CN115850350A - 一种氨解液及氨解方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种氨解液及氨解方法。所述氨解液含有叔丁胺，所述氨解液还含有甲醇和/或乙腈。本发明设计全新氨解液配方，各组分能够有效协同，可高效进行氨解，实现在不破坏酰胺键的情况下，高效地将核酸分子从固相载体上分离并去除保护基团，且氨解液配方简单、成本低、易于操作。
Description
技术领域
本发明属于核酸合成技术领域，涉及一种氨解液及氨解方法。
背景技术
短链DNA又称为寡核苷酸(Oligo)，通常采用固相合成技术进行人工合成。固相合成以控制孔径玻璃球(CPG)为固相载体，以亚磷酰胺为单体，按照3’-5’方向，经过脱保护、缩合、氧化和盖帽四个反应的循环，将目标序列逐渐连接在固相载体上。由于A、C、G碱基含有活性氨基，会干扰缩合反应，所以一般预先采用保护基团将氨基保护，当反应结束后，再将保护基团基团切除。而将Oligo从CPG上剪切下来和脱除保护基团的反应称为氨解反应。
常用的氨解反应主要包括氨水氨解和氨气氨解等，氨水氨解的缺点主要包括反应时间长、容易造成交叉污染以及后处理步骤繁琐；氨气氨解反应快速高效、操作简单，但是存在对设备要求高、需要使用有毒气体、存在安全隐患、污染环境、对引物的结构破坏性较大的缺点。因此，开发新的氨解方法逐渐引起人们的重视。
如CN111704644A公开一种氨解液及氨解方法，所述氨解液包括胺、丁醇、氨基醇和碱性水溶液，所述氨解方法包括：(1)向装有固相载体的固相合成柱中加入氨解液；(2)将所述固相合成柱置于装有氨解缓冲液的密封容器内，并保持所述固相合成柱不接触氨解缓冲液；(3)加热所述密封容器，使固相载体处于氨解缓冲液的蒸汽气氛中，随后冷却；(4)从所述密封容器中取出固相合成柱，用洗脱液处理固相合成柱中的固相载体，并收集流出液。但其氨解液配方较复杂，一定程度影响广泛应用。
综上所述，开发新的氨解液及氨解方法，操作简单、成本低，为现有氨解技术提供补充和借鉴，对于核酸合成领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种氨解液及氨解方法，氨解液配方简单、易于操作且成本低，可广泛应用于寡核苷酸合成。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种氨解液，所述氨解液含有叔丁胺，所述氨解液还含有甲醇和/或乙腈。
本发明中，设计全新氨解液配方，发现将叔丁胺作为主要成分，与甲醇和/或乙腈配合使用，能够有效协同，可高效进行氨解，实现在不破坏酰胺键的情况下，高效地将核酸分子从固相载体上分离并去除保护基团，且氨解液配方简单、成本低、易于操作。
优选地，所述氨解液中叔丁胺与甲醇和/或乙腈的体积比为1:(1～5)，包括但不限于1:1、1:2、1:3、1:4或1:5。
可以理解，所述体积比指叔丁胺与甲醇，或叔丁胺与乙腈，或叔丁胺与甲醇-乙腈混合物的体积比。
优选地，所述氨解液还含有水。
优选地，所述氨解液中叔丁胺，甲醇和/或乙腈，水的体积比为1:(1～5):(1～10)，包括但不限于1:2:10、1:2:5、1:3:7、1:4:2、1:5:3、1:1:10、1:5:9、1:2:6、1:4:8、1:1:9或1:5:1。
本发明中，所述氨解液的制备方法包括：将叔丁胺与甲醇和/或乙腈按比例混合。
第二方面，本发明提供第一方面所述的氨解液在制备用于合成核酸的产品中的应用。
第三方面，本发明提供一种用于合成核酸的产品，所述用于合成核酸的产品包括第一方面所述的氨解液。
