CN102498123A - 改进的生物聚合物筛选 - Google Patents

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Abstract

本文描述的是创造性的组合物以及涉及生物聚合物取样特别是生物聚合物部分取样的方法。在一方面，实施方案大体涉及独特的生物聚合物物质其中每种独特的生物聚合物物质的一部分含有可裂解接头。在一些实施方案中，所述生物聚合物物质可以与表面连接。例如，所述生物聚合物物质可以与珠连接。在一些实施方案中，可以通过裂解所述可裂解接头对独特的生物聚合物物质的一部分取样。在一些实例中，可以分析样品以确定所述生物聚合物的序列。

Description

改进的生物聚合物筛选
相关申请
本申请请求Heath等人2009年7月22日提交的申请号为PCT/SG2009/000258的国际专利申请(题为《同量异位氨基酸和其它物质的区分》)以及Heath等人2009年7月15日提交的申请号为61/225,881的美国临时专利申请(题为《改进的筛选基于珠的肽的方法和使用部分可裂解的肽的肽模拟文库》)的权益，其均通过引用并入本文。
发明领域
本文描述的是创造性的组合物以及涉及生物聚合物取样特别是生物聚合物部分取样的方法。
背景
拆分和混合合成方法已经被用于产生在小珠上的肽文库，每一珠含有单一肽分子。这样的文库被称为一珠一化合物(OBOC)文库。OBOC文库的普遍用途是从文库中鉴定执行一些感兴趣的功能的分子。例如，通过筛选文库与特定蛋白相关的珠(“命中(hit)”珠)，OBOC文库可以用来鉴定与所述蛋白结合的分子(即肽)。可以将命中珠从文库其余的珠分离，在特定命中珠上的肽的身份可以使用肽测序策略确定。
发明概述
本文描述的是创造性的组合物以及涉及生物聚合物取样特别是生物聚合物部分取样的方法。
在一个方面，提供了组合物。所述组合物包含第一生物聚合物和第二生物聚合物的混合物，其中除了在一或多个位置处第二生物聚合物含有可裂解接头外，所述第二生物聚合物与第一生物聚合物相同。
在一些实施方案中，第一生物聚合物和第二生物聚合物各自包含氨基酸序列。
在其它实施方案中，第一生物聚合物和第二生物聚合物各自包含核酸序列。
在仍然其它的实施方案中，第一生物聚合物和第二生物聚合物各自包含多糖。
在仍然其它的实施方案中，所述可裂解接头是甲硫氨酸。
在仍然其它的实施方案中，第一生物聚合物和第二生物聚合物与表面连接。
在仍然其它实施方案中，所述表面是颗粒的外表面。
在仍然其它实施方案中，第一生物聚合物与第二生物聚合物的比例大于1∶1。
在仍然其它实施方案中，所述组合物还包括多个所述混合物，其中每一混合物与单独的颗粒连接。
在仍然其它实施方案中，第一生物聚合物包含锚定氨基酸序列和N-末端氨基酸序列延伸。
在仍然其它实施方案中，第一生物聚合物包含锚定氨基酸序列和C-末端氨基酸序列延伸。
在仍然其它实施方案中，第二生物聚合物比第一生物聚合物长至少一个亚单元(subunit)。
在仍然其它实施方案中，第二生物聚合物比第一生物聚合物多包含至少一个氨基酸。
在仍然其它实施方案中，第二生物聚合物具有和第一生物聚合物相同数目的氨基酸。
在另一方面，提供了方法。所述方法包括在表面上生长生物聚合物，其中在生长步骤期间将可裂解接头前体添加至含有所述生物聚合物的介质并掺入所述生物聚合物，使得所述生长于表面上的生物聚合物仅一部分含有来源于所述可裂解接头前体的可裂解接头。
在仍然另一方面，提供了方法。所述方法包括使多个生物聚合物与至少一个表面混合并使所述多个生物聚合物与所述至少一个表面连接，使得与表面连接的所述生物聚合物仅一部分含有可裂解接头。
在一些实施方案中，所述可裂解接头前体包含至少一个氨基酸。
在其它实施方案中，将相对于所述序列的反应中心的少于1当量的所述可裂解接头前体添加至所述介质。
在仍然其它实施方案中，所述介质还包含可与所述可裂解接头区分的氨基酸前体。
在仍然其它实施方案中，所述氨基酸前体与所述可裂解接头前体的比例大于1∶1。
在仍然其它实施方案中，所述氨基酸前体与所述可裂解接头前体的比例大于5∶1。
在仍然其它实施方案中，所述氨基酸前体包含第一保护基团以及所述可裂解接头前体包含与第一保护基团不同的第二保护基团。
在仍然其它实施方案中，所述方法还包括在多个单独颗粒上生长生物聚合物，其中每一颗粒包含独特的生物聚合物。
在仍然另一方面，提供了组合物。所述组合物包含含有结合区和可裂解接头的生物聚合物，其中所述结合区和所述可裂解接头由足以使所述结合区对靶物质的结合亲和力的降低少于20％的距离分隔。
在仍然另一方面，提供了组合物。所述组合物包含含有结合区和可裂解接头的生物聚合物，其中所述结合区和所述可裂解接头由至少两个生物聚合物亚单元分隔。
在仍然另一方面，提供了组合物。所述组合物包含含有结合区和可裂解接头的生物聚合物，其中所述可裂解接头位于所述生物聚合物一端的5个生物聚合物亚单元内。
在一些实施方案中，所述结合区是表位。
在一些实施方案中，所述结合区和所述可裂解接头由至少两个生物聚合物亚单元分隔。
在仍然其它实施方案中，所述生物聚合物包括氨基酸序列，并且其中所述可裂解接头位于所述氨基酸序列C-末端的5个氨基酸内。
在仍然其它实施方案中，第一多个生物聚合物与表面连接。
在仍然其它实施方案中，第二多个生物聚合物与表面连接，其中除了在一或多个位置处第二多个生物聚合物含有可裂解接头外，所述第二多个生物聚合物与所述第一多个生物聚合物相同。
在仍然其它实施方案中，所述表面是颗粒的外表面。
在仍然其它实施方案中，所述组合物还包括独特的生物聚合物的文库，其中所述每种生物聚合物与单独的颗粒连接。
在仍然其它方面，提供了筛选生物聚合物文库的方法。所述方法包括提供多个颗粒，其中每个颗粒包括独特的第一生物聚合物和独特的第二聚合物，所述第二生物聚合物包括可裂解接头；使所述多个颗粒与靶接触；分离与靶的结合高于阈值水平的所述多个颗粒的成员；裂解所分离的所述多个颗粒的成员上的可裂解接头来释放所述第二生物聚合物的片段；并测定所述第二生物聚合物的片段的序列。
在仍然另一方面，提供了文库。所述文库包含多个颗粒，其中每个所述颗粒连接第一生物聚合物和第二生物聚合物，其中除了在一或多个位置处第二生物聚合物含有可裂解接头外，所述第二生物聚合物与所述第一生物聚合物相同。
从以下本发明多个非限制性实施方案的详细描述并结合附图进行考虑，本发明的其他优势和新特性将变得显而易见。除非另外注明，本文所引用的全部参考文献均以其整体援引加入本文。如果本说明书和通过援引加入的文献包括冲突和/或不一致的公开，应以本说明书为准。
附图简述
本发明的非限制性实施方案将通过实施例并参考附图来描述，附图是示意性的而并不旨在按比例描绘。在图中，描述的每个相同的或几乎相同的要素一般用相同数字表示。为了清楚的目的，如果图解说明对于本领域一般技术人员理解本发明不是必要，则并不是每个要素均在每幅图中标出，也不显示每一实施方案的每个要素。图中：
图1显示与第一生物聚合物和具有裂解接头的第二生物聚合物连接的颗粒；
图2显示根据一实施方案的通过限制添加的试剂来产生珠的两种方法，所述珠在特定位置含有部分量的甲硫氨酸；
图3显示根据一实施方案的通过使用预混合的氨基酸试剂来产生珠的两种方法，所述珠在特定位置含有部分量的甲硫氨酸。
图4显示一实施方案中通过用不同量的肽AC-Phe-Leu-高丝氨酸内酯来运行LC所获得的标准校正曲线，其用来实现相对于全部饱和(＝100％)的精确的部分偶联。(A)液相色谱数据，作为标准肽的相对量的函数而收集。在每一色谱图上，积分的峰面积(“面积”下面的数字)以及所使用的肽的百分比(“肽”下面的数字)，是通过标准肽溶液的稀释获得。(B)测量的裂解的肽的量(相对比例)相对于用于LC运行的肽百分比的图。所述面积相对通过双偶联方法获得的全部饱和值(＝100％)进行标准化；
图5显示根据一实施方案的通过CNBr裂解从三种类型珠中不同部分的甲硫氨酸获得的肽Ac-Phe-Leu-高丝氨酸内酯的色谱图；图6显示根据一实施方案的来自具有10％可裂解接头的单一珠的测序。测序结果和代表性MS谱来自通过10％甲硫氨酸连接至主链(HLYFLR)(SEQ ID NO.1)的6种五聚体肽。(A)在N-末端(线性)和(B)在中点(分支)；
图7显示根据一实施方案的位置依赖的图，(A)来自用15％甲硫氨酸接头的肽文库筛选的45个命中珠，(B)来自用100％甲硫氨酸接头的肽文库筛选的48个命中珠。每一图获得自100mg珠的筛选；
图8显示根据一实施方案的位置依赖的图，(A)来自用15％甲硫氨酸接头的肽文库筛选的37个命中珠，(B)来自用100％甲硫氨酸接头的肽文库筛选的32个命中珠。每一图获得自100mg珠的筛选；
图9显示根据一实施方案的(A)结构；(B)SPR传感图；和(C)六聚体-1和十聚体-N1针对bCAII和hCAII的点印迹实验；
图10显示根据一实施方案的(A)从最初的锚定六聚体-2至三种N-末端延伸的十聚体肽的全部流程；以及(B)三种十聚体肽与六聚体-2以及商业可得的多克隆CAII抗体比较的点印迹实验；
图11显示根据一实施方案的(A)从最初的锚定六聚体-2至三种C-末端延伸的十聚体肽的全部流程；以及(B)三种十聚体肽与六聚体-2以及商业可得的多克隆CAII抗体比较的点印迹实验；
图12显示根据一实施方案的(A)从最初的锚定六聚体-2经由两种延伸的肽十聚体-N2和十聚体-C2至组合的肽十四聚体-N2C；以及(B)十四聚体-N2C与六聚体-2、十聚体-N2、十聚体-C2以及两种没有锚定基序的肽和商业可得的多克隆CAII抗体进行比较的点印迹实验；
图13显示根据一实施方案在多点同步延伸来产生可能能够代替抗体的多配体样捕获剂的流程图；
图14显示根据一实施方案的(A)六聚体-2、(B)十聚体-C2、(C)十聚体-N2、和(D)十四聚体-N2C的SPR传感图。固定化的Rmax为RU＝1000。浓度从1M至8nM；和
图15显示根据一实施方案的(A)RYRR-G6-WRYP(SEQ ID NO.2)、(B)RYRR-PEG4-WRYP(SEQ ID NO.3)、(C)RYRR(SEQ ID NO.4)和(D)WRYP(SEQ ID NO.5)的SPR传感图。固定化的Rmax为RU＝1000。浓度从1M至8nM。
