DE19825899A1 - Vorrichtung zur parallelen Identifizierung und Quantifizierung von Polynukleinsäuren - Google Patents
Vorrichtung zur parallelen Identifizierung und Quantifizierung von PolynukleinsäurenInfo
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Abstract
Träger mit an mindestens einer Hauptoberfläche des im wesentlichen planaren Trägers kovalent gebundener Oligo- oder Polynukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß DOLLAR A die Hauptoberfläche des Trägers eine reaktive Gruppe aufweist, die mit einem bifunktionellen Spacer unter Ausbildung einer kovalenten Bindung zwischen einer funktionellen Gruppe des Spacers und der reaktiven Gruppe der Hauptoberfläche des Trägers reagiert hat, DOLLAR A die zweite funktionelle Gruppe des bifunktionellen Spacers mit einer der funktionellen Gruppen eines bifunktionellen Linkers reagiert und DOLLAR A die zweite funktionelle Gruppe des bifunktionellen Linkers mit dem Oligo- oder Polynukleotid, das kovalent gebunden werden soll, unter Ausbildung einer kovalenten Bindung am 5'- oder 3'-Terminus des Oligo- oder Polynukleotids reagiert hat.
Description
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung gemäß Anspruch 1,
Verwendung des erfindungsgemäßen Trägers sowie Herstellung des
erfindungsgemäßen Trägers.
Analysen, die auf molekularbiologischer Ebene durchgeführt
werden, gewinnen zunehmend an Bedeutung. In den meisten Fällen
wird in solchen Methoden ein zu analysierendes Nukleinsäurege
misch durch Hybridisierungsreaktionen mit sogenannten Sonden
hybridisiert und charakterisiert. Insbesondere bei Fragestellun
gen, bei denen gleichzeitig eine Vielzahl von Polynukleinsäuren
verschiedener Art nachgewiesen werden sollen, kommt es zu metho
dischen Engpässen. Man versucht insbesondere durch parallele
Prozeßführung eine Vielzahl von Analyseschritten in kurzer Zeit
durchzuführen. Dabei stellt sich oftmals das Problem, daß
Trägersysteme, auf denen die Hybridisierungsexperimente durchge
führt werden können, nur beschränkte Raumkapazität aufweisen.
Man versucht daher durch Verwendung von Trägern, auf denen eine
Vielzahl von Proben plaziert werden können, diese Probleme zu
lösen. Insbesondere werden im Stand der Technik Träger beschrie
ben, die Mikro- oder Nanokompartimente aufweisen zur Aufnahme
entsprechend kleiner Volumina, der meistens in Lösung befindli
chen Analyten. Entsprechende Trägersysteme sind beispielsweise
durch Ätzen von Oberflächen von aus Silizium aufgebauten Wafern
erhältlich.
Solche Systeme sind üblicherweise nur recht aufwendig herstell
bar und erreichen oft eine nicht zufriedenstellende Kapazität
von Probenkompartimenten, die für eine entsprechende Paral
lelisierung notwendig wären.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist mithin die Bereitstellung
eines Trägers, der die genannten Nachteile des Standes der
Technik vermeidet. Insbesondere soll der erfindungsgemäße Träger
Nukleinsäuren, bevorzugt mit definierter Sequenz und möglichst
gleicher Länge von 200 bp bis 400 bp in hoher Dichte binden
können und eine hohe Parallelisierung von zu untersuchenden
Proben erlauben.
Erfindungsgemäß gelöst wird diese Aufgabe durch einen Träger
mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1. Bevorzugte Weiterbil
dungen des erfindungsgemäßen Trägers finden sich in den Ansprü
chen 2 bis 8. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eben
falls ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen
Trägers sowie dessen Verwendung.
