JPH07505904A

JPH07505904A - オリゴヌクレオチド類を開裂及び脱保護する方法及び試薬

Info

Publication number: JPH07505904A
Application number: JP5519282A
Authority: JP
Inventors: レディー、パラメスワラ　メダ; ハンナ、ネイーム　バトロス
Original assignee: ベックマン　インスツルメンツ　インコーポレーテッド
Priority date: 1992-04-24
Filing date: 1993-04-09
Publication date: 1995-06-29
Anticipated expiration: 2018-01-20
Also published as: JP3368353B2; EP0639200A1; US5348868A; US5518651A; DE69316205T2; EP0639200B1; DE69316205D1; WO1993022329A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】オリゴヌクレオチド類を開裂及び脱保謁する方法及び試薬直連」朋本出願は、本出願と同時に提出したパラメスワラ・メダ・レディ（Ｐａｒａｍｅｓｗａｒａ　Ｍｅｄａ　Ｒｅｄｄｙ）とナエーム・ホトロス・ハナ（Ｎａｅｅｍ　Ｂｏｔｒｏｓ　Ｈａｎｎａ）による「オリゴヌクレオチド合成で有用な保護基」についての米国出願番号第−−−−−−二ベックマンドヶット番号第１２８Ｄ −１００７号）に関連する。関連出願は、相互参考のためにここに十分に組み本発明は、オリゴヌクレオチドの合成一般に関し、さらに詳細には、固体支持体からオリゴヌクレオチドを開裂し、オリゴヌクレオチドから保護基を除去する方法および試薬に関する。

光匪Ω丘景デオキシリポ核酸（ＤＮＡ）及びリポ核酸（ＲＮＡ）は長い糸状の巨大分子であり、ＤＮＡはデオキシリボヌクレオチド類の鎖を含んでなり、ＲＮＡはリボヌクレオチド類の鎖を含んでなる。ヌクレオチドはヌクレオシド及びＩまたはそれ以上のリン酸（ホスフェート）基からなり、ヌクレオシドはペントース糖に結合した含窒素塩基からなる。典型的には、リン酸基はペントース糖の第５炭素（Ｃ− ５）ヒドロキシル基（ＯＨ）に付着しているが、第３炭素ヒドロキシル基（Ｃ− ３０Ｈ）にも付着することができる。ＤＮＡの分子内で、ペントース糖はデオキシリポースであり、他方ＲＮＡの分子内で、ペントース糖はリボースである。ＤＮＡ中の含窒素塩基はアデニン（Ａ）、シトンン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）及びチミン（Ｔ）である。これらの塩基はＲＮＡについてもウラシル（Ｕ）がチミンを！き換える以外同じである。したがって、集団的に［チオキシヌクレオチド類」と呼ばれるＤＮＡの主要ヌクレオチド類は次の通りである：デオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシシチジン（ｄＣ）、デオキシグアノシン（ｄ　Ｇ）及びチミジン（Ｔ）である。対応するりボタクレオチド類はＡ、ＣＳＧ及びＵで示される。（便宜上、及び対応するチミジンリポヌクレオシドが存在しないから、デオキシチミジンは典型的にＴで示されるが、整合性の上から、チミジンはこの開示中ではｄＴで示す。）ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の含窒素塩基の配列はその分子内に含まれる遺伝情報をコード化する。ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の糖及びリン酸基は構造的な役目を果たし、分子のバックボーンを形成する。特に、各ヌクレオチドの糖部分は隣接ヌクレオチドの糖部分に結合して、１つのヌクレオチドのペントース糖の３゛　−ヒドロキシルが隣接ヌクレオチドのペントース塘の５゛　−ヒドロキシルに結合する。

２つのペントース糖量の結合は典型的にはリン酸ジエステル結合を経ている。この結合プロトコル（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）に基づいて、ヌクレオチド類の一端（末端）は５゛末！（例えば、ヒドロキシル、トリリン酸など）を有しており、他端は３′　−ヒドロキシル基を有している。便宜上、ヌクレオチド類の塩基配列は５′から３°の方向に記載される。

ＤＮＡ及びＲＮＡは生きている動物によりその内部で製造されるけれども、化学的に合成することができ、ＤＮＡ及びＲＮＡの合成ストランドが迅速かつ効果的に製造できる。これらのストランドは「合成オリゴヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」と呼ばれる。広く利用されるオリゴヌクレオチド類合成用の化学的操作は「ホスホルアミダイト法」と呼ばれる。例えば、米国特許第４．４１５．７３２号：マクブリッド・エル及びカルザース・エム、テトラヘドロン・レターズ（ＭｃＢｒｉｄｅ　Ｌ、　＆　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｍ、　ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ）、２４　：２４５−２４８　（１９８３）　、及びシンハ・エヌら、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ（Ｓｉｎｈａ、　Ｎ、　ｅｔａｌ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５）旦：４５３９−４５５７　（１９８４）参照、これらは全てここに参考として取り入れられる。ホスホルアミダイト法に基づく商品として入手可能なシンセサイザーには例えばバイオリサーチ８７５０”及びＡＢＩ３８０Ｂ”、３９２”及び３９４”ＤＮＡシンセサイザーが含まれる。

化学的合成オリゴヌクレオチド類の重要性は、基本的にそれらヌクレオチド類が用いられる広く変化に富んだ用途による。例えば、オリゴヌクレオチド類は遺伝子工学、組換えＤＮＡ技術、アンチセンスＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ検出、種々の系からのＤＮＡ及びＲＮＡプローブ、蛋白質−Ｄ　Ｎ　Ａ　？Ｊ１合体の検出、サイト七向突然変異誘発の検出、ＤＮＡ及びＲＮＡ合成用プライマー、ポリメラーゼ鎖反応やりガーゼ鎖反応などのような増幅技術用プライマー、鋳型、リンカ− １分子相互作用研究を含む生物学研究において利用することができる。

ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の主要な構造は次のように表すことができる。

ＤＮＡ　Ｔ’ｌ五ＡＢ＝アデニン、チミン　Ｂ、＝アデニン、ウラシル、グアニン、シトシン　グアニン、シトシン核酸合成の鍵となる段階は１つのヌクレオチドの５’　−ＯＨ基ともう１つの３’　−ＯＨ基の間のヌクレオチド内リン酸結合を特異的かつ配列順に形成させることである。したがって、オリゴヌクレオチドの典型的な合成において、「入ってくる」ヌクレオチドのリン酸基はもう１つのヌクレオチドの５ °−ＯＨ基と結合する（すなわち、５’　−ＯＨ基が「リン酸化」または「亜リン酸化」される）。

これらの基はオリゴヌクレオチドの合成に活性的に関与できなければならない。

このように、研究者が２つのそのようなヌクレオチドを反応室に導入し、その中の条件を２つのヌクレオチドが正常に結合するよう調節し、そのような付加を一連して順次行うことにより一定の配列を有するオリゴヌクレオチドの生成が正確に達成できるように５′−ＯＨ基は（典型的にはジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基により）変性される。

ヌクレオシドの４つの塩基であるアデニン、チミン（ＲＮＡの場合はウラシル）、グアニンおよびシトシンは、化学的に活性である部分（たとえば、環外アミノ基）を含んでいる。これらの基は、「一時的に」保護されねばならない、すなわち、オリゴヌクレオチド合成が完結した後まで保護基は、塩基の反応性部位を遮断できなくてなはらない：そのような合成が完結した後、またこれらの基は、オリゴヌクレオチドの生物学的な活性が影響を受けないように塩基から除去され得なくてはならない。ｄＡＳｄＣ，ｄＧ　（またはＲＮＡ合成の場合は対応するりボヌクレオチド）のアミノ基を保護しないと、所望されないおよび／または有用さの少ない物質が合成されることになる。アミノ基を持たないチミン（Ｔ）は、保護基を典型的に必要としない。ｄＡに対する従来のアミノ保護基は、ベンゾイル基（ｒｂｚＪ）；ｄＣに対してはｂｚ基またはイソブチリル基（ｒｉｂｕＪ）；ｄＧに対してはｉｂｕである。次のようにどの保護基が用いられているかを示すのが慣用である：ｄＡ’″、これはベンゾイル保護基が用いられてアデニン環外アミノ基を保護していることを示している。

オリゴヌクレオチド合成の制御の度合いをさらにを保つために、不溶化した開始点からオリゴヌクレオチドの合成を始める必要がある。すなわち、オリゴヌクレオチドは、適当な固体支持体に「拘束」されたままで合成される。このプロトコールは、溶液に基づくオリゴヌクレオチド合成に比較して合成の速度と便利さとを増加する。したがって、オリゴヌクレオチドの合成は、最終段階として、オリゴヌクレオチドからの保護基の除去（「保護を除去すること（脱保護）」および固体支持物質からのオリゴヌクレオチドの解放（「開裂」）を必要とする一一一このような段階は、生物学的に有用なオリゴヌクレオチドを生ずるために必要とされる。

