 절단되었고, 그리고 절단된 펩티드의 양은, 출발 시 비드 상에 결합하기 위해 첨가된 TBTU의 양의 함수로서 분석되었다. 예를 들면, (51)의 결과를 기본으로 할 때, 10% 결합을 달성하는 데 필요한 TBTU의 양은 13%이다.

제2 예(52)는 테트라머 펩티드 H₂N-RYWF (SEQ ID NO. 6)를 부착하는 비드로부터 얻어졌다. 이 경우에, 예를 들면 약 15%의 TBTU가 메티오닌의 15% 결합을 위해 사용될 필요가 있다. 제3 예(53)는 또한 더욱 신축성이 있는 헥사머 펩티드 H₂N-LHRYWF (SEQ ID NO. 7)를 부착하는 비드의 경우에 분획 결합을 위해 신뢰성 있는 방법을 나타낸다. 마찬가지로, 이 경우에 약 15%의 TBTU가 메티오닌의 15% 결합을 위해 필요하다.

도 4 및 5에 기재된 실험으로부터, 비드 상에 어떠한 형태의 N-말단에 결합된 메티오닌의 지정된 분획에 대한 각 시약의 필요량이 쉽게 결정될 수 있다.

실험 설명

일반:

N-메틸피롤리돈 (NMP), 디에틸에테르 및 디클로로메탄 (DCM)을 Merck사로부터 구입하였다. Fmoc-보호 아미노산 (Fmoc-AA's), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-l,l,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (DIEA)을 GL Biochem (샹하이) 사로부터 구입하였다.

트리플루오로아세트산(TFA) 및 트리이소프로필실란 (TIS)을 Aldrich사로부터 구입하였다. a-시아노-4-히드록시신남산 (CHCA)을 Bruker사로부터 구입하였다. MALDI-MS 및 MS/MS을 Bruker Autoflex II TOF/TOF 로서 얻었다.

메티오닌을 TentaGel S 아미노 수지에 부분 결합 ( 일예로서 10% 결합):

TentaGel S 아미노 수지 (200 mg, 용량 = 0.29 mmol/g)을 바이얼 내의 NMP (3 ml) 중에서 2 시간 동안 팽윤하였다. 1분 동안 원심분리한 후, 대부분의 용매를 취하고, 그리고 NMP (1 ml) 중에서 10 분 동안 교반함으로써 제조된 fmoc-Met-OH 및 TBTU (각각 0.26 및 0.13 당량)의 용액을 DMA (2 당량, NMP 중의 0.5 M 용액)의 존재 하에 첨가하였다. 그 결과 얻어진 혼합물을 30 분 동안 교반한 후, 반응 용액을 배출한 다음, NMP (3 ml x 4)로 완전 세척하였다. Fmoc 기는 NMP (각 3 ml, v/v) 중의 20% 피페리딘으로 5 분, 그 다음 15 분 동안 2회 처리하여 제거되었다. 용액을 배출시키고, 비드를 NMP (3 ml x 4) 및 DCM (3 ml x 4)으로 완전 세척하였다.

펩티드 Ac -F-L-M(10-100%)의 후속적 합성:

NMP (3 ml) 중에서 2 시간 동안 팽윤한 후, 메티오닌-결합 비드 (10-100%)에 fmoc-Leu-OH (2 당량, NMP 중 0.2 M 용액), TBTU (2 당량, NMP 중 0.2 M 용액), 및 DMA (5 당량, NMP 중 0.5 M 용액)를 첨가하고, 그 결과 얻어진 혼합물을 30 분 동안 교반하였다. 액체를 배출시키고, 30분 동안 더 교반하면서 새로운 시약 용액을 사용하여 커플링(coupling)을 반복하였다. NMP (3 ml, v/v) 중의 20% 피페리딘으로 5 분 동안 처리한 후 다시 15 분 동안 2회 처리함으로써 Fmoc 기를 제거하였다. 용액을 배출시키고, NMP (3 ml x 4) 및 DCM (3 ml x 4)으로 비드를 완전 세척하였다. fmoc-Phe-OH로 커플링 및 보호해제를 반복하였다. 마지막으로, N-말단은 NMP (3 ml) 중의 무수 아세트산 (10 당량) 및 DIEA (20 당량)로 30 분 동안 처리함으로써 아세틸화되었다. 그 결과 얻어진 비드를 NMP (3 ml x 4), 메탄올 (3 ml x 4), DCM (3 ml x 4), 및 디에틸에테르 (3 ml)로 완전 세척한 다음, 감압 하에서 24 시간 동안 건조하였다.

단일 비드의 CNBr -매개 절단:

메티오닌의 가변적 분획을 갖는 비드 (약 5 mg)의 정확한 양을 2 ml Eppendorf 튜브에 넣었다. 탈이온수(200 ul)를 첨가한 후, 튜브를 아르곤으로 1분 동안 주의깊게 퍼지(purge)하였다. CNBr (200 pi, 0.2 N HCl 용액 중 0.50 M)을 튜브에 첨가한 후, 밀봉한 다음, 실온에서 15 시간 동안 교반하였다. 그 결과 얻어진 용액을 원심 진공 하에서 2 시간 동안 농축하였다.

단계 2. 10% 절단 가능한 링커를 갖는 선형 및 분기형 펩티드의 정확한 서열화:

이 단계에 있어서, 공지된 펩티드의 분획 (<< 50 %) 만이 단일 비드로부터 절단될 때, 정확한 서열화 정보가 얻어질 수 있다는 것이 증명되었다. 표준 질량 분석법을 이용하여 서열화를 실시하였다. 이 실험을 위해서, 두 선형 및 분기형 여러 비드-결합 펩티드를 제조하였다. 선형 펩티드에 있어서, 주어진 비드 상의 펩티드 10%가 표준 CNBr-매개 화학적 절단법을 이용하여 절단될 수 있도록, 펩티드가 구성되었다. 분기형 펩티드에 있어서, CNBr을 이용하여 분기점에서 펩티드의 10%를 절단하였다. 도 4에 데이터를 나타냈다. 이러한 것을 증명하기 위해서, 각각 공지된 조성물인 6 선형 및 6 분기형 펩티드를 절단한 후, 100% 정확도로 서열화하였다. 모든 측정은 단일 비드 상에서 실시되었다.

실험 설명

비드 상에 있는 HLYFLR ( SEQ ID NO . 1)의 N-말단으로부터 펜타머 펩티드(선형 펩티드)의 합성:

TentaGel S 아미노 수지 (600 mg, 용량 = 0.29 mmol/g)를 팽윤하는 것으로부터 시작하여, 단계 1에서 설명된 바와 같이, 골격 서열은 이중 커플링법을 통해 표준 fmoc 펩티드 합성 프로토콜에 따라 R, L, F, Y, L, 및 H를 혼입함으로써 구성되었다. 단계 1에서 설명된 바와 같이, 각 펜타머 펩티드의 후속적인 구성을 위해 비드를 6 부분으로 동일하게 분할하기 전에, 동일한 프로토콜(이중 커플링)에 따라 10% 메티오닌의 혼입을 실시하였다. 잔류물에 대한 보호기는 트리플루오로아세트산 절단 칵테일(cocktail) (2 ml, TFA/TIS/물=94/3/3, v/v/v)로 2 시간 동안 처리함으로써 제거되었다. 그 결과 얻어진 비드는 NMP (3 ml X 4), 메탄올 (3 ml x 4), DCM (3 ml X 4), 및 그 다음 디에틸에테르 (3 ml)로 강하게 세척된 후 진공에서 24 시간 동안 건조되었다.

