JP4651196B2 - 相補的オリゴヌクレオチドタグセットを作製するための方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般には分子（特にポリヌクレオチド）を同定、選別、および／または探知するために使用され得るオリゴヌクレオチドタグのコレクションを合成するための方法に関する。特定の局面においては、本発明は、タグ化された実体をタグ成分のアドレス可能なアレイ上に固定化するに特に有用である、オリゴヌクレオチドタグおよびタグ成分の相補的なセットを形成するための方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
オリゴヌクレオチドおよびそのアナログの特異的ハイブリダイゼーションは、広く多様な研究的適用、医学的適用および産業的適用で用いられている基礎的なプロセス（診断アッセイにおける疾患関連のポリヌクレオチドの同定、新規の標的ポリヌクレオチドのクローンのスクリーニング、ポリヌクレオチド混合物のブロットにおける特異的ポリヌクレオチドの同定、特異的な標的ポリヌクレオチドの増幅、不適切に発現された遺伝子の治療的ブロッキング、ＤＮＡ配列決定などを含む）である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）；ＫｅｌｌｅｒおよびＭａｎａｋ、ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅｓ、第２版（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３）；Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３６：１９２３−１９３７（１９９３）；Ｄｒｍａｎａｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：１６４９−１６５２（１９９３）；Ｂａｉｎｓ、Ｊ．、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｐｐｉｎｇ，４：１４３−１５０（１９９３））。
【０００３】
特異的ハイブリダイゼーションはまた、オリゴヌクレオチドタグで標識された化合物を探知、回収、および同定する方法として提案されている（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ、国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９５／１２７９１号（公開番号第ＷＯ９６／１２０１４号）；Ｃｈｕｒｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１８５−１８８（１９８８）；ＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８９：５３８１−５３８３（１９９２）：Ａｌｐｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６４：１３９９−１４０１（１９９４）：およびＮｅｅｄｅｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０：１０７００−１０７０４（１９９３））。このようなタグ化スキームをうまく実施することは、タグとその相補的プローブとの間での特異的なハイブリダイゼーションの達成における成功に大部分依存している。すなわち、オリゴヌクレオチドタグが物質をうまく同定するためには、擬陽性および擬陰性のシグナルの数を最小限にしなければならない。不幸にも、このような偽のシグナルは稀ではない。なぜなら塩基対合成および塩基スタッキング（ｂａｓｅ ｓｔａｃｋｉｎｇ）の自由エネルギーは二重鎖構造または三重鎖構造におけるヌクレオチドのあいだで広く変化するからである。例えば、その相補体に結合したデオキシアデノシン（Ａ）およびチミジン（Ｔ）の繰り返し配列からなる二重鎖は、ミスマッチを含む部分的に相補的な標的に結合したデオキシグアノシン（Ｇ）およびデオキシシチジン（Ｃ）の繰り返し配列からなる同じ長さの二重鎖より安定性が低い可能性がある。従って、大きなコンビナトリアルケミカルライブラリー由来の所望の化合物が前者のオリゴヌクレオチドでタグ化された場合、完全にマッチしたＡＴに富む二重鎖を検出するように設計されたハイブリダイゼーション条件下では、ＧＣに富むオリゴヌクレオチドで標識された所望されない化合物（ミスマッチした二重鎖においてさえ）が、ＡＴに富むタグからなる完全にマッチした二重鎖とともに検出されるという重大な可能性が存在する。たとえ塩化テトラメチルアンモニウムのような試薬がオリゴヌクレオチド二重鎖の塩基特異的安定性の相違を無効にするために利用可能であるとしても、このような試薬の効果はしばしば限定され、そしてその存在は選択された化合物のさらなる操作（例えば、ポリメーラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅など）と非適合性であり得るか、またはこのような操作をより困難にし得る。このような問題は、ミスマッチしたハイブリダイゼーションの発生を最小化する、最小に交差ハイブリダイズしている（ｍｉｎｉｍａｌｌｙ ｃｒｏｓｓ−ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）オリゴヌクレオチドタグセットの開発において、ＷＯ９６／１２０１４（前出）および国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０９５１３号（ＷＯ９６／４１０１１）に記載のように、Ｂｒｅｎｎｅｒにより取り組まれている。
【０００４】
しかし、不運なことに、固相オリゴヌクレオチド合成の既存の方法は、高度に効率的であるが、オリゴヌクレオチドが３０〜４０ヌクレオチド長を超える場合に特に、不首尾の配列の有意な画分を依然としてもたらす。このようなオリゴヌクレオチドの混合物がタグとして（特に選別のために）利用される場合には、不首尾の配列の重要な結果は、２つの化合物を別個に合成する場合にはいつでも、そのタグの画分が相補体を有さないことである。従って、複雑な混合物を選別する際（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ（上で引用）に記載されるプロセスにおいて必要とされるような）には、このような不首尾は、この選別プロセスの完全性を制限する。
【０００５】
上記を考慮すると、用いられる合成プロセスの効率にかかわらず、全てのタグが相補体を有することを確実にするオリゴヌクレオチドタグのセットを合成するための手段が利用可能である場合、これは有用である。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明の目的は、レパートリーにおける全てのオリゴヌクレオチドタグが対応するタグ相補体を有することを確実にする、オリゴヌクレオチドタグの１つ以上のレパートリーを合成する方法を提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、本発明の方法により生成されるオリゴヌクレオチドタグにより、ポリヌクレオチドを固相支持体上に選別するためのシステムを提供することである。
【０００８】
本発明のさらなる目的は、サブユニット（ワード）のコンビナトリアル付加により、オリゴヌクレオチドタグを合成する方法を提供することである。
【０００９】
本発明のこれらおよび他の目的は、オリゴヌクレオチドタグ相補体のレパートリーを、１つ以上の固相支持体上で合成する工程、このオリゴヌクレオチドタグ相補体の画分をこの支持体（単数または複数）から切断する工程、およびこの切断したタグ相補体をクローニングベクターに挿入する工程を包含する、合成方法を提供することにより、達成される。このクローン化されたタグ相補体は、選択された物質（好ましくは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生体分子）に好都合に結合体化されて、独特のタグ配列を有する、タグ化された物質を生成し得、これは、ハイブリダイゼーションによって、対応するタグ相補体へと捕捉され得、そして選別され得る。
【００１０】
１実施形態においては、本発明は、オリゴヌクレオチドタグのレパートリーを合成する方法を提供する。この方法において、複数の異なる配列のオリゴヌクレオチド集団が、１つ以上の固相支持体上で合成され、その結果、各集団は、他の集団に対して空間的に離れた領域に位置し、そして各集団内のオリゴヌクレオチドは、所定の集団における全てのオリゴヌクレオチドについては同一であるが他の全てのオリゴヌクレオチド集団におけるタグ相補体配列とは異なり得る、タグ相補体配列を含む。このオリゴヌクレオチドの画分は、１つ以上の支持体上の各集団から切断されて、異なる配列のタグ相補体オリゴヌクレオチドの混合物を遊離する。プライマーは各タグ相補体オリゴヌクレオチドへとアニールされ、そしてこのアニールされたプライマーは伸長されて、タグ相補体鎖および相補的なタグ鎖を含む二重鎖を形成し、その結果、このように形成されるタグ相補体鎖または二重鎖は、オリゴヌクレオチドタグレパートリーを含む。１つの好ましい実施形態においては、このオリゴヌクレオチドは、その３’末端によって１つ以上の支持体に結合され、そして各オリゴヌクレオチドは、このタグ相補体配列の３’側に、ユニバーサルプライマー結合配列を含む。別の好ましい実施形態においては、各集団から切断されるオリゴヌクレオチドの画分は、１０〜３０％である。なお別の好ましい実施形態によれば、合成されたオリゴヌクレオチドの各集団の選択された画分は、塩基切断可能結合を介して、１つ以上の支持体に結合される。
【００１１】
本発明はまた、上記のように調整したタグオリゴヌクレオチドのレパートリーを含む。
【００１２】
また、タグレパートリー由来の複数のメンバーを含むタグベクターライブラリー形成の方法も提供する。本発明の方法において、上記のように調製したオリゴヌクレオチドのタグのレパートリーは、選択されたベクターの複数のコピーへの連結により挿入され、タグレパートリーのメンバーを含むタグベクターライブラリーを形成する。本発明はまた、この方法により形成されたタグベクターライブラリーを含む。
【００１３】
本発明はまた、タグ化ポリヌクレオチドフラグメントのライブラリーを形成する方法を含む。この方法では、上記由来のタグベクターライブラリーは、各ベクターにおけるタグ配列に隣接する部位で、各タグベクターへのポリヌクレオチドフラグメントの挿入に有効な連結条件下で、異なるポリヌクレオチドフラグメントの混合物と組み合わせられる。本発明はまた、この方法によって形成したタグ化ポリヌクレオチドフラグメントのライブラリーを含む。
【００１４】
別の局面において、本発明はまた、ポリヌクレオチドをソートするためのシステムを含む。このシステムは、１つ以上の固相支持体を含み、この固相支持体上で複数のオリゴヌクレオチド集団を付着し、これにより各集団は、１つ以上の支持体上で、他の集団に対して、空間的に別個の領域に配置される。そして各集団中のこれらのオリゴヌクレオチドは、所定の集団中のあらゆるオリゴヌクレオチドについて同じであるタグ相補体配列を含む。このシステムはまた、上記のように調製され得るタグレパートリー、タグベクターライブラリー、またはタグ化ポリヌクレオチドフラグメントからなる群より選択されるタグ組成物を含む。
【００１５】
本発明はまた、同一のタグ配列を含む複数の固定オリゴヌクレオチドを含む固相支持体を提供する。ここで少なくとも１方のオリゴヌクレオチドは、切断可能リンカーにより支持体に連結され、そしてオリゴヌクレオチドの少なくとももう一方は、切断不能リンカーにより支持体に連結される。第１の好ましい実施形態において、この支持体は、ビーズである。第２の好ましい実施形態において、この支持体は、アドレス可能な領域の平面アレイを含む。それぞれの領域は、同一のタグ配列を含む複数の固定オリゴヌクレオチドを含み、これにより、その領域内の少なくとも２つのタグ配列は、お互いに異なる。好ましくは、切断可能リンカーは、基部−移動性（ｂａｓｅ−ｌａｂｉｌｅ）リンカーである。本発明の固相支持体は、この支持体上に固定されたオリゴヌクレオチドに実質的に相補的であるタグオリゴヌクレオチドのレパートリーを生成するために特に有用である。
【００１６】
従って、本発明はまた、固相ビーズまたは粒子を含む。これは、このビーズまたは粒子に付着するオリゴヌクレオチドの集団を含み、ここでこの集団は、同一のオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドの第１および第２のクラスを含み、そしてこの第１のクラス中のオリゴヌクレオチドは、第２のクラスのオリゴヌクレオチドを有意に切断することなく、支持体からの第１のクラスのオリゴヌクレオチドの選択的切断を可能にする切断可能な連結部分を含む。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、上記の型の固相ビーズまたは粒子の混合物を含む。ここでこの混合物中の少なくとも２つのビーズまたは粒子は、異なるタグ相補体配列を有するオリゴヌクレオチド集団を含む。
【００１８】
これら、ならびに本発明の他の目的および特徴は、以下の説明および添付の図面からより明確になる。
【００１９】
（本発明の詳細な説明）
本発明は、お互いに高い相補性を有するタグおよびタグ相補体のマッチしたセット（レパートリーともよばれる）を合成するための方法および試薬を提供する。このようなマッチしたセットは、配列決定、フィンガープリンティング、または他の型の分析のような、並行した操作のためのタグ化分子を標識およびソートするために特に有用である。
【００２０】
本発明の１つの局面において、オリゴヌクレオチドの集団が合成される。ここで各集団は、切断可能連結部分および切断不能連結部分の混合により支持体に連結される同一のタグ相補体を含む。この切断可能リンカーは、各集団におけるオリゴヌクレオチドの一部が支持体から切断され、オリゴヌクレオチド（この配列はこの支持体上に残るタグ相補体に完全に相補的である）を形成する鋳型として働くことを可能にする。１つ以上の支持体からのタグ相補体の一部を切断すること、および相補的タグを形成するためにこの切断タグを鋳型として用いることにより、この方法は、以前の方法よりも高い収率および忠実度で、マッチしたタグおよびタグ相補体レパートリーを生成する。従って、本発明は、ハイブリダイゼーション特異性およびタグ配列複雑性を、タグおよびそれらの相補体が独立して合成される場合に得られたものに対して増強する。
【００２１】
本発明は、タグ相補体の合成の複雑性の増強のための方法を提供することにより、オリゴヌクレオチドタグを利用する技術における実質的な改善を提供する。以前には、タグは、タグ相補体から独立して合成され、そのため全ての意図されたタグおよびタグ相補体が現実に合成されるという保証はなかった。特に、以前のポリヌクレオチド合成方法は、１つ以上のヌクレオチドフラグメント付加工程において、重大なまたは完全な失敗をうけやすかった。その結果、得られたタグおよびタグ相補体は、意図した配列を有さず、そしてその意図したパートナーに完全にハイブリダイズし得ない。オリゴヌクレオチドの欠陥合成は、タグ化されたサンプル種を意図されたタグ相補体に対する位置付けおよびハイブリダイズから防ぎ、影響したサンプル種のシグナルの消失および／または量の過少評価を生じる。さらに、欠陥タグ配列の存在は、他のタグとの交差ハイブリダイゼーションを導き得、それらの対応する相補体へのそれらのタグのハイブリダイゼーションを妨害する。さらに、タグレパートリーおよびタグ相補体レパートリーの複雑性は減じた。
【００２２】
これらの問題は、固定タグ相補配列の選択部分を鋳型として用いて対応するタグのレパートリーを形成することにより、本発明によって克服される。サンプルへのタグの連結がサンプル物質、好ましくは生体分子（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）を選択し、タグ相補体のアレイ上で捕獲され得るタグ化物質（例えば、サンプルポリヌクレオチドフラグメント）の混合物を生成した。従って、本発明は、タグ相補体の全範囲にハイブリダイズし得る、タグレパートリー、またはレパートリーのサブセットを保証ずる方法を提供する。
【００２３】
Ｉ．定義
「タグ」または「タグオリゴヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチドタグ」は、付着した種（例えば、サンプルオリゴヌクレオチド）のための同定者標識として働き得るヌクレオチド配列を含む、そしてタグレパートリーにおいて他のタグから検出的に識別可能である、オリゴヌクレオチドをいう。
【００２４】
「相補体」または「タグ相補体」は、本明細書において用いる場合、オリゴヌクレオチドタグが特別にハイブリダイズし、完全にマッチした二重鎖または三重鎖を形成するオリゴヌクレオチドをいう。特異的ハイブリダイゼーションが三重鎖を生じる実施形態において、オリゴヌクレオチドタグは、二重鎖または一本鎖のいずれかになるように選択され得る。従って、三重鎖が形成される場合、用語「相補体」は、一本鎖オリゴヌクレオチドタグの二本鎖相補体または二本鎖オリゴヌクレオチドタグの一本鎖相補体のいずれかを包含することを意味する。
【００２５】
用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書において用いる場合、天然または改変されたヌクレオシドモノマーの直線状オリゴマーを意味し、これはデオキシリボヌクレオシドおよびリボヌクレオシドを含む。通常、モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのアナログ（例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミダイト、ホスホネート、ペプチド核酸（Ｎ−誘導体化グリシンポリマー）など）により連結され、数モノマー単位（例えば、３〜４）〜数十モノマー単位、そして１００モノマー単位までのサイズにわたる、オリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドが「ＡＴＧＣＣＴＧ」などの一連の文字の配列により示される場合いつでも、ヌクレオチドは左から右方向に５’→３’の順であること、そして、他に示さない限り、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを意味し、そして「Ｔ」はチミジンを示すことが理解される。通常、本発明のオリゴヌクレオチドは、４つの天然のヌクレオチドを含む。しかし、それらはまた、非天然ヌクレオチドアナログも含む。天然または非天然のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが使用され得る場合（例えば、酵素による処理が必要とされる場合）、通常、天然のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが必要であることが当業者には明白である。
【００２６】
「ポリヌクレオチド」または「ポリヌクレオチドフラグメント」とは、２つ以上のヌクレオチドを含むポリマーをいう。「ポリヌクレオチド」は「オリゴヌクレオチド」を包含するが、ポリヌクレオチドの長さは１００モノマー単位を超え得る。
【００２７】
二重鎖に関して「完全にマッチした」は、各鎖中のあらゆるヌクレオチドが他鎖中のヌクレオチドとＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成を受けるように、二重鎖を作るポリヌクレオチド鎖またはオリゴヌクレオチド鎖が、もう一方の鎖と２本鎖構造を形成することを意味する。この用語はまた、用いられ得るヌクレオシドアナログ（例えば、デオキシイノシン、２−アミノプリン塩基を有するヌクレオシドなど）の対形成を包含する。三重鎖に関しては、この用語は三重鎖が完全にマッチした二重鎖および第３鎖からなり、ここで、あらゆるヌクレオチドが完全にマッチした二重鎖の塩基対とＨｏｏｇｓｔｅｅｎまたは逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ会合を受けることを意味する。逆に、二重鎖におけるタグとオリゴヌクレオチドとの間の「ミスマッチ」は、二重鎖または三重鎖におけるヌクレオチドの対またはトリプレット（ｔｒｉｐｌｅｔ）がＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋおよび／またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎおよび／または逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ結合を受け損なうことを意味する。
【００２８】
本明細書中に用いられる「ヌクレオシド」は、２’−デオキシ型および２’−ヒドロキシル型（例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９２）に記載されるように）を含む天然のヌクレオシドを含む。ヌクレオシドに関する「アナログ」は、改変された塩基部分および／または改変された糖部分を有する合成ヌクレオシド（例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８０）；ＵｈｌｍａｎおよびＰｅｙｍａｎ， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ９０：５４３−５８４（１９９０）などに記載された）を、それらが特異的ハイブリダイゼーションをし得るという条件つきで含む。このようなアナログは、結合特性を増強し、退化を低減し、特異性を増すなどのように設計された合成ヌクレオシドを包含する。
【００２９】
「ヌクレオチド」とは、５’、３’、および／または２’−ヒドロキシルに付着した１つ以上のリン酸基（またはそれらのアナログ）を有するヌクレオシドもしくはヌクレオシドアナログ、またはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに含まれるヌクレオシドをいう。
【００３０】
本明細書において用いる場合、ポリヌクレオチドの集団に関する「複雑性」とは、この集団に存在する異なる種の分子の数を意味する。
【００３１】
本明細書において用いる場合、「レパートリー」とは、配列の異なるオリゴヌクレオチドの収集物または混合物（例えば、オリゴヌクレオチドタグまたはタグ相補体を含む）をいう。「レパートリー」は、規定された複雑性を有し得る。
【００３２】
本明細書において用いる場合、「切断可能連結部分」は、選択された化学条件下で切断可能である化学基をいう。用語「切断可能リンカー」は、切断可能連結部分を含む化合物または化学基をいう。例えば、用語「切断可能リンカー」は、第一の連結機能性を介して支持体に、そして第二の機能性を介してオリゴヌクレオチドに結合し得るリンカー化合物の活性化形態を包含する。切断可能リンカーは、選択された切断可能条件下で切断可能である、エステル基のような切断可能連結部分を含み得る。
【００３３】
（ＩＩ．構成要素）
以下の小節は、本発明の種々の局面を実施するために用いられ得る種々の構成要素（例えば、材料および試薬）を考察する。
【００３４】
（Ａ．固相支持体）
本発明内の使用のための固相支持体は、任意の広範な種々の形態を有し得る。これには微粒子、ビーズ、メンブレン、スライド、プレート、マイクロマシンチップなどを含む。同様に、本発明の固相支持体は、広範な種々の材料を含み得る。これには、ガラス、プラスチック、シリコン、アルケンチオレート誘導体化金、セルロース、低架橋ポリスチレンおよび高架橋ポリスチレン、シリカゲル、ポリアミド、などが挙げられる。好ましくは、別個の粒子の集団のいずれかが使用され、これによりそれぞれの粒子は、同じタグ（および他でない）の相補的配列の、均一なコーティング、または集団を有し、または１つ以上の支持体は、空間的に別個の領域で使用され、それぞれの領域は、同じタグ（および他でない）に相補的である配列の、均一のコーティング、または集団を含む。後者の実施形態では、この領域の面積は、特定の適用に従って変化し得る。通常、この領域は、数μｍ2（例えば、３〜５μｍ2）〜数百μｍ2（例えば、１００〜５００μｍ2）の面積にわたる。好ましくは、このような領域は、空間的に別個であり、この結果、隣接する領域で、事象により生成されたシグナル（例えば、蛍光放出）は、使用され得る検出システムによりお互いから分離され得る。いくつかの適用において、１つより多いタグ相補体の均一なコーティングを有する領域を有することが、例えば、同時の配列分析のために、または別々にタグ化した分子をごく近接して持ってくるために、所望され得る。
【００３５】
例えば、広範な種々の微粒子支持体が、本発明で用いられ得る。、微粒子支持体としては、徐放性の多孔性ガラス（ＣＰＧ）、高架橋ポリスチレン、アクリルコポリマー、セルロース、ナイロン、デキストラン、ラテックス、ポリアクロレインなどにより作製される微粒子が挙げられ、以下の模範的な参考文献中に開示されている：Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、Ａ節、第４４巻、１１−１４７頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７６）；米国特許第４，６７８，８１４号；同第４，４１３，０７０号；および第４，０４６，７２０号；ならびにＰｏｎ、１９章、Ａｇｒａｗａｌ（編）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２０巻（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、１９９３）。微粒子支持体としては、市販のヌクレオシド誘導体化ＣＰＧおよびポリスチレンビーズ（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡから入手可能）；誘導体化磁気ビーズ；ポリエチレングリコールでグラフトされたポリスチレン（例えば、ＴｅｎｔａＧｅｌTM、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）などがさらに挙げられる。支持体の特性（例えば、材質、多孔度、サイズ、形態など）の選択、および用いられる結合部分の型は、タグを用いる際の条件に依存する。例えば、酵素による連続的なプロセスを含む適用において、酵素の立体障害を最小にし、そして基質への接近を容易にする支持体およびリンカーが好ましい。最も適切な微粒子支持体を選択する際に、考慮されるべき他の重要な因子としては、サイズの均一性、合成支持体としての効率、表面積、および光学特性が挙げられる。表面で多くのビーズを扱う場合、平滑な透明（半透明）のビーズは、計測的な（ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎａｌ）利点を提供することに注目する。
【００３６】
上記のように、タグ相補体はまた、１つ以上の固相支持体上で合成され得、タグ相補体で均一にコートされた領域のアレイを形成する。すなわち、このようなアレイ中の各領域内で、同じタグ相補体が合成される。このようなアレイを合成するための技術は、今や周知であり、そして例えば、以下に開示される：ＭｃＧａｌｌら、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３７６７（ＷＯ９３／２２６８０（Ａｆｆｙｍａｘ））；Ｐｅａｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９１：５０２２−５０２６（１９９４）；ＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＭａｓｋｏｓ、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ８９／０１１１４（ＩｓｉｓによるＷＯ９０／０３３８２）；Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１３：１００８−１０１７（１９９２）；およびＭａｓｋｏｓおよびＳｏｕｔｈｅｒｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２１：４６６３−４６６９（１９９３）。
【００３７】
好ましくは、本発明は、同じタグ配列の相補体で均一にコートされた微粒子またはビーズを用いて実行される。微粒子支持体、およびそれらの表面にオリゴヌクレオチドを共有結合または非共有結合する方法は、周知であり、以下の参考文献により例示される：ＢｅａｕｃａｇｅおよびＩｙｅｒ（上記に引用される）に引用される；Ｇａｉｔ（編）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８４版および１９９０版）；および上記に引用される参考文献。一般に、微粒子のサイズおよび形態は重要ではない；しかし、最小の試薬およびサンプルの用法でオリゴヌクレオチドタグの多くのレパートリーの構築および操作を容易にするので、直径数μｍ（例えば、１〜２μｍ）から数百μｍ（例えば、２００〜１０００μｍ）の範囲のサイズの微粒子が好ましい。
【００３８】
いくつかの好ましい適用では、市販の徐放性の多孔性ガラス（ＣＰＧ）またはポリスチレン支持体が、本発明における固相支持体として用いられる。このような支持体は、塩基不安定性のリンカーおよび結合した最初のヌクレオチド（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ））を用いて利用可能になる。好ましくは、５００オングストローム〜１０００オングストロームの間のポアサイズを有する微粒子が用いられる。
【００３９】
他の好ましい適用では、細孔のない微粒子が、その光学特性のために用いられ、この微粒子は、平面支持体（例えば、顕微鏡スライド）の上で多くの微粒子を探知する場合、有利に用いられ得る。特に、好ましい細孔のない微粒子は、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｒｍｅｌ．ＩＮ）から入手可能なグリシダルメタクリレート（ｇｌｙｃｉｄａｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）（ＧＭＡ）である。このような微粒子は、種々のサイズで有用であり、そしてタグまたはタグ相補体を合成するための種々の結合基で誘導体化される。好ましくは、タグ化された微粒子の多量（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ）の平行操作のために、約直径５μｍの直径を有するＧＭＡビーズが用いられる。
【００４０】
（Ｂ．タグ配列）
本発明のタグは、目的のサンプル種のための、および一つ以上の固体支持体に固定された対応するタグ相補体への特異的ハイブリダイゼーションのための、固有のタグ化配列を提供するように設計される。このタグ（およびタグ相補体）の配列は、以下の場合、使用者により選択される配列の任意の群であり得る：（１）それぞれ異なるタグおよびタグ相補体が、分類のための選択的ハイブリダイゼーション条件下で、レパートリー中の他のタグまたはタグ相補体と顕著に交差ハイブリダイズしない、（２）それぞれのタグおよびタグ相補体が、意図された相補的な配列との特異的ハイブリダイゼーションを防げる、第二の構造を形成しない、そして（３）それぞれのタグが、選択されたタグレパートリー中の全てのタグについて同一の条件下で、その対応するタグ相補体を特異的に認識しかつハイブリダイズし得る。一般的に、異なるタグの数は、並行して処理される異なるサンプル種の数に比例して増加する。タグ配列は、任意の適切な方法に従って設計され得、従って、所望の配列特異性および感度が達成される。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドタグ配列は、オリゴヌクレオチド配列の「最小に交差ハイブリダイズしているセット」から選択される。好ましくは、タグレパートリーの任意の二つのオリゴヌクレオチドタグの配列は、オリゴヌクレオチドが最大配列同一性を達成するように整列された場合、少なくとも二つのヌクレオチドが異なる。言い換えると、レパートリー中の任意のタグとレパートリー中の任意の他のタグ（またはそのタグ相補体）との間の二本鎖または三本鎖の形成は、少なくとも二つのミスマッチを生じる。より詳細な実施形態において、タグレパートリー中のタグ配列は、二本鎖および三本鎖が、少なくとも三つのミスマッチヌクレオチドを生成することなく、レパートリー中の他のタグまたはタグ相補体を用いて生成し得ないことなどを保証するように設計される。このような実施形態において、ミスマッチの最小数が増えるにつれて、より大きな特異性が達成されるが、タグのレパートリーの合計は小さくなる。従って、所定の長さのタグについて、所望の特異性とレパートリーの大きさとの間に二律背反がある。