「保護を除去すること（脱保護）」は、ヌクレオチドに組み込まれた保護基の除去に必要なプロセスと時間として定義され、「開裂」は、ヌクレオチドが付着した固体支持物質からの合成されたオリゴヌクレオチドの除去に必要なプロセスと時間として定義される。

ｄＧの保護を除去することは、オリゴヌクレオチド脱保護の速度限定段階である。慣習により、当業者は、オリゴヌクレオチドに組み入れられたデオキシグアノシンの保護を除去するに必要な時間に関心が集まろう。副生酸物形成（すなわち、所望されない物質の生成）に関して、デオキシシチジンは、特に副生物形成を受けやすい。したがって、副生酸物形成を避けるかまたは最低にするのを確実にする努力から、ｄＣに関する副生酸物形成を監視することが通常有用であるとみなされる。

保護を除去することと開裂は、典型的には、アンモニアを用いることにより達成される。保護を除去し開裂する試薬としてのアンモニアの広範な使用のため、保護の除去と開裂に必要な時間の観点から、他のそのような試薬とアンモニアとを比較することは、一般に行われている。アンモニアの手段による保護の除去と開裂は、室温で数日要し得、あるいは、５５℃で約６−１７時間要し得る。典型的には、開裂は、室温で約１時間以内で起こり、残りの時間は、保護の除去に向けられる。典型的なオリゴヌクレオチド（すなわち長さが、約２０−２５個のヌクレオチド）の合成は、約２時間で合成でき：最も商業的に入手できる合成装置（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて不溶化され成長しているヌクレオチド鎖に１つのヌクレオチドを加えるのに約６分間必要とされる。オリゴヌクレオチドを合成するに必要な時間と相対的に、アンモニアを用いてオリゴヌクレオチドの保護を除去して開裂するのに必要な時間は、過剰となり得る。

異なる保護基の使用は、保護の除去と開裂に必要な時間の短縮を考慮に入れる。

ジメチルホルムアミジン（ｒＤＭＦＪ　）が、ｄＧおよびｄＡに対する有用な保護基であると報告された。ここに参考として入れたＶｕ、Ｈｕｇｎｈ　ｅｔ　ａ　１．　ｒＤＮＡ合成に対する速いオリゴヌクレオチド脱保護ホスホルアミダイト化学（Ｆａｓｔ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙｆｏｒ　ＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）Ｊ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　ＬｅｔｔｅｒｓＳ３土：　７２６９−７２７２を参照。説明しであるように、そのような保護基を含むオリゴヌクレオチドは、脱保護と開裂に、アンモニア水中で５５℃で１時間、またはアンモニア水中で室温で８時間を要する。フェノキシアセチル（ｒＰＡＣＪ）が、ｄＧおよびｄＡに対する有用な保護基であることも報告されている。ここに参考として入れたＥＰＯ公開出願（Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）第０２４１３６３ＡＩ。

ｒＤｅｒｉｖｅｓ　ｄｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ｅｔ　１ｅｕｒ　ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｐｏｕｒ　ｌａ　５ｙｎｔｈ　ｓｅｄ’ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓＪ、Ｍｏ１ｋｏ、　Ｄｉｄｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ　（１９８７）を参照。説明しであるように、この保護基を含むオリゴヌクレオチドは、脱保護と開裂に対してアンモニア水中で室温で２−８時間を要する。

脱保護と開裂に要する時間を少なくする別のアプローチとしては、ほかの脱保護と開裂の試薬を単独でまたはアンモニアと組み合わせて用いることである。低級アルキルアルコール、水および３−６個の炭素原子を含む非親核的ヒンダードアルキルアミンを含んでなる試薬が、室温で１−２時間以内の開裂をもたらし、さらに約８０℃−約９０°Ｃで約２０−６０分での脱保護をもたらすことが報告されている。ここに参考として入れたＥＰＯ公開出願第０３２３１５２Ａ２ｒオリゴヌクレオチドの合成方法（Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）Ｊ、Ｗｏｏ、Ｓａｍ　Ｌｅｅ、　ｅｔ　ａｌ　（１９８９）（以下ｒＷｏｏＪ）を参照。脱保護と開裂に対しｎ−ブチルアミン／メタノールの１＝１混合物（容量／容量）によるオリゴヌクレオチドの処理が記載されている。ここに参考として入れたＷｅｂｅｒ、ＨおよびＫｈｏｒａｎａ、Ｈ，Ｇ、のｒｃｔｖ、イーストからのアラニントランスファーリボ核酸に対する遺伝子構造の総合合成。ヌクレオチド配列２１−４０に相当するアイコサ −デオキシヌクレオチドの化学的合成。Ｊ、Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

ヱ２：２１９−２４９　（１９７２）（以下、ｒＷｅｂｅｒＪ）を参照。しかしながら、この試薬は、デオキシシチジン副生成物の形成をもたらしたことが報告されている。したがって、さらに説明されるように、シチジンを含まないオリゴヌクレオチドでは、ｎ−ブチルアミンとメタノールのｌ：ｌ混合物（容量／容量）での２日間の室温での処理、シチジンを含むオリゴヌクレオチドでは、処理は、まず、２日間の室温でのアンモニアを含み、（デオキシシチジン副生成物の形成を避けるため）ｎ−ブチルアミンとメタノールの１．１混合物（容量／容量）での２日間の室温を後続させる。

以下は、前記の保護基と試薬についての脱保護と開裂に必要な記載した時間の簡単な要約である。

脱係ｔ！／開裂時間試薬　、（時間）　温度ｒ＝ニーアンモニア　６−：Ｌ７　５三アンモニア　）２４　Ｒ−Ｔ。

ＤＭＦ／アンモニア　２５５０ＭＦ／アンモニア　９　Ｒ、７・ＰＡＣ／アンモニア　８：（、Ｔ。

Ｗｏｏｓ　１−３　Ｒ，Ｔ、；８０／９０Ｗａｌｐξｒ　２日間　Ｒ１τ。

Ｍ出ｅｒ″４日間　Ｒ，Ｔ。

１＊　低級アルキルアルコール、水および３−６個の炭素原子を含む非親核的ヒンダードアルキルアミンからなる混合物；Ｒ，Ｔ、Ｔｌ−２時間（開裂）および８０−９０　’Ｃで２０−６０分間（脱保護）２ネ＊　オリゴヌクレオチドを含むｎｏｎ−Ｃａｎ−ブチルアミン／メタノールのｌ＝１混合物（容量／容量）３…　Ｃを含むオリゴヌクレオチド：アンモニア（２日間）、続けてｎ−ブチルアミン／メタノール（２日間）Ｒ，Ｔ、　冨室温麿鳳−−ｓｍ簡−曽−−誼一一寓冒一霞鱈一細讃■−冒鳳一−■電−鴫一一■− 園−−膳一閣調一■■麿−■−■−露一■ｍ＋＋＋開裂と脱保護のための前記の報告された反応時間のい（つかは、アンモニアだけのものよりも短いが、オリゴヌクレオチドの合成に必要な時間と比べ、多くの時間が脱保護と開裂に向けられていることが明白である。

オリゴヌクレオチドが合成され得る迅速性が与えられているとして、必要なものは、副生酸物生成なしを最低として、さまざまな利用できる保護基の迅速な除去と、支持体からのオリゴヌクレオチドの開裂を行い得る試薬である。実際的見地から、加熱段階と組み合わさって、そのような試薬がオリゴヌクレオチドを脱保護し開裂できる迅速性が増すように、そのような試薬が、さまざまな温度で有用であることが好ましい。

凡肌二盟ヱ本発明は少なくともこの要求を満たす。ここに開示の発明に従えば、合成により生成したオリゴヌクレオチドの脱保護と開裂に有用な試薬が提供される。該試薬は、ｌ−約１０個の炭素原子を有する少な（とも１つの直鎖アルキルアミンを含んでなる。好ましくは、該試薬は、少なくとも１種のアミノ基転移抑制剤をさらに含んでいて、ｔ−ブチルアミンが、特に好ましいアミノ基転移抑制剤である。

該試薬は、さらにアンモニアを含むことができる。

好ましくは、試薬のアルキルアミンは、ｌ−約６個の炭素原子、さらに好ましくは、ｌ−約３個の炭素原子、最も好ましくは、ｌｆｌｌも炭素原子を宵する。したがって、最も好ましい試薬は、メチルアミンを含んでなる。都合よくは、オリゴヌクレオチドの脱保護と開裂は、約９０分未満で室温で起こり得るが、より速い脱保護と開裂を達成するには、より高い温度も用いられ得る。

本発明に従えば、保護されたオリゴヌクレオチドの開裂の方法、可溶性オリゴヌクレオチドからの保護基の除去の方法および不溶化されたオリゴヌクレオチドの保護を除去する方法が、開示の試薬と関連して、可能である。

これらの利点およびほかの利点が、開示により明らかとなろう。

ｌ証旦皿車眉説所以下の図面は、好ましい実施態様の詳細な説明を明瞭にする目的で用いることを意図している：図１は、各種の試薬を用いた、不溶化した不均質２１−ｍａｒの開裂に対する時間のグラフによる表示である。

