DE69929708T2 - Methode zur herstellung von sätzen komplementärer oligonucleotide - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Verfahren zur Synthese von Sammlungen von Oligonucleotid-Anhängen(Tags), welche verwendet werden können, um Moleküle, insbesondere Polynucleotide, zu identifizieren, zu sortieren und/oder zu verfolgen. In einem bestimmten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung von komplementären Sätzen von Oligonucleotid-Anhängen(Tags) und Anhang(Tag)-Komplementen, welche besonders nützlich sind, um angehängte Einheiten auf adressierbaren Anordnungen von Anhang(Tag)-Komplementen zu immobilisieren.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Die spezifische Hybridisierung von Oligonucleotiden und ihren Analogen ist ein grundlegender Vorgang, welcher in einem breiten Bereich in der Forschung und von medizinischen und industriellen Anwendungen, einschließlich der Identifizierung von krankheitsbezogenen Polynucleotiden in diagnostischen Tests, der Durchmusterung nach Clonen von neuen Zielpolynucleotiden, der Identifizierung von spezifischen Polynucleotiden in Blots von Gemischen von Polynucleotiden, der Vervielfältigung von spezifischen Zielpolynucleotiden, der therapeutischen Blockierung von unangemessen exprimierten Genen, der DNA-Sequenzierung und ähnlichem angewendet wird, zum Beispiel Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Ausgabe (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989); Keller und Manak, DNA Probes, zweite Ausgabe (Stockton Press, New York, 1993); Milligan et al., J. Med. Chem., 36 (1993), 1923–1937; Drmanac et al., Science 260 (1993), 1649–1652; Bains J., DNA Sequencing and Mapping 4 (1993), 143–150.
  • Die spezifische Hybridisierung wurde auch als ein Verfahren zur Verfolgung, Gewinnung und Identifizierung von mit Oligonucleotid-Anhängen(Tags) markierten Verbindungen vorgeschlagen, zum Beispiel Brenner (Veröff.-Nr. WO 96/12014); Church et al., Science 240 (1988), 185–188; Brenner und Lerner, Proc. Natl. Acad. Sci. 89 (1992), 5381–5383; Alper, Science 264 (1994), 1399–1401; und Needels et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90 (1993), 10700–10704. Die erfolgreiche Etablierung solcher Anhangschemata hängt in großen Teilen vom Erfolg beim Erreichen einer spezifischen Hybridisierung zwischen einem Anhang(Tag) und seiner komplementären Sonde ab. Das heißt, damit ein Oligonucleotid-Anhang(Tag) eine Substanz erfolgreich identifizieren kann, muss die Zahl der falsch positiven und falsch negativen Signale minimiert werden. Unglücklicherweise sind solche falschen Signale nicht ungewöhnlich, da die freien Energien der Basenpaarung und Stapelung von Basen zwischen Nucleotiden in einer Duplex- oder Triplexstruktur breit variieren. Zum Beispiel kann ein an sein Komplement gebundenes Duplexmolekül, welches aus einer wiederholten Sequenz von Desoxyadenosin (A) und Thymidin (T) besteht, eine geringere Stabilität haben als ein gleich langes, aus einer wiederholten Sequenz von Desoxyguanosin (G) und Desoxycytidin (C) bestehendes Duplexmolekül, welches an ein teilweise komplementäres Ziel gebunden ist, welches eine Fehlpaarung enthält. So würde, wenn an eine gewünschte Verbindung aus einer großen kombinatorischen chemischen Bank das vorstehende Oligonucleotid angehängt würde, eine signifikante Möglichkeit bestehen, dass unter Hybridisierungsbedingungen, welche zum Nachweis perfekt gepaarter AT-reicher Duplexmoleküle ausgelegt sind, unerwünschte mit dem GC-reichen Oligonucleotid markierte Verbindungen sogar in einem fehlgepaarten Duplexmolekül zusammen mit den perfekt gepaarten, aus dem AT-reichen Anhang(tag) bestehenden Duplexmolekülen nachgewiesen würden. Obwohl sogar Reagenzien wie Tetramethylammoniumchlorid verfügbar sind, um die basenspezifischen Stabilitätsunterschiede von Oligonucleotidduplexmolekülen aufzuheben, ist die Wirkung solcher Reagenzien oft begrenzt und ihre Anwesenheit kann mit weiteren Manipulationen der ausgewählten Verbindungen, zum Beispiel Vervielfältigung durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) oder ähnliches, unverträglich sein oder diese erschweren. Solche Probleme wurden durch Brenner in der Entwicklung von minimal kreuzhybridisierenden Oligonucleotid-Anhangen(Tag)-Sätzen angegangen, welche das Auftreten von Fehlpaarungshybridisierungen minimieren, wie dies in WO 96/12014 (vorstehend) und WO 96/41011 beschrieben ist.
  • Unglücklicherweise ergeben jedoch die aktuellen Verfahren der Festphasenoligonucleotidsynthese, obwohl hocheffizient, immer noch eine signifikante Fraktion von fehlerhaften Sequenzen, insbesondere wenn Oligonucleotide eine Länge von 30 bis 40 Nucleotiden überschreiten. Wenn Gemische solcher Oligonucleotide insbesondere für die Sortierung als Anhänge(Tags) verwendet werden, ist eine wichtige Folge von fehlerhaften Sequenzen, dass eine Fraktion der Anhänge(Tags) immer dann keine Komplementärstränge haben wird, wenn die zwei Verbindungen getrennt synthetisiert werden. Somit werden solche Fehler bei der Sortierung von komplexen Gemischen, zum Beispiel wie dies in dem in Brenner (vorstehend zitiert) beschriebenen Verfahren gefordert wird, die Vollständigkeit des Sortierungsvorgangs begrenzen.
  • Unter Berücksichtigung des Vorstehenden wäre es nützlich, wenn Mittel zur Synthetisierung von Sätzen von Oligonucleotid-Anhängen(Tags) verfügbar wären, welche sicherstellen würden, dass jeder Anhang(Tag) ungeachtet der Effizienz des verwendeten Syntheseverfahrens ein Komplement hätte.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Synthese eines oder mehrerer Repertoires von Oligonucleotid-Anhängen(Tags) bereitzustellen, welches sicherstellt, dass jeder Oligonucleotid-Anhang(Tag) in einem Repertoire ein entsprechendes Anhang(Tag)-Komplement haben wird.
  • Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist es, ein System zur Sortierung von Polynucleotiden auf Festphasenträger mittels durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellter Oligonucleotid-Anhänge(Tags) bereitzustellen.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Synthese von Oligonucleotid-Anhängen(Tags) durch die kombinatorische Hinzufügung von Untereinheiten (Worten) bereitzustellen.
  • Diese und andere Gegenstände der Erfindung werden durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Synthese erreicht, umfassend die Schritte des Synthetisierens eines Repertoires von Oligonucleotid-Anhang(Tag)-Komplementen auf einem oder mehreren Festphasenträgern, des Abspaltens einer Fraktion der Oligonculeotid-Anhang(Tag)-Komplemente von dem/den Träger(n) und des Einfügens der gespaltenen Anhang(Tag)-Komplemente in einen Clonierungsvektor. Die clonierten Anhang(Tag)-Komplemente können bequem mit ausgewählten Substanzen, bevorzugt Biomolekülen wie Polynucleotiden oder Polypeptiden, konjugiert werden, um mit Anhängen(Tags) versehene Substanzen herzustellen, welche einzigartige Anhang(Tag)-Sequenzen besitzen, welche durch Hybridisierung mit entsprechenden Anhang(Tag)-Komplementen gefangen und sortiert werden können.
  • In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Synthese eines Repertoires von Oligonucleotid-Anhängen(Tags) bereit. In dem Verfahren wird eine Vielzahl von verschiedenen Oligonucleotidpopulationen auf einem oder mehreren Festphasenträgern synthetisiert, so dass jede Population gegenüber den anderen Populationen in einem räumlich getrennten Bereich lokalisiert ist und die Oligonucleotide in jeder Population eine Anhang(Tag)-Komplement-Sequenz umfassen, die für jedes Oligonucleotid in einer gegebenen Population die gleiche ist, welche aber unterschiedlich zur Anhang(Tag)-Komplement-Sequenz in jeder anderen Oligonucleotidpopulation sein kann. Eine Fraktion der Oligonucleotide wird von jeder Population auf dem einen oder mehreren Trägern abgespalten, um ein Gemisch von Anhang(Tag)-Komplement-Oligonucleotiden verschiedener Sequenz freizusetzen. Ein Primer wird an jedes Anhang(Tag)-Komplement-Oligonucleotid angelagert und die angelagerten Primer werden verlängert, um ein Duplexmolekül, umfassend einen Anhang(Tag)-Komplement-Strang und einen komplementären Anhang(Tag)-Strang, zu bilden, in der Form, dass die so gebildeten Anhang(Tag)-Komplement-Stränge oder die Duplexmoleküle ein Oligonucleotid-Anhang(Tag)-Repertoire umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Oligonucleotide an denen einen oder mehrere Träger über ihre 3'-Enden gebunden und jedes Oligonucleotid enthält eine Universalprimer-bindende Sequenz auf der 3'-Seite der Anhang(Tag)-Komplement-Sequenz. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform beträgt die Fraktion der aus jeder Population abgespaltenen Oligonucleotide zwischen 10% bis 30%. Entsprechend noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist eine ausgewählte Fraktion von jeder Population synthetisierter Oligonucleotide über Basen-spaltbare Bindungen an den einen oder mehrere Träger gebunden.
  • Die Offenbarung schließt auch ein wie vorstehend hergestelltes Repertoire von Anhang(Tag)-Oligonucleotiden ein.
  • Auch wird ein Verfahren zur Erzeugung einer Anhang(Tag)-Vektorbank, umfassend multiple Mitglieder eines Anhang(Tag)-Repertoires, bereitgestellt. Im Verfahren wird ein wie vorstehend hergestelltes Oligonucleotid-Anhang(Tag)-Repertoire durch Ligierung in multiple Kopien eines ausgewählten Vektors eingefügt, um eine Anhang(Tag)-Vektorbank zu erzeugen, welche Mitglieder des Anhang(Tag)-Repertoires umfasst. Die Erfindung schließt auch eine durch das Verfahren erzeugte Anhang(Tag)-Vektorbank ein.
  • Die Erfindung schließt auch ein Verfahren zur Bildung einer Bank von mit Anhängen (Tags) versehenen Polynucleotidfragmenten ein. Im Verfahren wird eine vorstehend beschriebene Anhang(Tag)-Vektorbank mit einem Gemisch von unterschiedlichen Polynucleotidfragmenten unter Ligierungsbedingungen kombiniert, die wirksam sind zur Insertion eines Polynucleotidfragments in jeden Anhang(Tag)-Vektor an einer Stelle, die einer Anhang(Tag)-Sequenz in jedem Vektor benachbart ist. Die Offenbarung schließt auch eine durch das Verfahren erzeugte Bank von mit Anhängen versehenen Polynucleotidfragmenten ein.
  • In noch einem anderen Aspekt schließt die Offenbarung auch ein System zur Sortierung von Polynucleotiden ein. Das System schließt einen oder mehrere Festphasenträger ein, auf welchem/welchen eine Vielzahl von Oligonucleotidpopulationen gebunden ist, so dass jede Population relativ zu den anderen Populationen in einem räumlich abgegrenzten Bereich auf dem einen oder mehreren Trägern lokalisiert ist und die Oligonucleotide in jeder Population eine Anhang(Tag)-Komplement-Sequenz umfassen, welche für jedes Oligonucleotid in einer gegebenen Population die gleiche ist. Das System schließt auch eine Anhang(Tag)- Zusammensetzung ein, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Anhang(Tag)-Repertoire, einer Anhang(Tag)-Vektorbank oder einer Bank von mit Anhängen versehenen Polynucleotidfragmenten, welche wie vorstehend hergestellt werden können.
  • Die Erfindung stellt auch einen Festphasenträger bereit, umfassend eine Vielzahl von immobilisierten, identische Anhang(Tag)-Sequenzen enthaltenden Oligonucleotiden, worin wenigstens eines der Oligonucleotide über einen spaltbaren Linker an den Träger gebunden ist und wenigstens ein anderes der Oligonucleotide über einen nicht-spaltbaren Linker an den Träger gebunden ist. In einer ersten bevorzugten Ausführungsform ist der Träger eine Perle. In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform umfasst der Träger eine planare Anordnung mit adressierbaren Bereichen, wobei jeder Bereich eine Vielzahl von immobilisierten Oligonucleotiden mit identischen Anhang(Tag)-Sequenzen enthält, in der Form, dass die Anhang(tag)-Sequenzen in mindestens zwei der Bereiche unterschiedlich voneinander sind. Bevorzugt ist der spaltbare Linker ein basenlabiler Linker. Die erfindungsgemäßen Festphasenträger sind besonders nützlich bei der Herstellung von Repertoires von Anhang(Tag)-Oligonucleotiden, welche im Wesentlichen komplementär zu den auf den Trägern immobilisierten Oligonucleotiden sind.
  • Somit schließt die Erfindung auch eine Festphasen-Perle oder ein Festphasen-Partikel ein, welches) eine Population von an die Perle oder das Partikel gebundenen Oligonucleotiden umfasst, wobei die Population eine erste und zweite Klasse von Oligonucleotiden umfasst, die identische Oligonucleotidsequenzen enthalten, und die Oligonucleotide in der ersten Klasse eine spaltbare Verknüpfungseinheit enthalten, die das selektive Abspalten der ersten Klasse von Oligonucleotiden vom Träger erlaubt, ohne die zweite Klasse von Oligonucleotiden signifikant abzuspalten.
  • In einer anderen Ausführungsform schließt die Erfindung ein Gemisch von Festphasenperlen oder -Partikeln von der vorstehend beschriebenen Art ein, worin wenigstens zwei Perlen oder Partikel in dem Gemisch Oligonucleotidpopulationen mit verschiedenen Anhang(Tag)-Komplement-Sequenzen enthalten.
  • Diese und andere Gegenstände und Eigenschaften der vorliegenden Erfindung werden durch die folgende Beschreibung und die angehängten Zeichnungen offensichtlicher werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt ein beispielhaftes Paar von an eine Festphasenperle gebundenen Oligonucleotid-verknüpfenden Strukturen und einen Mechanismus der Spaltung eines dieser Linker, um ein ein Anhang(Tag)-Komplement (TC1) enthaltendes Oligonucleotid freizusetzen, während der andere Linker intakt bleibt.
  • Die 2 zeigt ein allgemeines Schema zur Ausführung einer Ausführungsform der Erfindung, worin eine Fraktion eines Repertoires immobilisierter Oligonucleotide, welches Anhang(Tag)-Komplemente verschiedener Sequenz enthält, von dem Festphasenträger abgespalten wird, zu einer doppelsträngigen Form umgewandelt wird und in einen Clonierungsvektor eingefügt wird. Eine Anhang(Tag)-Vektor (1)-Bank wird mit einem Gemisch verschiedener Polynucleotidfragmente unter Ligierungsbedingungen kombiniert, die wirksam zur Insertion der verschiedenen Fragmente an einer Stelle sind, die einer Anhang(Tag)-Sequenz in jedem Vektor benachbart ist, so dass jedes Probenfragment (Sn) mit einem unterschiedlichen Anhang(Tag) (Tn) verknüpft wird. Die Anhang(Tag)-Proben-Fragmente können dann ausgeschnitten und/oder vervielfältigt werden und die mit Anhängen (Tags) versehenen Fragmente durch Hybridisierung auf entsprechende immobilisierte Anhang(Tag)-Komplemente sortiert werden.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Reagenzien zur Synthese gepaarter Sätze (auch als Repertoires bezeichnet) von Anhängen(Tags) und Anhang(Tag)-Komplementen bereit, welche miteinander eine große Komplementarität haben. Solche gepaarten Sätze sind besonders nützlich zur Markierung und Sortierung von mit Anhängen (Tags) versehenen Molekülen für parallele Arbeitsgänge wie Sequenzierung, Durchführung eines molekularen Fingerprints oder andere Arten von Untersuchungen.
  • In einem Aspekt der Erfindung werden Populationen von Oligonucleotiden synthetisiert, worin jede Population identische Anhang(Tag)-Komplemente enthält, die durch ein Gemisch von spaltbaren und nicht-spaltbaren Verknüpfungseinheiten an einen Träger gebunden sind. Der spaltbare Linker erlaubt es einer Fraktion der Oligonucleotide in jeder Population, von dem Träger abgespalten zu werden, um als Matrizen für die Erzeugung von Oligonucleotiden zu dienen, deren Sequenzen perfekt komplementär zu den an dem Träger verbleibenden Anhang(Tag)-Komplementen sind. Durch Abspaltung einer Fraktion der Anhang(Tag)-Komplemente von dem einen oder mehreren Trägern und Verwendung der abgespaltenen Anhang(Tag)-Komplemente als Matrizen zur Erzeugung komplementärer Anhänge(Tags) stellt das Verfahren gepaarte Anhang(Tag)- und Anhang(Tag)-Komplement-Repertoires in größerer Ausbeute und Genauigkeit her als vorherige Verfahren. Die Erfindung verbessert deshalb die Hybridisierungsspezifität und die Komplexität von Anhang(Tag)-Sequenzen im Vergleich zu dem, was erreicht wird, wenn Anhänge(Tags) und deren Komplemente unabhängig synthetisiert werden.
  • Die Erfindung stellt eine wesentliche Verbesserung in Oligonucleotid-Anhänge(Tags) verwendenden Techniken durch Bereitstellung eines Verfahrens zur Verbesserung der Genauigkeit der Synthese von Anhang(Tag)-Komplementen bereit. Zuvor wurden Anhänge(Tags) unabhängig von Anhang(Tag)-Komplementen synthetisiert, so dass es keine Garantie gab, dass alle vorgesehenen Anhänge(Tags) und Anhang(Tag)-Komplemente wirklich synthetisiert wurden. Insbesondere waren frühere Polynucleotidsyntheseverfahren anfällig für bedeutende oder vollständige Fehler bei einem oder mehreren Nucleotid-Additionsschritten, so dass die sich ergebenden Anhänge(Tags) oder Anhang(Tag)-Komplemente nicht die beabsichtigten Sequenzen hatten und nicht perfekt mit ihren vorgesehenen Partnern hybridisieren konnten. Die fehlerhafte Synthese von Oligonucleotiden kann mit Anhängen (Tags) versehene Probenspezies an der Auffindung von und Hybridisierung an die vorgesehenen Anhang(Tag)-Komplemente hindern, was einen Verlust von Signal und/oder eine Unterschätzung der Häufigkeit der betroffenen Probenspezies ergibt. Zusätzlich könnte das Vorliegen von fehlerhaften Anhang(Tag)-Sequenzen zur Kreuzhybridisierung mit anderen Anhängen(Tags) führen, was die Hybridisierung dieser Anhänge(Tags) mit ihren entsprechenden Komplementen beeinträchtigt. Zudem war die Komplexität der Anhang(Tag)-Repertoires und der Anhang(Tag)-Komplement-Repertoires verringert.