Der erfindungsgemäße Träger mit an mindestens einer Hauptober
fläche des im wesentlichen planaren Trägers kovalent gebundener
Oligo- oder Polynukleinsäuren ist dadurch gekennzeichnet, daß
die Hauptoberfläche des Trägers eine reaktive Gruppe aufweist,
die mit einem bifunktionellen Spacer unter Ausbildung einer
kovalenten Bindung zwischen einer funktionellen Gruppe des
Spacers und der reaktiven Gruppe der Hauptoberfläche des Trägers
reagiert hat. Unter Hauptoberfläche wird jede Oberfläche ver
standen, die eine hinreichende Dimension aufweist, um eine für
die Verwendung des Trägers notwendige Anzahl von Proben auf
zunehmen.
Die zweite funktionelle Gruppe des bifunktionellen Spacers hat
mit einer funktionellen Gruppen eines bifunktionellen Linkers
reagiert und die zweite funktionelle Gruppe des bifunktionellen
Linkers hat mit dem Oligo- oder Polynukleotid, das kovalent
gebunden werden soll (Leit-Nukleinsäure), unter Ausbildung einer
kovalenten Bindung am 5'- oder 3'-Terminus des Oligo- oder
Polynukleotids reagiert.
Vorzugsweise ist das Polynukleotid eine RNA, DNA oder PNA. Der
Träger besteht vorzugsweise aus einem Glas oder einem anderen
hauptsächlich aus Siliziumoxid bestehenden Material. Vorzugs
weise weist der bifunktionelle Spacer, der an die Hauptoberflä
che des erfindungsgemäßen Trägers gebunden ist, die nachstehende
Struktur auf
(XO)3-Si-Y-Nu
wobei
X = C1-C3 Alkyl,
Y = C2-C4 Alkylen,
Nu = eine nukleophile Gruppe wie -NH2, -NHR, mit
R = -CH2-CH2-NH2, -CH2-CH2-NH -CH2-CH2-NH2 -CO-NH2, oder SH, ist.
X = C1-C3 Alkyl,
Y = C2-C4 Alkylen,
Nu = eine nukleophile Gruppe wie -NH2, -NHR, mit
R = -CH2-CH2-NH2, -CH2-CH2-NH -CH2-CH2-NH2 -CO-NH2, oder SH, ist.
Insbesondere bevorzugt ist ein Spacer der Struktur
Me3OSi-CH2-CH2-CH2-NH2.
Der Linker, der mit der noch freien Gruppe des bifunktionellen
Spacers eine kovalente Bindung eingeht, hat die folgende Struk
tur
E1-A-E2,
wobei
E1 und E2 gleiche oder verschiedene elektrophile Gruppen wie
S = C = N- sind und
A = C2-C30 Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, ist.
E1 und E2 gleiche oder verschiedene elektrophile Gruppen wie
S = C = N- sind und
A = C2-C30 Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, ist.
Insbesondere bevorzugt ist ein Linker mit der folgenden Struktur
S = C = N-Phenylen-N = C = S.
Der erfindungsgemäße Träger weist vorzugsweise ein kovalent an
den bifunktionellen Linker gebundenes Oligo- oder Polynukleotid
auf, wobei die kovalente Bindung mittels einer am 3'- oder 5'-
Terminus über ein Alkan mit einer Länge von 4 bis 30 Methylen
gruppen oder über einen Polyether mit 2 bis 20 wiederholenden
Struktureinheiten synthetisch oder über die PCR Reaktion ange
fügte primäre Aminogruppe gebunden ist.
E. M. Southern (E. M. Southern et al. (1992), Nucleic Acids Re
search 20: 1679 bis 1684 und E. M. Southern et al. (1997),
Nucleic Acids Research 25: 1155 bis 1161) beschreibt die Her
stellung sogenannter Oligonukleotid-Anordnungen durch direkte
Synthese an einer Glasoberfläche, die mit 3-Glycidoxypropyltri
methoxysilan und anschließend mit einem Glycol derivatisiert
wurde.