【００４２】
最小に交差ハイブリダイズしているセット（レパートリー）のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、本明細書中で参考として援用されるＰＣＴ公開第ＷＯ９６／４１０１１号（特に図１、補遺ＩａおよびＩｂにおいて提供されるプログラム、および文章中の対応する考察を参照のこと）ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ９７／４６７０４号（補遺ＩおよびＩＩ）に記載される手順に従って、単純なコンピュータプログラムにより、好都合に列挙される。ＷＯ９６／４１０１１中の補遺Ｉａのプログラムｍｉｎｈｘは、三種のヌクレオチドで構成される４マーサブユニットを有する、全ての最小に交差ハイブリダイズしているセットを算定する。補遺ＩｂのプログラムｔａｇＮ（ＷＯ９６／４１０１１）は、最小に交差ハイブリダイズしているセットの長い方のオリゴヌクレオチドを列挙する。プログラム３ｔａｇＮ（ＷＯ９７／４６７０４、補遺ＩＩ）は、一本鎖タグ相補体を結合するための、二本鎖タグの最小に交差ハイブリダイズしているセットを生産するために使用され得る。同様のアルゴリズムおよびコンピュータプログラムが、本発明の任意の実施形態のための最小に交差ハイブリダイズしているセットの、オリゴヌクレオチドを列挙するために、容易に書かれる。以下の表Ｉは、ヌクレオチド差異の示される長さおよび数についての、最小に交差ハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドのセットの大きさに関する手引きを与える。ここで、示された数字を発生させるために、上述のコンピュータプログラムが使用された。
【００４３】
【表１】
タグの極端に大きなレパートリーが必要とされない、本発明のいくつかの実施形態のために、最小に交差ハイブリダイズしているセットのオリゴヌクレオチドタグが別々に合成され得る。数百から数千のオリゴヌクレオチドを含有するセット（または数万のオリゴヌクレオチドを含有するセットでさえ）は、様々な並行合成アプローチ（例えば、Ｆｒａｎｋら，米国特許第４，６８９，４０５号；Ｆｒａｎｋら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１：４３６５−４３７７（１９８３）；Ｍａｔｓｏｎら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２４：１１０−１１６（１９９５）；Ｆｏｄｏｒら，国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／０４１４５（ＷＯ９３／２２６８４）；Ｐｅａｓｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１：５０２２−５０２６（１９９４）；Ｓｏｕｔｈｅｒｎら，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３５：２１７−２２７（１９９４），Ｂｒｅｎｎａｎ，国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５８９６（ＷＯ９４／２７７１９）；Ｌａｓｈｋａｒｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９２：７９１２−７９１５（１９９５）；などに開示されるようなもの）によって直接合成され得る。
【００４４】
好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドタグは、３〜９の、好ましくは３〜６のヌクレオチド長さであり、そして同一の最小に交差ハイブリダイズしているセットから選択されるサブユニット（「ｗｏｒｄｓ」ともいわれる）からコンビナトリアル的に合成される。この範囲におけるオリゴヌクレオチドについて、このようなセットのメンバーは、ＷＯ９６／４１０１１からの図１のアルゴリズムに基づいたコンピュータ・プログラムにより列挙され得る。
【００４５】
好ましくは、最小に交差ハイブリダイズしているセットは、セットの全ての他のサブユニットのように二重鎖（または三重鎖）安定性にほぼ等しい寄与をするサブユニットを含有する。このように、全てのサブユニットとその相補体との間で完全にマッチした二重鎖の安定性はほぼ等しい。このようなセットを選択するためのガイダンスは、至適なＰＣＲプライマーの選択および二重鎖安定性の計算についての報告された技術により提供される（例えばＲｙｃｈｌｉｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：８５４３−８５５１（１９８９）および１８：６４０９−６４１２（１９９０）；Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８３：３７４６−３７５０（１９８６）：Ｗｅｔｍｕｒ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２６：２２７−２５９（１９９１）など）。より短いタグ（例えば、約３０ヌクレオチド以下）について、ＲｙｃｈｌｉｋおよびＷｅｔｍｕｒにより記載されたアルゴリズムが好ましく、より長いタグ（例えば、約３０〜３５ヌクレオチド以上）については、Ｓｕｇｇｓら、Ｂｒｏｗｎ編のＩＣＮ−ＵＣＬＡ Ｓｙｍｐ． Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．， 第２３巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８１）の６８３−６９３頁に開示されたアルゴリズムが便利に用いられ得る。明らかに、本発明の範囲内で最小に交差ハイブリダイズしているサブユニットのセットを設計するために当業者に利用可能な多くのアプローチがある。例えば、サブユニットを組み立てる場合、末端ヌクレオチドの異なる塩基の積み重ねエネルギーの影響を最小にするために、サブユニットは同じ末端ヌクレオチドを有するように提供され得る。このように、サブユニットを連結する場合、全ての隣接する末端ヌクレオチドの塩基の積み重ねエネルギーの総量は同じであり、これによりタグ融解温度の多様性が低減または除去される。
【００４６】
以下で下線を付したイタリック体で示される、末端ヌクレオチドの「ワード」もまた、タグの各末端に付加され得、その結果、その「ワード」と任意の他のタグ相補体にある類似の末端「ワード」との間で、完全なマッチが常に形成される。このような増強（ａｕｇｍｅｎｔｅｄ）タグは、以下の形態を有する：
【００４７】
【化１】
ここで、プライムされるＷ’は、相補体を示す。タグの末端は常に完全にマッチした二重鎖を形成するので、ミスマッチしたすべてのサブユニット（ワード）は、内部でのミスマッチを生じ、それによって、タグ相補体二重鎖（これは、さもなくば、それらの末端でミスマッチしたワードを有する）の安定性を減少させる。内部でのミスマッチを有する二重鎖が、同じミスマッチを末端で有する二重鎖よりも安定性が有意に低いことは、周知である。
【００４８】
最小に交差ハイブリダイズしているセットの好ましい実施形態は、ワードが、４つの天然のヌクレオチドのうちの３つから作製されるセットである。オリゴヌクレオチドタグにおける１つの型のヌクレオチドの欠損は、所望されるならば、タグの相補鎖を除去するために（ストリッピング反応）、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’ エキソヌクレアーゼ活性を使用して、タグが二本鎖から一本鎖の形態へと変換されることを可能にする。以下は、Ａ、Ｇ、およびＴからなる群から選択される４つのヌクレオチドを各々含む、例示的な最小に交差ハイブリダイズするワードのセットである：
【００４９】
【表２】
このセットにおいて、各メンバーは、すべての他のメンバーの相補体と、３つのミスマッチした塩基を有する二重鎖を形成する。
【００５０】
さらなる例示的な最小に交差ハイブリダイズしているセットを、以下の表ＩＩＩにおいて列挙する。明らかなことに、さらなるセットが、異なるヌクレオチドの群で置換することによって、または既知の最小に交差ハイブリダイズしているセットのサブセットを使用することによって、生成され得る。
【００５１】
【表３】
（Ｃ．タグ合成）
本発明における使用のためのオリゴヌクレオチドタグ相補体を、例えば、以下の参考文献において開示されるような、標準的ケミストリー（好ましくは、ホスホルアミダイトケミストリー）を使用して、自動化ＤＮＡ合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３９２または３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）または「ＧＥＮＥ ＡＳＳＥＭＢＬＥＲ ＰＬＵＳ」（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で、従来的に合成する：ＢｅａｕｃａｇｅおよびＩｙｅｒ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４８：２２２３−２３１１（１９９２）；Ｍｏｌｋｏら、米国特許第４，９８０，４６０号；Ｋｏｓｔｅｒら、米国特許第４，７２５，６７７号；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、米国特許第４，４１５，７３２号；同第４，４５８，０６６号；および同第４，９７３，６７９号；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（編）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９０）；など。
【００５２】
微粒子が支持体として用いられる場合、タグ相補体のレパートリーは、例えば、Ｓｈｏｒｔｌｅら、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３４１８（ＷＯ９３／２１２０３）またはＬｙｔｔｌｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９：２７４−２８０（１９９５）に開示されるような、「分割および混合（ｓｐｌｉｔ ａｎｄ ｍｉｘ）」技術を介するワード様式（ｗｏｒｄ−ｗｉｓｅ）合成によって生成され得る。簡単に述べると、合成の基本ユニットは、タグ配列のサブユニット（「ワード」）である。好ましくは、ホスホルアミダイトケミストリーを使用し、そして３’ホスホルアミダイトオリゴヌクレオチドが最小に交差ハイブリダイズしているセット（例えば、上記に最初に列挙したセットについては、８つの３’−ホスホルアミダイトテトラマーがある）における各ワードについて調製される。合成は、Ｓｈｏｒｔｌｅらにより開示されたように、またはヌクレオシドモノマーを用いる種々のオリゴヌクレオチドライブラリーを生じるために用いられる技術（例えば、Ｔｅｌｅｎｉｕｓら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１３：７１８−７２５（１９９２）；Ｗｅｌｓｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：５２７５−５２７９（１９９１）；Ｇｒｏｔｈｕｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２１：１３２１−１３２２（１９９３）；Ｈａｒｔｌｅｙ、欧州特許出願第９０３０４４９６．４号；Ｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ，３５４；８２−８４（１９９１）；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ４０：４９８−５０７（１９９２）；などに開示されたような）に直接的に類似して進行する。一般的に、これらの技術はカップリング工程の間、成長するオリゴヌクレオチドへの活性化されたモノマー（または、ポリマー性のワード）の混合物の適用を単に必要とする。
【００５３】
好ましくは、タグの相補体を、タグの構築において使用される異なる種類のワードの数より多いかまたはそれに等しい、多数の合成チャンバーを備えるＤＮＡ合成装置で合成する。すなわち、好ましくは、各タイプのワードに対応する合成チャンバーが存在する。この実施形態では、ワードをヌクレオチド毎に付加し、その結果、ワードが５個のヌクレオチドからなる場合には、各合成チャンバーにおいて５つのモノマーのカップリングが存在する。ワードを完全に合成した後、合成支持体をチャンバーから取り外し、混合し、そしてワード付加の次のサイクルのためのチャンバーに再分配し直す。この後者の実施形態は、例えば、ホスホルアミダイトケミストリーにおける、モノマー付加の高カップリング収率を利用している（例えば、実施例１を参照のこと）。
【００５４】
本発明のタグおよびタグ相補体の配列は、好ましくは、１２から６０までのヌクレオチドまたは塩基対の長さの範囲を有する。好ましくは、タグ配列は、１８から４０までのヌクレオチドまたは塩基対の長さの範囲である。より好ましくは、タグ配列は、２５から４０までのヌクレオチドまたは塩基対の長さを有する。ワードの好ましい数およびより好ましい数に関して、これらの範囲を、以下のように表し得る：
【００５５】
【表４】
最も好ましくは、オリゴヌクレオチドタグが一本鎖であり、そして特異的なハイブリダイゼーションが、タグ相補体とのワトソン−クリック対形成により生じる。
【００５６】
好ましくは、本発明のタグおよび／またはタグ相補体のレパートリーは、少なくとも１００のメンバー；より好ましくは、少なくとも１０００のメンバー；そして最も好ましくは、少なくとも１０，０００のメンバーを含む。
【００５７】
特異的なハイブリダイゼーションが三重鎖形成を介して生じる実施形態では、タグ配列のコード化は、二重鎖形成タグについてと同じ原理に従う；しかし、ワード配列の選択に対して、さらなる制約が存在する。一般に、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型の結合を介した第３鎖の会合は、二本鎖標的においてホモピリミジン−ホモプリントラックに沿って最も安定である。通常、塩基トリプレットは、Ｔ−Ａ*ＴまたはＣ−Ｇ*Ｃモチーフ（ここで、「−」はワトソン−クリック対形成を示し、そして「*」はＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型の結合を示す）に形成する；しかし、他のモチーフもまた可能である。例えば、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成は、鎖の状態および組成に依存して、第三鎖（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ鎖）とその第三鎖が結合する二重鎖のプリン−リッチ鎖との間で平行および逆平行の配向を可能にする。特定の実施形態で所望されるような三重鎖の安定性を、最大にするか、さもなくば調節するための、適切な配列、配向、条件、ヌクレオシド型（例えば、リボースヌクレオシドまたはデオキシリボースヌクレオシドのいずれが使用されるか）、塩基修飾（例えば、メチル化シトシン）などの選択について、広範囲にわたるガイダンスが参考文献中にある。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８８：９３９７−９４０１（１９９１）；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５８：１４６３−１４６６（１９９２）；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９３：４３２０−４３２５（１９９６）；Ｄｉｓｔｅｆａｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０：１１７９−１１８３（１９９３）；Ｍｅｒｇｎｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：９７９１−９７９８（１９９１）；Ｃｈｅｎｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１４：４４６５−４４７４（１９９２）；ＢｅａｌおよびＤｅｒｖａｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０：２７７３−２７７６（１９９２）；ＢｅａｌおよびＤｅｒｖａｎ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１４：４９７６−４９８２（１９９２）；Ｇｉｏｖａｎｎａｎｇｅｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８９：８６３１−８６３５（１９９２）；ＭｏｓｅｒおよびＤｅｒｖａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８：６４５−６５０（１９８７）；ＭｃＳｈａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：５７１２−５７２１（１９９２）；Ｙｏｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８９：３８４０−３８４４（１９９２）；Ｂｌｕｍｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０：１７７７−１７８４（１９９２）；ＴｈｕｏｎｇおよびＨｅｌｅｎｅ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３２：６６６−６９０（１９９３）；Ｅｓｃｕｄｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９３：４３６５−４３６９（１９９６）；など。
【００５８】
一本鎖タグまたは二重鎖タグをそれらの一本鎖相補体または二重鎖相補体にアニールするための条件は、周知である（例えば、Ｊｉら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６５：１３２３−１３２８（１９９３）；Ｃａｎｔｏｒら、米国特許第５，４８２，８３６号など）。三重鎖タグの使用は、タグが最初に二本鎖形態で調製される場合に、その相補体にアニーリングするためにタグを露出するために、ポリメラーゼでの「ストリッピング」反応を必要としないという利点を有する。
【００５９】
好ましくは、三重鎖ハイブリダイゼーションを使用する本発明のオリゴヌクレオチドタグは二本鎖ＤＮＡであり、そして対応するタグ相補体は、一本鎖である。より好ましくは、タグ相補体中のシトシンの代わりに、５−メチルシトシンを使用して、タグとその相補体との間で形成される三重鎖のｐＨ安定性の範囲を広げる。三重鎖を形成するために好ましい条件は、上記の参考文献において、完全に開示されている。手短には、ハイブリダイゼーションを、濃縮塩溶液（例えば、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１．０Ｍ酢酸カリウムなど）において、５．５（または、５−メチルシトシンが使用される場合には６．５）未満のｐＨで行う。ハイブリダイゼーションの温度は、タグの長さおよび組成に依存する；しかし、１８〜２０マーまたはそれより長いタグについては、室温でのハイブリダイゼーションが適切である。洗浄を、さほど濃縮されていない塩溶液（例えば、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2）、ｐＨ５．８、室温で実施し得る。タグを、類似の塩溶液（ｐＨ９．０）中でのインキュベーションによって、それらのタグ相補体から溶出し得る。
【００６０】
最小に交差ハイブリダイズする、三重鎖を形成するオリゴヌクレオチドタグのセットは、ＷＯ９７／４６７０４の付録ＩＩにおいてコンピュータープログラム３ｔａｇＮまたは類似のプログラムによって生成され得る。小文字の対応する相補体を有する、二本鎖８マーのワードの典型的なセットは、大文字の下に与えられる。各々のこのようなワードは、３塩基対によるセットにおける他の各ワードとは異なる。
【００６１】
【表５】
【００６２】
【表６】
好ましくは、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドのレパートリーは、少なくとも１０メンバーを含み；より好ましくは、このようなタグのレパートリーは少なくとも１００メンバーを含む。好ましくは、コンビナトリアル合成された二本鎖オリゴヌクレオチドタグについて、ワードは４と８との間の長さのヌクレオチドであり、そして三重鎖形成のためのタグ配列は、１２〜６０塩基対長である。より好ましくは、タグ配列は、１８〜４０塩基対長である。
【００６３】
（Ｄ．固相リンカー）
合成の間、本発明のタグ相補体は、第１および第２の型の連結部分によって１つ以上の固相支持体に結合され、その結果、（１）連結部分の両方の型がタグ相補体合成の間にインタクトな（切断されない）ままであり、そして（２）第２の連結部分が切断されない条件下で、連結部分の第１の型が切断されて、合成ヌクレオチドを放出し得る。好ましくは、この切断可能な連結は、化学的に切断可能な連結であり、すなわち、切断酵素を使用することなしで選択的な切断のために適切である。
【００６４】
多くの連結化学およびそれらの切断特性が公知である。典型的な切断可能な連結部分には、限定することを意図することなく、塩基不安定性部分、酸不安定性部分、光不安定性部分、還元可能部分、および酵素不安定性部分が含まれる。
【００６５】
塩基不安定性連結には、例えば、エステル（−Ｃ（Ｏ）Ｏ−）、チオエステル（−Ｃ（Ｏ）Ｓ−）、および２−オキシエチルスルホン（−ＯＣＨ2ＣＨ2−Ｓ（＝Ｏ）2Ｒ）が含まれる。このような連結は、塩基性条件下で、代表的には、ｐＨ≧８．０、好ましくはｐＨ≧９．０を用いて、適切な時間の間切断され得、そして必要に応じて、ｐＨを増加するため、および／または求核攻撃による切断を促進するために、適切な求核試薬（例えば、アンモニア）を含む。例えば、ジ（２−オキシエチル）スルホン連結部分は、アンモニア（水中２８〜３０％）を用いる反応によって、穏やかな条件下で（５５℃で１２〜１５時間）、オリゴヌクレオチドを有意に損なうことなく切断され得る（実施例１）。コハク酸エステル（切断可能）およびスクシンアミド（非切断性）連結部分の混合物を含む支持体の合成は、実施例３に記載される。
【００６６】
酸不安定性連結には、例えば、エステル（−Ｃ（Ｏ）Ｏ−）、チオエステル（−Ｃ（Ｏ）Ｓ−）、ケタール（Ｏ−Ｃ（Ｒ1Ｒ2）−Ｏ−）、ヘミケタール（Ｏ−ＣＨＲ−Ｏ−）、およびホスホルアミデート（−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ-）−Ｎ−）が挙げられる。例えば、ホスホルアミデート連結は、Ｈｉｒｓｃｈｂｅｉｎら（ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／１０４１８、公開番号９７／３１００９）またはＧｒｙａｚｎｏｖら（米国特許第５，５９９，９２２号）において記載される方法によって支持体に導入され得、そしてジクロロメタン中の０．８％トリフルオロ酢酸を用いて、室温で４０分間の処理によって切断され得る（Ｇｒｙａｚｎｏｖら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：３４０３−３４０９（１９９２）もまた参照のこと）。
【００６７】
典型的な光不安定性リンカーには、Ｄ．Ｊ．Ｙｏｏら、Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：３３５８−３３６４（１９９５）；Ｄ．Ｌ．ＭｃＭｉｎｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５２：３８２７−３８４０（１９９６）；およびＵｒｄｅａへの米国特許第５，４３０，１３６号によって記載されるような２−ニトロベンジルエステルが挙げられる。
【００６８】
還元可能リンカーは、例えば、２−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトールを用いて容易に還元されるジスルフィド連結基（Ｇｒｙａｚｎｏｖら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：１４０３−１４０８（１９９３）；Ｕｒｄｅａらへの米国特許第５，１１８，６０５号）によって例証される。
【００６９】
酵素不安定基には、酵素によって切断され得る任意の連結部分が挙げられる。典型的な連結部分には、エステル基（−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）、ペプチド基（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）、チオエステル（−Ｃ（Ｏ）−Ｓ）、およびエンドヌクレアーゼ制限部位を含むポリヌクレオチド配列（例えば、Ｕｒｄｅａへの米国特許第４，７７５，６１９号）が挙げられる。１つの好ましい実施形態において、連結部分は、特異的プロテアーゼによって認識されるアミノ酸残基（例えば、リジン−Ｘもしくはアルギニン−Ｘ（トリプシン）；アスパラギン酸−Ｘ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｖ８プロテアーゼ）；またはチロシン−Ｘ、トリプトファン−Ｘ、フェニルアラニン−Ｘ、ロイシン−Ｘ、もしくはメチオニン−Ｘ（α−キモトリプシン）；ここでＸは、ペプチドのＮ→Ｃ方向における次の残基を表す）を含むオリゴペプチドである。オリゴペプチド連結基の切断がオリゴヌクレオチド−ペプチド結合体を生じる場合、所望されるならば、プロナーゼまたは他の適切なプロテアーゼを使用して、そのペプチド部分は除去され得るか、またはそのオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドからのペプチド部分の選択的除去を可能にするように位置するエンドヌクレアーゼ制限部位を含み得る。
【００７０】
他の化学的連結（例えば、メチオニン含有オリゴペプチド、これは、酸性条件下で臭化シアンを用いて化学的に切断可能である）もまた意図される。切断可能な連結部分を記載するさらなる参考文献には、Ｍｏｎｆｅｒｔｅら、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０６１１６（ＷＯ９６／３７６３０）、Ｕｒｄｅａ（米国特許第５，３８０，８３３号）、Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ．，１９９１（特に６３−６７頁）、およびＡｌｌｅｎ，Ｇ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂ．Ｂ．Ｖ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８３（特に第３章）が挙げられ、これらは本明細書中に参考として援用される。
【００７１】
上記で言及した切断条件に一般的に耐性である多くの安定な連結部分もまた、公知である。典型的な、安定な「切断不能」部分には、エーテルおよびポリエーテル、ポリアミン、ホスホルアミダイト、ホスホルアミデートなどが挙げられる。これらの部分は、上述したいくつかの基と対照的に、大部分の酸性条件下および塩基性条件下で抵抗性であり、従って、特に、本発明で使用される切断不能な連結についての簡便な選択である。
【００７２】
微粒子表面上のタグを結合および／または合成するための典型的なリンカーは、Ｐｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：７６８−７７５（１９８８）；Ｗｅｂｂ、米国特許第４，６５９，７７４号；Ｂａｒａｎｙら、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０６１０３（ＷＯ９２／０４３８４）；Ｂｒｏｗｎら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８９：８９１−８９３；Ｄａｍｈａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８：３８１３−３８２１（１９９０）；Ｂｅａｔｔｉｅら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３９：７１９−７２２（１９９３）；ＭａｓｋｏｓおよびＳｏｕｔｈｅｒｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０：１６７９−１６８４（１９９２）などにおいて記載されている。
【００７３】
（ＩＩＩ．レパートリー合成法）
本発明は、オリゴヌクレオチドタグのレパートリーおよびタグ相補体の対応するレパートリーを合成する方法を提供し、その結果、タグおよびタグ相補体が別々に合成された以前の方法と比較して、所望のタグの合成の忠実度および収率が改善され、そして失敗の配列によって引き起こされる問題は減少する。
【００７４】
１つの実施形態において、この方法は（１）１つ以上の固相支持体に固定化された複数の異なる配列のオリゴヌクレオチド集団を合成する工程（ここで各集団は、複数の同じ配列のオリゴヌクレオチドを含み、そして各集団中のオリゴヌクレオチドは、他の集団中のタグ相補的配列と比較して異なるタグ相補的配列を含む）、（２）１つ以上の支持体からの各オリゴヌクレオチド集団の画分を切断する工程、および（３）切断されたオリゴヌクレオチドを複数のクローニングベクターに挿入して、タグベクターライブラリーを形成する工程を伴う。このようなプロセスを図２に図示する。ここで切断されたタグ相補的配列Ｔnを含むタグベクター構築物１は、タグベクターライブラリーのメンバーを例証する。
【００７５】
本発明における使用のための固相支持体は、上記の第ＩＩ節における記載に照らした任意の適切な方法によって調製され得る。上述のように、タグ相補体を支持体に連結する連結部分は、第１の切断可能連結部分および第２の非切断不能連結部分を含む、少なくとも２つの異なる連結部分の混合物を含む。切断可能連結部分および切断不能連結部分の両方は、支持体上にタグ相補的配列を作るために使用される、オリゴヌクレオチド合成プロトコルに耐えるために選択される。切断不能連結部分はまた、タグ化された分子を支持体に結合したタグ相補体にハイブリダイズさせるために後で使用される条件に耐えることが可能でなければならない。
【００７６】