  • Diese Probleme werden durch die vorliegende Erfindung durch Verwendung eines ausgewählten Anteils von immobilisierten Anhang(Tag)-Komplement-Sequenzen als Matrizen für die Erzeugung eines Repertoires korrespondierender Anhänge(Tags) überwunden. Die Ligierung der Anhänge(Tags) zum Auffinden von ausgewählten Probensubstanzen, bevorzugt Biomoleküle wie Polynucleotide oder Polypeptide, ergibt ein Gemisch von mit Anhängen versehenen Substanzen (zum Beispiel Probenpolynucleotidfragmente), welche auf einer Anordnung von Anhang(Tag)-Komplementen gefangen werden können. Die Erfindung stellt somit einen Weg bereit, der sicherstellt, dass ein Anhang(Tag)-Repertoire oder eine Teilmenge eines Repertoires mit einer vollen Breite von Anhang(Tag)-Komplementen hybridisieren kann.
  • I. Definitionen
  • „Anhang(Tag)" oder „Anhang(Tag)-Oligonucleotid" oder „Oligonucleotid-Anhang(Tag)" bezieht sich auf ein Oligonucleotid, welches eine Nucleotidsequenz enthält, die fähig ist, als identifizierbare Markierung für eine angehängte Spezies wie ein Probenoligonucleotid zu dienen, und welche nachweisbar von anderen Anhängen(Tags) in einem Anhang(Tag)-Repertoire unterscheidbar ist.
  • „Komplement" oder „Anhang(Tag)-Komplement" bezieht sich, wie hier verwendet, auf ein Oligonucleotid, an welches ein Oligonucleotid-Anhang(Tag) spezifisch hybridisiert, um ein perfekt gepaartes Duplex- oder Triplexmolekül zu ergeben. In Ausführungsformen, worin die spezifische Hybridisierung ein Triplexmolekül ergibt, kann ausgewählt werden, dass der Oligonucleotid-Anhang(Tag) entweder doppelsträngig oder einzelsträngig ist. Somit soll der Begriff „Komplement", wo Triplexmoleküle gebildet werden, entweder ein doppelsträngiges Komplement eines einzelsträngigen Oligonucleotid-Anhangs(Tags) oder ein einzelsträngiges Komplement eines Doppelsträngigen Oligonucleotid-Anhangs(Tags) umfassen.
  • Der Begriff „Oligonucleotid" bedeutet, wie hier verwendet, ein lineares Oligomer von natürlichen oder modifizierten Nucleosidmonomeren, einschließlich Desoxyribonucleoside und Ribonucleoside. Für gewöhnlich sind Monomere durch Phosphodiesterbindungen oder Analoga davon (zum Beispiel Phosphorthioate, Phosphoramidate, Phosphonate, Peptidnucleinsäuren (N-derivatisierte Glycin-Polymere) und ähnliches) verbunden, um Oligonucleotide in einem Größenbereich von wenigen Monomereinheiten, zum Beispiel 3–4, bis zum Mehrfachen von 10 Monomereinheiten und bis zu 100 Monomereinheiten zu erzeugen. Immer wenn ein Oligonucleotid durch eine Sequenz von Buchstaben wie „ATGCCTG," dargestellt wird, wird verstanden werden, dass die Nucleotide von links nach rechts in einer 5' → 3'-Anordnung sind und dass „A" Desoxyadenosin bezeichnet, „C" Desoxycytidin bezeichnet, „G" Desoxyguanosin bezeichnet und „T" Thymidin bezeichnet, soweit nichts anderes angegeben ist. Für gewöhnlich umfassen erfindungsgemäße Oligonucleotide die vier natürlichen Nucleotide. Sie können jedoch auch nicht-natürliche Nucleotidanaloga umfassen. Dem Fachmann ist klar, wann Oligonucleotide, welche natürliche oder nicht-natürliche Nucleotide haben, verwendet werden können, zum Beispiel sind für gewöhnlich, wo die Prozessierung durch Enzyme gefordert wird, aus natürlichen Nucleotiden bestehende Oligonucleotide erforderlich.
  • „Polynucleotid" oder „Polynucleotidfragment" bezieht sich auf ein Polymer, welches zwei oder mehr Nucleotide enthält. „Polynucleotid" umfasst „Oligonucleotid", obwohl die Länge eines Polynucleotids 100 Monomereinheiten überschreiten kann.
  • „Perfekt gepaart" bedeutet in Bezug auf ein Duplexmolekül, dass die das Duplexmolekül bildenden Poly- oder Oligonucleotidstränge miteinander eine doppelsträngige Struktur bilden, so dass jedes Nucleotid in jedem Strang eine Watson-Crick-Basenpaarung mit einem Nucleotid in dem anderen Strang eingeht. Der Begriff umfasst auch die Paarung von Nucleosidanaloga wie Desoxyinosin, Nucleosiden mit 2-Aminopurinbasen und ähnlichem, welche verwendet werden können. In Bezug auf ein Triplexmolekül bedeutet der Begriff, dass das Triplexmolekül aus einem perfekt gepaarten Duplexmolekül und einem dritten Strang besteht, in welchem jedes Nucleotid eine Hoogsteen- oder eine reverse Hoogsteen-Assoziation mit einem Basenpaar des perfekt gepaarten Duplexmoleküls eingeht.
  • Umgekehrt bedeutet eine „Fehlpaarung" in einem Duplexmolekül zwischen einem Anhang(Tag) und einem Oligonucleotid, dass ein Paar oder Triplett von Nucleotiden in dem Duplex- oder Triplexmolekül keine Watson-Crick- und/oder Hoogsteen- und/oder reversen Hoogsteenbindung eingeht.
  • Wie hier verwendet, schließt „Nucleosid" die natürlichen Nucleoside, einschließlich 2'-Desoxy- und 2'-Hydroxylformen, wie in Kornberg und Baker, DNA Replication, 2. Ausgabe (Freeman, San Francisco, 1992) beschrieben, ein. In Bezug auf Nucleoside schließt „Analoga" synthetische Nucleoside, welche modifizierte Baseneinheiten und/oder modifizierte Zuckereinheiten, zum Beispiel beschrieben durch Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley, New York, 1980); Uhlman und Peyman, Chemical Reviews 90 (1990), 543–584 oder ähnliches, haben, mit der einzigen Vorbedingung, dass diese zu einer spezifischen Hybridisierung fähig sind, ein. Solche Analoga schließen synthetische Nucleoside, welche ausgelegt sind Bindungseigenschaften zu verbessern, die Komplexität zu verringern, die Spezifität zu erhöhen und ähnliches, ein.
  • „Nucleotid" bezieht sich auf ein Nucleosid oder ein Nucleosidanalog, welches eine oder mehrere an ein 5'-, 3'- und/oder 2'-Hydroxyl gebundene Phosphatgruppen (oder Analoga davon) hat, oder ein in einem Oligonucleotid oder Polynucleotid enthaltenes Nucleosid.
  • Wie hier verwendet, bedeutet „Komplexität" in Bezug auf eine Population von Polynucleotiden die Zahl von unterschiedlichen Spezies von Molekülen, die in der Population vorhanden sind.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich „Repertoire" auf eine Sammlung oder ein Gemisch von Oligonucleotiden verschiedener Sequenz, zum Beispiel umfassend Oligonucleotid-Anhänge(Tags) oder Anhang(Tag)-Komplemente. Ein „Repertoire" kann eine definierte Komplexität haben.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich „spaltbare Verknüpfungseinheit" auf eine chemische Gruppe, welche unter ausgewählten chemischen Bedingungen spaltbar ist. Der Begriff „spaltbarer Linker" bezieht sich auf eine Verbindung oder chemische Gruppe, welche eine spaltbare Verknüpfungseinheit enthält. Zum Beispiel umfasst der Begriff „spaltbarer Linker" eine aktivierte Form einer Linkerverbindung, welche über eine erste verknüpfende Funktionalität an einen Träger und über eine zweite Funktionalität an ein Oligonucleotid gekoppelt werden kann. Der spaltbare Linker kann eine spaltbare Verknüpfungseinheit wie eine Estergruppe, welche unter ausgewählten Spaltungsbedingungen spaltbar ist, enthalten.
  • II. Bestandteile
  • Die folgenden Unterabschnitte diskutieren verschiedene Bestandteile, zum Beispiel Materialien und Reagenzien, welche dazu verwendet werden können, verschiedene Aspekte der vorliegenden Erfindung auszuführen.
  • A. Fester Träger
  • Festphasenträger zur Verwendung mit der Erfindung können jegliche einer breiten Vielfalt von Formen haben, einschließlich Mikropartikel, Perlen, Membranen, Objektträger, Platten, miniaturisiert hergestellter Chips und ähnliches. Genauso können erfindungsgemäße Festphasenträger eine breite Vielfalt von Materialien, einschließlich Glas, Plastik, Silicium, durch Alkanthiolat derivatisiertes Gold, Cellulose, gering vernetztes und stark vernetztes Polystyrol, Kieselgel, Polyamid und ähnliches, umfassen. Bevorzugt wird entweder eine Population von abgegrenzten Partikeln verwendet, so dass jedes Partikel eine gleichmäßige Beschichtung oder eine Population von komplementären Sequenzen für den gleichen Anhang(Tag) (und keinen anderen) hat, oder ein oder mehrere Träger mit räumlich abgegrenzten Bereichen werden verwendet, wobei jede Region eine gleichmäßige Beschichtung oder Population von Sequenzen hat, welche komplementär zu dem gleichen Anhang(Tag) (und keinem anderen) sind. In der letzteren Ausführungsform kann die Oberfläche der Bereiche entsprechend bestimmter Anwendungen variieren. Für gewöhnlich liegen die Oberflächen der Bereiche zwischen einigen μm2, zum Beispiel 3–5 μm2, bis einige hundert μm2, zum Beispiel 100–500 μm2. Bevorzugt sind solche Bereiche räumlich abgegrenzt, so dass durch Ereignisse erzeugte Signale, zum Beispiel Fluoreszenzemissionen, in benachbarten Bereichen voneinander durch das verwendete Nachweissystem aufgelöst werden können. In einigen Anwendungen kann es zum Beispiel für die simultane Sequenzuntersuchung oder um getrennt mit Anhängen (Tags) versehene Moleküle in enge Nähe zu bringen wünschenswert sein, Bereiche mit gleichmäßigen Beschichtungen von mehr als einem Anhang(Tag)-Komplement zu haben.
  • Zum Beispiel kann eine breite Vielfalt von Mikropartikelträgern, einschließlich Micropartikel, hergestellt aus Glas mit kontrollierter Porengröße (CPG), stark vernetztem Polystyrol, Acrylcopolymeren, Cellulose, Nylon, Dextran, Latex, Polyacrolein und ähnlichem, offenbart in den folgenden beispielhaften Quellen: Meth. Enzymol., Abschnitt A, Band 44, Seiten 11–147 (Academic Press, New York, 1976); US-Patente 4,678,814; 4,413,070; und 4,046;720; und Pon, Kapitel 19, in Agrawal, Herausgeber, Methods in Molecular Biology, Band 20, (Humana Press, Totowa, NJ, 1993), in der Erfindung verwendet werden. Mikropartikelträger schließen weiterhin kommerziell erhältliche, durch Nucleoside derivatisierte CPG- und Polystyrol-Perlen (zum Beispiel erhältlich von Perkin-Eimer Applied Biosystems, Foster City, CA); derivatisierte magnetische Perlen; mit Polyethylenglycol gepfropftes Polystyrol (zum Beispiel TentaGelTM, Rapp Polymere, Tübingen, Deutschland) und ähnliches ein. Die Auswahl der Eigenschaften des Trägers wie Material, Porosität, Größe, Form und ähnliches und die Art der verwendeten Verknüpfungseinheit wird von den Bedingungen abhängen, unter denen die Anhänge(Tags) verwendet werden. Zum Beispiel sind in Anwendungen, welche die aufeinanderfolgende Prozessierung mit Enzymen einschließen, Träger und Linker bevorzugt, welche die sterische Behinderung der Enzyme minimieren und welche den Zugang zum Substrat erleichtern. Andere bei der Auswahl des am meisten geeigneten Mikropartikelträgers zu berücksichtigende, wichtige Faktoren schließen die Gleichmäßigkeit der Größe, Effizienz als Syntheseträger, Fläche der Oberfläche und optische Eigenschaften ein. Es ist zu beachten, dass glatte und klare (transparente) Perlen Instrumentationsvorteile bereitstellen, wenn große Mengen von Perlen auf einer Oberfläche gehandhabt werden.
  • Wie vorstehend erwähnt, können Anhang(Tag)-Komplemente auch auf einem oder mehren Festphasenträgern synthetisiert werden, um eine Anordnung von gleichmäßig mit Anhang(Tag)-Komplementen beschichteten Bereichen zu erzeugen. Das heißt, in jedem Bereich in so einer Anordnung wird das gleiche Anhang(Tag)-Komplement synthetisiert. Techniken zur Synthese solcher Anordnungen sind nun wohl bekannt und werden zum Beispiel in McGall et al. (WO 93/22680 (Affymax); Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91 (1994), 5022–5026; Southern und Maskos (WO 90/03382 von Isis); Southern et al., Genomics 13 (1992), 1008–1017; und Maskos und Southern, Nucleic Acids Research 21 (1993), 4663–4669 offenbart.
  • Bevorzugt wird die Erfindung mit gleichmäßig mit Komplementen der gleichen Anhang(Tag)-Sequenz beschichteten Mikropartikeln oder Perlen ausgeführt. Mikropartikelträger und Verfahren zur kovalenten oder nicht-kovalenten Verknüpfung von Oligonucleotiden an deren Oberflächen sind, wie durch folgende Quellen veranschaulicht: Beaucage und lyer (vorstehend zitiert); Gait, Herausgeber, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, Ausgaben von 1984 und 1990); und die vorstehend zitierten Quellen, wohl bekannt. Im Allgemeinen ist die Größe und die Form eines Mikropartikels nicht kritisch, es sind jedoch Mikropartikel in einem Größenbereich von einigen wenigen, zum Beispiel 1–2, bis zu einigen hundert, zum Beispiel 200–1000 μm, Durchmesser bevorzugt, da sie die Konstruktion und Manipulation von großen Repertoires von Oligonucleotid-Anhängen(Tags) bei minimalem Reagenz- und Probenverbrauch erleichtern.
  • In einigen bevorzugten Anwendungen werden kommerziell erhältliche Träger aus Glas mit kontrollierter Porengröße (CPG) oder Polystyrol in der Erfindung als Festphasenträger verwendet. Solche Träger sind mit basenlabilen Linkern und gebundenen ersten Nucleosiden erhältlich, zum Beispiel Applied Biosystems (Foster City, CA). Bevorzugt werden Micropartikel, welche eine Porengröße von 500 bis 1000 Ångström haben, verwendet.
  • In anderen bevorzugten Anwendungen werden nicht-poröse Mikropartikel wegen ihrer optischen Eigenschaften verwendet, welche vorteilhafterweise bei der Verfolgung von großen Mengen von Mikropartikeln auf ebenen Trägern wie einem Mikroskopobjektträger verwendet werden können. Besonders bevorzugte nicht-poröse Mikropartikel sind die von Bangs Laboratories (Carmel, IN) erhältlichen Glycidyl-methacrylat (GMA)-Perlen. Solche Mikropartikel sind in einer Vielfalt von Größen und derivatisiert mit einer Vielfalt von Verknüpfungsgruppen zur Synthese von Anhängen (Tags) oder Anhang(Tag)-Komplementen nützlich. Bevorzugt werden GMA-Perlen, welche Durchmesser von etwa 5 μm haben, für in großem Rahmen stattfindende parallele Manipulationen von mit Anhängen (Tags) versehenen Mikropartikeln verwendet.
  • B. Anhang(Tag)-Sequenzen
  • Die erfindungsgemäßen Anhänge(Tags) sind dazu ausgelegt, einzigartige Anhang(Tag)-Sequenzen für interessierende Probenspezies für die spezifische Hybridisierung mit entsprechenden auf einem oder mehreren festen Trägern immobilisierten Anhang(Tag)-Komplementen bereitzustellen. Die Sequenzen der Anhänge(Tags) (und Anhang(Tag)-Komplemente) können jede Gruppe von durch den Anwender ausgewählten Sequenzen sein, vorausgesetzt dass (1) jeder verschiedene Anhang(Tag) und jedes verschiedene Anhang(Tag)-Komplement unter selektiven Hybridisierungsbedingungen zur Sortierung nicht signifikant mit jeglichem anderen Anhang(Tag) oder Anhang(Tag)-Komplement in dem Repertoire kreuzhybridisiert, (2) jeder Anhang(Tag) und jedes Anhang(Tag)-Komplement keine Sekundärstrukturen ausbildet, welche eine spezifische Hybridisierung mit der vorgesehenen Komplementärsequenz verhindern würden und (3) jeder Anhang(Tag) sein entsprechendes Anhang(Tag)-Komplement unter den gleichen Bedingungen für alle Anhänge(Tags) in dem ausgewählten Anhang(Tag)-Repertoire spezifisch erkennen und mit ihm hybridisieren kann. Im Allgemeinen nimmt die Zahl von verschiedenen Anhängen(Tags) im Verhältnis zu der Zahl der verschiedenen Probenspezies, welche parallel verarbeitet werden sollen, zu. Anhang(Tag)-Sequenzen können in Übereinstimmung mit jedem geeigneten Verfahren entworfen werden, so dass die gewünschte Sequenzspezifität und Sensitivität erreicht wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Oligonucleotid-Anhang(Tag)-Sequenzen aus einem „minimal kreuzhybridisierenden Satz" von Oligonucleotidsequenzen ausgewählt. Bevorzugt unterscheiden sich die Sequenzen von jeglichen zwei Oligonucleotid-Anhängen(Tags) eines Anhang(Tag)-Repertoires durch wenigstens zwei Nucleotide, wenn die Oligonucleotide so ausgerichtet sind, dass eine maximale Sequenzidentität erreicht wird. In anderen Worten ergibt die Duplex- oder Triplexbildung zwischen jedem Anhang(Tag) in einem Repertoire und jeglichem anderen Anhang(Tag) in dem Repertoire oder einem Anhang(Tag)-Komplement davon wenigstens zwei Fehlpaarungen. In einer spezielleren Ausführungsform sind die Anhang(Tag)-Sequenzen in einem Anhang(Tag)-Repertoire dazu ausgelegt, sicher zu stellen, dass sich mit jeglichen anderen Anhängen(Tags) oder Anhang(Tag)-Komplementen in dem Repertoire keine Duplex- und Triplexmoleküle bilden können, ohne wenigstens drei fehlgepaarte Nucleotide zu bilden und so weiter. In solchen Ausführungsformen wird eine größere Spezifität erreicht, wenn die minimale Zahl von Fehlpaarungen zunimmt, aber das gesamte Repertoire von Anhängen(Tags) kleiner ist. Somit besteht für Anhänge(Tags) einer gegebenen Länge eine Abwägung zwischen der gewünschten Spezifität und der Größe des Repertoires.
