DE60000836T2

DE60000836T2 - Verfahren zur herstellung eines dns chip

Info

Publication number: DE60000836T2
Application number: DE60000836T
Authority: DE
Inventors: Masashi Hakamata; Satoru Kuhara; Shigeru Muta; Kosuke Tashiro; Toru Tsuchiya
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 1999-02-08
Filing date: 2000-02-08
Publication date: 2003-09-04
Anticipated expiration: 2020-02-09
Also published as: US20020090640A1; DE60000836D1; EP1026259B1; US20040132081A1; EP1026259A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft einen DNA-Chip, der auf günstige Weise zur Detektion eines DNA-Fragments, komplementär zu einem Oligonukleotid oder Polynukleotid, gebunden an den DNA-Chip, verwendet werden kann, und seine Herstellung.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

In der Genanalyse auf den Gebieten der Biochemie und des klinischen Tests wird die Detektion eines DNA-Fragments mit einer spezifischen Basensequenz mittels eines Hybridisierungsverfahrens, insbesondere des Southern-Hybridisierungsverfahrens (d. h. dem Southern-Blotting-Verfahren) durchgeführt. Die Southern-Hybridisierung wird gemäß den Stufen durchgeführt: Spaltung der zu prüfenden DNA (d. h. eine Proben-DNA) unter Verwendung von einem Restriktionsenzym unter Bildung seiner Fragmente; Trennung der DNA- Fragmente mit unterschiedlichen molekularen Größen durch Elektrophorese an Agarosegel oder Polyacrylamidgel; Behandlung des abgetrennten DNA-Fragments unter Bildung eines Einzelstrang-DNA-Fragments; Fixierung des Einzelstrang-DNA-Fragments auf einem Polyamidfilter oder einem Nitrocellulosefilter; Hybridisierung der fixierten Einzelstrang-DNA mit einer Sonden-DNA (d. h. einer einzelsträngigen DNA, die komplementär zu der fixierten einzelsträngigen DNA ist, und die mit RI (einem radioaktiven Isotop) markiert ist; Waschen des Filters und Durchführung einer Autoradiographie mit dem Filter zur Visualisierung des hybridisierten DNA-Fragments auf dem Filter.
Die bekannten Verfahren, bei denen eine Radioisotopmarkierung verwendet wird, wie das Southern-Hybridisierungsverfahren, besitzen die nachteiligen Merkmale, dass sie Radioisotope benötigen, die mit extremer Vorsicht gehandhabt werden müssen. Außerdem verlangt das autoradiographische Verfahren eine lange Zeit, wie 24 Stunden oder länger. Wenn nur eine geringe Menge an Proben-DNA verfügbar ist, erfordert das autoradiographische Verfahren eine längere Zeit, und es gibt keine klar getrennten Banden.
Ein Southern-Hybridisierungsverfahren, bei dem eine fluoreszierende Markierung anstelle der radioisotopen Markierung verwendet wird, und die Detektion durch Fluormetrie durchgeführt wird, ist ebenfalls bekannt. Dementsprechend ist ein DNA-Chip, der ein Substrat (d. h. einen festen Träger), wie einen Objektträger oder ein Siliconplättchen, und eine große Zahl an Oligonukleotiden oder Polynukleotiden, fixiert an das Substrat, umfasst, für die Verwendung fluoreszierender Detektionssysteme jetzt im Handel erhältlich.
Derzeit sind zwei Verfahren bekannt zur Herstellung eines DNA-Chips mit einem festen Träger und einem Oligonukleotid oder Polynukleotid, fixiert an den Träger. Ein Herstellungsverfahren umfasst die Herstellung von einem Oligonukleotid oder Polynukleotid Schritt-für-Schritt auf dem Träger. Dieses Verfahren wird als "Am-Chip-Verfahren" bezeichnet. Ein typisches Am-Chip-Verfahren wird von Foder, S.P.A., in Science, 251, Seite 767 (1991) beschrieben.
Ein anderes Herstellungsverfahren umfasst die Bindung eines getrennt hergestellten Oligonukleotids oder Polynukleotids an einen festen Träger. Es sind verschiedene Verfahren für verschiedene Oligonukleotide und Polynukleotide bekannt. Wenn das Oligonukleotid oder Polynukleotid ein cDNA-Fragment ist (d. h. ein komplementäres DNA-Fragment, welches unter Verwendung von mRNA als Form synthetisiert wurde) oder ein PCR-Produkt (welches ein DNA-Fragment ist, hergestellt durch Multiplizierung der cDNA gemäß dem PCR- Verfahren), wird eine wässrige Lösung des hergestellten DNA-Fragments auf einen festen Träger mit einem polykationischen Uberzug in einer DNA-Chip-Herstellungsvorrichtung aufgetüpfelt, so dass das DNA-Fragment an den Träger über elektrostatische Bindung gebunden ist, und dann wird die freie Oberfläche des polykationischen Überzugs blockiert.