支持体上の切断可能連結部分：切断不能連結部分の比は、以下を確実にするために選択される：（１）支持体上で合成されたタグ相補的レパートリーの十分な量が、相補的タグレパートリーを調製するために支持体から切断され得ること、（２）切断されたオリゴヌクレオチドは、クローン化可能であるか、または容易にクローン化され得ること、および（３）支持体がソーティングのために使用される場合、タグ相補体の十分な量がタグ化された分子を捕捉するために支持体上に残存すること。好ましくは、切断可能な連結部分は、全結合タグ相補体の５０％未満、およびより好ましくは、約１０％〜約３０％を構成する。合成されたオリゴヌクレオチドの各集団の選択された画分が、塩基切断可能な連結を介して支持体（単数または複数）に結合されることもまた好ましい。
【００７７】
上記で議論したように、所望される連結部分を結合するための多数の適切に反応性の支持体が既知である。例えば、ヒドロキシル誘導体化支持体またはアミノ誘導体化支持体が市販されているか、または上記で議論したように、選択されたリンカー基を結合するために適切な、容易に利用可能な材料から調製され得る。
【００７８】
切断可能連結基および切断不能連結基を、支持体に連続的にまたは同時に結合させ得る。好ましくは、この連結部分は、切断可能リンカーおよび切断不能リンカーの混合物と、支持体上の相補的反応基とを同時に反応させることにより固相支持体に導入され得る。従って、支持体上の切断可能部分および切断不能部分の相対的割合は、固体支持体上の相補的反応基に関するリンカーの相対的反応性を考慮すると、誘導体化反応のためのリンカーの比を適切に選択することにより制御され得る。例えば、切断可能リンカーおよび切断不能リンカーが支持体に対して等しく反応性である場合、１０：９０という切断可能リンカー：切断不能リンカー比を用いて、誘導体化支持体を生成し、ここで、１０％の結合したタグ相補体は支持体から切断可能である。同様に、３０：７０という比を用いて、誘導体化支持体を生成し得る。ここで、タグ相補体の３０％が切断可能である。必要であれば、あまり反応性でないリンカーの相対的割合を増加させて、より高い反応性の他のリンカー型をオフセットし得る。
【００７９】
例えば、実施例１に記載のプロトコルにおいて、エチレンジアミンで誘導体化したグリシダル（ｇｌｙｃｉｄａｌ）メタクリレート／エチレンジメタククリレート（９５／５）架橋ビーズを、標準的なホスホルアミダイト反応化学により、１０：９０のモル比の切断可能リンカー：切断不能リンカーと同時に反応させた。この反応によって、両リンカーが固体支持体上のアミノ基に結合して、ホスホルアミダイト連結を形成させ得、これは、後に酸化させて安定なホスホルアミダイト基を形成し得る（図１）。切断可能リンカー（これは、２−［２−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）−エチルスルホニル］エチル−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイトとして支持体上に導入され得る）は、酸性条件および酸化的条件に安定なジ（２−オキシエチル）スルホン部分を含み、そしてオリゴヌクレオチド合成の間にインタクトなままであるが、図１に示されるように、塩基触媒による切断を受けやすい。図１の切断不能リンカー（これは、９−Ｏ−ジメトキシトリチル−トリエチレングリコール，１−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイトとして支持体に付加され得る）は、オリゴヌクレオチド合成条件および切断可能リンカー部分を切断するために用いられ得る塩基性条件に安定なポリエチレンオキシドリンカーを含む。
【００８０】
タグ相補体を含むオリゴヌクレオチドを、適切な反応条件を用いてリンカー誘導体化支持体に付加する。広範に種々の合成ストラテジーが当該分野で開発され、そして記載される（例えば、Ｇａｉｔ，１９９０（前出）および上記で引用された他の合成の参考文献）。現在では、固相ホスホルアミダイト法が好ましい。なぜなら、これは、約９９％以上のカップリング収率をもたらすからである。好ましくは、合成は、効率的な合成をもたらす任意の種々の市販の機器および試薬を用いて自動化される。
【００８１】
タグ相補体に相補的なタグレパートリーの調製を容易にするために、固定化されたタグ相補体オリゴヌクレオチドは、好ましくは、各オリゴヌクレオチドにおけるタグ相補体配列に隣接する第１のプライマーセグメントおよび第２のプライマーセグメントを含む。従って、支持体へのリンカーの結合の後に、第１のプライマー配列は、好ましくは、代表的には、このリンカーに対する適切なモノマーの連続的付加により、リンカーに付加される。実施例１に記載されるプロトコルにおいて、配列５’−ＴＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴＧＧＴＣＴＣＡＣＴＧＴＣＧＣＡ−３’（配列番号１）を有するプライマーセグメントを、３’から５’方向で、ホスホルアミダイト−ホスホトリエステル化学を用いて、連続的モノマー付加により付加される。あるいは、プライマーセグメントは、別々に合成され得、そして１回のカップリング反応においてこのリンカーに結合され得る。好ましくは、このリンカーおよび任意の結合したプライマー配列は、共に、少なくとも１０鎖原子のストレッチを含むスペーサー部分を提供して、支持体の表面からの、および支持体上の他のタグ相補体からのタグ相補体セグメント（すぐ下で議論される）の分離を補助する。好ましくは、スペーサー（必要に応じたプライマー結合配列を含む）は、１０〜３０ヌクレオチドの長さを有する。スペーサー部分の存在は、タグ相補体が、選別するためにタグ相補体配列とのハイブリダイゼーションに容易に利用しやすいことを確実にするために特に有用である。
【００８２】
各オリゴヌクレオチドのタグ相補体配列は、モノマーもしくはモノマーのブロックの連続的付加により、またはタグ相補体の別々に合成されたレパートリーの同時結合により付加され得るが、モノマーの連続的な付加が好ましい。レパートリーは、当該分野で公知の写真平版法またはロボット利用分配（ｒｏｂｏｔｉｃ ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ）方法（前出）により、平面アレイ上に形成され得る。ビーズまたは粒子上に形成されるレパートリーについては、タグ相補体配列は、好ましくは、ＢｒｅｎｎｅｒによりＰＣＴ公開ＷＯ９６／４１０１１に記載されるように、分割および混合（ｓｐｌｉｔ ａｎｄ ｍｉｘ）アプローチを用いてコンビナトリアルに形成される。簡潔には、複数の異なる、最小限に交差ハイブリダイズする（ｃｒｏｓｓ−ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）オリゴヌクレオチドの「ワード（ｗｏｒｄ）」配列は選択され、これは、合成されたタグ相補体だけが選択されたハイブリダイゼーション条件下でそれらの対応する相補体タグに確実にハイブリダイズし得るように（すなわち、任意の不正確にハイブリダイズしたタグおよびタグ相補体のレベルがほんのわずかであるように）設計される。
【００８３】
実施例１に記載のプロトコルにおいて、各タグ相補体配列は、８「ワード」の直鎖状ストリングからなり、各々、８つのテトラマーワードの同じセットから選択される。プライマー誘導体化ビーズは８つのアリコートに分けられ、これは、自動化合成機の８つの別個の合成カラムにロードされる。各カラムにおいて、この８つの可能なワードから選択された異なるワードは、適切なモノマーの連続的付加によりビーズに付加される。各カラムにおける第１のワードの合成が完了した後、８つのカラムからのビーズが合わされ、均一になるまで穏やかに混合される。混合後、このビーズ混合物は、再び等しいアリコートに分けられ、これは、別のサイクルのワード付加のために８つのカラムにロードされる。ワード付加の計８サイクルを行って、計８8（ほぼ１．７×１０7）の異なる可能なタグ相補体配列を有するビーズを生成する。分割および混合プロトコルは、確実に各ビーズが実質的に均一な、同じ配列のオリゴヌクレオチドの集団を含むようにする（すなわち、特定のビーズ上のオリゴヌクレオチドが実質的に同じ配列を有する）。
【００８４】
必要であれば、固定化タグ相補体の配列は、任意の公知の配列決定法により固相支持体上で直接決定され得る。好ましくは、タグ相補体は、タグ相補体配列の３’側にユニバーサルプライマー結合配列を含み、そのために、このタグ相補体は、相補体配列決定プライマーをアニーリングおよび伸長することによって、Ｓａｎｇｅｒのジデオキシ配列決定法により配列決定され得る。しかし、通常は、この方法は、固定化タグ相補体の配列が公知である場合は必要ではない。
【００８５】
タグ相補体配列の付加後、さらなるヌクレオチド残基が、第２のプライマー配列、１つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位および／または他の所望の特徴を取り込むために追加される。例えば、実施例１に記載のプロトコルにおいて、ヘキサマーブロックのＧＧＧＣＣＣがタグ相補体に追加されて、（１）タグ相補体セグメントがハイブリダイゼーションの間にその対応する相補的タグに結合することを補助する、（２）タグ相補体セグメントの末端を規定する、および（３）ベクターへのその後の連結のためにＢｓｐ１２０Ｉ制限部位を導入する。以下でさらに議論されるように、必要に応じた増幅のために第２のプライマー配列（プライマー２）の付加が後に続く。
【００８６】
従って、好適な実施形態において、タグ相補体配列を含む固定化されたオリゴヌクレオチドは、以下の特徴を含む：
［支持体］−［連結部分］−［スペーサー］−［タグ相補体］−［末端セグメント］
ここで、この連結部分は、上記で議論されたように、切断可能または切断不能のいずれかであり、スペーサーセグメント（好ましくは、１０〜３０ヌクレオチドの長さを有する）は、必要に応じて、（１）エンドヌクレアーゼ制限部位、および／または（２）ユニバーサルプライマー結合配列を含み、タグ相補体セグメント（好ましくは、１２〜６０、１８〜４０、または２５〜４０ヌクレオチドの長さを有する）は、上記で議論された特徴を有し、そして末端セグメント（好ましくは、０〜４０ヌクレオチド、または１０〜３０ヌクレオチドの長さを有する）は、必要に応じて、（１）第１の制限部位と同じか、またはそれと異なり得るエンドヌクレアーゼ制限部位、および（２）スペーサーにおける任意のプライマー結合配列の相補体と同じか、またはそれと異なり得るユニバーサルプライマー配列を含む。１つの好適な実施形態において、各オリゴヌクレオチドにおけるタグ相補体配列は、同じか、または異なり得る第１および第２のエンドヌクレアーゼ制限部位に隣接して、選択されるベクターへのその後の連結を容易にする。
【００８７】
オリゴヌクレオチド合成が完了した後、このオリゴヌクレオチドは、必要であれば脱保護され、そしてタグ相補体レパートリーの一部は、切断可能連結部分のみを選択的に切断する一方で、切断不能連結部分はインタクトなままであるように、適切な反応条件を用いて支持体から切断される。
【００８８】
簡便に、切断工程および任意の脱保護工程は、１つの試薬で同時に行われる。例えば、切断可能連結部分および１つ以上の保護基が塩基に不安定である場合、次いで支持体を塩基で処理して保護基を除去し、そして支持体から切断可能オリゴヌクレオチドを切断する。もちろん、脱保護および切断工程はまた、別々に行われ得る。
【００８９】
切断されたオリゴヌクレオチド混合物は、以下でさらに議論されるように、選択されたクローニングベクターに直接挿入され得る。しかし、この混合物は、好ましくは精製されて、任意の従来法を用いて失敗した配列および他の外来物質が除去される。例えば、この混合物は、公知の方法により、イオン交換クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーを用いたＨＰＬＣによって迅速かつ簡便に精製され得る。電気泳動的分離もまた使用され得る。逆相クロマトグラフィーについては、合成されたオリゴヌクレオチドは、好ましくは、吸着剤に対するトリチル化オリゴヌクレオチドの優先的な吸着を容易にするように、疎水性基（例えば、トリチルまたはジメトキシトリチル（ＤＭＴ））を含む。その一方で、非トリチル化配列（失敗したカップリング工程から生じる）は、カラムにより実質的に保持されない。代表的には、所望のオリゴヌクレオチド混合物は、幅広いピークとして溶出（または移動）する。なぜなら、異なるＧ／Ｃ含量および分布を有する非常に幅広いスペクトルの配列が存在するからである。この混合物は、エタノール溶出などによりさらに精製され得、そして得られる混合物は、好ましくは、０℃未満で、乾燥状態または安定な貯蔵媒体中で保存され得る。オリゴヌクレオチド配列の完全性は、混合物の個々のメンバーをランダムに配列決定することにより評価され得る（通常は、この混合物がクローニングベクターに挿入された後）。
【００９０】
目的のサンプルオリゴヌクレオチドへのその後の結合については、切断されたオリゴヌクレオチドは、好ましくは、１つ以上のクローニングベクターに挿入されて、タグベクターライブラリーが形成される。任意の型の複製可能ベクター（例えば、プラスミド、ファージミド、コスミドなど）が用いられ得、これは、適切な宿主中で増殖され得る。このベクターは、一本鎖または二本鎖であり得る。種々の適切なベクターは、商業的供給元から入手可能である（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＧｉｂｃｏＢＲＬなど）か、または文献中に記載されている。このベクターは、一般的に、外来ＤＮＡを挿入するための１つ以上の制限部位、１つ以上の選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性）、必要に応じて、挿入部位の上流にユニバーサルプライマー配列（インサートを配列決定するため）、および適切な宿主中でベクターを増殖するための任意の必要な成分を含む。好ましくは、このベクターは、オリゴヌクレオチドタグを挿入するための第１の制限部位、およびタグに対して近位にサンプルフラグメントを挿入するための、第１の部位に直ぐ隣接する第２の制限部位を含む。あるいは、サンプルフラグメントを挿入するための制限部位は、タグセグメントに直ぐ隣接するエンドヌクレアーゼ部位を含むタグオリゴヌクレオチドを介してベクターに導入され得る。
【００９１】
二本鎖ベクター中への挿入のために、この切断されたオリゴヌクレオチドは、好ましくは、任意の適切な手段によって、このオリゴヌクレオチドにおける汎用３’−プライマーセグメントに相補的なプライマーをアニーリングさせ、そしてこのプライマーを伸長することによって、二本鎖形態に変換される。この二本鎖産物は、対応するタグ相補配列と完全に塩基対合するタグ配列を含む。代表的には、このアニーリングしたプライマーは、ｄＮＴＰの混合物の存在下で、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、３’方向に伸長される。ベクター中への挿入についての二本鎖オリゴヌクレオチドの量を増加させるために、このオリゴヌクレオチド混合物は、所望の量の二本鎖産物が得られるまで、タグ相補配列に隣接するプライマー結合配列にアニーリングする、一対のプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅され得る。
【００９２】
二本鎖タグオリゴヌクレオチド混合物は、標準的な連結技術によって（例えば、平滑末端または粘着末端の連結によって）ベクター中に挿入され得る。代表的には、ベクターおよびオリゴヌクレオチドの混合物は、付着末端を有する産物を生成するために、各々、１以上の制限酵素と別々に処理される。好ましくは、ベクターおよびオリゴの混合物は、インサートの取り込みなしにベクターの再連結を低減することを補助するために、２つの異なる粘着末端を有する産物を生成する２つの異なる制限酵素で、各々、別々に処理される。切断されたベクターはまた、インサートを含まないベクターの自己連結（ｓｅｌｆ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）を阻害する仔ウシ腸アルカリホスファターゼで、処理され得る。例えば、実施例２Ｄにおいて、オリゴヌクレオチド混合物およびベクターは、ＰａｃＩおよびＢｓｐ１２０Ｉで、各々、処理される。切断されたベクター由来のより大きなフラグメントは、仔ウシ腸ホスファターゼで処理され、次いで、リガーゼの存在下で制限されたオリゴヌクレオチド混合物と反応され、タグベクターの混合物を形成する。
【００９３】
次いで、連結産物は、タグベクターライブラリーを作製するために、適切な宿主を形質転換するために使用され得る。形質転換体は、所望の数の形質転換体が収集されるまで培養される。一般には、形質転換体の数は、タグレパートリーの高い割合のメンバーのサンプリングを保障するために、このレパートリーの複雑性を超えるべきである。好ましくは、形質転換体の量は、タグベクターライブラリーにおける少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、およびより好ましくは９９％のレパートリーよりも多くの存在を保障するに十分である。
【００９４】
本発明のタグベクターライブラリーは、多数のサンプルオリゴヌクレオチドフラグメントを同時かつ独特にタグ化するために有用であり、その結果、タグ化されたオリゴヌクレオチドは、さらなるプロセシングまたは分析のために、タグ相補体のアレイ上に選別され得る。従って、タグベクターは、各ベクターにおけるタグ配列に隣接する部位にて、異なるフラグメントを挿入するに効果的な連結条件下で、タグベクターライブラリーと異なるポリヌクレオチドフラグメントの混合物とを組み合わせることによって、タグ化されたポリヌクレオチドフラグメントのライブラリーを形成するために使用され得、その結果、各サンプルフラグメント（図２におけるＳn）は、異なるタグ（Ｔn）と会合する。このようなタグベクターライブラリーの１つのメンバーは、図２における構築物２によって表される。好ましくは、タグベクターライブラリーの複雑性は、２以上の異なるサンプルフラグメントと会合した同じタグの可能性を低減することを補助するように、サンプルの複雑性を超える。
【００９５】
例えば、実施例２Ｄにおいて、タグベクターライブラリーｐＢＰ９をＢｂｓＩおよびＢａｍＨＩで消化して、ＢｂｓＩ部位に隣接するタグ配列（２０ヌクレオチド以内）を有する、大きなベクターフラグメントを作製した。このベクターフラグメントをホスファターゼで処理して、５’−リン酸基を除去し、そしてＢｂｓＩ／ＢａｍＨＩ粘着末端を有するオリゴヌクレオチドサンプルの混合物（ｃＤＮＡ）を、連結によって、ベクター中に挿入した。この連結混合物を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を形質転換し、そしておよそ１．６×１０5のクローンを含むアリコートを使用して、このライブラリーを拡大するために液体培養物を接種した。プラスミドＤＮＡを、これらの培養物から抽出し、そして貯蔵した。
【００９６】
ライブラリー中のタグ化サンプルオリゴヌクレオチドからのタグ化ポリヌクレオチドは、任意の所望の方法によって処理または分析され得る。検出を容易にするために、タグ化ポリヌクレオチドは、同時増幅のために汎用プライマー対を使用するＰＣＲによって増幅され、続いてテンプレートおよび増幅試薬から、所望の産物を、必要に応じて精製し得る（実施例２Ｅ）。タグが、一本鎖または二本鎖のタグ相補体を結合するために、一本鎖形態で使用されるべきである場合、このタグ鎖は、所望のタグ鎖の変性および収集によって、例えば、ストレプトアビジン支持体上のビオチン化タグ鎖の固相での捕捉によって、それらの相補鎖から分離され得る。あるいは、相補鎖を、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性または３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼを使用して、タグ相補領域中に含まれない選択されたｄＮＴＰの存在下で、除去し得、その結果、このエキソヌクレアーゼは、このタグ相補体の末端で効果的に停止する。例えば、タグ配列がＡ塩基、Ｃ塩基、およびＴ塩基を含むが、Ｇを含まない場合、この相補配列は、Ｔ、ＧおよびＡを含むが、Ｃを含まない。ＣＴＰの存在下でのエキソヌクレアーゼの使用は、第１のＣが相補配列に達するまでに、この相補配列から除去するために効果的である。
【００９７】
タグ化されたオリゴヌクレオチド（タグ化されたオリゴヌクレオチドフラグメントとしても既知）は、上記で議論されるような、または実施例２Ｅにおいて例示されるような、適切なハイブリダイゼーション条件下で、固定されたタグ相補レパートリーにハイブリダイズされる。固体支持体が粒子またはビーズを含む場合、この粒子またはビーズは、ハイブリダイゼーション、続いて洗浄工程を容易にする一定の攪拌で、タグ化されたオリゴヌクレオチドの存在下でインキュベートされ得る。低い割合のビーズのみが相補性タグとハイブリダイズされる場合、ハイブリダイズされたビーズは、任意の適切な方法によって（例えば、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）によって）ハイブリダイズしていないビーズから分離され得る。この目的のために、タグ化されたポリヌクレオチドは、好ましくは、ハイブリダイズされたタグ化ポリヌクレオチドの検出を容易にするために、蛍光標識（例えば、ＰＣＲプライマーを介して）のような、検出可能な標識を含む。
【００９８】
固定化されたタグ相補体レパートリーへのハイブリダイゼーションの後に、タグ化されたポリヌクレオチドは、任意の適切な方法に従って分析され得る。例えば、固定化されたタグ化ポリヌクレオチドは、例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／１２６７８（ＷＯ９６／１２０３９）および国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３６７８（ＷＯ９５／２７０８０）により教示されるように、サイクル配列決定による標識伸長生成物を作製するために、例えば、テンプレートとして固定化されたポリヌクレオチドを使用して、配列決定され得る。あるいは、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドは、既知の溶液相方法に従って、支持体から変性され、そして配列決定され得る。
【００９９】
本発明はまた、配列の分析または定量のために、固体支持体上に異なるｃＤＮＡを選別するために有用である。例えば、タグは、異なるサンプルに由来する転写物レベルにおける変化を特徴づけするために、ディファレンシャルディスプレイ実験を行うために使用され得る（例えば、異なる細胞および組織型、疾患状態などの特徴づけのため）。本発明はまた、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／１６３４２（ＷＯ９７／１３８７７）に開示されるような種々の化合物の毒性を決定するために使用され得る。
【０１００】
タグ化分子がポリペプチドである場合、固定化されたポリペプチドは、例えば、特定のポリペプチド種を同定する標的特異的抗体での処置によって、さらに特徴づけられ得る。タグ−ペプチド結合体の合成は、例えば、ＷＯ９６／１２０１４ １４頁に記載される。
【０１０１】
本発明のタグおよびタグ相補体レパートリーについてのさらなる使用は、例えば、ＷＯ ９５／２７０８０；ＷＯ ９６／１２０１４；ＷＯ９６／１２０３９；ＷＯ ９６／１３８７７；ＷＯ ９６／４１０１１；およびＷＯ ９７／４６７０４（これらは、本明細書中に参考として援用される）に開示され、これらには、分子、ＤＮＡ配列決定、ｍＲＮＡフィンガープリントなどのクラスまたは亜集団を、トラッキング（ｔｒａｃｋｉｎｇ）、同定、または選別することが挙げられる。
【０１０２】
本発明は、以下の実施例を鑑みてさらに理解され得る。これらの実施例は、本発明の範囲を制限するようにいかなる様式においても意図されない。
【０１０３】
（実施例１）
（タグ相補体の合成）
全ての市販の化学物質は、合成品質であり、そしてさらなる精製なしに使用した。オリゴヌクレオチド合成を、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｆｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｄｉａｎａからの、５．６μｍアミノ誘導化ポリマービーズ（エチレンジアミンで誘導体化された９５％グリシダルメタクリレート（ｇｌｙｃｉｄａｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）／５％エチレンジメタクリレート））を使用するＧＥＮＥ ＡＳＳＥＢＬＥＲ ＰＬＵＳ−ＳＰＥＣＩＡＬ／４ ＰＲＩＭＥＲＳ合成機（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して行った。これらのビーズは、１ビーズあたり約１０7アミノ基のアミノ基密度を有すると推定された。Ｐｈａｒｍａｃｉａからの合成カラムに供給された２５μｍポリプロピレンフィルターに加えて、ＧＦＡガラスフィルターマット（Ｗｈａｔｍａｎ）を、各々の合成カラムの端に加えて、これらのビーズの保持を改善した。あるいは、合成カラムを、これらのビーズを保持するために、各々の端にて２μｍ孔サイズＰＥＥＫフィルターを保有するネジキャップ端を有するステンレス鋼チューブ（１〜５ｍｍの長さ×０．７５インチの直径）から構築した（５ｍｍの長さを有するカラムは、約６００ｍｇのビーズの容量を有する）。
【０１０４】
４．８ｍｇのアミノ誘導体化ビーズを、８つの合成カラムの各々に充填した（各々が、６００ｍｇのビーズを含む）。切断リンカー部分を形成するために、２５０ｍｇの５’−ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ−ＯＮ試薬（２−［２−４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）−エチルスルホニル］エチル−（２−シアノ−エチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイト（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号５２１０−２から）を、３．８ｍＬの無水アセトニトリル中に溶解し、０．１Ｍの濃度を得た。非切断リンカー部分を形成するために、２５０ｍｇのＳＰＡＣＥＲ ＰＨＯＳＰＨＯＲＡＭＩＤＩＴＥ（９−Ｏ−ジメトキシトリチルートリエチレングリコール、１−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイト、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから、カタログ番号５２６０−３）を、別々に、３．８ｍＬの無水アセトニトリル中に溶解し、０．１Ｍの最終濃度を得た。これらの２つの溶液を、１つの比率にて合わせて、任意の所望される％切断性を提供した。例えば、１０％の切断性を達成するために、１部のＰＨＯＳＰＨＡＴＥ−ＯＮ溶液（例えば、２００μＬ）を、乾燥ビンにおいて、９部のＳＰＡＣＥＲ ＰＨＯＳＰＨＯＲＡＭＩＤＩＴＥ（例えば、１８００μＬ）と合わせ、次いで、ＧＥＮＥ ＡＳＳＥＭＢＬＥＲ ＳＰＥＣＩＡＬ ＰＲＩＭＥＲＳ ４装置上の延長（ｅｘｔｒａ）ホスホルアミダイトポートに取り付けた。全ての移動を、シリンジを用いて行い、そしてこのボトルに、空気中の水蒸気への曝露を最小化するため、アルゴンを適用（ｂｌａｎｋｅｔ）した
ビーズへのリンカー（切断可能および非切断可能）の付加の後、以下のＤＮＡ配列（プライマー１、配列番号１）を、ホスファイトトリエステル（ホスホルアミダイト）法（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ、１９９０、特に第３章）を使用して、以下の保護モノマー：Ｔ（非保護）、ＡおよびＣ（ベンゾイル）、およびＧ（イソブチリル）：
【０１０５】
【化２】
（プライマー１、配列番号１）を使用して、３’から５’への方向に、ビーズ上で合成した。
【０１０６】
次に、異なる「ワード」配列を、ホスホルアミダイト合成によって、適切なモノマーの連続付加により、各カラムにおいてプライマーテンプレート配列に付加した。その８つのワードの配列は、以下であった：
１）５’−ＣＴＴＴ （配列番号２０）
２）５’−ＴＡＣＴ （配列番号２１）
３）５’−ＡＣＡＴ （配列番号２２）
４）５’−ＡＡＴＣ （配列番号２３）
５）５’−ＴＴＡＣ （配列番号２４）
６）５’−ＴＣＴＡ （配列番号２５）
７）５’−ＡＴＣＡ （配列番号２６）
８）５’−ＣＡＡＡ （配列番号２７）。
【０１０７】
第１のワード付加工程の完了後、ビーズをカラムから収集し、ともに混合し、そしてカラムに再びロードし、その後、異なる「ワード」配列各々を、上記のようなホスホルアミダイト合成により８つのカラムに別々に再び付加し、続いてビーズを収集し、再混合し、そしてカラムに再ロードした。ワードの付加およびビーズの混合／分割というこのサイクルを、合計８回実施して、約１．７×１０7（＝８8）個の異なるオリゴヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチドライブラリーを作製した。このコンビナトリアル合成が完了した後、配列５’−ＣＣＣ−３’（トリチルオン（ｔｒｉｔｙｌ−ｏｎ））をビーズに付加して、以下の一般式（配列番号２）を有する固定されたオリゴヌクレオチドの混合物を生じた。：
【０１０８】
【化３】
ＣＣＣセグメントの付加後、ビーズの一部（４．３ｇ＝９０％）を、５５℃にて１２時間飽和アンモニア水（２ｍＬ、水中２８〜３０％）を用いて脱保護した。次いで、この脱保護したビーズを、酢酸を用いて１５分間処理して、末端の５’トリチル基を除去した。この酸を除去した後、このビーズを、メタノールを用いて洗浄し、そして真空にて濃縮した。次いで、このビーズを、ハイブリダイゼーション用に準備した。
【０１０９】
このビーズの残りの部分（０．５ｇ＝１０％）を適切なホスホルアミダイトモノマーと反応させて、配列５’−ＣＣＴＴＡＧＧＧ−３’（プライマー２、トリチルオン、配列番号３）を付加し、続いてアンモニア（２ｍＬ）を５５℃にて１２時間用いて脱保護した。このアンモニア処理もまた、切断可能なリンカーを切断してこのビーズからオリゴヌクレオチドのうちの１０％を解離させるのに有効であった。ビーズを遠心分離により除去し、そして残存するアンモニア溶液を、もとの容量の半分にまで真空により濃縮した。この混合物中の切断されたオリゴヌクレオチドは、以下の一般式（配列番号４）を有した。：
【０１１０】
【化４】
このオリゴヌクレオチド混合物を、Ｇｉｌｓｏｎ ＨＰＬＣ装置上にある、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（１００オングストローム孔径、８μｍ粒子）からの１５０ｍｍ×４．６ｍｍ ＰＬＲＰ−Ｓカラムを使用して、ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより精製した。２段階溶媒勾配を使用した：緩衝液Ａ：水中の０．２Ｍ酢酸トリエチルアンモニウムおよび２％アセトニトリル；緩衝液Ｂ：１００％アセトニトリル：流速＝室温にて１ｍＬ／分；勾配プログラム：９５％Ａ、１分間；５分間かけて８０％Ａに減少、そして５分間５０％Ａにて保持；５分間かけて９５％Ａに戻し、そして９５％Ａにて１０分間維持して、カラムを再平衡化する。広いトリチルオンピーク全体を、１８分と２０分との間で収集した。この収集した画分を真空にて濃縮し、氷酢酸を用いて１５分間処理して、５’−トリチル基を除去し、そして真空にて濃縮して乾燥させた。残渣を３００μＬの水に溶解し、そして１．５ｍＬ微小遠心チューブに移した。これに１００μＬの４Ｍ ＮａＣｌを添加し、そして混合物をボルテックスした。１ｍＬのエタノールを添加後、サンプルをボルテックスし、次いで−２０℃で２０分間冷却した。沈殿したＤＮＡを遠心分離し、そして上清を除去した。この沈殿手順を２回以上反復した。最終精製混合物を、ＢＰ９と名付けた。
【０１１１】
（実施例２）