  • Die Nucleotidsequenzen für Oligonucleotide eines minimal kreuzhybridisierenden Satzes (Repertoire) können bequem durch einfache Computerprogramme den in der PCT-Veröffentlichung WO 96/41011 (siehe insbesondere 1, die in den Anhängen Ia and Ib bereitgestellten Programme und die entsprechende Diskussion im Text) und der PCT-Veröffentlichung WO 97/46704 (Anhänge I und II) beschriebenen Verfahren folgend spezifiziert werden. Das Programm minhx aus Anhang Ia in WO 96/41011 berechnet alle minimal kreuzhybridisierenden Sätze, welche aus drei Arten von Nucleotiden zusammengesetzte 4-mer Untereinheiten haben. Das Programm tagN aus Anhang Ib (WO 96/41011) spezifiziert längere Oligonucleotide eines minimal kreuzhybridisierenden Satzes. Das Programm 3tagN (WO 97/46704 in Appendix II) kann verwendet werden, um minimal kreuzhybridisierende Sätze von doppelsträngigen Anhängen(Tags) zur Bindung einzelsträngiger Anhang(Tag)-Komplemente herzustellen. Ähnliche Algorithmen und Computerprogramme für die Auflistung von Oligonucleotiden minimal kreuzhybridisierender Sätze für jegliche erfindungsgemäße Ausführungsform sind einfach zu schreiben. Die nachstehende Tabelle I stellt eine Anleitung bezüglich der Größe der Sätze minimal kreuzhybridisierender Oligonucleotide für die angegebenen Längen und die Zahl der Nucleotidunterschiede bereit, wobei die vorstehend erwähnten Computerprogramme verwendet wurden, um die gezeigten Zahlen zu erzeugen.
  • Tabelle I
    Figure 00170001
  • Für einige erfindungsgemäße Ausführungsformen, worin extrem große Repertoires von Anhängen(Tags) nicht benötigt werden, können Oligonucleotid-Anhänge(Tags) eines minimal kreuzhybridisierenden Satzes getrennt synthetisiert werden. Sätze, welche einige hundert bis zu einige tausend oder sogar einige zehntausend Oligonucleotide enthalten, können direkt durch eine Vielfalt von parallelen Syntheseansätzen, wie zum Beispiel in Frank et al., US-Patent 4,689,405; Frank et al., Nucleic Acids Research 11 (1983), 4365–4377; Matson et al., Anal. Biochem. 224 (1995), 110–116; Fodor et al., Internationale Anmeldung PCT/US93/04145 (WO 93/22684); Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91 (1994), 5022–5026; Southern et al., J. Biotechnology 35 (1994), 217–227; Brennan (WO 94/27719); Lashkari et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92 (1995), 7912–7915 offenbart, oder ähnliches synthetisiert werden.
  • Bevorzugt werden erfindungsgemäße Oligonucleotid-Anhänge(Tags) kombinatorisch aus Untereinheiten (auch als „Wörter" bezeichnet), welche drei bis neun und bevorzugt drei bis sechs Nucleotide lang sind und aus dem gleichen minimal kreuzhybridisierenden Satz ausgewählt sind, synthetisiert. Für Oligonucleotide in diesem Bereich können die Mitglieder solcher Sätze durch auf dem Algorithmus der 1 aus WO 96/41011 basierende Computerprogramme spezifiziert werden.
  • Bevorzugt umfassen minimal kreuzhybridisierende Sätze Untereinheiten, welche annähernd äquivalente Beiträge zur Duplex- (oder Triplex-) Stabilität wie jede andere Untereinheit in dem Satz machen. In dieser Weise ist die Stabilität von perfekt gepaarten Duplexmolekülen zwischen jeder Untereinheit und ihrem Komplement annähernd gleich. Eine Anleitung zur Auswahl solcher Sätze wird durch die veröffentlichten Verfahren zur Auswahl optimaler PCR-Primer und die Berechnung von Duplexstabilitäten, zum Beispiel Rychlik et al., Nucleic Acids Research 17 (1989), 8543–8551 und 18 (1990), 6409–6412; Breslauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83 (1986), 3746–3750; Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26 (1991), 227–259, und ähnliches bereitgestellt. Für kürzere Anhänge(Tags), zum Beispiel um 30 Nucleotide oder weniger, wird der durch Rychlik und Wetmur beschriebene Algorithmus bevorzugt und es kann für längere Anhänge(Tags), zum Beispiel um 30–35 Nucleotide oder länger, ein durch Suggs et al., Seiten 683–693 in Brown, Herausgeber, ICN-UCLA Symp. Dev. Biol. Band 23 (Academic Press, New York, 1981) offenbarter Algorithmus bequem verwendet werden. Klarer Weise gibt es im Umfang der Erfindung viele dem Fachmann verfügbare Ansätze zum Entwurf von Sätzen minimal kreuzhybridisierender Untereinheiten. Zum Beispiel können zur Minimierung der Einflüsse von verschiedenen Energien der Stapelung von Basen der terminalen Nucleotide, wenn Untereinheiten zusammengesetzt werden, Untereinheiten bereitgestellt werden, welche die gleichen terminalen Nucleotide haben. In dieser Weise wird, wenn Untereinheiten verknüpft werden, die Summe der Energien der Stapelung von Basen von all den benachbarten terminalen Nucleotiden gleich sein, wodurch die Variabilität der Anhang(Tag)-Schmelztemperaturen verringert wird.
  • Ein „Wort" terminaler Nucleotide, was nachstehend kursiv und unterstrichen gezeigt wird, kann ebenfalls an jedes Ende eines Anhangs(Tags) angehängt werden, so dass immer eine perfekte Paarung zwischen diesem und einem ähnlichen terminalen „Wort" auf jedem anderen Anhang(Tag)-Komplement gebildet wird. So ein verstärkter Anhang(Tag) würde die Form haben:
    Figure 00190001
    worin die mit einem „'" versehenen W's Komplemente anzeigen. Wenn die Enden der Anhänge(Tags) immer perfekt gepaarte Duplexmoleküle ausbilden, werden alle fehlgepaarten Untereinheiten (Wörter) interne Fehlpaarungen bedingen, wodurch die Stabilität von Anhang(Tag)-Komplement-Duplexmolekülen reduziert wird, welche sonst fehlgepaarte Wörter an ihren Enden haben würden. Es ist wohl bekannt, dass Duplexmoleküle mit internen Fehlpaarungen signifikant weniger stabil sind als Duplexmoleküle mit der gleichen Fehlpaarung an einem Ende.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform von minimal kreuzhybridisierenden Sätzen sind solche, deren Wörter aus drei der vier natürlichen Nucleotide aufgebaut sind. Die Abwesenheit von einer Art von Nucleotid in den Oligonucleotid-Anhängen(Tags) erlaubt es, wenn gewünscht, die Anhänge(Tags) unter Verwendung der 5'- > 3' Exonucleaseaktivität einer DNA-Polymerase, um den Anhang(Tag)-Komplement-Strang zu entfernen (Stripping-Reaktion), von einer doppelsträngigen in eine einzelsträngige Form umzuwandeln. Das folgende ist ein beispielhafter minimal kreuzhybridisierender Satz von Wörtern, wobei jedes vier Nucleotide, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus A, G und T umfasst:
  • Tabelle II
    Figure 00200001
  • In diesem Satz würde jedes Mitglied ein Duplexmolekül bilden, welches mit dem Komplement jedes anderen Mitglieds drei fehlgepaarte Basen hat.
  • Weitere beispielhafte minimal kreuzhybridisierende Sätze sind nachstehend in Tabelle III aufgeführt. Klarer Weise können zusätzliche Sätze durch Ersetzung verschiedener Gruppen von Nucleotiden oder durch Verwendung von Teilmengen von bekannten minimal kreuzhybridisierenden Sätzen erzeugt werden.
  • Tabelle III Beispielhafte minimal kreuzhybridisierende Sätze von 4-mer-Untereinheiten (Wörter)
    Figure 00210001
  • C. Anhang(Tag)-Synthese
  • Oligonucleotid-Anhang(Tag)-Komplemente zur Verwendung in der Erfindung werden günstiger Weise in einem automatisierten DNA-Syntheseautomaten, zum Beispiel einem Applied Biosystems Modell 392 oder 394 DNA/RNA Synthesizer (Perkin-Eimer Applied Biosystems, Foster City, CA) oder einem „GENE ASSEMBLER PLUS" (Pharmacia), unter Verwendung von Standardchemien, bevorzugt Phosphoramiditchemie, zum Beispiel wie in den folgenden Quellen offenbart: Beaucage und lyer, Tetrahedron 48 (1992), 2223–2311; Molko et al., US-Patent 4.980,460; Koster et al., US-Patent 4,725,677; Caruthers et al., US-Patente 4,415,732; 4,458,066 und 4,973,679; M. J. Gait (Hrsg.) in Oligonucleotide Synthesis, a Practical Approach, IRL Press, Oxford, England (1990), und ähnlichem synthetisiert.
  • Wenn Mikropartikel als Träger verwendet werden, können Repertoires von Anhang(Tag)-Komplementen durch wortweise Synthese über „teile und mische"-Techniken, zum Beispiel wie in Shortle et al. (WO 93/21203) oder Lyttle et al., Biotechniques 19 (1995), 274–280 offenbart, erzeugt werden. Kurz gesagt ist die Grundeinheit der Synthese eine Untereinheit („Wort") der Anhang(Tag)-Sequenz. Bevorzugt wird die Phosphoramiditchemie verwendet und 3'-Phosphoramiditoligonucleotide werden für jedes Wort in einem minimal kreuzhybridisierenden Satz hergestellt, zum Beispiel gäbe es für den ersten vorstehend aufgeführten Satz acht 3'-Phosphoramidit-Tetramere. Die Synthese verläuft, wie durch Shortle et al. offenbart oder in direkter Analogie mit den zur Erzeugung verschiedener Oligonucleotidbanken unter Verwendung von nucleosidischen Monomeren, zum Beispiel wie in Telenius et al., Genomics 13 (1992), 718–725; Welsh et al., Nucleic Acids Research 19 (1991), 5275–5279; Grothues et al., Nucleic Acids Research 21 (1993), 1321–1322; Hartley, Europäische Patentanmeldung Nr. 90304496.4; Lam et al., Nature 354 (1991), 82–84; Zuckerman et al., Int. J. Pept. Protein Research 40 (1992), 498–507 offenbart, verwendeter Techniken und ähnlichem. Im Allgemeinen erfordern diese Techniken einfach die Anwendung von Gemischen der aktivierten Monomere (oder Polymerwörter) an dem wachsenden Oligonucleotid während der Kupplungsschritte.
  • Bevorzugt werden Anhang(Tag)-Komplemente auf einem DNA-Syntheseautomaten synthetisiert, welcher eine Menge von verschiedenen Synthesekammern hat, die größer oder gleich der Zahl der verschiedenen Arten von beim Aufbau der Anhänge(Tags) verwendeten Wörter ist. Das heißt, dass es bevorzugt eine jeder Art von Wort entsprechende Synthesekammer gibt. In dieser Ausführungsform werden Wörter Nucleotid für Nucleotid hinzugefügt, so dass es, wenn ein Wort aus fünf Nucleotiden besteht, fünf Monomerkupplungen in jeder Synthesekammer gibt. Nachdem ein Wort vollständig synthetisiert ist, werden die Syntheseträger aus den Kammern entfernt, gemischt und zum nächsten Zyklus der Addition von Wörtern wieder zurück auf die Kammern verteilt. Diese letzte Ausführungsform nutzt den Vorteil der hohen Kupplungsausbeuten der Monomeraddition zum Beispiel in Phosphoramiditchemien (zum Beispiel siehe Beispiel 1).
  • Die erfindungsgemäßen Anhang(Tag)- und Anhang(Tag)-Komplement-Sequenzen haben bevorzugt einen Längenbereich von 12 bis 60 Nucleotiden oder Basenpaaren. Bevorzugt liegen die Anhang(Tag)-Sequenzen in einem Längenbereich von 18 bis 40 Nucleotiden oder Basenpaaren. Stärker bevorzugt haben die Anhang(Tag)-Sequenzen Längen von 25 bis 40 Nucleotiden oder Basenpaaren. In Bezug auf bevorzugte und stärker bevorzugte Zahlen von Wörtern können diese Bereiche wie folgt ausgedrückt werden:
  • Tabelle IV Zahlen von Untereinheiten (Wörtern) in bevorzugten Anhanq(Tag)-Ausführungsformen
    Figure 00230001
  • Am stärksten bevorzugt sind Oligonucleotid-Anhänge(Tags) einzelsträngig und die spezifische Hybridisierung tritt durch Watson-Crick-Paarung mit einem Anhang(Tag)-Komplement auf.
  • Bevorzugt enthalten Repertoires von erfindungsgemäßen Anhängen(Tags) und/oder Anhang(Tag)-Komplementen wenigstens 100 Mitglieder, stärker bevorzugt wenigstens 1000 Mitglieder und am stärksten bevorzugt wenigstens 10000 Mitglieder.
  • In Ausführungsformen, worin die spezifische Hybridisierung über Triplex-Bildung auftritt, folgt die Kodierung von Anhang(Tag)-Sequenzen den gleichen Prinzipien wie für Duplexmoleküle bildende Anhänge(Tags); es gibt jedoch weitere Einschränkungen bei der Auswahl von Wort-Sequenzen. Im Allgemeinen ist die Assoziation des dritten Stranges über Bindung nach dem Hoogsteen-Typ am stabilsten entlang Homopyrimidin-Homopurin-Abschnitten in einem doppelsträngigen Ziel. Für gewöhnlich bilden sich Basentriplets in T-A*T- oder C-G*C-Motiven (worin „-' die Watson-Crickpaarung anzeigt und „*" die Bindung vom Hoogsteen-Typ anzeigt); es sind jedoch auch andere Motive möglich. Zum Beispiel erlaubt die Hoogsteen-Basenpaarung abhängig von den Bedingungen und der Zusammensetzung der Stränge parallele und antiparallele Orientierungen zwischen dem dritten Strang (dem Hoogsteen-Strang) und dem purinreichen Strang des Duplexmoleküls, an welche der dritte Strang bindet. In der Literatur gibt es umfangreiche Anleitung zur Auswahl geeigneter Sequenzen, Orientierung, Bedingungen, Nucleosidart (zum Beispiel ob Ribose- oder Desoxyribosenucleoside verwendet werden), Basenmodifizierungen (zum Beispiel methyliertes Cytosin und ähnliches), um in bestimmten Ausführungsformen die Triplexstabilität wie gewünscht zu maximieren oder anderweitig zu regulieren, zum Beispiel Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (1991), 9397–9401; Roberts et al., Science 258 (1992), 1463–1466; Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93 (1996), 4320–4325; Distefano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90 (1993), 1179–1183; Mergny et al., Biochemistry 30 (1991), 9791–9798; Cheng et al., J. Am. Chem. Soc. 114 (1992), 4465–4474; Beal und Dervan, Nucleic Acids Research 20 (1992), 2773–2776; Beal und Dervan, J. Am. Chem. Soc. 114 (1992), 4976–4982; Giovannangeli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89 (1992), 8631–8635; Moser und Dervan, Science 238 (1987), 645–650; McShan et al., J. Biol. Chem. 267 (1992), 5712–5721; Yoon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89 (1992), 3840 – 3844; Blume et al., Nucleic Acids Research 20 (1992), 1777–1784; Thuong und Helene, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32 (1993), 666–690; Escude et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93 (1996), 4365–4369) und ähnliches.
  • Bedingungen zum Anlagern von einzelsträngigen oder Duplex-Anhängen(Tags) an ihre einzelsträngigen oder Duplex-Komplemente sind wohl bekannt, zum Beispiel Ji et al., Anal. Chem. 65 (1993), 1323–1328; Cantor et al., US-Patent 5,482,836 und ähnliches. Die Verwendung von Triplex-Anhängen(Tags) hat den Vorteil, keine „Stripping"-Reaktion mit einer Polymerase zur Freilegung des Anhangs(Tags) zur Anlagerung an sein Komplement zu benötigen, wenn der Anhang(Tag) ursprünglich in doppelsträngiger Form hergestellt wurde.
  • Bevorzugt sind erfindungsgemäße Oligonucleotid-Anhänge(Tags), welche eine Triplex-Hybridisierung verwenden, doppelsträngige DNA und die entsprechenden Komplemente sind einzelsträngig. Stärker bevorzugt wird 5-Methylcytosin anstelle von Cytosin in dem Anhang(Tag)-Komplementen verwendet, um den Bereich der pH-Stabilität des zwischen einem Anhang(Tag) und seinem Komplement gebildeten Triplexmoleküls zu verbreitern. Bevorzugte Bedingungen zur Bildung von Triplexmolekülen sind in den vorstehenden Quellen vollständig offenbart. Kurz gesagt findet die Hybridisierung in konzentrierter Salzlösung, zum Beispiel 1,0 M NaCl, 1,0 M Kaliumacetat oder ähnlichem, bei einem pH unter 5,5 (oder 6,5, wenn 5-Methylcytosin verwendet wird) statt. Die Hybridisierungstemperatur hängt von der Länge und Zusammensetzung des Anhangs(Tags) ab; es ist jedoch für einen 18–20-mer oder längeren Anhang(Tag) eine Hybridisierung bei Raumtemperatur angemessen. Waschschritte können mit weniger konzentrierten Salzlösungen, zum Beispiel 10 mM Natriumacetat, 100 mM MgCl2, pH 5,8 bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Anhänge(Tags) können von ihren Anhang(Tag)-Komplementen durch Inkubation in einer ähnlichen Salzlösung bei einem pH-Wert von 9,0 eluiert werden.