비드 (분기형 펩티드) 상에 있는 HLYFLR ( SEQ ID NO . 1)의 중간점으로부터 펜타머 펩티드의 합성:

먼저, 단계 1에서 설명된 방법 (이중 커플링)에 따라, 골격 헥사머 펩티드 Ac-HLG(4-아지도-l-부틸)FLR를 TentaGel S 아미노 비드 (600 mg, 용량 = 0.29 mmol/g) 상에 구성하였다. 보호기는 후속 커플링을 위해 원래대로 유지되었다. 필터가 구비된 25 ml 반응기에 비드를 넣고, NMP (12 ml) 중에서 팽윤하기 위해 2 시간 동안 흔들었다. Fmoc-Pra-OtBu (3 당량), 구리 요오드화물 (0.1 당량), 및 DMA (3 ml)를 첨가한 후, 반응기를 15 시간 동안 흔들었다. 반응 용액을 수지로부터 제거한 후, NMP 중 DIEA (1%, v/v)를 함유하는 나트륨 디에틸디티오카바메이트 3 수화물 (Et₂NC S SNa.3 H₂O, 1% w/v)의 용액(15 ml x 5)으로 세척하여 클릭(click) 반응에 의해 생성된 배위결합된(coordinated) 구리 종을 제거하였다. 수지 및 용액이 모두 무색이 될 때까지 세척을 반복하였다. NMP 중 20% 피페리딘 (각 15 ml, v/v)으로 5 분 및 그 다음 15 분 동안 2회 처리함으로써 fmoc 기를 제거한 후, 단계 1에서 설명한 바와 같이, 10% 메티오닌의 혼입을 실시하였다. 그 결과 얻어진 비드를, 동일한 프로토콜 (이중 커플링)에 따라, 각 펜타머 펩티드의 후속적인 구성을 위해, 6 부분으로 동일하게 분할하였다. 트리플루오로아세트산 절단 칵테일 (2 ml, TFA/TIS/물=94/3/3, v/v/v)로 2 시간 동안 처리함으로써 잔류물에 대한 보호기를 제거하였다. 그 결과 얻어진 비드를 NMP (3 ml x 4), 메탄올 (3 ml x 4), DCM (3 ml x 4), 및 그 다음 디에틸에테르 (3 ml)로 강하게 세척한 후, 진공 하에서 24 시간 동안 건조하였다.

10% 메티오닌 링커를 갖는 단일 비드로부터 펩티드에 대한 MALDI - MS 샘플링:

Bruker Autoflex III TOF/TOF를 사용하여 MS 및 MS/MS 실험을 실시하였다. 각 바이얼이나 웰(well)에, a-시아노-4-히드록시신남산 (CHCA) [2 ul, 아세토니트릴/물 (70:30, v/v) 중의 0.5% 용액]을 첨가한 후, 아세토니트릴/물 [2 ul, 70:30, v/v, 0.1% 트리플루오로아세트산 (v/v) 함유]을 첨가하였다. 샘플을 2 분 동안 원심분리한 후, 2 ul를 취하여 Bruker 384-웰 MALDI-MS 플레이트 상에 스폿팅한 다음, 15 분 동안 공기 건조하였다.

단계 3. 단백질 친화력 스크리닝을 위해 부분적으로 절단 가능한 OBOC 펩티드 라이브러리의 장점에 대한 증명.

그 다음, OBOC 라이브러리가 주어진 단백질에 대한 펩티드 바인더를 결정하기 위해 스크린될 때, 본 실시예에서 설명된 방법을 이용한 비드는 본 실시예에서 설명된 방법을 이용하지 않는 비드로부터 통계적으로 서로 다른 히트를 생성하였다는 것이 증명되었다. 분획 링커 시트템의 효과를 극대화 하기 위해서, 헥사머 펩티드를 비드 상에 먼저 부착하였다. 서열 LFIRYWF는 bCAII에 대해 헥사머 펩티드 라이브러리의 초기 스크리닝으로부터 제1 발생 앵커 펩티드로서 밝혀졌는 데, 이는 표면 플라스몬 공명 (SPR) 연구에서 몇몇 마이크로몰 1CD의 친화력을 나타냈다. 그 다음, 라이브러리 내의 가변 영역으로서 2개의 서로 다른 헥사머 펩티드는, 시스테인 및 메티오닌을 제외하고, 모노머로서 18 인조 (D) 아미노산을 사용하여 C-말단에서 15% 및 100% 메티오닌으로 구성되었다. 15% 메티오닌의 혼입은 단계 1에서 설명된 방법에 의해 이루어졌고, 100% 메티오닌에 대해 표준 합성 프로토콜을 이용하였다(이중 커플링). "분할-혼합" 방법을 용이하게 실시하기 위해서 AAPPTEC Titan 357을 이용하였다. 모든 공정은 표준 고상 fmoc 화학적 방법에 따라 완전 자동화 방식으로 실시되었다. CNBr 절단 가능한 링커로서 초기 메티오닌을 도입함에 따라, 18 개의 다양한 요소 각각과 커플링하기 전에 비드를 18 개의 반응 용기(RV)에 균일하게 배분하였다. 분할(split), 커플링, Fmoc-보호해제 및 혼합의 주기를 6회 반복하고, 보호기를 TFA 절단 칵테일에 의해 완전 제거하였다. 이에 따라, 2개의 라이브러리는 관심있는 단백질, 소(bovine) 탄산탈수효소 II (bCAII)에 대해 생화학적 스크리닝을 할 수 있다. 비드 상에 있는 펩티드의 순도는, 스크리닝 공정 전에, MALDI-TOF/TOF에 의해 측정되었다. 라이브러리는 25 ℃에서 20 시간 동안, 50 nM의 소 탄산탈수효소 (bCAII)에 대해 배양된 후, 형광 검출을 위해 Alexa Fluor647로 콘주게이트(conjugate) 되었다. 히트 비드를 COPAS Plus에 의해 자동 방식으로 96 웰 플레이트 속으로 분류한 후, 부착된 펩티드를 CNBr로 처리함으로써 방출한 다음, 특화를 위해 MALDI-MS 스테이숀으로 분배되었다. 도 7의 위치-의존 히스토그램은 2개의 라이브러리들 사이에서 분명한 차이를 나타내는데, 이는 중요한 간섭이 링커 부분이라고 생각됨에 따라 스크리닝 결과에 혼란을 가져오는 것을 의미한다.

절단 가능한 링커가 앵커 펩티드 LHRYWF (SEQ ID NO. 7)의 중간에 놓여진, 2개의 테트라머 펩티드 라이브러리로 또 다른 비교를 하였다(도 8). 라이브러리는 각각 H와 R 사이에 혼입된 15% 및 100% 메티오닌으로 유사한 방법에 의해 합성되었다. 라이브러리는, 25 ℃에서 20 시간 동안, 10 nM의 소 탄산탈수효소 (bCAII)에 대해 배양된 후, 형광 검출을 위해 Alexa Fluor^® 647로 콘주게이트되었다. 서열화 결과, 2개의 라이브러리들 사이에 차별화된 결과를 나타내는 도 8에서 위치-의존 히스토그램으로서 표시되었다. 이들 결과는 링커 부분이 스크린 공정에 간섭하는 것을 알 수 있다.

실험 설명

앵커 펩티드 LHRYWF ( SEQ ID NO . 7)에 부착된 절단 가능한 링커로서 15% 및 100% 메티오닌을 갖는 헥사머 펩티드 라이브러리의 합성:

합성은 자동 합성화기 AAPPTEC Titan 357를 사용하여 실시되었다. TentaGel S 아미노 비드 (각 1.8 g, NH₂: 0.24 mmol/g 로딩)으로부터 시작하고, 표준 fmoc 화학법을 이용하여 앵커 서열 LHRYWF (SEQ ID NO. 7)를 구성한 후, N-말단에 4-아미노부티레이트를 혼입하였다. 그 결과 얻어진 비드에, 단계 1에서 설명된 바와 같이, 15% 메티오닌이 도입되고, 정상적인(regular) 이중 커플링법이 100% 메티오닌 계열에 적용되었다. 그 다음 비드를 18 개의 반응 용기(RV)에 균일하게 배분하였다. 시스테인 및 메티오닌을 제외하고 다양한 요소로서 18개의 선택된 fmoc-보호 d-아미노산들 중 하나(3 당량), TBTU (3 당량) 및 DIEA (7.5 당량)를 각 반응 용기(RV)에 첨가하였다. 반응 용기(RV)를 30 분 동안 교반하였다. 용액을 배출한 후, 커플링 단계를 반복하였다. 그 결과 얻어진 각 반응 용기 내의 비드를 NMP (2 ml x 4)로 세척하였다. 다시, NMP(2 ml x 4) 중의 20% 피페리딘을 각 반응 용기에 넣고 15 분 동안 교반하였다. 액체를 배출하고, NMP(2 ml x 4) 중의 20% 페페리딘의 새로운 용액을 넣고 30분 동안 더 교반하였다. 각 반응 용기 내의 비드를 NMP (2 ml x 4) 및 DCM (2 ml x 4)으로 완전 세척한 후, 수집 용기(CV)에 넣었다. 비드가 추가적 헥사머에 부착할 때까지 전체적인 분할, 커플링, 보호해제 및 혼합 공정을 6회 반복하였다. 필터가 구비된 50 ml 반응기에 비드를 옮겼다. 잔류물 중의 보호기는, TFA-물-TIS (27 ml, 94:3:3, v/v) 중에서 2 시간 동안 흔들어줌으로서 제거되었다. 액체를 배출시키고, 그 결과 얻어진 비드를 DCM (27 ml x 3), 메탄올 (27 ml x 3), 물 (27 ml x 3), 메탄올 (27 ml x 3), DCM (27 ml x 3), 및 디에틸에테르 (27 ml)로 연속해서 완전 세척한 다음, 감압 하에 24 시간 동안 건조하였다.

