JPH07505904A - オリゴヌクレオチド類を開裂及び脱保護する方法及び試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 オリゴヌクレオチド類を開裂及び脱保謁する方法及び試薬直連」朋 本出願は、本出願と同時に提出したパラメスワラ・メダ・レディ（Ｐａｒａｍｅ ｓｗａｒａ　Ｍｅｄａ　Ｒｅｄｄｙ）とナエーム・ホトロス・ハナ（Ｎａｅｅｍ 　Ｂｏｔｒｏｓ　Ｈａｎｎａ）による「オリゴヌクレオチド合成で有用な保護基 」についての米国出願番号第−−−−−−二ベックマンドヶット番号第１２８Ｄ −１００７号）に関連する。関連出願は、相互参考のためにここに十分に組み本 発明は、オリゴヌクレオチドの合成一般に関し、さらに詳細には、固体支持体か らオリゴヌクレオチドを開裂し、オリゴヌクレオチドから保護基を除去する方法 および試薬に関する。

光匪Ω丘景 デオキシリポ核酸（ＤＮＡ）及びリポ核酸（ＲＮＡ）は長い糸状の巨大分子であ り、ＤＮＡはデオキシリボヌクレオチド類の鎖を含んでなり、ＲＮＡはリボヌク レオチド類の鎖を含んでなる。ヌクレオチドはヌクレオシド及びＩまたはそれ以 上のリン酸（ホスフェート）基からなり、ヌクレオシドはペントース糖に結合し た含窒素塩基からなる。典型的には、リン酸基はペントース糖の第５炭素（Ｃ− ５）ヒドロキシル基（ＯＨ）に付着しているが、第３炭素ヒドロキシル基（Ｃ− ３０Ｈ）にも付着することができる。ＤＮＡの分子内で、ペントース糖はデオキ シリポースであり、他方ＲＮＡの分子内で、ペントース糖はリボースである。Ｄ ＮＡ中の含窒素塩基はアデニン（Ａ）、シトンン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）及びチ ミン（Ｔ）である。これらの塩基はＲＮＡについてもウラシル（Ｕ）がチミンを ！き換える以外同じである。したがって、集団的に［チオキシヌクレオチド類」 と呼ばれるＤＮＡの主要ヌクレオチド類は次の通りである：デオキシアデノシン （ｄＡ）、デオキシシチジン（ｄＣ）、デオキシグアノシン（ｄ　Ｇ）及びチミ ジン（Ｔ）である。対応するりボタクレオチド類はＡ、ＣＳＧ及びＵで示される 。（便宜上、及び対応するチミジンリポヌクレオシドが存在しないから、デオキ シチミジンは典型的にＴで示されるが、整合性の上から、チミジンはこの開示中 ではｄＴで示す。） ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の含窒素塩基の配列はその分子内に含まれる遺伝情報をコ ード化する。ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の糖及びリン酸基は構造的な役目を果たし 、分子のバックボーンを形成する。特に、各ヌクレオチドの糖部分は隣接ヌクレ オチドの糖部分に結合して、１つのヌクレオチドのペントース糖の３゛　−ヒド ロキシルが隣接ヌクレオチドのペントース塘の５゛　−ヒドロキシルに結合する 。

２つのペントース糖量の結合は典型的にはリン酸ジエステル結合を経ている。こ の結合プロトコル（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）に基づいて、ヌクレオチド類の一端（末 端）は５゛末！（例えば、ヒドロキシル、トリリン酸など）を有しており、他端 は３′　−ヒドロキシル基を有している。便宜上、ヌクレオチド類の塩基配列は ５′から３°の方向に記載される。

ＤＮＡ及びＲＮＡは生きている動物によりその内部で製造されるけれども、化学 的に合成することができ、ＤＮＡ及びＲＮＡの合成ストランドが迅速かつ効果的 に製造できる。これらのストランドは「合成オリゴヌクレオチド」または「オリ ゴヌクレオチド」と呼ばれる。広く利用されるオリゴヌクレオチド類合成用の化 学的操作は「ホスホルアミダイト法」と呼ばれる。例えば、米国特許第４．４１ ５．７３２号：マクブリッド・エル及びカルザース・エム、テトラヘドロン・レ ターズ（ＭｃＢｒｉｄｅ　Ｌ、　＆　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｍ、　Ｔｅｔｒａ ｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ）、２４　：２４５−２４８　（１９８３）　、及 びシンハ・エヌら、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ（Ｓｉｎｈａ、　Ｎ、　 ｅｔａｌ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５）旦：４５３９−４５５７　（ １９８４）参照、これらは全てここに参考として取り入れられる。ホスホルアミ ダイト法に基づく商品として入手可能なシンセサイザーには例えばバイオリサー チ８７５０”及びＡＢＩ３８０Ｂ”、３９２”及び３９４”ＤＮＡシンセサイザ ーが含まれる。

化学的合成オリゴヌクレオチド類の重要性は、基本的にそれらヌクレオチド類が 用いられる広く変化に富んだ用途による。例えば、オリゴヌクレオチド類は遺伝 子工学、組換えＤＮＡ技術、アンチセンスＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ検出、種々の系 からのＤＮＡ及びＲＮＡプローブ、蛋白質−Ｄ　Ｎ　Ａ　？Ｊ１合体の検出、サ イト七向突然変異誘発の検出、ＤＮＡ及びＲＮＡ合成用プライマー、ポリメラー ゼ鎖反応やりガーゼ鎖反応などのような増幅技術用プライマー、鋳型、リンカ− １分子相互作用研究を含む生物学研究において利用することができる。

ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の主要な構造は次のように表すことができる。

ＤＮＡ　Ｔ’ｌ五Ａ Ｂ＝アデニン、チミン　Ｂ、＝アデニン、ウラシル、グアニン、シトシン　グア ニン、シトシン核酸合成の鍵となる段階は１つのヌクレオチドの５’　−ＯＨ基 ともう１つの３’　−ＯＨ基の間のヌクレオチド内リン酸結合を特異的かつ配列 順に形成させることである。したがって、オリゴヌクレオチドの典型的な合成に おいて、「入ってくる」ヌクレオチドのリン酸基はもう１つのヌクレオチドの５ °−ＯＨ基と結合する（すなわち、５’　−ＯＨ基が「リン酸化」または「亜リ ン酸化」される）。

これらの基はオリゴヌクレオチドの合成に活性的に関与できなければならない。

このように、研究者が２つのそのようなヌクレオチドを反応室に導入し、その中 の条件を２つのヌクレオチドが正常に結合するよう調節し、そのような付加を一 連して順次行うことにより一定の配列を有するオリゴヌクレオチドの生成が正確 に達成できるように５′−ＯＨ基は（典型的にはジメトキシトリチル（ＤＭＴ） 基により）変性される。

ヌクレオシドの４つの塩基であるアデニン、チミン（ＲＮＡの場合はウラシル） 、グアニンおよびシトシンは、化学的に活性である部分（たとえば、環外アミノ 基）を含んでいる。これらの基は、「一時的に」保護されねばならない、すなわ ち、オリゴヌクレオチド合成が完結した後まで保護基は、塩基の反応性部位を遮 断できなくてなはらない：そのような合成が完結した後、またこれらの基は、オ リゴヌクレオチドの生物学的な活性が影響を受けないように塩基から除去され得 なくてはならない。ｄＡＳｄＣ，ｄＧ　（またはＲＮＡ合成の場合は対応するり ボヌクレオチド）のアミノ基を保護しないと、所望されないおよび／または有用 さの少ない物質が合成されることになる。アミノ基を持たないチミン（Ｔ）は、 保護基を典型的に必要としない。ｄＡに対する従来のアミノ保護基は、ベンゾイ ル基（ｒｂｚＪ）；ｄＣに対してはｂｚ基またはイソブチリル基（ｒｉｂｕＪ） ；ｄＧに対してはｉｂｕである。次のようにどの保護基が用いられているかを示 すのが慣用である：ｄＡ’″、これはベンゾイル保護基が用いられてアデニン環 外アミノ基を保護していることを示している。

オリゴヌクレオチド合成の制御の度合いをさらにを保つために、不溶化した開始 点からオリゴヌクレオチドの合成を始める必要がある。すなわち、オリゴヌクレ オチドは、適当な固体支持体に「拘束」されたままで合成される。このプロトコ ールは、溶液に基づくオリゴヌクレオチド合成に比較して合成の速度と便利さと を増加する。したがって、オリゴヌクレオチドの合成は、最終段階として、オリ ゴヌクレオチドからの保護基の除去（「保護を除去すること（脱保護）」および 固体支持物質からのオリゴヌクレオチドの解放（「開裂」）を必要とする一一一 このような段階は、生物学的に有用なオリゴヌクレオチドを生ずるために必要と される。

「保護を除去すること（脱保護）」は、ヌクレオチドに組み込まれた保護基の除 去に必要なプロセスと時間として定義され、「開裂」は、ヌクレオチドが付着し た固体支持物質からの合成されたオリゴヌクレオチドの除去に必要なプロセスと 時間として定義される。

ｄＧの保護を除去することは、オリゴヌクレオチド脱保護の速度限定段階である 。慣習により、当業者は、オリゴヌクレオチドに組み入れられたデオキシグアノ シンの保護を除去するに必要な時間に関心が集まろう。副生酸物形成（すなわち 、所望されない物質の生成）に関して、デオキシシチジンは、特に副生物形成を 受けやすい。したがって、副生酸物形成を避けるかまたは最低にするのを確実に する努力から、ｄＣに関する副生酸物形成を監視することが通常有用であるとみ なされる。