Wenn das Oligonukleotid synthetisch hergestellt ist und eine funktionelle Gruppe besitzt, wird eine wässrige Lösung des synthetischen Oligonukleotids auf einen aktivierten, festen Träger aufgetüpfelt, wobei eine covalente Bindung zwischen dem Oligonukleotid und der Trägeroberfläche gebildet wird. Vergleiche Lamture, J. B., et al., Nucl. Acids Res., 22, 2121-2125, 1994, und Guo, Z., et al., Nucl. Acids Res., 22, 5456-5465, 1994. Im Allgemeinen ist das Oligonukleotid covalent an den Träger mit aktivierter Oberfläche über einen Spacer oder ein Vernetzungsmittel gebunden. Ebenfalls bekannt ist ein Verfahren, das die Stufen umfasst: Anordnung kleiner Polyacrylamidgele auf einer Glasplatte und Fixierung synthetisierter Oligonukleotide an der Glasplatte durch Herstellung einer covalenten Bindung zwischen dem Polyacrylamid und dem Oligonukleotid (Yershov, G., et al., Proc. Natl.. Acad. Sci. USA, 94, 4913 (1996)). Sosnowski, R. G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 1119-1123 (1997)) beschreiben ein Verfahren, das die Stufen umfasst: Anordnung von Mikroelektroden auf einem Silicamaterial-Chip, Bildung einer Streptoavidin-umfassenden Agaroseschicht auf der Mikroelektrode und Bindung eines Biotin-modifizierten DNA-Fragments an die Agaroseschicht durch positive Ladung der Agaroseschicht. Schena, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 10614-10619 (1996), lehren ein Verfahren, das die Stufen umfasst: Herstellung einer Suspension aus einem an der Aminogruppe modifizierten PCR-Produkt in SSC (d. h. Standardnatriumchlorid-Zitronensäure-Pufferlösung), Auftüpfeln der Suspension auf einen Objektträger, Inkubieren des getüpfelten Objektträgers, Behandlung des inkubierten Objektträgers mit Natriumborhydrid und Erhitzen des so behandelten Objektträgers.
Wie oben erläutert, wird bei den meisten bekannten Verfahren zur Fixierung eines getrennt hergestellten DNA- Fragments an einen festen Träger eine elektrostatische Bindung oder eine covalente Bindung, wie oben beschrieben, verwendet.
Bei irgendeinem DNA-Chip mit einem getrennt hergestellten DNA-Fragment an seinem festen Träger sollte das DNA- Fragment fest an den Träger fixiert sein, so dass die Hybridisierung zwischen dem fixierten DNA-Fragment und dem Proben-DNA-Fragment, das komplementär zu dem fixierten DNA-Fragment ist, glatt durchgeführt werden kann.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines DNA-Chips, der ein Oligonukleotid oder Polynukleotid fest fixiert an einem festen Träger besitzt, zur Verfügung zu stellen.
Erfindungsgemäß soll ein Verfahren zur Fixierung eines Oligonukleotids oder Polynukleotids an einen festen Träger zur Verfügung gestellt werden, wobei relativ einfache Maßnahmen angewendet werden.
Erfindungsgemäß soll ein Verfahren zur Detektion eines DNA-Fragments, das zu dem Oligonukleotid oder Polynukleotid, die an den DNA-Chip fixiert sind, komplementär ist, zur Verfügung gestellt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines DNA-Chips, umfassend einen festen Träger und ein Oligonukleotid oder Polynukleotid, das an den Träger fixiert ist, bevorzugt an einem Endteil desselben, in Anwesenheit eines hydrophilen Polymeren.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Fixierung eines Oligonukleotids oder Polynukleotids an einen festen Träger an einem Endteil, das umfasst: Tüpfelung einer wässrigen Lösung, die das Oligonukleotid oder Polynukleotid und ein hydrophiles Polymeres enthält, auf den Träger.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