  • Minimal kreuzhybridisierende Sätze von Oligonucleotid-Anhängen(Tags), welche Triplexmoleküle bilden, können durch das Computerprogramm 3tagN in Anhang II von WO 97/46704 oder ähnliche Programme erzeugt werden. Ein beispielhafter Satz von doppelsträngigen 8-mer-Wörtern wird nachstehend in Großbuchstaben mit den entsprechenden Komplementen in kleinen Buchstaben angegeben. Jedes dieser Wörter unterscheidet sich von jedem der anderen Wörter im Satz durch drei Basenpaare.
  • Tabelle V Beispielhafter minimal kreuzhybridisierender Satz von doppelsträngigen 8-mer-Anhängen(Tags)
    Figure 00260001
  • Tabelle VI Repertoiregröße von verschiedenen doppelsträngigen Anhängen(Tags), welche mit ihren Anhang(Tag)-Komplementen Triplexmoleküle bilden
    Figure 00270001
  • Bevorzugt enthalten erfindungsgemäße Repertoires von doppelsträngigen Oligonucleotid-Anhängen(Tags) wenigstens 10 Mitglieder, stärker bevorzugt enthalten Repertoires solcher Anhänge(Tags) wenigstens 100 Mitglieder. Bevorzugt habe die Wörter für kombinatorisch synthetisierte doppelsträngige Oligonucleotid-Anhänge(Tags) eine Länge zwischen 4 und 8 Nucleotiden und Anhang(Tag)-Sequenzen für die Bildung von Triplexmolekülen haben eine Länge von 12 bis 60 Basenpaaren. Stärker bevorzugt haben die Anhang(Tag)-Sequenzen eine Länge von 18 bis 40 Basenpaaren.
  • D. Festphasenlinker
  • Während der Synthese werden erfindungsgemäße Anhang(Tag)-Komplemente durch erste und zweite Arten von Verknüpfungseinheiten an einen oder mehrere Festphasenträger gebunden, so dass (1) beide Arten von Verknüpfungseinheiten während der Anhang(Tag)-Komplement-Synthese intakt (ungespalten) bleiben und (2) eine erste Art von Verknüpfungseinheit unter Bedingungen, unter welchen die zweite Verknüpfungseinheit (oder Einheiten) nicht gespalten wird, gespalten werden kann, um die synthetisierten Oligonucleotide freizusetzen. Bevorzugt ist die spaltbare Verknüpfung eine chemisch spaltbare Verknüpfung, das heißt, geeignet zur selektiven Spaltung ohne Verwendung eines spaltenden Enzyms.
  • Eine große Zahl von Chemien zur Verknüpfung und ihre Spaltungseigenschaften sind bekannt. Beispielhafte spaltbare Verknüpfungseinheiten, welche nicht als eingrenzend gedacht sind, schließen basenlabile, säurelabile, photolabile, reduzierbare und enzymlabile Einheiten ein.
  • Basenlabile Verknüpfungen schließen zum Beispiel Ester (-C(O)O-), Thioester (-C(O)S-) und 2-Oxyethylsulfone (-OCH2CH2-S(=O)2R) ein. Solche Verknüpfungen können unter basischen Bedingungen, typischer Weise unter Verwendung eines pH-Wertes von ≥ 8,0, bevorzugt pH ≥ 9,0, über eine geeignete Zeit und unter optionaler Einbeziehung eines geeigneten Nucleophils wie Ammoniak zur Erhöhung des pH-Werts und/oder zur Förderung der Spaltung durch nucleophilen Angriff gespalten werden. Zum Beispiel kann eine di(2-Oxyethyl)sulfon-Verknüpfungseinheit durch Reaktion mit Ammoniak (28–30% in Wasser) unter milden Bedingungen (55°C über 12–15 Stunden) ohne signifikanten Schaden für das Oligonucleotid gespalten werden (Beispiel 1). Die Synthese eines ein Gemisch aus Succinatester- (spaltbar) und Succinamid- (nicht-spaltbar) Verknüpfungseinheiten enthaltenden Trägers wird in Beispiel 3 beschrieben.
  • Säurelabile Verknüpfungen schließen zum Beispiel Ester (-C(O)O-), Thioester (-C(O)S-), Ketale (O-C(R1R2)-O-), Hemiketale (O-CHR-O-) und Phosphoramidate (-OP(=O)(O–)-N-) ein. Zum Beispiel kann eine Phosphoramidatverknüpfung durch in Hirschbein et al. (Veröff.-Nr. WO 97/31009) oder Gryaznov et al. (US-Patent Nr. 5,599,922) beschriebene Verfahren in einen Träger eingeführt werden und kann durch Behandlung mit 0,8% Trifluoressigsäure in Dichlormethan über 40 Minuten bei Raumtemperatur gespalten werden (siehe auch Gryaznov et al., Nucleic Acids Res. 20 (1992), 3403–3409).
  • Beispielhafte photolabile Linker schließen 2-Nitrobenzylester, so wie beschrieben durch D. J. Yoo et al., Org. Chem. 60 (1995), 3358–3364; D. L. McMinn et al., Tetrahedron 52 (1996): 3827–3840; und US-Patent Nr. 5,430,136 an Urdea, ein.
  • Als Beispiel für reduzierbare Linker dienen sich über Disulfide verknüpfende Gruppen, welche leicht mit zum Beispiel 2-Mercaptoethanlol oder Dithiothreit reduziert werden können (Gryaznov et al., Nucleic Acids Res. 21 (1993), 1403–1408; US-Patent Nr. 5,118,605 an Urdea).
  • Enzymlabile Gruppen schließen jede Verknüpfungseinheit ein, welche durch ein Enzym gespalten werden kann. Beispielhafte Verknüpfungseinheiten schließen Estergruppen (-C(O)-O-), Peptidgruppen (-NH-C(O)-), Thioester (-C(O)-S) und Polynucleotidsequenzen, welche Endonucleaserestriktionsschnittstellen enthalten (zum Beispiel US-Patent Nr. 4,775,619 an Urdea) ein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Verknüpfungseinheit ein Oligopeptid, welches einen Aminosäurerest enthält, welcher durch eine spezifische Protease erkannt wird, zum Beispiel Lysin-X oder Arginin-X (Trypsin); Aspartat-X (Staphylococcus aureus-V8-Protease); oder Tyrosin-X, Tryptophan-X, Phenylalanin-X, Leucin-X oder Methionin-X (α-Chymotrypsin), worin X den nächsten Rest in der N → C-Richtung des Peptids darstellt. Wenn die Spaltung der Oligopeptid-Verknüpfungsgruppe ein Oligonucleotid-Peptid-Konjugat ergibt, kann der Peptidanteil wenn gewünscht unter Verwendung von Pronase oder einer anderen geeigneten Protease entfernt werden oder das Oligonucleotid kann eine Endonucleaserestriktionsschnittstelle einschließen, welche so positioniert ist, dass sie die selektive Entfernung des Peptidanteils von dem Oligonucleotid erlaubt.
  • Andere chemische Verknüpfungen werden ebenfalls in Erwägung gezogen, so wie Methionin enthaltende Oligopeptide, welche chemisch unter sauren Bedingungen unter Verwendung von Cyanogenbromid spaltbar sind. Zusätzliche Quellen, welche spaltbare Verknüpfungseinheiten beschreiben, schließen Monforte et al., (WO 96/37630), Urdea (US-Patent 5,380,833), Wong, S. S., Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press Boca Raton, FL, 1991 (insbesondere Seiten 63–67) und Allen, G., Seguencing of Proteins and Peptides, Elsevier Science Pub. B. V., New York, 1983 (insbesondere Kapitel 3) ein.
  • Viele stabile Verknüpfungseinheiten, welche im Allgemeinen widerstandsfähig gegenüber den vorstehend genannten Spaltungsbedingungen sind, sind ebenfalls bekannt. Beispielhafte stabile, „nicht-spaltbare" Einheiten schließen Ether und Polyether, Polyamine, Phosphoramidite, Phosphoramidate und ähnliches ein. Diese Einheiten sind, im Gegensatz zu einigen der vorstehend aufgeführten Gruppen, gegenüber den meisten sauren und basischen Bedingungen widerstandsfähig und sind deshalb eine besonders günstige Wahl für die in der Erfindung verwendeten nicht-spaltbaren Verknüpfungen.
  • Beispielhafte Linker für die Anbindung und/oder Synthese von Anhängen(Tags) auf der Oberfläche von Mikropartikeln sind in Pon et al., Biotechniques, 6 (1988), 768–775; Webb, US-Patent 4,659,774; Barany et al., (WO 92/04384); Brown et al., J. Chem. Soc. Commun. 1989, 891–893; Damha et al., Nucleic Acids Research, 18 (1990), 3813–3821; Beattie et al., Clin. Chem, 39 (1993), 719–722; Maskos und Southern, Nucleic Acids Research 20 (1992), 1679–1684 und ähnlichem beschrieben.
  • III. Repertoiresyntheseverfahren
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Synthese eines Repertoires von Oligonucleotid-Anhängen(Tags) und eines korrespondierenden Repertoires von Anhang(Tag)-Komplementen bereit, so dass die Synthesegenauigkeit und Ausbeute von gewünschten Anhängen(Tags) verbessert wird und Probleme, welche durch fehlerhafte Sequenzen bedingt sind, im Vergleich zu früheren Verfahren, in welchen die Anhänge(Tags) und Anhang(Tag)-Komplemente getrennt synthetisiert wurden, reduziert werden.
  • In einer Ausführungsform beinhaltet das Verfahren (1) die Synthese einer Vielzahl von Oligonucleotidpopulationen verschiedener Sequenz, welche auf einem oder mehreren Festphasenträgern immobilisiert sind, worin jede Population eine Vielzahl von Oligonucleotiden gleicher Sequenz umfasst und die Oligonucleotide in jeder Population eine Anhang(Tag)-Komplement-Sequenz umfassen, welche unterschiedlich im Vergleich mit den Anhang(Tag)-Komplement-Sequenzen in den anderen Populationen ist, (2) die Spaltung einer Fraktion einer jeden Oligonucleotidpopulation von dem einen oder mehreren Trägern und (3) Einfügen der gespaltenen Oligonucleotide in eine Vielzahl von Clonierungsvektoren, um eine Anhang(Tag)-Vektorbank zu erzeugen. Solch ein Vorgang wird in 2 dargestellt, wo ein Anhang(Tag)-Vektor-Konstrukt 1, welches eine gespaltene Anhang(Tag)-Komplement-Sequenz Tn enthält, ein Mitglied einer Anhang(Tag)-Vektorbank darstellt.
  • Der/die Festphasenträger zur Verwendung in der Erfindung kann/können durch jedes geeignete Verfahren unter Berücksichtigung der Beschreibung des vorstehenden Abschnitts II hergestellt werden. Wie vorstehend angegeben, umfassen die Verknüpfungseinheiten, welche die Anhang(Tag)-Komplemente an den Träger binden, ein Gemisch von wenigstens zwei verschiedenen Verknüpfungseinheiten, umfassend eine erste spaltbare Verknüpfungseinheit und eine zweite nicht-spaltbare Verknüpfungseinheit. Sowohl die spaltbaren als auch die nicht-spaltbaren Verknüpfungseinheiten werden so ausgewählt, dass sie dem zum Aufbau der Anhang(Tag)-Komplement-Sequenzen auf dem Träger verwendeten Syntheseprotokoll des Oligonucleotids standhalten. Die nicht-spaltbare Verknüpfungseinheit muss ebenfalls fähig sein, den Bedingungen standzuhalten, welche später zur Hybridisierung der angehängten Moleküle an die an den Träger gebundenen Anhang(Tag)-Komplemente verwendet werden.
  • Das Verhältnis von spaltbaren : nicht-spaltbaren Verknüpfungseinheiten auf dem Träger wird so ausgewählt, dass sichergestellt ist, dass (1) eine ausreichende Menge des auf dem Träger synthetisierten Anhang(Tag)-Komplement-Repertoires zur Herstellung eines komplementären Anhang(Tag)-Repertoires von dem Träger abgespalten werden kann, (2) die gespaltenen Oligonucleotide clonierbar sind oder leicht clonierbar gemacht werden können und (3) eine ausreichende Menge von Anhang(Tag)-Komplementen auf dem Träger verbleibt, um mit Anhängen (Tags) versehene Moleküle zu binden, wenn der Träger zum Sortieren verwendet wird. Bevorzugt stellen die spaltbaren Verknüpfungseinheiten weniger als 50% und stärker bevorzugt zwischen etwa 10% bis etwa 30% der gesamten gebundenen Anhang(Tag)-Komplemente. Es ist auch bevorzugt, dass eine ausgewählte Fraktion von jeder Population synthetisierter Oligonucleotide an den oder die Träger über Basen-spaltbare Verknüpfungen gebunden ist.
  • Eine große Zahl von in geeigneter Weise reaktiven Trägern zur Anbindung der gewünschten Verknüpfungseinheiten sind, wie vorstehend diskutiert, bekannt. Zum Beispiel sind hydroxyl- oder amino-derivatisierte Träger, welche zur Anbindung ausgewählter Verknüpfungsgruppen geeignet sind, kommerziell erhältlich oder können aus leicht erhältlichen Materialien, wie vorstehend diskutiert, hergestellt werden.
  • Die spaltbaren und nicht-spaltbaren Verknüpfungsgruppen können nacheinander oder gleichzeitig an den Träger gebunden werden. Bevorzugt können die Verknüpfungseinheiten auf einen Festphasenträger durch gleichzeitige Umsetzung eines Gemisches von spaltbaren und nicht-spaltbaren Linkern mit komplementären reaktiven Resten auf dem Träger eingeführt werden. Somit können die relativen Anteile von spaltbaren und nicht-spaltbaren Einheiten auf dem Träger durch geeignete Auswahl des Verhältnisses der Linker für die Derivatisierungsreaktion unter Berücksichtigung der relativen Reaktivitäten der Linker in Bezug auf die komplementären reaktiven Reste auf dem festen Träger gesteuert werden. Zum Beispiel kann, wenn die spaltbaren und nicht-spaltbaren Linker gegenüber dem Träger gleich reaktiv sind, ein Verhältnis der spaltbaren : nicht-spaltbaren Linker von 10 : 90 verwendet werden, um einen derivatisierten Träger herzustellen, in dem 10% der gebundenen Anhang(Tag)-Komplemente von dem Träger abspaltbar sind. Ähnlich kann ein Verhältnis von 30 : 70 verwendet werden, um einen derivatisierten Träger herzustellen, in welchem 30% der Anhang(Tag)-Komplemente spaltbar sind. Wenn nötig, kann der relative Anteil eines weniger reaktiven Linkers gesteigert werden, um eine größere Reaktivität der anderen Art von Linker auszugleichen.
  • Zum Beispiel wurden in dem in Beispiel 1 beschriebenen Protokoll mit Ethylendiamin derivatisierte und über Glycidyl-methacrylat/Ethylendimethacrylat (95/5) quervernetzte Perlen gleichzeitig mit einem molaren 10 : 90-Verhältnis von spaltbaren : nicht-spaltbaren Linkern durch eine Standardphosphoramiditreaktionschemie umgesetzt. Durch diese Reaktion werden beide Linker an Aminogruppen auf dem Träger gebunden, um Phosphoramiditverknüpfungen zu erzeugen, welche später oxidiert werden können, um stabile Phosphoramidatgruppen zu erzeugen (1). Der spaltbare Linker, welcher auf dem Träger als 2-[2-(4,4'- Dimethoxytrityloxy)-ethylsulfonyl]ethyl-(2-cyanoethyl)-(N, N-diisopropyl)-phosphoramidit eingeführt werden kann, enthält eine Di(2-oxyethyl)sulfon-Einheit, welche stabil gegenüber sauren und oxidierenden Bedingungen ist und während der Oligonucleotidsynthese intakt bleibt, aber gegenüber basisch katalysierter Spaltung empfindlich ist, wie in 1 gezeigt. Der nicht-spaltbare Linker in 1, welcher dem Träger als 9-O-Dimethoxytrityl-triethylenglycol, 1-[(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropyl)]-phosphor-amidit hinzugefügt werden kann, umfasst einen Polyethylenoxid-Linker, welcher gegenüber den Bedingungen zur Oligonucleotidsynthese und gegenüber den basischen Bedingungen, welche verwendet werden können, um die spaltbare Verknüpfungseinheit zu spalten, stabil ist.
  • Die Anhang(Tag)-Komplemente enthaltenden Oligonucleotide werden dem mit den Linkern derivatisierten Träger unter Verwendung jeglicher geeigneter Reaktionsbedingungen hinzugefügt. Eine breite Vielfalt von Synthesestrategien wurde im Fachgebiet entwickelt und wurde beschrieben (zum Beispiel Gait, 1990 (vorstehend) und andere vorstehend zitierte Quellen zur Synthese). Zur Zeit wird das Festphasenphosphoramiditverfahren bevorzugt, da es Kopplungsausbeuten von etwa 99% oder höher bereitstellt. Bevorzugt wird die Synthese unter Verwendung jeglicher aus einer Vielfalt verfügbarer Geräte und Reagenzien automatisiert, um eine effiziente Synthese bereitzustellen.
  • Um die Herstellung eines Anhang(Tag)-Repertoires, welches komplementär zu den Anhang(Tag)-Komplementen ist, zu erleichtern, schließen die immobilisierten Anhang(Tag)-Komplement-Oligonucleotide bevorzugt einen ersten und zweiten Primerabschnitt ein, welche die Anhang(Tag)-Komplement-Sequenz in jedem Oligonucleotid flankieren. So wird bevorzugt der Anbindung der Linker an den Träger folgend dem Linker eine erste Primersequenz hinzugefügt, typischerweise durch aufeinanderfolgende Hinzufügung der entsprechenden Monomere an die Linker. In dem in Beispiel I beschriebenen Protokoll wird ein Primerabschnitt, welcher die Sequenz 5'-TCCTTAATTAACTGGTCTCACTGTCGCA-3' (SEQ ID NO: 1) hat, durch aufeinanderfolgende Hinzufügung von Monomeren in der 3' nach 5'-Richtung unter Verwendung der Phosphoramidit-Phosphotriesterchemie hinzugefügt. Alternativ kann ein Primerabschnitt getrennt synthetisiert werden und an den Linker in einer einzelnen Kopplungsreaktion gebunden werden. Bevorzugt stellen der Linker und jegliche hinzugefügte Primersequenz zusammen eine Spacereinheit bereit, welche einen Abschnitt von wenigstens 10 Kettenatomen enthält, um die Abtrennung des Anhang(Tag)-Komplement-Abschnittes (unmittelbar nachstehend diskutiert) von der Oberfläche des Trägers und von anderen Anhang(Tag)-Komplementen auf dem Träger zu unterstützen. Bevorzugt hat der Spacer (einschließlich einer optionalen Primerbindungssequenz) eine Länge von 10 bis 30 Nucleotiden. Das Vorliegen einer Spacereinheit ist besonders nützlich, um sicherzustellen, dass die Anhang(Tag)-Komplemente für die Hybridisierung mit komplementären Anhang(Tag)-Sequenzen für die Sortierung leicht zugänglich sind.