Ein ähnliches Verfahren betrifft die Veröffentlichung von S. P. A.
Fodor (Pease, A. C. et al. (1994.), Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91: 5022 bis 5026). Die dort beschriebene in situ Oligonukleo
tidsynthese findet mittels vollautomatischer, lichtgesteuerter
kombinatorischer Chemie statt. Die Direktsynthese von Oligonu
kleotiden auf einer Glasoberfläche erlaubt eine maximale Länge
von ca. 30 Basen. Eine Sicherstellung des Syntheseverlaufs der
individuellen Sequenz längerer Oligonukleotide ist - wenn
überhaupt - mit einem nicht vertretbaren Aufwand verbunden.
Diese Oligonukleotide als Leit-DNA erlauben die Hybridisierung
eines nur sehr kurzen Stücks der Analyse-Nukleinsäure. Um diesen
Nachteil zu umgehen, werden für jede zu analysierende Nuklein
säure mehrere Oligonukleotide als Leit-DNAs synthetisiert. Dies
hat eine größere Platzbeanspruchung und damit größeres Proben
volumen an Analyse-Nukleinsäure zur Folge. Die geringe Länge
der Oligonukleotide schließt ferner Kreuzhybridisierungen mit
verschiedenen Analyse-Nukleinsäuren nicht aus. Dadurch wird eine
eindeutige Zuordnung der aufgenommenen Signale erschwert.
P. O. Brown (DeRisi et al. (1997), Science 278: 680-686) offen
bart zur Herstellung sogenannter DNA-Chips Polylysin beschich
tete Glasoberflächen, auf die kleinste DNA-Mengen mittels Kapil
lartechnik aufgetropft werden. Die Immobilisierung der Leit-DNA
auf einer Polylysin-Oberfläche beeinträchtigt allerdings die
Hybridisierung und setzt damit die Nachweisgrenze und Verläß
lichkeit bei der Detektion der Analyse-Nukleinsäuren beträcht
lich herab.
L. M. Smith (Guo, Z. et al. (1994), Nucleic Acids Research 22:
5456-5465) beschreibt eine Technik zur Immobilisierung von
Oligonukleotiden, die darauf beruht, daß Oligonukleotide mit
einer 5' terminalen Aminogruppen derivatisiert werden und diese
dann auf eine Glasoberfläche gebracht werden, die mit 3-Amino
propyltrimethoxysilan und anschließend mit 1,4-Phenyldiisothio
cyanat derivatisiert wurde. Während die Chemie zur Immobilisie
rung der Oligonukleotide die Nachteile der zuvor beschriebenen
Systeme umgeht, gelten auch hier die zuvor erwähnten Nachteile,
die durch die Verwendung von kurzen Oligonukleotiden als Leit-
DNA bedingt sind.
200 bis 400 bp lange DNA Fragmente bilden aus folgenden Gründen
bevorzugte Leit-DNAs: Die Länge und die damit gegebene Schmelz
temperatur sind ausreichend, um - bei sorgfältiger Auswahl und
einer maximalen Komplexität wie sie das menschliche Genom
darstellt - mit hoher Sicherheit eine nicht redundante Hybridi
sierung zu garantieren.
Die kürzesten bekannten cDNAs liegen im Bereich von ca. 200 bp.
Somit können alle cDNAs einer zu analysierenden cDNA-Population
vollständig oder als 200 bis 400 bp-Fragmente an die Festphase
gebunden werden. Die ähnliche Länge aller aufgetragenen DNAs
ergibt bei der Hybridisierung mit einer markierten Analyse-
Nukleinsäure Hybridisierungssignale, die nicht durch die Länge
oder unterschiedliche Hybridisierungskinetik der Leit-Nuklein
säure beeinträchtigt werden.