図２は、開裂／脱保護試薬としてのメチルアミン／ｌ−ブチルアミンおよび開裂／脱保護試薬としてのアンモニアの影響下に置いた２ｔ−ｍｅｒ（およびその補体（ｃ　ｏｍｐ　１　ｅｍｅ　ｎ　ｔ）　）の融点分析である。

図３は、さまざまなの百分率のｄＣ”およびｄＣ”を含み、図２の開裂／脱保護試薬の影響下に置いた各種の３５−１５１−および１０１−ｍｅ　ｒのポリアクリルアミドゲル電気泳動分析の写真による再現である。

図４は、開裂／脱保護試薬としてのアンモニアの影響下に置いた３５％ｄＣ”を含んでなる不均質５１−ｍｅｒの電気泳動図である。

図５は、開裂／脱保護試薬としてのメチルアミン／ｌ−ブチルアミンの影響下に置いた３５％ｄＣ”を含んでなる不均質５１−ｍｅｒの電気泳動図である。

図６は、ＰＣＲ誘導の９５７塩基対増幅鋳型（ＰＣＲ−ｄｅｒｉｖｅｄ　９５７　ｂａｓｅ−ｐａｉｒ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｔｅｍｐｌａｔｅ）の写真による再現である。

図７は、Ｍ１３ｍｐ１８鋳型の配列決定反応の写真による再現である。

図８は、ｄＣＡｃを含み、開裂／脱保護試薬としてのメチルアミン／ｌ−ブチルアミンの影響下に置いた２２−ｍａｒを用いて開始させた３°　−ターミナルトランスフェラーゼ延長（３’　−Ｔｅ　ｒｍｉｎａｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）の電気泳動図である。

図９は、ｄＣ”“を含み、開裂／脱保護試薬としてのアンモニアの影響下に置いた２２−ｍａｒを用いて開始させた３′　−ターミナルトランスフェラーゼ延長の電気泳動図である。

い　能　のび　ｔ″ｔ［Ｉ当業者が認めるように、自動化した合成装置にまつわる欠点は、保護基の脱保護と、固体支持物質上に合成されている場合の固体支持物質からの保護基の開裂とに必要な時間である。さらには、実際的見地から、機器自体で開裂と脱保護を行う商業的に入手できる自動化された合成装置の大部分について、その機器が開裂段階の間利用できなく、当然、処理量を減する。さらには、慣用の開裂および脱保護の試薬は、個人が、合成装置カラムを通してアンモニアを手動的に押す／引くようにすることを要して開裂と脱保護を実施し得るもので、個人がほかの企画に従事できる時間を減じる。さらに、アンモニアと共に合成装置カラムの内容物を熱することは、不溶化したオリゴヌクレオチドを異なる容器に注ぐこと、アンモニアを加えること、新たな容器を加熱することおよび容器を遠心分離にかけ支持物質を除去することを典型的に必要とする。すべてのこれらの段階は、本質的に時間を費やすものであり、特に、誤差の可能性を加える。

保護の除去と開裂のための時間を減じ得る試薬は、当然、明白な目標であり、当業者は、そのような試薬は少なくとも次の基準を満たさねばならないことを認めるであろう、オリゴヌクレオチドの完全な状態が保たれねばならない、すなわち、オリゴヌクレオチドが、例えば、プローブとしての使用に対して、配列決定および合成に対してなど生物学的に有用であらねばならない；また、副生酸物形成が、実質的に最小限とされねばならなく、好ましくは、まったく排除されねばならない。

ここで用いた、用語「オリゴヌクレオチド」は、合成のデオキシオリゴヌクレオチドおよびリボオキシヌクレオチドさらに修飾オリゴヌクレオチド（すなわち、ここでは、３’　ＯＨ，５’　ＯＨ：糖または複素環塩基が修飾されている）を含み、フォスフェート主鎖の修飾（例えば、メチルフォスフォネート、フォスフォロチオエートおよびフォスフォラミデート）も含む。さらに、オリゴヌクレオチドは、付着リポータ−基を含むオリゴヌクレオチド例えばビオチン、アビジン、ハプテン、染料、蛍光ラベノペ化学発光ラベル、酵素ラベルまたは放射性ラベルおよびオリゴヌクレオチドが合成される固体支持体以外の固体支持体を含み得る。

ここで用いた用語「迅速」、「実質的に短縮された（短くされた）」、「速い」などは、開示の試薬と関連して用いた時、相対的なものであり、試薬が働いている媒質の温度に依存する。広い意味で、これらの用語は、脱保護と開裂が、室温で少なくとも約９０分で、また約９０℃で少なくとも約１５分で完了し得ることを示すことを意図する。比較として、アンモニアは、開裂と脱保護に対し室温で少なくとも約２４時間、また約８０℃で少なくとも約９０分未満する。

アンモニアよりも少なくとも５倍親核的な少なくとも１つの第１の試剤；水の１．５分の１以下のの極性の第２の試剤：およびアンモニア水からなる組み合わせが、アミノ基転移／副生成物生成を実質的に防ぐ保護除去および切断の試薬として有効に用いられ得ることが見いだされた。第１の試剤、第２の試剤およびアンモニア水に関してここで用いた「組み合わせ」は、試薬が少なくとも次の好ましい実施態様を含んでなることを示すことを意味する。

ａ）第１の試剤：ｂ）第２の試剤およびアンモニア水：Ｃ）第１の試剤および第２の試剤；およびｄ）第１の試剤、アンモニア水：および第２の試剤。

第１の試剤（アンモニアよりもより親核的）は、１−約１０個の炭素原子を有する直鎖のアルキルアミンである。その親核性に加え、アルキルアミンの長さも、考慮すべき事がらで、好ましくは、直鎖のアルキルアミンは、１−約６個の炭素原子を有し、より好ましくは、１−約３個の炭素原子を有し、最も好ましくは、１個の炭素原子を有する（すなわちメチルアミンである）。メチルアミンは、特に好ましい第１の試剤であり、その理由は、これが、アンモニアの約４０分の１の親核性であるからであり、また、定義された直鎖のアリキルアミンの内で「最も小さい」からである。特定の理論に拘泥することを望むものではないが、その親核性と大きさとに依存してそのような試剤は、保護基（および用いられている場合は固体の支持体）とオリゴヌクレオチドの個々のヌクレオチドとの間の結合を攻撃するのに特に適していると考えられる。そのような試剤がこれらの結合を攻撃し得る相対的な「容易さ」のため（すなわち、反応動力学の増加）、保護の除去と切断の時間を実質的に短縮する。

当業者が認識するように、「アミノ基転移」とは、ヌクレオチド上のアミンの交換を指し、典型的には、アミノ基転移は副生成物の生成として明示される。たとえば、メチルアミンの存在下で、たとえば望ましくない副生成物であるＮ−メチルシチジンへのシチジンのアミノ基転移の可能性は増す。したがって、試薬は、アミノ基転移抑制剤（便宜上以下ｒＴＳＡＪとする）として少なくとも１種の第２の試剤（水よりも極性でない）を含むことが好ましい。ＴＳＡは、好ましくは、ｌ−約１０個の炭素原子を有し、さらに、官能基を含んでいてもよい、直鎖、分校、環状、飽和または不飽和アルキルアミン、エタノール：メタノール；イソプロピルアミン；アセチルニトリル：ジメチルホルムアミド：テトラヒドロフランおよび上記のものの組み合わせからなる群から選択される。定義されるような例示的なアルキルアミンは、限定するものではないが、ｔ−ブチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミンおよび第２ブチルアミンを含む。好ましいＴＳＡは、水（水の極性指標値（ｐ。

Ｉａｒｉｔｙ　１ｎｄｅｘ　ｖａｌｕｅ）は、約１０である）の約１、　５分の１以下の極性指標値を有する。特定の理論に拘泥するものではないが、ＴＳＡのこの特性は、ＴＳＡとヌクレオチドアミンとのまたはアミノ基転移時に関与するアミンを含む試剤との間の有利な相互作用に起因してアミノ基転移が起こるのを実質的に減じるかあるいは防ぐと考えられる。

アンモニア水は、必要条件ではないが、試薬に加えることができる。試薬中のアンモニアの存在または不在は、研究者にとって主に任意である。本質的には、アンモニア水は、切断と保護除去の反応の点で、試薬に有意的に影響しない；しかしながら、第１の試剤と組み合わさったアンモニア水の存在は、保護除去に必要な時間を約５０％増加させ得る。したがって、試薬は、アンモニア水を含むことができるが、好ましくは、試薬は、アンモニアを含まない。