（タグのクローニングおよび調製）
（Ａ．プラスミドクローニングベクター）プラスミドクローニングベクターｐＬＣＶ２を、以下のオリゴヌクレオチドを使用して、以下のようにしてプラスミドベクターｐＢＣ．ＳＫ-（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から作製した。：
【０１１２】
【化５】
オリゴＳ−７２３およびＳ−７２４をキナーゼ処理し、ともにアニールさせ、そしてＫｐｒＩおよびＸｂａＩを用いて消化しかつ仔ウシ腸アルカリホスファターゼを用いて処理したｐＢＣ．ＳＫ-に連結して、プラスミドｐＳＷ１４３．１を作製した。
【０１１３】
オリゴＳ−７８５およびＳ−７８６をキナーゼ処理し、ともにアニールさせ、そしてＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化しかつ仔ウシ腸アルカリホスファターゼを用いて処理したプラスミドｐＳＷ１４３．１に連結して、プラスミドｐＳＷ１６４．０２を作製した。
【０１１４】
オリゴヌクレオチドＳ−９６０、Ｓ−９６１、Ｓ−９６２およびＳ−９６３をキナーゼ処理し、ともにアニールさせて、４つのオリゴヌクレオチドからなる二重鎖を形成させた。プラスミドｐＳＷ１６４．０２をＸｈｏＩおよびＳａｐＩを用いて消化した。この消化したＤＮＡを、アガロースゲル上で電気泳動し、そして約３０４５ｂｐの産物を、適切なゲルの切片から精製した。プラスミドｐＵＣ４Ｋ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから）をＰｓｔＩを用いて消化し、そしてアガロースゲルにて電気泳動した。約１２４０ｂｐの産物を、適切なゲルの切片から精製した。この２つのプラスミド産物（ｐＳＷ１６４．０２およびｐＵＣ４Ｋ由来）を、Ｓ−９６０／９６１／９６２／９６３二重鎖とともに連結して、プラスミドｐＬＣＶ１を作製した。
【０１１５】
アデノウイルス５（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）由来のＤＮＡを、ＰａｃＩおよびＢｓｐ１２０Ｉを用いて消化し、仔ウシ腸アルカリホスファターゼを用いて処理し、そしてアガロースゲルにて電気泳動した。約２８５３ｂｐの産物を、適切なゲルの切片から精製した。このフラグメントを、ＰａｃＩおよびＢｓｐ１２０Ｉを用いて消化したプラスミドｐＬＣＶ１に連結して、プラスミドｐＳＷ２０８．１４を作製した。
【０１１６】
プラスミドｐＳＷ２０８．１４を、ＸｈｏＩを用いて消化し、仔ウシ腸アルカリホスファターゼを用いて処理し、そしてアガロースゲルにて電気泳動した。約５３７４ｂｐの産物を、適切な切片から精製した。このフラグメントを、（キナーゼ処理しそしてともにアニールさせた）オリゴヌクレオチドＳ−１１０５およびＳ−１１０６に連結して、プラスミドｐＬＣＶ２を作製した。このプラスミドは、以下のエレメント（配列番号１５）を含んだ。：
【０１１７】
【化６】
（Ｂ．タグプラスミドライブラリーの構築）ｐＢＰ９と称するタグプラスミドライブラリーを、以下のように作製した。以下の配列を有する、ＰＥＰ−１と称するプライマーを合成した：
【０１１８】
【化７】
（ＰＥＰ−１、配列番号１６）（Ｆａｍ−ＴＴＰ結合体は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎから得た）。このＰＥＰ−１プライマーを、実施例１からのコンビナトリアルタグ混合物（ＢＰ９と称する）にアニールさせ、そしてこのプライマーを、４つの標準ｄＮＴＰの存在下でＳｅｑｕｅｎａｓｅ ＤＮＡポリメラーゼを用いての処理によって伸長させた。二本鎖産物を精製し、ＰａｃＩおよびＢｓｐ１２０Ｉを用いて消化した。そしてこれを、ＰａｃＩおよびＢｓｐ１２０Ｉを用いての消化および仔ウシ腸アルカリホスファターゼを用いての５’リン酸基の除去によってｐＬＣＶ２から作製した大きい方のフラグメントに連結した。この連結産物を、アガロースゲルにて電気泳動し、そしてＱＩＡＥＸ ＩＩキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、このゲル切片から精製した。この連結材料を使用して、エレクトロコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０Ｆ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＸＬＩＢｌｕｅＭＲＦ’（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換した。連結条件および形質転換条件を、１μＬのベクターフラグメント（約１０μｇ）と、インサートなし、１μＬの１：１０希釈インサート、または１μＬの非希釈インサート（約１ｐｍｏｌ）のいずれかを使用して、ＲＡＰＩＤ ＬＩＧＡＴＩＯＮ ＫＩＴ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して予備連結反応を実行することによって、最適化した。連結後、この連結混合物を使用して、エレクトロコンピテント細胞を形質転換し、そして形質転換体（そのまま １００μＬ、１：１０希釈 １００μＬ、および１：１００希釈 １００μＬ）をプレートした。このアプローチを使用して、最良のベクター／インサート比を、非常に低いバックグラウンドを維持しつつ最初のＤＮＡあたり最高数のコロニーを生成する比として決定した。ライブラリー合成のために、必要な場合は、この連結条件をスケールアップした。例示的条件は、以下の通りである：
２００μＬ ベクター（２０μｇプラスミドから開始して得られる合計）
ＸμＬ インサート（ＰａｃＩ／Ｂｓｐ１２０Ｉ消化物）
５０μＬ １０×連結緩衝液
５０μＬ １０ｍＭ ＡＴＰ
ＹμＬ 水
１０μＬ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（２，０００，０００ Ｕ／ｍＬ）
→最終容量＝５００μＬ。
【０１１９】
この連結混合物を、１６℃で一晩インキュベートし、続いて、１容量（５００μｌ）のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）で２回、クロロホルムで１回抽出し、続いてエタノール沈殿した。遠心分離、洗浄、そして乾燥後、このペレットを、５０μＬ水に再懸濁した。エレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞（８０〜１００μＬの細胞）の数個のバイアルの各々の中に、１〜２μＬの連結産物を添加した。以下の条件を、エレクトロポレーションのために使用した：冷却した０．１ｃｍエレクトロポレーションキュベット中で、２００ｏｈｍ、２５μＦ、１８００Ｖ。エレクトロポレーションの直後、１ｍＬのＳＯＣブロス（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、ＳＯＣ培地の補遺Ａ．２において）を添加し（室温）、そしてこの混合物を、１５ｍＬ Ｆａｌｃｏｎチューブに移し、そして２２０ｒｐｍ、３７℃で１時間振盪した。次いで、各形質転換混合物を、振盪フラスコ中で５０ｍＬの予熱したブロス（ＴＢまたはＬＢ＋クロラムフェニコール）に添加した。力価を決定するために、各形質転換体の少量のアリコート（５μＬのニートまたは希釈した）を、３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天プレート上にプレートして力価を決定した。一方残りを、液体培養物へ接種し、そしてインキュベーターで一晩浸透した。形質転換を、独立した形質転換体（クローン）の総数が、希釈分析に基づいて約１．７×１０8であると推定されるまで反復した。形質転換体のこの量は、８ワードの全体長さ（８8＝１．７×１０7）を有するタグ配列を生成するために８つの異なる力価「ワード」配列のランダムな組合せ結合によって生成される、可能なタグ改変体の１０倍量に等しい。プラスミドＤＮＡ（ｐＢＰ９）を、この培養物から抽出し、そしてプールした。この培養物は、類似の力価を有する場合にのみプラスミド単離の前に組み合わせられ得ることに留意すること。そうでなければ、プラスミドを、別々に単離し、次いで、これらの力価に比例して一緒に混合した。約１．５ｍｇのｐＢＰ９を得た。
【０１２０】
（Ｃ．ポリ（Ａ）+ＲＮＡ単離）
ポリ（Ａ）+ＲＮＡ（５×１０7細部から約３０μｇ）を、供給業者によって推奨されるように、ＦａｓｔＴｒａｃｋキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＴＨＰ細胞から抽出した。ポリ（Ａ）+ＲＮＡ（５×１０7細胞から約１５μｇ）を、ＮｏｖａｇｅｎからのＳＴＲＡＩＧＨＴ Ａ’ｓ ｍＲＮＡ単離システムを使用して酵母細胞から抽出した。ｃＤＮＡ合成のために、ポリＡ ＲＮＡのエタノール懸濁物を、冷脚微小遠心において、最高速度で３０分間遠心分離した。この上清を取り除き、そして破棄し、その後このペレットを短時間再遠心分離し、そしてこの上清を、ピペットによって注意深く取り除いた。このチューブの側面を、０．７５ｍＬの７０％エタノールで注意深く洗浄し、続いて２０分間遠心分離した。この上清を、先の通りに取り除き、すべての液体が取り除かれたことを確認した。ＲＮＡペレットを、ＤＥＰＣ処理水中に再懸濁した（３２ｍＬを、５×１０7の哺乳動物細胞由来のｍＲＮＡのために使用し；さもなければ、この容量を調節した）。得られた溶液を、チューブの底にスピンさせ、そして氷上に置いた。ＲＮＡ濃度を、２６０ｎｍでの１．０吸光度単位（Ａ２６０）＝４０μｇ／ｍＬ ＲＮＡと仮定して、水での希釈によって評価した（Ａ２６０／Ａ２８０比は、２．０であるはずである）。すべての時間でグローブを着用して、ヌクレアーゼ夾雑を回避した。
【０１２１】
（Ｄ．ｃＤＮＡライブラリー構築）
第１鎖ｃＤＮＡおよび第２鎖ｃＤＮＡを、以下の特注プライマーを第１鎖合成のために使用することを除いては、ＲＮＡｓｅを含まないチューブを使用し、供給業者によって推奨されるようにｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して合成した（ＲＴプライマー、配列番号１７）：
【０１２２】
【化８】
ここで、「Ｖ」は、Ａ、ＣおよびＧの混合物を示す。簡潔には、以下の溶液を、滅菌０．５ｍＬチューブに添加した：
２．２５μＬ １０×第１鎖緩衝液
１．３５μＬ 第１鎖メチルヌクレオチド混合物
１．０μＬ ＲＴプライマー（５０ｐｍｏｌ／μＬ）
ｎμＬ ＤＥＰＣ処理水（ｎは、以下のように算出した）
０．４５μＬ ＲＮａｓｅブロックリボヌクレアーゼインヒビター（４０Ｕ／μＬ）。
【０１２３】
得られた混合物をすばやく動かし（ｆｌｉｃｋ）て成分を混合し、次いで、チューブの底にスピンさせた。この混合物に、上記（ｍμＬ）から２．５μｇのポリ（Ａ）+ＲＮＡを添加した。ここで、ｍは、２．５μｇのＲＮＡを含む容量であり、そしてｎ（ＤＥＰＣ処理水の容量）を生じるように算出して、最終容量２１．８μＬを生成した（ｎ＋ｍ＝１６．８μＬ）。この混合物に、０．７μＬ ＭＭＬＶ逆転写酵素（５０Ｕ／μＬ）を添加した。この混合物を穏やかにボルテックスまたはすばやく動かし、次いで、チューブの底にスピンさせた。この混合物を、ヒートブロックまたはＰＣＲ機械中で３７℃で６０分間インキュベートし、次いで、氷上に置いた。
【０１２４】
第２鎖ｃＤＮＡ合成のために、第１鎖ｃＤＮＡ産物（２２．５μＬ）を氷上に置き、そして以下の成分を、順番に添加した：
１００μＬ １０×第２鎖緩衝液
３μＬ 第２鎖ヌクレオチド混合物
５７．０μＬ 滅菌水（非ＤＥＰＣ処理）
１．０μＬ α−32Ｐ−ｄＡＴＰ（１０μＣｉ／μＬ、２週間よりも古くない）。
この混合物をすばやく動かしてこの溶液を混合し、次いで、短時間スピンダウンさせ、続いて氷上で５分間平衡化させてヘアピン構造の数を減少させた。次に、以下の酵素を添加した：
１．０μＬ ＲＮＡｓｅ Ｈ（１．５Ｕ／μＬ）
５．５μＬ ＤＮＡポリメラーゼＩ（９．０Ｕ／μＬ）。
得られた溶液を短時間混合し、そして１６℃を超える温度にせずに、短時間回転させた。この混合物を、１６℃で１５０分間インキュベートし（それより長い時間ではない）、その後、この混合物を氷上に置いた。
【０１２５】
この反応チューブに、１００μＬ ＴＥ飽和フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を添加し、そしてこの混合物を、徹底的にボルテックスした。この混合物を、５分間遠心分離した。水（上）層を、注意深く取り出し、そしていかなる界面も回収することなく、新たなチューブに移した。１００μＬのクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を添加し、そしてこの混合物を、徹底的にボルテックスした。この混合物を、５分間遠心分離した。水層を回収し、そして先のように新たなチューブへ移し、そして１μＬの５Ｍ ＮａＣｌを添加し、そしてボルテックスした。
【０１２６】
得られた二本鎖ヘミメチル化ｃＤＮＡを、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＳＩＺＥＳＥＰ ４００カラム（カタログ番号２７−５１０５）上でサイズ分画した。このカラムを、スピンカラム中にＳＩＺＥＳＥＰゲルを置くことによって、ＳＴＥ緩衝液（１×ＳＴＥ＝１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）中で平衡化させ、そしてこのゲルベッドの上部に達するまで緩衝液を排出させ、続いて２ｍＬ ＴＢＥ中にゲルベッドを懸濁し、そしてこのゲルベッドの上部まで緩衝液を排出させ、そしてＴＢＥ懸濁工程および排出工程を２回以上繰り返した。このカラムを、乾燥を避けるために使用まで両端でキャップした。使用の直前、このキャップを取り除き、そしてこのカラムを約４００×ｇで２分間、短時間回転させて、このゲルを密にし（ｃｏｍｐａｃｔ）、そして過剰の緩衝液を除去した。次に、ｃＤＮＡサンプルを、ゲルベッドの上部で平滑な表面の中央に、注意深くかつゆっくりアプライし、その結果、このサンプルは、このゲルの側面を通過して、または亀裂を通じては流れなかった。このカラムを、Ｆａｌｃｏｎ ２０５９チューブへ置き、その結果、このカラムの下部の先端を、キャップのない１．５ｍＬ遠心分離チューブのチップ上に置いて、カラム溶出物を回収した。このカラムを、Ｆａｌｃｏｎチューブ中で約４００×ｇで２分間回転させ、その結果、合成プライマーおよび低分子ｃＤＮＡを、このカラム中に保持し、一方所望の長さのｃＤＮＡを、遠心チューブ中に収集した。収集したｃＤＮＡ混合物を、新たなキャップ付チューブに移した。収集したｃＤＮＡに、１μＬ ＰＥＬＬＥＴ ＰＡＩＮＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、０．１容量の３Ｍ ＮａＯＡｃ、および２．５容量のＥｔＯＨを（必要に応じて）添加した。得られた溶液を、−７０℃で少なくとも３０分間、または−２０℃で一晩保存した。二本鎖ｃＤＮＡ産物は、以下の式（配列番号１８）を有した：
【０１２７】
【化９】
ここで、Ｘ’は、ｃＤＮＡ中のヌクレオチドを示し、Ｖは、Ａ、ＣまたはＧを示し、そしてＢは、Ｃ、ＧまたはＴを示す。ＲＴプライマー配列を、ｃＤＮＡ中にＢｓｍＢＩ部位（これは、ＢｓｍＢＩを用いる消化の際に５’−ＧＣＡＴオーバーハングを生じる）を与えるように選択したことに留意すること。
【０１２８】
先のように、エタノール／ＮａＯＡｃ／ｃＤＮＡ溶液を冷却遠心分離において３０分間回転させ、そして７０％エタノールで洗浄した後、サイズ分画したｃＤＮＡを、１７０μＬ水、２０μＬ １０×ＤｐｎＩＩ緩衝液、および１０μＬ ＤｐｎＩＩ（１０Ｕ／μＬ）の溶液中にｃＤＮＡペレットを再懸濁することによりＤｐｎＩＩによって完全に消化し、続いて３７℃で２時間インキュベートした。
【０１２９】
ビオチン化フラグメントを、Ｄｙｎａｌ Ｍ−２８０ストレプトアビジンビーズを使用して精製した。ビオチン捕捉のための調製において、磁気ストレプトアビジンビーズを、ボルテックスすることによって再懸濁し、そして１００μＬビーズ（１ｍｇ）を新鮮な１．５ｍＬ遠心チューブに移した。このチューブを、磁気粒子濃縮機（ＭＰＣ）中に少なくとも６０秒間置いて、このビーズを磁石に近いペレットにした。このチューブがＭＰＣにあったまま、この上清を取り除き、そして破棄した。このチューブに１００μＬの１×Ｂ＆Ｗ緩衝液（２×Ｂ＆Ｗ緩衝液＝２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および２Ｍ ＮａＣｌ）を添加し、そしてこの懸濁物をボルテックスして、ＭＰＣに置いて磁気ビーズを濃縮し、そしてこの上清を、先のように除去した。この洗浄手順を、２回以上繰り返した。上記の手順の間にビーズを乾燥させる時間はなかった。
【０１３０】
上記からのＤｐｎＩＩ消化物（２００μＬ）に、２００μＬの２×Ｂ＆Ｗ緩衝液を添加した。この混合物を、調製された磁気ストレプトアビジンビーズを含むチューブに移し、そしてこのビーズを、このビーズをすばやく動かすことによって再懸濁した。このチューブを、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ中、２５℃で３０分間インキュベートし、その結果、このビーズを、ビオチン捕捉を確実にさせるためにすべての時間で十分に懸濁した。次に、このチューブを、ＭＰＣ中に置き、そしてこの上清を回収し、そして−２０℃で保存した。このビーズを、４００μＬ×Ｂ＆Ｗ緩衝液で５回洗浄し、そしてこの上清を分析して、放射性数（ｃｏｕｎｔ）が、３回目または４回目の洗浄後に、ほとんどないかまたはまったく存在しないことを確認した。
【０１３１】
タグ化ｃＤＮＡフラグメントを除くために、以下の手段が実施された：
１．２０μＬの１０×ＮＥＢ３ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）および１６８μＬの水の混合物中にビーズを再懸濁する。
【０１３２】
２．２μＬのウシ血清アルブミン １００×ストック（１０ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加する。
【０１３３】
３．１０μＬのＢｓｍＢＩ（４Ｕ／μＬ）を添加する。
【０１３４】
４．５５℃で２時間、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ中でチューブを振盪する。従って、ビーズは、十分懸濁されたままである。
【０１３５】
５．７μＬのＢｓｍＢＩ １０×ストック溶液を添加し、そして５５℃でさらに１−２時間、チューブを振盪する。
【０１３６】
６．チューブをＭＰＣ中に６０秒間静置する。放出されたタグ配列を含む上清を回収する。
【０１３７】
７．２μＬのＰＥＬＬＥＴ ＰＡＩＮＴを添加する。２００μＬのフェノール／クロロホルムで一度、そして２００μＬのクロロホルムで一度抽出する。
【０１３８】
得られた水層に、２０μＬの３Ｍ ＮａＯＡｃおよび５００μＬのＥｔＯＨを加える。この混合物を、−２０℃で一昼夜または−７０℃で３０分保存する。次いでこの溶液を、少なくとも３０秒間微量遠心器にスピンした。この上清を除きかつ廃棄し、そして沈渣を、０．５ｍＬの７０％ＥｔＯＨで洗浄し、そして０．５ｍＬの７０％ＥｔＯＨ中で再遠心分離した。放出されたｃＤＮＡフラグメント混合物は、以下の定式を有する（配列番号１９）：
【０１３９】
【化１０】
上のｐＢＰ９タグ化ベクターを、ＢｂｓＩおよびＢａｎＨＩで切断し、仔ウシ腸管アルカリホスファターゼで処理し、そしてアガロースゲル中で電気泳動によって精製した。大きいフラグメント（およそ３．１５ｋｂ）を、ゲルから精製し、そして連結のためのｃＤＮＡフラグメント混合物と結合した。このベクターは、ＢｂｓＩ切断によってｃＤＮＡのＢｓｍＢＩ切断端と互換性の端を産生するように操作されたことに注意のこと。精製されたベクターフラグメントを、上記のように調製したｃＤＮＡ混合物に連結した。
【０１４０】
タグ化ｃＤＮＡ挿入物のベクターライブラリーを産生するために、連結されたベクター−挿入物混合物を、電気的形質転換受容性（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換するのに用いた。この形質転換の少量を、力価を決定するために３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢアガープレート上にプレートした。ライブラリーを広げるために、およそ１．６×１０5のクローンを含むアリコートを、液体培地を播種するのに用いた。プラスミドＤＮＡを、これらの培養物より抽出し、そして保存した。
【０１４１】
（Ｅ．タグ相補体を固定化するためのタグ化フラグメントのハイブリダイゼーション）
タグ化ＤＮＡ挿入物を、ハイブリダイゼーションによって取りこみ得るか、または上述のような固定化（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）タグ相補体の配列に分別し得た。
【０１４２】
好ましくは、このタグ化ｃＤＮＡ接合体を、以下のような従来のプロトコールを用いて、ベクターからＰＣＲによって増幅する。８つのＰＣＲ複製物の各々に関して、以下の反応成分を結合する：１μＬのベクターＤＮＡ（ライブラリーに１２５ｎｇ／μＬ、単一コロニーに１０9コピー）；１０μＬの１０×ＫＬＥＮＴＡＱ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）；０．２５μＬのビオチン化２０マー「前向き」ＰＣＲプライマー（１ｎｍｏｌ／μＬ）；０．２５μＬのＦＡＭ標識化２０マー「逆向き」ＰＣＲプライマー（１ｎｍｏｌ／μＬ）；１μＬの２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、および５−メチル−ｄＣＴＰ（総ｄＮＴＰ濃度 １００ｍＭ）；５μＬ ＤＭＳＯ；２μＬ ５０×ＫＬＥＮＴＡＱ酵素；および８０．５μＬの水（１００μＬの総容量に）。ＰＣＲ反応は、以下のプロトコールを用いて、ＭＪＲ ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、または同様のサーモサイクラーにおいて行われる：（１）９４℃で４分間；（２）９４℃で３０秒間；（３）６７℃で３分間；（４）８サイクルの工程２および３；（５）９４℃で３０秒間；（６）６４℃で３分間；（７）２２サイクルの工程５および６；（８）６７℃で３分間；ならびに（９）４℃で静置。
【０１４３】
８つのＰＣＲ混合物を、プールし、そして７００μＬのフェノールを室温で加える。結合混合物を、２０−３０秒間ボルテックスし、次いで３分間高速で遠心する（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ卓上遠心機、または同様の装置で１４，０００ｒｐｍ）。上清を、除去し、そして新しいチューブ内で７００μＬのクロロホルム（クロロホルム：イソアミルアルコールの２４：１混合物）と結合し、２０〜３０秒間ボルテックスし、そして１分間遠心分離し、その後上清を新しいチューブに移し、そして８０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウムおよび５８０μＬのイソプロパノールと結合する。２０分間の遠心後、上清を除き、そして１ｍＬの７０％エタノールを加える。エタノールを除いた後、混合物を５−１０分間遠心し、そして沈殿したＤＮＡを微量遠心機内で乾燥する。
【０１４４】
再撹拌後、ｃＤＮＡを、アビジン化磁石ビーズ（Ｄｙｎａｌ）上で、製造業者の推奨するプロトコールを用いて精製する。次いでｃＤＮＡは、製造業者の推奨するプロトコール（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）をまた用いて、ＰａｃＩ（１ユニットの酵素／μｇＤＮＡ）で切断する。切断したＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、その後エタノール沈殿を行う。タグ化ｃＤＮＡ接合物のタグを、ストレプトアビジン精製ＤＮＡの１μｇあたり２ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の添加により一本鎖にする。１５０μｇのストレプトアビジン精製ＤＮＡを、２００μＬの水に再懸濁し、以下の反応成分と結合する：３０μＬの１０×ＮＥＢ Ｂｕｆｆｅｒ Ｎｏ．２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；９μＬの１００ｍＭ ｄＧＴＰ；３０μＬのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（１０Ｕ／μＬ）；および３１μＬの水；３００μＬの最終反応用量を得る。３７℃で１時間のインキュベート後、反応を２０μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡの添加によって停止し、そしてＴ４ＤＮＡポリメラーゼを７５℃で２０分間反応混合物をインキュベートすることによって不活化する。タグｃＤＮＡ接合物を、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって精製する。
【０１４５】
タグｃＤＮＡ接合物の固定化タグ相補体へのハイブリダイゼーションに関して、上記のように調製したタグｃＤＮＡ接合物を、５０μＬの水中に撹拌し、生じる混合物を、４０μＬの２．５×ハイブリダイゼーション緩衝液と結合する。組み合わせた混合物を、従来のプロトコールを用いて、ＳＰＩＮ−Ｘカラム（０．２２μｍ）を通して濾過し、タグｃＤＮＡ接合物を含む濾液を得る（１．２５ｍＬの０．１Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１．２５ｍＬの５Ｍ ＮａＣｌ、０．２５ｍＬ、０．５％ ＴＷＥＥＮ ２０、１．５ｍＬの２５％硫酸デキストラン、および０．７５ｍＬの水からなる５ｍＬの２．５×ハイブリダイゼーション緩衝液）。所定の容量の多くのビーズを、ヘモサイトメーター（ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて容易に除去する。上記のようにタグ相補体で誘導体化された約１．８×１０7のビーズを、１０μＬのＴＥ／ＴＷＥＥＮ緩衝液（０．１％のＴＷＥＥＮ ２０を伴うＴＥ）中で溶解し、そしてＴＥ／ＴＷＥＥＮを除いたものからビーズが沈渣を生じるように遠心する。ビーズに２５μＬの１×ハイブリダイゼーション緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ ＴＷＥＥＮ ２０、および３％硫酸デキストラン）を加え、そして混合物を、ビーズが完全に再懸濁するようにボルテックスする。混合物を、ビーズが沈渣を形成するように遠心した後、上清を除く。
【０１４６】
上記の濾液由来のタグＤＮＡ接合物を、７５℃で３分間インキュベートし、次いでビーズと結合する。混合物を、ボルテックスし、完全にビーズを再懸濁する。生じる混合物をさらに、７５℃でボルテックスしながら約３日間（６０時間）インキュベートする。ハイブリダイゼーション後、混合物を２分間遠心し、そして上清を除く。ビーズを５００μＬのＴＥ／ＴＷＥＥＮ ２０で２回洗浄し、０．１％ ＴＷＥＥＮ ２０を伴う５００μＬの１×ＮＥＢ緩衝液Ｎｏ．２中に再撹拌する。ビーズを、この溶液中で６４℃で３０分間インキュベートし、その後ビーズが沈渣を生じるように混合物を遠心分離する。上清を除き、そしてビーズを５００μＬのＴＥ／ＴＷＥＥＮ中に再懸濁する。次いで、ハイブリダイズした接合物を、当該分野において公知のまたは本明細書中に記載された任意の方法によって分析し得る。
【０１４７】
（実施例３）
（コハク酸に基づく連結特性）
以下の手順は、切断可能なコハク酸エステル連結特性（１０％）および切断不可能なコハク酸エステル連結特性（９０％）を用いて誘導体化されたＧＭＡビーズを作製するのに用い得る。
【０１４８】
（コハク酸エステル）
無水コハク酸（２４０ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）を一部、４−ジメチルアミノピリジン（１８０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を含む無水ピリジン（６ｍＬ）中の５’−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン（３ｍｏｌ）撹拌溶液に３０分間以上加えた。反応物を、一晩撹拌し、クロロホルム：メタノールが９：１（ｖ：ｖ）を用いる薄層クロマトグラフィーによってモニターした。混合物を、減圧下でガムにまで乾燥した。残渣のピリジンを、乾燥トルエン（３×２０ｍＬ）を用いる同時蒸着（ｃｏ−ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）によって除いた。産物を、ジクロロメタン（２０ｍＬ）中に溶解し、そして氷冷１０％硫酸ナトリウム水溶液（２×１５ｍＬ）、次に水（２×１５ｍＬ）で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥減圧下でエバポレートした。生じた泡を、ジクロロメタン（１０ｍＬ）中に溶解し、室温で迅速に撹拌するヘキサン（２５０ｍＬ）中で沈殿した。混合物の遠心分離後、上清を除いた。沈渣を減圧下で乾燥し、７５−８０％の収量（エステル産物）を得た。
【０１４９】
（スクシニミド）
上記のコハク酸化の手順を、５’−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジンの代わりに、当量の５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−デオキシ−３’−アミノチミジンを用いて繰り返し、対応するコハク酸アミド産物（アミド産物）を形成した。
【０１５０】
（支持体への接着）
０．８２１ｇ（１．１ｍｍｏｌ）のエステル産物またはアミド産物を、溶解しそして５ｍＬの０．２Ｍ ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾル水和物、４．７ｍＬ ＤＭＳＯ（ジメチルスルホオキシド）および４．７ｍＬ ＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）の混合物中に０．２７ｇ）、ならびに５ｍＬの０．２Ｍ ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾル−１−リル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリン酸、１．４ｍＬ Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、９．３ｍＬ ＤＭＳＯおよび９．３ｍＬ ＮＭＰの混合物中に１．０３ｇ）の混合物中で２分間撹拌した。アミノ誘導体化ＧＭＡビーズ（５．５ｇ、直径５．６μｍ）を１０ｍＬ ＤＮＡちゅうで撹拌した。このスラリーに、上記のアミド産物全ておよびアミド産物の１／９（９：１モル比）に等しい量のエステル産物を加えた。このスラリーを、スクリューキャップのファルコンチューブに移し、そして２時間穏やかに振盪した。次いで混合物を、濾過し、各々２０ｍＬのＤＭＦ、アセトニトリル、メタノール、およびエーテルで、首尾よく洗浄した。次いで乾燥したビーズを、タグ相補体の合成に準備した。
【０１５１】
本発明は特定の実施形態に関して記載されているにもかかわらず、種々の改変が、本発明の精神から逸脱することなくなされ得ることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、固相ビーズに結合するオリゴヌクレオチド連結構造の代表的な対、および他のリンカーはインタクトなままで、タグ相補体（ＴＣ１）を含有する付着したオリゴヌクレオチドを放出するためにリンカーの１つを切断する機構を示す。