Die Sequenzen der aufzutragenden Leit-DNAs werden vorzugsweise
jeweils einzeln, z. B. durch eine eigens hierfür hergestellt
Software, insbesondere aus den öffentlich zur Verfügung stehen
den Gen-Datenbank herausgesucht. Es ist bevorzugt die Leit-DNAs
auf Nicht-Redundanz zu prüfen. Damit ist weitestgehend ausge
schlossen, daß eine Leit-DNA mit mehreren Analyse-Nukleinsäuren
hybridisiert und so zu falsch positiven Signalen führen kann.
Die Leit-DNA wird, z. B. mittels RT-PCR und sequenzspezifischer
Primer, ausgehend von Gesamt-RNA nach gängigen Protokollen,
amplifiziert.
Bei der Auswahl der sequenzspezifischen Primer werden diese vor
zugsweise so gewählt, daß sie zur Amplifizierung der gewünschten
Leit-Nukleinsäure verschiedener Spezies wie z. B. human und murin
geeignet sind. Auch bei diesem Vorgang hat sich eine Länge der
Leit-Nukleinsäure von 200 bis 400 bp als geeignet erwiesen. Die
Länge reicht aus um in ca. 70 bis 80% der Fälle 18 bis 22 bp
lange Primer zu definieren, die mit maximal 3 "mismatch-Basen"
die Amplifizierung der Leit-Nukleinsäure beider Spezies erlaubt.
Als Träger werden vorzugsweise an sich bekannte Glas-Objektträ
ger benutzt. Im Gegensatz zu oftmals verwendeten Nylonmembranen
bieten z. B. Objektträger den Vorteil, daß sie aufgrund ihrer
Starrheit und der Tatsache, daß Glas für die meisten Reagenzien
inert ist, wesentlich leichter zu bearbeiten und anschließend
von unspezifischen Hybridisierungssignalen freizuwaschen sind.
Ein großer Vorteil liegt weiterhin darin, daß Glas zur fluores
zenzgestützten Analyse genutzt werden kann.
Insbesondere die Nutzung piezoelektrischer Nanodispenser zum
Auftragen der Leit-DNA auf die Festphase erlaubt eine sehr
genaue Dosierung, was für eine verläßliche Quantifizierung der
Analyse-DNA bevorzugt ist, die im direkten Zusammenhang mit
einer reproduzierbaren Menge an Leit-DNA steht. Die Möglichkeit,
Tropfenvolumina von 0,1 nl aufzutragen, erlaubt die Anordnung
von 100.000 unterschiedlichen Leit-DNAs z. B. auf der Fläche
eines Objektträgers (76 × 26 mm). Damit wird es möglich, auch
sehr geringe Nukleinsäuremengen zu detektieren.
Die erfindungsgemäße Immobilisierung der Leit-DNA über die
Reaktion eines Isothiocyanats mit einem primären Amin zu N-
substituierten Thioharnstoffen birgt Vorteile. Sowohl die
Chemikalien als auch die aminomodifizierten 5'-Oligonukleotid
primer zur Synthese der DNAs sind kostengünstig im Vergleich
zu anderen Syntheseverfahren, die auf der Phosphoramidit-Chemie
beruhen. N-substituierte Thioharnstoffe stellen eine stabile
Verbindung dar. Die nach dem hier beschriebenen Verfahren kova
lent gebundene DNAs werden auch durch mehrstündiges Kochen in
Wasser nicht von der Festphase abgetrennt. Damit können die DNA-
Chips auch einer Mehrfachverwendung zugänglich sein. Dies
scheitert bei anderen Chips unter anderem daran, daß die für
die Regenerierung erforderlichen Waschbedingungen zum Entfernen
von spezifischen und unspezifischen Analyse-DNAs aufgrund der
Instabilität der Festphasen-Bindung nicht stringent genug
gewählt werden können.