試薬の成分の好ましい容量対容量比は、次のようである：第１の試剤とＴＳＡの第２の試剤を含んでなる試薬の実施態様については、好ましい比は、約９：ｌ− 約１：９、より好ましくは約７：３−約３ニア、最も好ましくはｌ；１であり、第１の試剤とアンモニア水とを含んでなる試薬の実施態様については、好ましい比は、約９：１−約ｌ：９、より好ましくは約７：３−約３＝７、最も好ましくは約１＝１であり、そして第１の試剤、ＴＳＡの第２の試剤およびアンモニアを含んでなる試薬の実施態様については、３つの成分の好ましい比は、約９−１　：９−１　：９−１から約１−９．：　１−９＝１−９、より好ましくは約７− ３　：　７−３　：　７−３から約、３−７：３　７：３−７、最も好ましくは約１：１：１である。

反応温度は、研究者の必要性に主に依存する。すなわち、反応温度は、約２５− 約１００℃の範囲であってよい（しかしながら、得られるオリゴヌクレオチドが実質的に限定された用途となるがオリゴヌクレオチドの完全な状態が有意的に強い影響を受けない限りより高い温度またはより低い温度も用いられ得る）。当業者が認識するように、化学反応の温度を増すと、その反応の動力学も典型的に増す。したがって、速度を考慮するなら（たとえば、オリゴヌクレオチド処理量が高いことが望ましい商業的状況で）、反応温度は、室温より上、好ましくは約５０℃より高く、最も好ましくは約６５００−約８０°Ｃである。このような温度は、切断時間に実質的な影響を与えないが、このような温度は、保護除去に必要な時間を実質的に少なくし得る。しかしながら、反応温度は、切断と保護除去とが約９０分未満で達成されるように室温であり得るものと解釈されたい。

開示に従えば、試薬の特に好ましい実施態様は、メチルアミンとｔ−ブチルアミとの１：ｌ容量対容量比である。特に好ましい反応温度は、約６５℃であり、この温度で、保護され不溶化したオリゴヌクレオチドの保護除去と切断が、約１０分未満で達成され得る。

透本発明の好ましい実施態様についての次の例は、開示または後の請求の範囲に限定を加えることを意図するものでな（、また限定を加えるものと解釈されるものでもない。

■、物質と方法Ａ、■ ｌ　開裂／脱保護試薬すべての薬品は、少なくともＡＣ５級とした。水酸化アンモニウムは、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ；　Ｃａｔ、Ｎｏ、　２２．　１２２−８）から得た。水に含むようにした４０重量％溶液としたメチルアミンは、ｔ−ブチルアミン（Ｃａｔ、　Ｎｏ、Ｂ８．　９２０−５）と同様にＡｌｄｒｉｃｈ　（Ｃａｔ、　Ｎｏ、　Ｍ２．　７７５−１）から得た。

メチルアミン／ｌ−ブチルアミン試薬は、１．１容量比をｌ捏合して準備し、室温で５分間振盪し４℃で保存した。水酸化アンモニウムは、供給者の指示に従い保存した。

２、保護されたデオキシヌクレオシド次の保護されたデオキシヌクレオシドをＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、（Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、Ｍｏ、）がら得た。

ｄＡ”（Ｃａｔ、　Ｎｏ、　Ｂ　６１３０）；ｄＣ”（Ｃａｔ、　Ｎｏ、　８　５８８２）；ｄｅｌ′′”　（Ｃａｔ、Ｎｏ、　Ｉ　６２６１）およびｄＧ”” 　（Ｃａｔ、　Ｎｏ、　Ｉ　６００７）。

チミジンは、Ｓｉｇｍａ　（Ｃａｔ、Ｎｏ、７　５０１８）から得た。

新規な保護されたデオキシシチジンも、各側で用いた。開示した試薬と関連して用いた時、ｄｅｌ′′およびｄＣｌｂ”　（いわゆる「慣用の」保護されたデオキシシチジン）は、副生酸物生成をもたらし得たことが測定された。新規な保護されたデオキシシチジンは、アセチル（ｒＡｃＪ）保護基を含む。その合成は、参照のためにここに十分に組み入れた上記の同時係属出願に開示されている。

Ｂ、　・に　口　ｌ−口　コール１、ポリメラーゼ連鎖反応（ｒＰｃＲＪ）開示した開裂／脱保護試薬の影響下に置いたオリゴヌクレオチドブライマーのＰＣＲ分析は、ＡｍｐｌｉＴａｇ”’　（Ｐ　ａ　ｒ　ｔ　Ｎ。

、　Ｎ８０１−００５５）を有するＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＧｅｎｅＡｍｐＴｌ″　ＤＮＡ適用試薬キットを用いて行った。製造者の指示に従うようにした。

２、ＤＮＡ配列決定配列決定反応は、ａ−［”Ｓ］−ｄＡＴＰを用い、米国Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｅｑｕｅｎａｓｅ＠　Ｖｅｒｓｉｏｎ　１．０のプロトコールに従い、Ｍ１３ｍｐ１８−木組ＤＮＡ鋳型（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃａｔ、Ｎｏ、　４０４−Ｃ）を使用して行った。

Ｃ，ｊＬＷ１、自動化したＤＮＡ合成装置オリゴヌクレオチドの合成は、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　８７５０”ゝ１ＤＮＡ合成装置を用いて行った二制御しｔこポアーグラス（ｐ　ｏ　ｒ　ｅｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）（５００人−１０００人の孔の大きさ）を固体支持物質用に用いた。さまざまな長さのホモ第１ノゴヌクレオチドおよびヘテロオリゴヌクレオチドを、製造者の１旨示ｌこ従１４ｚ合成した。

２、毛管電気泳動オリゴヌクレオチドの毛管電気泳動を、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ、　Ｐ／ＡＣＥ”２０００高性ｆ４ヒ毛管電気泳動システムで行った。３７ｃｍ　ＵｌｏｏＰ　ＵｒｅａＧｅｌ　Ｃｏｌｕｍ　（Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｃａｔ、Ｎｏ、　３３８４８０）を使用した。サンプルは、動電学注入法（ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ　１ｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ）　（１０ｋＶ、３秒）によりカラムに充填した１分離１ま、第１Ｊゴヌクレオチドの長さに依存して、３０−９０分間、１１ｋＶ／ｃｍで（テつた。

トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン（ｒＴＲＩｓＪ）−ポレート７Ｍ尿素（ランニングｌｌｉ衝液（Ｂｅｃｋｍａｎ、　Ｇｅ　Ｉ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｋｉｔ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　３３８４８１））を用いた。吸光度検出は、オリゴヌクレオチドの長さに主に依存して、０、　０５　２．　ＯＤ２ｇｏｎｍ　７ｍ　ｌの範囲であった。

３、高圧液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）ＨＰＬＣ分析は、ダイオードアレー検出モジュール１６８およびオートサンプラー５０７を備えたＢｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　ＧｏｌｄＴ′　ＨＰＬＣＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　５ｏｌｖｅｎｔ　Ｍｏｄｕｌｅにより行った。Ｃ１゜ＵｌｔｒａｓｐｈｅｒｅＴＭ　ＨＰＬＣカラム（Ｂｅｃｋｍａｎ。

Ｃａｔ、Ｎｏ、　２３５３９；　５ｕ粒子、４．６ｍｍｘ２５ｃｍ）を用いた。

瓶Ａは、０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ６，９）を含み、瓶Ｂは、ＨＰＬＣ級アセドアセトニトリルだ。システムは、次のような勾配モードで操作した（　１　ｍ　ｌ　／分の流量）：０−１０分＝８５％瓶ＡＳ１５％瓶８．２０−２５分＝７５％瓶Ａ１２５％瓶８．２５−２７分＝５０％瓶Ａ１５０％瓶８．２７−３０分＝５０％瓶Ａ１５０％瓶８．３０−５０分、１００％瓶Ａ１０％瓶Ｂ０Ｉｌ、例■、支持体に結合した保護されたオリゴヌクレオチドの開裂不均質２１−ｍａｒを、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　８７５０合成装置を用いて合成した。４つの異なる種類の２１−ｍａ　ｒを分析し、４つのヌクレオシドのそれぞれを支持体に拘束した（すなわち開裂の部位）、残りの２０のヌクレオシドは同一であった。したがって、開示した試薬は、４つのヌクレオシドのそれぞれについて開裂時間に関して評価した。

比較の目的で、次の条件で分析を行った。

ａ）メチルアミン／ｌ−ブチルアミン（１：１（容量／容量））ｂ）メチルアミン；およびＣ）アンモニア。

支持体に結合したオリゴヌクレオチドは、室温で、オリゴヌクレオチドを含んでなるカラムの両端に位置させたンリンジを介してカラムを通して上記の試薬を前後に送ることにより試薬１ｍｌにより処理した。得られる混合物のアリコート（５０μｍ）を、１，２．５．１０．１５．３０および６０分で除去し、１ｍｌの２度蒸留したＨ、Ｏと混合し、吸光度を２６０ｎｍで測定した。

固体支持体にすぐ隣接するヌクレオチドとは関係なく、開裂は、上記の試薬（ａ）および（ｂ）について約５分で達成された。アンモニアについては、開裂は、すべての条件に対し、約６０分で達成された。図１は、時間に対するオリゴヌクレオチドの開裂の百分率として、上記のことをまとめた動力学プロットを示す。