앵커 펩티드 LHRYWF ( SEQ ID NO . 7)의 H 및 R 사이에 부착된 절단 가능한 링커로서 15% 및 100% 메티오닌을 갖는 테트라머 펩티드 라이브러리의 합성:

합성은 자동 합성화기 AAPPTEC Titan 357를 사용하여 실시되었다. TentaGel S 아미노 비드 (각 1.8 g, NH₂: 0.24 mmol/g 로딩)으로부터 시작하고, 표준 fmoc 화학법을 이용하여 RYWF (SEQ ID NO. 6)를 구성한 후, 단계 1에서 설명된 바와 같은 15% 메티오닌 또는 정규 이중 커플링법에 의한 100% 메티오닌을 혼입하였다. 그 결과 얻어진 비드 (이중 커플링)에 H와 L을 커플링한 후, 18 개의 반응 용기(RV)에 동일하게 배분하였다. 다양한 요소로서 시스테인 및 메티오닌을 제외하고 18개의 선택된 fmoc-보호 d-아미노산들 중 하나(3 당량), TBTU (3 당량) 및 DIEA (7.5 당량)를 각 반응 용기에 첨가하였다. 반응 용기(RV)를 30 분 동안 교반하였다. 용액을 배출한 후, 커플링 단계를 반복하였다. 그 결과 얻어진 각 반응 용기 내의 비드를 NMP (2 ml x 4)로 세척하였다. 다시, NMP(2 ml x 4) 중의 20% 피페리딘을 각 반응 용기에 넣고 15 분 동안 교반하였다. 액체를 배출하고 NMP(2 ml x 4) 중의 새로운 20% 피페리딘 용액을 30분 동안 더 교반하면서 첨가하였다. 각 반응 용기(RV) 내의 비드를 NMP (2 ml x 4) 및 DCM (2 ml x 4)로 완전 세척한 후, CV에 넣었다. 비드가 추가적인 테트라머에 부착할 때까지 전체적인 분할, 커플링, 보호해제 및 혼합 공정을 4회 반복하였다. 필터가 구비된 50 ml 반응기에 비드를 옮겼다. 잔류물 중의 보호기는, TFA-물-TIS (27 ml, 94:3:3, v/v) 중에서 2 시간 동안 흔들어줌으로서 제거되었다. 액체를 배출시키고, 그 결과 얻어진 비드를 DCM (27 ml x 3), 메탄올 (27 ml x 3), 물 (27 ml x 3), 메탄올 (27 ml x 3), DCM (27 ml x 3), 및 디에틸에테르 (27 ml)로 연속해서 완전 세척한 다음, 감압 하에 24 시간 동안 건조하였다.

라이브러리 스크리닝 및 비드 분류:

Alexa Fluor^® 647 단백질 라벨링 키트 (A20173, 인비트로겐)는, 공급자의 포로토콜에 따라, 소 탄산탈수효소 (bCAII)를 라벨링하기 위한 반응성 염료로서 선택되었다. 라벨링에 대해서 간단히 설명하면, 0.1 M 중탄산나트륨 용액 (pH-8.3) 1 ml에 2 mg을 용해함으로써 제조된 bCATI 용액 0.5 ml를, 반응성 염료를 함유하는 바이얼로 옮겼다. 바이얼의 뚜껑을 닫은 다음, 염료를 완전 용해할 때까지 수회 거꾸로 하였다. 반응 혼합물을 실온의 어두운 상태에서 1 시간 동안 교반하였다. Alexa Fluor^® 647 라벨된 bCAII (bCAII-A647)를 키트 내의 크기 배제 정제 수지(size exclusion purification resin)에 의해 혼합물로부터 정제되었다. 정제된 bCAII-A647는 SDS-PAGE 후에 NanoDrop (Thermo Scientific) 및 젤 다큐멘테이션 (Typhoon)으로 특징지어졌다. 200 mg의 건조된 라이브러리 수지를 8 ml Alltech 용기로 옮긴 후, 블로킹(blocking) 용액, 0.05% NaN₃, 0.1% Tween 20 및 PBS 완충액 (pH 7.4) 중의 0.1% BSA에서, 주위 온도에서 1 시간 동안 360-도 셰이커 상에서 미리 배양하였다. 완충액을 버린 다음, 블로킹 용액에 희석된 5 ml의 10 또는 50 nM bCAII-A647을 팽윤된 수지에 첨가하였다. 그 결과 얻어진 혼합물을 360-도 회전 자동 온도조절 셰이커에서 20 시간 동안 배양하였다. 액체를 배출시키고, 비특이적으로 결합된 단백질은, 블로킹 용액으로 3회, PBS 중의 0.1% Tween 20으로 7회 연속으로 세척함으로써 제거되었다. 엄격하게 세척한 후에, 200 mg의 분석된 라이브러리 수지를 COPAS Plus의 샘플 용기 (Union Biometrica)로 옮긴 후, PBS 완충액 중 0.1% Tween 20(200 ml)로 희석하였다.

히트 비드는 COPAS Plus에 의해 96 타이터(titer) 웰 플레이트 상에 장착된 200 ul 폴리프로필렌 튜브 스트립 속으로 분류되었다. 게이팅(gating) 및 분류 영역은 최적화되었고, 2-단계 분류 전략이 신속하고도 확고한 분류를 위해 이용되었다. 제1 분류에서는 비드를 높은 농도 범위 (>1,000 비드/ml)로 정제하였다. 제1 단계 분류 동안, PBS 내에서 분석된 라이브러리 비드 중 200 트리그(trig) (약 300,000 비드)가 시드(sheath) 용액으로서 탈이온수로 분류되었다. 샘플 컵 내의 비드를 플로우 셀(flow cell)에 통과시킨 후, >100 개체/초의 속도로 유체역학적으로(hydrodynamically) 집중시켰다. 타임 오브 플라이트(time-of-fiight, TOF), 적색 형광 및 적색 형광 피크 높이의 비드가 적색 다이오드 레이저(λ=635 nm)에 의해 검출되었다. 비드의 자동 형광 발광으로 인해, 아르곤 이온 레이저가 의도적으로 꺼져 블리드-스루(bleed-through) 효과를 최소화 하였다. 일반적으로 5,000 미만의 비드 (< 1.7%)가 제1 분류 단계에서 수집되었다. 제2 단계 분류를 위해, 제1 단계로부터 분류된 비드를 탈이온수로 완전 세척한 후, COPAS Plus의 샘플 컵에 옮긴 다음, 100 ml의 탈이온수로 희석하였다. 샘플 컵 내의 비드를 <5 개체/초의 속도로 플로우 셀에 통과시켰다. 각 히트 비드는 96 타이터 웰 플레이트의 원추형 웰 속으로 직접 분류되었다.

실시예 2

본 실시예에서는 바이오폴리머 라이브러리를 사용하는 스크리닝 분석을 나타낸다.

본 실시예에서 이용된 모든 OBOC 펩티드 라이브러리는 비드 상에 고 순도 펩티드를 확보하기 위해서 이중 커플링법을 이용하여 제조되었다. 표적 바이오마커 bCAII에 대한 앵커 서열은 하기 i) 및 ii)의 단계별 스크리닝에 의해 얻어졌다:

i) 시스테인 및 메티오닌을 제외하고, 인조 D-입체이성질체, 즉 천연 L-아미노산의 에난티오머를 포괄하는 헥사머 라이브러리, 및

ii) 상기 라이브러리를 스크리닝하여 얻어진 결과를 기본으로 선택된 아미노산을 이용하는 집중된 헥사머 라이브러리.

실시예 2에서, D-입체이성질체는, 표준보다 낮은 경우로, 단일 글자 약어(예를 들면, W = L-트립토판, W = D-트립토판)로 하였다. 통상적인 배양은, 비특이적 결합을 억제하기 위한 차단제로서 소 혈청 알부민 (BSA)의 존재 하에 완충 용액 중에서 10 nM의 bCAII-AlexaFluor 647 콘주게이트로 18 시간 동안 실시되었다. 최적화된 CNBr 절단 조건을 이용하여 단일 비드로부터 절단된 펩티드를 MALDI-MS/MS 서열화 하기 전에, COPAS Plus (Union Biometrica)를 사용하여 자동적으로 분류가 실시되었다.