发明详述
本文描述的是创造性的组合物以及涉及生物聚合物取样特别是生物聚合物部分取样的方法。在一方面，实施方案大体涉及独特的生物聚合物物质，其中每种生物聚合物物质的一部分含有可裂解接头。所述生物聚合物物质在一些实施方案中可以与表面连接。例如，所述生物聚合物物质可以与珠连接。在一些实施方案中，可以通过裂解所述可裂解接头对独特的生物聚合物物质的一部分进行取样。在一些实例中，可以分析样品来确定所述生物聚合物的序列。
在一方面，实施方案允许生物聚合物物质的一部分被裂解。例如，在一些实例中，可能期望将可裂解接头掺入生物聚合物物质的一些分子，而使所述生物聚合物物质的其它分子基本上没有可裂解接头。例如，在一些实施方案中，可裂解接头可以影响生物聚合物物质对靶物质的结合强度。因此可能期望使所述生物聚合物物质的一些可裂解，使得可以收集所述生物聚合物物质的样品，而使剩余的生物聚合物物质基本上没有可裂解接头，使得基本上不影响所述生物聚合物物质和靶物质的结合。
在一些实施方案中，裂解生物聚合物物质可以允许收集所述生物聚合物的样品。裂解生物聚合物物质可能是期望的，例如，当所述生物聚合物物质的身份或所述生物聚合物物质内的区域的身份未知的时候。在一些实施方案中，可以对生物聚合物物质的样品进行测定来确定所述生物聚合物物质的身份。例如，在一些实施方案中，可以对所述生物聚合物物质测序，在下文将进行更详细讨论。
在一些实施方案中，所述生物聚合物物质可以与表面连接。所述表面可以是任何合适的表面。在一些实例中，所述表面可以包括金属、类金属(metalloid)、陶瓷或聚合物。例如，在一些实例中，所述表面可以包括金、银、硅或玻璃(如可控孔度玻璃)。在一些实施方案中，所述表面可以是聚合的。例如，所述表面可以包括不可降解的或可降解的聚合物。在一个实施方案中，所述表面可以包括聚苯乙烯。
在一些实施方案中，所述表面可以是颗粒(即，珠)的表面。在一些实例中，所述珠可以具有少于100微米的直径，在某些实施方案中少于10微米，或在某些实施方案中少于1微米。
在一些实施方案中，可以用反应性基团功能化所述表面，所述反应性基团可以与单体或生物聚合物偶联。在一些实施方案中，可以将反应性基团直接连接至所述表面。在一些实施方案中，可以用接头(如，PEG)将反应性基团间接地连接至所述表面。反应性基团的非限制性实例包括羧基、醇、胺和巯基。
所述生物聚合物物质可以是怀疑或能够和靶物质相互作用的任何合适的聚合物。靶物质可以是任何生物学靶，包括但不限于生物体、细胞、膜、蛋白质、酶、抗体、受体、转录因子、生长因子、核酸、适体、核酶、多糖等。生物聚合物可以是天然存在的或合成的。在一些实施方案中，所述生物聚合物物质包括一或多个天然存在的亚单元。天然存在的亚单元的非限制性实施例包括核苷酸、氨基酸和糖。在一些实例中，所述生物聚合物物质可以包括合成的亚单元，例如合成的核苷酸、合成的氨基酸和合成的糖。在一些实施方案中，所述生物聚合物物质可以包括天然存在的和合成的亚单元的混合物。在一些实施方案中，所述生物聚合物可以掺入作为接头、扩链剂、反应中心、溶解性增强剂、降解中心等的亚单元。
聚合物一般是延伸的分子结构，其包含任选地含有突出(pendant)侧基(如核苷碱基和/或氨基酸侧基)的主链。如本文所用，“主链”以本领域所使用的其一般含义给出，例如，聚合物分子内的线性原子链，这样其它原子链可以被认为是侧链。一般来说，但不总是，主链是聚合物内最长的原子链。在一些实施方案中，聚合物可以在一或多个分支点分支。在这样的实例中，分支可以不认为是突出侧基而是单独的聚合物链，其本身在分支点连接至聚合物链。例如，氨基酸序列可以具有“Y”构象，其中单一氨基酸序列在分支点分叉为两个氨基酸序列。聚合物可以是共聚物，例如，嵌段共聚物、交替共聚物或随机共聚物。
示例性的非限制性聚合物物质列表包括多糖、多核苷酸(如DNA和/或RNA)、多肽(即氨基酸序列)、肽核酸、聚氨酯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚酐、聚二恶烷酮、聚乙炔和聚二乙炔、聚磷腈、聚硅氧烷、聚烯烃、聚胺、聚酯、聚醚、聚(醚酮)、聚(碱性氧化物)、聚(对苯二甲酸乙二酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚苯乙烯、聚(乳酸)/聚丙交酯、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸共聚物)、聚(己内酯)、聚(原酸酯)、聚(醚酯)如聚二恶烷酮、聚(氨基碳酸酯)、和聚(羟基脂肪酸酯)如聚(3-羟基丁酸酯)和聚(3-羟基丁酸酯-3-羟基戊酸酯共聚物)，以及以上的衍生物和嵌段、随机、星型、线性或teleblock共聚物。
现在将描述非限制性的实例。图1显示颗粒100，其具有连接于所述颗粒表面的第一生物聚合物物质110和第二生物聚合物物质120。应当理解尽管颗粒描述于图1，但是这仅是示例，而在其它实施方案中，也可以使用其它的系统，例如，所述第一生物聚合物物质和第二生物聚合物物质可以在溶液中，连接至平面基片等等。所述颗粒可以是独特颗粒的文库的部分，其中所述第一生物聚合物物质和第二生物聚合物物质在每个独特颗粒上是独特的。应当理解文库可以含有一或多种所述独特的颗粒的多拷贝。第一生物聚合物物质110包含选自亚单元库的氨基酸亚单元的序列。第二生物聚合物物质120包含和第一生物聚合物物质110相同的氨基酸亚单元序列，除了在第二生物聚合物物质两个亚单元之间插入可裂解接头130。在图1显示的非限制性实施方案中，所述可裂解接头130是甲硫氨酸亚单元。第一生物聚合物物质包括可变序列140和锚定序列150。可变序列140在每个独特颗粒上是独特的，而锚定序列150在每个独特颗粒上是相同的。第二生物聚合物物质的部分160可以从所述颗粒裂解开(例如如下文详细描述，通过可裂解接头130)，形成可以随后通过质谱(或其它技术)分析来测定可变序列140的序列的混合物。
在一些实施方案中，第一生物聚合物物质和第二生物聚合物物质可以具有相同数目的亚单元。在一些实例中，第二生物聚合物物质可以具有比第一生物聚合物物质更多的亚单元。在一些实例中，第二生物聚合物物质可以具有比第一生物聚合物物质更少的亚单元。例如，在一些实施方案中，第二生物聚合物物质可以多具有至少1个亚单元，在某些实施方案中多具有至少2个亚单元，在某些实施方案中多具有至少3个亚单元，以及在某些实施方案中多具有至少4个亚单元。在一些实例，第一生物聚合物质和第二生物聚合物物质可以是相同的，除了在一或多个位置处第二生物聚合物物质被修饰。例如，如上所讨论的，第二生物聚合物物质可以含有可裂解接头，而第一生物聚合物物质不可以含有可裂解接头。在一些实例中，第一生物聚合物物质和第二生物聚合物物质可以具有相同的序列，除了在第二生物聚合物物质的两个亚单元之间可以插入可裂解接头，由此第二生物聚合物物质相对于第一生物聚合物物质增加了一个亚单元的长度。在一些实例中，第一生物聚合物物质和第二生物聚合物物质可以具有相同的序列和相同的长度，除了在一或多个位置第二生物聚合物物质的亚单元被可裂解接头替换。
生物聚合物可以具有任何合适的长度。在一些实施方案中，所述生物聚合物可以具有至少5个亚单元，在某些实施方案中至少10个亚单元，在某些实施方案中至少15个亚单元，在某些实施方案中至少20个亚单元，在某些实施方案中至少25个亚单元，在某些实施方案中至少30个亚单元，在某些实施方案中至少35个亚单元，在某些实施方案中至少40个亚单元。
第一生物聚合物物质与第二生物聚合物物质的比例可以是任何期望的比例。在某些实施方案中，可能需要具有大于1∶1的比例，在某些实施方案大于2∶1，在某些实施方案大于5∶1，在某些实施方案大于9∶1，在某些实施方案大于20∶1，以及在某些实施方案大于50∶1。在某些实施方案中，可以选择所述比例使得可以通过裂解第二生物聚合物物质取样足够用于分析的量的第二生物聚合物物质。
在某些实施方案中，不可以使用生物聚合物物质的混合物，而仅可以使用单一的生物聚合物物质。在某些实施方案中，单一的生物聚合物物质全部都可以是可裂解的。
如上所讨论，在一些实施方案中，在第二生物聚合物物质中可裂解接头的存在可能影响第二生物聚合物物质对靶物质的结合亲和力。在一些实施方案中，与第一生物聚合物物质对靶物质的结合亲和力相比，可裂解接头的存在可能改变第一生物聚合物物质和第二生物聚合物物质的组合对靶物质的有效结合亲和力。当然，所述组合的有效结合亲和力取决于以下因素，例如第一生物聚合物物质与第二生物聚合物物质的比例，以及所述可裂解接头对第二生物聚合物物质对靶物质的结合亲和力的影响的大小。在一些实例中，所述影响的大小可以取决于所述可裂解接头的结构，接近(即邻近的2个亚单元内，3个亚单元内，4个亚单元内，5个亚单元内等等)所述可裂解接头的生物聚合物亚单元的性质，以及所述可裂解接头与生物聚合物内结合区域(如表位)的接近程度。因此，基于这些和其它特性，第一生物聚合物物质和第二生物聚合物物质的所需比例可以不同。
可以使用任何合适的可裂解接头。这样的接头为本领域(如固相肽合成以及液相寡核苷酸合成)技术人员已知。在一些实例中，甲硫氨酸残基可以用作接头。可以通过如CNBr的试剂裂解甲硫氨酸接头，CNBr在甲硫氨酸残基的C-末端裂解肽键。可以使用的其它类型接头的实例包括酸裂解接头、碱裂解接头、光裂解接头、氧化还原(如那些由高碘酸盐、2，3-二氯-5，6-二氰苯醌(DDQ)、硝酸铵铈(IV)(CAN)介导的)裂解接头等等。所述可裂解接头在对于所述生物聚合物基本上无害的条件下对裂解敏感。在一些实施方案中，所述可裂解接头可以位于所述生物聚合物序列内。在一些实施方案中，可裂解接头可以用于将生物聚合物和表面(即颗粒)连接。例如，所述可裂解接头可以位于肽的C-末端。