例Ｉ１．保護されたオリゴヌクレオチドの脱保護保護されたオリゴヌクレオチドの脱保護は、酵素により消化したオリゴヌクレオチドの逆相ＨＰＬＣ分析により測定した。使用した酵素は次のものであった：（１）５ｍｌの４０ｍＭのＴＲｌ５と１０ｍＭのＭｇＣ１，により再構成したフォスフオシエステラーゼＩ　（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ、Ｎｏ、Ｐ−６８９Ｆ）　、ｐＨ７，５（０，ＯＩＵを検定ごとに使用）；および（２）Ｅ、　ｃ。

１ｉ　２００Ｕ／１．８ｍｌからのアルカリフーオスファターゼ（Ｓｉｇｍａ、　Ｃａｔ、Ｎｏ、　Ｐ−４２５２）（０，２Ｕを検定ごとに使用）。２５μｍのフォスフオシエステラーゼおよび２μｌのフォスファターゼを、オリゴヌクレオチドのｉ−２０Ｄｚｓ。。１に加え、室温で、３０−１２０分間、温室した。０．５−１．００Ｄ、６゜。１の消化済み混合物を上記のＨＰＬＣカラムに注入した。

保護されたデオキシグアノシンの脱保護は、速度限定段階であるため、異なる百分率のｄＧｌｂ″からなる複数の２１−ｍａｒオリゴヌクレオチドの分析を行った。合成は、上記のＤＮＡ合成装置を用いて行い、次の２１−ｍａｒを得た：１）５’　−ＣＴＧ−ＧＡＣ−ＡＧＴ−ＡＧＴ−ＣＡＧ−ＡＣＴ−ＧＣ−（Ｔ）　−３°　［２５％Ｇコ２）５’　−ＧＴＧ−ＧＡＣ−ＧＣＴ−ＡＧＧ−ＧＣＧ−ＧＡＧ−（Ｃ−（Ｔ） −３°　［５０％Ｇ］３）５’　−Ｇｘ２１−３’　［１００％Ｇ］テストした試薬は、例工に示したのと同じであった。反応時間は、２５−８０°Ｃの範囲であった。結果は表■のようである。

表Ｉ保護されたオリゴヌクレオチドの脱保護（時間（分））２５　７５　タ０　９０　７Ｅ　７５　工００５５　７　１０　工０　：ＬＯ１０’０１１０　２　］　１　２　２　２表１（続き）Ｉ！ｉＩ！！されたオリゴヌクレオチドの脱保護（時間（分））２５　６０　６０　６０　４３２Ｑ　４３２０　５９４０３７　２０　２０　２０　１２００　ｕＯＱ　１８００６５　５　５　５　１８０　ＬｊＩＯ２４０日０　２　２　２　６０　ｇｏ　９０上記のデータは、開示した試薬のさまざまな特徴を示している。

先ず、いわゆる「慣用の」開裂／脱保護試薬であるアンモニアと比較し、開示した試薬は、有意的に短い時間で開裂と脱保護を行うことが注目される。さらに、温度が上がると、脱保護時間の減少により明示されるように、反応運動学も上がることが注目される。このように、開示した試薬は、研究者の必要に依存して、さまざまな反応温度にわたり利用できる。さらに、開裂と脱保護の点で、開示した試薬のさまざまな実施態様が、およそ同等程度で働くばかりではなく、さまざまな実施態様が、慣用の開裂／脱保護試薬よりも有意的に良好に働くことが注目される。

例ＩＩＩ：ンチジン副生成副生彫物注目されるように、デオキシシチジンは、例えば、デオキシシチジンを含んでなるオリゴヌクレオチドの保護除去の間に、副生成物形成を通常量も受けやすい。

典型的には、そのような副生酸物生成は、保護除去段階中の、または試薬が保護除去されたデオキシシチジンと接触したままの保護除去の後のアミノ基転移を介する。

当業者が認識するように、オリゴヌクレオチドの合成は、最終生成物をできるだけ迅速に回収することを意図して典型的には行われる。しかしながら、可溶化し、保護されたオリゴヌクレオチドが、長い時間保護試薬中に残ってよいことも時には可能である。当業者がさらに認識するように、オリゴヌクレオチドが試薬の中にある時の時間の増加が、アミノ基転移の起こる機会を増加し得て、副生酸物生成の機会を増す。

いくつかの時間い（つかの温度で、試薬としてメチルアミンとメチルアミン／ｌ −ブチルアミンの両者を用いて、逆相ＨＰＬＣにより、デオキシシチジン副生成物生成を調べた。「慣用の」デオキシシチジン保護基のｒｂｚＪとｒｉｂｕＪおよび上記のｒＡｃＪ保護基を調べた。そのような試薬を用いて観察された副生成物（核磁気共鳴により確認）は、Ｎ−メチルシチジンであった。デオキシシチジンと比べた、Ｎ−メチルデオキシシチジンの一百分率を、Ａｃ保護基により保護したデオキシシチジンの溶液に基づ（保護除去を基礎として、下記に示した。

表Ｉ＋Ｎ−メチルアミン形成の百分率０直亙に１　甚二　＝　五二（１６時間）本　平均百分率本１０．０１％は打器の最低検知限界である。

これらの結果は、典型的なオリゴヌクレオチド合成（すなわち、研究者が、できるだけ早くでき上がった最終生成物を望む合成）について、メチルアミンを含む試薬は、実買的に有意的なシチジン副生成物形成をもたらさないことを示している。しカルながら、オリゴヌクレオチドが試薬中に残る時間が増すと、シチジン副生成物形成のできるのを増す。したがって、アミン基転移抑制試薬（Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｔｉｏｎ　５ｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ）の使用は、（定義したように）宵月である；データは、メチルアミンに比べ、メチルアミンおよびＴＳＡｔ−ブチルアミンを含むる。

有利には、かくて、ＴＳＡは、そのような長くなった反応時間を考慮するかしないかにかかわらず試薬に含ませることができる。認識されるであろうように、通常は必要でないであろうが、ＴＳＡの使用は、次の少なくとも２つの理由から好ましい：第１は、ＴＳＡの存在は、副生酸物生成の可能性を減する；第２は、延長した時間が望まれる場合、最適開裂／脱保護時間を越える時間試薬内にオリゴヌクレオチドを保つ機会を研究者が与えられ−る。

第２の研究をこの線に沿って行った。これらの研究で、ｄ（：ＡＣ。

ｄＣＩｂｕ１ｄＣｂＩＳｄＧＩｂ″、ｄＡｂｆおよびｄＴに”：）いて（７）副生成物形成（ヌクレオシドについての非副生成物生成の相対的百分率として）を、試薬としてメチルアミン／ｌ−ブチルアミンを用いてさまざまな時間と温度で調べた。結果を表１１４に示す。

表ＩＩ＋副生成物形成の百分率３２５　９０　分　會Ｉ　Ｏ，’！：　１０．０　會脅　★會　＊喰２５　ＬＧ　ｓＢ、１１　会食　音量喰　音量會　會ｔ　音量　會ｉ３７　３０　分　會脅　０．１５　１０．０　音量　重電　重電３７　５Ｉ間　青會　音量喰　中喰音　音量　音量　音電３７　１６ｔ、ｊＪ　青雲　會音電　重電會　！！　音量　音量６５　５　分　音量　０．Ｌ５　Ｌｏ、０　音量　音量　會會（ｓＢ　ＬｎＭ　會脅　會脅會　音量實　重電　重電　會ｔ６５　１６　１ＲＬＩＩ　Ｑ、６　音量管　會脅會　音量　音量　音量８０　３　分　重管　０．１５　工０．０　音電　音量　音量８０　１時ｌ５ＩＩ　會青雲　重電會　會脅　會１　音量　會脅音量會最適温度／反応晴間での百分率のため調べずこれらの結果は、少なくともい（つかの事がらを示している。第１に、ｄＣ保護基に関して、データは、「ＡＣ」保護基が、開示の試薬と共に有利に使用され得ることを示している；　「慣用の」シチジン保護基は、有意的に高い副生成物形成をもたらした。第２に、開示した試薬は、高められた温度で、所望の反応時間よりも長い時間でのｄＣＡ ″の保護除去を別として、調べた温度または反応時間のずれでも、保護されたでデオキシヌクレオシドのいずれについても統計的に有意的な副生酸物生成をもたらさない。よって、Ａｃ保護基により保護されたデオキシシチジンを含むオリゴヌクレオチドについては、そのような高めた温度で、延長した反応時間を用いないことが好ましい。