이미 확보된 앵커 펩티드 헥사머-1 (lhrywf) (SEQ ID NO. 7)를 가지고, h 와 r 사이에 메티오닌을 혼입함으로 N-말단으로부터 시작하여 테트라머 펩티드를 부착함으로써 새로운 가변적 영역이 구성되었다. 그 결과 절단된 화합물은 MS 서열화를 용이하게 하기 위한 헥사머 펩티드로 될 수 있다. 커플링된 메티오닌의 양은 결합 공정에서 절단 가능한 링커의 악영향을 방지하기 위해 오로지 15 내지 20%인 반면, N-말단은 아세틸기에 의해 차단되어 비특이적 결합을 감소시켰다. 데카머-Nl (kvtflhrywf) (SEQ ID NO. 8)은, 집중된 라이브러리의 발생 없이 초기 스크리닝으로부터 얻어진 결과 중에서 직접 선택되었다. 헥사머-1 (lhrywf) (SEQ ID NO. 7) 및 데카머-Nl (kvtflhrywf) (SEQ ID NO. 8) 모두는 아세틸기에 의해 차단된 N-말단을 갖는 Rink 아미드 수지로부터 시작하여 재구성되었다. 도트 블롯 실험을 위해서, 펩티드는 테더(tether)로서 PEG2 (Merck, 20 원자)를 사용함으로써 C-말단에서 바이오틴으로 콘주게이트되었다(도 9). 두 펩티드가 bCAII과 상호작용하는 것으로 밝혀진 반면, 연장된 데카머-Nl (kvtflhrywf) (SEQ ID NO. 8)는, 표면 플라스몬 공명 (SPR) 센서그램에서 더 높은 반응 단위(RU)를 나타낼 뿐만 아니라, 결합-분해 형태로 더 많은 항체-형 작용을 나타냈다. 도트 블롯 실험에서는 또한 데카머-Nl 이 선을 따라 퇴적된 bCAII의 연속적인 감소로 더 많은 점(spots)을 나타냄으로써 bCAII을 향해 더 강력해졌다는 것을 나타낸다. 재미있게도, 헥사머-1이 인간 탄산탈수효소 II (hCAII)를 향해 더 강력할지라도, 연장된 데카머-Nl은 소 및 인간 마커 모두에 대해서도 마찬가지로 강력한 것으로 밝혀졌다. 이들의 결과로부터, 이러한 방법은 분명히 단순한 연장법을 통해 펩티드 리간드의 잠재성 및 특이성을 촉진시키는 분명한 작용을 한다는 것을 알 수 있다. 부분 혼입이 스크리닝 과정에서 절단 가능한 링커의 참여를 최소화 하는 것을 돕는다는 것을 주목할만 하다. 그 결과 연장된 데카머-Nl은 신뢰성 있는 스크리닝에 의해 얻어진 진정한 히트로 입증되었다.

앵커 펩티드의 N-말단에서 연장

더 최적화된 분석 조건 뿐만 아니라 더욱 정확한 분류 및 서열화 기술을 이용하여 새로운 스크리닝 캠페인(campaign)을 실시하였다. 또 다른 앵커 펩티드 헥사머-2 (ifvykr) (SEQ ID NO. 9)가 얻어져서 bCAII를 향해 헥사머-1보다 더 좋은 성질을 나타내기 위해 SPR 및 도트 블롯에 의해 실험되었다. 헥사머-2로부터 시작하여, 또 다른 연장된 라이브러리는 f와 v 사이의 메티오닌의 일 부분을 위치시키는 유사한 방법으로 구성되었다. 박스 내의 히스토그램으로 나타나는 포괄적인 헥사머 라이브러리로부터 얻어지는 스크리닝 결과를 기본으로, 집중된(focused) 라이브러리가 구성되고 스크린되어 연장된 데카머 리간드에 대한 20개의 후보(candidate)를 얻었다(도 10). 20 개의 후보 펩티드를 bCAII를 향해 동등한(competitive) 환경 하에 놓음으로써 신속한 스크리닝을 실시하였다. 마지막으로 3개의 데카머 펩티드가 선택 및 재구성되었고, 도트 블롯 실험에서 시험되었다. 3개의 모든 데카머 펩티드가 전개된 스폿을 20 ng까지의 퇴적된 bCAII 를 나타냄으로써 그들의 전구체 헥사머-2에 비해 매우 친화력이 크게 증진된 반면, 데카머-3 (ryrr-ifvykr) (SEQ ID NO. 10)는 추가 조사를 위해 가장 우수한 것으로 나타냈다.

앵커 펩티드의 C-말단에서 연장

C-말단에서의 연장은 100 % 메티오닌의 혼입으로 시작되었으며, 이는 합성 및 MS 조작을 더 쉽게 하였다. 메티오닌을 TentaGel S 아미노 수지에 부분적으로 커플링하는 대신에, 과량의 Fmoc-메티오닌이 절단 가능한 링커를 충분히 커플링하기 위해 사용되었다. 그 다음, 가변적 테트라머 영역을 구성하고, 메티오닌 및 시스테인을 제외한 18 d-아미노산을 이용한 다음, 앵커 모티프, ifvykr (SEQ ID NO. 9)를 선형 합성함으로써 합성을 계속하였다. N-말단은 상술한 바와 같이 아세틸기에 의해 차단되었다. 100% 절단 가능한 링커의 사용으로 인해 쉬운 합성 및 MS 샘플링의 장점에도 불구하고, 절단된 데카머 펩티드의 새로운 서열화는, 비교적 더 크게 이온화된 단편의 감소된 질량 민감성으로 인해, 특히 N-말단 근처의 아미노산에 대해 더욱 자극적이었다. 신속하고 강한 새로운 펩티드 서열화를 위한 펩티드의 최적의 길이는 10 이하의 아미노산인 것처럼 보였다. 전체적인 플로우는 N-말단에서의 연장과 유사한 방식으로, 즉 집중된 라이브러리 및 20개 후보의 2 이상의 스크리닝으로 진행되었다(도 11). 최종 3개의 데카머 펩티드는, 전구체 헥사머-2 (ifvykr) (SEQ ID NO. 9)에 비해 크게 증가된 친화력을 나타내도록, 도트 블롯에 의해 확인할 수 있도록 C-말단에서 라벨된 바이오틴으로 재구성되었다. 그들의 친화력이 전개된 스폿을 20 ng 이하로 분명히 나타내도록 N-말단으로부터 연장된 히트의 것들과 대조적으로 나타난 것은 주목할 만하다. 3 개의 연장된 히트 중에서, 데카머-4 (ifvykr-wryp) (SEQ ID NO. 11)가 추가 조사를 위해 가장 우수한 것으로 나타났다.

연장된 펩티드의 조합

2개의 연장된 펩티드 리간드를 중간에 유지된 앵커 모티프와 조합함으로써 친화력이 더 커지게되었다는 것은 분명하였다. 조합된 테트라데카머-N2C (ryrr-ifvykr-wryp) (SEQ ID NO. 12)는, 바이오틴 잔기를 C-말단에 부착하는 것으로 시작한 후, PEG2 잔기를 스페이서로서 취하는 통상적인 펩티드 합성에 의해 정교하게 형성되었다(도 12). 2개의 기타 펩티드가 또한 앵커 모티프를 i) 6개의 연속적인 글리신, 및 ii) 유사한 길이의 PEG4 (19 원자)로 대체함으로써 비교를 위해 합성되었다[Chung, S.; Parker, J. B.; Bianchet, M.; Amzel, L. M.; Stivers, J. T. Nat. Chem . Biol . 2009, 5, 407-413]. 각 펩티드 리간드의 농도는 0.5 μM로부터 0.1 μM까지 감소되었다는데, 이는 더 많은 수의 스폿으로 나타내진 더 높은 친화력을 관찰할 수 있을 것으로 기대되었다. 간단히 말해서, 초기 앵커 헥사머-2 (ifvykr) (SEQ ID NO. 9)보다 훨씬 더 강력할지라도, 테트라데카머-N2C의 친화력은 2개의 전구체, 데카머-N2 및 데카머-C2로부터 크게 개선되지 못하였다. 앵커 모티프를 갖지 않는 2개의 펩티드는 bCAII에 크게 결합되지 않는 것으로 밝혀졌다. 이들 결과로부터, 펩티드가 표적과 어느 정도 상호작용해야 하는 단편화된(segmented) 서열을 여전히 함유할지라도, 앵커 모티프는 표적 마커를 향한 결합 친화력을 유도할 수 있다는 것을 알 수 있다. 각 테트라머 펩티드 (ryrr 및 wryp) (SEQ ID NO. 4 및 SEQ ID NO. 5)에 의해 유도된 결합 친화력은 주어진 농도 범위 내에서 스폿을 충분히 나타내지 못하는 것 같다. 6개의 연속적인 글리신의 2차 일치가 앵커 모티프 (ifvykr) (SEQ ID NO. 9)와 크게 달라서 테트라머 펩티드 영역이 결합 위치에 접근하는 것을 방지하는 또 다른 가능성이다. 6개의 글리신을 더 신축성 있는 링커기로 대체하여 이러한 가설을 지지한다는 것은 재미있는 일이다.