Durch die spezifische Bindung der DNA über ihr 5' oder 3' Ende
ist weitestgehend sichergestellt, daß nahezu die gesamte Leit-
DNA für die Hybridisierung mit der Analyse-DNA zur Verfügung
steht und nicht durch unspezifische Bindung an der Oberfläche
beeinträchtigt ist. Die DNA-Doppelhelix wird sich aufgrund ihrer
recht starren Struktur und negativen Ladung senkrecht zur Fest
phase ausrichten und so eine maximale Dichte an aufzutragender
Leit-DNA ermöglichen.
Die spezifische und monovalente Bindung der Leit-DNA an die
Festphase erlaubt nicht zuletzt eine Kontrolle der Menge an
aufgetragener DNA über die zur Verfügung stehenden derivatisier
baren Isothiocyanatgruppen.
Die erfindungsgemäße Verwendung eines erfindungsgemäßen Trägers
in einem Verfahren zur Identifizierung und Quantifizierung von
Polynukleotiden durch eine Markierung der zu analysierenden
Polynukleotide und anschließende Hybridisierung auf dem Träger
ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die Detektion der Hybridisierung von Leit- und Analyse-Nuklein
säuren kann nach verschiedenen Methoden erfolgen. Eine geeignete
Methode besteht in der Markierung der Analyse-Nukleinsäure
mittels fluoreszierender Nukleotide und anschließender Detektion
der Hybridisierung mittels Fluoreszensmikroskopie. Zur differen
tiellen bzw. relativen Quantifizierung von Analyse-Nukleinsäuren
wird zu der fluoreszenzmarkierten Analyse-Nukleinsäure eine
bekannte Menge an Referenz-Nukleinsäure, die einen zweiten
Fluoreszenzmarker trägt, zugegeben und für die Hybridisierung
auf die immmobilisierte Leit-DNA aufgetragen. Durch Vergleich
der detektierten Signalintensitäten erfolgt eine relative Quan
tifizierung der Analyse-Nukleinsäure.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines erfin
dungsgemäßen Trägers weist folgende Schritte auf.
Der bifunktionelle Spacer wird in einem polaren aprotischen
Lösungsmittel auf die Hauptoberfläche des Trägers aufgebracht,
woraufhin gegebenenfalls überschüssiger nicht abreagierter
Spacer entfernt wird. Der bifunktionelle Spacer wird beispiels
weise in 95%-igem Aceton/Wasser-Gemisch (Vol.-%) auf die Haupt
oberfläche des Trägers aufgebracht. Vorzugsweise wird der Träger
nach den eventuell durchgeführten Waschschritten, insbesondere
durch Erhitzen, getrocknet.
Der bifunkbionelle Linker wir in einem im wesentlichen was
serfreien polaren aprotischen Lösungsmittel gelöst und zur
Reaktion mit dem auf der Hauptoberfläche gebundenen Spacer
gebracht. Der Linker sollte vorzugsweise in geringer Konzentra
tion, beispielsweise im Bereich von 0,5 Gew.-% in dem polaren
aprotischen Lösungsmittel vorliegen. In diesem Falle kommt z. B.
ein Lösungsmittelsystem mit 10% Pyridin/Dimethylformamid (Vol.-%)
in Betracht. Die Reaktionszeit hängt von der Reaktionsfreudig
keit des bifunktionellen Spacers oder bifunktionellen Linkers
ab und kann durchaus mehrere Stunden bei Raumtemperatur oder
erhöhter Temperatur betragen. Der Träger kann in diesem Zustand
gekühlt und trocken mehrere Monate aufbewahrt werden.
In einem weiteren Ansatz wird das am 5'- oder 3'-Terminus über
eine Alkylengruppe mit einer Aminogruppe modifizierte Oligo-
oder Polynukleotid in einem Puffer aufgenommen. Hierzu bietet
sich insbesondere ein basischer Puffer, beispielsweise ein Car
bonatpuffer an. Die Mischung wird auf dem vorher vorbereiteten
Träger inkubiert zur Bindung des Oligo- oder Polynukleotids an
eine freie Gruppe des bifunktionellen Linkers. Dies kann insbe
sondere für einen Zeitraum von mehreren Stunden in einer dampf
gesättigten Atmosphäre erfolgen. Danach werden eventuell nicht
abreagierte Gruppen des bifunktionellen Linkers entfernt. Hierzu
dienen insbesondere Amine wie Ethanolamin oder Hydroxylamin.