In Fig. 1 ist schematisch ein Verfahren zur Detektion eines DNA-Fragments, das zu einem Oligonukleotid oder Polynukleotid, das an einen DNA-Chip der Erfindung fixiert ist, dargestellt.
Fig. 2 ist eine vergrößerte Ansicht eines DNA-Chips, an den Fluoreszenzindikator-markierte, komplementäre DNA- Fragmente an das Oligonukleotid durch Hybridisierung gebunden sind.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Fixierung des Oligonukleotids oder Polynukleotid an einem festen Träger erfolgt erfindungsgemäß mit einem hydrophilen Polymeren. Der detaillierte Mechanismus der Fixierung durch das hydrophile Polymer ist noch nicht bekannt. Es wird jedoch angenommen, dass das hydrophile Polymere die bekannte elektrostatische Bindung zwischen dem festen Träger und der terminalen Stelle des Oligonukleotids oder Polynukleotids unterstützt. Eine hohe Viskosität des hydrophilen Polymeren kann wirksam sein um eine feste Fixierung des Oligonukleotids oder Polynukleotids an einem festen Träger zu erreichen.
In Fig. 1 ist ein Fließschema erläutert, das die Herstellung des DNA-Chips und ein Verfahren zur Detektion eines DNA-Fragments, komplementär zu dem Oligonukleotid oder Polynukleotid, fixiert auf den DNA-Chip, darstellt. Dieses Fließschema wird in der bekannten Publikation Protein, Nucleotide, Enzyme, Bd. 43, NR. 13, 1998, gezeigt.
Gemäß der Datenbank 11, die die Genomsequenz, eine cDNA- Sequenz oder EST (d. h. ein cDNA-Fragment mit 200 bis 300 bp (bp: Basenpaar) von dem 3'-Ende) oder von den Klonen 12 betrifft, wird ein Oligonukleotid oder Polynukleotid 21 (beispielsweise cDNA, EST oder Oligo-DNA) gemäß einem PCR- Multiplikationsverfahren oder chemischer Synthese hergestellt. Das Oligonukleotid oder Polynukleotid 21 wird an einem festen Träger 31a unter Bildung eines DNA-Chips 31 mit einem fixierten Oligonukleotid oder Polynukleotid 31b fixiert.
Getrennt wird eine DNA-enthaltende Probe 41 der Extraktion zur Abtrennung von mRNA oder Genom DNA 51 unterworfen, woraus cDNA oder die Ziel-DNA 52 erhalten wird. Die cDNA oder die Ziel-DNA 52 wird mit einem Fluoreszenzindikator 53a unter Bildung eines markierten Ziel-DNA-Fragments 53 (welches mit einem RNA-Fragment markiert sein kann) markiert.
Das markierte Ziel-DNA-Fragment 53 wird dann mit dem Oligonukleotid oder Polynukleotid 31b des DNA-Chips 31 unter Bildung des hybridisierten DNA-Chips 61 hybridisiert. Der hybridisierte DNA-Chip 61 wird durch Fluorometrie in einer bekannten DNA-fluorometrischen Scannvorrichtung durchgemustert, wobei eine Karte 71 erhalten wird, wo die Positionen angegeben sind, wo die hybridisierten DNA-Fragmente vorhanden sind. Die bekannte DNA-fluorometrische Scannvorrichtung ist aus einem Fluoreszenz-Lasermikroskop, einer gekühlten CCD-Kamera und einem Computer zusammengebaut.
In Fig. 2 ist eine vergrößerte Ansicht des DNA-Chips 61 dargestellt, wo die Fluoreszenzindikator-markierten Komplementär-DNA-Fragmente mit dem Oligonukleotid durch Hybridisierung verbunden sind.
Der DNA-Chip umfasst einen festen Träger und eine große Zahl von Oligonukleotiden oder Polynukleotiden, fixiert an dem festen Träger.
Der feste Träger ist im Allgemeinen eine Folie beziehungsweise eine Platte aus hydrophobem oder schwach hydrophilem Material. Beispielsweise kann der feste Träger eine Glasplatte, eine Siliciumplatte oder eine Polymerfolie sein, hergestellt aus einem Polymeren, wie Polyethylenterephthalat, Celluloseacetat, Polycarbonat von Bisphenol A, Polystyrol oder Poly(methylmethacrylat). Eine transparente Glasplatte und eine Siliciumplatte werden bevorzugt verwendet. Bevorzugter wird eine transparente Glasplatte mit einer Silicamaterialbedeckung verwendet. Der feste Träger besitzt bevorzugt eine Dicke von 100 bis 2.000 um.
Der feste Träger wird bevorzugt mit einem Oberflächenaktivierungsmittel, wie Poly-L-lysin, Polyethylenimin oder Polyalkylamin, vorbehandelt. Das Poly-L-lysin ist am meisten bevorzugt. Sonst kann eine Glasplatte mit einem Silan- Haftmittel mit einer Aminogruppe, einer Aldehydgruppe oder einer Epoxygruppe vorbehandelt werden. Die Vorbehandlung unter Verwendung eines Silan-Haftmittels und Poly-L-lysin in Kombination wird bevorzugt verwendet. Der vorbehandelte feste Träger kann auf seiner behandelten Oberfläche mit einem hydrophilen Polymeren (welches bevorzugt eine positive oder negative Ladung aufweist) oder mit einem Vernetzungsmittel behandelt sein. Der feste Träger kann per se eine positive oder negative Ladung aufweisen. Die Vorbehandlung des festen Trägers wird günstigerweise verwendet um die Fixierung des Oligonukleotids oder Polynukleotids an der Trägeroberfläche zu verstärken.