각 말단 및 분기된 어떠한 지점에서의 연장은 전개 시간을 감소하기 위해서 동시에 실시될 수 있다. 각 연장된 세그먼트는, 항체를 대체하기에 충분히 잠재력이 있고 특이적일 수 있는 멀티-리간드-형 캡처제를 정교하게 만들도록, 조합될 수 있다(도 13).

SPR 에 의한 확인

펩티드 리간드는 확인 툴(tool)로서 SPR을 이용하여 bCAII에 대한 결합 친화력을 위해 조사되었다. 표적 마커는 Biacore TlOO 시스템에서 1,000의 반응 단위 (RU)까지 CM5 센서 칩에 부동화되었다. 일련의 농도를 갖는 각 펩티드 용액은, 글리신-하이드로클로라이드의 처리에 의해 매개된 분해 패턴 뿐만아니라 응답을 관찰하도록 칩의 표면을 통해 용출(elute)되었다. 도 14에 도시한 바와 같이, 펩티드 리간드에 의한 최대 응답 (R_max)은 최고의 농도(1.0 μM)에서 헥사머-2로부터 데카머로, 그 다음 테트라데카머로 (8 -> 40 -> 140) 단계별로 증가하였다. 조합된 리간드가 높은 응답을 나타낼 뿐만아니라 결합 및 분해에서 더욱 항체-형 패턴을 나타낸다는 것은 주목할만 하다. 이들 결과는 본 발명의 연장법이 주어진 표적 마커를 향한 친화력을 촉진시키기에 매우 효과적이라는 것을 분명히 알 수 있다.

4개의 기타 펩티드를 사용하여 SPR 실험을 더 실시하였다(도 15). 모티프 서열(ifvykr) (SEQ ID NO. 9) 대신에 각각 G6 및 PEG4를 함유하는 2개의 제1 펩티드는, RU 30 내지 40으로서 도 14의 2개의 데카머와 같은 응답을 가진 것으로 밝혀졌다. 도트 블롯 실험에서, 이들은 bCAII에 대해 큰 친화력을 나타내지 못하였다. 테트라머들은 여전히 리간드-형 작용을 나타낼지라도, 테트라머들은 결합력이 너무 약하여 낮은 응답만을 제공하는 것처럼 보였다.

실험 섹션

일반.

N-메틸피롤리돈 (NMP), 디에틸에테르 및 디클로로메탄 (DCM)을 Merck 사로부터 구입하였다. Fmoc-보호 아미노산 (Fmoc-AA's), 2-(1H-벤조트리아졸-l-일)-l,l,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (DIEA)을 GL Biochem (샹하이) 사로부터 구입하였다. 트리플루오로아세트산 (TFA) 및 트리이소프로필실란 (TIS)을 Aldrich 사로부터 구입하였다. 일련의 Fmoc-보호 PEG-COOH 및 Biotin-NHS를 Merck 사로부터 구입하였다., a-시아노-4-히드록시신남산 (CHCA)을 Bruker 사로부터 구입하였다. MALDI-MS 및 MS/MS는 Bruker 사의 상품, ultrafleXtreme^™ MALDI-TOF/TOF를 사용하였다. 마이크로파-보조 CNBr 절단 반응은 가정용 마이크로파 오븐 (모델: R-248J, 800 W, 2450 MHz) (샤프 사 제)를 사용하여 실시되었다.

펩티드 라이브러리의 합성 (모두 절단 가능한 링커로서 완전 및 부분적 메티오닌)

펩티드 라이브러리의 합성은 자동 합성기 Titan 357 (AAPPTEC)을 사용함으로써 실시되었다. TentaGel S 아미노 비드 (1.8 g, 90 μm; 용량 = 0.30 mmol/g; 2.86 x 10⁶ 비드/g)는 수집 용기(CV)에서 2 시간 동안 NMP (27 ml) 중에서 팽윤되었다. 링커로서 충분한 메티오닌의 혼입을 위해, 용매를 배출한 후, Fmoc-메티오닌(2.5 당량, NMP 중 0.2 M 용액) 뿐만아니라 TBTU (2.5 당량, NMP 중 0.2 M 용액) 및 DIEA (5 당량, NMP 중 0.5 M 용액)를 수집 용기(CV)에 첨가하였다. 그 결과 얻어진 혼합물을 30 분 동안 교반하였다. 용액을 배출하고, 그 결과 얻어진 비드를 NMP (27 ml x 3)로 완전히 세척하였다. 링커로서 부분적 (예를 들면 20 %) 메티오닌을 혼입하기 위해, Fmoc-메티오닌 (0.4 당량)은, 팽윤된 비드 (1.8 g)를 첨가하기 전에, NMP (20 ml) 중의 TBTU (0.2 당량)로 10 분 동안 미리 배양되었다. 교반 5 분 후에, DIEA (2.0 당량, NMP 중 0.5 M 용액)를 현탁액에 첨가하였다. 그 결과 얻어진 혼합물은 NMP (27 ml x 3)로 세척하기 전에 30 분 동안 교반하였다. 그 다음, NMP (27 ml, 20 %, v/v) 중 피페리딘 을 첨가하고, 수집 용기(CV)를 5 분 동안 교반하였다. 액체를 배출하고, NMP (27 ml, 20 %, v/v)중 피페리딘의 새로운 부분에 의해 15 분 동안 비드를 처리하였다. 그 결과 얻어진 비드를 NMP (27 ml x 3) 및 DCM (27 ml x 3)로 완전히 세척한 다음, 18 개의 반응 용기 (RV) 속으로 동일하게 배분하였다. 18개 아미노산의 여러 요소 (2 당량, 시스테인 및 메티오닌 제외, NMP 중 0.2 M 용액) 중 하나, 뿐만아니라 TBTU (2 당량, NMP 중 0.2 M 용액), 및 DIEA (5 당량, NMP 중 0.5 M 용액)를 각 반응 용기(RV)에 첨가하였다. 반응 용기(RV)를 30 분 동안 교반하였다. 용액을 배출한 후, 커플링 단계를 반복하였다. 그 결과 얻어진 각 반응 용기(RV) 내의 비드를 NMP (1.5 ml x 3)로 세척하였다. NMP(각 1.5 ml, 20 %, v/v) 중의 피페리딘의 새로운 2개 부분을 사용하여 각각 5 분 및 15 분 동안 Fmoc 기를 제거하였다. 용액을 배출한 후, 각 반응 용기(RV) 내의 비드를 NMP (1.5 ml x 3) 및 DCM (1.5 ml x 3)로 완전히 세척한 다음, 수집 용기(CV)에 넣었다. 비드가 펩티드의 의도된 길이를 부착할 때까지 전체적인 분할, 커플링, 보호해제 및 혼합 공정을 반복하였다. 필요한 경우, 비드를 DIEA (15 ml, NMP 중 0.5 M 용액)의 존재 하에, 무수 아세트산 (15 ml, NMP 중의 0.3 M 용액)으로 15 분 동안 처리함으로써 N-말단에 아세틸기를 도입하였다. 필터가 구비된 50 ml 반응기에 조합된 비드를 넣었다. 잔류물을 위한 산-라벨 보호기는 TFA-물-TIS (27 ml, 95:2.5:2.5, v/v/v) 중에서 2 시간 동안 흔들어줌으로써 제거되었다. 용매를 배출하고, 그 결과 얻어진 비드를 DCM (27 ml x 3), 메탄올 (27 ml x 3), 물 (27 ml x 3), 메탄올 (27 ml x 3), DCM (27 ml x 3), 및 디에틸에테르 (27 ml)로 연속적으로 완전 세척한 다음, 감압 하에서 24 시간 동안 건조하였다.