保護を除去することと開裂は、典型的には、アンモニアを用いることにより達成 される。保護を除去し開裂する試薬としてのアンモニアの広範な使用のため、保 護の除去と開裂に必要な時間の観点から、他のそのような試薬とアンモニアとを 比較することは、一般に行われている。アンモニアの手段による保護の除去と開 裂は、室温で数日要し得、あるいは、５５℃で約６−１７時間要し得る。典型的 には、開裂は、室温で約１時間以内で起こり、残りの時間は、保護の除去に向け られる。典型的なオリゴヌクレオチド（すなわち長さが、約２０−２５個のヌク レオチド）の合成は、約２時間で合成でき：最も商業的に入手できる合成装置（ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて不溶化され成長しているヌクレオチド鎖に１ つのヌクレオチドを加えるのに約６分間必要とされる。オリゴヌクレオチドを合 成するに必要な時間と相対的に、アンモニアを用いてオリゴヌクレオチドの保護 を除去して開裂するのに必要な時間は、過剰となり得る。

異なる保護基の使用は、保護の除去と開裂に必要な時間の短縮を考慮に入れる。

ジメチルホルムアミジン（ｒＤＭＦＪ　）が、ｄＧおよびｄＡに対する有用な保 護基であると報告された。ここに参考として入れたＶｕ、Ｈｕｇｎｈ　ｅｔ　ａ 　１．　ｒＤＮＡ合成に対する速いオリゴヌクレオチド脱保護ホスホルアミダイ ト化学（Ｆａｓｔ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏ ｎ　ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙｆｏｒ　ＤＮＡ　５ ｙｎｔｈｅｓｉｓ）Ｊ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　ＬｅｔｔｅｒｓＳ３土：　７ ２６９−７２７２を参照。説明しであるように、そのような保護基を含むオリゴ ヌクレオチドは、脱保護と開裂に、アンモニア水中で５５℃で１時間、またはア ンモニア水中で室温で８時間を要する。フェノキシアセチル（ｒＰＡＣＪ）が、 ｄＧおよびｄＡに対する有用な保護基であることも報告されている。ここに参考 として入れたＥＰＯ公開出願（Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ） 第０２４１３６３ＡＩ。

ｒＤｅｒｉｖｅｓ　ｄｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ｅｔ　１ｅｕｒ　ｕｔｉｌ ｉｚａｔｉｏｎ　ｐｏｕｒ　ｌａ　５ｙｎｔｈ　ｓｅｄ’ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ ｏｔｉｄｅｓＪ、Ｍｏ１ｋｏ、　Ｄｉｄｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ　（１９８７）を参 照。説明しであるように、この保護基を含むオリゴヌクレオチドは、脱保護と開 裂に対してアンモニア水中で室温で２−８時間を要する。

脱保護と開裂に要する時間を少なくする別のアプローチとしては、ほかの脱保護 と開裂の試薬を単独でまたはアンモニアと組み合わせて用いることである。低級 アルキルアルコール、水および３−６個の炭素原子を含む非親核的ヒンダードア ルキルアミンを含んでなる試薬が、室温で１−２時間以内の開裂をもたらし、さ らに約８０℃−約９０°Ｃで約２０−６０分での脱保護をもたらすことが報告さ れている。ここに参考として入れたＥＰＯ公開出願第０３２３１５２Ａ２ｒオリ ゴヌクレオチドの合成方法（Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ　 Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）Ｊ、Ｗｏｏ、Ｓａｍ　Ｌｅｅ、　ｅｔ　ａ ｌ　（１９８９）（以下ｒＷｏｏＪ）を参照。脱保護と開裂に対しｎ−ブチルア ミン／メタノールの１＝１混合物（容量／容量）によるオリゴヌクレオチドの処 理が記載されている。ここに参考として入れたＷｅｂｅｒ、ＨおよびＫｈｏｒａ ｎａ、Ｈ，Ｇ、のｒｃｔｖ、イーストからのアラニントランスファーリボ核酸に 対する遺伝子構造の総合合成。ヌクレオチド配列２１−４０に相当するアイコサ −デオキシヌクレオチドの化学的合成。Ｊ、Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

ヱ２：２１９−２４９　（１９７２）（以下、ｒＷｅｂｅｒＪ）を参照。しかし ながら、この試薬は、デオキシシチジン副生成物の形成をもたらしたことが報告 されている。したがって、さらに説明されるように、シチジンを含まないオリゴ ヌクレオチドでは、ｎ−ブチルアミンとメタノールのｌ：ｌ混合物（容量／容量 ）での２日間の室温での処理、シチジンを含むオリゴヌクレオチドでは、処理は 、まず、２日間の室温でのアンモニアを含み、（デオキシシチジン副生成物の形 成を避けるため）ｎ−ブチルアミンとメタノールの１．１混合物（容量／容量） での２日間の室温を後続させる。

以下は、前記の保護基と試薬についての脱保護と開裂に必要な記載した時間の簡 単な要約である。

脱係ｔ！／開裂時間 試薬　、（時間）　温度ｒ＝ニ ーアンモニア　６−：Ｌ７　５三 アンモニア　）２４　Ｒ−Ｔ。

ＤＭＦ／アンモニア　２５５ ０ＭＦ／アンモニア　９　Ｒ、７・ ＰＡＣ／アンモニア　８：（、Ｔ。

Ｗｏｏｓ　１−３　Ｒ，Ｔ、；８０／９０Ｗａｌｐξｒ　２日間　Ｒ１τ。

Ｍ出ｅｒ″４日間　Ｒ，Ｔ。

１＊　低級アルキルアルコール、水および３−６個の炭素原子を含む非親核的ヒ ンダードアルキルアミンからなる混合物；Ｒ，Ｔ、Ｔｌ−２時間（開裂）および ８０−９０　’Ｃで２０−６０分間（脱保護） ２ネ＊　オリゴヌクレオチドを含むｎｏｎ−Ｃａｎ−ブチルアミン／メタノール のｌ＝１混合物（容量／容量）３…　Ｃを含むオリゴヌクレオチド：アンモニア （２日間）、続けてｎ−ブチルアミン／メタノール（２日間）Ｒ，Ｔ、　冨室温 麿鳳−−ｓｍ簡−曽−−誼一一寓冒一霞鱈一細讃■−冒鳳一−■電−鴫一一■− 園−−膳一閣調一■■麿−■−■−露一■ｍ＋＋＋開裂と脱保護のための前記の 報告された反応時間のい（つかは、アンモニアだけのものよりも短いが、オリゴ ヌクレオチドの合成に必要な時間と比べ、多くの時間が脱保護と開裂に向けられ ていることが明白である。

オリゴヌクレオチドが合成され得る迅速性が与えられているとして、必要なもの は、副生酸物生成なしを最低として、さまざまな利用できる保護基の迅速な除去 と、支持体からのオリゴヌクレオチドの開裂を行い得る試薬である。実際的見地 から、加熱段階と組み合わさって、そのような試薬がオリゴヌクレオチドを脱保 護し開裂できる迅速性が増すように、そのような試薬が、さまざまな温度で有用 であることが好ましい。

凡肌二盟ヱ 本発明は少なくともこの要求を満たす。ここに開示の発明に従えば、合成により 生成したオリゴヌクレオチドの脱保護と開裂に有用な試薬が提供される。該試薬 は、ｌ−約１０個の炭素原子を有する少な（とも１つの直鎖アルキルアミンを含 んでなる。好ましくは、該試薬は、少なくとも１種のアミノ基転移抑制剤をさら に含んでいて、ｔ−ブチルアミンが、特に好ましいアミノ基転移抑制剤である。

該試薬は、さらにアンモニアを含むことができる。

好ましくは、試薬のアルキルアミンは、ｌ−約６個の炭素原子、さらに好ましく は、ｌ−約３個の炭素原子、最も好ましくは、ｌｆｌｌも炭素原子を宵する。し たがって、最も好ましい試薬は、メチルアミンを含んでなる。都合よくは、オリ ゴヌクレオチドの脱保護と開裂は、約９０分未満で室温で起こり得るが、より速 い脱保護と開裂を達成するには、より高い温度も用いられ得る。

本発明に従えば、保護されたオリゴヌクレオチドの開裂の方法、可溶性オリゴヌ クレオチドからの保護基の除去の方法および不溶化されたオリゴヌクレオチドの 保護を除去する方法が、開示の試薬と関連して、可能である。

これらの利点およびほかの利点が、開示により明らかとなろう。

ｌ証旦皿車眉説所 以下の図面は、好ましい実施態様の詳細な説明を明瞭にする目的で用いることを 意図している： 図１は、各種の試薬を用いた、不溶化した不均質２１−ｍａｒの開裂に対する時 間のグラフによる表示である。

図２は、開裂／脱保護試薬としてのメチルアミン／ｌ−ブチルアミンおよび開裂 ／脱保護試薬としてのアンモニアの影響下に置いた２ｔ−ｍｅｒ（およびその補 体（ｃ　ｏｍｐ　１　ｅｍｅ　ｎ　ｔ）　）の融点分析である。

