JPH05502940A - 分離物質と核酸のクロマトグラフ分離プロセスにおけるその用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 分離物質と核酸のクロマトグラフ分離プロセスにおけるその用法 ［技術分野］ 本発明は、キャリヤー物質の分離に関し、さらに、核酸のクロマトグラフ分離プ ロセスにおける上記キャリヤー物質の用法に関する。

［背景技術］ 核酸を迅速かつ系統的に分離し、隔離することは、多くの生化学分野、とくに遺 伝子科学技術分野において必要不可欠である。しばしば、１００種以上の混合物 からただ１種の核酸種のみを分離する必要が生じている。

しかしながら、従来のクロマトグラフ分離プロセスは、個々の分子種への分離度 と分離速度に関する要求に応えることができない。

ＵＳＡ４．０２９．５８３は、プロティン、ベブタイド、および核酸の分離に適 したシリカゲルから出来たクロマトグラフキャリヤーを記述している。このキャ リヤーの空洞は５０ｎｍ以下の直径を有し、アニオンあるいはカチオン変換体を 形成しうる基を有する固定相は、シラン化反応試薬を用いてキャリヤーの空洞に 化学結合される。上記基は分離されるべき物質と互いに反応する。シラン化反応 処理されたシリカゲルは水と接触するので、上記固定相か重合してキャリヤーの 細孔を塞ぐ懸念がある。

ＥＰ−Ｂ−０１０４２１０に記述された核酸の混合物は、高分離度と高い処理速 度をもって構成要素に分離しうるが、但し、クロマトグラフに用いられるキャリ ヤー物質の空洞の直径が、分離されるべき核酸の最大径の１から２０倍あるいは 混合物内に含まれる核酸の最大径と同じである場合に限る。このクロマトグラフ キャリヤーは、このキャリヤーを、屈曲性チェーン基を有するシラン化反応試薬 と反応させることによって製造される。なお、上記屈曲性チェーン基は、アニオ ンあるいはカチオン交換体を形成しうる試薬と反応させることによって最終キャ リヤーに転換される。

［発明の開示］ 上述の従来技術に鑑み、本発明の目的は、生物学上のマクロ分子、たとえば長鎖 オリゴヌクレオチド、高分子核酸、ｓ　ＲＮＡ、５　Ｓ　ｒ　ＲＮＡ、　１６Ｓ ／２３Ｓ　ｒ　ＲＮＡ。

１本鎖のＤＮＡ　（たとえば、Ｍ１３）　、２本鎖のＤＮＡ（たとえば、ゲノム ＤＮＡの片とプラスミド）をクロマトグラフで分析する方法を提供するにある。

これに関連して採用されるキャリヤーは、広い温度範囲に適用できて、高い負荷 容量を示すものでなくてはならない。さらに必要な条件は、耐圧性についてのも のであって、極めて安定したキャリヤー物質がめられている。さらに、キャリヤ ー物質は、高性能液体クロノマドグラフィ　（ＨＰＬＣ）あるいは超遠心分離法 に用いられるような高価てコストのかかる装置を採用しなくとも、核酸基を急速 分離できるものでなくてはならない。

驚くべきことに、上記目的は、分離されるべき核酸の最大寸法の１から２０倍の 大きさの空洞をもつクロマトグラフキャリヤーを提供することによって達成され た。この場合の核酸は、一般式ＲＲＲＳ　ｒ　Ｒ４をもつンラン化反応試薬を、 １０から１０００ｎＩ１１の空洞をもつキャリヤー物質と反応させることによっ て得られる。上記一般式におけるＲ１は、１から１０のＣ原子をもつアルコキシ 残基あるいは１から６のＣ原子をもつハロゲン原子あるいはジアルキルアミノ基 を示し、ＲとＲ３は、１から１０のＣ原子をもつ炭化水素残基あるいは１から１ ０の原子をもつアルコキシ残基あるいは４から２０のＣ原子をもつ／＼ロゲン原 子かアルキル残基を示す。ＲとＲ３は少なくとも１つのオキサ基あるいはアミノ 基によって妨害されるので、残基はハロゲン、シアノ、ニトロ、アミノ、モノア ルキルアミノ、ヒドロキシ、あるいはアリルによってモノあるいは多置換されう る。Ｒ４は、１から２０のＣ原子をもつ炭化水素鎖あるいは少なくともオキサ基 かアミノ基で妨害されるアルキル残基を示すが、上記妨害により、残基は、下の 式で示すように／ＸＸロジンシアノ、ニトロ、アミノ、単アルキルアミノ、複ア ルキルアミノ、アルコキシ、ヒドロキシ、アリルおよび／またはエポキシてモノ あるいは多置換されうる。