펩티드 리간드의 합성

자동 합성기 Titan 357 (AAPPTEC)의 반응 용기(RV) 내에 있는 웰(ewll)을 반응기로서 사용하였다. 링크(Rink) 아미드 수지 (100 mg, 아미노기:0.31 mmol/g을 로딩)를 NMP (1.5 ml) 중에서 15 분 동안 팽윤한 다음, 용매를 배출하였다. NMP(1.5 ml x 2, 20 % v/v) 중의 피페리딘으로 각각 5 분 및 15 분 동안 처리함으로써 Fmoc기를 제거한 후, 필요한 Fmoc-아미노산 (2.5 당량, NMP 중 0.2 M 용액), TBTU (2.5 당량, NMP 중 0.2 M 용액), 및 DIEA (5 당량, NMP 중 0.2 M 용액)를 연속적으로 첨가하고, 그 결과 얻어진 비드를 30 분 동안 교반하였다. 비드가 목적하는 서열을 부착할 때까지, 각 단계에서 필요로 하는 Fmoc-아미노산을 사용하여 보호해제-커플링 사이클을 반복하였다. 바이오틴-라벨된 펩티드를 합성하는 경우에, Fmoc-Lys(Mtt)-OH를 초기에 커플링한 후, TFA/TIS/DCM 용액(각 1.5 ml, 1/5/94 v/v/v)으로 각각 2 분, 5 분, 30 분 동안 연속적으로 처리함으로써 Mtt 기를 제거하였다. 그 결과 얻어진 비드를 DCM (1.5 ml x 3), NMP (1.5 ml) 및 그 다음 NMP (1.5 ml, 0.1 M) 중의 DIEA 용액으로 완전 세척하였다. 바이오틴-NHS (1.5 당량) 및 DIEA (5 당량)을 15 분 동안 교반하면서 NMP (1.5 ml) 중의 비드에 처리하였다. 그 결과 얻어진 비드를 NMP (1.5 ml ^'x 3)로 완전 세척하였다. 그 결과 얻어진 비드를 NMP (3 ml x 4)로 완전 세척하였다. 그 다음, NMP (5 ml, v/v) 중 20 % 피페리딘을 첨가하고, 반응용기(RV)를 5분 동안 교반하였다. 액체를 배출하고, NMP (3 ml, v/v) 중 20 % 피페리딘의 새로운 용액을 첨가한 다음, 반응용기(RV)를 15분 동안 더 교반하였다. 그 결과 얻어진 비드를 NMP (3 ml x 4) 및 DCM (3 ml x 4)로 완전 세척하였다. 필요한 아미노산 또는 PEG 기는, 시스테인 및 메티오닌을 제외한 18개의 인조 Fmoc-보호 아미노산 및 Fmoc-PEG-COOH을 사용하여 상술한 바와 같이 서열에 도입되었다.

필요한 경우, DIEA (1 ml, NMP 중 0.5 M 용액)의 존재 하에서 비드를 무수 아세트산 (1 ml, NMP 중 0.3 M 용액)으로 15 분 동안 처리함으로써 N-말단에 아세틸기를 도입하였다. 비드를 필터가 구비된 8 ml 반응기로 옮긴 후, 실온에서 2 시간 동안 트리플루오로아세트산(TFA)/물/TIS (2 ml, 94/3/3, /v/v/v)에서 배양하였다. 절단 용액을 수집한 후, 질소 스트림 중에서 농축하였다. 준비된 HPLC를 사용하여 최종 정제를 실시함으로써 C-말단에 카르복사미드기를 갖는 소망의 펩티드 (통상적인 양 1~5 mg, 순도 >95 %)를 백색 고체 형태로 생성하였다.

라이브러리의 스크리닝 및 분류

스크리닝을 위해, 공급자의 프로토콜에 따라서, Alexa Fluor 647 단백질 라벨링 키트 (A20173, 인비트로겐)을 사용하여 bCAII 단백질을 먼저 라벨링하였다. 먼저, bCAII의 2 mg/mL 용액을 0.1 M 중탄산나트륨(pH =8.3)에 용해하였다. 그 다음, 이러한 bCAII 용액 0.5 mL를 반응성 염료의 바이얼로 옮겼다. 바이얼의 뚜껑을 닫은 다음, 염료가 완전 용해할 때까지 수회 거꾸로 하였다. 반응 혼합물을 어두운 조건 하에 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. Alexa Fluor 647-라벨된 bCAII은, 라벨링 키트 내의 사이즈 배제 정제 수지를 사용하여 혼합물로부터 정제되었다. 정제 및 라벨된 bCAII는 UV-vis 분광법(spectroscopy) 및 SDS-PAGE로 특징지어졌다. 스크린을 위해서, 100 mg의 라이브러리 수지를 8 mL Alltech 용기로 옮긴 후, 블로킹 용액, 0.05 % NaN₃, 0.1 % Tween 20 및 PBS 완충액 (pH 7.4) 중의 0.1 % BSA에서, 360° 셰이커 상에서 25 ℃에서 1 시간 동안 미리 배양하였다. 완충 용액을 진공에 의해 배출한 다음, 블로킹 용액으로 희석된 10 nM 염료-라벨된 bCAII 5 mL를 팽윤 수지에 첨가하였다. 그 결과 얻어진 혼합물을 15 내지 18 시간 동안 360° 셰이커 상에서 25 ℃에서 배양하였다. 액체를 진공에 의해 배출하고, 비특이적으로 결합된 단백질은 블로킹 용액으로 3회 그리고 PBS 완충액 중의 0.1 % Tween 20으로 3회 연속해서 세척함으로써 제거되었다. 마지막으로, 수지를 PBS 완충액으로 6회 세척하였다. 엄격하게 세척한 후, 200 mg의 분석된 라이브러리 수지를 COPAS Plus (Union Biometrica)의 샘플 용기 속으로 옮긴 후[Fields, G. B.; Noble, R. L. Int. J. Pept. Protein Res. 1990, 55, 161-214], 200 mL의 PBS 완충액 (pH 7.4)으로 희석하였다. 2-단계 분류를 이용하였다. 제2 분류에서, 포지티브(positive) 비드는 원추형 웰을 갖는 96 타이터 웰 플레이트 속으로 직접 분류되었다. 후속적으로 CNBr 절단 및 MALDI-MS 및 MS/MS를 실시하였다.

CNBr 에 의해 분류된 단일 비드로부터 펩티드의 절단

10 μL의 탈이온수를 함유하는 마이크로 크기의 바이얼에 단일 비드를 옮겼다. 반응 용기를 아르곤으로 15 분 동안 퍼지한 다음, CNBr (10 μL, 0.2 N HCl 용액 중 0.50 M)을 용기에 넣었다. 아르곤으로 15 분 동안 더 퍼징한 후, 바이얼을 마이크로파로 1분 동안 처리하였다. 그 결과 얻어진 용액을 원심진공 하에 45 ℃에서 10분, 그 다음 60 ℃에서 50분 동안 농축하였다.

MALDI - MS 및 MS / MS 를 사용하여 단일 비드로부터 절단된 펩티드의 분석

충분히 절단 가능한 비드에 있어서, 각 바이얼 또는 웰에 CHCA [7 μL, 아세토니트릴/물 (70:30) 중의 0.5 % 용액]과, 그 다음 아세토니트릴/물 [7 μL, 70:30, 0.1 % TFA (v/v) 및 1 mM 일염기성 암모늄 포스페이트 함유]을 첨가하였다.

부분적으로 절단 가능한 비드 (예를 들면, 20 %)에 있어서, 각 바이얼 또는 웰에 CHCA [2 μL, 아세토니트릴/물 (70:30) 중의 0.5 % 용액]와, 그 다음 아세토니트릴/물 [2 μL, 70:30, 0.1 % TFA (v/v) 및 1 mM 일 염기성 암모늄 포스페이트 함유]을 첨가하였다. 플레이트를 2 분 동안 원심분리한 후, 각 용액 (2 μl)을 취하여 384-웰 MALDI 플레이트 상에 스폿팅한 다음, 15 분 동안 방치하여 자연 건조하였다. ultrafleXtreme™ MALDI-TOF/TOF 질량 분석기(Bruker Daltonics 사 제품)으로 MALDI-MS 및 MS/MS를 실시하였다.