Alternativ oder zusätzlich kann das Oligonukleotid oder Polynukleotid, das an dem festen Träger fixiert wird, vorbehandelt worden sein um an die terminale Gruppe eine funktionelle Gruppe, wie eine Aminogruppe, eine Aldehydgruppe, eine Thiolgruppe oder eine Biotinverbindung, zu binden. Eine Aminogruppe wird bevorzugt verwendet. Diese funktionellen Gruppen sind wirksam um die elektrostatische Bindung zwischen dem festen Träger und dem Oligonukleotid oder Polynukleotid zu verstärken.
Das Oligonukleotid oder Polynukleotid kann synthetisch hergestellt werden, gemäß dem PCR-Multiplikationsverfahren hergestellt werden oder durch Spaltung einer einzelsträngigen DNA oder RNA von natürlichem Ursprung durch ein Restriktionsenzym hergestellt werden. Es ist bevorzugt, dass das Oligonukleotid oder Polynukleotid, das an dem festen Träger fixiert wird, eine bekannte Basensequenz besitzt.
Das Oligonukleotid oder Polynukleotid wird in wässriger Lösung eines hydrophilen Polymeren gelöst oder dispergiert. Die wässrige Lösung, die das Oligonukleotid oder Polynukleotid und ein hydrophiles Polymeres enthält, wird einmal allgemein auf eine Kunststoffplatte mit 96 oder 384 Vertiefungen gegeben, und dann auf einen festen Träger unter Verwendung einer Tüpfelungsvorrichtung getüpfelt.
Das hydrophile Polymere kann kationisch, anionisch oder amphoter sein. Ein nichtionisches Polymeres ist ebenfalls verwendbar. Bevorzugt ist ein kationisches Polymeres.
Das kationische Polymere ist bevorzugt ein Polymeres, das eine quarternäre Amingruppe enthält. Beispiele von bevorzugten kationischen Polymeren umfassen Poly-(1,4-diazoniabicyclo[2.2.2]octan-1,4-diylmethylen-1,4-phenylenmethylenchlorid), Poly(vinylbenzyltrimethylammoniumchlorid), Poly(methylentrimethylammoniumchloridacrylat) und Poly- (ethylentrimethylammoniumchloridacrylat). Tertiäre Aminogruppe-enthaltende Polymere, wie Poly-N-vinylpyrrolidon, Polyvinylimidazol oder Polyvinylpyrrazol werden ebenfalls bevorzugt verwendet. Am meisten bevorzugt ist Poly-(1,4- diazoniabicyclo[2.2]octan-1,4-diylmethylen-1,4-phenylenmethylenchlorid).
Beispiele der nichtionischen Polymere umfassen Polyacrylamid, Polyethylenglykol, Polyvinylalkohol, Acetalderivate von Polyvinylalkohol, Cellulose, Cellulosederivate (beispielsweise Hydroxyethylcellulose und Hydroxypropylcellulose), und Saccharide (beispielsweise Trehalose, Natriumalginat und Stärke). Bevorzugt sind Polyacrylamid, Polyethylenglykol und Trehalose. Am meisten bevorzugt sind Polyacrylamid und Polyethylenglykol.
Das anionische Polymere enthält bevorzugt eine anionische Gruppe, wie -COO&supmin;, -SO&sub3;&supmin;, -SO&sub3;&supmin;, -OSO&sub3;&supmin;, -PO&sub3;&supmin; oder -PO&sub2;&supmin;. Bevorzugte anionische Polymere sind Carboxymethylcellulose, Cellulosesulfat, Polyacrylsäure, Polymethacrylsäure, Polyvinylbenzolsulfonsäure oder die Salze von diesen sauren Polymeren. Am meisten bevorzugt sind Natriumpolyacrylät, Natriumpolyvinylbenzolsulfonat und Carboxymethylcellulose.
Beispiele von amphoteren Polymeren umfassen Proteine, wie Albumin, Gelatine, Gelatinederivate, Casein. Albumin ist bevorzugt.
Die Wirkung der Erhöhung der Bindungsstärke, gebildet zwischen dem Oligonukleotid oder Polynukleotid und dem festen Träger in Anwesenheit eines hydrophilen Polymeren, nimmt von einem kationischen Polymeren (am höchsten), einem -COO&supmin; -Gruppe-enthaltenden anionischen Polymeren, einem amphoteren Polymeren und einem SO&sub3;&supmin;-Gruppen-enthaltenden anionischen Polymeren (am niedrigsten) in dieser Reihenfolge ab. Das hydrophile Polymere besitzt bevorzugt ein Molekulargewicht von 10³ bis 10&sup6;. Ein hydrophiles Polymeres mit einem extrem hohen Molekulargewicht kann eine extrem hohe Viskosität ergeben, was einen nachteiligen Einfluss auf die Auflösung des Oligonukleotid oder Polynukleotid in der Polymerlösung, wie auch auf die Fixierung des Oligonukleotids oder Polynukleotids an dem festen Träger besitzt.
In der Lösung aus Oligonukleotid oder Polynukleotid ist das hydrophile Polymere bevorzugt in einer Menge von 0,1 bis 2 Vol.-%, bevorzugter in einer Menge von 0,5 bis 1,0 Vol.-%, enthalten.