この結果、分離される物質との反応に影響を与えそして好ましくはエポキシ基を もつ屈曲性鎖基は、ヒドロキシアルキルアミンと続けて反応させることにより変 えられる。

本発明によると、シラン化反応試薬もまた、１級あるいは２級ヒドロキシアルキ ルアミンとすてに反応している反応基をもってもよい。

アミノエタノール、ジェタノールアミン、Ｎ−メチ−ルアミノエタノール、１． ３−アミノプロパツール、１．４−アミノブタノールなどのようなヒドロキシア ルキルアミンを選ぶことにより、イオン交換基のアルカリ度が変えられるので、 分離に伴う問題を最少にすることができる。

適当なキャリヤーは、シリカゲル、酸化アルミ、二酸化チタン、多孔ガラス、あ るいはレジンである。溶離剤の流れに対する抵抗を最少にするという要件につい て考えると、採用されるキャリヤーの粒子のサイズは、５０から５００μ曙、で きれば５０から２００μｍの範囲がよい。

従来技術においてアニオン交換基としてしばしば用いられるジエチルアミノエチ ール（ＤＥＡＥ）基は、１００から２００μ■の直径をもつマクロ細孔シリカゲ ル粒子に用いられる場合、単一の核酸クラス、つまり転移ＲＮＡ。

メツセンジャーＲＮＡおよび１本鎖のあるいは２本鎖のＤＮＡの溶離剤の範囲は 比較的狭くなってしまう。しかし、下記例で示すように、０．４モル／１　（０ ，２５Ｍから０．６５Ｍ　Ｋｃｌ　）の範囲では核酸溶離剤の段階的クラスは小 さすぎる。

キャリヤーにヒドロキシアルキルアミンを化学結合することによる化学変性は、 １段階あるいは２段階反応によって達成されつる。

１段階反応の場合、無機キャリヤーは、ヒドロキシアルキルアミン基をすでに含 んでいるアルコキシシランと反応する。

２段階反応の場合、上記キャリヤーは、反応基（たとえば、エポキシ基、ハロゲ ン原子、など）を含むアルコキンかクロロシランとまず反応し、所望のアルカリ 度によって選ばれたヒドロキシアルキルアミンは次工程の反応に導入される。

アルコキシンランによるンラン処理は、おだやかな反応条件にしたがって触媒、 つまりアミンあるいはオルガノ金属化合物で行うと都合がよい。

ｑ機キャリヤーは、たとえばエポキシ基の反応基を含まねばならない。この反応 基には、続く反応段階においてヒドロキシアルキルアミンか化学結合する。

本発明によるキャリヤー物質により、高価な装置を使用しなくとも、段階グラジ ェントを用いて錯塩混合物から核酸のような単一クラスの生物学的マクロ分子を 溶離てきる可能性かえられる。

たとえば、アミノエタノールで変性された、粒子径が１００から２００μｌのマ クロ分子シリカゲルを用いると、溶離剤における塩濃度を約１．０モル／１の割 合に増加させることにより、核酸の混合物をいろいろな基に分離することができ る。これは図示のクロマトグラムにおいて、５ＲＮＡ（ピーク１）、ｒＲＮＡ（ ピーク２）、遺伝学上のＤＮＡの一部（ピーク３）によって示される。

分離プロセスは好ましくは、各種の核酸（３０から５０．０００塩基のオーダに おけるオリゴヌクレオタイドおよびポリヌクレオタイド）を分離するのに適して いる。ポリサッカライド、プロティン、その他の細胞物質のような不純物は、す てに塩濃度の低くされている（約０．３Ｍに近い）固定相から溶離される。