재합성된 펩티드 리간드의 친화력을 측정하기 위한 표면 플라스몬 공명( Surface Plasmon Resonance , SPR ) 실험

친화력은 Biacore TlOO 시스템 및 실험실 급 CM5 센서 칩(GE Heathcare)을 사용하여 측정되었다. 실험 기구를 HBS-EP+ (GE Heathcare) 완충액을 프라임(prime) 처리하였다. 비특이적 결합, 드리프트(drift), 및 벌크 굴절률을 빼기 위해 참고로 플로우 셀 1(또는 3)을 사용한 반면, 플로우 셀 2 (또는 4)는 표준 절차에 따라 표적 바이오마커 (bCAII)로 부동화되었다. 0.4 M EDC 및 0.1 M NHS의 1:1 혼합물을 사용하여 플로우 셀 2 (또는 4)을 활성화한 후, 0.1 mg/mL의 bCAII 용액을 주입하였다. 나머지 활성화된 기의 블로킹은 에탄올아민 (pH 8.5) 1M 용액으로 실시되었다. bCAII은 약 5,000 응답 유닛(RU)에 의해 센서 칩 표면 상에서 부동화되었다. 실험(running) 완충액 (HBS-EP+)을 사용하여 실험기구를 프라임 처리하였다. 확인된 헥사머 리간드 후보 각각을 HBS-EP+ 완충액에 용해하여 각 펩티드에 대한 5 μM 펩티드 스톡 용액을 생성한 다음, 2의 팩터까지 연속 희석하여 2 nM 아래까지 농도 시리즈를 형성하였다. 주어진 친화력 즉정을 위해, 25 ℃에서 100 μL/분의 유속을 이용하여, 이들 시리즈의 펩티드 용액을 접촉 시간 3 분, 분해 시간 5 분, 및 안정화 시간 3.5 분 동안 플로우 셀 2(또는 4) 속으로 연속 주입하였다. 플로우 셀 2 (또는 4)는, 각 펩티드 용액의 주입 후 글리신 2.5 (GE Healthcare)에 의해 재생되었다.

바이오틴에 콘주게이트된 재합성 펩티드 리간드의 친화력을 측정하기 위한 도트 블롯 분석

표적 바이오마커(bCAII)에 대한 펩티드 리간드의 친화력은 TBS-T [25 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 % Tween 20 (pH 8.0)] 내의 5 % 무지방 분유 중에서의 도트 블롯 실험을 이용하여 입증되었다. bCAII의 용액은 PBS 완충액 (pH 7.4) 중 10 mg/mL 스톡으로서 제조되었다. 모액에 대한 일련의 희석은 통상 2 μg 내지 5 ng/스폿의 범위에서 니트로셀룰로오스 멤브레인에 이용되었다. 멤브레인은 5 % 무지방 우유/TBS-T에서 2 시간 동안 실온에서 블로킹되었다. 그 다음 멤브레인을 TBS-T로 세척하였다. 링커로서 PEG2 (20 원자, Novabiochem^®)으로 바이오틴에 콘주게이트된 펩티드 리간드 용액은 5 % 무지방 우유/TBS-T에서 0.5 μM로 제조된 후, 멤브레인 상에서 2 시간 동안 실온에서 배양되었다. TBS-T로 10 분 동안 3회 세척한 후, 0.5 % 우유/TBS-T로 제조된 1:3,000 스트렙타비딘-HRP (Abeam)을 멤브레인에 첨가한 후 2 시간 동안 배양하였다. TBS-T로 10 분 동안 3회 세척한 후, 멤브레인을 화학발광 시약 (Amersham ECL plus Western 블로팅 검출 시약, GE Healthcare)으로 처리한 다음, 즉시 필름에 현상하였다.

본 명세서에서 본 발명에 대한 몇 가지 실시양태를 설명하고 예증하였지만, 본 기술 분야에서 숙련된 사람들은 기능을 실시하고 및/또는 본 명세서에서 설명된 결과 및/또는 1 또는 그 이상의 장점들을 얻기 위한 기타 여러 가지 수단 및/또는 구조를 쉽게 생각해 낼 수 있을 것이며, 그리고 이러한 변형 및/또는 변경의 각각은 본 발명의 범위 내에 속하게 될 것이다. 더욱 일반적으로, 본 기술 분야에서 숙련된 자들은 본 명세서에서 설명된 모든 파라메터, 치수, 물질, 및 구조가 예시적인 것을 의미하며, 그리고 실제적인 파라메터, 치수, 물질, 및/또는 구조가 특정 분야 또는 본 발명의 가르침이 이용되는 분야에 따라 달라지게 된다는 것을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 본 기술 분야에서 숙련된 자들은 일상적인 실험 이외의 것들, 그리고 본 명세서에 기술된 본 발명의 특정 실시양태와 동일한 수많은 것들을 인식할 수 있고, 확인할 수 있을 것이다.

그러므로, 상기 실시양태는 예시적인 목적으로만 제공되며, 그리고 첨부된 특허청구범위 및 그에 해당 사항 내에서 본 발명이 특별히 설명되고 청구된 것 이외로 실시될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본 발명은 본 명세서에서 설명한 각각의 개별적인 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 이러한 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법들이 서로 불일치하지 않는다면, 2 이상의 이러한 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법들을 어떠한 방법으로도 조합하는 것은 본 발명의 범위 내에 포함된다.

본 명세서의 상세한 설명 및 특허청구범위에서 기재된 모든 정의는 사전적 정의 및 본 명세서에서 참고로 하는 문헌에서의 정의 및/또는 한정된 용어의 일반적인 의미를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서의 상세한 설명 및 특허청구범위에서 사용된 부정 관사 "a" 및 "an"은, 별도로 분명히 나타내지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서의 상세한 설명 및 특허청구범위에서 "및/또는"이란 용어는, 상기와 같이 결합된 요소, 즉 어떤 경우에 결합하여 존재하는 요소 그리고 다른 경우에는 분리적으로 존재하는 요소의 "어느 하나 또는 모두"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"으로 열거된 다수의 요소들은 동일한 방식, 즉 상기와 같이 결합된 요소의 "1 또는 그 이상의"로 해석되어야 한다. 특별히 확인된 요소들과 관련되거나 관련되지 않을지라도. 기타 요소들은 "및/또는" 용어로 특별히 확인된 요소 이외에 임의로 존재할 수 있다. 이와 같이, 비제한적인 예로서, “포함하는”과 같이 오픈-엔드 언어와 관련하여 사용될 때, "A 및/또는 B"는, 일 실시양태에서 A 만 (B 이외의 요소를 임의로 포함)을 의미하고; 또 다른 실시양태에서 B 만(A 이외의 요소를 임의로 포함)을 의미하고; 또 다른 실시양태에서는 A 및 B 모두(기타 요소들을 임의로 포함)을 의미한다.

본 명세서 및 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, "또는"이란 용어는 상술한 바와 같이 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, 리스트에서 항목을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 즉, 숫자 또는 요소의 수 및 임의적으로는 추가적인 항목중 적어도 하나를 포함할 뿐만 아니라 1보다 큰 것을 포함하는 의미로 해석되어야 한다.

별도로 분명하게 언급되지 않은 용어, 이를테면 "오직 하나 또는 "정확히 하나" 또는, 청구범위에서 "구성되는"은 숫자나 요소 리스트의 정확히 한 요소를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 일반적으로, 본 명세서에서 "또는"이란 용어는 "어느 하나", "중 하나", "중 오직 하나" 또는 "중 정확히 하나"와 같이 배제성을 띄는 용어로 나올 때 배타적인 용어(즉 "하나 또는 다른 것, 그렇지만 둘은 아닌 것)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 특허청구범위에서 사용되는 "주로 구성되는"이란 용어는 특허법 분야에서 사용되는 일반적인 의미를 갖는다.

본 명세서의 상세한 설명 및 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 1 또는 그 이상의 요소에 대한 리스트와 관련하여 “적어도 하나”라는 용어는, 요소의 리스트에서 1 또는 그 이상의 어떠한 요소로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하는 것으로 이해하여야 하지만, 요소의 리스트 내에 특별히 열거된 매 요소들 중 적어도 하나를 포함하고 요소의 리스트 중 어떠한 조합의 요소들을 반드시 포함하지 않는 것을 의미하는 것으로 이해하여야 한다.

특별히 확인된 상기 요소들과 관련이 있든 없든 간에, 이러한 정의는 또한 "적어도 하나"라는 용어가 관련된 요소의 리스트 내에서 특별히 확인된 요소들 이외에 요소들이 선택적으로 존재할 수 있다는 것이 가능하다. 그러므로, 비제한적인 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나" (또는, 동등하게는, “A 또는 B 중 적어도 하나" 또는, 동등하게는 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는 일 실시양태에서 적어도 하나, 임의적으로는 1 보다 큰 것, A, B가 존재하지 않는 것(및 B 이외의 요소들을 임의로 포함)을 의미할 수 있고; 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나, 임의적으로는 1보다 큰 것, B, A가 존재하지 않는 것(및 A 이외의 요소들을 임의로 포함)을 의미할 수 있고; 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나, 임의적으로는 1보다 큰 것, A, 및 적어도 하나, 임의적으로는 1보다 큰 것, B (및 기타 요소들을 임의로 포함)를 의미할 수 있다.