【図２】 図２は、本発明の１つの実施形態を実行するための一般的スキームを示す。ここで異なる配列タグ相補体を含有する固定化オリゴヌクレオチドのレパートリーの部分は、固相支持体から切断され、二本鎖形態に転換され、そしてクローニングベクターに挿入される。タグベクター（１）ライブラリーは、各ベクターにおけるタグ配列に隣接する部位で異なるフラグメントを挿入するために有効な連結条件下で異なるポリヌクレオチドフラグメントの混合物と組み合わされ、これにより、各サンプルフラグメント（Ｓn）は、異なるタグ（Ｔn）と結合される。次いで、このタグ−サンプルフラグメントは、切り出され、および／または増幅され得、そしてタグ化フラグメントは、固定された対応するタグ相補体へのハイブリダイゼーションによりソートされ得る。
（発明の分野）
本発明は、一般には分子（特にポリヌクレオチド）を同定、選別、および／または探知するために使用され得るオリゴヌクレオチドタグのコレクションを合成するための方法に関する。特定の局面においては、本発明は、タグ化された実体をタグ成分のアドレス可能なアレイ上に固定化するに特に有用である、オリゴヌクレオチドタグおよびタグ成分の相補的なセットを形成するための方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
オリゴヌクレオチドおよびそのアナログの特異的ハイブリダイゼーションは、広く多様な研究的適用、医学的適用および産業的適用で用いられている基礎的なプロセス（診断アッセイにおける疾患関連のポリヌクレオチドの同定、新規の標的ポリヌクレオチドのクローンのスクリーニング、ポリヌクレオチド混合物のブロットにおける特異的ポリヌクレオチドの同定、特異的な標的ポリヌクレオチドの増幅、不適切に発現された遺伝子の治療的ブロッキング、ＤＮＡ配列決定などを含む）である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）；ＫｅｌｌｅｒおよびＭａｎａｋ、ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅｓ、第２版（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３）；Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３６：１９２３−１９３７（１９９３）；Ｄｒｍａｎａｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：１６４９−１６５２（１９９３）；Ｂａｉｎｓ、Ｊ．、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｐｐｉｎｇ，４：１４３−１５０（１９９３））。
【０００３】
特異的ハイブリダイゼーションはまた、オリゴヌクレオチドタグで標識された化合物を探知、回収、および同定する方法として提案されている（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ、国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９５／１２７９１号（公開番号第ＷＯ９６／１２０１４号）；Ｃｈｕｒｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１８５−１８８（１９８８）；ＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８９：５３８１−５３８３（１９９２）：Ａｌｐｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６４：１３９９−１４０１（１９９４）：およびＮｅｅｄｅｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０：１０７００−１０７０４（１９９３））。このようなタグ化スキームをうまく実施することは、タグとその相補的プローブとの間での特異的なハイブリダイゼーションの達成における成功に大部分依存している。すなわち、オリゴヌクレオチドタグが物質をうまく同定するためには、擬陽性および擬陰性のシグナルの数を最小限にしなければならない。不幸にも、このような偽のシグナルは稀ではない。なぜなら塩基対合成および塩基スタッキング（ｂａｓｅ ｓｔａｃｋｉｎｇ）の自由エネルギーは二重鎖構造または三重鎖構造におけるヌクレオチドのあいだで広く変化するからである。例えば、その相補体に結合したデオキシアデノシン（Ａ）およびチミジン（Ｔ）の繰り返し配列からなる二重鎖は、ミスマッチを含む部分的に相補的な標的に結合したデオキシグアノシン（Ｇ）およびデオキシシチジン（Ｃ）の繰り返し配列からなる同じ長さの二重鎖より安定性が低い可能性がある。従って、大きなコンビナトリアルケミカルライブラリー由来の所望の化合物が前者のオリゴヌクレオチドでタグ化された場合、完全にマッチしたＡＴに富む二重鎖を検出するように設計されたハイブリダイゼーション条件下では、ＧＣに富むオリゴヌクレオチドで標識された所望されない化合物（ミスマッチした二重鎖においてさえ）が、ＡＴに富むタグからなる完全にマッチした二重鎖とともに検出されるという重大な可能性が存在する。たとえ塩化テトラメチルアンモニウムのような試薬がオリゴヌクレオチド二重鎖の塩基特異的安定性の相違を無効にするために利用可能であるとしても、このような試薬の効果はしばしば限定され、そしてその存在は選択された化合物のさらなる操作（例えば、ポリメーラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅など）と非適合性であり得るか、またはこのような操作をより困難にし得る。このような問題は、ミスマッチしたハイブリダイゼーションの発生を最小化する、最小に交差ハイブリダイズしている（ｍｉｎｉｍａｌｌｙ ｃｒｏｓｓ−ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）オリゴヌクレオチドタグセットの開発において、ＷＯ９６／１２０１４（前出）および国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０９５１３号（ＷＯ９６／４１０１１）に記載のように、Ｂｒｅｎｎｅｒにより取り組まれている。
【０００４】
しかし、不運なことに、固相オリゴヌクレオチド合成の既存の方法は、高度に効率的であるが、オリゴヌクレオチドが３０〜４０ヌクレオチド長を超える場合に特に、不首尾の配列の有意な画分を依然としてもたらす。このようなオリゴヌクレオチドの混合物がタグとして（特に選別のために）利用される場合には、不首尾の配列の重要な結果は、２つの化合物を別個に合成する場合にはいつでも、そのタグの画分が相補体を有さないことである。従って、複雑な混合物を選別する際（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ（上で引用）に記載されるプロセスにおいて必要とされるような）には、このような不首尾は、この選別プロセスの完全性を制限する。
【０００５】
上記を考慮すると、用いられる合成プロセスの効率にかかわらず、全てのタグが相補体を有することを確実にするオリゴヌクレオチドタグのセットを合成するための手段が利用可能である場合、これは有用である。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明の目的は、レパートリーにおける全てのオリゴヌクレオチドタグが対応するタグ相補体を有することを確実にする、オリゴヌクレオチドタグの１つ以上のレパートリーを合成する方法を提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、本発明の方法により生成されるオリゴヌクレオチドタグにより、ポリヌクレオチドを固相支持体上に選別するためのシステムを提供することである。
【０００８】
本発明のさらなる目的は、サブユニット（ワード）のコンビナトリアル付加により、オリゴヌクレオチドタグを合成する方法を提供することである。
【０００９】
本発明のこれらおよび他の目的は、オリゴヌクレオチドタグ相補体のレパートリーを、１つ以上の固相支持体上で合成する工程、このオリゴヌクレオチドタグ相補体の画分をこの支持体（単数または複数）から切断する工程、およびこの切断したタグ相補体をクローニングベクターに挿入する工程を包含する、合成方法を提供することにより、達成される。このクローン化されたタグ相補体は、選択された物質（好ましくは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生体分子）に好都合に結合体化されて、独特のタグ配列を有する、タグ化された物質を生成し得、これは、ハイブリダイゼーションによって、対応するタグ相補体へと捕捉され得、そして選別され得る。
【００１０】
１実施形態においては、本発明は、オリゴヌクレオチドタグのレパートリーを合成する方法を提供する。この方法において、複数の異なる配列のオリゴヌクレオチド集団が、１つ以上の固相支持体上で合成され、その結果、各集団は、他の集団に対して空間的に離れた領域に位置し、そして各集団内のオリゴヌクレオチドは、所定の集団における全てのオリゴヌクレオチドについては同一であるが他の全てのオリゴヌクレオチド集団におけるタグ相補体配列とは異なり得る、タグ相補体配列を含む。このオリゴヌクレオチドの画分は、１つ以上の支持体上の各集団から切断されて、異なる配列のタグ相補体オリゴヌクレオチドの混合物を遊離する。プライマーは各タグ相補体オリゴヌクレオチドへとアニールされ、そしてこのアニールされたプライマーは伸長されて、タグ相補体鎖および相補的なタグ鎖を含む二重鎖を形成し、その結果、このように形成されるタグ相補体鎖または二重鎖は、オリゴヌクレオチドタグレパートリーを含む。１つの好ましい実施形態においては、このオリゴヌクレオチドは、その３’末端によって１つ以上の支持体に結合され、そして各オリゴヌクレオチドは、このタグ相補体配列の３’側に、ユニバーサルプライマー結合配列を含む。別の好ましい実施形態においては、各集団から切断されるオリゴヌクレオチドの画分は、１０〜３０％である。なお別の好ましい実施形態によれば、合成されたオリゴヌクレオチドの各集団の選択された画分は、塩基切断可能結合を介して、１つ以上の支持体に結合される。
【００１１】
本発明はまた、上記のように調整したタグオリゴヌクレオチドのレパートリーを含む。
【００１２】
また、タグレパートリー由来の複数のメンバーを含むタグベクターライブラリー形成の方法も提供する。本発明の方法において、上記のように調製したオリゴヌクレオチドのタグのレパートリーは、選択されたベクターの複数のコピーへの連結により挿入され、タグレパートリーのメンバーを含むタグベクターライブラリーを形成する。本発明はまた、この方法により形成されたタグベクターライブラリーを含む。
【００１３】
本発明はまた、タグ化ポリヌクレオチドフラグメントのライブラリーを形成する方法を含む。この方法では、上記由来のタグベクターライブラリーは、各ベクターにおけるタグ配列に隣接する部位で、各タグベクターへのポリヌクレオチドフラグメントの挿入に有効な連結条件下で、異なるポリヌクレオチドフラグメントの混合物と組み合わせられる。本発明はまた、この方法によって形成したタグ化ポリヌクレオチドフラグメントのライブラリーを含む。
【００１４】
別の局面において、本発明はまた、ポリヌクレオチドをソートするためのシステムを含む。このシステムは、１つ以上の固相支持体を含み、この固相支持体上で複数のオリゴヌクレオチド集団を付着し、これにより各集団は、１つ以上の支持体上で、他の集団に対して、空間的に別個の領域に配置される。そして各集団中のこれらのオリゴヌクレオチドは、所定の集団中のあらゆるオリゴヌクレオチドについて同じであるタグ相補体配列を含む。このシステムはまた、上記のように調製され得るタグレパートリー、タグベクターライブラリー、またはタグ化ポリヌクレオチドフラグメントからなる群より選択されるタグ組成物を含む。
【００１５】
本発明はまた、同一のタグ配列を含む複数の固定オリゴヌクレオチドを含む固相支持体を提供する。ここで少なくとも１方のオリゴヌクレオチドは、切断可能リンカーにより支持体に連結され、そしてオリゴヌクレオチドの少なくとももう一方は、切断不能リンカーにより支持体に連結される。第１の好ましい実施形態において、この支持体は、ビーズである。第２の好ましい実施形態において、この支持体は、アドレス可能な領域の平面アレイを含む。それぞれの領域は、同一のタグ配列を含む複数の固定オリゴヌクレオチドを含み、これにより、その領域内の少なくとも２つのタグ配列は、お互いに異なる。好ましくは、切断可能リンカーは、基部−移動性（ｂａｓｅ−ｌａｂｉｌｅ）リンカーである。本発明の固相支持体は、この支持体上に固定されたオリゴヌクレオチドに実質的に相補的であるタグオリゴヌクレオチドのレパートリーを生成するために特に有用である。
【００１６】
従って、本発明はまた、固相ビーズまたは粒子を含む。これは、このビーズまたは粒子に付着するオリゴヌクレオチドの集団を含み、ここでこの集団は、同一のオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドの第１および第２のクラスを含み、そしてこの第１のクラス中のオリゴヌクレオチドは、第２のクラスのオリゴヌクレオチドを有意に切断することなく、支持体からの第１のクラスのオリゴヌクレオチドの選択的切断を可能にする切断可能な連結部分を含む。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、上記の型の固相ビーズまたは粒子の混合物を含む。ここでこの混合物中の少なくとも２つのビーズまたは粒子は、異なるタグ相補体配列を有するオリゴヌクレオチド集団を含む。
【００１８】
これら、ならびに本発明の他の目的および特徴は、以下の説明および添付の図面からより明確になる。
【００１９】
（本発明の詳細な説明）
本発明は、お互いに高い相補性を有するタグおよびタグ相補体のマッチしたセット（レパートリーともよばれる）を合成するための方法および試薬を提供する。このようなマッチしたセットは、配列決定、フィンガープリンティング、または他の型の分析のような、並行した操作のためのタグ化分子を標識およびソートするために特に有用である。
【００２０】
本発明の１つの局面において、オリゴヌクレオチドの集団が合成される。ここで各集団は、切断可能連結部分および切断不能連結部分の混合により支持体に連結される同一のタグ相補体を含む。この切断可能リンカーは、各集団におけるオリゴヌクレオチドの一部が支持体から切断され、オリゴヌクレオチド（この配列はこの支持体上に残るタグ相補体に完全に相補的である）を形成する鋳型として働くことを可能にする。１つ以上の支持体からのタグ相補体の一部を切断すること、および相補的タグを形成するためにこの切断タグを鋳型として用いることにより、この方法は、以前の方法よりも高い収率および忠実度で、マッチしたタグおよびタグ相補体レパートリーを生成する。従って、本発明は、ハイブリダイゼーション特異性およびタグ配列複雑性を、タグおよびそれらの相補体が独立して合成される場合に得られたものに対して増強する。
【００２１】
本発明は、タグ相補体の合成の複雑性の増強のための方法を提供することにより、オリゴヌクレオチドタグを利用する技術における実質的な改善を提供する。以前には、タグは、タグ相補体から独立して合成され、そのため全ての意図されたタグおよびタグ相補体が現実に合成されるという保証はなかった。特に、以前のポリヌクレオチド合成方法は、１つ以上のヌクレオチドフラグメント付加工程において、重大なまたは完全な失敗をうけやすかった。その結果、得られたタグおよびタグ相補体は、意図した配列を有さず、そしてその意図したパートナーに完全にハイブリダイズし得ない。オリゴヌクレオチドの欠陥合成は、タグ化されたサンプル種を意図されたタグ相補体に対する位置付けおよびハイブリダイズから防ぎ、影響したサンプル種のシグナルの消失および／または量の過少評価を生じる。さらに、欠陥タグ配列の存在は、他のタグとの交差ハイブリダイゼーションを導き得、それらの対応する相補体へのそれらのタグのハイブリダイゼーションを妨害する。さらに、タグレパートリーおよびタグ相補体レパートリーの複雑性は減じた。
【００２２】
これらの問題は、固定タグ相補配列の選択部分を鋳型として用いて対応するタグのレパートリーを形成することにより、本発明によって克服される。サンプルへのタグの連結がサンプル物質、好ましくは生体分子（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）を選択し、タグ相補体のアレイ上で捕獲され得るタグ化物質（例えば、サンプルポリヌクレオチドフラグメント）の混合物を生成した。従って、本発明は、タグ相補体の全範囲にハイブリダイズし得る、タグレパートリー、またはレパートリーのサブセットを保証ずる方法を提供する。
【００２３】
Ｉ．定義
「タグ」または「タグオリゴヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチドタグ」は、付着した種（例えば、サンプルオリゴヌクレオチド）のための同定者標識として働き得るヌクレオチド配列を含む、そしてタグレパートリーにおいて他のタグから検出的に識別可能である、オリゴヌクレオチドをいう。
【００２４】
「相補体」または「タグ相補体」は、本明細書において用いる場合、オリゴヌクレオチドタグが特別にハイブリダイズし、完全にマッチした二重鎖または三重鎖を形成するオリゴヌクレオチドをいう。特異的ハイブリダイゼーションが三重鎖を生じる実施形態において、オリゴヌクレオチドタグは、二重鎖または一本鎖のいずれかになるように選択され得る。従って、三重鎖が形成される場合、用語「相補体」は、一本鎖オリゴヌクレオチドタグの二本鎖相補体または二本鎖オリゴヌクレオチドタグの一本鎖相補体のいずれかを包含することを意味する。
【００２５】
用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書において用いる場合、天然または改変されたヌクレオシドモノマーの直線状オリゴマーを意味し、これはデオキシリボヌクレオシドおよびリボヌクレオシドを含む。通常、モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのアナログ（例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミダイト、ホスホネート、ペプチド核酸（Ｎ−誘導体化グリシンポリマー）など）により連結され、数モノマー単位（例えば、３〜４）〜数十モノマー単位、そして１００モノマー単位までのサイズにわたる、オリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドが「ＡＴＧＣＣＴＧ」などの一連の文字の配列により示される場合いつでも、ヌクレオチドは左から右方向に５’→３’の順であること、そして、他に示さない限り、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを意味し、そして「Ｔ」はチミジンを示すことが理解される。通常、本発明のオリゴヌクレオチドは、４つの天然のヌクレオチドを含む。しかし、それらはまた、非天然ヌクレオチドアナログも含む。天然または非天然のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが使用され得る場合（例えば、酵素による処理が必要とされる場合）、通常、天然のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが必要であることが当業者には明白である。
【００２６】
「ポリヌクレオチド」または「ポリヌクレオチドフラグメント」とは、２つ以上のヌクレオチドを含むポリマーをいう。「ポリヌクレオチド」は「オリゴヌクレオチド」を包含するが、ポリヌクレオチドの長さは１００モノマー単位を超え得る。
【００２７】
二重鎖に関して「完全にマッチした」は、各鎖中のあらゆるヌクレオチドが他鎖中のヌクレオチドとＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成を受けるように、二重鎖を作るポリヌクレオチド鎖またはオリゴヌクレオチド鎖が、もう一方の鎖と２本鎖構造を形成することを意味する。この用語はまた、用いられ得るヌクレオシドアナログ（例えば、デオキシイノシン、２−アミノプリン塩基を有するヌクレオシドなど）の対形成を包含する。三重鎖に関しては、この用語は三重鎖が完全にマッチした二重鎖および第３鎖からなり、ここで、あらゆるヌクレオチドが完全にマッチした二重鎖の塩基対とＨｏｏｇｓｔｅｅｎまたは逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ会合を受けることを意味する。逆に、二重鎖におけるタグとオリゴヌクレオチドとの間の「ミスマッチ」は、二重鎖または三重鎖におけるヌクレオチドの対またはトリプレット（ｔｒｉｐｌｅｔ）がＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋおよび／またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎおよび／または逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ結合を受け損なうことを意味する。
【００２８】
本明細書中に用いられる「ヌクレオシド」は、２’−デオキシ型および２’−ヒドロキシル型（例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９２）に記載されるように）を含む天然のヌクレオシドを含む。ヌクレオシドに関する「アナログ」は、改変された塩基部分および／または改変された糖部分を有する合成ヌクレオシド（例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８０）；ＵｈｌｍａｎおよびＰｅｙｍａｎ， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ９０：５４３−５８４（１９９０）などに記載された）を、それらが特異的ハイブリダイゼーションをし得るという条件つきで含む。このようなアナログは、結合特性を増強し、退化を低減し、特異性を増すなどのように設計された合成ヌクレオシドを包含する。
【００２９】
「ヌクレオチド」とは、５’、３’、および／または２’−ヒドロキシルに付着した１つ以上のリン酸基（またはそれらのアナログ）を有するヌクレオシドもしくはヌクレオシドアナログ、またはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに含まれるヌクレオシドをいう。
【００３０】
本明細書において用いる場合、ポリヌクレオチドの集団に関する「複雑性」とは、この集団に存在する異なる種の分子の数を意味する。
【００３１】
本明細書において用いる場合、「レパートリー」とは、配列の異なるオリゴヌクレオチドの収集物または混合物（例えば、オリゴヌクレオチドタグまたはタグ相補体を含む）をいう。「レパートリー」は、規定された複雑性を有し得る。
【００３２】
本明細書において用いる場合、「切断可能連結部分」は、選択された化学条件下で切断可能である化学基をいう。用語「切断可能リンカー」は、切断可能連結部分を含む化合物または化学基をいう。例えば、用語「切断可能リンカー」は、第一の連結機能性を介して支持体に、そして第二の機能性を介してオリゴヌクレオチドに結合し得るリンカー化合物の活性化形態を包含する。切断可能リンカーは、選択された切断可能条件下で切断可能である、エステル基のような切断可能連結部分を含み得る。
【００３３】
（ＩＩ．構成要素）
以下の小節は、本発明の種々の局面を実施するために用いられ得る種々の構成要素（例えば、材料および試薬）を考察する。
【００３４】
（Ａ．固相支持体）
本発明内の使用のための固相支持体は、任意の広範な種々の形態を有し得る。これには微粒子、ビーズ、メンブレン、スライド、プレート、マイクロマシンチップなどを含む。同様に、本発明の固相支持体は、広範な種々の材料を含み得る。これには、ガラス、プラスチック、シリコン、アルケンチオレート誘導体化金、セルロース、低架橋ポリスチレンおよび高架橋ポリスチレン、シリカゲル、ポリアミド、などが挙げられる。好ましくは、別個の粒子の集団のいずれかが使用され、これによりそれぞれの粒子は、同じタグ（および他でない）の相補的配列の、均一なコーティング、または集団を有し、または１つ以上の支持体は、空間的に別個の領域で使用され、それぞれの領域は、同じタグ（および他でない）に相補的である配列の、均一のコーティング、または集団を含む。後者の実施形態では、この領域の面積は、特定の適用に従って変化し得る。通常、この領域は、数μｍ2（例えば、３〜５μｍ2）〜数百μｍ2（例えば、１００〜５００μｍ2）の面積にわたる。好ましくは、このような領域は、空間的に別個であり、この結果、隣接する領域で、事象により生成されたシグナル（例えば、蛍光放出）は、使用され得る検出システムによりお互いから分離され得る。いくつかの適用において、１つより多いタグ相補体の均一なコーティングを有する領域を有することが、例えば、同時の配列分析のために、または別々にタグ化した分子をごく近接して持ってくるために、所望され得る。
【００３５】
例えば、広範な種々の微粒子支持体が、本発明で用いられ得る。、微粒子支持体としては、徐放性の多孔性ガラス（ＣＰＧ）、高架橋ポリスチレン、アクリルコポリマー、セルロース、ナイロン、デキストラン、ラテックス、ポリアクロレインなどにより作製される微粒子が挙げられ、以下の模範的な参考文献中に開示されている：Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、Ａ節、第４４巻、１１−１４７頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７６）；米国特許第４，６７８，８１４号；同第４，４１３，０７０号；および第４，０４６，７２０号；ならびにＰｏｎ、１９章、Ａｇｒａｗａｌ（編）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２０巻（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、１９９３）。微粒子支持体としては、市販のヌクレオシド誘導体化ＣＰＧおよびポリスチレンビーズ（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡから入手可能）；誘導体化磁気ビーズ；ポリエチレングリコールでグラフトされたポリスチレン（例えば、ＴｅｎｔａＧｅｌTM、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）などがさらに挙げられる。支持体の特性（例えば、材質、多孔度、サイズ、形態など）の選択、および用いられる結合部分の型は、タグを用いる際の条件に依存する。例えば、酵素による連続的なプロセスを含む適用において、酵素の立体障害を最小にし、そして基質への接近を容易にする支持体およびリンカーが好ましい。最も適切な微粒子支持体を選択する際に、考慮されるべき他の重要な因子としては、サイズの均一性、合成支持体としての効率、表面積、および光学特性が挙げられる。表面で多くのビーズを扱う場合、平滑な透明（半透明）のビーズは、計測的な（ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎａｌ）利点を提供することに注目する。
【００３６】
上記のように、タグ相補体はまた、１つ以上の固相支持体上で合成され得、タグ相補体で均一にコートされた領域のアレイを形成する。すなわち、このようなアレイ中の各領域内で、同じタグ相補体が合成される。このようなアレイを合成するための技術は、今や周知であり、そして例えば、以下に開示される：ＭｃＧａｌｌら、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３７６７（ＷＯ９３／２２６８０（Ａｆｆｙｍａｘ））；Ｐｅａｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９１：５０２２−５０２６（１９９４）；ＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＭａｓｋｏｓ、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ８９／０１１１４（ＩｓｉｓによるＷＯ９０／０３３８２）；Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１３：１００８−１０１７（１９９２）；およびＭａｓｋｏｓおよびＳｏｕｔｈｅｒｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２１：４６６３−４６６９（１９９３）。
【００３７】
好ましくは、本発明は、同じタグ配列の相補体で均一にコートされた微粒子またはビーズを用いて実行される。微粒子支持体、およびそれらの表面にオリゴヌクレオチドを共有結合または非共有結合する方法は、周知であり、以下の参考文献により例示される：ＢｅａｕｃａｇｅおよびＩｙｅｒ（上記に引用される）に引用される；Ｇａｉｔ（編）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８４版および１９９０版）；および上記に引用される参考文献。一般に、微粒子のサイズおよび形態は重要ではない；しかし、最小の試薬およびサンプルの用法でオリゴヌクレオチドタグの多くのレパートリーの構築および操作を容易にするので、直径数μｍ（例えば、１〜２μｍ）から数百μｍ（例えば、２００〜１０００μｍ）の範囲のサイズの微粒子が好ましい。
【００３８】
いくつかの好ましい適用では、市販の徐放性の多孔性ガラス（ＣＰＧ）またはポリスチレン支持体が、本発明における固相支持体として用いられる。このような支持体は、塩基不安定性のリンカーおよび結合した最初のヌクレオチド（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ））を用いて利用可能になる。好ましくは、５００オングストローム〜１０００オングストロームの間のポアサイズを有する微粒子が用いられる。
【００３９】
他の好ましい適用では、細孔のない微粒子が、その光学特性のために用いられ、この微粒子は、平面支持体（例えば、顕微鏡スライド）の上で多くの微粒子を探知する場合、有利に用いられ得る。特に、好ましい細孔のない微粒子は、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｒｍｅｌ．ＩＮ）から入手可能なグリシダルメタクリレート（ｇｌｙｃｉｄａｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）（ＧＭＡ）である。このような微粒子は、種々のサイズで有用であり、そしてタグまたはタグ相補体を合成するための種々の結合基で誘導体化される。好ましくは、タグ化された微粒子の多量（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ）の平行操作のために、約直径５μｍの直径を有するＧＭＡビーズが用いられる。
【００４０】
（Ｂ．タグ配列）