本発明のとくに好適な具体例によると、上述の方法で２級ヒドロキシルアミンと 反応させることにより得られたアニオン交換基をもつ、シリカゲルベースのクロ マトグラフキャリヤーか提供される。

従来技術によると、尿素あるいはフォルムアミドのような水素結合を破れる高濃 度の溶剤を、アニオン交換基をもつシリカゲルキャリヤー物質に入れて、長鎖１ 本鎖あるいは２本鎖ＤＮＡ型（ファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ）から、長鎖 ＲＮＡ型（ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ）を分離させる必要があった。これは、もし２級 ヒドロキシアルキルアミンを用いて交換基を作る場合は必要がないのである。

溶液の粘度か低いと、クロマトグラフ分離度が改良され、分離時間が短縮される 。

加えて、長時間にわたって尿素なしのバッファーを使用することか可能である。

つまり、水素架橋を破る薬剤か分解することによる劣化か防止されるからである 。

［実施例］ 本発明は次の例を用いることによってさらに詳しく逆比表面積か１０ｆｆＩｔ／ ｇで細孔の平均径が４００ｎｍのシリカゲル５０ｇが、１２時間にわたり、１７ ０℃で乾燥され、Ｈ の式をもつンラン１５１と乾燥キシレン３００１１　、およびブチルアミン０． ５Ｉｌｌか触媒として加えられ、２分間超音波処理をし、３時間にわたり自然湿 度を排除して１３０℃に維持された。この変成シリカゲルはフィルターにかけら れ、メチレンクロライド、メタノール／水（１対１）、メタノールとメチレンク ロライドで数回洗浄され、１０５℃で乾燥された。

例２ 乾燥キシレン３００ｍ１　、γ−グリシジロキシブロピルトリメトキシシラン１ ５１、ジブチル錫ジラウウレート０．５１が、比表面積２２イ／ｇと平均孔径１ ００ｒｖを有する乾燥シリカゲル５０ｇに添加され、２分間超音波処理をし、自 然湿度なしに４時間にわたり１２５℃で維持される。この変性シリカゲルは、メ チレンクロライド、メタノール、メチレンクロライドによってくりかえし洗浄さ れ、１０５℃で乾燥される。

続いて、テトラヒドロフラン３００１　とＮ−メチルアミノエタノール１５ｍ１ か、製品に添加され、自然湿度を排除して１６時間にわたり沸とうさせる。製品 は、例１に記述した方法にしたがって洗浄され、乾燥される。

酊 乾燥されたテトラヒドロフラン２００１　とジェタノールアミンｌｏ１か、グリ シジル基含有レジン（重合体キャリヤーＶＡエポキシバイオシンスＲ，リーデル ・デノ＼エン）３０ｇに添加され、大気湿度つまり自然湿度を排除しつつ還流さ せ、次いて例１の方法に従って洗浄し、乾燥させた。

」 多孔シリコンダイオキサイドでコーティングされ、１０ｎｉ”　／　ｇの比表面 積を有するガラス玉５０ｇを例２において述べたようにγ−グリシジルオキシブ ロピルトリメトキシシランと反応させ、洗浄し、乾燥させた。つづいて、乾燥さ せたテトラヒドロフラン３００１　とアミノエタノール１５１を製品に添加し、 大気つまり自然湿度を排除しつつ１６時間にわたり還流処理をし、その後側１に 従って洗浄し、乾燥させた。

例５ 本発明によって変性された例１の最終製品０．０７ｇが乾燥状態で鋼製パイプ（ １５ｘ　４　ａｓ）に詰め、核酸の化学結合および溶離挙動をＨＰＬＣ装置を用 いて検査した。

流量１１／分と検知器波長２６５ｎ■のとき、核酸混合物（ｔＲＮＡ　［Ｅ、　 Ｃｏ１ｊ　］　、ｒＲＮＡ　（Ｅ、　Ｃｏ１ｔ　）　。

ｄ　ｓ　Ｄ　Ｎ　Ａ　［Ｃａ１ｒｔｈｙｓｕｓコ）５μｍが射出された。溶離作 用は、１００％溶離剤Ａ　（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　／　Ｈ３Ｐ　Ｏ４。