Die wässrige Lösung wird auf den festen Träger unter solchen Bedingungen getüpfelt, dass jeder Tropfen der Lösung im Allgemeinen ein Volumen von 100 pl bis 1 ul, bevorzugt 1 bis 100 nl, besitzt. Die Zahl der Oligonukleotide oder Polynukleotide wird bevorzugt auf den festen Träger in einer Menge von 10² bis 10&sup5;/cm² getüpfelt. Ausgedrückt als Mol werden 1 bis 10&supmin;¹&sup5; mol aufgetüpfelt. Ausgedrückt als Gewicht werden mehrere ng oder weniger Oligonukleotid oder Polynukleotid aufgetüpfelt. Das Tüpfeln der wässrigen Lösung erfolgt auf dem festen Träger unter Bildung mehrerer Punkte mit fast gleicher Form und Größe. Es ist wichtig, diese Punkte so herzustellen, dass sie die gleiche Form und Größe besitzen, wenn die Hybridisierung quantitativ analysiert wird. Mehrere Punkte werden getrennt voneinander mit einer Entfernung von 1,5 mm oder weniger, bevorzugt 100 bis 300 um, hergestellt. Ein Punkt besitzt bevorzugt einen Durchmesser von 50-300 um.
Nachdem die wässrige Lösung, die das Oligonukleotid oder Polynukleotid und ein hydrophiles Polymeres enthält, auf den festen Träger getüpfelt wurde, wird die getüpfelte Lösung bevorzugt inkubiert, nämlich indem sie während einer bestimmten Zeit bei Raumtemperatur oder unter Erwärmen gehalten wird, so dass das getüpfelte Oligonukleotid oder Polynukleotid an dem Träger fixiert wird. Im Laufe der Inkubation kann UV-Bestrahlung oder eine Oberflächenbehandlung unter Verwendung von Natriumborhydrid oder eines Schiffs-Reagens verwendet werden. Bevorzugt wird die UV- Bestrahlung unter Erhitzen durchgeführt. Es wird angenommen, dass diese Behandlung wirksam eine zusätzliche Bindung oder Brücke zwischen dem festen Träger und dem gebundenen Oligonukleotid oder Polynukleotid ergibt. Das freie (nämlich nichtfixierte) Oligonukleotid oder Polynukleotid wird mit einer wässrigen Lösung herausgewaschen. Der gewaschene feste Träger wird dann getrocknet, wobei ein erfindungsgemäßer DNA-Chip erhalten wird.
Der DNA-Chip wird bevorzugt zur Überwachung der Genexpression, der Sequenzierung der Basenanordnung von DNA, der Analyse der Mutation, der Analyse des Polymorphismus mittels Hybridisierung verwendet.
Ein Ziel-DNA-Fragment oder ein Proben-DNA-Fragment, das der Analyse, die die Anwesenheit eines komplementären DNA- Fragments betrifft, unterworfen wird, kann aus verschiedenen Quellen erhalten werden. Bei der Analyse von Genen ist das Ziel-DNA-Fragment aus einer Zelle oder einem Gewebe eines Eukaryoten hergestellt. Bei der Analyse des Genoms wird das Ziel-DNA-Fragment aus Geweben, außer den Erythrocyten, erhalten. Bei der Analyse von mRNA wird die Zielprobe aus Geweben erhalten, in denen mRNA exprimiert wird. Wenn der DNA-Chip ein Oligonukleotid, fixiert an einem festen Träger, enthält, besitzt das Ziel-DNA-Fragment bevorzugt ein niedriges Molekulargewicht. Die Ziel-DNA kann gemäß dem PCR-Verfahren multipliziert werden.
An das Ziel-DNA-Fragment wird eine RI-Markierung oder eine Nicht-RI-Markierung gemäß einem bekannten Verfahren gebunden. Die Nicht-RI-Markierung wird bevorzugt verwendet. Beispiele von Nicht-RI-Markierungen umfassen Fluoreszenzmarkierung, Biotinmarkierung und chemische Lumineszenzmarkierung. Die Fluoreszenzmarkierung wird am bevorzugtesten verwendet. Beispiele von Fluoreszenzmarkierungen umfassen Cyaninfarbstoffe (beispielsweise Cy3 und Cy5, die zu den Cy DyeTM gehören), Rhodamin 6G-Reagens, N-Acetoxy-N²- acetylaminofluoren (AAF) und AAIF (lodidderivat von AAF). Die Ziel- oder Proben-DNA-Fragmente, die mit unterschiedlichen Fluoreszenzindikatoren markiert sind, können gleichzeitig analysiert werden, wenn die Fluoreszenzindikatoren Fluoreszenzspektren mit unterschiedlichen Peaks besitzen.
Die Hybridisierung wird durchgeführt, indem eine wässrige Probenlösung, die das Ziel-DNA-Fragment enthält, auf einen erfindungsgemäßen DNA-Chip getüpfelt wird. Das Tüpfeln erfolgt allgemein in einer Menge von 1 bis 100 nl. Die Hybridisierung erfolgt, indem der DNA-Chip mit der getüpfelten Probenlösung darauf bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 70ºC während 6 bis 20 Stunden gehalten wird. Nach Beendigung der Hybridisierung wird der DNA-Chip mit einer wässrigen Pufferlösung, die ein grenzflächenaktives Mittel enthält, zur Entfernung des freien (nichtfixierten) Proben-DNA-Fragments gewaschen. Das grenzflächenaktive Mittel ist bevorzugt Natriumdodecylsulfonat (SDS). Die Pufferlösung kann eine Citratpufferlösung, eine Phosphatpufferlösung, eine Boratpufferlösung, eine Trispufferlösung oder eine Goods-Pufferlösung sein. Die Citratpufferlösung wird bevorzugt verwendet.
Die Hybridisierung auf dem DNA-Chip ist charakteristisch, so dass eine extrem kleine Menge der Probe oder des Ziel- DNA-Fragments der Analyse unterworfen wird. Damit die gewünschte Hybridisierung auf geeignete Weise durchgeführt werden kann, sollten optimale Bedingungen bestimmt werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1: Fixierung des PCR-Produkts