本発明のタグは、目的のサンプル種のための、および一つ以上の固体支持体に固定された対応するタグ相補体への特異的ハイブリダイゼーションのための、固有のタグ化配列を提供するように設計される。このタグ（およびタグ相補体）の配列は、以下の場合、使用者により選択される配列の任意の群であり得る：（１）それぞれ異なるタグおよびタグ相補体が、分類のための選択的ハイブリダイゼーション条件下で、レパートリー中の他のタグまたはタグ相補体と顕著に交差ハイブリダイズしない、（２）それぞれのタグおよびタグ相補体が、意図された相補的な配列との特異的ハイブリダイゼーションを防げる、第二の構造を形成しない、そして（３）それぞれのタグが、選択されたタグレパートリー中の全てのタグについて同一の条件下で、その対応するタグ相補体を特異的に認識しかつハイブリダイズし得る。一般的に、異なるタグの数は、並行して処理される異なるサンプル種の数に比例して増加する。タグ配列は、任意の適切な方法に従って設計され得、従って、所望の配列特異性および感度が達成される。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドタグ配列は、オリゴヌクレオチド配列の「最小に交差ハイブリダイズしているセット」から選択される。好ましくは、タグレパートリーの任意の二つのオリゴヌクレオチドタグの配列は、オリゴヌクレオチドが最大配列同一性を達成するように整列された場合、少なくとも二つのヌクレオチドが異なる。言い換えると、レパートリー中の任意のタグとレパートリー中の任意の他のタグ（またはそのタグ相補体）との間の二本鎖または三本鎖の形成は、少なくとも二つのミスマッチを生じる。より詳細な実施形態において、タグレパートリー中のタグ配列は、二本鎖および三本鎖が、少なくとも三つのミスマッチヌクレオチドを生成することなく、レパートリー中の他のタグまたはタグ相補体を用いて生成し得ないことなどを保証するように設計される。このような実施形態において、ミスマッチの最小数が増えるにつれて、より大きな特異性が達成されるが、タグのレパートリーの合計は小さくなる。従って、所定の長さのタグについて、所望の特異性とレパートリーの大きさとの間に二律背反がある。
【００４２】
最小に交差ハイブリダイズしているセット（レパートリー）のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、本明細書中で参考として援用されるＰＣＴ公開第ＷＯ９６／４１０１１号（特に図１、補遺ＩａおよびＩｂにおいて提供されるプログラム、および文章中の対応する考察を参照のこと）ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ９７／４６７０４号（補遺ＩおよびＩＩ）に記載される手順に従って、単純なコンピュータプログラムにより、好都合に列挙される。ＷＯ９６／４１０１１中の補遺Ｉａのプログラムｍｉｎｈｘは、三種のヌクレオチドで構成される４マーサブユニットを有する、全ての最小に交差ハイブリダイズしているセットを算定する。補遺ＩｂのプログラムｔａｇＮ（ＷＯ９６／４１０１１）は、最小に交差ハイブリダイズしているセットの長い方のオリゴヌクレオチドを列挙する。プログラム３ｔａｇＮ（ＷＯ９７／４６７０４、補遺ＩＩ）は、一本鎖タグ相補体を結合するための、二本鎖タグの最小に交差ハイブリダイズしているセットを生産するために使用され得る。同様のアルゴリズムおよびコンピュータプログラムが、本発明の任意の実施形態のための最小に交差ハイブリダイズしているセットの、オリゴヌクレオチドを列挙するために、容易に書かれる。以下の表Ｉは、ヌクレオチド差異の示される長さおよび数についての、最小に交差ハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドのセットの大きさに関する手引きを与える。ここで、示された数字を発生させるために、上述のコンピュータプログラムが使用された。
【００４３】
【表１】
【００４４】
好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドタグは、３〜９の、好ましくは３〜６のヌクレオチド長さであり、そして同一の最小に交差ハイブリダイズしているセットから選択されるサブユニット（「ｗｏｒｄｓ」ともいわれる）からコンビナトリアル的に合成される。この範囲におけるオリゴヌクレオチドについて、このようなセットのメンバーは、ＷＯ９６／４１０１１からの図１のアルゴリズムに基づいたコンピュータ・プログラムにより列挙され得る。
【００４５】
好ましくは、最小に交差ハイブリダイズしているセットは、セットの全ての他のサブユニットのように二重鎖（または三重鎖）安定性にほぼ等しい寄与をするサブユニットを含有する。このように、全てのサブユニットとその相補体との間で完全にマッチした二重鎖の安定性はほぼ等しい。このようなセットを選択するためのガイダンスは、至適なＰＣＲプライマーの選択および二重鎖安定性の計算についての報告された技術により提供される（例えばＲｙｃｈｌｉｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：８５４３−８５５１（１９８９）および１８：６４０９−６４１２（１９９０）；Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８３：３７４６−３７５０（１９８６）：Ｗｅｔｍｕｒ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２６：２２７−２５９（１９９１）など）。より短いタグ（例えば、約３０ヌクレオチド以下）について、ＲｙｃｈｌｉｋおよびＷｅｔｍｕｒにより記載されたアルゴリズムが好ましく、より長いタグ（例えば、約３０〜３５ヌクレオチド以上）については、Ｓｕｇｇｓら、Ｂｒｏｗｎ編のＩＣＮ−ＵＣＬＡ Ｓｙｍｐ． Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．， 第２３巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８１）の６８３−６９３頁に開示されたアルゴリズムが便利に用いられ得る。明らかに、本発明の範囲内で最小に交差ハイブリダイズしているサブユニットのセットを設計するために当業者に利用可能な多くのアプローチがある。例えば、サブユニットを組み立てる場合、末端ヌクレオチドの異なる塩基の積み重ねエネルギーの影響を最小にするために、サブユニットは同じ末端ヌクレオチドを有するように提供され得る。このように、サブユニットを連結する場合、全ての隣接する末端ヌクレオチドの塩基の積み重ねエネルギーの総量は同じであり、これによりタグ融解温度の多様性が低減または除去される。
【００４６】
以下で下線を付したイタリック体で示される、末端ヌクレオチドの「ワード」もまた、タグの各末端に付加され得、その結果、その「ワード」と任意の他のタグ相補体にある類似の末端「ワード」との間で、完全なマッチが常に形成される。このような増強（ａｕｇｍｅｎｔｅｄ）タグは、以下の形態を有する：
【００４７】
【化１】
【００４８】
最小に交差ハイブリダイズしているセットの好ましい実施形態は、ワードが、４つの天然のヌクレオチドのうちの３つから作製されるセットである。オリゴヌクレオチドタグにおける１つの型のヌクレオチドの欠損は、所望されるならば、タグの相補鎖を除去するために（ストリッピング反応）、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’ エキソヌクレアーゼ活性を使用して、タグが二本鎖から一本鎖の形態へと変換されることを可能にする。以下は、Ａ、Ｇ、およびＴからなる群から選択される４つのヌクレオチドを各々含む、例示的な最小に交差ハイブリダイズするワードのセットである：
【００４９】
【表２】
【００５０】
さらなる例示的な最小に交差ハイブリダイズしているセットを、以下の表ＩＩＩにおいて列挙する。明らかなことに、さらなるセットが、異なるヌクレオチドの群で置換することによって、または既知の最小に交差ハイブリダイズしているセットのサブセットを使用することによって、生成され得る。
【００５１】
【表３】
本発明における使用のためのオリゴヌクレオチドタグ相補体を、例えば、以下の参考文献において開示されるような、標準的ケミストリー（好ましくは、ホスホルアミダイトケミストリー）を使用して、自動化ＤＮＡ合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３９２または３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）または「ＧＥＮＥ ＡＳＳＥＭＢＬＥＲ ＰＬＵＳ」（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で、従来的に合成する：ＢｅａｕｃａｇｅおよびＩｙｅｒ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４８：２２２３−２３１１（１９９２）；Ｍｏｌｋｏら、米国特許第４，９８０，４６０号；Ｋｏｓｔｅｒら、米国特許第４，７２５，６７７号；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、米国特許第４，４１５，７３２号；同第４，４５８，０６６号；および同第４，９７３，６７９号；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（編）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９０）；など。
【００５２】
微粒子が支持体として用いられる場合、タグ相補体のレパートリーは、例えば、Ｓｈｏｒｔｌｅら、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３４１８（ＷＯ９３／２１２０３）またはＬｙｔｔｌｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９：２７４−２８０（１９９５）に開示されるような、「分割および混合（ｓｐｌｉｔ ａｎｄ ｍｉｘ）」技術を介するワード様式（ｗｏｒｄ−ｗｉｓｅ）合成によって生成され得る。簡単に述べると、合成の基本ユニットは、タグ配列のサブユニット（「ワード」）である。好ましくは、ホスホルアミダイトケミストリーを使用し、そして３’ホスホルアミダイトオリゴヌクレオチドが最小に交差ハイブリダイズしているセット（例えば、上記に最初に列挙したセットについては、８つの３’−ホスホルアミダイトテトラマーがある）における各ワードについて調製される。合成は、Ｓｈｏｒｔｌｅらにより開示されたように、またはヌクレオシドモノマーを用いる種々のオリゴヌクレオチドライブラリーを生じるために用いられる技術（例えば、Ｔｅｌｅｎｉｕｓら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１３：７１８−７２５（１９９２）；Ｗｅｌｓｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：５２７５−５２７９（１９９１）；Ｇｒｏｔｈｕｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２１：１３２１−１３２２（１９９３）；Ｈａｒｔｌｅｙ、欧州特許出願第９０３０４４９６．４号；Ｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ，３５４；８２−８４（１９９１）；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ４０：４９８−５０７（１９９２）；などに開示されたような）に直接的に類似して進行する。一般的に、これらの技術はカップリング工程の間、成長するオリゴヌクレオチドへの活性化されたモノマー（または、ポリマー性のワード）の混合物の適用を単に必要とする。
【００５３】
好ましくは、タグの相補体を、タグの構築において使用される異なる種類のワードの数より多いかまたはそれに等しい、多数の合成チャンバーを備えるＤＮＡ合成装置で合成する。すなわち、好ましくは、各タイプのワードに対応する合成チャンバーが存在する。この実施形態では、ワードをヌクレオチド毎に付加し、その結果、ワードが５個のヌクレオチドからなる場合には、各合成チャンバーにおいて５つのモノマーのカップリングが存在する。ワードを完全に合成した後、合成支持体をチャンバーから取り外し、混合し、そしてワード付加の次のサイクルのためのチャンバーに再分配し直す。この後者の実施形態は、例えば、ホスホルアミダイトケミストリーにおける、モノマー付加の高カップリング収率を利用している（例えば、実施例１を参照のこと）。
【００５４】
本発明のタグおよびタグ相補体の配列は、好ましくは、１２から６０までのヌクレオチドまたは塩基対の長さの範囲を有する。好ましくは、タグ配列は、１８から４０までのヌクレオチドまたは塩基対の長さの範囲である。より好ましくは、タグ配列は、２５から４０までのヌクレオチドまたは塩基対の長さを有する。ワードの好ましい数およびより好ましい数に関して、これらの範囲を、以下のように表し得る：
【００５５】
【表４】
【００５６】
好ましくは、本発明のタグおよび／またはタグ相補体のレパートリーは、少なくとも１００のメンバー；より好ましくは、少なくとも１０００のメンバー；そして最も好ましくは、少なくとも１０，０００のメンバーを含む。
【００５７】
特異的なハイブリダイゼーションが三重鎖形成を介して生じる実施形態では、タグ配列のコード化は、二重鎖形成タグについてと同じ原理に従う；しかし、ワード配列の選択に対して、さらなる制約が存在する。一般に、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型の結合を介した第３鎖の会合は、二本鎖標的においてホモピリミジン−ホモプリントラックに沿って最も安定である。通常、塩基トリプレットは、Ｔ−Ａ*ＴまたはＣ−Ｇ*Ｃモチーフ（ここで、「−」はワトソン−クリック対形成を示し、そして「*」はＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型の結合を示す）に形成する；しかし、他のモチーフもまた可能である。例えば、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成は、鎖の状態および組成に依存して、第三鎖（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ鎖）とその第三鎖が結合する二重鎖のプリン−リッチ鎖との間で平行および逆平行の配向を可能にする。特定の実施形態で所望されるような三重鎖の安定性を、最大にするか、さもなくば調節するための、適切な配列、配向、条件、ヌクレオシド型（例えば、リボースヌクレオシドまたはデオキシリボースヌクレオシドのいずれが使用されるか）、塩基修飾（例えば、メチル化シトシン）などの選択について、広範囲にわたるガイダンスが参考文献中にある。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８８：９３９７−９４０１（１９９１）；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５８：１４６３−１４６６（１９９２）；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９３：４３２０−４３２５（１９９６）；Ｄｉｓｔｅｆａｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０：１１７９−１１８３（１９９３）；Ｍｅｒｇｎｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：９７９１−９７９８（１９９１）；Ｃｈｅｎｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１４：４４６５−４４７４（１９９２）；ＢｅａｌおよびＤｅｒｖａｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０：２７７３−２７７６（１９９２）；ＢｅａｌおよびＤｅｒｖａｎ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１４：４９７６−４９８２（１９９２）；Ｇｉｏｖａｎｎａｎｇｅｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８９：８６３１−８６３５（１９９２）；ＭｏｓｅｒおよびＤｅｒｖａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８：６４５−６５０（１９８７）；ＭｃＳｈａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：５７１２−５７２１（１９９２）；Ｙｏｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８９：３８４０−３８４４（１９９２）；Ｂｌｕｍｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０：１７７７−１７８４（１９９２）；ＴｈｕｏｎｇおよびＨｅｌｅｎｅ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３２：６６６−６９０（１９９３）；Ｅｓｃｕｄｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９３：４３６５−４３６９（１９９６）；など。
【００５８】
一本鎖タグまたは二重鎖タグをそれらの一本鎖相補体または二重鎖相補体にアニールするための条件は、周知である（例えば、Ｊｉら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６５：１３２３−１３２８（１９９３）；Ｃａｎｔｏｒら、米国特許第５，４８２，８３６号など）。三重鎖タグの使用は、タグが最初に二本鎖形態で調製される場合に、その相補体にアニーリングするためにタグを露出するために、ポリメラーゼでの「ストリッピング」反応を必要としないという利点を有する。
【００５９】
好ましくは、三重鎖ハイブリダイゼーションを使用する本発明のオリゴヌクレオチドタグは二本鎖ＤＮＡであり、そして対応するタグ相補体は、一本鎖である。より好ましくは、タグ相補体中のシトシンの代わりに、５−メチルシトシンを使用して、タグとその相補体との間で形成される三重鎖のｐＨ安定性の範囲を広げる。三重鎖を形成するために好ましい条件は、上記の参考文献において、完全に開示されている。手短には、ハイブリダイゼーションを、濃縮塩溶液（例えば、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１．０Ｍ酢酸カリウムなど）において、５．５（または、５−メチルシトシンが使用される場合には６．５）未満のｐＨで行う。ハイブリダイゼーションの温度は、タグの長さおよび組成に依存する；しかし、１８〜２０マーまたはそれより長いタグについては、室温でのハイブリダイゼーションが適切である。洗浄を、さほど濃縮されていない塩溶液（例えば、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2）、ｐＨ５．８、室温で実施し得る。タグを、類似の塩溶液（ｐＨ９．０）中でのインキュベーションによって、それらのタグ相補体から溶出し得る。
【００６０】
最小に交差ハイブリダイズする、三重鎖を形成するオリゴヌクレオチドタグのセットは、ＷＯ９７／４６７０４の付録ＩＩにおいてコンピュータープログラム３ｔａｇＮまたは類似のプログラムによって生成され得る。小文字の対応する相補体を有する、二本鎖８マーのワードの典型的なセットは、大文字の下に与えられる。各々のこのようなワードは、３塩基対によるセットにおける他の各ワードとは異なる。
【００６１】
【表５】
【表６】
【００６３】
（Ｄ．固相リンカー）
合成の間、本発明のタグ相補体は、第１および第２の型の連結部分によって１つ以上の固相支持体に結合され、その結果、（１）連結部分の両方の型がタグ相補体合成の間にインタクトな（切断されない）ままであり、そして（２）第２の連結部分が切断されない条件下で、連結部分の第１の型が切断されて、合成ヌクレオチドを放出し得る。好ましくは、この切断可能な連結は、化学的に切断可能な連結であり、すなわち、切断酵素を使用することなしで選択的な切断のために適切である。
【００６４】
多くの連結化学およびそれらの切断特性が公知である。典型的な切断可能な連結部分には、限定することを意図することなく、塩基不安定性部分、酸不安定性部分、光不安定性部分、還元可能部分、および酵素不安定性部分が含まれる。
【００６５】
塩基不安定性連結には、例えば、エステル（−Ｃ（Ｏ）Ｏ−）、チオエステル（−Ｃ（Ｏ）Ｓ−）、および２−オキシエチルスルホン（−ＯＣＨ2ＣＨ2−Ｓ（＝Ｏ）2Ｒ）が含まれる。このような連結は、塩基性条件下で、代表的には、ｐＨ≧８．０、好ましくはｐＨ≧９．０を用いて、適切な時間の間切断され得、そして必要に応じて、ｐＨを増加するため、および／または求核攻撃による切断を促進するために、適切な求核試薬（例えば、アンモニア）を含む。例えば、ジ（２−オキシエチル）スルホン連結部分は、アンモニア（水中２８〜３０％）を用いる反応によって、穏やかな条件下で（５５℃で１２〜１５時間）、オリゴヌクレオチドを有意に損なうことなく切断され得る（実施例１）。コハク酸エステル（切断可能）およびスクシンアミド（非切断性）連結部分の混合物を含む支持体の合成は、実施例３に記載される。
【００６６】
酸不安定性連結には、例えば、エステル（−Ｃ（Ｏ）Ｏ−）、チオエステル（−Ｃ（Ｏ）Ｓ−）、ケタール（Ｏ−Ｃ（Ｒ1Ｒ2）−Ｏ−）、ヘミケタール（Ｏ−ＣＨＲ−Ｏ−）、およびホスホルアミデート（−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ-）−Ｎ−）が挙げられる。例えば、ホスホルアミデート連結は、Ｈｉｒｓｃｈｂｅｉｎら（ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／１０４１８、公開番号９７／３１００９）またはＧｒｙａｚｎｏｖら（米国特許第５，５９９，９２２号）において記載される方法によって支持体に導入され得、そしてジクロロメタン中の０．８％トリフルオロ酢酸を用いて、室温で４０分間の処理によって切断され得る（Ｇｒｙａｚｎｏｖら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：３４０３−３４０９（１９９２）もまた参照のこと）。
【００６７】
典型的な光不安定性リンカーには、Ｄ．Ｊ．Ｙｏｏら、Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：３３５８−３３６４（１９９５）；Ｄ．Ｌ．ＭｃＭｉｎｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５２：３８２７−３８４０（１９９６）；およびＵｒｄｅａへの米国特許第５，４３０，１３６号によって記載されるような２−ニトロベンジルエステルが挙げられる。
【００６８】
還元可能リンカーは、例えば、２−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトールを用いて容易に還元されるジスルフィド連結基（Ｇｒｙａｚｎｏｖら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：１４０３−１４０８（１９９３）；Ｕｒｄｅａらへの米国特許第５，１１８，６０５号）によって例証される。
【００６９】
酵素不安定基には、酵素によって切断され得る任意の連結部分が挙げられる。典型的な連結部分には、エステル基（−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）、ペプチド基（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）、チオエステル（−Ｃ（Ｏ）−Ｓ）、およびエンドヌクレアーゼ制限部位を含むポリヌクレオチド配列（例えば、Ｕｒｄｅａへの米国特許第４，７７５，６１９号）が挙げられる。１つの好ましい実施形態において、連結部分は、特異的プロテアーゼによって認識されるアミノ酸残基（例えば、リジン−Ｘもしくはアルギニン−Ｘ（トリプシン）；アスパラギン酸−Ｘ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｖ８プロテアーゼ）；またはチロシン−Ｘ、トリプトファン−Ｘ、フェニルアラニン−Ｘ、ロイシン−Ｘ、もしくはメチオニン−Ｘ（α−キモトリプシン）；ここでＸは、ペプチドのＮ→Ｃ方向における次の残基を表す）を含むオリゴペプチドである。オリゴペプチド連結基の切断がオリゴヌクレオチド−ペプチド結合体を生じる場合、所望されるならば、プロナーゼまたは他の適切なプロテアーゼを使用して、そのペプチド部分は除去され得るか、またはそのオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドからのペプチド部分の選択的除去を可能にするように位置するエンドヌクレアーゼ制限部位を含み得る。
【００７０】
他の化学的連結（例えば、メチオニン含有オリゴペプチド、これは、酸性条件下で臭化シアンを用いて化学的に切断可能である）もまた意図される。切断可能な連結部分を記載するさらなる参考文献には、Ｍｏｎｆｅｒｔｅら、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０６１１６（ＷＯ９６／３７６３０）、Ｕｒｄｅａ（米国特許第５，３８０，８３３号）、Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ．，１９９１（特に６３−６７頁）、およびＡｌｌｅｎ，Ｇ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂ．Ｂ．Ｖ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８３（特に第３章）が挙げられ、これらは本明細書中に参考として援用される。
【００７１】
上記で言及した切断条件に一般的に耐性である多くの安定な連結部分もまた、公知である。典型的な、安定な「切断不能」部分には、エーテルおよびポリエーテル、ポリアミン、ホスホルアミダイト、ホスホルアミデートなどが挙げられる。これらの部分は、上述したいくつかの基と対照的に、大部分の酸性条件下および塩基性条件下で抵抗性であり、従って、特に、本発明で使用される切断不能な連結についての簡便な選択である。
【００７２】
微粒子表面上のタグを結合および／または合成するための典型的なリンカーは、Ｐｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：７６８−７７５（１９８８）；Ｗｅｂｂ、米国特許第４，６５９，７７４号；Ｂａｒａｎｙら、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０６１０３（ＷＯ９２／０４３８４）；Ｂｒｏｗｎら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８９：８９１−８９３；Ｄａｍｈａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８：３８１３−３８２１（１９９０）；Ｂｅａｔｔｉｅら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３９：７１９−７２２（１９９３）；ＭａｓｋｏｓおよびＳｏｕｔｈｅｒｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０：１６７９−１６８４（１９９２）などにおいて記載されている。
【００７３】
（ＩＩＩ．レパートリー合成法）
本発明は、オリゴヌクレオチドタグのレパートリーおよびタグ相補体の対応するレパートリーを合成する方法を提供し、その結果、タグおよびタグ相補体が別々に合成された以前の方法と比較して、所望のタグの合成の忠実度および収率が改善され、そして失敗の配列によって引き起こされる問題は減少する。
【００７４】
１つの実施形態において、この方法は（１）１つ以上の固相支持体に固定化された複数の異なる配列のオリゴヌクレオチド集団を合成する工程（ここで各集団は、複数の同じ配列のオリゴヌクレオチドを含み、そして各集団中のオリゴヌクレオチドは、他の集団中のタグ相補的配列と比較して異なるタグ相補的配列を含む）、（２）１つ以上の支持体からの各オリゴヌクレオチド集団の画分を切断する工程、および（３）切断されたオリゴヌクレオチドを複数のクローニングベクターに挿入して、タグベクターライブラリーを形成する工程を伴う。このようなプロセスを図２に図示する。ここで切断されたタグ相補的配列Ｔnを含むタグベクター構築物１は、タグベクターライブラリーのメンバーを例証する。
【００７５】
本発明における使用のための固相支持体は、上記の第ＩＩ節における記載に照らした任意の適切な方法によって調製され得る。上述のように、タグ相補体を支持体に連結する連結部分は、第１の切断可能連結部分および第２の非切断不能連結部分を含む、少なくとも２つの異なる連結部分の混合物を含む。切断可能連結部分および切断不能連結部分の両方は、支持体上にタグ相補的配列を作るために使用される、オリゴヌクレオチド合成プロトコルに耐えるために選択される。切断不能連結部分はまた、タグ化された分子を支持体に結合したタグ相補体にハイブリダイズさせるために後で使用される条件に耐えることが可能でなければならない。
【００７６】
支持体上の切断可能連結部分：切断不能連結部分の比は、以下を確実にするために選択される：（１）支持体上で合成されたタグ相補的レパートリーの十分な量が、相補的タグレパートリーを調製するために支持体から切断され得ること、（２）切断されたオリゴヌクレオチドは、クローン化可能であるか、または容易にクローン化され得ること、および（３）支持体がソーティングのために使用される場合、タグ相補体の十分な量がタグ化された分子を捕捉するために支持体上に残存すること。好ましくは、切断可能な連結部分は、全結合タグ相補体の５０％未満、およびより好ましくは、約１０％〜約３０％を構成する。合成されたオリゴヌクレオチドの各集団の選択された画分が、塩基切断可能な連結を介して支持体（単数または複数）に結合されることもまた好ましい。
【００７７】
上記で議論したように、所望される連結部分を結合するための多数の適切に反応性の支持体が既知である。例えば、ヒドロキシル誘導体化支持体またはアミノ誘導体化支持体が市販されているか、または上記で議論したように、選択されたリンカー基を結合するために適切な、容易に利用可能な材料から調製され得る。
【００７８】
切断可能連結基および切断不能連結基を、支持体に連続的にまたは同時に結合させ得る。好ましくは、この連結部分は、切断可能リンカーおよび切断不能リンカーの混合物と、支持体上の相補的反応基とを同時に反応させることにより固相支持体に導入され得る。従って、支持体上の切断可能部分および切断不能部分の相対的割合は、固体支持体上の相補的反応基に関するリンカーの相対的反応性を考慮すると、誘導体化反応のためのリンカーの比を適切に選択することにより制御され得る。例えば、切断可能リンカーおよび切断不能リンカーが支持体に対して等しく反応性である場合、１０：９０という切断可能リンカー：切断不能リンカー比を用いて、誘導体化支持体を生成し、ここで、１０％の結合したタグ相補体は支持体から切断可能である。同様に、３０：７０という比を用いて、誘導体化支持体を生成し得る。ここで、タグ相補体の３０％が切断可能である。必要であれば、あまり反応性でないリンカーの相対的割合を増加させて、より高い反応性の他のリンカー型をオフセットし得る。
【００７９】