図３は、さまざまなの百分率のｄＣ”およびｄＣ”を含み、図２の開裂／脱保護 試薬の影響下に置いた各種の３５−１５１−および１０１−ｍｅ　ｒのポリアク リルアミドゲル電気泳動分析の写真による再現である。

図４は、開裂／脱保護試薬としてのアンモニアの影響下に置いた３５％ｄＣ”を 含んでなる不均質５１−ｍｅｒの電気泳動図である。

図５は、開裂／脱保護試薬としてのメチルアミン／ｌ−ブチルアミンの影響下に 置いた３５％ｄＣ”を含んでなる不均質５１−ｍｅｒの電気泳動図である。

図６は、ＰＣＲ誘導の９５７塩基対増幅鋳型（ＰＣＲ−ｄｅｒｉｖｅｄ　９５７ 　ｂａｓｅ−ｐａｉｒ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｔｅｍｐｌａｔｅ）の写真による 再現である。

図７は、Ｍ１３ｍｐ１８鋳型の配列決定反応の写真による再現である。

図８は、ｄＣＡｃを含み、開裂／脱保護試薬としてのメチルアミン／ｌ−ブチル アミンの影響下に置いた２２−ｍａｒを用いて開始させた３°　−ターミナルト ランスフェラーゼ延長（３’　−Ｔｅ　ｒｍｉｎａｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ 　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）の電気泳動図である。

図９は、ｄＣ”“を含み、開裂／脱保護試薬としてのアンモニアの影響下に置い た２２−ｍａｒを用いて開始させた３′　−ターミナルトランスフェラーゼ延長 の電気泳動図である。

い　能　のび　ｔ″ｔ［Ｉ 当業者が認めるように、自動化した合成装置にまつわる欠点は、保護基の脱保護 と、固体支持物質上に合成されている場合の固体支持物質からの保護基の開裂と に必要な時間である。さらには、実際的見地から、機器自体で開裂と脱保護を行 う商業的に入手できる自動化された合成装置の大部分について、その機器が開裂 段階の間利用できなく、当然、処理量を減する。さらには、慣用の開裂および脱 保護の試薬は、個人が、合成装置カラムを通してアンモニアを手動的に押す／引 くようにすることを要して開裂と脱保護を実施し得るもので、個人がほかの企画 に従事できる時間を減じる。さらに、アンモニアと共に合成装置カラムの内容物 を熱することは、不溶化したオリゴヌクレオチドを異なる容器に注ぐこと、アン モニアを加えること、新たな容器を加熱することおよび容器を遠心分離にかけ支 持物質を除去することを典型的に必要とする。すべてのこれらの段階は、本質的 に時間を費やすものであり、特に、誤差の可能性を加える。

保護の除去と開裂のための時間を減じ得る試薬は、当然、明白な目標であり、当 業者は、そのような試薬は少なくとも次の基準を満たさねばならないことを認め るであろう、オリゴヌクレオチドの完全な状態が保たれねばならない、すなわち 、オリゴヌクレオチドが、例えば、プローブとしての使用に対して、配列決定お よび合成に対してなど生物学的に有用であらねばならない；また、副生酸物形成 が、実質的に最小限とされねばならなく、好ましくは、まったく排除されねばな らない。

ここで用いた、用語「オリゴヌクレオチド」は、合成のデオキシオリゴヌクレオ チドおよびリボオキシヌクレオチドさらに修飾オリゴヌクレオチド（すなわち、 ここでは、３’　ＯＨ，５’　ＯＨ：糖または複素環塩基が修飾されている）を 含み、フォスフェート主鎖の修飾（例えば、メチルフォスフォネート、フォスフ ォロチオエートおよびフォスフォラミデート）も含む。さらに、オリゴヌクレオ チドは、付着リポータ−基を含むオリゴヌクレオチド例えばビオチン、アビジン 、ハプテン、染料、蛍光ラベノペ化学発光ラベル、酵素ラベルまたは放射性ラベ ルおよびオリゴヌクレオチドが合成される固体支持体以外の固体支持体を含み得 る。

ここで用いた用語「迅速」、「実質的に短縮された（短くされた）」、「速い」 などは、開示の試薬と関連して用いた時、相対的なものであり、試薬が働いてい る媒質の温度に依存する。広い意味で、これらの用語は、脱保護と開裂が、室温 で少なくとも約９０分で、また約９０℃で少なくとも約１５分で完了し得ること を示すことを意図する。比較として、アンモニアは、開裂と脱保護に対し室温で 少なくとも約２４時間、また約８０℃で少なくとも約９０分未満する。

アンモニアよりも少なくとも５倍親核的な少なくとも１つの第１の試剤；水の１ ．５分の１以下のの極性の第２の試剤：およびアンモニア水からなる組み合わせ が、アミノ基転移／副生成物生成を実質的に防ぐ保護除去および切断の試薬とし て有効に用いられ得ることが見いだされた。第１の試剤、第２の試剤およびアン モニア水に関してここで用いた「組み合わせ」は、試薬が少なくとも次の好まし い実施態様を含んでなることを示すことを意味する。

ａ）第１の試剤： ｂ）第２の試剤およびアンモニア水： Ｃ）第１の試剤および第２の試剤；およびｄ）第１の試剤、アンモニア水：およ び第２の試剤。

第１の試剤（アンモニアよりもより親核的）は、１−約１０個の炭素原子を有す る直鎖のアルキルアミンである。その親核性に加え、アルキルアミンの長さも、 考慮すべき事がらで、好ましくは、直鎖のアルキルアミンは、１−約６個の炭素 原子を有し、より好ましくは、１−約３個の炭素原子を有し、最も好ましくは、 １個の炭素原子を有する（すなわちメチルアミンである）。メチルアミンは、特 に好ましい第１の試剤であり、その理由は、これが、アンモニアの約４０分の１ の親核性であるからであり、また、定義された直鎖のアリキルアミンの内で「最 も小さい」からである。特定の理論に拘泥することを望むものではないが、その 親核性と大きさとに依存してそのような試剤は、保護基（および用いられている 場合は固体の支持体）とオリゴヌクレオチドの個々のヌクレオチドとの間の結合 を攻撃するのに特に適していると考えられる。そのような試剤がこれらの結合を 攻撃し得る相対的な「容易さ」のため（すなわち、反応動力学の増加）、保護の 除去と切断の時間を実質的に短縮する。

当業者が認識するように、「アミノ基転移」とは、ヌクレオチド上のアミンの交 換を指し、典型的には、アミノ基転移は副生成物の生成として明示される。たと えば、メチルアミンの存在下で、たとえば望ましくない副生成物であるＮ−メチ ルシチジンへのシチジンのアミノ基転移の可能性は増す。したがって、試薬は、 アミノ基転移抑制剤（便宜上以下ｒＴＳＡＪとする）として少なくとも１種の第 ２の試剤（水よりも極性でない）を含むことが好ましい。ＴＳＡは、好ましくは 、ｌ−約１０個の炭素原子を有し、さらに、官能基を含んでいてもよい、直鎖、 分校、環状、飽和または不飽和アルキルアミン、エタノール：メタノール；イソ プロピルアミン；アセチルニトリル：ジメチルホルムアミド：テトラヒドロフラ ンおよび上記のものの組み合わせからなる群から選択される。定義されるような 例示的なアルキルアミンは、限定するものではないが、ｔ−ブチルアミン、エチ ルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ジメチルアミン、ジエチルア ミン、トリメチルアミンおよび第２ブチルアミンを含む。好ましいＴＳＡは、水 （水の極性指標値（ｐ。

Ｉａｒｉｔｙ　１ｎｄｅｘ　ｖａｌｕｅ）は、約１０である）の約１、　５分の １以下の極性指標値を有する。特定の理論に拘泥するものではないが、ＴＳＡの この特性は、ＴＳＡとヌクレオチドアミンとのまたはアミノ基転移時に関与する アミンを含む試剤との間の有利な相互作用に起因してアミノ基転移が起こるのを 実質的に減じるかあるいは防ぐと考えられる。

アンモニア水は、必要条件ではないが、試薬に加えることができる。試薬中のア ンモニアの存在または不在は、研究者にとって主に任意である。本質的には、ア ンモニア水は、切断と保護除去の反応の点で、試薬に有意的に影響しない；しか しながら、第１の試剤と組み合わさったアンモニア水の存在は、保護除去に必要 な時間を約５０％増加させ得る。したがって、試薬は、アンモニア水を含むこと ができるが、好ましくは、試薬は、アンモニアを含まない。

試薬の成分の好ましい容量対容量比は、次のようである：第１の試剤とＴＳＡの 第２の試剤を含んでなる試薬の実施態様については、好ましい比は、約９：ｌ− 約１：９、より好ましくは約７：３−約３ニア、最も好ましくはｌ；１であり、 第１の試剤とアンモニア水とを含んでなる試薬の実施態様については、好ましい 比は、約９：１−約ｌ：９、より好ましくは約７：３−約３＝７、最も好ましく は約１＝１であり、そして第１の試剤、ＴＳＡの第２の試剤およびアンモニアを 含んでなる試薬の実施態様については、３つの成分の好ましい比は、約９−１　 ：９−１　：９−１から約１−９．：　１−９＝１−９、より好ましくは約７− ３　：　７−３　：　７−３から約、３−７：３　７：３−７、最も好ましくは 約１：１：１である。