또한, 별도 언급이 없는 한, 1 단계 이상을 포함하여 청구된 어떠한 방법에서, 방법의 단계나 동작의 순서는, 방법의 단계나 동작이 인용되는 순서에 제한될 필요가 없는 것으로 이해되어야 한다.

상세한 설명 및 특허청구범위에서, "포함하는", "갖는", "함유하는", "유지하는", "이루어진“ 등과 같은 표현은 제한적이지 않은 표현으로 이해되어야 한다. "구성되는” 및 "본질적으로 구성되는“이라는 표현만이, 미국특허청, 특허심사 규정 매뉴얼, 섹션 2111.03에 규정된 바와 같이, 각각 폐쇄적 또는 반폐쇄적인 표현이다.

100: 입자 110: 제1 바이오폴리머 종
120: 제2 바이오폴리머 종 130: 절단 가능한 링커
140: 가변 서열 150: 앵커 서열
160: 제2 바이오폴리머 종의 일부

Claims

제1 바이오폴리머와 제2 바이오폴리머의 혼합물을 포함하고, 상기 제2 바이오폴리머가, 절단 가능한 링커를 함유하는 1 또는 그 이상의 부위를 제외하고, 제1 바이오폴리머와 동일한 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 제1 바이오폴리머와 제2 바이오폴리머가 각각 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 제1 바이오폴리머와 제2 바이오폴리머가 각각 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 제1 바이오폴리머와 제2 바이오폴리머가 각각 다당류를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 절단 가능한 링커가 메티오닌인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 제1 바이오폴리머와 제2 바이오폴리머가 표면에 부착되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 6항에 있어서, 표면이 입자의 외부 표면인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 제1 바이오폴리머 대 제2 바이오폴리머의 비가 1:1보다 더 큰 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 다수의 상기 혼합물을 더 포함하고, 각 혼합물이 별도의 입자에 부착되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2항에 있어서, 제1 바이오폴리머가 앵커 아미노산 서열과 N-말단 아미노산 서열 연장을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2항에 있어서, 제1 바이오폴리머가 앵커 아미노산 서열과 C-말단 아미노산 서열 연장을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 제2 바이오폴리머가 제1 바이오폴리머보다 더 긴 적어도 하나의 서브유닛인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2항에 있어서, 제2 바이오폴리머가 제1 바이오폴리머보다 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2항에 있어서, 제2 바이오폴리머가 제1 바이오폴리머와 동일한 수의 아미노산을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
표면 상에 바이오폴리머를 성장하는 단계를 포함하고, 상기 표면에 성장된 바이오폴리머의 일 부분만이 절단 가능한 링커 전구체로부터 유도된 절단 가능한 링커를 함유하도록, 성장 단계 과정 동안 절단 가능한 링커 전구체가 바이오폴리머를 함유하는 배지에 첨가되고, 그리고 바이오폴리머에 혼입되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15항에 있어서, 절단 가능한 링커 전구체가 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15항에 있어서, 서열 상의 반응성 중심과 관련하여 절단 가능한 링커 전구체의 1 당량 미만이 배지에 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15항에 있어서, 배지가 절단 가능한 링커로부터 구별할 수 있는 아미노산 전구체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 18항에 있어서, 아미노산 전구체 대 절단 가능한 링커 전구체의 비가 1:1보다 큰 것을 특징으로 하는 방법.
제 18항에 있어서, 아미노산 전구체 대 절단 가능한 링커 전구체의 비가 5:1보다 큰 것을 특징으로 하는 방법.
제 18항에 있어서, 아미노산 전구체가 제1 보호기를 포함하고, 그리고 절단 가능한 링커 전구체가 제1 보호기와 다른 제2 보호기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15항에 있어서, 다수의 개별 입자 상에 바이오폴리머를 성장하는 단계를 더 포함하고, 각 입자가 독특한 바이오폴리머를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
다수의 바이오폴리머를 적어도 하나의 표면과 혼합하는 단계; 및
상기 다수의 바이오폴리머를 적어도 하나의 표면에 부착하여 표면에 부착된 바이오폴리머의 일 부분만이 절단 가능한 링커를 함유하는 단계
를 포함하는 방법.
결합 영역 및 절단 가능한 링커를 함유하는 바이오폴리머를 포함하고, 상기 결합 영역 및 절단 가능한 링커가 표적 종을 위한 결합 영역의 결합 친화력이 20% 미만까지 감소하기에 충분한 거리만큼 분리되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 24항, 제 32항 또는 제 33항에 있어서, 결합 영역이 항원결정인자인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 24항 또는 제 33항에 있어서, 결합 영역 및 절단 가능한 링커가 적어도 2개의 바이오폴리머 서브유닛에 의해 분리되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 24항, 제 32항 또는 제 33항에 있어서, 바이오폴리머가 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 절단 가능한 링커가 아미노산 서열의 C-말단의 5 아미노산 내에 위치하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 24항, 제 32항 또는 제 33항에 있어서, 제1 다수의 바이오폴리머가 표면에 부착되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 28항에 있어서, 제2 다수의 바이오폴리머가 표면에 부착되고, 제2 다수의 바이오폴리머가, 절단 가능한 링커를 함유하는 1 또는 그 이상의 위치를 제외하고는, 제1 다수의 바이오폴리머와 동일한 것을 특징으로 하는 조성물.
제 28항에 있어서, 표면이 입자의 외부 표면인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 24항, 제 32항 또는 제 33항에 있어서, 독특한 바이오폴리머의 라이브러리를 더 포함하고, 바이오폴리머의 각각이 별도의 입자에 부착되는 것을 특징으로 하는 조성물.
결합 영역 및 절단 가능한 링커를 함유하는 바이오폴리머를 포함하고, 결합 영역과 절단 가능한 링커가 적어도 2개의 바이오폴리머 서브유닛에 의해 분리되는 것을 특징으로 하는 조성물.
결합 영역과 절단 가능한 링커를 함유하는 바이오폴리머를 포함하고, 절단 가능한 링커가 바이오폴리머의 말단의 5개의 바이오폴리머 서브유닛 내에 위치하는 것을 특징으로 하는 조성물.
각 입자가 독특한 제1 바이오폴리머 및 절단 가능한 링커를 포함하는 독특한 제2 바이오폴리머를 포함하는 다수의 입자를 제공하는 단계;
다수의 입자를 표적과 접촉하는 단계;
임계치 이상에서 표적과 결합하는 다수의 입자의 멤버를 분리하는 단계;
다수의 입자의 분리된 멤버 상에 절단 가능한 링커를 절단하여 제2 바이오폴리머의 단편을 방출하는 단계; 및
제2 바이오폴리머의 단편의 서열을 결정하는 단계;
를 포함하는, 바이오폴리머의 라이브러리를 스크리닝하는 방법:
다수의 입자를 포함하고, 각 입자가 자체에 제1 바이오폴리머 및 제2 바이오폴리머를 부착하고, 제2 바이오폴리머가, 절단 가능한 링커를 함유하는 1 또는 그 이상의 위치를 제외하고, 제1 바이오폴리머와 동일한 것을 특징으로 하는 라이브러리.
제 35항에 있어서, 제1 바이오폴리머와 제2 바이오폴리머가 각각 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 라이브러리.
제 35항에 있어서, 제1 바이오폴리머와 제2 바이오폴리머가 각각 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 라이브러리.
제 35항에 있어서, 제1 바이오폴리머와 제2 바이오폴리머가 각각 다당류를 포함하는 것을 특징으로 하는 라이브러리.
제 35항에 있어서, 절단 가능한 링커가 메티오닌인 것을 특징으로 하는 라이브러리.
제 35항에 있어서, 제1 바이오폴리머 대 제2 바이오폴리머의 비가 1:1 보다 큰 것을 특징으로 하는 라이브러리.
제 35항에 있어서, 제1 바이오폴리머가 앵커 아미노산 서열과 N-말단 아미노산 서열 연장을 포함하는 것을 특징으로 하는 라이브러리.
제 35항에 있어서, 제1 바이오폴리머가 앵커 아미노산 서열과 C-말단 아미노산 서열 연장을 포함하는 것을 특징으로 하는 라이브러리.
제 35항에 있어서, 절단 가능한 링커가 제1 바이오폴리머의 길이에 비해 제2 바이오폴리머의 길이를 증가시키는 것을 특징으로 하는 라이브러리.
제 36항에 있어서, 제2 바이오폴리머가 제1 바이오폴리머보다 1 이상의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 라이브러리.
제 36항에 있어서, 제2 바이오폴리머가 제1 바이오폴리머와 동일한 수의 아미노산을 갖는 것을 특징으로 하는 라이브러리.