例えば、実施例１に記載のプロトコルにおいて、エチレンジアミンで誘導体化したグリシダル（ｇｌｙｃｉｄａｌ）メタクリレート／エチレンジメタククリレート（９５／５）架橋ビーズを、標準的なホスホルアミダイト反応化学により、１０：９０のモル比の切断可能リンカー：切断不能リンカーと同時に反応させた。この反応によって、両リンカーが固体支持体上のアミノ基に結合して、ホスホルアミダイト連結を形成させ得、これは、後に酸化させて安定なホスホルアミダイト基を形成し得る（図１）。切断可能リンカー（これは、２−［２−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）−エチルスルホニル］エチル−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイトとして支持体上に導入され得る）は、酸性条件および酸化的条件に安定なジ（２−オキシエチル）スルホン部分を含み、そしてオリゴヌクレオチド合成の間にインタクトなままであるが、図１に示されるように、塩基触媒による切断を受けやすい。図１の切断不能リンカー（これは、９−Ｏ−ジメトキシトリチル−トリエチレングリコール，１−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイトとして支持体に付加され得る）は、オリゴヌクレオチド合成条件および切断可能リンカー部分を切断するために用いられ得る塩基性条件に安定なポリエチレンオキシドリンカーを含む。
【００８０】
タグ相補体を含むオリゴヌクレオチドを、適切な反応条件を用いてリンカー誘導体化支持体に付加する。広範に種々の合成ストラテジーが当該分野で開発され、そして記載される（例えば、Ｇａｉｔ，１９９０（前出）および上記で引用された他の合成の参考文献）。現在では、固相ホスホルアミダイト法が好ましい。なぜなら、これは、約９９％以上のカップリング収率をもたらすからである。好ましくは、合成は、効率的な合成をもたらす任意の種々の市販の機器および試薬を用いて自動化される。
【００８１】
タグ相補体に相補的なタグレパートリーの調製を容易にするために、固定化されたタグ相補体オリゴヌクレオチドは、好ましくは、各オリゴヌクレオチドにおけるタグ相補体配列に隣接する第１のプライマーセグメントおよび第２のプライマーセグメントを含む。従って、支持体へのリンカーの結合の後に、第１のプライマー配列は、好ましくは、代表的には、このリンカーに対する適切なモノマーの連続的付加により、リンカーに付加される。実施例１に記載されるプロトコルにおいて、配列５’−ＴＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴＧＧＴＣＴＣＡＣＴＧＴＣＧＣＡ−３’（配列番号１）を有するプライマーセグメントを、３’から５’方向で、ホスホルアミダイト−ホスホトリエステル化学を用いて、連続的モノマー付加により付加される。あるいは、プライマーセグメントは、別々に合成され得、そして１回のカップリング反応においてこのリンカーに結合され得る。好ましくは、このリンカーおよび任意の結合したプライマー配列は、共に、少なくとも１０鎖原子のストレッチを含むスペーサー部分を提供して、支持体の表面からの、および支持体上の他のタグ相補体からのタグ相補体セグメント（すぐ下で議論される）の分離を補助する。好ましくは、スペーサー（必要に応じたプライマー結合配列を含む）は、１０〜３０ヌクレオチドの長さを有する。スペーサー部分の存在は、タグ相補体が、選別するためにタグ相補体配列とのハイブリダイゼーションに容易に利用しやすいことを確実にするために特に有用である。
【００８２】
各オリゴヌクレオチドのタグ相補体配列は、モノマーもしくはモノマーのブロックの連続的付加により、またはタグ相補体の別々に合成されたレパートリーの同時結合により付加され得るが、モノマーの連続的な付加が好ましい。レパートリーは、当該分野で公知の写真平版法またはロボット利用分配（ｒｏｂｏｔｉｃ ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ）方法（前出）により、平面アレイ上に形成され得る。ビーズまたは粒子上に形成されるレパートリーについては、タグ相補体配列は、好ましくは、ＢｒｅｎｎｅｒによりＰＣＴ公開ＷＯ９６／４１０１１に記載されるように、分割および混合（ｓｐｌｉｔ ａｎｄ ｍｉｘ）アプローチを用いてコンビナトリアルに形成される。簡潔には、複数の異なる、最小限に交差ハイブリダイズする（ｃｒｏｓｓ−ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）オリゴヌクレオチドの「ワード（ｗｏｒｄ）」配列は選択され、これは、合成されたタグ相補体だけが選択されたハイブリダイゼーション条件下でそれらの対応する相補体タグに確実にハイブリダイズし得るように（すなわち、任意の不正確にハイブリダイズしたタグおよびタグ相補体のレベルがほんのわずかであるように）設計される。
【００８３】
実施例１に記載のプロトコルにおいて、各タグ相補体配列は、８「ワード」の直鎖状ストリングからなり、各々、８つのテトラマーワードの同じセットから選択される。プライマー誘導体化ビーズは８つのアリコートに分けられ、これは、自動化合成機の８つの別個の合成カラムにロードされる。各カラムにおいて、この８つの可能なワードから選択された異なるワードは、適切なモノマーの連続的付加によりビーズに付加される。各カラムにおける第１のワードの合成が完了した後、８つのカラムからのビーズが合わされ、均一になるまで穏やかに混合される。混合後、このビーズ混合物は、再び等しいアリコートに分けられ、これは、別のサイクルのワード付加のために８つのカラムにロードされる。ワード付加の計８サイクルを行って、計８8（ほぼ１．７×１０7）の異なる可能なタグ相補体配列を有するビーズを生成する。分割および混合プロトコルは、確実に各ビーズが実質的に均一な、同じ配列のオリゴヌクレオチドの集団を含むようにする（すなわち、特定のビーズ上のオリゴヌクレオチドが実質的に同じ配列を有する）。
【００８４】
必要であれば、固定化タグ相補体の配列は、任意の公知の配列決定法により固相支持体上で直接決定され得る。好ましくは、タグ相補体は、タグ相補体配列の３’側にユニバーサルプライマー結合配列を含み、そのために、このタグ相補体は、相補体配列決定プライマーをアニーリングおよび伸長することによって、Ｓａｎｇｅｒのジデオキシ配列決定法により配列決定され得る。しかし、通常は、この方法は、固定化タグ相補体の配列が公知である場合は必要ではない。
【００８５】
タグ相補体配列の付加後、さらなるヌクレオチド残基が、第２のプライマー配列、１つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位および／または他の所望の特徴を取り込むために追加される。例えば、実施例１に記載のプロトコルにおいて、ヘキサマーブロックのＧＧＧＣＣＣがタグ相補体に追加されて、（１）タグ相補体セグメントがハイブリダイゼーションの間にその対応する相補的タグに結合することを補助する、（２）タグ相補体セグメントの末端を規定する、および（３）ベクターへのその後の連結のためにＢｓｐ１２０Ｉ制限部位を導入する。以下でさらに議論されるように、必要に応じた増幅のために第２のプライマー配列（プライマー２）の付加が後に続く。
【００８６】
従って、好適な実施形態において、タグ相補体配列を含む固定化されたオリゴヌクレオチドは、以下の特徴を含む：
［支持体］−［連結部分］−［スペーサー］−［タグ相補体］−［末端セグメント］
ここで、この連結部分は、上記で議論されたように、切断可能または切断不能のいずれかであり、スペーサーセグメント（好ましくは、１０〜３０ヌクレオチドの長さを有する）は、必要に応じて、（１）エンドヌクレアーゼ制限部位、および／または（２）ユニバーサルプライマー結合配列を含み、タグ相補体セグメント（好ましくは、１２〜６０、１８〜４０、または２５〜４０ヌクレオチドの長さを有する）は、上記で議論された特徴を有し、そして末端セグメント（好ましくは、０〜４０ヌクレオチド、または１０〜３０ヌクレオチドの長さを有する）は、必要に応じて、（１）第１の制限部位と同じか、またはそれと異なり得るエンドヌクレアーゼ制限部位、および（２）スペーサーにおける任意のプライマー結合配列の相補体と同じか、またはそれと異なり得るユニバーサルプライマー配列を含む。１つの好適な実施形態において、各オリゴヌクレオチドにおけるタグ相補体配列は、同じか、または異なり得る第１および第２のエンドヌクレアーゼ制限部位に隣接して、選択されるベクターへのその後の連結を容易にする。
【００８７】
オリゴヌクレオチド合成が完了した後、このオリゴヌクレオチドは、必要であれば脱保護され、そしてタグ相補体レパートリーの一部は、切断可能連結部分のみを選択的に切断する一方で、切断不能連結部分はインタクトなままであるように、適切な反応条件を用いて支持体から切断される。
【００８８】
簡便に、切断工程および任意の脱保護工程は、１つの試薬で同時に行われる。例えば、切断可能連結部分および１つ以上の保護基が塩基に不安定である場合、次いで支持体を塩基で処理して保護基を除去し、そして支持体から切断可能オリゴヌクレオチドを切断する。もちろん、脱保護および切断工程はまた、別々に行われ得る。
【００８９】
切断されたオリゴヌクレオチド混合物は、以下でさらに議論されるように、選択されたクローニングベクターに直接挿入され得る。しかし、この混合物は、好ましくは精製されて、任意の従来法を用いて失敗した配列および他の外来物質が除去される。例えば、この混合物は、公知の方法により、イオン交換クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーを用いたＨＰＬＣによって迅速かつ簡便に精製され得る。電気泳動的分離もまた使用され得る。逆相クロマトグラフィーについては、合成されたオリゴヌクレオチドは、好ましくは、吸着剤に対するトリチル化オリゴヌクレオチドの優先的な吸着を容易にするように、疎水性基（例えば、トリチルまたはジメトキシトリチル（ＤＭＴ））を含む。その一方で、非トリチル化配列（失敗したカップリング工程から生じる）は、カラムにより実質的に保持されない。代表的には、所望のオリゴヌクレオチド混合物は、幅広いピークとして溶出（または移動）する。なぜなら、異なるＧ／Ｃ含量および分布を有する非常に幅広いスペクトルの配列が存在するからである。この混合物は、エタノール溶出などによりさらに精製され得、そして得られる混合物は、好ましくは、０℃未満で、乾燥状態または安定な貯蔵媒体中で保存され得る。オリゴヌクレオチド配列の完全性は、混合物の個々のメンバーをランダムに配列決定することにより評価され得る（通常は、この混合物がクローニングベクターに挿入された後）。
【００９０】
目的のサンプルオリゴヌクレオチドへのその後の結合については、切断されたオリゴヌクレオチドは、好ましくは、１つ以上のクローニングベクターに挿入されて、タグベクターライブラリーが形成される。任意の型の複製可能ベクター（例えば、プラスミド、ファージミド、コスミドなど）が用いられ得、これは、適切な宿主中で増殖され得る。このベクターは、一本鎖または二本鎖であり得る。種々の適切なベクターは、商業的供給元から入手可能である（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＧｉｂｃｏＢＲＬなど）か、または文献中に記載されている。このベクターは、一般的に、外来ＤＮＡを挿入するための１つ以上の制限部位、１つ以上の選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性）、必要に応じて、挿入部位の上流にユニバーサルプライマー配列（インサートを配列決定するため）、および適切な宿主中でベクターを増殖するための任意の必要な成分を含む。好ましくは、このベクターは、オリゴヌクレオチドタグを挿入するための第１の制限部位、およびタグに対して近位にサンプルフラグメントを挿入するための、第１の部位に直ぐ隣接する第２の制限部位を含む。あるいは、サンプルフラグメントを挿入するための制限部位は、タグセグメントに直ぐ隣接するエンドヌクレアーゼ部位を含むタグオリゴヌクレオチドを介してベクターに導入され得る。
【００９１】
二本鎖ベクター中への挿入のために、この切断されたオリゴヌクレオチドは、好ましくは、任意の適切な手段によって、このオリゴヌクレオチドにおける汎用３’−プライマーセグメントに相補的なプライマーをアニーリングさせ、そしてこのプライマーを伸長することによって、二本鎖形態に変換される。この二本鎖産物は、対応するタグ相補配列と完全に塩基対合するタグ配列を含む。代表的には、このアニーリングしたプライマーは、ｄＮＴＰの混合物の存在下で、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、３’方向に伸長される。ベクター中への挿入についての二本鎖オリゴヌクレオチドの量を増加させるために、このオリゴヌクレオチド混合物は、所望の量の二本鎖産物が得られるまで、タグ相補配列に隣接するプライマー結合配列にアニーリングする、一対のプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅され得る。
【００９２】
二本鎖タグオリゴヌクレオチド混合物は、標準的な連結技術によって（例えば、平滑末端または粘着末端の連結によって）ベクター中に挿入され得る。代表的には、ベクターおよびオリゴヌクレオチドの混合物は、付着末端を有する産物を生成するために、各々、１以上の制限酵素と別々に処理される。好ましくは、ベクターおよびオリゴの混合物は、インサートの取り込みなしにベクターの再連結を低減することを補助するために、２つの異なる粘着末端を有する産物を生成する２つの異なる制限酵素で、各々、別々に処理される。切断されたベクターはまた、インサートを含まないベクターの自己連結（ｓｅｌｆ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）を阻害する仔ウシ腸アルカリホスファターゼで、処理され得る。例えば、実施例２Ｄにおいて、オリゴヌクレオチド混合物およびベクターは、ＰａｃＩおよびＢｓｐ１２０Ｉで、各々、処理される。切断されたベクター由来のより大きなフラグメントは、仔ウシ腸ホスファターゼで処理され、次いで、リガーゼの存在下で制限されたオリゴヌクレオチド混合物と反応され、タグベクターの混合物を形成する。
【００９３】
次いで、連結産物は、タグベクターライブラリーを作製するために、適切な宿主を形質転換するために使用され得る。形質転換体は、所望の数の形質転換体が収集されるまで培養される。一般には、形質転換体の数は、タグレパートリーの高い割合のメンバーのサンプリングを保障するために、このレパートリーの複雑性を超えるべきである。好ましくは、形質転換体の量は、タグベクターライブラリーにおける少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、およびより好ましくは９９％のレパートリーよりも多くの存在を保障するに十分である。
【００９４】
本発明のタグベクターライブラリーは、多数のサンプルオリゴヌクレオチドフラグメントを同時かつ独特にタグ化するために有用であり、その結果、タグ化されたオリゴヌクレオチドは、さらなるプロセシングまたは分析のために、タグ相補体のアレイ上に選別され得る。従って、タグベクターは、各ベクターにおけるタグ配列に隣接する部位にて、異なるフラグメントを挿入するに効果的な連結条件下で、タグベクターライブラリーと異なるポリヌクレオチドフラグメントの混合物とを組み合わせることによって、タグ化されたポリヌクレオチドフラグメントのライブラリーを形成するために使用され得、その結果、各サンプルフラグメント（図２におけるＳn）は、異なるタグ（Ｔn）と会合する。このようなタグベクターライブラリーの１つのメンバーは、図２における構築物２によって表される。好ましくは、タグベクターライブラリーの複雑性は、２以上の異なるサンプルフラグメントと会合した同じタグの可能性を低減することを補助するように、サンプルの複雑性を超える。
【００９５】
例えば、実施例２Ｄにおいて、タグベクターライブラリーｐＢＰ９をＢｂｓＩおよびＢａｍＨＩで消化して、ＢｂｓＩ部位に隣接するタグ配列（２０ヌクレオチド以内）を有する、大きなベクターフラグメントを作製した。このベクターフラグメントをホスファターゼで処理して、５’−リン酸基を除去し、そしてＢｂｓＩ／ＢａｍＨＩ粘着末端を有するオリゴヌクレオチドサンプルの混合物（ｃＤＮＡ）を、連結によって、ベクター中に挿入した。この連結混合物を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を形質転換し、そしておよそ１．６×１０5のクローンを含むアリコートを使用して、このライブラリーを拡大するために液体培養物を接種した。プラスミドＤＮＡを、これらの培養物から抽出し、そして貯蔵した。
【００９６】
ライブラリー中のタグ化サンプルオリゴヌクレオチドからのタグ化ポリヌクレオチドは、任意の所望の方法によって処理または分析され得る。検出を容易にするために、タグ化ポリヌクレオチドは、同時増幅のために汎用プライマー対を使用するＰＣＲによって増幅され、続いてテンプレートおよび増幅試薬から、所望の産物を、必要に応じて精製し得る（実施例２Ｅ）。タグが、一本鎖または二本鎖のタグ相補体を結合するために、一本鎖形態で使用されるべきである場合、このタグ鎖は、所望のタグ鎖の変性および収集によって、例えば、ストレプトアビジン支持体上のビオチン化タグ鎖の固相での捕捉によって、それらの相補鎖から分離され得る。あるいは、相補鎖を、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性または３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼを使用して、タグ相補領域中に含まれない選択されたｄＮＴＰの存在下で、除去し得、その結果、このエキソヌクレアーゼは、このタグ相補体の末端で効果的に停止する。例えば、タグ配列がＡ塩基、Ｃ塩基、およびＴ塩基を含むが、Ｇを含まない場合、この相補配列は、Ｔ、ＧおよびＡを含むが、Ｃを含まない。ＣＴＰの存在下でのエキソヌクレアーゼの使用は、第１のＣが相補配列に達するまでに、この相補配列から除去するために効果的である。
【００９７】
タグ化されたオリゴヌクレオチド（タグ化されたオリゴヌクレオチドフラグメントとしても既知）は、上記で議論されるような、または実施例２Ｅにおいて例示されるような、適切なハイブリダイゼーション条件下で、固定されたタグ相補レパートリーにハイブリダイズされる。固体支持体が粒子またはビーズを含む場合、この粒子またはビーズは、ハイブリダイゼーション、続いて洗浄工程を容易にする一定の攪拌で、タグ化されたオリゴヌクレオチドの存在下でインキュベートされ得る。低い割合のビーズのみが相補性タグとハイブリダイズされる場合、ハイブリダイズされたビーズは、任意の適切な方法によって（例えば、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）によって）ハイブリダイズしていないビーズから分離され得る。この目的のために、タグ化されたポリヌクレオチドは、好ましくは、ハイブリダイズされたタグ化ポリヌクレオチドの検出を容易にするために、蛍光標識（例えば、ＰＣＲプライマーを介して）のような、検出可能な標識を含む。
【００９８】
固定化されたタグ相補体レパートリーへのハイブリダイゼーションの後に、タグ化されたポリヌクレオチドは、任意の適切な方法に従って分析され得る。例えば、固定化されたタグ化ポリヌクレオチドは、例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／１２６７８（ＷＯ９６／１２０３９）および国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３６７８（ＷＯ９５／２７０８０）により教示されるように、サイクル配列決定による標識伸長生成物を作製するために、例えば、テンプレートとして固定化されたポリヌクレオチドを使用して、配列決定され得る。あるいは、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドは、既知の溶液相方法に従って、支持体から変性され、そして配列決定され得る。
【００９９】
本発明はまた、配列の分析または定量のために、固体支持体上に異なるｃＤＮＡを選別するために有用である。例えば、タグは、異なるサンプルに由来する転写物レベルにおける変化を特徴づけするために、ディファレンシャルディスプレイ実験を行うために使用され得る（例えば、異なる細胞および組織型、疾患状態などの特徴づけのため）。本発明はまた、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／１６３４２（ＷＯ９７／１３８７７）に開示されるような種々の化合物の毒性を決定するために使用され得る。
【０１００】
タグ化分子がポリペプチドである場合、固定化されたポリペプチドは、例えば、特定のポリペプチド種を同定する標的特異的抗体での処置によって、さらに特徴づけられ得る。タグ−ペプチド結合体の合成は、例えば、ＷＯ９６／１２０１４ １４頁に記載される。
【０１０１】
本発明のタグおよびタグ相補体レパートリーについてのさらなる使用は、例えば、ＷＯ ９５／２７０８０；ＷＯ ９６／１２０１４；ＷＯ９６／１２０３９；ＷＯ ９６／１３８７７；ＷＯ ９６／４１０１１；およびＷＯ ９７／４６７０４（これらは、本明細書中に参考として援用される）に開示され、これらには、分子、ＤＮＡ配列決定、ｍＲＮＡフィンガープリントなどのクラスまたは亜集団を、トラッキング（ｔｒａｃｋｉｎｇ）、同定、または選別することが挙げられる。
【０１０２】
本発明は、以下の実施例を鑑みてさらに理解され得る。これらの実施例は、本発明の範囲を制限するようにいかなる様式においても意図されない。
【０１０３】
（実施例１）
（タグ相補体の合成）
全ての市販の化学物質は、合成品質であり、そしてさらなる精製なしに使用した。オリゴヌクレオチド合成を、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｆｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｄｉａｎａからの、５．６μｍアミノ誘導化ポリマービーズ（エチレンジアミンで誘導体化された９５％グリシダルメタクリレート（ｇｌｙｃｉｄａｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）／５％エチレンジメタクリレート））を使用するＧＥＮＥ ＡＳＳＥＢＬＥＲ ＰＬＵＳ−ＳＰＥＣＩＡＬ／４ ＰＲＩＭＥＲＳ合成機（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して行った。これらのビーズは、１ビーズあたり約１０7アミノ基のアミノ基密度を有すると推定された。Ｐｈａｒｍａｃｉａからの合成カラムに供給された２５μｍポリプロピレンフィルターに加えて、ＧＦＡガラスフィルターマット（Ｗｈａｔｍａｎ）を、各々の合成カラムの端に加えて、これらのビーズの保持を改善した。あるいは、合成カラムを、これらのビーズを保持するために、各々の端にて２μｍ孔サイズＰＥＥＫフィルターを保有するネジキャップ端を有するステンレス鋼チューブ（１〜５ｍｍの長さ×０．７５インチの直径）から構築した（５ｍｍの長さを有するカラムは、約６００ｍｇのビーズの容量を有する）。
【０１０４】
４．８ｍｇのアミノ誘導体化ビーズを、８つの合成カラムの各々に充填した（各々が、６００ｍｇのビーズを含む）。切断リンカー部分を形成するために、２５０ｍｇの５’−ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ−ＯＮ試薬（２−［２−４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）−エチルスルホニル］エチル−（２−シアノ−エチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイト（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号５２１０−２から）を、３．８ｍＬの無水アセトニトリル中に溶解し、０．１Ｍの濃度を得た。非切断リンカー部分を形成するために、２５０ｍｇのＳＰＡＣＥＲ ＰＨＯＳＰＨＯＲＡＭＩＤＩＴＥ（９−Ｏ−ジメトキシトリチルートリエチレングリコール、１−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイト、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから、カタログ番号５２６０−３）を、別々に、３．８ｍＬの無水アセトニトリル中に溶解し、０．１Ｍの最終濃度を得た。これらの２つの溶液を、１つの比率にて合わせて、任意の所望される％切断性を提供した。例えば、１０％の切断性を達成するために、１部のＰＨＯＳＰＨＡＴＥ−ＯＮ溶液（例えば、２００μＬ）を、乾燥ビンにおいて、９部のＳＰＡＣＥＲ ＰＨＯＳＰＨＯＲＡＭＩＤＩＴＥ（例えば、１８００μＬ）と合わせ、次いで、ＧＥＮＥ ＡＳＳＥＭＢＬＥＲ ＳＰＥＣＩＡＬ ＰＲＩＭＥＲＳ ４装置上の延長（ｅｘｔｒａ）ホスホルアミダイトポートに取り付けた。全ての移動を、シリンジを用いて行い、そしてこのボトルに、空気中の水蒸気への曝露を最小化するため、アルゴンを適用（ｂｌａｎｋｅｔ）した
ビーズへのリンカー（切断可能および非切断可能）の付加の後、以下のＤＮＡ配列（プライマー１、配列番号１）を、ホスファイトトリエステル（ホスホルアミダイト）法（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ、１９９０、特に第３章）を使用して、以下の保護モノマー：Ｔ（非保護）、ＡおよびＣ（ベンゾイル）、およびＧ（イソブチリル）：
【０１０５】
【化２】
【０１０６】
次に、異なる「ワード」配列を、ホスホルアミダイト合成によって、適切なモノマーの連続付加により、各カラムにおいてプライマーテンプレート配列に付加した。その８つのワードの配列は、以下であった：
１）５’−ＣＴＴＴ （配列番号２０）
２）５’−ＴＡＣＴ （配列番号２１）
３）５’−ＡＣＡＴ （配列番号２２）
４）５’−ＡＡＴＣ （配列番号２３）
５）５’−ＴＴＡＣ （配列番号２４）
６）５’−ＴＣＴＡ （配列番号２５）
７）５’−ＡＴＣＡ （配列番号２６）
８）５’−ＣＡＡＡ （配列番号２７）。
【０１０７】
第１のワード付加工程の完了後、ビーズをカラムから収集し、ともに混合し、そしてカラムに再びロードし、その後、異なる「ワード」配列各々を、上記のようなホスホルアミダイト合成により８つのカラムに別々に再び付加し、続いてビーズを収集し、再混合し、そしてカラムに再ロードした。ワードの付加およびビーズの混合／分割というこのサイクルを、合計８回実施して、約１．７×１０7（＝８8）個の異なるオリゴヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチドライブラリーを作製した。このコンビナトリアル合成が完了した後、配列５’−ＣＣＣ−３’（トリチルオン（ｔｒｉｔｙｌ−ｏｎ））をビーズに付加して、以下の一般式（配列番号２）を有する固定されたオリゴヌクレオチドの混合物を生じた。：
【０１０８】
【化３】
【０１０９】
このビーズの残りの部分（０．５ｇ＝１０％）を適切なホスホルアミダイトモノマーと反応させて、配列５’−ＣＣＴＴＡＧＧＧ−３’（プライマー２、トリチルオン、配列番号３）を付加し、続いてアンモニア（２ｍＬ）を５５℃にて１２時間用いて脱保護した。このアンモニア処理もまた、切断可能なリンカーを切断してこのビーズからオリゴヌクレオチドのうちの１０％を解離させるのに有効であった。ビーズを遠心分離により除去し、そして残存するアンモニア溶液を、もとの容量の半分にまで真空により濃縮した。この混合物中の切断されたオリゴヌクレオチドは、以下の一般式（配列番号４）を有した。：
【０１１０】
【化４】
【０１１１】
（実施例２）
（タグのクローニングおよび調製）
（Ａ．プラスミドクローニングベクター）プラスミドクローニングベクターｐＬＣＶ２を、以下のオリゴヌクレオチドを使用して、以下のようにしてプラスミドベクターｐＢＣ．ＳＫ-（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から作製した。：
【０１１２】
【化５】
【０１１３】
オリゴＳ−７８５およびＳ−７８６をキナーゼ処理し、ともにアニールさせ、そしてＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化しかつ仔ウシ腸アルカリホスファターゼを用いて処理したプラスミドｐＳＷ１４３．１に連結して、プラスミドｐＳＷ１６４．０２を作製した。
【０１１４】
オリゴヌクレオチドＳ−９６０、Ｓ−９６１、Ｓ−９６２およびＳ−９６３をキナーゼ処理し、ともにアニールさせて、４つのオリゴヌクレオチドからなる二重鎖を形成させた。プラスミドｐＳＷ１６４．０２をＸｈｏＩおよびＳａｐＩを用いて消化した。この消化したＤＮＡを、アガロースゲル上で電気泳動し、そして約３０４５ｂｐの産物を、適切なゲルの切片から精製した。プラスミドｐＵＣ４Ｋ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから）をＰｓｔＩを用いて消化し、そしてアガロースゲルにて電気泳動した。約１２４０ｂｐの産物を、適切なゲルの切片から精製した。この２つのプラスミド産物（ｐＳＷ１６４．０２およびｐＵＣ４Ｋ由来）を、Ｓ−９６０／９６１／９６２／９６３二重鎖とともに連結して、プラスミドｐＬＣＶ１を作製した。
【０１１５】
アデノウイルス５（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）由来のＤＮＡを、ＰａｃＩおよびＢｓｐ１２０Ｉを用いて消化し、仔ウシ腸アルカリホスファターゼを用いて処理し、そしてアガロースゲルにて電気泳動した。約２８５３ｂｐの産物を、適切なゲルの切片から精製した。このフラグメントを、ＰａｃＩおよびＢｓｐ１２０Ｉを用いて消化したプラスミドｐＬＣＶ１に連結して、プラスミドｐＳＷ２０８．１４を作製した。
【０１１６】
プラスミドｐＳＷ２０８．１４を、ＸｈｏＩを用いて消化し、仔ウシ腸アルカリホスファターゼを用いて処理し、そしてアガロースゲルにて電気泳動した。約５３７４ｂｐの産物を、適切な切片から精製した。このフラグメントを、（キナーゼ処理しそしてともにアニールさせた）オリゴヌクレオチドＳ−１１０５およびＳ−１１０６に連結して、プラスミドｐＬＣＶ２を作製した。このプラスミドは、以下のエレメント（配列番号１５）を含んだ。：
【０１１７】
【化６】
【０１１８】
【化７】
２００μＬ ベクター（２０μｇプラスミドから開始して得られる合計）
ＸμＬ インサート（ＰａｃＩ／Ｂｓｐ１２０Ｉ消化物）
５０μＬ １０×連結緩衝液
５０μＬ １０ｍＭ ＡＴＰ
ＹμＬ 水
１０μＬ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（２，０００，０００ Ｕ／ｍＬ）
→最終容量＝５００μＬ。
【０１１９】
この連結混合物を、１６℃で一晩インキュベートし、続いて、１容量（５００μｌ）のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）で２回、クロロホルムで１回抽出し、続いてエタノール沈殿した。遠心分離、洗浄、そして乾燥後、このペレットを、５０μＬ水に再懸濁した。エレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞（８０〜１００μＬの細胞）の数個のバイアルの各々の中に、１〜２μＬの連結産物を添加した。以下の条件を、エレクトロポレーションのために使用した：冷却した０．１ｃｍエレクトロポレーションキュベット中で、２００ｏｈｍ、２５μＦ、１８００Ｖ。エレクトロポレーションの直後、１ｍＬのＳＯＣブロス（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、ＳＯＣ培地の補遺Ａ．２において）を添加し（室温）、そしてこの混合物を、１５ｍＬ Ｆａｌｃｏｎチューブに移し、そして２２０ｒｐｍ、３７℃で１時間振盪した。次いで、各形質転換混合物を、振盪フラスコ中で５０ｍＬの予熱したブロス（ＴＢまたはＬＢ＋クロラムフェニコール）に添加した。力価を決定するために、各形質転換体の少量のアリコート（５μＬのニートまたは希釈した）を、３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天プレート上にプレートして力価を決定した。一方残りを、液体培養物へ接種し、そしてインキュベーターで一晩浸透した。形質転換を、独立した形質転換体（クローン）の総数が、希釈分析に基づいて約１．７×１０8であると推定されるまで反復した。形質転換体のこの量は、８ワードの全体長さ（８8＝１．７×１０7）を有するタグ配列を生成するために８つの異なる力価「ワード」配列のランダムな組合せ結合によって生成される、可能なタグ改変体の１０倍量に等しい。プラスミドＤＮＡ（ｐＢＰ９）を、この培養物から抽出し、そしてプールした。この培養物は、類似の力価を有する場合にのみプラスミド単離の前に組み合わせられ得ることに留意すること。そうでなければ、プラスミドを、別々に単離し、次いで、これらの力価に比例して一緒に混合した。約１．５ｍｇのｐＢＰ９を得た。