例Ｉｖ：精製してないオリゴヌクレオチドの酵素消化分析いくつかのオリゴヌクレオチドの組成の分析を、酵素消化と逆相ＨＰＬＣ法を用いて行った。　これらの研究は、慣用の保護基ｂｚおよびＡｃ保護基で保護したデオキシシチジンを用いて行った：すべでの他の保護基は、オリゴヌクレオチド間で一貫していた。次の配列を有する３５−ｍａｒ、５１−ｍｅｒおよびｌｏｔ−ｍｅｒを分析した：５−ｍａｒ５°　−ＣＡＧ−ＴＧＣ−ＡＧＣ−ＴＣＣ−ＴＡＧ−ＣＡＧ−ＣＣＴ−ＡＧＣ− ＧＴＡ−ＣＴＡ−ＧＴＣ−ＴＴ−３゜５１−ｍａ　ｒ５°　−ＣＡＧ−ＴＣＣ−ＴＡＧ−ＴＣＡ−ＣＡＧ−ＴＣＣ−ＡＧＴ−ＣＧＣ− ＴＣＡ−ＡＧＣ−ＧＴＣ−ＣＡＧ−ＴＴＧ−ＣＡＣ−ＡＧＧ−ＴＣＡ−ＣＣＴ− ３’１０１−１０ｌ −’　−ＧＣＴ−ＧＣＣ−Ａｃ”ｒ−Ｔｃｃ　ＧＴＣ−ＡＴＣ−ＣＧＡ−ＴＣＣ −ＴＣＧ−ＧＴＣ−ＡｃＧ−ＣＡＡ−ＣＴＧ−ＴＣＡ−ＡＣＧ−ＧＣＡ−ＣＣＴ −ＡＣＴ−ＣＣＴ−ＣＧＴ−ＡＡＣ−ＧＴＡ−ＧＧＡ−ＣＡＧ−ＴＣＣ−ＧＡＴ −ＴＣＧ−ＣＡＣ−ＧＴＧ−ＣＡＡ−ＡＧＣ−ＣＣＡ−ＴＴＣ−ＡＴ−３’ オリゴヌクレオチドは、メチルアミン／ｌ−ブチルアミンを含んでなる試薬の実施聾様を用いて２５’Ｃで９０分間まｔこ；まアンモニアを用いて３時間６５° Ｃで開裂し、脱保護した。可溶イヒし、脱保護されたオリゴヌクレオチドは、分析に先立ち精製をしな力）つた。結果を表ＩＶに示す。

表工ｖ組成分析１＋淀結果各種の精製してないオリゴヌクレオチドの理論的組成と測定された組成は、良好な相関性を与えている。さらに、上記のデータに基づくと、デオキシンチジン保護基の違いは、結果に統計的に有意的な差を示さない。

例Ｖ、融点測定融点測定値を、不均質２１−ｍａｒとその補体についてめた。

同一のオリゴヌクレオチド（調査の際、メチルアミン／ｌ−ブチルアミンを含んでなる開示の試薬またはアンモニアより、開裂し脱保護した）。２１”ｍｅｒおよびその補体は次の配列を有していた：１−ｍａｒ５’　−ＡＧＣ−ＴＡＣ−ＧＧＴ−ＣＡＴ−ＣＧＴ−ＡＴＧ−ＣＡＴ−３’ 皿鉢５’　−ＡＴＧ−ＣＡＴ−ＡＣＧ−ＡＴＧ−ＡＣＣ−、ＧＴＡ−Ｇ、ＣＴ−３゜メチルアミン／ｌ−ブチルアミンを含・んでなる試・薬の″実施態様に９０分間２５℃でまたはアンモニア１こ３・時間６５′℃でオリゴヌクレオチドをその影響下・に置いた。脱保護と開裂の後、・それぞれのオ」ノボヌクレオチドとその補体のＯ，，５ｏ、Ｄ、、、。、−（’２．０μ゛１の最小容量中）をｌｏｍＭのＴＲＩ　Ｓ　（ｐＨ７，５）のｌ　ｍ　ｌに加えた。サンプルを１０−１５分間沸騰させてから、鉛加熱ブロック上でゆっくりと加熱した。サンプルをキュベツトに入れ、キュベツトの温度を３℃ごとに上昇させて２５℃から７０℃まで吸光度（２６０ｎｍ）を後続させてから、３分間、安定化させ、吸光度を読んだ。

結果を図２に示した：図２では、「、」は、アンモニア処理によるオリゴヌクレオチドの読みであり、「＊」は、開示した試薬による処理によるオリゴヌクレオチドの読みである。

図２に示、した結果は、アンモニアと比較した開示した試薬が、２１−ｍａｒの融点温度に影響を与えなかったことを示している。

温度に対する吸光度の読みは、両方の試薬条件下でほぼ同じパターンをたどった。

例ｖ１．ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｒＰＡＧＥＪ　）３５−ｍ＝ｅｒ　（３５％ｄＣ”；３５％ｄＣＡｃ、１００％ｄＣ”。

および１００％ｄＣ”）　、５１−ｍｅｒ　（３５％ｄＣ”、３５％ｄＣ”：１００％ｄＣ”、および１００％ｄＣ＾つおよび１０１−ｍｅｌｏｌ−％ｄＣ”、３５％ｄＣＡｃ、１００％ｄＣ”、および１００ｄＣＡｃ）の分析をＰＡＧＥにより分析した。ヘテロ３５−ｍｅｒ、ヘテｏ５１−ｍｅｒおよびヘテｏｌｏ１− ｍｅｒは例ＩＶで示したようにし、ホモ３５−ｍａｒ、ホモ５１−ｍａｒおよびホモ１０１１０ｌ−については、オリゴマーを不溶化したチミジンから合成した。ｄＣＡＣを含むオリゴヌクレオチドは、９０分間２５℃でメチルアミン／ｌ− ブチルアミンを含む試薬を用いて開裂し、脱保護した。ｄＣ”を含むオリゴヌクレオチドは６５°Ｃで３時間アンモニアを用いて開裂し脱保護した。

１００　ｇｍのあらかじめ混合したアクリルアミド／メチレンビス−アクリルアミド（２９：１）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ；　Ｃａｔ、Ｎｏ、１００−１５１）に１０７．３ｍｌの脱イオン水を加えて２２ｃｍ　ｘ　１６．５ｃｍの変性ゲル（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　ｇｅ　ｌ）を準備して、５０％原液とした。５０％原液２０ｍ１に、２２．５ｇの尿素、５　ｍ　ｌの１０ｘトリスボレート／ＥＤＴＡ　（ｒＴＢＥ」）および十分な脱イオン水を加えて、５０　ｍ　ｌとした。この溶液を攪拌し加熱して、固体成分を溶解させた。その後、２０ｍｇの過硫酸アンモニウムと２０μｌのＮ、Ｎ、Ｎ’　、　Ｎ’　−テトラメチルエチレンジアミン（ｒＴＥＭＤＪ）を加えた：この溶液を、清浄な皿にあけ、１時間重合させ、１時間２０ｍＡで１ｘＴＢＨによるプリラン（ｐｒｅ−ｒｕｎ）したゲル、０．２　１．０ＯＤｘｓ。＋＋ｓのそれぞれのオリゴヌクレオチドを１０μ ｌの１０ｍの尿素に加えた。２０μｍの添加物をゲルに充填してオリゴヌクレオチドの長さに従い２−４時間２８ｍＡで電気泳動した。バンドは、ＴＬＣ蛍光板へのＵＶ増影法によりまたはエチジウムプロミド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）染色により視覚化した。

写真による結果を図３に示すニス３では、レーン（ｌｉｎｅ）は次のように定めである：旦二之　オリゴヌ　レオ　１　３５−ｍａｒ（３５％ｄＣＡｃ）２　３５−ｍｅｒ（３５％ｄＣ”）３　３５−ｍａｒ　（１００％ｄＣＡｅ）４　３５−ｍｅｒ（１００％ｄ　Ｃ” ）５　５１−ｍｅｒ（３５％ｄＣ”）６　５１−ｍｅｒ（３５％ｄＣ’つ７　５１−ｍａ　ｒ　（１００％ｄＣＡｃ）８　５１−ｍａｒ　（１００％ｄＣｈｔ）９　１０１−ｍａｌｏｌ−％ｄＣＡｃ）ｔｏ　１０１−ｍｅｌｏｌ−％ｄＣ’つ１１　１０１１０ｌ−（１００％ｄＣ”）１２　１０１１０ｌ−（１００％ｄＣ”）図３の結果は、Ａｃ保護基および開示した試薬の実施態様の影響下に置いたオリゴヌクレオチドが、アンモニアおよび慣用のデオキシンチジン保護基ｂｚの影響下に置いたオリゴヌクレオチドに比べてほぼ同じＰＡＧＥパターンを与えることを示している。

例ＶＩ１．毛管電気泳動３５％ｄＣ”または３５％ｄＣ”を含んでなる不均質５１−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを、６５℃で３時間アンモニアまたは２５℃で９０分間メチルアミン／ｌ −ブチルアミンの影響下に置いてから、毛管電気泳動法で分析した。アンモニアおよび開示した実施態様の影響下に置いたオリゴヌクレオチドについての電気泳動図をそれぞれ図４および５に示した。