(1) Präparierung eines Objektträgers

Ein Objektträger (25 mm · 25 mm) wird eine Stunde in eine wässrige ethanolische Lösung von 50 g Natriumhydroxid in einem Gemisch aus 150 ml destilliertem Wasser und 200 ml Ethanol eingetaucht. Der Objektträger wird mit destilliertem Wasser gewaschen und dann in eine wässrige Lösung aus 10 Vol.-% Poly-L-lysin (erhältlich von Sigma Co.) eingetaucht. Der so behandelte Objektträger wird unter Verwendung einer Plättchenzentrifugiervorrichtung zentrifugiert und dann bei Raumtemperatur getrocknet. In den im Folgenden erwähnten Beispielen werden solche behandelten Objektträger verwendet.

(2) Herstellung eines PCR-Produkts (Oligonukleotid)

Ein PCR-Produkt, hergestellt aus Hefe, wurde mit einer Aminogruppe in der 5'-Stellung geschützt und mit einem Fluoreszenzindikator (FluoroLink Cy5-dCTP, erhältlich von Amasham Pharmacia Biotec Corp.) markiert.

(3) Tüpfelung der PCR-Produkt-enthaltenden Lösung

Eine wässrige Lösung des oben erhaltenen PCR-Produkts in verdünnter Pufferlösung (3 · SSC, d. h. Standardnatriumchlorid-Citratpufferlösung, 0,5 mg/ml) wurde hergestellt. Zu der wässrigen PCR-Produktlösung wurde Carboxymethylcellulose (CMC) unter Bildung einer 1 vol.-%igen CMC-Lösung gegeben. Die Lösung, die das PCR-Produkt und CMC enthielt, wurde in einer Menge von 1 nl auf einen Objektträger unter Verwendung einer Tüpfelungsvorrichtung getüpfelt. Der Objektträger wurde in ein wässriges Gemisch aus Standardlösung (0,2 · SSC) und 0,2 Gew.-% Natriumdodecylsulfat (SDS)-Lösung während 10 Minuten unter periodischem Schütteln eingetaucht. Der Objektträger wurde dann in Ethanol eingetaucht und bei Raumtemperatur getrocknet. Der so getrocknete Objektträger wurde zur Detektion der Fluoreszenzstärke gescannt. Die detektierte Fluoreszenzstärke ist in Tabelle 1 angegeben.
Das oben erwähnte Verfahren wurde unter Verwendung einer 0,5 vol.-%igen CMC-Lösung anstelle der 1 vol.-%igen CMC- Lösung wiederholt. Die detektierte Fluoreszenzstärke ist ebenfalls in Tabelle 1 angegeben.

Vergleichsbeispiel 1: Fixierung des PCR-Produkts

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, ausgenommen, dass CMC nicht zu der Lösung, die das PCR-Produkt enthielt, gegeben wurde. Die nachgewiesene Fluoreszenzstärke ist in Tabelle 1 angegeben.

Vergleichsbeispiel 2: Fixierung des PCR-Produkts

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, ausgenommen, dass Natriumhydrogencarbonat zu der wässrigen PCR- Produktlösung anstelle von CMC gegeben wurde, wobei eine 0,35 M Natriumhydrogencarbonatlösung erhalten wurde. Die detektierte Fluoreszenzstärke ist in Tabelle 1 angegeben.