  • Die Anhang(Tag)-Komplement-Sequenz in jedem Oligonucleotid kann durch aufeinanderfolgende Hinzufügung von Monomeren oder Blöcken von Monomeren oder durch gleichzeitiges Hinzufügen eines getrennt synthetisierten Repertoires von Anhang(Tag)-Komplementen hinzugefügt werden, wobei die aufeinanderfolgende Hinzufügung von Monomeren bevorzugt ist. Repertoires können auf einer planaren Anordnung durch im Fachgebiet bekannte (vorstehend) photolithographische oder robotertechnische Dispensierverfahren erzeugt werden. Für auf Perlen oder Partikeln erzeugte Repertoires werden Anhang(Tag)-Komplement-Sequenzen bevorzugt kombinatorisch unter Verwendung eines Teile und Mische-Ansatzes, so wie durch Brenner in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 96/41011 beschrieben, erzeugt. Kurz gesagt, wird eine Vielzahl von verschiedenen, minimal kreuzhybridisierenden Oligonucleotid-„Wort"-Sequenzen ausgewählt, welche dazu ausgelegt sind sicherzustellen, dass die synthetisierten Anhang(Tag)-Komplemente nur fähig sein werden, unter ausgewählten Hybridisierungsbedingungen an ihre entsprechenden komplementären Anhänge(Tags) zu hybridisieren, das heißt, so dass die Spiegel jeglicher inkorrekt hybridisierter Anhänge(Tags) und Anhang(Tag)-Komplemente unbedeutend sind.
  • In dem in Beispiel I beschriebenen Protokoll besteht jede Anhang(Tag)-Komplement-Sequenz aus einer linearen Kette von acht „Wörtern", jedes ausgewählt aus dem gleichen Satz von acht tetrameren Wörtern. Die mit Primern derivatisierten Perlen werden in acht Teile aufgeteilt, welche in acht getrennte Synthesesäulen auf einem automatisierten Syntheseautomaten geladen werden. In jeder Säule wird ein unterschiedliches Wort aus den acht möglichen Worten den Perlen durch aufeinanderfolgende Hinzufügung von entsprechenden Monomeren hinzugefügt. Nachdem die Synthese des ersten Wortes in jeder Säule abgeschlossen ist, werden die Perlen aus den acht Säulen vereinigt und behutsam miteinander bis zur Homogenität vermischt. Nach dem Mischen wird die Perlenmischung wieder in gleiche Teile aufgeteilt, welche für noch einen Zyklus der Hinzufügung eines Wortes in die acht Säulen geladen werden. Eine Summe von acht Zyklen der Hinzufügung von Wörtern wird durchgeführt, um Perlen mit einer Summe von 88 (≈ 1,7 × 107) verschiedenen möglichen Anhang(Tag)-Komplement-Sequenzen herzustellen. Das Teile und Mische-Protokoll stellt sicher, dass jede Perle eine im Wesentlichen gleichförmige Population von Oligonucleotiden gleicher Sequenz enthält, das heißt, die Oligonucleotide auf einer bestimmten Perle haben im Wesentlichen die gleichen Sequenzen.
  • Wenn nötig können die Sequenzen von immobilisierten Anhang(Tag)-Komplementen direkt auf dem Festphasenträger durch jegliches bekannte Sequenzierverfahren bestimmt werden. Bevorzugt enthalten die Anhang(Tag)-Komplemente eine Universalprimer bindende Sequenz auf der 3'-Seite der Anhang(Tag)-Komplement-Sequenz, so dass die Anhang(Tag)-Komplemente durch das Didesoxysequenzierverfahren von Sanger durch Anlagerung und Verlängerung eines komplementären Sequenzierprimers sequenziert werden können. Es ist jedoch für gewöhnlich nicht notwendig, die Sequenzen der immobilisierten Anhang(Tag)-Komplemente zu kennen.
  • Der Hinzufügung der Anhang(Tag)-Komplement-Sequenz folgend, können zusätzliche Nucleotidreste angehängt werden, um eine zweite Primersequenz, eine oder mehrere Endonucleaserestriktionsschnittstellen und/oder jegliche andere gewünschte Eigenschaften einzubauen. Zum Beispiel wird in dem Protokoll von Beispiel 1 ein hexamerer Block von GGGCCC an das Anhang(Tag)-Komplement angehängt, um (1) die Verankerung des Anhang(Tag)-Komplements an seinen entsprechenden komplementären Anhang(Tag) unter Verwendung der Hybridisierung zu erleichtern, (2) das Ende des Anhang(Tag)-Komplement-Abschnittes zu definieren und (3) eine Bsp120I-Restriktionsschnittstelle für die nachfolgende Ligierung an einen Vektor einzuführen. Dem folgt die Hinzugabe einer zweiten Primersequenz (Primer 2) zur optionalen Amplifikation, wie dies weiter nachstehend diskutiert wird.
  • So schließen in einer bevorzugten Ausführungsform die immobilisierten Oligonucleotide, welche die Anhang(Tag)-Komplement-Sequenzen enthalten, die folgenden Eigenschaften ein:
    [Träger]-[Verknüpfungseinheit]-[Spacer][Anhang(Tag)-Komplement]-[terminaler Abschnitt]
    wobei die Verknüpfungseinheit, wie vorstehend diskutiert, entweder spaltbar oder nicht-spaltbar ist, der Spacerabschnitt (welcher bevorzugt eine Länge von 10 bis 30 Nucleotiden hat) optional (1) eine Endonucleaserestriktionsschnittstelle und/oder (2) eine Universalprimer bindende Sequenz enthält, der Anhang(Tag)-Komplement-Abschnitt (welcher bevorzugt eine Länge von 12 bis 60, 18 bis 40 oder 25 bis 40 Nucleotiden hat) die vorstehend diskutierten Eigenschaften hat und der terminate Abschnitt (welcher bevorzugt eine Länge von 0–40 Nucleotiden oder 10 bis 30 Nucleotiden hat) optional enthält (1) eine Endonucleaserestriktionsschnittstelle, welche gleich oder verschieden zu der ersten Restriktionsschnittstelle sein kann, und (2) eine Universalprimer-Sequenz, welche gleich oder verschieden zu dem Komplement jeder Primerbindungssequenz in dem Spacer sein kann. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Anhang(Tag)-Komplement-Sequenz in jedem Oligonucleotid durch eine erste und zweite Endonucleaserestriktionsschnittstellen flankiert, welche die gleiche oder verschieden sein können, um die nachfolgende Ligierung in einen ausgewählten Vektor zu erleichtern.
  • Nachdem die Oligonucleotidsynthese abgeschlossen ist, wird die Schutzgruppe der Oligonucleotide wenn nötig entfernt und ein Anteil des Anhang(Tag)-Komplement-Repertoires wird von dem/den Träger(n) unter Verwendung geeigneter Reaktionsbedingungen zur selektiven Spaltung nur der spaltbaren Verknüpfungseinheiten abgespalten, während die nicht-spaltbaren Verknüpfungseinheiten intakt gelassen werden.
  • Günstigerweise werden der Abspaltungsschritt und jegliche Schritte zur Entfernung der Schutzgruppe gleichzeitig unter Verwendung eines einzelnen Reagenzes durchgeführt. Zum Beispiel kann, wenn die spaltbare Verknüpfungseinheit und eine oder mehrere Schutzgruppe basenlabil sind, der Träger mit einer Base behandelt werden, um die Schutzgruppen zu entfernen und die spaltbaren Oligonucleotide vom Träger abzuspalten. Natürlich können der Schritt der Entfernung der Schutzgruppe und der Spaltungsschritt auch getrennt durchgeführt werden.
  • Das gespaltene Gemisch der Oligonucleotide kann, wie nachstehend weiter diskutiert, direkt in einen ausgewählten Clonierungsvektor eingefügt werden. Die Mischung wird jedoch bevorzugt unter Verwendung eines jeglichen günstigen Verfahrens aufgereinigt, um fehlerhafte Sequenzen und andere Fremdmaterialien zu entfernen. Zum Beispiel kann das Gemisch schnell und günstig durch HPLC, Ionenaustausch oder Umkehrphasen-Chromatographie durch bekannte Verfahren aufgereinigt werden. Eine elektorphoretische Auftrennung kann ebenfalls verwendet werden. Für die Umkehrphasen-Chromatographie enthalten die synthetisierten Oligonucleotide bevorzugt eine hydrophobe Gruppe wie Trityl oder Dimethoxytrityl (DMT), um die bevorzugte Adsorption von tritylierten Oligonucleotiden auf dem adsorbierenden Stoff zu erleichtern, während nicht-tritylierte Sequenzen (aus fehlgeschlagenen Konjugationsschritten stammend) im Wesentlichen nicht von der Säule zurückgehalten werden. Typischer Weise eluiert (oder wandert) das gewünschte Gemisch der Oligonucleotide als breiter Gipfel, da ein ausgedehntes Spektrum von Sequenzen mit unterschiedlichem G/C-Gehalt und unterschiedlicher Verteilung vorliegt. Das Gemisch kann weiter durch Ethanolextraktion oder ähnliches aufgereinigt werden und das sich ergebende Gemisch kann trocken oder in einem stabilen Lagerungsmedium bevorzugt unter 0°C gelagert werden. Die Intaktheit der Sequenzen der Oligonucleotide kann durch zufällige Sequenzierung einzelner Mitglieder des Gemisches (für gewöhnlich nachdem das Gemisch in einen Clonierungsvektor eingefügt worden ist) beurteilt werden.
  • Für die nachfolgende Bindung an interessierende Probepolynucleotide werden die gespaltenen Oligonucleotide bevorzugt in einen oder mehrere Clonierungsvektoren eingefügt, um eine Anhang(Tag)-Vektorbank zu erzeugen. Jegliche Art von vervielfältigbarem Vektor wie ein Plasmid, Phagemid, Cosmid oder ähnliches, welches in einem geeigneten Wirt vermehrt werden kann, kann verwendet werden. Der Vektor kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Eine Vielfalt von geeigneten Vektoren ist von kommerziellen Quellen erhältlich (zum Beispiel: New England Biolabs, Clontech, GibcoBRL und so weiter) oder wurde in der Literatur beschrieben. Der Vektor wird im Allgemeinen eine oder mehrere Restriktionsschnittstellen zum Einfügen fremder DNA, wenigstens eines Selektionsmarkers (zum Beispiel eine Ampicillinresistenz), optional einer Universalprimer-Sequenz stromaufwärts der Einfügungsstelle (zum Beispiel zur Sequenzierung der Insertion) und jeglicher notwendiger Komponenten zur Vermehrung des Vektors in einem geeigneten Wirt enthalten. Bevorzugt schließt der Vektor eine erste Restriktionsschnittstelle zum Einfügen eines Oligonucleotid-Anhangs(Tags) und eine zweite Restriktionsschnittstelle unmittelbar angrenzend an die erste Stelle zum Einfügen eines Probenfragmentes in enger Nähe zu einem Anhang(Tag) ein. Alternativ kann die Restriktionsschnittstelle zum Einfügen des Probenfragmentes in den Vektor über das Anhang(Tag)-Oligonucleotid eingefügt werden, welches eine Endonucleaseschnittstelle unmittelbar angrenzend an den Anhang(Tag)-Abschnitt enthält.
  • Zum Einfügen in einen doppelsträngigen Vektor werden die gespaltenen Oligonucleotide bevorzugt durch Anlagerung eines komplementären Primers an einen universellen 3'-Primerabschnitt in den Oligonucleotiden und Verlängerung des Primers durch jegliche geeignete Mittel in eine doppelsträngige Form umgewandelt. Das doppelsträngige Produkt enthält eine Anhang(Tag)-Sequenz, welche perfekt mit einer entsprechenden Anhang(Tag)-Komplement-Sequenz basengepaart ist. Typischer Weise wird der angelagerte Primer in der 3'-Richtung unter Verwendung einer DNA-Polymerase in der Anwesenheit eines Gemisches von dNTPs verlängert. Um die Menge von doppelsträngigen Oligonucleotiden für das Einfügen in den Vektor zu steigern, kann das Gemisch der Oligonucleotide durch eine Polymerasekettenreaktion unter Verwendung eines Paares von Primern, welche sich an Primerbindungssequenzen anlagern, welche die Anhang(Tag)-Komplement-Sequenzen flankieren, vervielfältigt werden, bis die gewünschte Menge von doppelsträngigem Produkt erhalten wird.
  • Das Gemisch doppelsträngiger Anhang(Tag)-Oligonucleotide kann durch Standardligierungstechniken, zum Beispiel über Ligierung von glatten oder klebrigen Enden, in einen Vektor eingefügt werden. Typischer Weise werden der Vektor und das Gemisch der Oligonucleotide getrennt jeweils mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen behandelt, um Produkte zu erzeugen, welche kohäsive Enden haben. Bevorzugt werden der Vektor und das Gemisch der Oigos getrennt jeweils mit zwei verschiedenen Restriktionsenzymen behandelt, um Produkte zu erzeugen, welche zwei verschiedene klebrige Enden haben, um dazu beizutragen, die Religierung des Vektors ohne Einbau einer Insertion zu verringern. Der gespaltene Vektor kann auch mit Phosphatase aus Kälberdarm behandelt werden, um die Selbstligierung des Vektors ohne Isertion zu hemmen. Zum Beispiel werden in Beispiel 2D das Gemisch der Oligonucleotide und der Vektor jeweils mit PacI und Bsp120I behandelt. Das größere Fragment des gespaltenen Vektors wird mit Phosphatase aus Kälberdarm behandelt und wird dann mit dem durch Restriktion behandelten Gemisch der Oligonucleotide in der Anwesenheit einer Ligase umgesetzt, um ein Gemisch von Anhang(Tag)-Vektoren zu erzeugen.
  • Das Produkt der Ligierung kann dann verwendet werden, um einen geeigneten Wirt zu transformieren, um eine Anhang(Tag)-Vektorbank zu erzeugen. Die Transformanten werden gezüchtet, bis eine gewünschte Zahl von Transformanten gesammelt worden sind. Im Allgemeinen sollte die Zahl de Transformanten die Komplexität des Anhang(Tag)-Repertoires überschreiten, um sicherzustellen, dass ein hoher Anteil der Mitglieder des Repertoires enthalten ist. Bevorzugt ist die Menge der Transformanten ausreichend, um ein Vorliegen von wenigstens 90% des Repertoires in der Anhang(Tag)-Vektorbank, stärker bevorzugt wenigstens 95% und stärker bevorzugt mehr als 99% sicherzustellen.
  • Erfindungsgemäße Anhang(Tag)-Vektorbanken sind nützlich dafür, gleichzeitig und einmalig eine große Zahl von Probenoligonucleotidfragmenten mit Anhängen (Tags) zu versehen, so dass die mit Anhängen versehenen Oligonucleotide auf eine Anordnung von Anhang(Tag)-Komplementen für die weitere Verarbeitung oder Untersuchung sortiert werden können. Somit können die Anhang(Tag)-Vektoren verwendet werden, um durch das Kombinieren einer Anhang(Tag)-Vektorbank mit einem Gemisch von verschiedenen Polynucleotidfragmenten unter Ligierungsbedingungen, welche wirksam sind, die verschiedenen Fragmente an einer einer Anhang(Tag)-Sequenz benachbarten Stelle in jedem Vektor einzufügen, eine Bank von mit Anhängen (Tags) versehenen Polynucleotidfragmenten zu erzeugen, so dass jedes Probenfragment (Sn in 2) mit einem unterschiedlichen Anhang(Tag) (Tn) assoziiert wird. Ein Mitglied von so einer Anhang(Tag)-Vektorbank wird durch das Konstrukt 2 in 2 dargestellt. Um zu verhindern, dass der gleiche Anhang(Tag) mit zwei oder mehr verschiedenen Probenfragmenten assoziiert wird, überschreitet die Komplexität der Anhang(Tag)-Vektorbank bevorzugt die Komplexität der Probe.
  • Zum Beispiel wurde in Beispiel 2D die Anhang(Tag)-Vektorbank pBP9 mit BbsI und BamHI gespalten, um ein großes Vektorfragment zu erzeugen, welches eine Anhang(Tag)-Sequenz benachbart zu der BbsI-Stelle (innerhalb von 20 Nucleotiden) besitzt. Das Vektorfragment wurde mit Phosphatase behandelt, um 5'-Phosphatgruppen zu entfernen, und ein Oligonucleotidprobengemisch (cDNA), welches klebrige BbsI/BamHI-Enden besitzt, wurde durch Ligierung in den Vektor eingefügt. Das Ligierungsgemisch wurde verwendet, um E. coli-Wirtszellen zu transformieren, und Anteile, welche annähernd 1,6 × 105 Clone umfassten, wurden verwendet, um flüssige Kulturen anzuimpfen, um die Bank zu erweitern. Aus diesen Kulturen wurde Plasmid-DNA extrahiert und eingelagert.
  • Mit Anhängen versehene Polynucleotide aus den Anhang(Tag)-Oligonucleotiden in der Bank können durch jegliches gewünschtes Verfahren verarbeitet oder untersucht werden. Um den Nachweis zu erleichtern, können die mit Anhängen (Tags) versehenen Polynucleotide durch PCR unter Verwendung eines Universalprimerpaares für die Mitvervielfältigung vervielfältigt werden, gefolgt von der optionalen Aufreinigung der gewünschten Produkte von der Matrize und den Vervielfältigungsreagenzien (Beispiel 2E). Wenn die Anhänge(Tags) in einzelsträngiger Form verwendet werden sollen, um einzel- oder doppelsträngige Anhang(Tag)-Komplemente zu binden, können die Anhang(Tag)-Stränge von ihren komplementären Strängen durch Denaturierung und Gewinnung der gewünschten Anhang(Tag)-Stränge, zum Beispiel durch Festphasenbindung von biotinylierten Anhang(Tag)-Strängen auf einem Streptavidinträger, getrennt werden. Alternativ kann der komplementäre Strang unter Verwendung einer Exonuclease mit 5' → 3'- oder 3' → 5'-Exonucleaseaktivität in der Anwesenheit eines ausgewählten dNTPs, welches nicht in dem Anhang(Tag)-Komplement-Bereich enthalten ist, so dass die Exonuclease effektiv am Ende des Anhang(Tag)-Komplements stoppt, entfernt werden. Wenn zum Beispiel die Anhang(Tag)-Sequenz A-, C- und T-Basen, aber nicht G enthält dann enthält die komplementäre Sequenz T, G und A, aber nicht C. Die Verwendung einer Exonuclease in der Anwesenheit von CTP ist wirksam, um die komplementäre Sequenz zu entfernen bis das erste C in der komplementären Sequenz erreicht ist.