図４および５の結果は、５１−ｍａ　ｒの検出とサンプル導入からの時間の点でほぼ同じである。図４については６６．９０２、図５については６６．５７５である主ピークの下の全パーセント総和面積（ｐｅｒｃｅｎｔ−ｏｆ−ｔｏｔａｌ　ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄａ　ｒ　ｅ　ａ）もほぼ同じである。これらの結果は、試薬とＡｃデオキシンチノン保護基が、アンモニアおよび慣用のデオキシシチジン保護基ｂｚに対して比較的に同一の可溶性の脱保護されたオリゴヌクレオチドを与えることをさらに示している。

例Ｖｒ　Ｉ　１．ポリメラーゼ連鎖反応上記の例は、開示された試薬が、オリゴヌクレオチドを迅速にかつ効果的に開裂し、脱保護するのに用いられ得ることを明示する。しかしながら、当業者が認識するように、そのようなオリゴヌクレオチドをさまざまな方法に用いることができる必要がある。

ポリマメラーゼ連鎖反応でプライマーとして用いたオリゴヌクレオチドをつくり、９０分間２５℃でメチルアミン／ｌ−ブチルアミンを含む開示した試薬の実施態様の影響下に置いた（デオキシシチジンは、Ａｃで保護した）。プライマーは次に示す：８−ｍｅｒ５°　−ＣＧＣ−ＣＡＧ−ＧＧＴ−ＴＴＴ−ＣＣＣ−ＡＧＴ−３’ ２−ｍａｒ５’　−ＴＴＣ−ＴＧＧ−ＣＧＴ−ＡＣＣ−ＧＴＴ−ＣＣＴ−ＧＴＣ−Ｔ−３’ 鋳型は、Ｍ１３ｍｐ１８　ＲＦＩ　ＤＮＡ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　４００−１８）であった。製造者の措示に、ＧｅｎｅＡｍｐ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ｋｉｔを用いて従った。

初期の融解温度は、７分間で９５℃であった：２５サイクルを、次のサイクルプロフィールでＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　’ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒで行った：温度（”Ｃ）　時間（秒）Ｓｅｑ、＃１　９４　１Ｓｅｑ、＃２　９４　６０Ｓｅｑ、＃３　３７　１Ｓｅｑ、＃４　３７　１２０Ｓｅｑ、＃５　７２　１Ｓｅｑ、＃６　７２　１８０得られる９５７塩基対ＰＣＲ生成物はＴＲｌ５−アセテート／ＥＤＴＡ　（ｒＴＡＥＪ　）に含むようにした１％アガロースゲルで電気泳動にかけ、エチジウムプロミドで染色した。図６に写真による結果を示す１図６では、示したレーンは次のようである：レーン１　９５７ｐｂ生成物　（デオキシシチジンについてアセチル保護基とメチルアミン／ｌ−ブチルアミンを用いて誘導したプライマー）：レーン２　９５７ｐｂ生成物　（デオキシシチジンについてｂ２保護基とアンモニアを用いて誘導したプライマー）；レーン３　ゲルマ−カー　（Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ、２３２２および２０２７ｂｐマーカーにより消化したラムダＤＮＡ）；およびレーン４　ゲルマ−カー　（Ｈｉｎｆ　Ｌ１６３２および５０６ｂｐマーカーにより消化したＰＢＲ３２２ＤＮＡ）図６に示した結果は、デオキシシチジン保護基Ａｃおよび開示した試薬の実施態様を用いて誘導したプライマーが、アンモニア開裂と脱保護により得られ、デオキシシチジンについてのｂｚ保護基を用いたプライマーから誘導されたものと実買的に同じ増幅した（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）生成物を生じることをもたらすことを示しているデオキシシチジン保護基Ａｃおよびｂｚを用いて２組の１８−ｍｅｒを合成し、メチルアミン／ｌ−ブチルアミンを含んでなる開示した試薬の実施態様の影響下に９０分間２５℃で置いた、またアンモニアの影響下に３時間６５ ℃で置いた。１８−ｍａｒは、次の配列を有していた：８−ｍｅｒ５’　−ＣＧＣ−ＣＡＧ−ＧＧＴ−ＴＴＴ−ＣＣＣ−ＡＧＴ−３′ 可溶化し脱保護したオリゴマーを、Ｓｅｐ　Ｐａｋ　（Ｗａｔｅｒｓ、　Ｐａｒｔ　Ｎｏ、　５１９０）ＤＮＡ精製キットを用いて精製した。これらの精製したオリゴマーを、配列決定を目的としたプライマーとして用いた。鋳型は、Ｍ１３ｍｐ１８−末鎖ＤＮＡ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ。

４０４−Ｃ）；配列決定は、ＵＢＳ　５ｅｑｕｅｎａｓｅ物質およびプロトコールと共に１８−ｍａｒを用いて達成した。結果を図７に示す。

図７の結果が示すように、配列ノくンドｌくターン（ま、アンモニアおよびｂｚを介して誘導されたプライマーに対してＡｃ保護基および開示した試薬の影響下に置いたプライマーを用Ｌ）て実質的（二同じである。

例ｘ、３′　ターミナルトランスフェラーゼ延長デオキシンチジン保護基Ａｃおよびｂｚを用Ｌ）で２２−ｍａｒを合成し、メチルアミン／ｌ−ブチルアミンを含んでなる開示した試薬ニー）Ｌ’では９０分間２５℃で、アンモニア１こつｌ、％て（ま、３時間６５℃で、それぞれその影響下に置いた。２２−ｍｅｒｉｔ次の配ダ１１を有していた；２−ｍｅｒ５°−ＴＴＣ−ＴＧＧ−ＣＧＴ−ＡＣＣ−ＧＴＴ−ＣＣＴ−ＧＴＣ−Ｔ−３’ 可溶化し脱保護したオリゴマーを、Ｓｅｐ　Ｐａｋ　ＤＮＡ精製キットを用いて精製した。これらの精製したオＩＪゴマ−を、３゛　ターミナルトランスフェラーゼ延長を調べるためのプライマーとして用いた。

それぞれのオリゴヌクレオチド２．５０Ｄ２６０．＠。。７を、１５０μｌの脱イオン水に加えた；　５ｍｇのチミジントリフオスフェート（ｒＴＴＰＪ）Ｓｉｇｍａ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　Ｔａ２０５）：５μｌのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ、１５Ｕ／μｌ　（ＢＲＬ、Ｃａｔ、Ｎｏ、　８００８５Ｂ）および５０μｌのトレーリング緩衝液（ｔｒａｉｌｉｎｇ　ｂｕｆ　ｆ　ｅ　ｒ）。この添加物を３７℃で夜通し温室し、得られる物質を、次に示すようにＳｅｐ　Ｐａｋ　Ｃ１ｍカートリッジを用いて精製した：反応混合物を、０．５ｍの酢酸アンモニウムで１：２に希釈し、カートリッジに入れ、脱イオン水でカートリッジを洗浄し、生成物を脱イオン水に含むようにした６０％メタノールで溶離した。生成物は、毛管電気泳動により分析した；電気泳動図の結果を図８と９に示す。

図８と９の電気泳動図は、Ａｃにより保護し、試薬の影響下に置いたシチジンを含むプライマー（図８）とｂｚで保護、しアンモニアの影響下に置いたシチジンを含むプライマー（図９）が、両方とも、その３°末端で延長されたことを明示し、また１、得られる生成物が実質的に同一であることを明示する。

上記のデータは、開示した開裂／脱保護試薬が、固体支持体からオリゴヌクレオチドを迅速にかつ効率的に除去し、それから保護基を除去することを明示する。

加えて、そのような試薬の影響下に置いた可溶化し、脱保護したオリゴヌクレオチドは、特に、生物学的に有用である。さらに、ＴＳＡを含む開示した試薬は、副生酸物生成を実質的に減少させる。

オリゴヌクレオチドを試薬の影響下に置く時間と温度を変えることにより、開示した試薬は、オリゴヌクレオチドの合成に対しさまざまな状況で利用できる。たとえば、自動化された合成装置の処理量の増加；不溶化し、保護されたオリゴヌクレオチドの開裂と脱保護；不溶化し、保護されたオリゴヌクレオチドの開裂と脱保護（すなわち、保護されたオリゴヌクレオチドを溶液として保つことが望ましい時）：可溶性のオリゴヌクレオチドの脱保護（すなわち、研究者が、保存した、可溶性の保護されたオリゴヌクレオチドを有する場合；および不溶性のオリゴヌクレオチドの脱保護（すなわち研究者が保存した保護された不溶性のオリゴヌクレオチドを有する場合）。

以上かなり詳細に説明したが、詳細な説明で記載した実施態様と例とは開示または以下の請求の範囲を限定するものと解釈するものでないと理解されるべきである。本発明は、自動化されたＤＮＡ合成装置に限定されない。本発明は、デオキシリポ核酸オリゴヌクレオチドに限定されるものではなく、リポ核酸オリゴヌクレオチドおよび他の修飾したオリゴヌクレオチド例えばオリゴヌクレオチドメチルフォスホネートおよびフォスホロチオエートについて利用することもできる。

本発明は、ヌクレオシドのいづれかの特定の保護基に限定されるものではなく、さまざまな保護基について利用できる。当業者の認識範囲の修正および変更は、次の請求の範囲に入るものとされる。