反応温度は、研究者の必要性に主に依存する。すなわち、反応温度は、約２５− 約１００℃の範囲であってよい（しかしながら、得られるオリゴヌクレオチドが 実質的に限定された用途となるがオリゴヌクレオチドの完全な状態が有意的に強 い影響を受けない限りより高い温度またはより低い温度も用いられ得る）。当業 者が認識するように、化学反応の温度を増すと、その反応の動力学も典型的に増 す。したがって、速度を考慮するなら（たとえば、オリゴヌクレオチド処理量が 高いことが望ましい商業的状況で）、反応温度は、室温より上、好ましくは約５ ０℃より高く、最も好ましくは約６５００−約８０°Ｃである。このような温度 は、切断時間に実質的な影響を与えないが、このような温度は、保護除去に必要 な時間を実質的に少なくし得る。しかしながら、反応温度は、切断と保護除去と が約９０分未満で達成されるように室温であり得るものと解釈されたい。

開示に従えば、試薬の特に好ましい実施態様は、メチルアミンとｔ−ブチルアミ との１：ｌ容量対容量比である。特に好ましい反応温度は、約６５℃であり、こ の温度で、保護され不溶化したオリゴヌクレオチドの保護除去と切断が、約１０ 分未満で達成され得る。

透 本発明の好ましい実施態様についての次の例は、開示または後の請求の範囲に限 定を加えることを意図するものでな（、また限定を加えるものと解釈されるもの でもない。

■、物質と方法 Ａ、■ ｌ　開裂／脱保護試薬 すべての薬品は、少なくともＡＣ５級とした。水酸化アンモニウムは、Ａｌｄｒ ｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ；　Ｃａｔ、Ｎｏ、　２２． 　１２２−８）から得た。水に含むようにした４０重量％溶液としたメチルアミ ンは、ｔ−ブチルアミン（Ｃａｔ、　Ｎｏ、Ｂ８．　９２０−５）と同様にＡｌ ｄｒｉｃｈ　（Ｃａｔ、　Ｎｏ、　Ｍ２．　７７５−１）から得た。

メチルアミン／ｌ−ブチルアミン試薬は、１．１容量比をｌ捏合して準備し、室 温で５分間振盪し４℃で保存した。水酸化アンモニウムは、供給者の指示に従い 保存した。

２、保護されたデオキシヌクレオシド 次の保護されたデオキシヌクレオシドをＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、 （Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、Ｍｏ、）がら得た。

ｄＡ”（Ｃａｔ、　Ｎｏ、　Ｂ　６１３０）；ｄＣ”（Ｃａｔ、　Ｎｏ、　８　 ５８８２）；ｄｅｌ′′”　（Ｃａｔ、Ｎｏ、　Ｉ　６２６１）およびｄＧ”” 　（Ｃａｔ、　Ｎｏ、　Ｉ　６００７）。

チミジンは、Ｓｉｇｍａ　（Ｃａｔ、Ｎｏ、７　５０１８）から得た。

新規な保護されたデオキシシチジンも、各側で用いた。開示した試薬と関連して 用いた時、ｄｅｌ′′およびｄＣｌｂ”　（いわゆる「慣用の」保護されたデオ キシシチジン）は、副生酸物生成をもたらし得たことが測定された。新規な保護 されたデオキシシチジンは、アセチル（ｒＡｃＪ）保護基を含む。その合成は、 参照のためにここに十分に組み入れた上記の同時係属出願に開示されている。

Ｂ、　・に　口　ｌ−口　コール １、ポリメラーゼ連鎖反応（ｒＰｃＲＪ）開示した開裂／脱保護試薬の影響下に 置いたオリゴヌクレオチドブライマーのＰＣＲ分析は、ＡｍｐｌｉＴａｇ”’　 （Ｐ　ａ　ｒ　ｔ　Ｎ。

、　Ｎ８０１−００５５）を有するＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　Ｇ ｅｎｅＡｍｐＴｌ″　ＤＮＡ適用試薬キットを用いて行った。製造者の指示に従 うようにした。

２、ＤＮＡ配列決定 配列決定反応は、ａ−［”Ｓ］−ｄＡＴＰを用い、米国Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 　５ｅｑｕｅｎａｓｅ＠　Ｖｅｒｓｉｏｎ　１．０のプロトコールに従い、Ｍ１ ３ｍｐ１８−木組ＤＮＡ鋳型（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃａｔ 、Ｎｏ、　４０４−Ｃ）を使用して行った。

Ｃ，ｊＬＷ １、自動化したＤＮＡ合成装置 オリゴヌクレオチドの合成は、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　８７５０”ゝ１ＤＮＡ合成 装置を用いて行った二制御しｔこポアーグラス（ｐ　ｏ　ｒ　ｅｇｌａｓｓ）（ ＣＰＧ）（５００人−１０００人の孔の大きさ）を固体支持物質用に用いた。さ まざまな長さのホモ第１ノゴヌクレオチドおよびヘテロオリゴヌクレオチドを、 製造者の１旨示ｌこ従１４ｚ合成した。

２、毛管電気泳動 オリゴヌクレオチドの毛管電気泳動を、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｓ、　Ｉｎｃ、　Ｐ／ＡＣＥ”２０００高性ｆ４ヒ毛管電気泳動システムで行っ た。３７ｃｍ　ＵｌｏｏＰ　ＵｒｅａＧｅｌ　Ｃｏｌｕｍ　（Ｂｅｃｋｍａｎ、 Ｃａｔ、Ｎｏ、　３３８４８０）を使用した。サンプルは、動電学注入法（ｅｌ ｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ　１ｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ）　（１０ｋＶ 、３秒）によりカラムに充填した１分離１ま、第１Ｊゴヌクレオチドの長さに依 存して、３０−９０分間、１１ｋＶ／ｃｍで（テつた。

トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン（ｒＴＲＩｓＪ）−ポレート７Ｍ尿素（ ランニングｌｌｉ衝液（Ｂｅｃｋｍａｎ、　Ｇｅ　Ｉ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｋｉｔ、 　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　３３８４８１））を用いた。吸光度検出は、オリゴヌクレ オチドの長さに主に依存して、０、　０５　２．　ＯＤ２ｇｏｎｍ　７ｍ　ｌの 範囲であった。

３、高圧液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）ＨＰＬＣ分析は、ダイオード アレー検出モジュール１６８およびオートサンプラー５０７を備えたＢｅｃｋｍ ａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　ＧｏｌｄＴ′　ＨＰＬＣＰｒｏ ｇｒａｍｍａｂｌｅ　５ｏｌｖｅｎｔ　Ｍｏｄｕｌｅにより行った。Ｃ１゜Ｕｌ ｔｒａｓｐｈｅｒｅＴＭ　ＨＰＬＣカラム（Ｂｅｃｋｍａｎ。

Ｃａｔ、Ｎｏ、　２３５３９；　５ｕ粒子、４．６ｍｍｘ２５ｃｍ）を用いた。

瓶Ａは、０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ６，９）を含み、瓶Ｂは、ＨＰＬＣ級 アセドアセトニトリルだ。システムは、次のような勾配モードで操作した（　１ 　ｍ　ｌ　／分の流量）：０−１０分＝８５％瓶ＡＳ１５％瓶８．２０−２５分 ＝７５％瓶Ａ１２５％瓶８．２５−２７分＝５０％瓶Ａ１５０％瓶８．２７−３ ０分＝５０％瓶Ａ１５０％瓶８．３０−５０分、１００％瓶Ａ１０％瓶Ｂ０ Ｉｌ、例■、支持体に結合した保護されたオリゴヌクレオチドの開裂 不均質２１−ｍａｒを、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　８７５０合成装置を用いて合成し た。４つの異なる種類の２１−ｍａ　ｒを分析し、４つのヌクレオシドのそれぞ れを支持体に拘束した（すなわち開裂の部位）、残りの２０のヌクレオシドは同 一であった。したがって、開示した試薬は、４つのヌクレオシドのそれぞれにつ いて開裂時間に関して評価した。

比較の目的で、次の条件で分析を行った。

ａ）メチルアミン／ｌ−ブチルアミン（１：１（容量／容量）） ｂ）メチルアミン；および Ｃ）アンモニア。

支持体に結合したオリゴヌクレオチドは、室温で、オリゴヌクレオチドを含んで なるカラムの両端に位置させたンリンジを介してカラムを通して上記の試薬を前 後に送ることにより試薬１ｍｌにより処理した。得られる混合物のアリコート（ ５０μｍ）を、１，２．５．１０．１５．３０および６０分で除去し、１ｍｌの ２度蒸留したＨ、Ｏと混合し、吸光度を２６０ｎｍで測定した。

固体支持体にすぐ隣接するヌクレオチドとは関係なく、開裂は、上記の試薬（ａ ）および（ｂ）について約５分で達成された。アンモニアについては、開裂は、 すべての条件に対し、約６０分で達成された。図１は、時間に対するオリゴヌク レオチドの開裂の百分率として、上記のことをまとめた動力学プロットを示す。

例Ｉ１．保護されたオリゴヌクレオチドの脱保護保護されたオリゴヌクレオチド の脱保護は、酵素により消化したオリゴヌクレオチドの逆相ＨＰＬＣ分析により 測定した。使用した酵素は次のものであった：（１）５ｍｌの４０ｍＭのＴＲｌ ５と１０ｍＭのＭｇＣ１，により再構成したフォスフオシエステラーゼＩ　（Ｓ ｉｇｍａ、Ｃａｔ、Ｎｏ、Ｐ−６８９Ｆ）　、ｐＨ７，５（０，ＯＩＵを検定ご とに使用）；および（２）Ｅ、　ｃ。