Es handelt sich dabei um dem Fachmann an sich bekannte typische
Blockierungsreaktionen reaktiver Gruppen.
Danach wir das auf dem Träger gebundene Oligo- oder Polynukleo
tid denaturiert. Zur Denaturierung wird beispielsweise der
Träger mit dem dann daran kovalent gebundenen Polynukleotid in
bidestilliertem Wassern gekocht. Zur Aufrechterhaltung des
denaturierten Zustandes kann der Träger mit reinem Alkohol
gespült und anschließend kühl und trocken aufbewahrt werden.
Die Erfindung wird anhand der folgenden weiteren Erläuterungen
näher beschrieben.
Fig. 1: Chemische Derivatisierung der Festphasenoberfläche und
kovalente Kopplung der Leit-DNA.
76 × 26 mm, reinweißes Glas,
ohne Beschichtung, Mattrand oder Beschriftungsfeld; z. B. Fisher
Scientific unter der Bezeichnung "Objektträger Reinweiß mit
geschnittenen Kanten": zwei Stunden Schütteln der Objektträger
in einer Lösung aus 2 N NaOH in 70% EtOH, dreimaliges Waschen
mit vollentsalztem (und bidestilliertem) Wasser und einmaliges
Waschen mit Aceton.
Die Objektträger werden zwei Minuten in einer
Lösung aus 1% 3-Aminopropyltrimethoxysilan (APTMS) in 95%
Aceton/Wasser eingetaucht, dann zehnmal jeweils fünf Minuten
in Aceton gewaschen und anschließend 45 Minuten bei 110°C getrocknet.
Die Objektträger werden zwei Stunden in einer Lösung aus
0,2 Gew.-% 1,4 Phenyldiisocyanat (PDC)/10 Vol.-% Pyridin/
Dimethylformamid eingetaucht und anschließend mit Methanol und
Aceton gewaschen.
0,1 nl PCR-
Fragmente werden mittels eines Nano-Dispensers auf definierte
Positionen der Objektträger aufgetragen, die Objektträger
mindestens eine Stunde bei 37°C in feuchter Atmosphäre inku
biert, dann einmal mit 1% NH4OH und dreimal mit Wasser gespült
und gekühlt und trocken gelagert.
Zur Abtrennung des DNA-Gegenstranges vom Matrizen-Strang werden
die Objektträger zehn Minuten bei 96°C in vollentsalztem Wasser
inkubiert, mit 96% Ethanol gespült und anschließend bei Raum
temperatur getrocknet. Die Objektträger sind nun für die Hybri
disierung mit der Analyse-Nukleinsäure bereit.
Erfindungsgemäß kann auch wie folgt verfahren werden.
Es kann auch eine Glasoberfläche genutzt werden, die nicht zur
Nutzung als Objektträger angefertigt wurde.
Die Dichte der derivatisierbaren Aminogruppen auf der Glasober
fläche kann durch die Konzentration der APTMS-Lösung zwischen
0,1 und 10% variiert werden, wodurch eine unterschiedliche
Dichte an gekoppelter Leit-DNA eingestellt werden kann.
Die Dichte der derivatisierbaren Aminogruppen kann ferner
gesteuert werden durch ein Gemisch aus APTMS/Propyltrimethoxysi
lan (PTMS) oder APTMS/Tetramethoxysilan (TeMS) im Verhältnis
1 : 10 bis 10 : 1.