  • Die mit Anhängen (Tags) versehenen Oligonucleotide (auch bezeichnet als mit Anhängen (Tags) versehene Oligonucleotidfragmente) werden an das immobilisierte Anhang(Tag)-Komplement-Repertoire unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen, wie vorstehend diskutiert oder wie in Beispiel 2E dargestellt, hybridisiert. Wenn der feste Träger Partikel oder Perlen umfasst, können die Partikel oder Perlen in der Anwesenheit von mit Anhängen (Tags) versehenen Oligonucleotiden bei konstanter Bewegung zur Erleichterung der Hybridisierung, gefolgt von einem Waschschritt, inkubiert werden. Wenn nur ein kleiner Anteil der Perlen mit komplementären Anhängen (Tags) hybridisiert wird, können die hybridisierten Perlen von nicht-hybridisierten Perlen durch jegliches geeignete Verfahren, zum Beispiel durch FACS (fluoreszenzaktivierte Zellsortierung), getrennt werden. Zu diesem Zweck schließen die mit Anhängen (Tags) versehenen Polynucleotide eine nachweisbare Markierung wie eine fluoreszierende Markierung (zum Beispiel über einen PCR-Primer) ein, um den Nachweis der hybridisierten mit Anhängen (Tags) versehenen Polynucleotide zu erleichtern.
  • Nach Hybridisierung an das immobilisierte Anhang(Tag)-Komplement-Repertoire können die mit Anhängen (Tags) versehenen Polynucleotide entsprechend jeglichem geeigneten Verfahren untersucht werden. Zum Beispiel können immobilisierte, mit Anhängen (Tags) versehene Polynucleotide, zum Beispiel unter Verwendung der immobilisierten Polynucleotide als Matrizen, um markierte Verlängerungsprodukte durch zyklische Sequenzierung, zum Beispiel wie gelehrt durch Brenner (WO 96/12039, WO 95/27080), zu erzeugen, sequenziert werden. Alternativ können hybridisierte Polynucleotide von ihrem Träger denaturiert werden und entsprechend bekannter Lösungsphasenverfahren sequenziert werden.
  • Die Erfindung ist auch nützlich zur Sortierung verschiedener cDNAs auf einem festen Träger zur Sequenzuntersuchung oder -Quantifizierung. Zum Beispiel können die Anhänge(Tags) verwendet werden, um differentielle Display-Experimente zur Charakterisierung von Änderungen in Transskriptspiegeln von verschiedenen Proben, zum Beispiel zu Charakterisierung von verschiedenen Zell- und Gewebearten, Erkrankungszuständen und so weiter, durchzuführen. Die Erfindung kann auch verwendet werden, um die Toxizität verschiedener Verbindungen wie in WO 97/13877 offengelegt, zu bestimmen.
  • Wenn die mit Anhängen (Tags) versehenen Moleküle Polypeptide sind, können die immobilisierten Polypeptide zum Beispiel durch Behandlung mit zielspezifischen Antikörpern zur Identifizierung spezifischer Polypeptidspezies weiter charakterisiert werden. Die Synthese von Anhang(Tag)-Peptidkonjugaten wird zum Beispiel in WO 96/12014 auf Seite 14 beschrieben.
  • Zusätzliche Verwendungen, einschließlich Verfolgung, Identifizierung und/oder Sortierung von Klassen oder Unterpopulationen von Molekülen, DNA-Sequenzierung mRNA-Fingerprinting und so weiter für die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene Anhang(Tag)- und Anhang(Tag)-Komplement-Repertoires werden zum Beispiel in WO 95/27080; WO 96/12014; WO 96/12039; WO 96/13877; WO 96/41011 und WO 97/46704 offenbart.
  • Die Erfindung kann im Licht der folgenden Beispiele, von welchen in keiner Weise beabsichtigt ist, dass sie den Umfang der Erfindung begrenzen, weitergehend verstanden werden.
  • Beispiel 1
  • Synthese von Anhang(Tag)-Komplementen
  • Alle kommerziellen Chemikalien hatten Synthesequalität und wurden ohne weitere Aufreinigung verwendet. Oligonucleotidsynthesen wurden unter Verwendung eines GENE ASSEMBLER PLUS-SPECIAL/4 PRIMERS-Syntheseautomaten (Pharmacia) unter Verwendung von amino derivatisierten, polymeren 5,6 μm-Perlen (95% Glycidyl-methacrylat/5% Ethylendimethacrylat derivatisiert mit Ethylendiamin von Bangs Laboratories Inc., Fishers, Indiana) durchgeführt. Von den Perlen wurde geschätzt, dass sie eine Dichte der Aminogruppen von etwa 107 Aminogruppen pro Perle besitzen. Zusätzlich zu den mit den Synthesesäulen von Pharmacia bereitgestellten 25 μm-Polypropylenfiltern wurde dem Ende einer jeden Synthesesäule eine GFA-Glasfiltermatte (Whatman) hinzugefügt, um die Rückhaltung der Perlen zu verbessern. Alternativ wurden Synthesesäulen aus Edelstahlröhren (1–5 mm Länge × 0,75 Zoll Durchmesser), welche Schraubkappenenden besaßen, um einen PEEK-Filter mit einer Porengröße von 2 μm zur Rückhaltung der Perlen an jedem Ende zu halten (solch eine Säule mit 5 mm Länge hat eine Kapazität von etwa 600 mg Perlen).
  • 4,8 g amino-derivatisierte Perlen wurden in jede der 8 Synthesesäulen, jede 600 mg Perlen enthaltend, gepackt. Um die spaltbaren Verknüpfungseinheiten zu erzeugen, wurden 250 mg 5'-PHOSPHATE-ON-Reagenz (2-[2-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-ethylsulfonyl]ethyl-(2-cyano-ethyl)-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidit von Clontech, Katalog Nr. 5210-2) in 3,8 ml wasserfreiem Acetonitril gelöst, um eine Konzentration von 0,1 M zu ergeben. Um die nicht-spaltbaren Verknüpfungseinheiten zu erzeugen, wurden 250 mg SPACER PHOSPHORAMIDIT (9-O-Dimethoxytrityl-triethylenglycol, 1-[(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropyl)]-phosphoramidit von Clontech, Katalog Nr. 5260-3) getrennt in 3,8 ml wasserfreiem Acetonitril gelöst, um eine Endkonzentration von 0,1 M zu ergeben. Diese zwei Lösungen wurden in einem Verhältnis gemischt, um jegliche gewünschte prozentuale Spaltbarkeit bereitzustellen. Um zum Beispiel eine 10%ige Spaltbarkeit zu erreichen, wurden 1 Teil PHOSPHATE-ON-Lösung (zum Beispiel 200 μl) mit 9 Teilen SPACER PHOSPHORAMIDIT (zum Beispiel 1800 μl) in einer trockenen Flasche vereinigt, welche dann an den zusätzlichen Phosphoramiditanschluss am GENE ASSEMBLER SPECIAL PRIMERS 4-Gerät angehängt wurde. Alle Übertragungen wurden mit einer Spritze durchgeführt und die Flaschen wurden mit Argon eingehüllt, um die Exposition gegenüber Wasserdampf in der Luft zu minimieren.
  • Der Hinzufügung der Linker (spaltbar und nicht-spaltbar) an die Perlen folgend wurde die nachstehende DNA-Sequenz (Primer I, SEQ ID NO: I) auf den Perlen in der 3'- nach 5'-Richtung unter Verwendung des Phosphittriester (Phosphoramidit)-Verfahrens (M. J. Gait, Herausgeber, Oligonucleotide Synthesis, a Practical Approach, IRL Press, London, UK, 1990, insbesondere Kapitel 3) unter Verwendung der folgenden geschützten Monomere: T (ungeschützt), A und C (Benzoyl) und G (Isobutyryl) synthetisiert:
    5'-TCCTTAATTAACTGGTCTCACTGTCGCA-3' (Primer 1, SEQ ID NO: 1)
  • Als nächstes wurde eine unterschiedliche „Wort"-Sequenz an die Primermatrizensequenz in jeder Säule durch Phosphoramiditsynthese durch aufeinanderfolgende Hinzufügung der entsprechenden Monomere angehängt. Die Sequenzen der 8 Wörter waren:
    • 1) 5'-CTTT (SEQ ID NO: 20)
    • 2) 5'-TACT (SEQ ID NO: 22)
    • 3) 5'-ACAT (SEQ ID NO: 22)
    • 4) 5'-AATC (SEQ ID NO: 23)
    • 5) 5'-TTAC (SEQ ID NO: 24)
    • 6) 5'-TCTA (SEQ ID NO: 25)
    • 7) 5'-ATCA (SEQ ID NO: 26)
    • 8) 5'-CAAA (SEQ ID NO: 27)
  • Dem Abschluss des Schrittes der ersten Hinzufügung eines Wortes folgend wurden die Perlen von den Säulen gewonnen, miteinander gemischt und wieder in die Säulen geladen, wonach wieder jede unterschiedliche „Wort"-Sequenz getrennt in den 8 Säulen durch Phosphoramiditsynthese wie vorstehend, gefolgt von der Gewinnung der Perlen, wiederholter Mischung und Wiederbeladung der Säulen hinzugefügt wurde. Dieser Zyklus der Hinzufügung von Wörtern und Mischung/Aufteilung der Perlen wurde in der Summe 8-mal durchgeführt, um eine Oligonucleotidbank von etwa 1,7 × 107 (= 88) verschiedenen Oligonucleotidsequenzen zu erzeugen. Nachdem diese kombinatorische Synthese abgeschlossen war, wurde die Sequenz 5'-CCC-3' (mit angehängtem Trityl) den Perlen hinzugefügt, was ein Gemisch von immobilisierten Oligonucleotiden ergab, welche die folgende allgemeine Formel besitzen (SEQ ID NO: 2)
  • Figure 00440001
  • Der Hinzufügung des CCC-Abschnittes folgend wurde bei einem Teil der Perlen (4,3 g = 90%) die Schutzgruppe mit gesättigtem wässrigen Ammoniak (2 ml, 28–30% in Wasser) bei 55°C über 12 Stunden entfernt. Die Perlen mit entfernter Schutzgruppe wurden dann über 15 Minuten mit Essigsäure behandelt, um die terminale 5'-Trityl-Gruppe zu entfernen. Nachdem die Säure entfernt worden war, wurden die Perlen mit Methanol gewaschen und im Vakuum konzentriert. Die Perlen waren dann für die Hybridisierung bereit.
  • Der verbleibende Anteil der Perlen (0,5 g = 10%) wurde mit entsprechenden Phosphoramiditmonomeren umgesetzt, um die Sequenz 5'-CCTTAGGG-3' (Primer 2, mit angehängtem Trityl, SEQ ID NO: 3), gefolgt von der Entfernung der Schutzgruppe mit Ammoniak (2 ml) bei 55°C über 12 Stunden, hinzuzufügen. Die Behandlung mit Ammoniak war auch wirksam, um die spaltbaren Linker zu spalten, um 10% der Oligonucleotide von den Perlen freizusetzen. Die Perlen wurden durch Zentrifugation entfernt und die verbleibende Ammoniaklösung wurde durch Vakuum auf die Hälfte des ursprünglichen Volumens konzentriert. Die gespaltenen Oligonucleotide in diesem Gemisch hatten die allgemeine Formel (SEQ ID NO: 4):
  • Figure 00450001
  • Das Gemisch der Oligonucleotide wurde durch HPLC-Chromatographie unter Verwendung einer 150 mm × 4,6 mm-PLRP-S-Säule von Polymer Laboratories (100 Ångström Porengröße, 8 μm Partikelgröße) auf einem Gilson-HPLC-Gerät aufgereinigt. Ein 2-stufiger Lösemittelgradient wurde verwendet: Puffer A: 0,2 M Triethylammoniumacetat und 2% Acetonitril in Wasser, Puffer B: 100% Acetonitril; Flussrate = 1 ml/min bei Raumtemperatur; Gradientenprogramm: 95% A über 1 Minute; verringere auf 80% A über 5 Minuten und halte bei 50% A über 5 Minuten; kehre auf 95% A zurück über 5 Minuten und halte bei 95% A über 10 Minuten, um die Säule wieder zu äquilibrieren. Der gesamte, breite Peak mit angehängtem Trityl wurde zwischen 18 Minuten und 20 Minuten gesammelt. Die gesammelten Fraktionen wurden im Vakuum konzentriert, über 15 Minuten mit Eisessig behandelt, um die 5'-Tritylgruppen zu entfernen und im Vakuum bis zur Trockenheit konzentriert. Der Rückstand wurde in 300 μl Wasser gelöst und in ein 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. Dazu wurden 100 μl von 4 M NaCl hinzugefügt und das Gemisch wurde mit einem Verwirbelgerät gemischt. Nach Zugabe von 1 ml Ethanol wurde die Probe mit einem Verwirbelgerät gemischt und dann bei –20°C über 20 Minuten gekühlt. Die ausgefällte DNA wurde zentrifugiert und der Überstand wurde entfernt. Der Ausfällungsvorgang wurde noch zweimal wiederholt. Das schließlich aufgereinigte Gemisch wurde als BP9 bezeichnet.
  • Beispiel 2
  • Clonierung und Herstellung von Anhängen(Tags)
  • A. Plasmidclonierungsvektor. Ein Plasmidclonierungsvektor pLCV2 wurde aus dem Plasmidvektor pBC.SK– (Stratagene) wie folgt hergestellt, unter Verwendung der folgenden Oligonucleotide:
  • S-723 (SEQ ID NO: 5)
    • 5'-CGA GAA AGA GGG ATA AGG CTC GAG CTT AAT TAA GAG TCG ACG AAT TCG GGC CCG GAT CCT GAC TCT TTC TCC CT-3'
  • S-724 (SEQ ID NO: 6)
    • 5'-CTA GAG GGA GAA AGA GTC AGG ATC CGG GCC CGA ATT CGT CGA CTC TTA ATT AAG CTC GAG CCT TAT CCC TCT TTC TCG GTA C-3'
  • S-785 (SEQ ID NO: 7)
    • 5'-TCG AGG CAT AAG TCT TCG AAT TCC ATC ACA CTG GGA AGA CAA CGT AG-3'
  • S-786 (SEQ ID NO: 8)
    • 5'-GAT CCT ACG TTG TCT TCC CAG TGT GAT GGA ATT CGA AGA CTT ATG CC-3'
  • S-960 (SEQ ID NO: 9)
    • 5'-TCG ATT AAT TAA CAA GCT TTG GGC CCT CGA GCA TAA GTC TTC TGC AGA ATT CGG ATC CAT CGA TGG TCA TAG C-3'
  • S-961 (SEQ ID NO: 10)
    • 5'-TGT TTC CTG CCA CAC AAC ATA CGA GCC GGA AGC GGC CGC TCT AGA-3'
  • S-962 (SEQ ID NO: 11)
    • 5'-AGC GTC TAG AGC GGC CGC TTC CGG CTC GTA TGT TGT GTG GCA GGA AAC AGC TAT GAC CAT C-3'
  • S-963 (SEQ ID NO: 12)
    • 5'-GAT GGA TCC GAA TTC TGC AGA AGA CTT ATG CTC GAG GGC CCA AAG CTT GTT AAT TAA-3'
  • S-1105 (SEQ ID NO: 13)
    • 5'-TCGA GGG CCC GCA TAA GTC TTC-3'
  • S-1106 (SEQ ID NO: 14)
    • 5'-TCGA GAA GAC TTA TGC GGG CCC-3'
  • Die Oligos S-723 und S-724 wurden mit einer Kinase behandelt, aneinander angelagert und in pBC.SK– ligiert, welches mit KprI und XbaI gespalten und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt worden war, um das Plasmid pSW143.1 herzustellen.
  • Die Oligos S-785 und S-786 wurden mit einer Kinase behandelt, aneinandergelagert und in das Plasmid pSW143.1 ligiert, welches mit XhoI und BamHI gespalten und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt worden war, um das Plasmid pSW164.02 herzustellen.
  • Die Oligonucleotide S-960, S-961, S-962 und S-963 wurden mit einer Kinase behandelt und aneinandergelagert, um ein aus den vier Oligonucleotiden bestehendes Duplexmolekül zu erzeugen. Das Plasmid pSW164.02 wurde mit XhoI und SapI gespalten. Die gespaltene DNA wurde einer Elektrophorese in einem Agarosegel unterzogen und das Produkt von annähernd 3045 Bp wurde aus dem entsprechenden Gelstück aufgereinigt. Das Plasmid pUC4K (von Pharmacia) wurde mit PstI gespalten und einer Elektrophorese in einem Agarosegel unterzogen. Das Produkt von annähernd 1240 Bp wurde aus dem entsprechenden Gelstück aufgereinigt. Die zwei Plasmidprodukte (von pSW164.02 und pUC4K) wurden zusammen mit dem Duplexmolekül S960/961/962/963 ligiert, um das Plasmid pLCV1 herzustellen.
  • DNA des Adenovirus 5 (New England Biolabs) wurde mit PacI und Bsp120I gespalten, mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt und einer Elektrophorese in einem Agarosegel unterzogen. Das Produkt von annähernd 2853 Bp wurde aus dem entsprechenden Gelstück aufgereinigt. Dieses Fragment wurde in das Plasmid pLCV1 ligiert, welches mit PacI und Bsp120I gespalten worden war, um das Plasmid pSW208.14 herzustellen.