２０％Ｃ２Ｈ５０Ｈ，４Ｍ尿素、　ｐＨ’７．０）から１００％溶離剤Ｂ　（５ ｈＭ　Ｔｒｉｓ　／ＨＰｏ　、　２０％Ｃ，，Ｈ５０Ｈ，４Ｍ尿素、■、８ζＫ ｃｌ、　ＰＨ７，０）までのリニアこう配をもって、１０分以内に行なわれた。

混合物成分の良好な分離が観察された。（トリス−トリス（ヒドロキシメチール ）−アミノメタン） ｂ）比較例 ＥＰ−Ｂ−０１０４２１０に従って、ジエチルアミノエタノール（例５ａにおけ る初期シリカゲルと同一）で変性されたシリカゲル０゜０７ｇか、乾燥状態で、 鋼製バイブ（１５Ｘ４ＩＩ１１）に詰められ、核酸の化学結合および溶離挙動を 例５ａに述べたＨＰＬＣ装置で検査した。

結果は添付図の左側のクロマトグラムに示す。ピークか重なっているのは、混合 物成分のベースラインが分離してないことを示している。

Ｌ　Ａ　（ＪＦＸＥ／　Ｔ　ｆｒｒｗ’ｎ）国際調査報告 国際調査報告 ＥＰ　９００１７５９

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．分離される核酸の最大寸法の１から２０倍の細孔を有し、１０から１０００ ｎｍの細孔と５から８００ｍ２／ｇの比表面積とを有し、さらに３から５００μ ｍの粒径をもつベースキャリヤー物質とシラン化反応試薬とを反応させることに よって得られるクロマトグラフキャリヤー物質において、上記シラン化反応試薬 は、１級あるいは２級ヒドロキシアルキルアミンとすでに反応している少なくと も１種の反応基を有し、 あるいは、あとの反応段階においてヒドロキシアルキルアミンと反応する、たと えばエポキシド基あるいはハロゲン原子のようなヒドロキシアルアミンと反応し うる反応基を含む、 クロマトグラフキャリヤー物質。
2. ２．上記ベースキャリヤー物質は、シリカゲル、酸化アルミ、二酸化チタン、多 孔ガラス、あるいは重合体レジンキャリヤーである、上記請求項１に記載のクロ マトグラフキャリヤー物質。
3. ３．上記ベースキャリヤー物質の粒径は、５０から５００μｍの間である、上記 請求項１あるいは２に記載のクロマトグラフキャリヤー物質。
4. ４．上記ベースキャリヤー物質は、１００から２００μｍの間の粒径を有するマ クロ細孔シリカゲルである、上記請求項３記載のクロマトグラフキャリヤー物質 。
5. ５．ヒドロキシアルキルアミンとすでに反応しているあるいは反応可能であり、 そしてシラン化反応試薬と化学結合しうるあるいは導入しうる基は、γ−グリジ ジルーオキシプロピル基である、上記請求項１〜４のいずれか１項に記載のクロ マトグラフキャリヤー物質。
6. ６．導入されたヒドロキシアルキルアミンは、アミノエタノール、ジエタノール アミン、あるいはＮ−メチルアミノエタノールである、上記請求項１〜５のいず れか１項に記載のクロマトグラフキャリヤー物質。
7. ７．ベースキャリヤー物質は、２級ヒドロキシルアミンによって変性されたシリ カゲルである、請求項４に記載のクロマトグラフキャリヤー物質。
8. ８．核酸混合物の溶離が、クロマトグラフプロセス中の、塩濃度約１モル／１の 割合で増加する過程に行われる、請求項１〜７のいずれか１項に記載されたクロ マトグラフキャリヤーを用いて核酸を分離する方法。
9. ９．請求項７に記載のクロマトグラフキャリヤーが用いられ、そして尿素あるい はフォルムアミドのような水素架橋を破れる薬剤が分離用として添加されること はない、核酸の分離方法。
10. １０．３０から５０，０００塩基のオーダーのオリゴあるいはポリヌクレオタイ ドが分離される、請求項８あるいは９記載の方法。
11. １１．塩濃度が０．３モル／１以下である場合、ポリサッカライド、プロテイン 、および低分子細胞物質が同時に溶離する、請求項８〜１０のいずれか１項に記 載された方法。