Vor der Derivatisierung der Aminogruppen mit PDC können die
gebundenen APTMS-Moleküle vernetzt werden: 30 Minuten bei 90°C
mit 5% APTMS oder PTMS oder TeMS in Wasser; pH 5,5 bis 5,8.
Die Konzentration der PDC kann, wie oben für das APTMS beschrieben,
zwischen 0,04% und 1% variiert werden, um so die Dichte der Linker
für die Aufnahme der Leit-DNA je nach Bedarf einzustellen.
Anstelle von PDC können auch andere Diisocyanate verwendet wer
den. PDC hat den Vorteil, daß eine Vernetzung von benachbarten
Aminogruppen sterisch gehindert wird. Um einen größeren Abstand
zwischen Trägeroberfläche und DNA zu erhalten, kann es von Vor
teil sein, längere Verbindungsmoleküle zwischen derivatisierter
Oberfläche und DNA oder mehrere Einheiten kurzer Verbindungsmo
leküle hintereinander zu setzen.
Die Generierung der PCR-Fragmente erfolgt vorzugsweise, indem
die Information einer mRNA mit Hilfe der reversen Transkriptasen
in DNA umgeschrieben wird. Diese DNA wird mit der Polymerasen-
Kettenreaktion (PCR) amplifiziert. Für beide enzymatische
Vorgänge werden unter anderem Oligonukleotidprimer benötigt,
die mit einer Matrize hybridisieren und als Synthesestart für
die jeweilige Polymerase dienen.
Es wird eine Liste von Genen erstellt, deren parallele Iden
tifizierung und Quantifizierung von Interesse ist. Diese Liste
wird als Input für ein hierfür erstelltes Programm genutzt. Mit
Hilfe des Programms werden die Sequenzen der zu analysierenden
Gene z. B. einer öffentlich zugänglichen Gen-Datenbank entnommen
und Oligonukleotidpaare entworfen, die eine spezifische Amplifi
zierung von jeweils 200 bis 400 bp Fragmenten eines jeden Gens
ergeben. Die Oligonukleotide werden synthetisiert und die RT-PCR
nach einem dem Fachmann an sich bekannten Protokoll durchge
führt. Die PCR-Fragmente werden zur Abtrennung nicht eingebauter
Nukleotide und Oligonukleotide mit Ethanol gefällt und mit
100 mM Natriumcarbonat/Natriumhydrogencarbonat-Lösung, pH 9,
eine Konzentration von 0 bis 50 ng/µl eingestellt.
Claims (10)
1. Träger mit an mindestens einer Hauptoberfläche des im we
sentlichen planaren Trägers kovalent gebundener Oligo- oder
Polynukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß
die Hauptoberfläche des Trägers eine reaktive Gruppe auf weist, die mit einem bifunktionellen Spacer unter Ausbildung einer kovalenten Bindung zwischen einer funktionellen Gruppe des Spacers und der reaktiven Gruppe der Hauptoberfläche des Trägers reagiert hat,
die zweite funktionelle Gruppe des bifunktionellen Spacers mit einer der funktionellen Gruppen eines bifunktionellen Linkers reagiert und
die zweite funktionelle Gruppe des bifunktionellen Linkers mit dem Oligo- oder Polynukleotid, das kovalent gebunden werden soll, unter Ausbildung einer kovalenten Bindung am 5'- oder 3'-Terminus des Oligo- oder Polynukleotids reagiert hat.
die Hauptoberfläche des Trägers eine reaktive Gruppe auf weist, die mit einem bifunktionellen Spacer unter Ausbildung einer kovalenten Bindung zwischen einer funktionellen Gruppe des Spacers und der reaktiven Gruppe der Hauptoberfläche des Trägers reagiert hat,
die zweite funktionelle Gruppe des bifunktionellen Spacers mit einer der funktionellen Gruppen eines bifunktionellen Linkers reagiert und
die zweite funktionelle Gruppe des bifunktionellen Linkers mit dem Oligo- oder Polynukleotid, das kovalent gebunden werden soll, unter Ausbildung einer kovalenten Bindung am 5'- oder 3'-Terminus des Oligo- oder Polynukleotids reagiert hat.