在一些实施方案中，所述可裂解接头可以与所述生物聚合物的结合区(如表位)分隔一段距离，所述距离足以使所述结合表位对靶的结合亲和力的降低少于一定量。在某些实施方案中，结合区可以通过生物聚合物内亚单元的特定序列限定。在某些实例中，所述结合区和所述可裂解接头可以被至少1个生物聚合物亚单元分隔，在某些实施方案中，被至少2个生物聚合物亚单元分隔，在某些实施方案中，被至少3个生物聚合物亚单元分隔，在某些实施方案中，被至少4个生物聚合物亚单元分隔，在某些实施方案中，被至少5个生物聚合物亚单元分隔，在某些实施方案中，被至少6个生物聚合物亚单元分隔，在某些实施方案中，被至少7个生物聚合物亚单元分隔，在某些实施方案中，被至少8个生物聚合物亚单元分隔，在某些实施方案中，被至少9个生物聚合物亚单元分隔，以及在某些实施方案中，被至少10个生物聚合物亚单元分隔。
在一些实施方案中，所述可裂解接头可以位于所述生物聚合物末端附近。例如，在一些实施方案中，所述可裂解接头可以位于所述生物聚合物末端，在某些实施方案中，离所述末端1个生物聚合物亚单元，在某些实施方案中，在所述末端2个生物聚合物亚单元内，在某些实施方案中，在所述末端3个生物聚合物亚单元内，在某些实施方案中，在所述末端4个生物聚合物亚单元内，在某些实施方案中，在所述末端5个生物聚合物亚单元内，在某些实施方案中，在所述末端10个生物聚合物亚单元内，以及在某些实施方案中，在所述末端20个生物聚合物亚单元内。
在一些实施方案中，可以选择所述可裂解接头在生物聚合物内的位置使得裂解后产生的生物聚合物片段具有特定长度。例如，在一些实施方案中，可能期望产生具有有助于分析的长度的片段。例如，分析具有6、7或8个生物聚合物亚单元长度的片段可以有助于生物聚合物片段的测序。当然，也可以分析具有该范围之外的长度的生物聚合物片段。在一些实施方案中，所述生物聚合物片段可以具有至少4个生物聚合物亚单元的长度，在某些实施方案中，至少6个生物聚合物亚单元，在某些实施方案中，至少8个生物聚合物亚单元，或在某些实施方案中，至少10个生物聚合物亚单元。
在某些实施方案中，可以提供生物聚合物物质的文库。如上文所讨论，在一些实例中，所述生物聚合物物质可以与表面(如颗粒的表面)连接。在一些实施方案中，所述文库可以包括多种独特的生物聚合物物质，每种独特的生物聚合物物质可以连接至表面的独特区域。例如，所述多种独特的生物聚合物物质可以在表面上排列成阵列。在一些实例中，每种独特的生物聚合物物质可以连接至单独的颗粒的表面。在一些实施方案中，在每个区域内或在每个颗粒上的生物聚合物物质中的至少一些可以包含可裂解接头
在一些实施方案中，文库可以包含至少100种独特的生物聚合物，在某些实施方案中至少500种独特的生物聚合物，在某些实施方案中至少1000种独特的生物聚合物，在某些实施方案中至少5000种独特的生物聚合物，以及在某些实施方案中至少10000种独特的生物聚合物。
在一些实例中，所述生物聚合物文库中的每一成员可以包含固定的序列区域(例如锚定序列)和可变序列区域。在一些实施方案中，所述锚定序列可以包含具有至少一些对靶物质的亲和力的序列。如下面将更详细描述的，在一些实施方案中，用可变序列区域对所述锚定序列的延伸可以增加所述生物聚合物物质的结合亲和力，其基于所述延伸的序列。在一些实例中，可以对独特的生物聚合物物质的文库进行筛选来鉴别具有改进的对特定靶物质的亲和力的特定序列。锚定序列可以是任意合适的长度。例如，所述锚定区域可以长至少1、2、5、10、15、20、25、30、35或40个亚单元。在一些实施方案中，所述可变序列区域可以长至少1、2、4或8个亚单元。所述锚定序列和所述可变序列区域可以直接连接或可以通过合适的接头连接。例如，所述接头可以是所述生物聚合物中大部分单体外的不同的物质(例如，所述接头可以包含PEG或4-氨基丁酸乙酯)，而所述生物聚合物的其余部分可以是肽)。在一些实施方案中，所述接头可以是氨基酸序列(例如聚甘氨酸)。所述锚定序列可以通过末端之一或两个末端延伸。例如，氨基酸锚定序列可以在N-末端和/或C-末端延伸。所述延伸可以是可变的或固定的。
生物聚合物可以使用任何标准的方法构建，例如标准的自动化固相合成方法。在一些实例中，可以酶促构建生物聚合物。在一些实施方案中，生物聚合物可以通过逐步形式构建，即，通过向生长中的生物聚合物链添加一或多个亚单元。在一些实施方案中，可以连接独立地构建的生物聚合物片段以形成全长生物聚合物。在某些实施方案中，生物聚合物可以直接在表面(例如颗粒的表面)上生长。在一些实施方案中，可以构建所述生物聚合物物质并随后连接至表面。在一些实例中，多个生物聚合物可以和至少一个表面混合使得所述生物聚合物与所述至少一个表面上的一或多个官能团反应以实现连接。可以使用许多方法使生物聚合物与表面连接。例如，在一些实例中，生物聚合物可以包含可以和金属(如金)表面反应来使所述生物聚合物与所述表面连接的巯基基团。在另一实例中，所述生物聚合物可以包含可以和表面上的胺反应来使所述生物聚合物与所述表面连接的羧基基团。用于实施这些反应的许多接头和试剂是本领域已知的。
在一些实施方案中，生物聚合物单体可以包含一或多个在所述生物聚合物合成期间或之后被转化(transform)或去除的基团。即是说，生物聚合物单体可以是“前体”。例如，氨基酸单体可以在氨基末端包含fmoc保护基团，其在添加随后的单体之前被去除，即，所述氨基酸单体可以是“氨基酸前体”。在另一个实例中，核苷亚磷酰胺在3′位置包含亚磷酰胺，其在寡核苷酸合成期间被转化为磷酸。
同样，可以使用可裂解接头的前体来将所述可裂解接头掺入所述生物聚合物。在一些实施方案中，所述可裂解接头前体可以是单一的单体。在一些实例中，所述可裂解接头可以包含一或多个额外的与所述可裂解接头连接的单体。例如，可裂解接头前体可以包括与一或多个氨基酸连接的甲硫氨酸可裂解接头。掺入这样的可裂解接头前体导致所述可裂解接头加上所述连接至可裂解接头的一或多个氨基酸添加至所述生物聚合物。
可以通过任意合适的方法将可裂解接头掺入生长中的生物聚合物链的一部分。在某些实施方案中，可以使用限制试剂的方法，如图2所示。例如，如果有多个生物聚合物链，可裂解接头可以以一定量添加，使得所述可裂解接头前体仅仅被添加至所述多个生物聚合物链的一部分。在一些实施方案中，需要来实现该结果的可裂解接头的量根据所述可裂解接头前体的反应性而不同。例如，在某些实例中，期望的含有可裂解接头的生物聚合物部分可以通过使生长中的生物聚合物链与基本上相等量的可裂解接头前体接触来实现，即，使生长中的生物聚合物链与约0.1当量的可裂解接头前体接触来实现所述生物聚合物的10％具有可裂解接头，等等。然而，在其它实例中，可能有必要使用更大量的可裂解接头前体来实现基本上相同的结果。在一些实施方案中，使少于10当量的所述可裂解接头前体与所述生物聚合物链混合，在某些实施方案中，使少于5当量的所述可裂解接头前体与所述生物聚合物链混合，在某些实施方案中，使少于1当量的所述可裂解接头前体与所述生物聚合物链混合，在某些实施方案中，使少于0.5当量的所述可裂解接头前体与所述生物聚合物链混合，以及在某些实施方案中，使少于0.1当量的所述可裂解接头前体与所述生物聚合物链混合。在添加所述可裂解接头前体后，可以将额外的单体添加至所述生物聚合物链。
在另一实施方案中，生物聚合物单体前体和可裂解接头前体的混合物可以用于将可裂解接头掺入部分生物聚合物链，如图3所示。例如，在一个实施方案中，生物聚合物链可以与生物聚合物单体前体和可裂解接头前体的混合物反应，所述可裂解接头前体包含与所述生物聚合物单体前体中的相同单体连接的可裂解接头。该方法获得生物聚合物链的混合物，其中全部链具有相同的序列除了所述生物聚合物链的一部分额外含有所述可裂解接头。或者，所述生物聚合物单体前体和所述可裂解接头可以各自含有仅仅单一的单体。在该方法中，可能需要使用在所述生物聚合物单体前体和所述可裂解接头前体上的正交保护基团。在一些实施方案中，使用正交保护基团可以允许所述生物聚合物单体和所述可裂解接头的选择性去保护。因此，如图3所示，可裂解接头alloc-Met-OH可以使用例如Pd催化剂选择性去保护，而使生物聚合物单体前体保持完整。然后可以将一或多个单体添加至所述可裂解接头。应当理解在所述生物聚合物单体前体和所述可裂解接头前体均属于相同类别的生物聚合物亚单元时(例如，均是氨基酸前体、核苷酸前体、糖前体等)，他们可以是可区分的。还应当理解可以调整所述生物聚合物单体前体与所述可裂解接头前体的比例来实现含有所述可裂解接头的生物聚合物链的期望部分。在一些实施方案中，所述生物聚合物单体前体比所述可裂解接头前体的比例可以大于1∶1，在某些实施方案中大于5∶1，在某些实施方案中大于9∶1，在某些实施方案中大于20∶1，以及在某些实施方案中大于50∶1。
在一些实施方案中，可以使生物聚合物与表面混合，并使得与所述表面连接，即，预合成的生物聚合物可以与所述表面连接。在一些实施方案中，所述生物聚合物的一部分可以包含可裂解接头。在一个实施方案中，可以将颗粒置于小瓶中，并且可以将独特的生物聚合物添加至每一小瓶并且使其连接至所述颗粒的表面，所述独特的生物聚合物的一部分包含可裂解接头。因此，可以制备与颗粒连接的独特的生物聚合物的文库。
如上所讨论，可以筛选独特的生物聚合物的文库。筛选实验的一个实施方案可以如下进行。可以提供独特的生物聚合物的文库，每种独特的生物聚合物的一部分含有可裂解接头。每种独特的生物聚合物可以连接至单独的颗粒。应当理解可以提供多拷贝的每种颗粒。可以使所述生物聚合物文库与靶物质(如蛋白质)接触，并且使用例如封闭溶液将非特异性结合的靶物质洗掉。在一些实施方案中，可以配制所述封闭溶液使得靶物质保持仅仅与这样的生物聚合物结合，即所述靶物质对所述生物聚合物显示高于阈值水平的结合亲和力。然后可以对所述文库的颗粒进行分选以鉴别那些具有特异性结合的靶物质的颗粒(即“命中”)。例如，可以使用抗体夹心测定来显示结合至所述颗粒上的生物聚合物的靶物质。在一些实施方案中，可以对所述颗粒进行多次分选，其中每轮分选基本上消除显示和靶物质最弱连接的颗粒。可以将分选的颗粒置于小瓶中，一颗粒每个小瓶。然后可以裂解每一珠上的可裂解生物聚合物链来产生生物聚合物片段。可以使用上文所述的试剂之一或任何其它合适的试剂来完成裂解。然后可以对所述生物聚合物片段进行任何合适的分析。在一些实施方案中，可以对所述生物聚合物片段进行测序。在一些实施方案中，可以使用质谱来对生物聚合物测序。例如，可以使用MALDI-TOF质谱以及MS/MS来分析(如，测序)所述生物聚合物片段。在一些实例中，所述生物聚合物片段可以使用例如酶来部分消化以产生不同长度生物聚合物片段“梯带”来用于测序。