１ｉ　２００Ｕ／１．８ｍｌからのアルカリフーオスファターゼ（Ｓｉｇｍａ、 　Ｃａｔ、Ｎｏ、　Ｐ−４２５２）（０，２Ｕを検定ごとに使用）。２５μｍの フォスフオシエステラーゼおよび２μｌのフォスファターゼを、オリゴヌクレオ チドのｉ−２０Ｄｚｓ。。１に加え、室温で、３０−１２０分間、温室した。０ ．５−１．００Ｄ、６゜。１の消化済み混合物を上記のＨＰＬＣカラムに注入し た。

保護されたデオキシグアノシンの脱保護は、速度限定段階であるため、異なる百 分率のｄＧｌｂ″からなる複数の２１−ｍａｒオリゴヌクレオチドの分析を行っ た。合成は、上記のＤＮＡ合成装置を用いて行い、次の２１−ｍａｒを得た： １）５’　−ＣＴＧ−ＧＡＣ−ＡＧＴ−ＡＧＴ−ＣＡＧ−ＡＣＴ−ＧＣ−（Ｔ） 　−３°　［２５％Ｇコ ２）５’　−ＧＴＧ−ＧＡＣ−ＧＣＴ−ＡＧＧ−ＧＣＧ−ＧＡＧ−（Ｃ−（Ｔ） −３°　［５０％Ｇ］ ３）５’　−Ｇｘ２１−３’　［１００％Ｇ］テストした試薬は、例工に示した のと同じであった。反応時間は、２５−８０°Ｃの範囲であった。結果は表■の ようである。

表Ｉ 保護されたオリゴヌクレオチドの脱保護（時間（分））２５　７５　タ０　９０ 　７Ｅ　７５　工００５５　７　１０　工０　：ＬＯ１０’０１１０　２　］　 １　２　２　２ 表１ （続き） Ｉ！ｉＩ！！されたオリゴヌクレオチドの脱保護（時間（分））２５　６０　６ ０　６０　４３２Ｑ　４３２０　５９４０３７　２０　２０　２０　１２００　 ｕＯＱ　１８００６５　５　５　５　１８０　ＬｊＩＯ２４０日０　２　２　２ 　６０　ｇｏ　９０ 上記のデータは、開示した試薬のさまざまな特徴を示している。

先ず、いわゆる「慣用の」開裂／脱保護試薬であるアンモニアと比較し、開示し た試薬は、有意的に短い時間で開裂と脱保護を行うことが注目される。さらに、 温度が上がると、脱保護時間の減少により明示されるように、反応運動学も上が ることが注目される。このように、開示した試薬は、研究者の必要に依存して、 さまざまな反応温度にわたり利用できる。さらに、開裂と脱保護の点で、開示し た試薬のさまざまな実施態様が、およそ同等程度で働くばかりではなく、さまざ まな実施態様が、慣用の開裂／脱保護試薬よりも有意的に良好に働くことが注目 される。

例ＩＩＩ：ンチジン副生成副生彫物 注目されるように、デオキシシチジンは、例えば、デオキシシチジンを含んでな るオリゴヌクレオチドの保護除去の間に、副生成物形成を通常量も受けやすい。

典型的には、そのような副生酸物生成は、保護除去段階中の、または試薬が保護 除去されたデオキシシチジンと接触したままの保護除去の後のアミノ基転移を介 する。

当業者が認識するように、オリゴヌクレオチドの合成は、最終生成物をできるだ け迅速に回収することを意図して典型的には行われる。しかしながら、可溶化し 、保護されたオリゴヌクレオチドが、長い時間保護試薬中に残ってよいことも時 には可能である。当業者がさらに認識するように、オリゴヌクレオチドが試薬の 中にある時の時間の増加が、アミノ基転移の起こる機会を増加し得て、副生酸物 生成の機会を増す。

いくつかの時間い（つかの温度で、試薬としてメチルアミンとメチルアミン／ｌ −ブチルアミンの両者を用いて、逆相ＨＰＬＣにより、デオキシシチジン副生成 物生成を調べた。「慣用の」デオキシシチジン保護基のｒｂｚＪとｒｉｂｕＪお よび上記のｒＡｃＪ保護基を調べた。そのような試薬を用いて観察された副生成 物（核磁気共鳴により確認）は、Ｎ−メチルシチジンであった。デオキシシチジ ンと比べた、Ｎ−メチルデオキシシチジンの一百分率を、Ａｃ保護基により保護 したデオキシシチジンの溶液に基づ（保護除去を基礎として、下記に示した。

表Ｉ＋ Ｎ−メチルアミン形成の百分率０ 直亙 に１　甚二　＝　五二 （１６時間） 本　平均百分率 本１０．０１％は打器の最低検知限界である。

これらの結果は、典型的なオリゴヌクレオチド合成（すなわち、研究者が、でき るだけ早くでき上がった最終生成物を望む合成）について、メチルアミンを含む 試薬は、実買的に有意的なシチジン副生成物形成をもたらさないことを示してい る。しカルながら、オリゴヌクレオチドが試薬中に残る時間が増すと、シチジン 副生成物形成のできるのを増す。したがって、アミン基転移抑制試薬（Ｔｒａｎ ｓａｍｉｎａｔｉｏｎ　５ｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ）の使用は、 （定義したように）宵月である；データは、メチルアミンに比べ、メチルアミン およびＴＳＡｔ−ブチルアミンを含むる。

有利には、かくて、ＴＳＡは、そのような長くなった反応時間を考慮するかしな いかにかかわらず試薬に含ませることができる。認識されるであろうように、通 常は必要でないであろうが、ＴＳＡの使用は、次の少なくとも２つの理由から好 ましい：第１は、ＴＳＡの存在は、副生酸物生成の可能性を減する；第２は、延 長した時間が望まれる場合、最適開裂／脱保護時間を越える時間試薬内にオリゴ ヌクレオチドを保つ機会を研究者が与えられ−る。

第２の研究をこの線に沿って行った。これらの研究で、ｄ（：ＡＣ。

ｄＣＩｂｕ１ｄＣｂＩＳｄＧＩｂ″、ｄＡｂｆおよびｄＴに”：）いて（７）副 生成物形成（ヌクレオシドについての非副生成物生成の相対的百分率として）を 、試薬としてメチルアミン／ｌ−ブチルアミンを用いてさまざまな時間と温度で 調べた。結果を表１１４に示す。

表ＩＩ＋ 副生成物形成の百分率３ ２５　９０　分　會Ｉ　Ｏ，’！：　１０．０　會脅　★會　＊喰２５　ＬＧ　 ｓＢ、１１　会食　音量喰　音量會　會ｔ　音量　會ｉ３７　３０　分　會脅　 ０．１５　１０．０　音量　重電　重電３７　５Ｉ間　青會　音量喰　中喰音　 音量　音量　音電３７　１６ｔ、ｊＪ　青雲　會音電　重電會　！！　音量　音 量６５　５　分　音量　０．Ｌ５　Ｌｏ、０　音量　音量　會會（ｓＢ　ＬｎＭ 　會脅　會脅會　音量實　重電　重電　會ｔ６５　１６　１ＲＬＩＩ　Ｑ、６　 音量管　會脅會　音量　音量　音量８０　３　分　重管　０．１５　工０．０　 音電　音量　音量８０　１時ｌ５ＩＩ　會青雲　重電會　會脅　會１　音量　會 脅音量會最適温度／反応晴間での百分率のため調べずこれらの結果は、少なくと もい（つかの事がらを示している。第１に、ｄＣ保護基に関して、データは、「 ＡＣ」保護基が、開示の試薬と共に有利に使用され得ることを示している；　「 慣用の」シチジン保護基は、有意的に高い副生成物形成をもたらした。第２に、 開示した試薬は、高められた温度で、所望の反応時間よりも長い時間でのｄＣＡ ″の保護除去を別として、調べた温度または反応時間のずれでも、保護されたで デオキシヌクレオシドのいずれについても統計的に有意的な副生酸物生成をもた らさない。よって、Ａｃ保護基により保護されたデオキシシチジンを含むオリゴ ヌクレオチドについては、そのような高めた温度で、延長した反応時間を用いな いことが好ましい。