時間（分）２５２Ｂ　３１　３４３７４０４３４５４９５２５５５８６１　６４６７７０温度　（°Ｃ）９１０１１夏２国際調査報告暫−一ム−＝　ＰＣＴ／ＵＳ　９３１０３３８６

Claims

【特許請求の範囲】

１．支持体に結合したオリゴヌクレオチドを開裂するためおよび／または保護されたオリゴヌクレオチドから少なくとも１つの保護基を除去するための試薬において、該試薬が、１−約１０個の炭素原子を有する少なくとも１つの直鎖アルキルアミンを含んでなる試薬。
２．該直鎖アルキルアミンが、１−約６個の炭素原子を有する請求項１の試薬。
３．該直鎖アルキルアミンが、１−約３個の炭素原子を有する請求項１の試薬。
４．該直鎖アルキルアミンが、メチルアミンである請求項１の試薬。
５．該試薬が、１−約１０個の炭素原子を有する直鎖、分枝、環状の飽和または不飽和アルキルアミン；１−約１０個の炭素原子を有しかつ少なくとも１つの官能基を含む直鎖、分枝、環状の飽和または不飽和アルキルアミン；エタノール；メタノール；イソプロピルアミン：アセチルニトリル；ジメチルホルムアミド；テトラヒドロフラン；および上記のものの組み合わせからなる群から選択された少なくとも１つのアミノ基転移抑制剤をさらに含む請求項１の試薬。
６．該アミノ基転移抑制剤が、ｔ−ブチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミンおよび第２ブチルアミンからなる群がら選択されるアルキルアミンである請求項５の試薬。
７．ｔ−ブチルアミンをさらに含む請求項１の試薬。
８．直鎖アルキルアミンのアミノ基転移抑制剤に対する容量対容量比が、約９：１−約１：９である請求項５の試薬。
９．該直鎖アルキルアミン対ｔ−ブチルアミンの比が、約３：１−約１：３である請求項７の試薬。
１０．アンモニア水をさらに含む請求項１の試薬。
１１．アンモニア水をさらに含む請求項５の試薬。
１２．支持体に結合したオリゴヌクレオチドを開裂するためおよび／またはプロトコールオリゴヌクレオチドから少なくとも１つの保護基を除去するための試薬において、該試薬が、ａ）１−約１０個の炭素原子を有する少なくとも１つの直鎖アルキルアミン；およびｂ）少なくとも１つのアミノ基転移抑制剤を含んでなる試薬。
１３．該アミノ基転移抑制剤が、１−約１０個の炭素原子を有する直鎖、分枝、環状の飽和または不飽和アルキルアミン：１−約１０個の炭素原子を有しかつ少なくとも１つの官能基を含む直鎖、分枝、環状の飽和または不飽和アルキルアミン；エタノール：メタノール；イソプロピルアミン；アセチルニトリル；ジメチルホルムアミド：テトラヒドロフラン；および上記のものの組み合わせからなる群から選択される請求項１２の試薬。
１４．該アミノ基転移抑制剤が、ｔ−ブチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミンおよび第２ブチルアミンからなる群から選択されるアルキルアミンである請求項１３の試薬。
１５．該直鎖アルキルアミンが、１−約６個の炭素原子を有する請求項１２の試薬。
１６．該直鎖アルキルアミンが、１−約３個の炭素原子を有する請求項１２の試薬。
１７．該直鎖アルキルアミンが、メチルアミンである請求項１２の試薬。
１８．該アミノ基転移抑制剤が、ｔ−ブチルアミンである請求項１２の試薬。
１９．直鎖アルキルアミンのアミノ基転移抑制剤に対する容量対容量比が、約９：１−約１：９である請求項１２の試薬。
２０．該直鎖アルキルアミンのアミノ基転移抑制剤に対する容量対容量比が、約１：１である請求項１２の試薬。
２１．アンモニア水をさらに含む請求項１２の試薬。
２２．支持体に結合したオリゴヌクレオチドを開裂するためおよび／または保護されたオリゴヌクレオチドから少なくとも１つの保護基を除去するための試薬において、該試薬が、ａ）１−約１０個の炭素原子を有する少なくとも１つの直鎖アルキルアミン；ｂ）１−　約１０個の炭素原子を有する直鎖、分枝、環状の飽和または不飽和アルキルアミン；１−約１０個の炭素原子を有しかつ少なくとも１つの官能基を含む直鎖、分枝、環状の飽和または不飽和アルキルアミン；エタノール；メタノール：イソプロピルアミン；アセチルニトリル；ジメチルホルムアミド；テトラヒドロフラン；および上記のものの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ基転移抑制剤：およびｃ）アンモニア水を含んでなる試薬。
２３．支持体に結合したオリゴヌクレオチドを開裂するためおよび／または保護されたオリゴヌクレオチドから少なくとも１つの保護基を除去するための方法において、該方法が、ａ）ｉ）少なくとも１つの不溶性の保護されたオリゴヌクレオチド、ｉｉ）少なくとも１つの可溶性の保護されたオリゴヌクレオチド：およびｉｉｉ）少なくとも１つの不溶性のオリゴヌクレオチドからなる群から選択されたオリゴヌクレオチドを、１−約１０個の炭素原子を有する少なくとも１つの直鎖アルキルアミンを含んでなる試薬に導入して混合物を形成させ：そしてｂ）該混合物を十分な時間十分な温度で温置して少なくとも１つの生物学的に有用なオリゴヌクレオチドを得る、工程を含んでなる方法。
２４．該直鎖アルキルアミンが、１−約６個の炭素原子を含む請求項２３の方法。
２５．該直鎖アルキルアミンが、１−約３個の炭素原子を含む請求項２３の方法。
２６．該直鎖アルキルアミンが、メチルアミンである請求項２３の方法。
２７．該試薬が、１−約１０個の炭素原子を有する直鎖、分枝、環状の飽和または不飽和アルキルアミン：１−約１０個の炭素原子を有しかつ少なくとも１つの官能基を含む直鎖、分枝、環状の飽和または不飽和アルキルアミン；エタノール；メタノール：イソプロピルアミン；アセチルニトリル；ジメチルホルムアミド；テトラヒドロフラン；および上記のものの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ基転移抑制剤をさらに含む請求項２３の方法。
２８．該アミノ基転移抑制剤が、ｔ−ブチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミンおよび第２ブチルアミンからなる群がら選択されるアルキルアミンである請求項２７の方法。
２９．該試薬が、ｔ−ブチルアミンをさらに含む請求項２３の方法。
３０．該試薬が、アンモニア水をさらに含む請求項２３の方法。
３１．該試薬が、アンモニア水をさらに含む請求項２９の方法。
３２．該温置時間が、約１００分未満である請求項２３の方法。
３３．該温置温度が、約１００℃未満である請求項２３の方法。
３４．支持体に結合したオリゴヌクレオチドを開裂するためおよび／または保護されたオリゴヌクレオチドから少なくとも１つの保護基を除去するための方法において、該方法が、ａ）ｉ）少なくとも１つの不溶性の保護されたオリゴヌクレオチド、ｉｉ）少なくとも１つの可溶性の保護されたオリゴヌクレオチド；およびｉｉｉ）少なくとも１つの不溶性のオリゴヌクレオチドからなる群から選択されたオリゴヌクレオチドを、試薬に導入して混合物を形成させ、該試薬がｉ）１−約１０個の炭素原子を有する少なくとも１つの直鎖アルキルアミン、およびｉｉ）少なくとも１つのアミノ基転移抑制剤を含んでなり、そしてｂ）該混合物を十分な時間十分な温度で温置して少なくとも１つの可溶性のオリゴヌクレオチドを得る、工程を含んでなる方法。
３５．該アミノ基転移抑制剤が、１−約１０個の炭素原子を有する直鎖、分枝、環状の飽和または不飽和アルキルアミン；１−約１０個の炭素原子を有しかつ少なくとも１つの官能基を含む直鎖の分枝、環状の飽和または不飽和アルキルアミン：エタノール；メタノール：イソプロピルアミン；アセチルニトリル；ジメチルホルムアミド：テトラヒド口フラン；および上記のものの組み合わせからなる群から選択される請求項３４の方法。
３６．該アミノ基転移抑制剤が、ｔ−ブチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミンおよび第２ブチルアミンからなる群がら選択されるアルキルアミンである請求項３５の方法。
３７．該試薬が、ｔ−ブチルアミンをさらに含む請求項３４の方法。
３８．該直鎖アルキルアミンが、１−約６個の炭素原子を含む請求項３４の方法。
３９．該直鎖アルキルアミンが、１−約３個の炭素原子を含む請求項３４の方法。
４０．該直鎖アルキルアミンが、メチルアミンである請求項３４の方法。
４１．該試薬が、アンモニア水をさらに含む請求項３４の方法。
４２．該温置時間が、約１００分未満である請求項３４の方法。
４３．該温置温度が、約１００℃未満である請求項３４の方法。