在一些实施方案中，可以进行进一步的分析来测量所述命中(即，显示结合活性的生物聚合物)对靶物质的结合亲和力。例如，所述命中生物聚合物可以重合成而不与颗粒连接并进行表面等离子共振实验来测量结合亲和力。在另一实施方案中，可以使用点印迹测定来测量结合亲和力，如下文实施例所述。
“氨基酸”以其在生物化学领域使用的一般含义给出。分离的氨基酸一般，但不总是(例如，脯氨酸的情况)，具有NH2-CHR-COOH的一般结构。R可以是任何合适的部分；例如，R可以是氢原子、甲基、或异丙基。通过一个氨基酸的-NH2和另一氨基酸的-COOH反应形成肽键(-CO-NH-)，可以将一系列的分离的氨基酸连接来形成肽或蛋白质。在这样的实例中，在所述肽或蛋白质上的每个R基团可以被称作氨基酸残基。所述氨基酸可以是通常在自然界发现的20种氨基酸之一(天然氨基酸)，或是非天然氨基酸(即不是天然氨基酸之一的氨基酸)。非天然氨基酸的非限制性实例包括别异亮氨酸、别苏氨酸、高苯丙氨酸、高丝氨酸、高半胱氨酸、5-羟赖氨酸、4-羟脯氨酸、4-羧基谷氨酸、磺基丙氨酸、丙氨酸环己酯、乙基甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、3-氨基丁酸、β-氨基酸(如β-丙氨酸)、N-甲基氨基酸(如N-甲基甘氨酸、N-甲基丙氨酸、N-甲基缬氨酸、N-甲基亮氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基正亮氨酸、N-甲基-2-氨基丁酸、N-甲基-2-氨基戊酸等等)，以及天然氨基酸的D-异构体。
在一个实施方案中，可以提供试剂盒，其含有上述组合物中的一或多种。如本文所用，“试剂盒”一般指的是包括本发明的一或多种组合物和/或如之前所述的其它与本发明相关的组合物的包装或组合体。试剂盒中的每一组合物可以以液体形式(如在液体中)、以固体形式(如干粉)等提供。在一些实例中，本发明的试剂盒可以包括与本发明的组合物一起提供的任何形式的说明书，其使得本领域普通技术人员可以认识到该说明书是与本发明的组合物相关的。例如，所述说明书可以包括关于该试剂盒相关的所述组合物或其它组合物的使用、修饰、混合、稀释、保存、施用、组装、储藏、包装和/或制备的说明。所述说明书可以以本领域普通技术人员认可为合适的含有说明的任何形式提供，所述说明例如是书面的或出版的、口头的、发声的(如电话的)、数字的、光学的、可视的(如录像带、DVD等)或电子通讯(包括互联网或基于网页的交流)，以任何方式提供。
Heath等人2009年7月22日提交的申请号为PCT/SG2009/000258的国际专利(题为《同量异位氨基酸和其它物质的区分》)以及Heath等人2009年7月15日提交的申请号为61/225,881的美国临时专利申请(题为《改进的筛选基于珠的肽的方法和使用部分可裂解的肽的肽模拟文库》)通过引用并入本文。
以下实施例旨在说明本发明的某些实施方案，并不是例举本发明的全部范围。
实施例1
该实施例阐述了构建含有甲硫氨酸可裂解基团的肽文库的多种方法。图2显示两种方法，其描述了利用甲硫氨酸作为可裂解接头的实施方案。
第一种方法(21)显示在用于构建OBOC肽文库的标准肽偶联步骤中对偶联步骤的修改。如图2所示，用于OBOC文库的珠(11)一般预装分子官能度来用于进一步的化学修饰。如图2所示，标准的例子会是以胺(-NH2)化学基团终止的聚乙二醇寡聚物。在该方式中，酰胺偶联化学(其用来系列地偶联氨基酸以形成肽)可以应用于珠上。当氨基酸被偶联至珠上，一般通过使用fmoc(9-芴甲氧羰基)基团来保护它们不进行随后的反应。Fmoc保护的甲硫氨酸(fmoc-Met-OH)的偶联程度可以通过限制所添加的试剂的量来控制，使得仅仅一部分暴露的NH2基团反应。在部分偶联完成后，根据标准方案构建OBOC文库。
第二种方法(22)采用fmoc-甲硫氨酸的活化酯形式，其在N，N′-二异丙基乙胺(DIPEA)存在下形成酰胺。通过使用活化的酯形式，fmoc保护的甲硫氨酸的掺入受到控制以使得仅一部分暴露的NH2基团反应。这和方法(21)类似，不过缓慢地反应的活化酯有助于更多地控制部分甲硫氨酸偶联至珠结合的NH2基团的程度。获得的珠进行fmoc去保护并随后偶联fmoc保护的氨基酸(fmoc-AA-OH).在另一次通过哌啶进行fmoc去保护后，所述珠追加与第一种方法(21)详细说明的相同分布的肽。两种方法都可以用来将甲硫氨酸在任何位置掺入部分量的所述OBOC肽文库，所述位置包括分支点，线性肽的中点，或线性肽的C-末端。
图3显示了两种其它的方法，其用于通过使用两种预混氨基酸试剂将氨基酸序列连接至珠。第三种方法(31)包括使用二聚体肽，所述二聚体肽中甲硫氨酸连接至fmoc保护的第二氨基酸。例如，如果C-末端的氨基酸是亮氨酸，一部分的fmoc-Leu-Met-OH(亮氨酸-甲硫氨酸)与fmoc-Leu-OH预混并用于偶联至氨基树脂。如果fmoc-Leu-OH和fmoc-Leu-Met-OH的偶联速率相当，以甲硫氨酸基团结尾的位点的比例仅仅与最初混合的fmoc-Leu-OH和fmoc-Leu-Met-OH的相对量相关。另外，应当添加的这两种分子的量必须针对这两种化合物的相对反应速率进行计算。一旦完成第一步，使用标准试剂(fmoc-AA-OH)和标准的肽偶联化学方案将后续的氨基酸(AA)偶联于树脂上的H2N-Leu-和H2N-Leu-Met-位点。对于这个实例，氨基酸亮氨酸显然可以被任何天然或非天然存在的氨基酸(AA)替换。该方法(31)然后产生文库，其中每一珠具有可控比例的通过甲硫氨酸偶联于珠上的肽。
第四种方法(32)为氨基酸的后续掺入提供了显著的灵活性。通过使用不同的保护基团，该方法并不要求预合成的二聚体。N-烯丙基氧羰基(Alice)基团可以使用Pd催化剂通过标准方法容易地去除，并且所述暴露的自由胺基团和后续的fmoc保护的氨基酸(fruoc-AA-OH)偶联以产生与通过前述方法(31)所获得的相同的物质。
步骤1.验证用于OBOC文库制备的化学：测定了可以被附加于珠上的甲硫氨酸的部分量。为进行该测量，通过对不同浓度的模型肽Ac-Phe-Leu-高丝氨酸内酯运行液相色谱(LC)获得标准校正曲线。利用该曲线，可以测量任何类型珠中的甲硫氨酸的部分量，所述珠携带自由氨基基团、线性肽的N-末端以及在肽中点的氨基基团。对该方法进行研究，示于图5。第一个实例(51)得自偶联至珠上的自由胺基的部分甲硫氨酸。使fmoc保护甲硫氨酸和偶联剂(TBTU)的添加量从10％-＞100％，其在后续构建用于LC分析的短肽之前用于和珠上的胺基初始偶联。当TBTU作为限制剂时，获得最高的偶联效率(＞90％)。两种试剂以2∶1的比例在NMP中预混10分钟，之后在2当量DIPEA存在下添加至珠。为了掺入10％甲硫氨酸作为接头，例如，分别将fmoc-Met-OH和TBTU的量限制为20％和10％。随后的短肽构建通过在每一步使用双偶联法的标准肽合成方案进行。N-末端用乙酸酐乙酰化，所述珠然后具有肽序列：Ac-Phe-Leu-Met，其中甲硫氨酸的部分从10％至100％。因此，仅一部分的结合珠的肽含有位于C-末端的作为可裂解接头的甲硫氨酸。使用标准CNBr介导的裂解方案裂解该部分肽，并且分析裂解的肽的量，其为开始添加用于偶联至珠的TBTU的函数。例如，基于(51)中的结果，实现10％偶联的必要的TBTU的量是13％。
第二个实例(52)获得自附加着四聚体肽H2N-RYWF(SEQ ID NO.6)的珠。在该实例中，例如，需要使用约15％的TBTU来实现15％的甲硫氨酸偶联。第三个实例(53)还证明了在附加着更柔性的六聚体肽H2N-LHRYWF(SEQ ID NO.7)的珠的实例中的部分偶联的可靠方法。类似地，在该实例中，需要使用约15％的TBTU来实现15％的甲硫氨酸偶联。
从描述于图4和5的实验中，对于偶联至珠上任何类型N-末端的甲硫氨酸的指定部分，可以容易地确定每种试剂的必需量。
实验详述
通用：N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二乙醚和二氯甲烷(DCM)购自Merch。Fmoc保护的氨基酸(Fmoc-AA′s)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)以及N，N-二异丙基乙胺(DIEA)购自GLBiochem(上海)公司。三氟乙酸(TFA)和三异丙基硅烷(TIS)购自Aldrich。a-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)购自Bruker。MALDI-MS和MS/MS用BrukerAutoflex II TOF/TOF获得。
甲硫氨酸部分偶联至TentaGel S氨基树脂(以10％偶联为例)：使TentaGel S氨基树脂(200mg，容量＝0.29mmol/g)在小瓶中在NMP吸胀2小时。离心1分钟后，大部分溶剂被吸收，并在DMA(2当量，0.5M的NMP溶液)存在下加入通过在NMP(1m1)中搅拌10分钟制备的fmoc-Met-OH和TBTU(分别0.26和0.13当量)溶液。获得的混合物涡旋30分钟，在排走反应溶液后用NMP(3ml x 4)将其充分洗涤。通过用NMP中的20％哌啶处理两次(3ml每次，5分钟然后15分钟)去除Fmoc基团。排走溶液并用NMP(3ml x 4)和DCM(3ml x 4)充分洗涤珠。
随后合成肽Ac-F-L-M(10-100％)：甲硫氨酸结合的珠(10-100％)在NMP(3m1)中吸胀2h后，加入moc-Leu-OH(2当量，0.2M的NMP溶液)、TBTU(2当量，0.2M的NMP溶液)和DMA(5当量，0.5M的NMP溶液)，获得的混合物涡旋30分钟。排干液体并使用新鲜的试剂溶液再次涡旋30分钟重复偶联。通过用NMP中的20％哌啶处理两次(3ml每次，5分钟然后15分钟)去除Fmoc基团。排走溶液并用NMP(3ml x 4)和DCM(3ml x 4)充分洗涤珠。用fmoc-Phe-OH重复偶联和去保护。最后，通过用NMP(3m1)中的乙酸酐(10当量)和DIEA(20当量)处理30分钟使N-末端乙酰化。获得的珠用NMP(3ml x 4)、甲醇(3ml x 4)、DCM(3ml x 4)、然后二乙醚(3m1)充分洗涤，减压干燥24小时。