  • Das Plasmid pSW208.14 wurde mit XhoI gespalten, mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt und einer Elektrophorese in einem Agarosegel unterzogen. Das Produkt von annähernd 5374 Bp wurde aus dem entsprechenden Gelstück aufgereinigt. Dieses Fragment wurde an die Oligonucleotide S-1105 und S-1106 (welche mit einer Kinase behandelt und aneinandergelagert worden waren) ligiert, um das Plasmid pLCV2 herzustellen, welches die folgenden Elemente enthielt (SEQ ID NO: 15)
  • Figure 00490001
  • B. Konstruktion einer Anhang(Tag)-Plasmidbank. Eine als pBP9 bezeichnete Anhang(Tag)-Plasmidbank wurde wie folgt hergestellt. Ein als PEP-1 bezeichneter Primer, welcher die Sequenz
    5'-Fam-TGTGGCTTAATTAAGG (PEP-1, SEQ ID NO: 16)
    besitzt, wurde synthetisiert (Das Fam-TTP-Konjugat wurde von Perkin Elmer-Applied Biosystems Division erhalten). Dieser PEP-1-Primer wurde an das kombinatorische Anhang(Tag)-Gemisch aus Beispiel 1 (bezeichnet als BP9) angelagert und der Primer wurde durch Behandlung mit Sequenase-DNA-Polymerase in der Anwesenheit der vier Standard-dNTPs verlängert. Das doppelsträngige Produkt wurde aufgereinigt, mit PacI und Bsp120I gespalten und an das aus pLCV2 durch Spaltung mit PacI und Bsp120I und Entfernung der 5'-Phosphatgruppen mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm erzeugte größere Fragment ligiert. Das Ligierungsprodukt wurde einer Elektrophorese in einem Agarosegel unterzogen und aus dem Gelstück unter Verwendung eines QIAEX II-Kits (Qiagen) aufgereinigt. Dieses ligierte Material wurde verwendet, um elektrokompetente E. coli TOP10F' (Invitrogen) oder XL1BlueMRF' (Stratagene) zu transformieren. Die Ligierungs- und Transformationsbedingungen wurde durch Durchführung vorbereitender Ligierungsreaktionen unter Verwendung von 1 μl Vektorfragment (~ 10 μg) und entweder keiner Insertion, 1 μl einer 1 : 10 verdünnten Insertion oder 1 μl nicht-verdünnter Insertion (~ 1 pMol) unter Verwendung eines RAPID LIGATION KIT (Boehringer Mannheim) optimiert. Nach der Ligierung wurde das Ligierungsgemisch verwendet, um elektrokompetente Zellen zu transformieren und die Transformanten wurden ausplattiert (100 μl pur, 100 μl 1 : 10 Verdünnung, 100 μl 1 : 100 Verdünnung). Unter Verwendung dieses Ansatzes wurde das beste Verhältnis von Vektor/Insertion als Verhältnis bestimmt, welches die größte Zahl von Kolonien pro Ausgangs-DNA erzeugte, während ein niedriger Hintergrund erhalten blieb. Zur Synthese der Bank wurden die Ligierungsbedingungen wie benötigt heraufgesetzt. Beispielhafte Bedingungen sind wie folgt:
    200 μl Vektor (der gesamte gewonnene, beginnend mit 20 μg Plasmid)
    X μl Insertion (PacI/Bsp120I-Spaltung)
    50 μl 10 × Ligierungspuffer
    50 μl 10 mM ATP
    Y μl Wasser
    10 μl T4 DNA-Ligase (2000000 U/ml)
    → Endvolumen = 500 μl
  • Das Ligierungsgemisch wurde über Nacht bei 16°C inkubiert, gefolgt von der zweimaligen Extraktion mit einem Volumen (500 μl) TE-gesättigtem Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) und der einmaligen Extraktion mit Chloroform, gefolgt von einer Fällung durch Ethanol. Nach Zentrifugation, Waschen und Trocknen wurde das Sediment in 50 μl Wasser resuspendiert. In jedes der mehreren Röhrchen elektrokompetenter Zellen (80–100 μl Zellen) wurden 1 bis 2 μl Ligierungsprodukt hinzugefügt. Die folgenden Bedingungen wurden für die Elektroporation verwendet: 200 Ohm, 25 μF, 1800 V in einer gekühlten 0,1 cm-Elektroporationsküvette. Unmittelbar nach der Elektroporation wurde 1 ml SOC-Medium (Sambrook et al., vorstehend, in Anhang A. 2 unter SOC Medium) hinzugefügt (Raumtemperatur) und das Gemisch wurde in ein 15 ml-Falcon-Röhrchen übertragen und bei 220 UpM bei 37°C über 1 Stunde geschüttelt. Jedes Transformationsgemisch wurde dann 50 ml vorgewärmtem Medium (TB oder LB + Chloramphenicol) in einem Schüttelkolben hinzugefügt. Um die Titer zu bestimmen, wurden kleine Anteile jeder Transformation (5 μl pur oder verdünnt) auf 30 μg/ml Chloramphenicol enthaltende LB-Agarplatten ausplattiert, um den Titer zu bestimmen, während der Rest in eine Flüssigkultur geimpft wurde und in einem Brutschrank über Nacht geschüttelt wurde. Die Transformationen wurden wiederholt, bis die gesamte Zahl von unabhängigen Transformanten (Clone) basierend auf Verdünnungsuntersuchungen auf annähernd 1,7 × 108 geschätzt wurde. Diese Menge von Transformanten ist gleich dem 10-fachen der Menge von möglichen Anhang(Tag)-Varianten, welche durch zufällige kombinatorische Verbindung von acht verschiedenen tetrameren „Wort"-Sequenzen, um Anhang(Tag)-Sequenzen mit einer gesamten Länge von acht Worten (88 = 1,7 × 107) herzustellen, hergestellt wurde. Die Plasmid DNA (pBP9) wurde aus diesen Kulturen extrahiert und vereinigt. Beachte, dass die Kulturen vor der Isolierung der Plasmide nur vereinigt werden konnten, wenn sie ähnliche Titer hatten. Ansonsten wurden die Plasmide getrennt isoliert und dann verhältnismäßig in Bezug auf ihre Titer zusammengemischt. Annähernd 1,5 mg von pBP9 wurden erhalten.
  • C. Isolierung von Poly(A)+-RNA
  • Poly(A)+-RNA (annähernd 30 μg von 5 × 107 Zellen) wurde aus THP-1-Zellen unter Verwendung eines FastTrack-Kits (Invitrogen), wie von der Lieferfirma empfohlen, extrahiert. Poly(A)+-RNA (annähernd 15 μg aus 5 × 107 Zellen) wurde aus Hefezellen unter Verwendung eines STRAIGHT A's mRNA-Isolierungssystems von Novagen extrahiert. Zur cDNA-Synthese wurde eine Ethanolsuspension der polyA-RNA in einer kalten Mikrozentrifuge bei voller Geschwindigkeit über 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und verworfen, wonach das Sediment kurz nochmals zentrifugiert wurde, und der Überstand wurde vorsichtig mit einer Pipette entfernt. Die Seiten des Röhrchens wurden vorsichtig mit 0,75 ml 70%igen Ethanol gewaschen, gefolgt von Zentrifugation über 20 Minuten. Der Überstand wurde wie zuvor entfernt, um sicherzustellen, dass die gesamte Flüssigkeit entfernt worden war. Das Sediment von RNA wurde in mit DEPC behandeltem Wasser resuspendiert (32 μl wurden bei mRNA von 5 × 107 Säugerzellen verwendet; ansonsten wurde das Volumen entsprechend angepasst). Die sich ergebende Lösung wurde auf den Boden des Röhrchens zentrifugiert und auf Eis gestellt. Die RNA-Konzentration wurde durch Verdünnung in Wasser, unter der Annahme von 1,0 Absorptionseinheiten bei 260 nm (A260) = 40 μg/ml RNA (das Verhältnis von A260/A280 sollte 2,0 sein) geschätzt. Handschuhe wurden zu jeder Zeit getragen, um eine Kontamination mit Nucleasen zu vermeiden.
  • D. Konstruktion einer cDNA-Bank
  • Erst- und Zweitstrang-cDNA wurden unter Verwendung eines cDNA-Synthesis Kit (Stratagene), wie durch die Lieferfirma empfohlen, unter Verwendung von RNAse-freien Röhrchen synthetisiert, außer dass der folgende speziell gefertigte Primer für die Synthese des ersten Stranges verwendet wurde (RT-Primer, SEQ ID NO: 17):
    Figure 00520001
    worin „V" ein Gemisch von A, C und G darstellt. Kurz gesagt, wurden die folgenden Lösungen einem sterilen 0,5 ml-Röhrchen hinzugefügt:
    2,25 μl 10 × Erststrangpuffer
    1,35 μl Erststrang-Methylnucleotidgemisch
    1,0 μl RT-Primer (50 pMol/μl)
    n μl mit DEPC behandeltes Wasser (n berechnet wie nachstehend)
    0,45 μl RNAse-Blockierungs-Ribonucleaseinhibitor (40 U/μl)
  • Das sich ergebende Gemisch wurde geschnipst, um die Bestandteile zu mischen, und wurde dann auf den Boden des Röhrchens zentrifugiert. Dem Gemisch wurden 2,5 μg Poly(A)+-RNA aus dem vorstehenden hinzugefügt (m μl), worin m das Volumen ist, welches 2,5 μg RNA enthält, und n (das Volumen des mit DEPC behandelten Wassers) wurde berechnet, um eine Endvolumen von 21,8 μl (n + m = 16,8 μl) zu ergeben. Diesem Gemisch wurden 0,7 μl MMLV-Reverse Transkriptase (50 U/μl) hinzugefügt. Das Gemisch wurde sanft auf einem Verwirbelgerät gemischt oder geschnipst und wurde dann auf den Boden des Röhrchens zentrifugiert. Das Gemisch wurde bei 37°C über 60 Minuten in einem Heizblock oder einer PCR-Maschine inkubiert und dann auf Eis gestellt.
  • Zur Synthese des Zweitstranges der cDNA wurde das Produkt der Erststrang-cDNA (22,5 μl) auf Eis gestellt und die folgenden Bestandteile wurden in der Reihenfolge hinzugefügt:
    100 μl 10 × Zweitstrangpuffer
    3 μl Zweitstrang-Nucleotidgemisch
    57,0 μl steriles Wasser (nicht mit DEPC behandelt)
    1 μl α-32P-dATP (10 μCi/μl, nicht älter als zwei Wochen)
  • Das Gemisch wurde zur Mischung der Lösung geschnipst und dann kurz zentrifugiert, gefolgt von einer Äquilibration auf Eis über 5 Minuten zur Verminderung der Zahl von Haarnadelstrukturen. Als nächstes wurden die folgenden Enzyme hinzugefügt:
    1,0 μl RNAse H (1,5 U/μl)
    5,5 μl DNA-Polymerase I (9,0 U/μl)
  • Die sich ergebende Lösung wurde gemischt und kurz zentrifugiert, ohne es zuzulassen, dass die Temperatur 16°C überstieg. Das Gemisch wurde bei 16°C über 150 Minuten (aber keine längere Zeit) inkubiert, wonach es auf Eis gestellt wurde.
  • Zu dem Reaktionsröhrchen wurden 100 μl TE-gesättigter Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) hinzugefügt und das Gemisch wurde auf einem Verwirbelgerät gründlich gemischt. Das Gemisch wurde über 5 Minuten zentrifugiert. Die wässrige (obere) Schicht wurde vorsichtig, ohne etwas von der Grenzschicht aufzunehmen, entfernt und in ein neues Röhrchen überführt. 100 μl Chloroform : Isoamylalkohol (24 : 1) wurden hinzugefügt und das Gemisch wurde auf einem Verwirbelgerät gründlich gemischt. Das Gemisch wurde über 5 Minuten zentrifugiert. Die wässrige Schicht wurde gesammelt und wie zuvor in ein neues Röhrchen überführt und 1 μl 5 M NaCl wurde hinzugefügt und auf einem Verwirbelgerät gemischt.
  • Die sich ergebende doppelsträngige hemimethylierte cDNA wurde der Größe nach auf einer SIZESEP 400-Säule von Pharmacia (Katalog Nr. 27-5105) fraktioniert. Die Säule wurde durch Setzen des SIZESEP-Gels in eine Zentrifugationssäule und indem zugelassen wurde, dass der Puffer auslief, bis die Obergrenze des Gel-Betts erreicht wurde, in STE-Puffer äquilibriert (1 × STE = 100 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 10 mM EDTA), gefolgt von Suspension des Gel-Betts in 2 ml TBE und Zulassen, dass der Puffer bis zum Erreichen der Obergrenze des Gel-Betts ausläuft und Wiederholung der Schritte der Suspension in TBE und des Auslaufens davon für zwei weitere Male. Die Säule wurde an beiden Enden bis zur Verwendung mit einem Deckel versehen, um einer Trocknung vorzubeugen. Unmittelbar vor der Verwendung wurden die Deckel entfernt und die Säule wurde kurz bei etwa 400 × g für 2 Minuten zentrifugiert, um das Gel zu verdichten und überschüssigen Puffer zu entfernen. Als nächstes wurde die cDNA-Probe vorsichtig und langsam in die Mitte der flachen Oberfläche oben auf das Gel-Bett aufgetragen, so dass die Probe nicht entlang der Seiten des Gels oder durch irgendwelche Risse lief. Die Säule wurde in ein 2059-Falcon-Röhrchen gesetzt, so dass die untere Spitze der Säule über einem deckellosen 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen platziert wurde, um den Auslauf der Säule zu sammeln. Die Säule wurde in dem Falcon-Röhrchen bei etwa 400 × g über 2 Minuten zentrifugiert, so dass Syntheseprimer und kleine cDNAs in der Säule zurückgehalten, während cDNAs der gewünschten Länge in dem Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt wurden. Das gesammelte cDNA-Gemisch wurde in ein neues Röhrchen mit Deckel übertragen. Zu der gesammelten cDNA wurden (optional) 1 μl PELLET PAIT (Novagen, Madison, WI), 0,1 Volumina 3 M NaOAc und 2,5 Volumina EtOH hinzugefügt. Die sich ergebende Lösung wurde bei –70°C über wenigstens 30 Minuten oder bei –20°C über Nacht gelagert. Das doppelsträngige cDNA-Produkt hatte die folgende Formel (SEQ ID NO: 18):
    Figure 00540001
    worin X Nucleotide in den cDNAs darstellt, V A, C oder G darstellt und B C, G oder T darstellt. Beachte, dass die Sequenz des RT-Primers so ausgewählt wurde, dass es eine BsmBI-Stelle in den cDNAs gibt, was einen 5'-GCAT-Überhang bei Spaltung mit BsmBI ergibt.
  • Nach Zentrifugation der Ethanol/NaOAc/cDNA-Lösung über 30 Minuten in einer kalten Mikrozentrifuge und waschen mit 70% Ethanol wie zuvor, wurde die der Größe nach fraktionierte cDNA bis zur Vollständigkeit durch Resuspension des cDNA-Sedimentes in einer Lösung von 170 μl Wasser, 20 μl 10 × DpnII-Puffer und 10 μl DpnII (10 U/μl), gefolgt von einer Inkubation bei 37°C über 2 Stunden, mit DpnII gespalten.
  • Die biotinylierten Fragmente wurden unter Verwendung von Dynal-M-280 Streptavidinperlen aufgereinigt. In Vorbereitung für das Einfangen durch Biotin wurden die magnetischen Streptavidinperlen auf einem Verwirbelgerät resuspendiert und 100 μl Perlen (1 mg) wurden in ein frisches 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. Das Röhrchen wurde über wenigstens 60 Sekunden in einen magnetischen Partikelkonzentrator (MPC) gestellt, um es den Perlen zu erlauben, nahe dem Magneten zu sedimentieren. Der Überstand wurde entfernt und verworfen, während das Röhrchen in dem MPC war. Dem Röhrchen wurden 100 μl 1 × B&W-Puffer (2 × B&W-Puffer = 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 2 mM EDTA und 2 M NaCl) zugefügt und die Suspension wurde mit einem Verwirbelgerät gemischt, in den MPC zur Konzentrierung der magnetischen Perlen gesetzt und der Überstand wurde entfernt; dies erfolgte wie zuvor durchgeführt. Dieser Waschvorgang wurde noch zweimal wiederholt. Zu keiner Zeit wurde es den Perlen erlaubt, während des vorstehenden Vorgangs auszutrocknen.
  • Zu dem DpnII-Spaltungsansatz aus dem vorstehenden (200 μl) wurden 200 μl 2 × B&W-Puffer hinzugefügt. Dieses Gemisch wurde in ein die vorbereiteten magnetischen Streptavidinperlen enthaltendes Röhrchen übertragen und die Perlen wurden durch Schnipsen des Röhrchens resuspendiert. Das Röhrchen wurde in einem Thermomixer bei 25°C über 30 Minuten inkubiert, so dass die Perlen zu allen Zeiten vollständig suspendiert waren, um das Einfangen durch Biotin zu sichern. Als nächstes wurde das Röhrchen in den MPC gestellt und der Überstand wurde entfernt und bei –20°C gelagert. Die Perlen wurden fünfmal mit 400 μl × B&W-Puffer gewaschen und die Überstände wurden untersucht, um zu überprüfen, dass wenig oder keine radioaktiven Zählerimpulse nach dem dritten oder vierten Waschschritt vorlagen.
  • Um die mit Anhängen versehenen cDNA-Fragmente zu entfernen, wurden die folgenden Schritte durchgeführt:
    • 1. Resuspendiere die Perlen in einem Gemisch aus 20 μl 10 × NEB 3-Puffer (New England Biolabs) und 168 μl Wasser.
    • 2. Füge 2 μl Rinderserumalbumin 100 × Stammlösung (10 mg/ml BSA, New England Biolabs) hinzu.
    • 3. Füge 10 μl BsmBI (4 U/μl) hinzu.
    • 4. Schüttle das Röhrchen im Thermomixer bei 55°C über 2 Stunden, so dass die Perlen vollständig suspendiert bleiben.
    • 5. Füge 7 μl BsmBI 10 × Stammlösung hinzu und schüttle das Röhrchen bei 55°C für zusätzliche 1–2 Stunden.
    • 6. Stelle das Röhrchen für 60 Sekunden in den MPC. Sammle den Überstand, welcher freigesetzte Anhang(Tag)-Sequenzen enthält.
    • 7. Füge 2 μl PELLET PAINT hinzu. Extrahiere einmal mit 200 μl Phenol/Chloroform und einmal mit 200 μl Chloroform.
  • Zu der sich ergebenden wässrigen Schicht wurden 20 μl 3 M NaOAc und 500 μl EtOH hinzugefügt. Dieses Gemisch wurde bei –20°C über Nacht oder bei –70°C über 30 Minuten gelagert. Die Lösung wurde dann in einer Mikrozentrifuge über wenigstens 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und verworfen und das Sediment wurde mit 0,5 ml 70% EtOH gewaschen und darin zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war, wurde das cDNA-Sediment in 10 μl Wasser resuspendiert. Das freigesetzte Gemisch von cDNA-Fragmenten hatte die folgende Formal (SEQ ID NO: 19):
    5'-GCATTGAGACGATTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTVXXX ... X-3'
    3'-ACTCTGCTAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAABXXX ... XCTAG-5'
  • Der Anhang(Tag)-Vektor pBP9 aus dem vorstehenden wurde mit BbsI und BamHI gespalten, mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt und durch eine Elektrophorese in einem Agarosegel aufgereinigt. Das größere Fragment (annähernd 3,15 Kb) wurde aus dem Gel aufgereinigt und mit dem Gemisch der cDNA-Fragmente für die Ligierung vereinigt. Beachte, dass der Vektor so konstruiert wurde, dass die Spaltung mit BbsI ein mit dem durch BsmBI gespaltenen Ende der cDNAs kompatibles Ende erzeugt. Das aufgereinigte Vektorfragment wurde mit dem wie vorstehend hergestellten cDNA-Gemisch ligiert.