优选地，所述用于合成核酸的产品还包括固相载体和/或亚磷酰胺单体。
第五方面，本发明提供第一方面所述的氨解液在核酸合成中的应用。
第六方面，本发明提供一种氨解方法，所述氨解方法包括：
将固相合成法中连接有寡核苷酸的固相载体与第一方面所述的氨解液混合，进行氨解反应。
本发明设计一种简单便捷的氨解方法，可快速有效完成氨解，且成本低。
本发明中，所述氨解方法具体包括以下步骤：
(1)按比例将叔丁胺、甲醇/乙腈、ddH2O混合配制氨解液；
(2)将带有酰胺键的样品与氨解液混合进行氨解；
(3)取氨解后的样品，做LC-MS，进行分子量检测；
(4)检测判断，目标峰是否合格，主峰是否有明显的±峰，检测值与理论值偏差≤0.1％，同时没有明显的±峰，判定合格。
优选地，所述氨解反应的温度不高于65℃。
优选地，所述氨解反应的温度为50～65℃，包括但不限于51℃、52℃、53℃、55℃、56℃、57℃、58℃、60℃、62℃、63℃或64℃。
本发明中，控制氨解反应的温度，在有效保护核酸分子中酰胺键的情况下，实现高效氨解反应，快速将核酸分子从固相载体上分离并去除核酸分子上保护基团。
第七方面，本发明提供一种核酸合成方法，所述核酸合成方法包括：
采用固相合成法从3’端到5’端合成寡核苷酸，得到连接有寡核苷酸的固相载体，将连接有寡核苷酸的固相载体与第一方面所述的氨解液混合，进行氨解反应，得到核酸分子。
优选地，所述氨解反应的温度不高于65℃，更优选50～65℃。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明设计全新氨解液配方，发现将叔丁胺作为主要成分，与甲醇和/或乙腈配合使用，能够有效协同，可高效进行氨解，实现在不破坏酰胺键的情况下，高效地将核酸分子从固相载体上分离并去除保护基团，且氨解液配方简单、成本低、易于操作。
附图说明
图1为实施例1中氨解反应MS检测图；
图2A为实施例2中氨解反应MS检测图；
图2B为实施例2中氨解反应MS检测图；
图2C为实施例2中氨解反应MS检测图；
图3为实施例3中氨解反应MS检测图；
图4为实施例4中氨解反应MS检测图；
图5为实施例5中25℃氨解反应MS检测图；
图6为实施例5中30℃氨解反应MS检测图；
图7为实施例5中37℃氨解反应MS检测图；
图8为实施例5中60℃氨解反应MS检测图；
图9为实施例5中63℃氨解反应MS检测图；
图10为实施例5中65℃氨解反应MS检测图；
图11为实施例5中70℃氨解反应MS检测图；
图12为对比例1氨解反应MS检测图；
图13为对比例3中氨解反应MS检测图；
图14为实施例1中对照品未氨解反应MS检测图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种氨解方法。
采用测试分子5’-CY5-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2-3’，其中5’端为CY5与氨基缩合，通过酰胺键连接，采用固相合成方法合成所述测试分子，对所述测试分子进行氨解，与1000μL氨解液(叔丁胺-甲醇-ddH2O混合液(体积比为1:1:1))混合，在50℃进行氨解，对产物进行MS检测，以不进行氨解反应的测试分子为对照，结果如表1所示，表明本发明设计独特的氨解液能够有效进行氨解，且能够保护5’端氨基形成的酰胺键。
实施例2
本实施例提供一种氨解方法。
与实施例1区别仅在于使用的氨解液分别为叔丁胺-乙腈-ddH2O混合液(体积比为1:1:1)、叔丁胺-乙腈-ddH2O混合液(体积比为1:1:5)和叔丁胺-乙腈-ddH2O混合液(体积比为1:1:10)，在65℃进行氨解，其余与实施例1相同。