CNBr介导的单一珠的裂解：将准确量的具有不同比例甲硫氨酸珠(约5mg)置于2ml Eppendorf管中。加入去离子水(200u1)并用氩气小心清洁管1分钟。将CNBr(200pi，0.2N HCl溶液中的0.50M)加入管中，然后将管封口并在室温涡旋15小时。获得的溶液在离心真空中浓缩2小时。
步骤2具有10％可裂解接头的线性和分支肽的精确测序：对于该步骤，已证明当已知的肽仅一部分可以从单一的珠裂解时仍然可以获得精确的测序信息。测序使用标准质谱方法完成。为该实验制备了线性和分支类型的结合珠的肽。构建肽使得对于线性肽，在给定的珠上的10％的肽能够使用标准CNBr介导的裂解化学裂解。对于分支的肽，使用CNBr来在分支点裂解10％的肽。数据显示于图4。为了该说明，6种线性和6种分支的各自具有已知组成的肽被裂解并用100％精度测序。所有测量在单一珠上完成。
实验详述
在珠上从HLYFLR(SEQ ID NO.1)的N-末端合成五聚体肽(线性肽)：从吸胀的TentaGel S氨基树脂(600mg，容量＝0.29mmol/g)开始，根据标准fmoc肽合成方案通过步骤1所述的双偶联方法，通过连续地掺入R、L、F、Y、L和H构建主链序列。如步骤1所述进行10％甲硫氨酸的掺入，之后将珠分为6等份，随后依照相同的方案(双偶联)进行每种五聚体肽的构建。通过用三氟乙酸裂解混合物(2ml，TFA/TIS/水＝94/3/3，v/v/v)处理2小时去除残基的保护基。在用NMP(3ml X 4)、甲醇(3ml x 4)、DCM(3ml X 4)以及然后二乙醚(3ml)剧烈洗涤后，将获得的珠在真空干燥24小时
在珠上从HLYFLR(SEQ ID NO.1)的中点合成五聚体肽(分支肽)：首先，依照步骤1所述的方法(双偶联)在TentaGel S氨基树脂(600mg，容量＝0.29mmol/g)上构建主链六聚体肽Ac-HLG(4-叠氮-l-丁基)FLR。保护基保持完整进行随后的偶联。将珠置于25ml的装有滤器的反应器中，摇动两小时以在NMP中吸胀。加入Fmoc-Pra-OtBu(3当量)、碘化亚铜(0.1当量)和DMA(3ml)，并摇动反应器15小时。从树脂去除反应溶液，树脂用含有DIEA(1％，v/v)的三水合二乙基二硫代氨基甲酸钠(Et2NCSSNa.3H2O，1％w/v)的NMP溶液洗涤以去除由点击反应产生的配位铜物质。重复洗涤直到树脂和溶液均无色。通过用NMP中的20％哌啶(15ml每次，v/v)5分钟然后15分钟处理两次去除fmoc基团后，如步骤1所述进行10％甲硫氨酸的掺入。获得的珠分成6等份用于随后依照相同方案(双偶联)构建每种五聚体肽。通过用三氟乙酸裂解混合物(2ml，TFA/TIS/水＝94/3/3，v/v/v)处理去除残基的保护基。在用NMP(3ml X 4)、甲醇(3ml x 4)、DCM(3ml X 4)以及然后二乙醚(3ml)剧烈洗涤后，将获得的珠在真空干燥24小时
对来自单一珠的具有10％甲硫氨酸接头的肽进行MALDI-MS取样：MALDI-MS和MS/MS实验用Bruker Autoflex II TOF/TOF进行。向每个小瓶或孔加入a-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)(2ul，0.5％的乙腈/水(70∶30，v/v)溶液)，然后加入乙腈/水(2ul，70∶30，v/v，含有0.1％三氟乙酸(v/v))。样品离心2分钟，去2ul并点于Bruker 384-孔MALDI-MS板上，空气干燥15分钟。
步骤3.证明部分可裂解的OBOC肽文库对蛋白质亲和力筛选的益处。然后，证明了当筛选OBOC文库以确定结合给定蛋白质的肽时，使用本实施例的方法的珠与不使用本实施例的方法的珠相比产生显著差异的命中。为了最大化部分接头系统的效果，首先将六聚体肽附加于珠上。针对bCAII的对六聚体肽文库的初始筛选中发现序列LFIRYWF为第一代锚定肽，其在表面等离子共振研究中显示几微摩尔1CD的亲和力。然后，使用除了半胱氨酸和甲硫氨酸外的18种非天然(D)氨基酸构建其C-末端具有15％和100％的甲硫氨酸的两种不同的六聚体肽作为文库中的可变区。15％甲硫氨酸的掺入通过步骤1描述的方法实现，而100％甲硫氨酸使用标准合成方案(双偶联)。应用AAPPTEC Titan 357来进行拆分和混合方法。整个过程依照标准固相fmoc化学以全自动方式进行。具有引入作为CNBr可裂解接头的初始甲硫氨酸的珠平均分入18个反应容器(RV)中，然后和18种多样性元件的每一种偶联。拆分、偶联、fmoc去保护和混合的循环重复6次并通过TFA裂解混合物完全去除保护基。由此所述两种文库可用于针对感兴趣的蛋白，牛碳酸酸酐酶II(bCAII)，进行生化筛选。在筛选步骤前用MALDI-TOF/TOF检查珠上的肽的纯度。文库和50nM的与Alexa
Figure BDA0000143762120000211
647缀合用于荧光检测的牛碳酸酸酐酶II(bCAII)在25℃孵育20小时。通过COPAS Plus以自动方式将命中珠分选入95孔板并通过CNBr处理释放其连接的肽，所述肽转移至MALDI-MS工作站进行表征。图7中的位置依赖图说明两种文库的明显差异，其提示连接部分可以造成显著的干扰，由此干扰筛选结果。
用两种四聚体肽文库进行了另一比较，其中可裂解接头位于锚定肽LHRYWF(SEQ ID NO.7)(图8)的中点。文库以相同的方式合成，15％和100％的甲硫氨酸分别掺入于H和R之间。文库和10nM的与Alexa
Figure BDA0000143762120000212
647缀合用于荧光检测的牛碳酸酸酐酶II(bCAII)在25℃孵育20小时。测序结果以图8的位置依赖图，其证明所述两种文库获得的不同的结果。这些结果支持接头部分干扰筛选方法。
实验详述
合成具有15％和100％甲硫氨酸作为附加于锚定肽LHRYWF(SEQID NO.7)的可裂解接头的六聚体文库：合成使用AAPPTEC Titan 357自动合成仪进行。从TentaGel S氨基珠(分别1.8g，装载NH2：0.24mmol/g)，使用标准fmoc化学来构建锚定序列LHRYWF(SEQ ID NO.7)，随后在N-末端掺入4-氨基丁酸。如步骤1所述将15％甲硫氨酸引入所获得的珠，而常规的双偶联方法应用于100％甲硫氨酸系列。然后将珠等分入18个反应容器(RV)中。将作为多样性元件18种选定的fmoc保护的d-氨基酸(除了半胱氨酸和甲硫氨酸)中的一种、TBTU(3当量)和DIEA(7.5当量)加入每一RV。然后将RV涡旋30分钟。在排干溶液后，重复偶联步骤。每个RV中获得的珠用NMP洗涤(2ml x 4)。然后，将NMP中的20％哌啶(2ml x 4)加入每个RV中，涡旋15分钟。排干液体并加入NMP中的20％哌啶的新鲜溶液(2ml x 4)，再次涡旋30分钟。每个RV中的珠用NMP(2ml x 4)和DCM(2ml x 4)充分洗涤，合并进CV。全部的拆分、偶联、去保护和混合过程重复6次直至珠附加额外的六聚体。将珠转移至50ml装有滤器的反应器。残余物中的保护基通过在TFA-水-TIS(27ml，94∶3∶3，v/v)中摇动2小时去除。排干液体并连续用DCM(27ml x 3)、甲醇(27ml x 3)、水(27ml x 3)、甲醇(27ml x 3)、DCM(27ml x 3)和二乙醚(27ml)充分洗涤获得的珠，然后减压下干燥24小时。
合成具有15％和100％甲硫氨酸作为附加于锚定肽LHRYWF(SEQID NO.7)的H和R之间的可裂解接头的四聚体文库：合成使用AAPPTECTitan 357自动合成仪进行。从TentaGel S氨基珠(分别1.8g，装载NH2：0.24mmol/g)，使用标准fmoc化学来构建锚定序列RYWF(SEQ ID NO.6)，如步骤1所述将15％甲硫氨酸引入所获得的珠，而常规的双偶联方法应用于100％甲硫氨酸系列。然后将H和L偶联至获得的珠(双偶联)。然后将珠等分入18个反应容器(RV)中。将作为多样性元件18种选定的fmoc保护的d-氨基酸(除了半胱氨酸和甲硫氨酸)中的一种、TBTU(3当量)和DIEA(7.5当量)加入每一RV。然后将RV涡旋30分钟。在排干溶液后，重复偶联步骤。每个RV中获得的珠用NMP洗涤(2ml x 4)。然后，将NMP中的20％哌啶(2ml x 4)加入每个RV中，涡旋15分钟。排干液体并加入NMP中的20％哌啶的新鲜溶液(2ml x 4)，再次涡旋30分钟。每个RV中的珠用NMP(2ml x 4)和DCM(2ml x 4)充分洗涤，合并进CV。全部的拆分、偶联、去保护和混合过程重复4次直至珠附加额外的四聚体。将珠转移至50ml装有滤器的反应器。残余物中的保护基通过在TFA-水-TIS(27ml，94∶3∶3，v/v)中摇动2小时去除。排干液体并连续用DCM(27ml x 3)、甲醇(27ml x 3)、水(27ml x 3)、甲醇(27ml x 3)、DCM(27ml x 3)和二乙醚(27ml)充分洗涤获得的珠，然后减压下干燥24小时。
文库筛选和珠分选：选择Alexa
Figure BDA0000143762120000221
647蛋白质标记试剂盒(A20173，Invitrogen)作为反应性染料，遵照供应商的方案标记牛碳酸酐酶(bCAII)。简言之，将0.5mL bCAII溶液(0.1M碳酸氢钠(pH～8.3)中的2mg/mL bCAII)转移至活性染料瓶中，将瓶盖好且颠倒数次以完全溶解染料。将反应混合物在室温和黑暗条件下搅拌1小时。使用试剂盒中的排阻纯化树脂从混合物中纯化Alexa
Figure BDA0000143762120000222