例Ｉｖ：精製してないオリゴヌクレオチドの酵素消化分析いくつかのオリゴヌク レオチドの組成の分析を、酵素消化と逆相ＨＰＬＣ法を用いて行った。　これら の研究は、慣用の保護基ｂｚおよびＡｃ保護基で保護したデオキシシチジンを用 いて行った：すべでの他の保護基は、オリゴヌクレオチド間で一貫していた。次 の配列を有する３５−ｍａｒ、５１−ｍｅｒおよびｌｏｔ−ｍｅｒを分析した： ５−ｍａｒ ５°　−ＣＡＧ−ＴＧＣ−ＡＧＣ−ＴＣＣ−ＴＡＧ−ＣＡＧ−ＣＣＴ−ＡＧＣ− ＧＴＡ−ＣＴＡ−ＧＴＣ−ＴＴ−３゜ ５１−ｍａ　ｒ ５°　−ＣＡＧ−ＴＣＣ−ＴＡＧ−ＴＣＡ−ＣＡＧ−ＴＣＣ−ＡＧＴ−ＣＧＣ− ＴＣＡ−ＡＧＣ−ＧＴＣ−ＣＡＧ−ＴＴＧ−ＣＡＣ−ＡＧＧ−ＴＣＡ−ＣＣＴ− ３’１０１−１０ｌ −’　−ＧＣＴ−ＧＣＣ−Ａｃ”ｒ−Ｔｃｃ　ＧＴＣ−ＡＴＣ−ＣＧＡ−ＴＣＣ −ＴＣＧ−ＧＴＣ−ＡｃＧ−ＣＡＡ−ＣＴＧ−ＴＣＡ−ＡＣＧ−ＧＣＡ−ＣＣＴ −ＡＣＴ−ＣＣＴ−ＣＧＴ−ＡＡＣ−ＧＴＡ−ＧＧＡ−ＣＡＧ−ＴＣＣ−ＧＡＴ −ＴＣＧ−ＣＡＣ−ＧＴＧ−ＣＡＡ−ＡＧＣ−ＣＣＡ−ＴＴＣ−ＡＴ−３’ オリゴヌクレオチドは、メチルアミン／ｌ−ブチルアミンを含んでなる試薬の実 施聾様を用いて２５’Ｃで９０分間まｔこ；まアンモニアを用いて３時間６５° Ｃで開裂し、脱保護した。可溶イヒし、脱保護されたオリゴヌクレオチドは、分 析に先立ち精製をしな力）つた。結果を表ＩＶに示す。

表工ｖ 組成分析 １＋淀結果 各種の精製してないオリゴヌクレオチドの理論的組成と測定された組成は、良好 な相関性を与えている。さらに、上記のデータに基づくと、デオキシンチジン保 護基の違いは、結果に統計的に有意的な差を示さない。

例Ｖ、融点測定 融点測定値を、不均質２１−ｍａｒとその補体についてめた。

同一のオリゴヌクレオチド（調査の際、メチルアミン／ｌ−ブチルアミンを含ん でなる開示の試薬またはアンモニアより、開裂し脱保護した）。２１”ｍｅｒお よびその補体は次の配列を有していた：１−ｍａｒ ５’　−ＡＧＣ−ＴＡＣ−ＧＧＴ−ＣＡＴ−ＣＧＴ−ＡＴＧ−ＣＡＴ−３’ 皿鉢 ５’　−ＡＴＧ−ＣＡＴ−ＡＣＧ−ＡＴＧ−ＡＣＣ−、ＧＴＡ−Ｇ、ＣＴ−３゜ メチルアミン／ｌ−ブチルアミンを含・んでなる試・薬の″実施態様に９０分間 ２５℃でまたはアンモニア１こ３・時間６５′℃でオリゴヌクレオチドをその影 響下・に置いた。脱保護と開裂の後、・それぞれのオ」ノボヌクレオチドとその 補体のＯ，，５ｏ、Ｄ、、、。、−（’２．０μ゛１の最小容量中）をｌｏｍＭ のＴＲＩ　Ｓ　（ｐＨ７，５）のｌ　ｍ　ｌに加えた。サンプルを１０−１５分 間沸騰させてから、鉛加熱ブロック上でゆっくりと加熱した。サンプルをキュベ ツトに入れ、キュベツトの温度を３℃ごとに上昇させて２５℃から７０℃まで吸 光度（２６０ｎｍ）を後続させてから、３分間、安定化させ、吸光度を読んだ。

結果を図２に示した：図２では、「、」は、アンモニア処理によるオリゴヌクレ オチドの読みであり、「＊」は、開示した試薬による処理によるオリゴヌクレオ チドの読みである。

図２に示、した結果は、アンモニアと比較した開示した試薬が、２１−ｍａｒの 融点温度に影響を与えなかったことを示している。

温度に対する吸光度の読みは、両方の試薬条件下でほぼ同じパターンをたどった 。

例ｖ１．ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｒＰＡＧＥＪ　）３５−ｍ＝ｅｒ　 （３５％ｄＣ”；３５％ｄＣＡｃ、１００％ｄＣ”。

および１００％ｄＣ”）　、５１−ｍｅｒ　（３５％ｄＣ”、３５％ｄＣ”：１ ００％ｄＣ”、および１００％ｄＣ＾つおよび１０１−ｍｅｌｏｌ−％ｄＣ”、 ３５％ｄＣＡｃ、１００％ｄＣ”、および１００ｄＣＡｃ）の分析をＰＡＧＥに より分析した。ヘテロ３５−ｍｅｒ、ヘテｏ５１−ｍｅｒおよびヘテｏｌｏ１− ｍｅｒは例ＩＶで示したようにし、ホモ３５−ｍａｒ、ホモ５１−ｍａｒおよび ホモ１０１１０ｌ−については、オリゴマーを不溶化したチミジンから合成した 。ｄＣＡＣを含むオリゴヌクレオチドは、９０分間２５℃でメチルアミン／ｌ− ブチルアミンを含む試薬を用いて開裂し、脱保護した。ｄＣ”を含むオリゴヌク レオチドは６５°Ｃで３時間アンモニアを用いて開裂し脱保護した。

１００　ｇｍのあらかじめ混合したアクリルアミド／メチレンビス−アクリルア ミド（２９：１）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｃａｌｓ、　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ；　Ｃａｔ、Ｎｏ、１００−１ ５１）に１０７．３ｍｌの脱イオン水を加えて２２ｃｍ　ｘ　１６．５ｃｍの変 性ゲル（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　ｇｅ　ｌ）を準備して、５０％原液とした。５ ０％原液２０ｍ１に、２２．５ｇの尿素、５　ｍ　ｌの１０ｘトリスボレート／ ＥＤＴＡ　（ｒＴＢＥ」）および十分な脱イオン水を加えて、５０　ｍ　ｌとし た。この溶液を攪拌し加熱して、固体成分を溶解させた。その後、２０ｍｇの過 硫酸アンモニウムと２０μｌのＮ、Ｎ、Ｎ’　、　Ｎ’　−テトラメチルエチレ ンジアミン（ｒＴＥＭＤＪ）を加えた：この溶液を、清浄な皿にあけ、１時間重 合させ、１時間２０ｍＡで１ｘＴＢＨによるプリラン（ｐｒｅ−ｒｕｎ）したゲ ル、０．２　１．０ＯＤｘｓ。＋＋ｓのそれぞれのオリゴヌクレオチドを１０μ ｌの１０ｍの尿素に加えた。２０μｍの添加物をゲルに充填してオリゴヌクレオ チドの長さに従い２−４時間２８ｍＡで電気泳動した。バンドは、ＴＬＣ蛍光板 へのＵＶ増影法によりまたはエチジウムプロミド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ　ｂｒｏｍ ｉｄｅ）染色により視覚化した。

写真による結果を図３に示すニス３では、レーン（ｌｉｎｅ）は次のように定め である： 旦二之　オリゴヌ　レオ　 １　３５−ｍａｒ（３５％ｄＣＡｃ） ２　３５−ｍｅｒ（３５％ｄＣ”） ３　３５−ｍａｒ　（１００％ｄＣＡｅ）４　３５−ｍｅｒ（１００％ｄ　Ｃ” ）５　５１−ｍｅｒ（３５％ｄＣ”） ６　５１−ｍｅｒ（３５％ｄＣ’つ ７　５１−ｍａ　ｒ　（１００％ｄＣＡｃ）８　５１−ｍａｒ　（１００％ｄＣ ｈｔ）９　１０１−ｍａｌｏｌ−％ｄＣＡｃ）ｔｏ　１０１−ｍｅｌｏｌ−％ｄ Ｃ’つ１１　１０１１０ｌ−（１００％ｄＣ”）１２　１０１１０ｌ−（１００ ％ｄＣ”）図３の結果は、Ａｃ保護基および開示した試薬の実施態様の影響下に 置いたオリゴヌクレオチドが、アンモニアおよび慣用のデオキシンチジン保護基 ｂｚの影響下に置いたオリゴヌクレオチドに比べてほぼ同じＰＡＧＥパターンを 与えることを示している。

例ＶＩ１．毛管電気泳動 ３５％ｄＣ”または３５％ｄＣ”を含んでなる不均質５１−ｍｅｒオリゴヌクレ オチドを、６５℃で３時間アンモニアまたは２５℃で９０分間メチルアミン／ｌ −ブチルアミンの影響下に置いてから、毛管電気泳動法で分析した。アンモニア および開示した実施態様の影響下に置いたオリゴヌクレオチドについての電気泳 動図をそれぞれ図４および５に示した。

図４および５の結果は、５１−ｍａ　ｒの検出とサンプル導入からの時間の点で ほぼ同じである。図４については６６．９０２、図５については６６．５７５で ある主ピークの下の全パーセント総和面積（ｐｅｒｃｅｎｔ−ｏｆ−ｔｏｔａｌ 　ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄａ　ｒ　ｅ　ａ）もほぼ同じである。これらの結果は、 試薬とＡｃデオキシンチノン保護基が、アンモニアおよび慣用のデオキシシチジ ン保護基ｂｚに対して比較的に同一の可溶性の脱保護されたオリゴヌクレオチド を与えることをさらに示している。

例Ｖｒ　Ｉ　１．ポリメラーゼ連鎖反応上記の例は、開示された試薬が、オリゴ ヌクレオチドを迅速にかつ効果的に開裂し、脱保護するのに用いられ得ることを 明示する。しかしながら、当業者が認識するように、そのようなオリゴヌクレオ チドをさまざまな方法に用いることができる必要がある。