Beispiel 2: Fixierung des PCR-Produkts

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, ausgenommen, dass der Objektträger, der mit der Lösung, die das PCR-Produkt und CMC (1 Vol.-% oder 0,5 Vol.-%) enthielt, in Wasser bei 80ºC 1 Stunde erhitzt wurde. Die detektierte Fluoreszenzstärke von jedem Versuch ist in Tabelle 1 angegeben.

Beispiel 3: Fixierung des PCR-Produkts

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, ausgenommen, dass der Objektträger, der mit der Lösung getüpfelt war, die das PCR-Produkt und CMC (1 Vol.-% oder 0,5 Vol.%) enthielt, in Wasser bei 80ºC 1 Stunde erhitzt wurde und dann mit einer Lösung eines Gemisches gewaschen wurde, das 315 ml 1-Methyl-2-pyrrolidon, 5 g Bernsteinsäureanhydrid und 35 ml wässrige 1 M Borsäurelösung enthielt. Die detektierte Fluoreszenzstärke von jedem Versuch ist in Tabelle 1 angegeben.

Beispiel 4: Fixierung des PCR-Produkts

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, ausgenommen, dass der Objektträger, der mit der Lösung getüpfelt war, die das PCR-Produkt und CMC (1 Vol.-% oder 0,5 Vol.-%) enthielt, in Wasser bei 80ºC 1 Stunde erhitzt wurde und dann mit ultravioletten (UV) Strahlen bei 120 mJ bestrahlt wurde. Die detektierte Fluoreszenzstärke von jedem Versuch ist in Tabelle 1 angegeben.

Beispiel 5: Fixierung des PCR-Produkts

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, ausgenommen, dass der Objektträger, der mit der Lösung getüpfelt war, die das PCR-Produkt und CMC (1 Vol.-% oder 0,5 Vol.-%) enthielt, in Wasser bei 80ºC 1 Stunde erhitzt wurde, und dann wurde der Objektträger mit ultravioletten (UV) Strahlen bei 120 mJ bestrahlt und mit einer Lösung eines Gemisches aus 315 ml 1-Methyl-2-pyrrolidon, 5 g Bernsteinsäureanhydrid und 35 ml wässrige 1 M Borsäurelösung gewaschen. Die detektierte Fluoreszenzstärke von jedem Versuch ist in Tabelle 1 angegeben.

Beispiel 6: Fixierung des PCR-Produkts

Das Verfahren von Beispiel 5 wurde wiederholt, ausgenommen, dass das PCR-Produkt, hergestellt aus Hefe, nicht mit einer Aminogruppe geschützt war. Die detektierte Fluoreszenzstärke von jedem Versuch ist in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1
Die Ergebnisse der Tabelle 1 zeigen an, dass die Einarbeitung von Carboxymethylcellulose (CMC) in eine Lösung von DNA-Fragment (d. h. PCR-Produkt) wirksam ist um das DNA- Fragment fest an den Objektträger zu fixieren. Die Aktivierung des DNA-Fragments durch Bindung einer funktionellen Gruppe, wie einer Aminogruppe, an der terminalen Stellung ist wirksam um die Fixierung des DNA-Fragments an dem Objektträger zu verstärken. Die Wärmebehandlung oder UV- Bestrahlung verstärkt die Fixierung des DNA-Fragments an dem Objektträger.

Beispiel 7: Nachweis des komplementären DNA-Fragments

(1) Herstellung des DNA-Chips

Ein PCR-Produkt wurde aus einem Genfragment von Hefe (enthaltend ungefähr 2.000 Baseneinheiten) hergestellt und mit einer Aminogruppe an seiner terminalen Position gebunden. Das Aminogruppen-enthaltende PCR-Produkt wurde in verdünnter Pufferlösung aufgelöst (3 · SSC, d. h. einer Standardnatriumchlorid-Citratpufferlösung, 0,5 mg/ml). Zu der wässrigen PCR-Produktlösung wurde ein hydrophiles Polymer (wie in Tabelle 2 angegeben) zugefügt um eine 1 vol.-%ige Lösung zu erhalten. Die Lösung, die das PCR- Produkt und ein hydrophiles Polymeres enthielt, wurde in einer Menge von 1 nl auf einen Objektträger unter Verwendung einer Tüpfelungsvorrichtung getüpfelt.
Der Objektträger, getüpfelt mit der Lösung, wurde in Wasser bei 80ºC während 1 Stunde erhitzt, und der erhitzte Objektträger wurde mit Ultraviolettstrahlen (UV) bei 120 mJ bestrahlt und dann mit einer Lösung aus einem Gemisch aus 315 ml 1-Methyl-2-pyrrolidon, 5 g Bernsteinsäureanhydrid und 35 ml wässrige 1 M Borsäurelösung gewaschen.
Der Objektträger wurde in eine wässrige Natriumbromidlösung 10 Minuten unter periodischem Schütteln eingetaucht. Der Objektträger wurde dann in Ethanol eingetaucht und bei Raumtemperatur unter Bildung eines erfindungsgemäßen DNA- Chips getrocknet.