647标记的bCAII(bCAII-A647)。在SDS-PAGE后，通过NanoDrop(Thermo Scientific)和凝胶记录仪(Typhoon)表征纯化和标记的bCAII-A647。将干燥的文库树脂(200mg)转移至8mLAlltech容器中，并在封闭液，0.05％NaN3、0.1％吐温20和0.1％BSA的PBS缓冲液(pH 7.4)中，在室温360°摇床上预孵育1小时。将缓冲液真空排干，随后将在封闭液中稀释的5mL 50nM染料标记的bCAII加入膨胀的树脂。将所得混合物在360°旋转热摇床上，在25℃孵育15小时。将液体真空排干，并将非特异性结合的蛋白通过连续用封闭液清洗3次和用0.1％吐温20的PBS溶液清洗7次来清除。在严谨性清洗后，将200mg测定的文库树脂转移至COPAS Plus样品容器(Union Biometrica)中，并用200mL 0.1％吐温20的PBS缓冲液稀释。
使用COPAS Plus将命中珠分选进入96孔板的锥形孔中。定义设门和分选区域，以在COPAS Plus上分选珠。基于珠的飞行时间(TOF)和红色荧光，定义珠的设门区域，且在用bCAII-A647孵育后，基于珠的飞行时间(TOF)和均匀红色荧光，选择分选区域以选择珠。使用两步分选策略以快速和有效的分选。第一次分选在高浓度条件下纯化珠(＞1000珠/mL)。在第一阶段分选期间，使用去离子水作为保护溶液(sheath solution)来分选PBS中200mg(约300,000珠)的测定文库珠。使样品杯中的珠通过流动室并以＞100对象/s的速率通过流体动力学聚集。珠的TOF、红色荧光和红色荧光峰高度使用红色二极管激光(λ＝635nm)检测。由于珠的自发荧光，有意地关闭氩离子激光，以最小化渗透(bleed-through)效应。在第一次分选中收集小于5,000珠(小于珠总数的1.7％)。对于第二步骤的分选，将从第一步骤分选的珠用去离子水充分清洗，转移至COPAS Plus的样品杯中，并用100mL去离子水稀释。使样品杯中的珠以＜5对象/s的速率通过流动池。将每个命中珠直接分选到具有锥形孔的96孔板中。
实施例2
该实施例说明使用生物聚合物文库的筛选测定。
本文所用的全部OBOC肽文库均使用双偶联方法制备来确保珠上的肽的高纯度。靶生物标记物bCAII的锚定序列通过逐步筛选以下获得：i)涵盖除半胱氨酸和甲硫氨酸外的非天然D立体异构体即天然L-氨基酸对映体的六聚体文库；ii)使用基于上一文库的筛选结果而选择的氨基酸的缩小(focused)的六聚体文库。在实施例2中，D-立体异构体通过小写的标准单字母缩写表示(如，W＝L-色氨酸，w＝D-色氨酸)。在牛血清白蛋白存在下用10nM的bCAII-AlexaFluor 647缀合物在缓冲溶液中孵育18小时，BSA作为封闭剂以抑制非特异性结合。分选使用COPAS Plus(Union Biometrica)自动化进行，之后对使用最佳CNBr裂解条件从单一珠获得的裂解肽进行MALDI-MS/MS测序。
在获得锚定肽六聚体-1(lhrywf)(SEQ ID NO.7)后，通过从N-末端开始附加四聚体肽构建新的可变区，在h和r之间掺入甲硫氨酸使得裂解的化合物可以是六聚体肽以有利于MS测序。偶联的甲硫氨酸的量为仅15％-20％以防止所述可裂解接头在结合过程中的不良影响，而N-末端用乙酰基封闭以降低非特异性结合。从初始筛选的结果中直接选择十聚体-N1(kvtflhrywf)(SEQ ID NO.8)，即没有产生缩小的文库。六聚体-1(lhrywf)(SEQ ID NO.7)和十聚体-N1(kvtflhrywf)(SEQ ID NO.8)均从Rink酰胺树脂出发重新构建，其N-末端用乙酰基封闭。对于点印迹实验，所述肽在C-末端通过作为连接物(tether)的PEG2(Merck，20个原子)与生物素缀合(图9)。尽管两种肽均显示与bCAII相互作用，延伸的十聚体-N1(kvtflhrywf)(SEQ ID NO.8)不仅在表面等离子共振传感图中显示更高的响应单位(RU)，而且在结合-解离模式上显示更多的抗体样行为。点印迹实验也支持十聚体N1对bCAII更高的效价，在沿着线堆积的系列减少的bCAII中其显示更多的斑。有趣的是，尽管六聚体-1对人碳酸酐酶II(hCAII)有更高效价，延伸的十聚体-N1对牛和人标记物均显示相似的效价。这些结果表明该方法明显有效地通过简单延伸方法增强对肽配体的效价和特异性。值得注意的是部分掺入帮助最小化可裂解接头在筛选过程中的参与，因此延伸的十聚体-N1证明是通过可靠的筛选获得的真命中。
在锚定肽N-末端的延伸。使用更优化的测定条件以及更精确地分选和测序技巧进行了新的筛选。获得另一锚定肽六聚体-2(ifvykr)(SEQ ID NO.9)并用SPR和点印迹检查来显示针对bCAII的比六聚体-1更好的特性。从六聚体-2出发，以相似的方式构建了另一延伸的文库，部分比例的甲硫氨酸位于f和v之间。基于全面的六聚体文库的筛选结果(在框中的直方图显示)，构建了缩小的文库并进行筛选，给出延长的十聚体配体的20个候选物(图10A)。通过将所属20种候选肽置于针对bCAII的竞争性环境下来进行快速筛选。最后选择了三种十聚体肽并重新构建，并在点印迹实验中测试。尽管与其前体六聚体-2相比，全部3种十聚体肽显著增强亲和力(直至20ng的沉积的bCAII也显示出清楚地显影的斑)，十聚体-3(ryrr-ifvykr)(SEQ ID NO.10)似乎最显著，用于进一步的研究。
在锚定肽C-末端的延伸。C-末端的延伸从掺入100％甲硫氨酸出发，这使得合成和MS操作更容易。使用过量的Fmoc-甲硫氨酸来完全偶联可裂解接头，而不是将甲硫氨酸部分偶联至TentaGel S氨基树脂。然后继续合成，应用除甲硫氨酸和半胱氨酸外的18种d-氨基酸构建可变四聚体区，然后线性合成锚定基序ifvykr(SEQ ID NO.9)。N-末端如上所述用乙酰基封闭。虽然由于使用100％可裂解接头有易于合成和MS取样的优点，但是由于对相对大的离子化片段的降低的质量灵敏度，裂解的十聚体肽的从头测序更有挑战性，特别对于接近N-末端的氨基酸。用于快速和有效地从头肽测序的最佳肽长度似乎是最多10个氨基酸。进行的全部流程和在N-末端的延伸相似，即对缩小的文库的多两次的筛选和20种候选物(图11)。最终的3种十聚体肽重新构建，用生物素在C-末端标记以通过点印迹进行验证，显示与前体六聚体-2(ifvykr)(SEQ ID NO.9)相比显著增强的亲和力。值得注意的是它们的亲和力似乎与那些N-末端延伸的命中的亲和力相当，直至20ng显示清楚地显影的斑。该3种延伸的命中中，十聚体-4(ifvykr-wryp)(SEQ ID NO.11)似乎更显著，用于进一步的研究。
延伸的肽的组合。显而易见，将锚定基序保留在中间而将两种延伸的肽配体组合会使得亲和力变得更好。组合的十四聚体-N2C(ryrr-ifvykr-wryp)(SEQ ID NO.12)通过典型的肽合成进行加工，从在C-末端附加生物素部分开始，随后将PEG2部分作为间隔物(图12)。通过用i)六个连续甘氨酸，和ii)相似长度的PEG4(19个原子)[Chung，S.；Parker，J.B.；Bianchet，M.；Amzel，L.M.；Stivers，J.T.Nat.Chem.Biol.2009，5，407-413]替换锚定基序，合成了另外两种肽来进行比较。每种肽配体的浓度从0.5μM降低至0.1μM，期望观察到由更多数目的斑所显示的更高的亲和力。简言之，十四聚体-N2C没有比两种前体十聚体-N2和十聚体-C2明显改进，不过其仍然比初始锚定六聚体-2(ifvykr)(SEQ ID NO.9)具有更高效价。两种没有锚定基序的肽没有明显地结合bCAII。这些结果表明锚定序列能够驱动对靶标记物的结合亲和力，即使所述肽仍然含有在某种程度和靶相互作用的片段序列。似乎由每种四聚体肽(ryrr和wryp)(分别SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5)驱动的结合亲和力不足以在给定的浓度范围内显示斑。另一种可能性是六个连续甘氨酸和锚定基序(ifvykr)(SEQ ID NO.9)的二级构象显著不同，阻止四聚体肽区域接近结合位点。为支持这一假说，用更具弹性的接头基团替换所述六个甘氨酸会是有意义的。
在每个末端和任意分支点的延伸可以同步进行以减少开发时间。然后可以组合每个延伸的节段来制备多配体类型捕获剂，其具有足以替换抗体的效价和特异性(图13)。
通过SPR的验证。使用SPR作为验证工具研究所述肽配体对bCAII的结合亲和力。在Biacore T100系统中，将靶标记物固定于CM5传感器芯片至1000相应单位(RU)。系列浓度的每种肽溶液被洗脱通过芯片表面以观察响应以及由甘氨酸-盐酸盐处理介导的解离模式。如图14所示，肽配体的最大响应(Rmax)从六聚体-2至所述十聚体然后至十四聚体在最高浓度(1.0μM)以逐步的形式增加(8→40→140)。值得注意的是组合的配体不仅显示高响应，还显示结合和解离的更多的抗体样模式。这些结果清楚地支持我们的延伸方法对增强对给定靶标记物的亲和力是高度有效地。
使用四种其它的肽进行了更多的SPR实验(图15)。第一两种分别含有G6和PEG4而不是基序序列(ifvykr)(SEQ ID NO.9)的肽显示和图14中的两种十聚体一样的响应，具有30-40的RU。在点印迹实验中，它们没有显示对bCAII的显著的亲和力。所述十聚体结合似乎太弱，仅仅给出低响应，不过它们仍显示配体样行为。
实验部分
通用：N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二乙醚和二氯甲烷(DCM)购自Merck。Fmoc保护的氨基酸(Fmoc-AA′s)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)以及N，N-二异丙基乙胺(DIEA)购自GLBiochem(上海)公司。三氟乙酸(TFA)和三异丙基硅烷(TIS)购自Aldrich。一系列Fmoc保护的PEG-COOH和生物素-NHS购自Merck。a-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)购自Bruker。MALDI-MS和MS/MS用Bruker Autoflex IITOF/TOF获得。微波辅助的CNBr裂解反应通过Sharp公司的家用微波炉(型号：R-248J，800W，2450MHz)进行。