实施例3
本实施例提供一种氨解方法，与实施例1区别仅在于使用的氨解液为叔丁胺-甲醇-ddH2O混合液(体积比为1:2:1)，其余与实施例1相同，结果如表1所示，表明本发明设计独特的氨解液能够有效进行氨解，且能够保护5’端氨基形成的酰胺键。
实施例4
本实施例提供一种氨解方法，与实施例1区别仅在于使用的氨解液为叔丁胺-甲醇-ddH2O混合液(体积比为1:5:10)，其余与实施例1相同，结果如表1所示，表明本发明设计独特的氨解液能够有效进行氨解，且能够保护5’端氨基形成的酰胺键。
实施例5
本实施例提供一种氨解方法，与实施例1区别仅在于分别在25℃、30℃、37℃、60℃、63℃、65℃和70℃进行氨解，其余与实施例1相同，结果如表1所示，表明本发明设计独特的氨解液能够有效进行氨解，且能够保护5’端氨基形成的酰胺键，结果如表1所示，表明本发明通过控制氨解温度，在有效保护酰胺键不被破坏的情况下，显著提高氨解效率。
对比例1
本对比例提供一种氨解方法，与实施例1区别仅在于将氨解液中甲醇按比例添加到叔丁胺和水上，其余与实施例1相同，结果如表1所示，检测结果不合格。
对比例2
本对比例提供一种氨解方法，与实施例1区别仅在于将氨解液中叔丁胺分别等量替换为正丁胺、异丁胺和仲丁胺进行氨解，结果酰胺键被破坏。
对比例3
本对比例提供一种氨解方法，与实施例1区别仅在于将氨解液中甲醇等量替换为乙醇进行氨解，结果如表1所示，检测结果不合格。
表1
综上所述，本发明设计全新氨解液配方，发现将叔丁胺作为主要成分，与甲醇和/或乙腈配合使用，能够有效协同，可高效进行氨解，实现在不破坏酰胺键的情况下，高效地将核酸分子从固相载体上分离并去除保护基团，且氨解液配方简单、成本低、易于操作；本发明设计一种简单便捷的氨解方法，可快速有效完成氨解，且成本低。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种氨解液，其特征在于，所述氨解液含有叔丁胺；
所述氨解液还含有甲醇和/或乙腈。
2.根据权利要求1所述的氨解液，其特征在于，所述氨解液中叔丁胺与甲醇和/或乙腈的体积比为1:(1～5)。
3.根据权利要求1或2所述的氨解液，其特征在于，所述氨解液还含有水；
优选地，所述氨解液中叔丁胺、甲醇和/或乙腈、水的体积比为1:(1～5):(1～10)。
4.权利要求1-3任一项所述的氨解液在制备用于合成核酸的产品中的应用。
5.一种用于合成核酸的产品，其特征在于，所述用于合成核酸的产品包括权利要求1-3任一项所述的氨解液。
6.根据权利要求5所述的用于合成核酸的产品，其特征在于，所述用于合成核酸的产品还包括固相载体和/或亚磷酰胺单体。
7.权利要求1-3任一项所述的氨解液在核酸合成中的应用。
8.一种氨解方法，其特征在于，所述氨解方法包括：
将固相合成法中连接有寡核苷酸的固相载体与权利要求1-3任一项所述的氨解液混合，进行氨解反应。
9.根据权利要求8所述的氨解方法，其特征在于，所述氨解反应的温度不高于65℃；
优选地，所述氨解反应的温度为50～65℃。
10.一种核酸合成方法，其特征在于，所述核酸合成方法包括：
采用固相合成法从3’端到5’端合成寡核苷酸，得到连接有寡核苷酸的固相载体；
将连接有寡核苷酸的固相载体与权利要求1-3任一项所述的氨解液混合，进行氨解反应，得到核酸分子；
优选地，所述氨解反应的温度不高于65℃，更优选50～65℃。
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