  • Um eine Vektorbank von mit Anhängen (Tags) versehenen cDNA-Insertionen herzustellen, wurde das ligierte Gemisch der Vektor-Insertionen verwendet, um elektrokompetente E. coli-TOP10-Zellen (Invitrogen) zu transformieren. Eine geringe Menge des Transformationsansatzes wurde auf 30 μg/ml Chloramphenicol enthaltende LB-Agarplatten ausplattiert, um den Titer zu bestimmen. Annähernd 1,6 × 105 Clone umfassende Anteile wurden verwendet, um Flüssigkulturen zu beimpfen, um die Bank zu vermehren. Von diesen Kulturen wurde Plasmid-DNA extrahiert und gelagert.
  • E. Hybridisierung von mit Anhängen versehenen Fragmenten an immobilisierte Anhang(Tag)-Komplemente
  • Die mit Anhängen (Tags) versehenen DNA-Insertionen können durch Hybridisierung durch eine Anordnung von immobilisierten Anhang(Tag)-Komplementen, so wie vorstehend beschrieben, gefangen oder sortiert werden.
  • Bevorzugt werden die Anhang(Tag)-cDNA-Konjugate von den Vektoren durch PCR unter Verwendung eines üblichen Protokolls wie des folgenden vermehrt. Für jede von acht wiederholten PCRs werden die folgenden Reaktionsbestandteile vereinigt: 1 μl Vektor-DNA (125 ng/μl für eine Bank, 109 Kopien für einen einzelnen Clon); 10 μl 10 × KLENTAQ-Puffer (Clontech Labs, Palo Alto, CA); 0,25 μl biotinylierter 20-mer „Vorwärts"-PCR-Primer (1 nMol/μl); 0,25 μl FAM-markierter „reverser"-20-mer-PCR-Primer (1 nMol/μl); 1 μl 25 mM dATP, dGTP, dTTP und 5-Methyl-dCTP (gesamte dNTP-Konzentration 100 mM); 5 μl DMSO; 2 μl 50 × KLENTAQ-Enzym; und 80,5 μl Wasser für ein gesamtes Volumen von 100 μl. Die PCR-Reaktionen werden in einem MJR DNA Engine (MJ Research) oder einem ähnlichen Thermal-Cycler mit dem folgenden Protokoll ausgeführt: (1) 94°C über 4 Min.; (2) 94°C über 30 Sek.; (3) 67°C über 3 Min.; (4) 8 Zyklen der Schritte 2 und 3; (5) 94°C über 30 Sek.; (6) 64°C über 3 Min.; (7) 22 Zyklen der Schritte 5 und 6; (8) 67°C über 3 Min.; und (9) halten bei 4°C.
  • Die acht PCR-Gemische werden vereinigt und 700 μl Phenol werden bei Raumtemperatur hinzugefügt, wonach das vereinigte Gemisch in einem Verwirbelgerät über 20–30 Sekunden gemischt wird und dann bei hoher Geschwindigkeit über 3 Minuten (zum Beispiel 14000 UpM in einer Eppendorf-Tischzentrifuge oder einem ähnlichen Gerät) zentrifugiert wird. Der Überstand wird entfernt und mit 700 μl Chloroform (24 : 1-Gemisch von Chloroform : Isoamylalkohol) in einem neuen Röhrchen vereinigt, über 20–30 Sekunden mit einem Verwirbelgerät gemischt und über 1 Minute zentrifugiert, wonach der Überstand in ein neues Röhrchen übertragen und mit 80 μl 3 M Natriumacetat und 580 μl Isopropanol vereinigt wird. Nach Zentrifugieren über 20 Minuten wird der Überstand entfernt und 1 ml 70% Ethanol wird hinzugefügt. Das Gemisch wird über 5–10 Minuten zentrifugiert, wonach der Ethanol entfernt wird und die ausgefällte DNA in einer Mikrozentrifuge getrocknet wird.
  • Nach der Resuspension wird die cDNA auf avidinierten magnetischen Perlen (Dynal) unter Verwendung des vom Hersteller empfohlenen Protokolls aufgereinigt. Die cDNA wird dann mit PacI (1 Einheit des Enzyms pro μg DNA) ebenfalls unter Verwendung des vom Hersteller empfohlenen Protokolls (New England Biolabs, Beverly MA) gespalten. Die gespaltene DNA wird mit Phenol/Chloroform gefolgt von einer Ethanolfällung extrahiert. Die Anhänge(Tags) der Anhang(Tag)-cDNA-Konjugate werden durch Zugabe von 2 Einheiten von T4-DNA-Polymerase (New England Biolabs) per μg von über Streptavidin aufgereinigter DNA einzelsträngig gemacht. 150 μg von über Streptavidin aufgereinigter DNA werden in 200 μl Wasser resuspendiert und mit den folgenden Reaktionsbestandteilen vereinigt: 30 μl 10 × NEB-Puffer Nr. 2 (New England Biolabs); 9 μl 100 mM dGTP; 30 μl T4-DNA-Polymerase (10 U/μl) und 31 μl Wasser, um ein Endreaktionsvolumen von 300 μl zu ergeben. Nach Inkubation über 1 Stunde bei 37°C wird die Reaktion durch Zugabe von 20 μl 0,5 M EDTA gestoppt und die T4-DNA-Polymerase wird durch Inkubation des Reaktionsgemisches über 20 Minuten bei 75°C inaktiviert. Die Anhang(Tag)- cDNA-Konjugate werde durch Extraktion mit Phenol/Chloroform und Ethanolfällung gereinigt.
  • Für die Hybridisierung von Anhang(Tag)-cDNA-Konjugaten an immobilisierte Anhang(Tag)-Komplemente werden die wie vorstehend hergestellten Anhang(Tag)-cDNA-Konjugate in 50 μl Wasser suspendiert und das sich ergebende Gemisch wird mit 40 μl 2,5 × Hybridisierungspuffer vereinigt. Das vereinigte Gemisch wird durch eine SPIN-X-Zentrifugationssäule (0,22 μm) unter Verwendung eines üblichen Protokolls gefiltert, um ein die Anhang(Tag)-cDNA-Konjugate enthaltendes Filtrat zu ergeben (5 ml des 2,5 × Hybridisierungspuffers bestehen aus 1,25 ml 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,2, 1,25 ml 5 M NaCl, 0,25 ml 0,5% TWEEN 20, 1,5 ml 25% Dextransulfat und 0,75 ml Wasser). Die Zahl der Perlen in einem gegebenen Volumen wir leicht mit einem Hämocytometer abgeschätzt. Annähernd 1,8 × 107 wie vorstehend mit Anhang(Tag)-Komplementen derivatisierter Perlen werden in 10 μl TE/TWEEN-Puffer (TE mit 0,1% TWEEN 20) gelöst und zentrifugiert, so dass die Perlen ein Sediment bilden, von dem das TE/TWEEN entfernt wird. Zu den Perlen werden 25 μl 1 × Hybridisierungspuffer (10 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 500 mM NaCl, 0,01% TWEEN 20 und 3% Dextransulfat) hinzugefügt und das Gemisch wird mit einem Verwirbelgerät gemischt, um die Perlen vollständig zu resuspendieren, wonach das Gemisch zentrifugiert wird, so dass die Perlen ein Sediment bilden und der Überstand entfernt wird.
  • Die Anhang(Tag)-DNA-Konjugate aus dem vorstehenden Filtrat werden bei 75°C über 3 Minuten inkubiert und werden dann mit den Perlen vereinigt. Das Gemisch wird mit einem Verwirbelgerät gemischt, um die Perlen vollständig zu resuspendieren. Das sich ergebende Gemisch wird weiter bei 75°C mit Mischung durch ein Verwirbelungsgerät über annähernd drei Tage (60 Stunden) inkubiert. Nach der Hybridisierung wird das Gemisch über 2 Minuten zentrifugiert und der Überstand wird entfernt. Die Perlen werden zweimal mit 500 μl TE/TWEEN 20 gewaschen und werden in 500 μl 1 × NEB Puffer Nr. 2 mit 0,1% TWEEN 20 resuspendiert. Die Perlen werden bei 64°C über 30 Minuten in dieser Lösung inkubiert, wonach das Gemisch zentrifugiert wird, so dass die Perlen ein Sediment bilden. Der Überstand wird entfernt und die Perlen werden in 500 μl TE/TWEEN resuspendiert. Die hybridisierten Konjugate können dann durch jegliches im Fachgebiet bekannte oder hier diskutierte Verfahren untersucht werden.
  • Beispiel 3
  • Succinatbasierte Verknüpfungseinheiten
  • Das folgende Verfahren wurde verwendet, um mit einer spaltbaren Bernsteinsäureesterverknüpfungseinheit (10%) und einer nicht-spaltbaren Succinatamidverknüpfungseinheit (90%) derivatisierte GMA-Perlen herzustellen.
  • Succinatester. Bernsteinsäureanhydrid (240 mg, 2,4 mMol) wurde in Portionen über 30 Minuten zu einer gerührten Lösung von 5'-O-Dimethoxytritylthymidin (3 Mol) in wasserfreiem, 4-Dimethylaminopryridin (180 mg, 1,5 mMol) enthaltendem Pyridin (6 ml) hinzugefügt. Die Reaktion wurde über Nacht gerührt und durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Chloroform : Methanol 9 : 1 (Vol.: Vol.) überwacht. Das Gemisch wurde unter reduziertem Druck zu einem Gummiharz getrocknet. Restliches Pyridin wurde durch Mitverdampfung mit trockenem Toluol (3 × 20 ml) entfernt. Das Produkt wurde in Dichlormethan (20 ml) aufgelöst und mit eiskalter 10%iger wässriger Zitronensäure (2 × 15 ml) und dann mit Wasser (2 × 15 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck verdampft. Der sich ergebende Schaum wurde in Dichlormethan gelöst (10 ml) und bei Raumtemperatur in schnell gerührtem Hexan (250 ml) ausgefällt. Nachdem das Gemisch zentrifugiert war, wurde der Überstand abgegossen. Das Sediment wurde unter reduziertem Druck getrocknet, um einen Ausbeute von 75–80% (Esterprodukt) zu ergeben.
  • Succinamid. Das vorstehende Verfahren für die Succinylierung wurde mit einer identischen Menge von 5'-O-Dimethoxytrityl-3'-desoxy-3'-aminothymidin anstatt von 5'-O-Dimethoxytritylthymidin wiederholt, um das entsprechende Succinamidprodukt (Amidprodukt) zu erzeugen.
  • Bindung an den Träger. 0,821 g (1,1 mMol) des Esterproduktes oder des Amidproduktes wurden gelöst und über 2 Minuten in einem Gemisch aus 5 ml 0,2 M HOBt (1-Hydroxybenzotriazolhydrat, 0,27 g in einem Gemisch von 4,7 ml DMSO (Dimethylsulfoxid) und 4,7 ml NMP (N-Methylpyrrolidon)) und 5 ml 0,2 M HBTU (O- Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat, 1,03 g in einem Gemisch aus 1,4 ml N,N-Diisopropylethylamin, 9,3 ml DMSO und 9,3 ml NMP) gerührt. Amino-derivatisierte GMA-Perlen (5,5 g, 5,6 μm Durchmesser) wurden in 10 ml DMF gerührt. Zu dieser Aufschwemmung wurde das gesamte Amidprodukt aus dem Vorstehenden und eine zu 1/9 des Amidproduktes gleiche Menge des Esterproduktes (9 : 1 molares Verhältnis) hinzugefügt. Die Aufschwemmung wurde in ein Falcon-Schraubkappenröhrchen gegeben und behutsam über 2 Stunden geschüttelt. Das Gemisch wurden dann gefiltert und aufeinanderfolgend mit jeweils 20 ml DMF, Acetonitril, Methanol und Ether gewaschen. Die getrockneten Perlen waren dann für die Synthese der Anhang(Tag)-Komplemente bereit.
  • Obwohl die Erfindung mit Bezug auf bestimmte Ausführungsformen beschrieben wurde, wird es anerkannt werden, dass verschiedene Veränderungen vorgenommen werden können.

Claims (18)

  1. Verfahren zur Synthese eines Repertoires von Oligonucleotid-Anhängen(Tags), das Verfahren umfassend: (a) Synthetisieren einer Vielzahl von unterschiedlichen Oligonucleotidsequenzpopulationen auf einem oder mehreren Festphasenträgern, in der Form, dass jede Population gegenüber den anderen Populationen in einem räumlich getrennten Bereich lokalisiert ist, und die Oligonucleotide in jeder Population eine Anhang(Tag)-Komplement-Sequenz umfassen, die für jedes Oligonucleotid in einer gegebenen Population die gleiche ist; (b) Abspalten einer Fraktion der Oligonucleotide aus jeder Population auf dem einen oder mehreren Trägern, um ein Gemisch von unterschiedlichen Sequenz-Anhang(Tag)-Komplement-Oligonucleotiden freizusetzen; und (c) Anlagern eines Primers an jedes Anhang(Tag)-Komplement-Oligonucleotid und Verlängern jedes angelagerten Primers, um ein Duplex umfassend einen Anhang(Tag)-Komplement-Strang und einen komplementären Anhang(Tag)-Strang zu bilden, in der Form, dass die so gebildeten Anhang(Tag)-Komplement-Stränge oder die Duplexe ein Oligonucleotid-Anhang(Tag)-Repertoire umfassen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Oligonucleotide über ihre 3'-Enden an den einen oder mehrere Träger gebunden sind, und jedes Oligonucleotid eine Universalprimer-bindende Sequenz auf der 3'-Seite der Anhang(Tag)-Komplement-Sequenz enthält.
  3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Fraktion 10% bis 30% beträgt.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei eine ausgewählte Fraktion von jeder Population synthetisierter Oligonucleotide über Basenspaltbare Bindungen an den einen oder mehrere Träger gebunden ist, und das Abspalten den Schritt umfaßt, die immobilisierten Oligonucleotide basischen Bedingungen auszusetzen, die wirksam sind, um die Fraktion von Oligonucleotiden von dem einen oder mehreren Trägern abzuspalten.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Anhang(Tag)-Komplement-Sequenz in jedem Oligonucleotid von einer ersten und zweiten Restriktionsschnittstelle für eine Endonuclease flankiert ist, welche gleich oder unterschiedlich sein können.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Repertoire von Oligonucleotid-Anhang(Tag)-Komplementen mindestens 1000 unterschiedliche Sequenz-Anhang(Tag)-Komplemente enthält.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Repertoire von Oligonucleotid-Anhang(Tag)-Komplementen mindestens 10000 unterschiedliche Sequenz-Anhang(Tag)-Komplemente enthält.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Anhang(Tag)-Komplement-Sequenzen eine Länge von 12 bis 60 Nucleotiden haben.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Anhang(Tag)-Komplement-Sequenzen eine Länge von 18 bis 40 Nucleotiden haben.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der eine oder mehrere Festphasenträger Mikropartikel sind.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das/die Mikropartikel Durchmesser von 5 bis etwa 40 μm hat haben.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei jede der Anhang(Tag)- Komplement-Sequenzen eine Vielzahl von Segmenten enthält, die (i) eine Länge von 3 bis 9 Nucleotiden haben und (ii) von einem minimal kreuzhybridisierenden Satz von Anhang(Tag)-Komplement-Sequenzen ausgewählt sind.
  13. Verfahren nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Erzeugung einer Anhang(Tag)-Vektorbank umfassend multiple Mitglieder eines Anhang(Tag)-Repertoires, wobei das Verfahren ferner den Schritt umfasst: (d) Einfügen der Duplexe in multiple Kopien eines ausgewählten Vektors durch Ligierung, um eine Anhang(Tag)-Vektorbank umfassend die Mitglieder des Anhang(Tag)-Repertoires zu erzeugen.
  14. Verfahren nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Bildung einer Anhang(Tag)-Vektorbank von angehängten Polynucleotidfragmenten, wobei das Verfahren ferner die Schritte umfasst: (d) Einfügen der Duplexe in multiple Kopien eines ausgewählten Vektors durch Ligierung, um eine Anhang(Tag)-Vektorbank umfassend die Mitglieder des Anhang(Tag)-Repertoires zu erzeugen; und (e) Kombinieren der Anhang(Tag)-Vektorbank mit einem Gemisch von unterschiedlichen Polynucleotidfragmenten unter Ligierungsbedingungen, die wirksam sind zur Insertion eines Polynucleotidfragments in jeden Anhang(Tag)-Vektor in eine Stelle, die an eine Anhang(Tag)-Sequenz in jedem Vektor angepasst ist, wobei eine Bank angehängter Polynucleotidfragmente erzeugt wird.
  15. Festphasenträger, umfassend eine Population von Oligonucleotiden, die an einen Träger gebunden sind, wobei die Population eine erste und zweite Klasse von Oligonucleotiden umfasst, die identische Oligonucleotidsequenzen enthalten, wobei die Oligonucleotide in der ersten Klasse eine spaltbare Verknüpfungseinheit enthalten, die das selektive Abspalten der ersten Klasse von Oligonucleotiden vom Träger erlaubt, ohne die zweite Klasse von Oligonucleotiden signifikant abzuspalten.
  16. Festphasenträger nach Anspruch 15, wobei der Träger eine Perle ist.
  17. Festphasenträger nach Anspruch 15, wobei der Träger ein Bereich innerhalb einer planaren Anordnung mit adressierbaren Bereichen darstellt, wobei jeder Bereich eine Vielzahl von immobilisierten Oligonucleotiden mit identischen Anhang(Tag)-Sequenzen enthält, in der Form, dass die Anhang(Tag)-Sequenzen in mindestens zwei der Bereiche unterschiedlich voneinander sind.
  18. Gemisch von Festphasenperlen, wobei das Gemisch eine Vielzahl von Perlen umfasst, jede mit einer Population von angehängten Oligonucleotiden, wobei jede Population eine erste und zweite Klasse von Oligonucleotiden umfaßt, in der Form, dass die Oligonucleotide in der ersten Klasse eine spaltbare Verknüpfungseinheit enthalten, die das selektive Abspalten der ersten Klasse von Oligonucleotiden vom Träger erlaubt, ohne die zweite Klasse von Oligonucleotiden signifikant abzuspalten, und die Oligonucleotide in beiden Klassen in jeder Population eine Anhang(Tag)-Komplement-Sequenz umfassen, die für jedes Oligonucleotid in einer gegebenen Population die gleiche ist.
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