肽文库合成(全部和部分甲硫氨酸作为可裂解接头)。肽文库合成使用自动化合成仪Titan 357(AAPPTEC)进行。TentaGel S氨基珠(1.8g，90m；容量＝0.30mmol/g；2.86×106珠/g)在收集容器(CV)中在NM/P(27ml)吸胀2小时。为了掺入全部甲硫氨酸作为接头，在排干溶剂之后将Fmoc-甲硫氨酸(2.5当量，0.2M的NM/P溶液)以及TBTU(2.5当量，0.2M的NM/P溶液)和DIEA(5当量，0.5M的NM/P溶液)加入CV中。获得的混合物涡旋30分钟。排干溶液并用NMP充分洗涤获得的珠(27ml x 3)。为了掺入部分甲硫氨酸(以20％为例)作为接头，Fmoc-甲硫氨酸(0.4当量)和TBTU(0.2当量)在NMP中预孵育10分钟，之后加入吸胀的珠(1.8g)。5分钟涡旋后，将DIEA(2.0当量，0.5M的NMP)溶液)加入悬液中。获得的混合物涡旋30分钟，之后用NMP洗涤(27ml x 3)。然后，加入NMP中的哌啶(27ml，20％，v/v)并将CV涡旋5分钟。排干液体，用新鲜部分的NMP中的哌啶(27ml，20％，v/v)处理珠5分钟。获得的珠用NMP(27ml x 3)和DCM(27ml x 3)充分洗涤，随后平均分入18个反应容器(RV)。将18种氨基酸差异元件(2当量，除半胱氨酸和甲硫氨酸外，0.2M的NMP溶液)中的一种，以及TBTU(2当量，0.2M的NMP溶液)和DIEA(5当量，0.5M的NMP溶液)加入每一RV。然后将RV涡旋30分钟。排干溶液后，重复偶联步骤。获得的每一RV中的珠用NMP洗涤(1.5ml x3)。两次使用新鲜部分的NMP中的哌啶(20％，v/v，1.5ml每次，分别5分钟和15分钟)进行Fmoc保护基的去除。在排干溶液后，每一RV中的珠用NMP(1.5ml x 3)和DCM(1.5ml x 3)充分洗涤，然后合并入CV中。重复全部的拆分、偶联、去保护和混合过程直至所述珠附加有期望长度的肽。如果有必要，通过在DIEA(15ml，0.5M的NMP溶液)存在下用乙酸酐(15ml，0.3M的NMP溶液)处理所述珠15分钟来在N-末端引入乙酰基。将合并的珠置于装配有滤器的50ml反应器。通过在TFA-水-TIS(27ml，95∶2.5∶2.5，v/v/v)中摇动2小时去除残余物中的酸敏感保护基。排干溶剂并用DCM(27ml x3)、甲醇(27ml x 3)、水(27ml x 3)、甲醇(27ml x 3)、DCM(27ml x 3)和二乙醚(27ml)连续地充分洗涤所获得的珠，然后在减压下干燥24小时。
肽配体的合成。自动化合成仪Titan 357(AAPPTEC)的RV中的孔用作反应器。Rink酰胺树脂(100mg，装载氨基基团：0.31mmol/g)在NMP(1.5ml)中吸胀15分钟，然后排干溶剂。在通过用NMP中的哌啶(1.5ml x 2，20％v/v)处理分别5分钟和15分钟去除Fmoc基团后，连续地加入所需的Fmoc-氨基酸(2.5当量，0.2M的NMP溶液)，、TBTU(2.5当量，0.2M的NMP溶液)和DIEA(5当量，0.2M的NMP溶液)，并将获得的珠涡旋30分钟。重复去保护-偶联循环，在每一步使用所需的Fmoc-氨基酸，直至所述珠附加目标序列。在合成生物素标记的肽的情况中，最初偶联Fmoc-Lys(Mtt)-OH，随后通过连续地用TFA/TIS/DCM溶液(1.5ml每次，1/5/94v/v/v)处理2min、5min、30min去除Mtt基团。获得的珠用DCM (1.5mlx 3)和NMP(1.5ml)然后DIEA的NMP溶液(1.5ml，0.1M)充分洗涤。将生物素-NHS(1.5当量)和DIEA(5当量)和珠在1.5ml NMP中涡旋15分钟进行处理，获得的珠用NMP(1.5ml x 3)充分洗涤。获得的珠用NMP(3ml x4)充分洗涤。然后，加入NMP中的20％哌啶(5ml，v/v)并将RV涡旋5分钟。排干液体并加入新鲜的NMP中的20％哌啶溶液(3ml，v/v)，并再次涡旋RV15分钟。
用NMP(3ml x 4)和DCM(3ml x 4)充分洗涤获得的珠。如上所述，使用18种非天然Fmoc保护的氨基酸(除半胱氨酸和甲硫氨酸外)和Fmoc-PEG-COOH连续地引入必要的氨基酸或PEG基团。如果有必要，通过在DIEA(1ml，0.5M的NMP溶液)存在下用乙酸酐(1ml，0.3M的NMP溶液)处理所述珠15分钟来在N-末端引入乙酰基。将珠转移进转配有滤器的8ml反应器，在三氟乙酸(TFA)/水/TIS(2ml，94/3/3，/v/v/v)中室温孵育2小时。收集裂解溶液并在氮气流中浓缩。使用制备型HPLC进行最终纯化以产生白色固体状的具有C-末端咪唑羧酰胺基的所需的肽。
文库筛选和分选。为了筛选，首先用Alexa Fluor 647蛋白标记试剂盒(A20173，Invitrogen)根据供应商方案标记bCAII蛋白。首先，在0.1M碳酸氢钠(pH～8.3)中溶解2mg/ml的bCAII溶液。然后将0.5ml的该bCAII溶液转移进反应性染料的小瓶。将小瓶盖好并颠倒数次来充分溶解染料。将反应混合物在室温和黑暗条件下搅拌1小时。使用试剂盒中的排阻纯化树脂从混合物中纯化Alexa
Figure BDA0000143762120000281
647标记的bCAII(bCAII-A647)。通过紫外-可见光谱和SDS-PAGE表征纯化的和标记的bCAII。对所述筛选，将100mg文库树脂转移至8mL Alltech容器中，并在封闭液，0.05％NaN3、0.1％吐温20和0.1％BSA的PBS缓冲液(pH 7.4)中，在25℃360°摇床上预孵育1小时。真空排干缓冲溶液，然后向吸胀的树脂中加入5ml稀释于封闭溶液的10nM染料标记的bCAII。获得的混合物在25℃360°摇床上孵育15-18小时。真空排干液体，并通过连续用封闭液清洗3次和用PBS缓冲液中的0.1％吐温20清洗3次来去除非特异性结合的蛋白。最后，树脂用PBS缓冲液洗涤6次。在严格性洗涤后，将200mg测定的文库树脂转移至COPAS Plus(UnionBiometrica)[Fields，G.B.；Noble，R.L.Int.J.Pept.Protein Res.1990，35，161-214]样品容器中，并用200mL PBS缓冲液(pH 7.4)稀释。应用两步分选。在第二次分选，将阳性珠直接分选进带锥形孔的96孔滴定板。接着进行CNBr裂解和MALDI-MS和MS/MS。
从分选的单一珠通过CNBr裂解肽。将单一的珠转移至含有10μL去离子水的微量瓶。用氩气吹洗反应容器15分钟，然后将CNBr(10μL，0.2NHCl中的0.50M溶液)加入所述容器中。再次用氩气吹洗15分钟后，将小瓶置于微波1分钟。获得的溶液45℃10分钟然后60℃50分钟离心真空浓缩。
使用MALDI-MS和MS/MS分析从单一珠裂解的肽。对于全部可裂解的珠，向每个小瓶或孔中加入CHCA(7微升，乙腈/水(70∶30)中的0.5％溶液)和然后加入乙腈/水(7微升，70∶30，包含0.1％TFA(v/v)和1mM磷酸二氢铵)。对于部分可裂解的珠(例如20％)，向每个小瓶或孔中加入CHCA(2微升，乙腈/水(70∶30)中的0.5％溶液)和然后加入乙腈/水(2微升，70∶30，包含0.1％TFA(v/v)和1mM磷酸二氢铵)。将板离心2分钟，每一溶液移出2微升并点样至384孔MALDI板上，将所述板静置15分钟以自然干燥。然后用来自Bruker Daltonics的ultrafleXtremeTM MALDI-TOF/TOF质谱仪进行MALDI-MS和MS/MS。
表面等离子共振(SPR)测量重新合成的肽配体的亲和力。亲和力测定使用安装有研究级CM5传感器芯片(GE Healthcare)的Biacore 3000系统(GEHeathcare)进行。设备用HBS-EP+(GE Heathcare)缓冲液预处理。流动室1(或3)用作参照以减去非特异性结合、偏差和本体折射率(bulk refractiveindex)，而流动室2(或4)依照标准步骤用靶生物标记物(bCAII)固定。用0.4M EDC和0.1M NHS的1∶1混合物活化流动室2(或4)，并注射0.1mg/mLbCAII溶液。用1M的乙醇胺溶液(pH 8.5)封闭剩余的活化的基团。约5000相应单位(RU)的bCAII固定于传感芯片表面上。设备用运行缓冲液(HBS-EP+)预处理。每种鉴别的6聚体配体候选物稀释于HBS-EP+缓冲液以产生每种肽的5μM肽储液，其被系列2倍稀释产生低至2nM的浓度系列。对于给定的亲和力测量，这些系列的肽溶液在25℃下以100μL/min的流速连续地注射进流动室2(或4)，3分钟的接触时间，5分钟的解离时间，以及3.5分钟的稳定化时间。在每种肽溶液注射后，用甘氨酸2.5(GE Healthcare)再生流动室2(或4)。
点印迹测定来测量缀合至生物素的重新合成的肽配体的亲和力。通过使用5％脱脂奶粉的TBS-T[25mM Tris，150mM NaCl，2mM KCl，0.5％Tween 20(pH 8.0)]中的点印迹实验，阐明了肽配体对靶生物标记物(bCAII)的亲和力。在PBS缓冲液(pH7.4)中制备10mg/mL的bCAII储备溶液。将母液的系列稀释物施加于硝酸纤维素膜上，一般从2μg至5ng每斑点。在室温用5％脱脂奶粉/TBS-T将膜封闭2小时。然后用TBS-T洗膜。在5％脱脂奶粉/TBS-T制备0.5μM的缀合至生物素(以PEG2(20个原子，
Figure BDA0000143762120000301
)作为接头)的肽配体溶液，并覆盖膜室温孵育2小时。在用TBS-T 10分钟洗涤3次后，将在5％脱脂奶粉/TBS-T制备的1∶3000链霉抗生物素蛋白-HRP(Abcam)加至膜并孵育2小时。在用TBS-T 10分钟洗涤3次后，用化学发光试剂(Amersham ECL plus Western印迹检测试剂，GE Healthcare)处理膜并立即在胶片上显影。