ポリマメラーゼ連鎖反応でプライマーとして用いたオリゴヌクレオチドをつくり 、９０分間２５℃でメチルアミン／ｌ−ブチルアミンを含む開示した試薬の実施 態様の影響下に置いた（デオキシシチジンは、Ａｃで保護した）。プライマーは 次に示す：８−ｍｅｒ ５°　−ＣＧＣ−ＣＡＧ−ＧＧＴ−ＴＴＴ−ＣＣＣ−ＡＧＴ−３’ ２−ｍａｒ ５’　−ＴＴＣ−ＴＧＧ−ＣＧＴ−ＡＣＣ−ＧＴＴ−ＣＣＴ−ＧＴＣ−Ｔ−３’ 鋳型は、Ｍ１３ｍｐ１８　ＲＦＩ　ＤＮＡ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌ ａｂｓ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　４００−１８）であった。製造者の措示に、Ｇｅ ｎｅＡｍｐ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ｋｉｔを用いて従った。

初期の融解温度は、７分間で９５℃であった：２５サイクルを、次のサイクルプ ロフィールでＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　’ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａ ｌ　Ｃｙｃｌｅｒで行った：温度（”Ｃ）　時間（秒） Ｓｅｑ、＃１　９４　１ Ｓｅｑ、＃２　９４　６０ Ｓｅｑ、＃３　３７　１ Ｓｅｑ、＃４　３７　１２０ Ｓｅｑ、＃５　７２　１ Ｓｅｑ、＃６　７２　１８０ 得られる９５７塩基対ＰＣＲ生成物はＴＲｌ５−アセテート／ＥＤＴＡ　（ｒＴ ＡＥＪ　）に含むようにした１％アガロースゲルで電気泳動にかけ、エチジウム プロミドで染色した。図６に写真による結果を示す１図６では、示したレーンは 次のようである：レーン１　９５７ｐｂ生成物　（デオキシシチジンについてア セチル保護基とメチルアミン／ ｌ−ブチルアミンを用いて誘導 したプライマー）： レーン２　９５７ｐｂ生成物　（デオキシシチジンについてｂ２保護基とアンモ ニアを用いて 誘導したプライマー）； レーン３　ゲルマ−カー　（Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ、２３２２および２０２７ｂ ｐマーカーに より消化したラムダＤＮＡ）； および レーン４　ゲルマ−カー　（Ｈｉｎｆ　Ｌ１６３２および５０６ｂｐマーカーに より消 化したＰＢＲ３２２ＤＮＡ） 図６に示した結果は、デオキシシチジン保護基Ａｃおよび開示した試薬の実施態 様を用いて誘導したプライマーが、アンモニア開裂と脱保護により得られ、デオ キシシチジンについてのｂｚ保護基を用いたプライマーから誘導されたものと実 買的に同じ増幅した（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）生成物を生じることをもたらすこと を示しているデオキシシチジン保護基Ａｃおよびｂｚを用いて２組の１８−ｍｅ ｒを合成し、メチルアミン／ｌ−ブチルアミンを含んでなる開示した試薬の実施 態様の影響下に９０分間２５℃で置いた、またアンモニアの影響下に３時間６５ ℃で置いた。１８−ｍａｒは、次の配列を有していた： ８−ｍｅｒ ５’　−ＣＧＣ−ＣＡＧ−ＧＧＴ−ＴＴＴ−ＣＣＣ−ＡＧＴ−３′ 可溶化し脱保護したオリゴマーを、Ｓｅｐ　Ｐａｋ　（Ｗａｔｅｒｓ、　Ｐａｒ ｔ　Ｎｏ、　５１９０）ＤＮＡ精製キットを用いて精製した。これらの精製した オリゴマーを、配列決定を目的としたプライマーとして用いた。鋳型は、Ｍ１３ ｍｐ１８−末鎖ＤＮＡ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｃａｔ 、　Ｎｏ。

４０４−Ｃ）；配列決定は、ＵＢＳ　５ｅｑｕｅｎａｓｅ物質およびプロトコー ルと共に１８−ｍａｒを用いて達成した。結果を図７に示す。

図７の結果が示すように、配列ノくンドｌくターン（ま、アンモニアおよびｂｚ を介して誘導されたプライマーに対してＡｃ保護基および開示した試薬の影響下 に置いたプライマーを用Ｌ）て実質的（二同じである。

例ｘ、３′　ターミナルトランスフェラーゼ延長デオキシンチジン保護基Ａｃお よびｂｚを用Ｌ）で２２−ｍａｒを合成し、メチルアミン／ｌ−ブチルアミンを 含んでなる開示した試薬ニー）Ｌ’では９０分間２５℃で、アンモニア１こつｌ 、％て（ま、３時間６５℃で、それぞれその影響下に置いた。２２−ｍｅｒｉｔ 次の配ダ１１を有していた； ２−ｍｅｒ ５°−ＴＴＣ−ＴＧＧ−ＣＧＴ−ＡＣＣ−ＧＴＴ−ＣＣＴ−ＧＴＣ−Ｔ−３’ 可溶化し脱保護したオリゴマーを、Ｓｅｐ　Ｐａｋ　ＤＮＡ精製キットを用いて 精製した。これらの精製したオＩＪゴマ−を、３゛　ターミナルトランスフェラ ーゼ延長を調べるためのプライマーとして用いた。

それぞれのオリゴヌクレオチド２．５０Ｄ２６０．＠。。７を、１５０μｌの脱 イオン水に加えた；　５ｍｇのチミジントリフオスフェート（ｒＴＴＰＪ）Ｓｉ ｇｍａ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　Ｔａ２０５）：５μｌのターミナルデオキシヌク レオチジルトランスフエラーゼ、１５Ｕ／μｌ　（ＢＲＬ、Ｃａｔ、Ｎｏ、　８ ００８５Ｂ）および５０μｌのトレーリング緩衝液（ｔｒａｉｌｉｎｇ　ｂｕｆ 　ｆ　ｅ　ｒ）。この添加物を３７℃で夜通し温室し、得られる物質を、次に示 すようにＳｅｐ　Ｐａｋ　Ｃ１ｍカートリッジを用いて精製した：反応混合物を 、０．５ｍの酢酸アンモニウムで１：２に希釈し、カートリッジに入れ、脱イオ ン水でカートリッジを洗浄し、生成物を脱イオン水に含むようにした６０％メタ ノールで溶離した。生成物は、毛管電気泳動により分析した；電気泳動図の結果 を図８と９に示す。

図８と９の電気泳動図は、Ａｃにより保護し、試薬の影響下に置いたシチジンを 含むプライマー（図８）とｂｚで保護、しアンモニアの影響下に置いたシチジン を含むプライマー（図９）が、両方とも、その３°末端で延長されたことを明示 し、また１、得られる生成物が実質的に同一であることを明示する。

上記のデータは、開示した開裂／脱保護試薬が、固体支持体からオリゴヌクレオ チドを迅速にかつ効率的に除去し、それから保護基を除去することを明示する。

加えて、そのような試薬の影響下に置いた可溶化し、脱保護したオリゴヌクレオ チドは、特に、生物学的に有用である。さらに、ＴＳＡを含む開示した試薬は、 副生酸物生成を実質的に減少させる。

オリゴヌクレオチドを試薬の影響下に置く時間と温度を変えることにより、開示 した試薬は、オリゴヌクレオチドの合成に対しさまざまな状況で利用できる。た とえば、自動化された合成装置の処理量の増加；不溶化し、保護されたオリゴヌ クレオチドの開裂と脱保護；不溶化し、保護されたオリゴヌクレオチドの開裂と 脱保護（すなわち、保護されたオリゴヌクレオチドを溶液として保つことが望ま しい時）：可溶性のオリゴヌクレオチドの脱保護（すなわち、研究者が、保存し た、可溶性の保護されたオリゴヌクレオチドを有する場合；および不溶性のオリ ゴヌクレオチドの脱保護（すなわち研究者が保存した保護された不溶性のオリゴ ヌクレオチドを有する場合）。

以上かなり詳細に説明したが、詳細な説明で記載した実施態様と例とは開示また は以下の請求の範囲を限定するものと解釈するものでないと理解されるべきであ る。本発明は、自動化されたＤＮＡ合成装置に限定されない。本発明は、デオキ シリポ核酸オリゴヌクレオチドに限定されるものではなく、リポ核酸オリゴヌク レオチドおよび他の修飾したオリゴヌクレオチド例えばオリゴヌクレオチドメチ ルフォスホネートおよびフォスホロチオエートについて利用することもできる。

本発明は、ヌクレオシドのいづれかの特定の保護基に限定されるものではなく、 さまざまな保護基について利用できる。当業者の認識範囲の修正および変更は、 次の請求の範囲に入るものとされる。

時間（分） ２５２Ｂ　３１　３４３７４０４３４５４９５２５５５８６１　６４６７７０温 度　（°Ｃ） ９１０１１夏２ 国際調査報告 暫−一ム−＝　ＰＣＴ／ＵＳ　９３１０３３８６

Claims (43)