(2) Herstellung eines markierten DNA-Fragments

mRNA, extrahiert aus Hefe, wurde der Umkehrtranskription unterworfen, und an das gebildete DNA-Fragment (cDNA- Fragment) wurde dCTP mit einer Cy5-Markierung gebunden. Es wurde so ein markiertes cDNA-Fragment erhalten.

(3) Hybridisierung

Das oben erhaltene cDNA-Fragment (1 mM) wurde in 20 ul Hybridisierungslösung (Gemisch aus 4 · SSC und 10 gew.-%iger SDS-Lösung) dispergiert. Die cDNA-Fragmentlösung wurde auf einen DNA-Chip getüpfelt, und die cDNA-Lösung, getüpfelt auf einen DNA-Chip, wurde in einer Feuchtigkeitskammer bei 60ºC 20 Stunden inkubiert. Der inkubierte Chip wurde in ein Gemisch aus wässriger 0,1 gew.-%iger SDS-Lösung und Standardlösung (2 · SSC) eingetaucht. Der so behandelte Chip wurde nacheinander mit einem Gemisch aus wässriger 0,1 gew.-%iger SDS-Lösung und einer Standardlösung (2 · SSC), einem Gemisch aus einer wässrigen 0,1 gew.-%igen SDS-Lösung und einer Standardlösung (0,2 · SSC) und einer Standardlösung (0,2 · SSC) gewaschen. Der gewaschene Chip wurde bei 600 Upm 20 sek zentrifugiert und dann bei Raumtemperatur getrocknet.
Der getrocknete Objektträger wurde zur Detektion der Fluoreszenzstärke gescannt. Die detektierte Fluoreszenzstärke wurde durch die Hintergrundfluoreszenzstärke verringert, die beobachtet wurde, wenn eine Probenlösung, die kein Fluoreszenz-markiertes DNA-Fragment enthielt, in gleicher Weise getüpfelt und behandelt wurde. Die so erhaltene Fluoreszenzstärke ist in Tabelle 2, ausgedrückt als relativer Wert, angegeben, wobei der relative Wert als Wert angegeben ist, der relativ zu der Fluoreszenzstärke, nachgewiesen auf dem DNA-Chip, erhalten wurde, welche auf gleiche Weise behandelt wurde, wobei keine hydrophile Lösung verwendet wurde.

Tabelle 2

Hydrophiles Polymeres / Fluoreszenzstärke
Keins 1
Poly-(1,4-diazoniabicyclo[2.2.2]octan-1,4- diylmethylen-1,4-phenylenmethylenchlorid) 20
Polyacrylamid 10
Polyethylenglykol (M.W.: 4.000) 10
Polyethylenglykol (M.W.: 20.000) 2
Polyacrylsäure 6
Carboxymethylcellulose (CMC) 5
Albumin 4
Trehalose 1,5
Polyvinylbenzolsulfonat 1,5

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines DNA-Chips, umfassend einen festen Träger und ein Oligonukleotid oder Polynukleotid, welches an den Träger fixiert ist, das umfasst Auftüpfeln einer wässrigen Lösung, enthaltend das Oligonukleotid oder Polynukleotid, und ein hydrophiles Polymeres, darin gelöst, zur Fixierung des Oligonukleotids oder des Polynukleotids auf den Träger unter Zuhilfenahme des hydrophilen Polymeren, Waschen des getüpfelten. Trägers und Trocknen des gewaschenen Trägers.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Oligonukleotid oder Polynukleotid an den festen Träger an einem seiner Endteile fixiert ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der feste Träger eine Glasplatte, eine Siliciumfolie oder eine Polymerfolie ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der feste Träger eine Glasplatte ist, die mit Poly-L-lysin, Polyethylenimin oder Polyalkylamin vorbehandelt wurde.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der feste Träger eine Glasplatte ist, die mit einem Silan-Kupplungsmittel, das eine Aminogruppe, eine Aldehydgruppe oder eine Epoxygruppe hat vorbehandelt wurde.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Oligonukleotid oder Polynukleotid eine funktionelle Gruppe aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Aminogruppe, einer Aldehydgruppe, einer Thiolgruppe und einer Biotingruppe.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das hydrophile Polymere ein nichtionisches Polymeres oder ein kationisches Polymeres ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das hydrophile Polymere ein Cellulosederivat ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das hydrophile Polymere ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Polyacrylamid, Polyethylenglykol, Polyvinylalköhöl und Saccharid.

10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das hydrophile Polymere ein Molekulargewicht von 10³ bis 10&sup6; besitzt.

11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die wässrige Lösung das hydrophile Polymere in einer Menge von 0,1 bis 2 Vol.-% enthält.

12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der getüpfelte Träger vor dem Waschen erwärmt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der getüpfelte Träger vor dem Waschen UV-Bestrahlung unterworfen wird.