尽管本文已经描述了本发明的若干实施方式，本领域技术人员将容易预见用于实现本文所述功能和/或获得结果和/或一种或多种优点的多种其他方法和/或结构，且这些变化和/或修改均被认为包括在本发明的范围内。更具体地，本领域技术人员将容易理解本文所述的全部参数、尺寸、材料和结构是示例性的，且实际参数、尺寸、材料和/或结构将取决于使用本发明教导的具体应用。本领域技术人员将认识到或能够确定使用不超出常规实验的本文所述发明具体实施方式的许多等同形式。因此，应理解全部前述实施方式仅为示例且在本发明所附权利要求和等价形式范围内，本发明可不按照具体所述和所要求保护来实施。本发明涉及本文所述的各个单独的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。此外，如果这样的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法不是相互不一致，则任何两种或多种这样的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的组合可包括在本发明的范围内。
应理解本文所定义和使用的全部定义包括字典的定义、通过援引加入本文的文献中的定义、和/或此定义术语的普通含义。
除非另有说明，说明书和权利要求中所用不定冠词“一”(“a”和“an”)应理解为至少一个。
说明书和权利要求中所用短语“和/或”应理解是指所联在一起的元素关系为“或者”或“两者均”，即在一些情况中联合存在，而在另一些情况中不联合存在的元素。用“和/或”表示的多种元素应以相同方式解释，即“一种或多种”元素联合。除了用“和/或”具体定义的元素，其它元素可任选地存在，无论其与具体定义的那些元素相关或不相关。因此，作为非限定性实施例，当与开放式表述例如“包括”一起使用时，“A和/或B”在一个实施方式中可仅指A(任选地包括B外的其它元素)；在另一个实施方式中可仅指B(任选地包括A外的其它元素)；在另一个实施方式中指A和B(任选地包括其它元素)等。
如说明书和权利要求中所用，“或”应理解为具有与上述定义的“和/或”相同含义。例如，当将此词分开时，“或”或者“和/或”应理解为包括的，即包括大量或列举的元素和任选地其它未列出的项目中至少一种，但也包括多于一种。只有与之明确相反的术语，例如“仅有一种”或“刚好一种”，或当用在权利要求的“由...组成”中时，是指包括大量或所列元素中的仅一种元素。通常，当用排除性术语之后时，例如“或者”、“之一”、“仅有一种”或“只有一种”，本文所用术语“或”应仅理解为排除性选择(即“一种或其它，但不包括两者均”)。当用在权利要求中时，“基本上由...组成”具有专利法律领域中所用的普通含义。
如说明书和权利要求中所用，关于列举的一种或多种元素，术语“至少一种”应理解为是指选自所列举元素中任何一种或多种元素的至少一种元素，但不必然包括所列举元素内的各种和每种元素的至少一种，且不排除所列举元素内的任何组合。除了术语“至少一种”所指的元素列表中明确指明的元素外，此定义也允许元素任选地存在，无论是否具体指明与那些元素相关或不相关。因此，作为非限定性实例，“A和B中的至少一种”(或等同地“A或B中的至少一种”，或等同地“A和/或B中的至少一种”)在一个实施方式中是指至少一种，任选地包括多于一种A，而没有B(任选地包括B以外的元素)；在另一个实施方式中是指至少一种，任选地包括多于一种B，而没有A(任选地包括A以外的元素)；在另一个实施方式中是指至少一种，任选地包括多于一种A，和至少一种，任选地包括大于一种B(任选地包括其它元素)等。
也应理解，除非有相反说明，在本文要求保护的任何方法中包括多于一个步骤或工艺，方法中步骤或工艺的顺序不必须限制为所引述方法中步骤或工艺的顺序。
在权利要求书以及上述说明书中，全部过渡短语例如“包括”、“包含”、“带有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“涵盖”等应理解为是开放式的，即指包括但不限于。仅有过渡术语“由...组成”和“基本上由...组成”各自应为封闭式或半封闭式过渡术语，如美国专利局专利审查规定手册2111.03节所述。
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Claims (45)

1.组合物，其包括：
第一生物聚合物和第二生物聚合物的混合物，其中除了在一或多个位置处第二生物聚合物含有可裂解接头外，所述第二生物聚合物与第一生物聚合物相同。
2.权利要求1的组合物，其中所述第一生物聚合物和第二生物聚合物各自包含氨基酸序列。
3.权利要求1的组合物，其中所述第一生物聚合物和第二生物聚合物各自包含核苷酸序列。
4.权利要求1的组合物，其中所述第一生物聚合物和第二生物聚合物各自包含多糖。
5.权利要求1的组合物，其中所述可裂解接头是甲硫氨酸。
6.权利要求1的组合物，其中所述第一生物聚合物和第二生物聚合物与表面连接。
7.权利要求6的组合物，其中所述表面是颗粒的外表面。
8.权利要求1的组合物，其中所述第一生物聚合物与第二生物聚合物的比例大于1∶1。
9.权利要求1的组合物，其还包括多个所述混合物，其中每一混合物与单独的颗粒连接。
10.权利要求2的组合物，其中所述第一生物聚合物包含锚定氨基酸序列和N-末端氨基酸序列延伸。
11.权利要求2的组合物，其中所述第一生物聚合物包含锚定氨基酸序列和C-末端氨基酸序列延伸。
12.权利要求1的组合物，其中所述第二生物聚合物比第一生物聚合物长至少一个亚单元。
13.权利要求2的组合物，其中所述第二生物聚合物比第一生物聚合物多包含至少一个氨基酸。
14.权利要求2的组合物，其中所述第二生物聚合物具有和第一生物聚合物相同数目的氨基酸。
15.一种方法，其包括：
在表面上生长生物聚合物，其中在生长步骤期间将可裂解接头前体添加至含有所述生物聚合物的介质并掺入所述生物聚合物，使得生长于表面上的生物聚合物仅一部分含有来源于所述可裂解接头前体的可裂解接头。
16.权利要求15的方法，其中所述可裂解接头前体包含至少一个氨基酸。
17.权利要求15的方法，其中将相对于所述序列的反应中心的少于1当量的所述可裂解接头前体添加至所述介质。
18.权利要求15的方法，其中所述介质还包含与所述可裂解接头可区分的氨基酸前体。
19.权利要求18的方法，其中所述氨基酸前体与所述可裂解接头前体的比例大于1∶1。
20.权利要求18的方法，其中所述氨基酸前体与所述可裂解接头前体的比例大于5∶1。
21.权利要求18的方法，其中所述氨基酸前体包含第一保护基团以及所述可裂解接头前体包含与第一保护基团不同的第二保护基团。
22.权利要求15的方法，其还包括在多个单独颗粒上生长生物聚合物，其中每一颗粒包含独特的生物聚合物。
23.一种方法，其包括：
使多个生物聚合物与至少一个表面混合；和
使所述多个生物聚合物与所述至少一个表面连接，使得所述生物聚合物的仅一部分与含有可裂解接头的所述表面连接。
24.组合物，其包括：
含有结合区和可裂解接头的生物聚合物，其中所述结合区与所述可裂解接头由足以使所述结合区对靶物质的结合亲和力的降低少于20％的距离分隔。
25.权利要求24、32或33中任一项的组合物，其中所述结合区是表位。
26.权利要求24或33的组合物，其中所述结合区与所述可裂解接头由至少两个生物聚合物亚单元分隔。
27.权利要求24、32或33中任一项的组合物，其中所述生物聚合物包括氨基酸序列，以及其中所述可裂解接头位于所述氨基酸序列C-末端的5个氨基酸内。
28.权利要求24、32或33中任一项的组合物，其中第一多个生物聚合物与表面连接。
29.权利要求28的组合物，其中第二多个生物聚合物与表面连接，其中除了在一或多个位置处第二多个生物聚合物含有可切割接头外，所述第二多个生物聚合物与第一多个生物聚合物相同。
30.权利要求28的组合物，其中所述表面是颗粒的外表面。
31.权利要求24、32或33中任一项的组合物，其还包括独特的生物聚合物的文库，其中每种生物聚合物与单独的颗粒连接。
32.组合物，其包括：
含有结合区和可裂解接头的生物聚合物，其中所述结合区与所述可裂解接头由至少两个生物聚合物亚单元分隔。
33.组合物，其包括：
含有结合区和可裂解接头的生物聚合物，其中所述可裂解接头位于生物聚合物一端的5个生物聚合物亚单元内。
34.筛选生物聚合物文库的方法，其包括：
提供多个颗粒，其中每一颗粒包含独特的第一生物聚合物以及独特的第二生物聚合物，所述第二生物聚合物包含可裂解接头；
使所述多个颗粒与靶接触；
分离与靶的结合高于阈值水平的所述多个颗粒的成员；
裂解在所分离的所述多个颗粒的成员上的可裂解接头来释放第二生物聚合物的片段；和
确定第二生物聚合物片段的序列。
35.一种文库，其包括：
多个颗粒，其中每一颗粒连接第一生物聚合物和第二生物聚合物，其中除了在一或多个位置处第二生物聚合物含有可裂解接头外，所述第二生物聚合物与第一生物聚合物相同。
36.权利要求35的文库，其中所述第一生物聚合物和第二生物聚合物各自包含氨基酸序列。
37.权利要求35的文库，其中所述第一生物聚合物和第二生物聚合物各自包含核酸序列。
38.权利要求35的文库，其中所述第一生物聚合物和第二生物聚合物各自包含多糖。
39.权利要求35的文库，其中所述可裂解接头是甲硫氨酸。
40.权利要求35的文库，其中所述第一生物聚合物与第二生物聚合物的比例大于1∶1。
41.权利要求35的文库，其中所述第一生物聚合物包含锚定氨基酸序列和N-末端氨基酸序列延伸。
42.权利要求35的文库，其中所述第一生物聚合物包含锚定氨基酸序列和C-末端氨基酸序列延伸。
43.权利要求35的文库，其中与第一生物聚合物相比，所述可裂解接头增加第二生物聚合物的长度。
44.权利要求36的文库，其中所述第二生物聚合物比第一生物聚合物多包含至少一个氨基酸。
45.权利要求36的文库，其中所述第二生物聚合物和第一生物聚合物具有相同数目的氨基酸。
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