【特許請求の範囲】
1. １．支持体に結合したオリゴヌクレオチドを開裂するためおよび／または保護さ れたオリゴヌクレオチドから少なくとも１つの保護基を除去するための試薬にお いて、該試薬が、１−約１０個の炭素原子を有する少なくとも１つの直鎖アルキ ルアミンを含んでなる試薬。
2. ２．該直鎖アルキルアミンが、１−約６個の炭素原子を有する請求項１の試薬。
3. ３．該直鎖アルキルアミンが、１−約３個の炭素原子を有する請求項１の試薬。
4. ４．該直鎖アルキルアミンが、メチルアミンである請求項１の試薬。
5. ５．該試薬が、１−約１０個の炭素原子を有する直鎖、分枝、環状の飽和または 不飽和アルキルアミン；１−約１０個の炭素原子を有しかつ少なくとも１つの官 能基を含む直鎖、分枝、環状の飽和または不飽和アルキルアミン；エタノール； メタノール；イソプロピルアミン：アセチルニトリル；ジメチルホルムアミド； テトラヒドロフラン；および上記のものの組み合わせからなる群から選択された 少なくとも１つのアミノ基転移抑制剤をさらに含む請求項１の試薬。
6. ６．該アミノ基転移抑制剤が、ｔ−ブチルアミン、エチルアミン、プロピルアミ ン、イソプロピルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミン および第２ブチルアミンからなる群がら選択されるアルキルアミンである請求項 ５の試薬。
7. ７．ｔ−ブチルアミンをさらに含む請求項１の試薬。
8. ８．直鎖アルキルアミンのアミノ基転移抑制剤に対する容量対容量比が、約９： １−約１：９である請求項５の試薬。
9. ９．該直鎖アルキルアミン対ｔ−ブチルアミンの比が、約３：１−約１：３であ る請求項７の試薬。
10. １０．アンモニア水をさらに含む請求項１の試薬。
11. １１．アンモニア水をさらに含む請求項５の試薬。
12. １２．支持体に結合したオリゴヌクレオチドを開裂するためおよび／またはプロ トコールオリゴヌクレオチドから少なくとも１つの保護基を除去するための試薬 において、該試薬が、ａ）１−約１０個の炭素原子を有する少なくとも１つの直 鎖アルキルアミン；および ｂ）少なくとも１つのアミノ基転移抑制剤を含んでなる試薬。
13. １３．該アミノ基転移抑制剤が、１−約１０個の炭素原子を有する直鎖、分枝、 環状の飽和または不飽和アルキルアミン：１−約１０個の炭素原子を有しかつ少 なくとも１つの官能基を含む直鎖、分枝、環状の飽和または不飽和アルキルアミ ン；エタノール：メタノール；イソプロピルアミン；アセチルニトリル；ジメチ ルホルムアミド：テトラヒドロフラン；および上記のものの組み合わせからなる 群から選択される請求項１２の試薬。
14. １４．該アミノ基転移抑制剤が、ｔ−ブチルアミン、エチルアミン、プロピルア ミン、イソプロピルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミ ンおよび第２ブチルアミンからなる群から選択されるアルキルアミンである請求 項１３の試薬。
15. １５．該直鎖アルキルアミンが、１−約６個の炭素原子を有する請求項１２の試 薬。
16. １６．該直鎖アルキルアミンが、１−約３個の炭素原子を有する請求項１２の試 薬。
17. １７．該直鎖アルキルアミンが、メチルアミンである請求項１２の試薬。
18. １８．該アミノ基転移抑制剤が、ｔ−ブチルアミンである請求項１２の試薬。
19. １９．直鎖アルキルアミンのアミノ基転移抑制剤に対する容量対容量比が、約９ ：１−約１：９である請求項１２の試薬。
20. ２０．該直鎖アルキルアミンのアミノ基転移抑制剤に対する容量対容量比が、約 １：１である請求項１２の試薬。
21. ２１．アンモニア水をさらに含む請求項１２の試薬。
22. ２２．支持体に結合したオリゴヌクレオチドを開裂するためおよび／または保護 されたオリゴヌクレオチドから少なくとも１つの保護基を除去するための試薬に おいて、該試薬が、ａ）１−約１０個の炭素原子を有する少なくとも１つの直鎖 アルキルアミン； ｂ）１−　約１０個の炭素原子を有する直鎖、分枝、環状の飽和または不飽和ア ルキルアミン；１−約１０個の炭素原子を有しかつ少なくとも１つの官能基を含 む直鎖、分枝、環状の飽和または不飽和アルキルアミン；エタノール；メタノー ル：イソプロピルアミン；アセチルニトリル；ジメチルホルムアミド；テトラヒ ドロフラン；および上記のものの組み合わせからなる群から選択される少なくと も１つのアミノ基転移抑制剤：および ｃ）アンモニア水 を含んでなる試薬。
23. ２３．支持体に結合したオリゴヌクレオチドを開裂するためおよび／または保護 されたオリゴヌクレオチドから少なくとも１つの保護基を除去するための方法に おいて、該方法が、ａ）ｉ）少なくとも１つの不溶性の保護されたオリゴヌクレ オチド、 ｉｉ）少なくとも１つの可溶性の保護されたオリゴヌクレオチド：および ｉｉｉ）少なくとも１つの不溶性のオリゴヌクレオチド からなる群から選択されたオリゴヌクレオチドを、１−約１０個の炭素原子を有 する少なくとも１つの直鎖アルキルアミンを含んでなる試薬に導入して混合物を 形成させ：そして ｂ）該混合物を十分な時間十分な温度で温置して少なくとも１つの生物学的に有 用なオリゴヌクレオチドを得る、工程を含んでなる方法。
24. ２４．該直鎖アルキルアミンが、１−約６個の炭素原子を含む請求項２３の方法 。
25. ２５．該直鎖アルキルアミンが、１−約３個の炭素原子を含む請求項２３の方法 。
26. ２６．該直鎖アルキルアミンが、メチルアミンである請求項２３の方法。
27. ２７．該試薬が、１−約１０個の炭素原子を有する直鎖、分枝、環状の飽和また は不飽和アルキルアミン：１−約１０個の炭素原子を有しかつ少なくとも１つの 官能基を含む直鎖、分枝、環状の飽和または不飽和アルキルアミン；エタノール ；メタノール：イソプロピルアミン；アセチルニトリル；ジメチルホルムアミド ；テトラヒドロフラン；および上記のものの組み合わせからなる群から選択され る少なくとも１つのアミノ基転移抑制剤をさらに含む請求項２３の方法。
28. ２８．該アミノ基転移抑制剤が、ｔ−ブチルアミン、エチルアミン、プロピルア ミン、イソプロピルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミ ンおよび第２ブチルアミンからなる群がら選択されるアルキルアミンである請求 項２７の方法。
29. ２９．該試薬が、ｔ−ブチルアミンをさらに含む請求項２３の方法。
30. ３０．該試薬が、アンモニア水をさらに含む請求項２３の方法。
31. ３１．該試薬が、アンモニア水をさらに含む請求項２９の方法。
32. ３２．該温置時間が、約１００分未満である請求項２３の方法。
33. ３３．該温置温度が、約１００℃未満である請求項２３の方法。
34. ３４．支持体に結合したオリゴヌクレオチドを開裂するためおよび／または保護 されたオリゴヌクレオチドから少なくとも１つの保護基を除去するための方法に おいて、該方法が、ａ）ｉ）少なくとも１つの不溶性の保護されたオリゴヌクレ オチド、 ｉｉ）少なくとも１つの可溶性の保護されたオリゴヌクレオチド；および ｉｉｉ）少なくとも１つの不溶性のオリゴヌクレオチド からなる群から選択されたオリゴヌクレオチドを、試薬に導入して混合物を形成 させ、該試薬が ｉ）１−約１０個の炭素原子を有する少なくとも１つの直鎖アルキルアミン、お よび ｉｉ）少なくとも１つのアミノ基転移抑制剤を含んでなり、そして ｂ）該混合物を十分な時間十分な温度で温置して少なくとも１つの可溶性のオリ ゴヌクレオチドを得る、工程を含んでなる方法。
35. ３５．該アミノ基転移抑制剤が、１−約１０個の炭素原子を有する直鎖、分枝、 環状の飽和または不飽和アルキルアミン；１−約１０個の炭素原子を有しかつ少 なくとも１つの官能基を含む直鎖の分枝、環状の飽和または不飽和アルキルアミ ン：エタノール；メタノール：イソプロピルアミン；アセチルニトリル；ジメチ ルホルムアミド：テトラヒド口フラン；および上記のものの組み合わせからなる 群から選択される請求項３４の方法。
36. ３６．該アミノ基転移抑制剤が、ｔ−ブチルアミン、エチルアミン、プロピルア ミン、イソプロピルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミ ンおよび第２ブチルアミンからなる群がら選択されるアルキルアミンである請求 項３５の方法。
37. ３７．該試薬が、ｔ−ブチルアミンをさらに含む請求項３４の方法。
38. ３８．該直鎖アルキルアミンが、１−約６個の炭素原子を含む請求項３４の方法 。
39. ３９．該直鎖アルキルアミンが、１−約３個の炭素原子を含む請求項３４の方法 。
40. ４０．該直鎖アルキルアミンが、メチルアミンである請求項３４の方法。
41. ４１．該試薬が、アンモニア水をさらに含む請求項３４の方法。
42. ４２．該温置時間が、約１００分未満である請求項３４の方法。
43. ４３．該温置温度が、約１００℃未満である請求項３４の方法。