2. Träger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das
Oligo- oder Polynukleotid RNA, DNA oder PNA ist.
3. Träger nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekenn
zeichnet, daß der Träger aus Glas oder einem anderen haupt
sächlich aus Siliziumoxid bestehenden Materials aufgebaut
ist.
4. Träger nach Anspruch 1 bis 3, wobei der bifunktionelle
Spacer die nachstehende Struktur hat
(XO)3-Si-Y-Nu
wobei
X = C1-C3 Alkyl,
Y = C2-C4 Alkylen,
Nu = eine nukleophile Gruppe wie -NH2, -NHR, mit
R = -CH2-CH2-NH2, -CH2-CH2-NH -CH2-CH2-NH2, -CO-NH2, oder SH, ist.
(XO)3-Si-Y-Nu
wobei
X = C1-C3 Alkyl,
Y = C2-C4 Alkylen,
Nu = eine nukleophile Gruppe wie -NH2, -NHR, mit
R = -CH2-CH2-NH2, -CH2-CH2-NH -CH2-CH2-NH2, -CO-NH2, oder SH, ist.
5. Träger nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei
der Spacer Me3OSi-CH2-CH2-CH2-NH2 ist.
6. Träger nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, daß der Linker die folgende Struktur
E1-A-E2
aufweist,
wobei
E1 und E2 gleiche oder verschiedene elektrophile Gruppen wie
S = C = N- sind und
A = C1-C10 Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, ist.
E1-A-E2
aufweist,
wobei
E1 und E2 gleiche oder verschiedene elektrophile Gruppen wie
S = C = N- sind und
A = C1-C10 Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, ist.
7. Träger nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei
der Linker die folgende Struktur hat
S = C = N-Phenylen-N = C = S.
S = C = N-Phenylen-N = C = S.
8. Träger nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei
das Oligo- oder Polynukleotid unter Ausbildung einer kova
lenten Bindung mittels einer am 3'- oder 5'-Terminus über
ein Alkan mit einer Länge von 6 bis 18 Methylengruppen oder
über einen Polyether von 2 bis 20 sich wiederholenden Struk
tureinheiten synthetisch oder über die PCR Reaktion angefüg
te primäre Aminogruppe mit einer funktionellen Gruppe des
bifunktionellen Linkers reagiert hat.
9. Verwendung eines Trägers nach mindestens einem der Ansprüche
1 bis 8, in einem Verfahren zur Identifizierung und Quanti
fizierung von Polynukleotiden durch eine Markierung der zu
analysierenden Polynukleotide und anschließende Hybridisie
rungsreaktion auf dem Träger.
10. Verfahren zur Herstellung eines Trägers nach mindestens
einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei
- 1. der Spacer in einem polaren aprotischen Lösungsmittel auf die Hauptoberfläche des Trägers aufgebracht wird, woraufhin gegebenenfalls überschüssiger nicht abrea gierter Spacer entfernt wird,
- 2. der Linker in einem wasserfreien polaren aprotischen Lösungsmittel gelöst und zur Reaktion mit dem auf der Hauptoberfläche gebundenen Spacers gebracht wird,
- 3. das am 5'- oder 3'-Terminus über eine Alkylengruppe mit einer Aminogruppe modifizierte Oligo- oder Polynukleo tid in einem Puffer aufgenommen und auf dem Träger inkubiert wird zur Bindung des Oligo- oder Polynukleo tids an eine freie Gruppe des bifunktionellen Linkers, gegebenenfalls gefolgt von einer Entfernung von über schüssigen freien Gruppen des bifunktionellen Linkers und
- 4. das auf dem Träger gebundene Oligo- oder Polynukleotid denaturiert wird.
Priority Applications (7)
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