【０１２０】
（Ｃ．ポリ（Ａ）+ＲＮＡ単離）
ポリ（Ａ）+ＲＮＡ（５×１０7細部から約３０μｇ）を、供給業者によって推奨されるように、ＦａｓｔＴｒａｃｋキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＴＨＰ細胞から抽出した。ポリ（Ａ）+ＲＮＡ（５×１０7細胞から約１５μｇ）を、ＮｏｖａｇｅｎからのＳＴＲＡＩＧＨＴ Ａ’ｓ ｍＲＮＡ単離システムを使用して酵母細胞から抽出した。ｃＤＮＡ合成のために、ポリＡ ＲＮＡのエタノール懸濁物を、冷脚微小遠心において、最高速度で３０分間遠心分離した。この上清を取り除き、そして破棄し、その後このペレットを短時間再遠心分離し、そしてこの上清を、ピペットによって注意深く取り除いた。このチューブの側面を、０．７５ｍＬの７０％エタノールで注意深く洗浄し、続いて２０分間遠心分離した。この上清を、先の通りに取り除き、すべての液体が取り除かれたことを確認した。ＲＮＡペレットを、ＤＥＰＣ処理水中に再懸濁した（３２ｍＬを、５×１０7の哺乳動物細胞由来のｍＲＮＡのために使用し；さもなければ、この容量を調節した）。得られた溶液を、チューブの底にスピンさせ、そして氷上に置いた。ＲＮＡ濃度を、２６０ｎｍでの１．０吸光度単位（Ａ２６０）＝４０μｇ／ｍＬ ＲＮＡと仮定して、水での希釈によって評価した（Ａ２６０／Ａ２８０比は、２．０であるはずである）。すべての時間でグローブを着用して、ヌクレアーゼ夾雑を回避した。
【０１２１】
（Ｄ．ｃＤＮＡライブラリー構築）
第１鎖ｃＤＮＡおよび第２鎖ｃＤＮＡを、以下の特注プライマーを第１鎖合成のために使用することを除いては、ＲＮＡｓｅを含まないチューブを使用し、供給業者によって推奨されるようにｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して合成した（ＲＴプライマー、配列番号１７）：
【０１２２】
【化８】
２．２５μＬ １０×第１鎖緩衝液
１．３５μＬ 第１鎖メチルヌクレオチド混合物
１．０μＬ ＲＴプライマー（５０ｐｍｏｌ／μＬ）
ｎμＬ ＤＥＰＣ処理水（ｎは、以下のように算出した）
０．４５μＬ ＲＮａｓｅブロックリボヌクレアーゼインヒビター（４０Ｕ／μＬ）。
【０１２３】
得られた混合物をすばやく動かし（ｆｌｉｃｋ）て成分を混合し、次いで、チューブの底にスピンさせた。この混合物に、上記（ｍμＬ）から２．５μｇのポリ（Ａ）+ＲＮＡを添加した。ここで、ｍは、２．５μｇのＲＮＡを含む容量であり、そしてｎ（ＤＥＰＣ処理水の容量）を生じるように算出して、最終容量２１．８μＬを生成した（ｎ＋ｍ＝１６．８μＬ）。この混合物に、０．７μＬ ＭＭＬＶ逆転写酵素（５０Ｕ／μＬ）を添加した。この混合物を穏やかにボルテックスまたはすばやく動かし、次いで、チューブの底にスピンさせた。この混合物を、ヒートブロックまたはＰＣＲ機械中で３７℃で６０分間インキュベートし、次いで、氷上に置いた。
【０１２４】
第２鎖ｃＤＮＡ合成のために、第１鎖ｃＤＮＡ産物（２２．５μＬ）を氷上に置き、そして以下の成分を、順番に添加した：
１００μＬ １０×第２鎖緩衝液
３μＬ 第２鎖ヌクレオチド混合物
５７．０μＬ 滅菌水（非ＤＥＰＣ処理）
１．０μＬ α−32Ｐ−ｄＡＴＰ（１０μＣｉ／μＬ、２週間よりも古くない）。
この混合物をすばやく動かしてこの溶液を混合し、次いで、短時間スピンダウンさせ、続いて氷上で５分間平衡化させてヘアピン構造の数を減少させた。次に、以下の酵素を添加した：
１．０μＬ ＲＮＡｓｅ Ｈ（１．５Ｕ／μＬ）
５．５μＬ ＤＮＡポリメラーゼＩ（９．０Ｕ／μＬ）。
得られた溶液を短時間混合し、そして１６℃を超える温度にせずに、短時間回転させた。この混合物を、１６℃で１５０分間インキュベートし（それより長い時間ではない）、その後、この混合物を氷上に置いた。
【０１２５】
この反応チューブに、１００μＬ ＴＥ飽和フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を添加し、そしてこの混合物を、徹底的にボルテックスした。この混合物を、５分間遠心分離した。水（上）層を、注意深く取り出し、そしていかなる界面も回収することなく、新たなチューブに移した。１００μＬのクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を添加し、そしてこの混合物を、徹底的にボルテックスした。この混合物を、５分間遠心分離した。水層を回収し、そして先のように新たなチューブへ移し、そして１μＬの５Ｍ ＮａＣｌを添加し、そしてボルテックスした。
【０１２６】
得られた二本鎖ヘミメチル化ｃＤＮＡを、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＳＩＺＥＳＥＰ ４００カラム（カタログ番号２７−５１０５）上でサイズ分画した。このカラムを、スピンカラム中にＳＩＺＥＳＥＰゲルを置くことによって、ＳＴＥ緩衝液（１×ＳＴＥ＝１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）中で平衡化させ、そしてこのゲルベッドの上部に達するまで緩衝液を排出させ、続いて２ｍＬ ＴＢＥ中にゲルベッドを懸濁し、そしてこのゲルベッドの上部まで緩衝液を排出させ、そしてＴＢＥ懸濁工程および排出工程を２回以上繰り返した。このカラムを、乾燥を避けるために使用まで両端でキャップした。使用の直前、このキャップを取り除き、そしてこのカラムを約４００×ｇで２分間、短時間回転させて、このゲルを密にし（ｃｏｍｐａｃｔ）、そして過剰の緩衝液を除去した。次に、ｃＤＮＡサンプルを、ゲルベッドの上部で平滑な表面の中央に、注意深くかつゆっくりアプライし、その結果、このサンプルは、このゲルの側面を通過して、または亀裂を通じては流れなかった。このカラムを、Ｆａｌｃｏｎ ２０５９チューブへ置き、その結果、このカラムの下部の先端を、キャップのない１．５ｍＬ遠心分離チューブのチップ上に置いて、カラム溶出物を回収した。このカラムを、Ｆａｌｃｏｎチューブ中で約４００×ｇで２分間回転させ、その結果、合成プライマーおよび低分子ｃＤＮＡを、このカラム中に保持し、一方所望の長さのｃＤＮＡを、遠心チューブ中に収集した。収集したｃＤＮＡ混合物を、新たなキャップ付チューブに移した。収集したｃＤＮＡに、１μＬ ＰＥＬＬＥＴ ＰＡＩＮＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、０．１容量の３Ｍ ＮａＯＡｃ、および２．５容量のＥｔＯＨを（必要に応じて）添加した。得られた溶液を、−７０℃で少なくとも３０分間、または−２０℃で一晩保存した。二本鎖ｃＤＮＡ産物は、以下の式（配列番号１８）を有した：
【０１２７】
【化９】
【０１２８】
先のように、エタノール／ＮａＯＡｃ／ｃＤＮＡ溶液を冷却遠心分離において３０分間回転させ、そして７０％エタノールで洗浄した後、サイズ分画したｃＤＮＡを、１７０μＬ水、２０μＬ １０×ＤｐｎＩＩ緩衝液、および１０μＬ ＤｐｎＩＩ（１０Ｕ／μＬ）の溶液中にｃＤＮＡペレットを再懸濁することによりＤｐｎＩＩによって完全に消化し、続いて３７℃で２時間インキュベートした。
【０１２９】
ビオチン化フラグメントを、Ｄｙｎａｌ Ｍ−２８０ストレプトアビジンビーズを使用して精製した。ビオチン捕捉のための調製において、磁気ストレプトアビジンビーズを、ボルテックスすることによって再懸濁し、そして１００μＬビーズ（１ｍｇ）を新鮮な１．５ｍＬ遠心チューブに移した。このチューブを、磁気粒子濃縮機（ＭＰＣ）中に少なくとも６０秒間置いて、このビーズを磁石に近いペレットにした。このチューブがＭＰＣにあったまま、この上清を取り除き、そして破棄した。このチューブに１００μＬの１×Ｂ＆Ｗ緩衝液（２×Ｂ＆Ｗ緩衝液＝２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および２Ｍ ＮａＣｌ）を添加し、そしてこの懸濁物をボルテックスして、ＭＰＣに置いて磁気ビーズを濃縮し、そしてこの上清を、先のように除去した。この洗浄手順を、２回以上繰り返した。上記の手順の間にビーズを乾燥させる時間はなかった。
【０１３０】
上記からのＤｐｎＩＩ消化物（２００μＬ）に、２００μＬの２×Ｂ＆Ｗ緩衝液を添加した。この混合物を、調製された磁気ストレプトアビジンビーズを含むチューブに移し、そしてこのビーズを、このビーズをすばやく動かすことによって再懸濁した。このチューブを、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ中、２５℃で３０分間インキュベートし、その結果、このビーズを、ビオチン捕捉を確実にさせるためにすべての時間で十分に懸濁した。次に、このチューブを、ＭＰＣ中に置き、そしてこの上清を回収し、そして−２０℃で保存した。このビーズを、４００μＬ×Ｂ＆Ｗ緩衝液で５回洗浄し、そしてこの上清を分析して、放射性数（ｃｏｕｎｔ）が、３回目または４回目の洗浄後に、ほとんどないかまたはまったく存在しないことを確認した。
【０１３１】
タグ化ｃＤＮＡフラグメントを除くために、以下の手段が実施された：
１．２０μＬの１０×ＮＥＢ３ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）および１６８μＬの水の混合物中にビーズを再懸濁する。
【０１３２】
２．２μＬのウシ血清アルブミン １００×ストック（１０ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加する。
【０１３３】
３．１０μＬのＢｓｍＢＩ（４Ｕ／μＬ）を添加する。
【０１３４】
４．５５℃で２時間、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ中でチューブを振盪する。従って、ビーズは、十分懸濁されたままである。
【０１３５】
５．７μＬのＢｓｍＢＩ １０×ストック溶液を添加し、そして５５℃でさらに１−２時間、チューブを振盪する。
【０１３６】
６．チューブをＭＰＣ中に６０秒間静置する。放出されたタグ配列を含む上清を回収する。
【０１３７】
７．２μＬのＰＥＬＬＥＴ ＰＡＩＮＴを添加する。２００μＬのフェノール／クロロホルムで一度、そして２００μＬのクロロホルムで一度抽出する。
【０１３８】
得られた水層に、２０μＬの３Ｍ ＮａＯＡｃおよび５００μＬのＥｔＯＨを加える。この混合物を、−２０℃で一昼夜または−７０℃で３０分保存する。次いでこの溶液を、少なくとも３０秒間微量遠心器にスピンした。この上清を除きかつ廃棄し、そして沈渣を、０．５ｍＬの７０％ＥｔＯＨで洗浄し、そして０．５ｍＬの７０％ＥｔＯＨ中で再遠心分離した。放出されたｃＤＮＡフラグメント混合物は、以下の定式を有する（配列番号１９）：
【０１３９】
【化１０】
【０１４０】
タグ化ｃＤＮＡ挿入物のベクターライブラリーを産生するために、連結されたベクター−挿入物混合物を、電気的形質転換受容性（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換するのに用いた。この形質転換の少量を、力価を決定するために３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢアガープレート上にプレートした。ライブラリーを広げるために、およそ１．６×１０5のクローンを含むアリコートを、液体培地を播種するのに用いた。プラスミドＤＮＡを、これらの培養物より抽出し、そして保存した。
【０１４１】
（Ｅ．タグ相補体を固定化するためのタグ化フラグメントのハイブリダイゼーション）
タグ化ＤＮＡ挿入物を、ハイブリダイゼーションによって取りこみ得るか、または上述のような固定化（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）タグ相補体の配列に分別し得た。
【０１４２】
好ましくは、このタグ化ｃＤＮＡ接合体を、以下のような従来のプロトコールを用いて、ベクターからＰＣＲによって増幅する。８つのＰＣＲ複製物の各々に関して、以下の反応成分を結合する：１μＬのベクターＤＮＡ（ライブラリーに１２５ｎｇ／μＬ、単一コロニーに１０9コピー）；１０μＬの１０×ＫＬＥＮＴＡＱ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）；０．２５μＬのビオチン化２０マー「前向き」ＰＣＲプライマー（１ｎｍｏｌ／μＬ）；０．２５μＬのＦＡＭ標識化２０マー「逆向き」ＰＣＲプライマー（１ｎｍｏｌ／μＬ）；１μＬの２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、および５−メチル−ｄＣＴＰ（総ｄＮＴＰ濃度 １００ｍＭ）；５μＬ ＤＭＳＯ；２μＬ ５０×ＫＬＥＮＴＡＱ酵素；および８０．５μＬの水（１００μＬの総容量に）。ＰＣＲ反応は、以下のプロトコールを用いて、ＭＪＲ ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、または同様のサーモサイクラーにおいて行われる：（１）９４℃で４分間；（２）９４℃で３０秒間；（３）６７℃で３分間；（４）８サイクルの工程２および３；（５）９４℃で３０秒間；（６）６４℃で３分間；（７）２２サイクルの工程５および６；（８）６７℃で３分間；ならびに（９）４℃で静置。
【０１４３】
８つのＰＣＲ混合物を、プールし、そして７００μＬのフェノールを室温で加える。結合混合物を、２０−３０秒間ボルテックスし、次いで３分間高速で遠心する（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ卓上遠心機、または同様の装置で１４，０００ｒｐｍ）。上清を、除去し、そして新しいチューブ内で７００μＬのクロロホルム（クロロホルム：イソアミルアルコールの２４：１混合物）と結合し、２０〜３０秒間ボルテックスし、そして１分間遠心分離し、その後上清を新しいチューブに移し、そして８０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウムおよび５８０μＬのイソプロパノールと結合する。２０分間の遠心後、上清を除き、そして１ｍＬの７０％エタノールを加える。エタノールを除いた後、混合物を５−１０分間遠心し、そして沈殿したＤＮＡを微量遠心機内で乾燥する。
【０１４４】
再撹拌後、ｃＤＮＡを、アビジン化磁石ビーズ（Ｄｙｎａｌ）上で、製造業者の推奨するプロトコールを用いて精製する。次いでｃＤＮＡは、製造業者の推奨するプロトコール（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）をまた用いて、ＰａｃＩ（１ユニットの酵素／μｇＤＮＡ）で切断する。切断したＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、その後エタノール沈殿を行う。タグ化ｃＤＮＡ接合物のタグを、ストレプトアビジン精製ＤＮＡの１μｇあたり２ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の添加により一本鎖にする。１５０μｇのストレプトアビジン精製ＤＮＡを、２００μＬの水に再懸濁し、以下の反応成分と結合する：３０μＬの１０×ＮＥＢ Ｂｕｆｆｅｒ Ｎｏ．２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；９μＬの１００ｍＭ ｄＧＴＰ；３０μＬのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（１０Ｕ／μＬ）；および３１μＬの水；３００μＬの最終反応用量を得る。３７℃で１時間のインキュベート後、反応を２０μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡの添加によって停止し、そしてＴ４ＤＮＡポリメラーゼを７５℃で２０分間反応混合物をインキュベートすることによって不活化する。タグｃＤＮＡ接合物を、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって精製する。
【０１４５】
タグｃＤＮＡ接合物の固定化タグ相補体へのハイブリダイゼーションに関して、上記のように調製したタグｃＤＮＡ接合物を、５０μＬの水中に撹拌し、生じる混合物を、４０μＬの２．５×ハイブリダイゼーション緩衝液と結合する。組み合わせた混合物を、従来のプロトコールを用いて、ＳＰＩＮ−Ｘカラム（０．２２μｍ）を通して濾過し、タグｃＤＮＡ接合物を含む濾液を得る（１．２５ｍＬの０．１Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１．２５ｍＬの５Ｍ ＮａＣｌ、０．２５ｍＬ、０．５％ ＴＷＥＥＮ ２０、１．５ｍＬの２５％硫酸デキストラン、および０．７５ｍＬの水からなる５ｍＬの２．５×ハイブリダイゼーション緩衝液）。所定の容量の多くのビーズを、ヘモサイトメーター（ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて容易に除去する。上記のようにタグ相補体で誘導体化された約１．８×１０7のビーズを、１０μＬのＴＥ／ＴＷＥＥＮ緩衝液（０．１％のＴＷＥＥＮ ２０を伴うＴＥ）中で溶解し、そしてＴＥ／ＴＷＥＥＮを除いたものからビーズが沈渣を生じるように遠心する。ビーズに２５μＬの１×ハイブリダイゼーション緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ ＴＷＥＥＮ ２０、および３％硫酸デキストラン）を加え、そして混合物を、ビーズが完全に再懸濁するようにボルテックスする。混合物を、ビーズが沈渣を形成するように遠心した後、上清を除く。
【０１４６】
上記の濾液由来のタグＤＮＡ接合物を、７５℃で３分間インキュベートし、次いでビーズと結合する。混合物を、ボルテックスし、完全にビーズを再懸濁する。生じる混合物をさらに、７５℃でボルテックスしながら約３日間（６０時間）インキュベートする。ハイブリダイゼーション後、混合物を２分間遠心し、そして上清を除く。ビーズを５００μＬのＴＥ／ＴＷＥＥＮ ２０で２回洗浄し、０．１％ ＴＷＥＥＮ ２０を伴う５００μＬの１×ＮＥＢ緩衝液Ｎｏ．２中に再撹拌する。ビーズを、この溶液中で６４℃で３０分間インキュベートし、その後ビーズが沈渣を生じるように混合物を遠心分離する。上清を除き、そしてビーズを５００μＬのＴＥ／ＴＷＥＥＮ中に再懸濁する。次いで、ハイブリダイズした接合物を、当該分野において公知のまたは本明細書中に記載された任意の方法によって分析し得る。
【０１４７】
（実施例３）
（コハク酸に基づく連結特性）
以下の手順は、切断可能なコハク酸エステル連結特性（１０％）および切断不可能なコハク酸エステル連結特性（９０％）を用いて誘導体化されたＧＭＡビーズを作製するのに用い得る。
【０１４８】
（コハク酸エステル）
無水コハク酸（２４０ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）を一部、４−ジメチルアミノピリジン（１８０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を含む無水ピリジン（６ｍＬ）中の５’−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン（３ｍｏｌ）撹拌溶液に３０分間以上加えた。反応物を、一晩撹拌し、クロロホルム：メタノールが９：１（ｖ：ｖ）を用いる薄層クロマトグラフィーによってモニターした。混合物を、減圧下でガムにまで乾燥した。残渣のピリジンを、乾燥トルエン（３×２０ｍＬ）を用いる同時蒸着（ｃｏ−ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）によって除いた。産物を、ジクロロメタン（２０ｍＬ）中に溶解し、そして氷冷１０％硫酸ナトリウム水溶液（２×１５ｍＬ）、次に水（２×１５ｍＬ）で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥減圧下でエバポレートした。生じた泡を、ジクロロメタン（１０ｍＬ）中に溶解し、室温で迅速に撹拌するヘキサン（２５０ｍＬ）中で沈殿した。混合物の遠心分離後、上清を除いた。沈渣を減圧下で乾燥し、７５−８０％の収量（エステル産物）を得た。
【０１４９】
（スクシニミド）
上記のコハク酸化の手順を、５’−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジンの代わりに、当量の５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−デオキシ−３’−アミノチミジンを用いて繰り返し、対応するコハク酸アミド産物（アミド産物）を形成した。
【０１５０】
（支持体への接着）
０．８２１ｇ（１．１ｍｍｏｌ）のエステル産物またはアミド産物を、溶解しそして５ｍＬの０．２Ｍ ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾル水和物、４．７ｍＬ ＤＭＳＯ（ジメチルスルホオキシド）および４．７ｍＬ ＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）の混合物中に０．２７ｇ）、ならびに５ｍＬの０．２Ｍ ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾル−１−リル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリン酸、１．４ｍＬ Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、９．３ｍＬ ＤＭＳＯおよび９．３ｍＬ ＮＭＰの混合物中に１．０３ｇ）の混合物中で２分間撹拌した。アミノ誘導体化ＧＭＡビーズ（５．５ｇ、直径５．６μｍ）を１０ｍＬ ＤＮＡちゅうで撹拌した。このスラリーに、上記のアミド産物全ておよびアミド産物の１／９（９：１モル比）に等しい量のエステル産物を加えた。このスラリーを、スクリューキャップのファルコンチューブに移し、そして２時間穏やかに振盪した。次いで混合物を、濾過し、各々２０ｍＬのＤＭＦ、アセトニトリル、メタノール、およびエーテルで、首尾よく洗浄した。次いで乾燥したビーズを、タグ相補体の合成に準備した。
【０１５１】
本発明は特定の実施形態に関して記載されているにもかかわらず、種々の改変が、本発明の精神から逸脱することなくなされ得ることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、固相ビーズに結合するオリゴヌクレオチド連結構造の代表的な対、および他のリンカーはインタクトなままで、タグ相補体（ＴＣ１）を含有する付着したオリゴヌクレオチドを放出するためにリンカーの１つを切断する機構を示す。
【図２】 図２は、本発明の１つの実施形態を実行するための一般的スキームを示す。ここで異なる配列タグ相補体を含有する固定化オリゴヌクレオチドのレパートリーの部分は、固相支持体から切断され、二本鎖形態に転換され、そしてクローニングベクターに挿入される。タグベクター（１）ライブラリーは、各ベクターにおけるタグ配列に隣接する部位で異なるフラグメントを挿入するために有効な連結条件下で異なるポリヌクレオチドフラグメントの混合物と組み合わされ、これにより、各サンプルフラグメント（Ｓn）は、異なるタグ（Ｔn）と結合される。次いで、このタグ−サンプルフラグメントは、切り出され、および／または増幅され得、そしてタグ化フラグメントは、固定された対応するタグ相補体へのハイブリダイゼーションによりソートされ得る。
Claims (16)
- オリゴヌクレオチドタグのレパートリーを合成する方法であって、該方法は、以下：
複数の異なる配列のオリゴヌクレオチド集団を、１以上の固相支持体上に合成する工程であって、各集団が、他の集団に対して空間的に別個の領域に位置され、そして各集団における該オリゴヌクレオチドが、所定の集団における全てのオリゴヌクレオチドについて同じであるタグ相補体配列を含み、ここで、合成されたオリゴヌクレオチドの各集団の選択された割合が、前記１以上の支持体に化学的に切断可能な結合を介して結合されるように合成する、工程、
該１以上の支持体上の各集団から、ある割合の該オリゴヌクレオチドを切断し、異なる配列のタグ相補体オリゴヌクレオチドの混合物を放出させる工程であって、該切断は、該固定化されたオリゴヌクレオチドを、該１以上の支持体から該割合のオリゴヌクレオチドを切断するのに効果的な化学的条件に供する工程を包含する、および
各タグ相補体オリゴヌクレオチドにプライマーをアニーリングさせ、そして各アニーリングさせたプライマーを伸長して、タグ相補体鎖および相補的タグ鎖を含む二重鎖を形成させる工程であって、この結果、このように形成された該タグ相補体鎖または該二重鎖は、オリゴヌクレオチドタグレパートリーを含む、工程、を包含する、方法。 - 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記オリゴヌクレオチドは、それらの３’末端で前記１以上の支持体に結合され、そして各オリゴヌクレオチドは、前記タグ相補体配列の３’側上にユニバーサルプライマー結合配列を含む、方法。
- 前記割合が、１０〜３０％である、請求項１に記載の方法。
- 請求項１に記載の方法であって、前記化学的に切断可能な結合は塩基切断可能な結合であり、前記化学的条件は塩基性条件である、方法。
- 前記各オリゴヌクレオチドにおける前記タグ相補体配列が、同じであり得るか、または異なり得る第１および第２のエンドヌクレアーゼ制限部位に隣接される、請求項１に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドタグ相補体のレパートリーが、少なくとも１０００の異なる配列タグ相補体を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドタグ相補体のレパートリーが、少なくとも１０，０００の異なる配列タグ相補体を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記タグ相補体配列が、１２〜６０ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
- 前記タグ相補体配列が、１８〜４０ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
- 前記１以上の固相支持体が、微粒子である、請求項１に記載の方法。
- 前記微粒子が、５〜４０μｍの直径である、請求項１０に記載の方法。
- 前記タグ相補体配列が各々、（ｉ）３〜９ヌクレオチド長であり、そして（ｉｉ）タグ相補体配列の最小に交差ハイブリダイズするセットから選択される、複数のセグメントを含む、請求項１に記載の方法。
- タグレパートリー由来の複数のメンバーを含むタグベクターライブラリーを形成する方法であって、該方法は、以下の工程：
複数のオリゴヌクレオチド集団を、１以上の固相支持体上に合成する工程であって、各集団が、他の集団に対して空間的に別個の領域に位置され、そして各集団における該オリゴヌクレオチドが、所定の集団における全てのオリゴヌクレオチドについて同じであるタグ相補体配列を含み、ここで、合成されたオリゴヌクレオチドの各集団の選択された割合が、前記１以上の支持体に化学的に切断可能な結合を介して結合されるように合成する、工程、
該１以上の支持体上の各集団から、ある割合の該オリゴヌクレオチドを切断し、異なる配列のタグ相補体オリゴヌクレオチドの混合物を放出させる工程であって、該切断は、該固定化されたオリゴヌクレオチドを、該１以上の支持体から該割合のオリゴヌクレオチドを切断するのに効果的な化学的条件に供する工程を包含する、
各タグ相補体オリゴヌクレオチドにプライマーをアニーリングさせ、そして各アニーリングさせたプライマーを伸長して、タグ相補体鎖および相補的タグ鎖を含む二重鎖を形成させる工程であって、この結果、このように形成された該タグ相補体鎖または該二重鎖は、オリゴヌクレオチドタグレパートリーを含む、工程、ならびに
該二重鎖を選択されたベクターの複数のコピーに連結によって挿入し、該タグレパートリーのメンバーを含むタグベクターライブラリーを形成する工程、を包含する、方法。 - タグ化されたポリヌクレオチドフラグメントのライブラリーを形成する方法であって、該方法は、以下の工程：
複数のオリゴヌクレオチド集団を、１以上の固相支持体上に合成する工程であって、各集団が、他の集団に対して空間的に別個の領域に位置され、そして各集団における該オリゴヌクレオチドが、所定の集団における全てのオリゴヌクレオチドについて同じであるタグ相補体配列を含み、ここで、合成されたオリゴヌクレオチドの各集団の選択された割合が、前記１以上の支持体に化学的に切断可能な結合を介して結合されるように合成する、工程、
該１以上の支持体上の各集団から、ある割合の該オリゴヌクレオチドを切断し、異なる配列のタグ相補体オリゴヌクレオチドの混合物を放出させる工程であって、該切断は、該固定化されたオリゴヌクレオチドを、該１以上の支持体から該割合のオリゴヌクレオチドを切断するのに効果的な化学的条件に供する工程を包含する、
各タグ相補体オリゴヌクレオチドにプライマーをアニーリングさせ、そして各アニーリングさせたプライマーを伸長して、タグ相補体鎖および相補的タグ鎖を含む二重鎖を形成させる工程であって、この結果、このように形成された該タグ相補体鎖または該二重鎖は、オリゴヌクレオチドタグレパートリーを含む、工程、
該二重鎖を選択されたベクターの複数のコピーに連結によって挿入し、該タグレパートリーのメンバーを含むタグベクターライブラリーを形成する工程、および
該タグベクターライブラリーを、各タグベクター中のタグ配列に隣接する部位で、各ベクター内にポリヌクレオチドフラグメントを挿入するのに効果的な連結条件下で、異なるポリヌクレオチドフラグメントの混合物と組み合わせて、これにより、タグ化されたポリヌクレオチドフラグメントのライブラリーを形成する工程、を包含する、方法。 - 固相ビーズであって、該ビーズは、該ビーズに結合されたオリゴヌクレオチドの集団を含み、該集団は、同一のオリゴヌクレオチド配列を含む第１および第２のクラスのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該第１のクラスのオリゴヌクレオチドは、該第２のクラスのオリゴヌクレオチドの有意な切断を伴わずに、該支持体からの該第１のクラスのオリゴヌクレオチドの選択的切断を可能にする切断可能な結合部分を含む、ビーズ。
- 固相ビーズの混合物であって、該混合物は、以下、
各々がそれに結合されたオリゴヌクレオチドの集団を有する、複数のビーズであって、ここで、各集団は、第１のクラスのオリゴヌクレオチドが、第２のクラスのオリゴヌクレオチドの有意な切断を伴わずに、支持体からの該第１のクラスのオリゴヌクレオチドの選択的切断を可能にする切断可能な結合部分を含み、そして各集団における両方のクラスのオリゴヌクレオチドが、所定の集団における全てのオリゴヌクレオチドについて同じであるタグ相補体配列を含むように、第１および第２のクラスのオリゴヌクレオチドを含む、固相ビーズの混合物。
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