DE68924591T2

DE68924591T2 - DNS-Nachweis unter Verwendung ladungsneutraler Probenstränge.

Info

Publication number: DE68924591T2
Application number: DE68924591T
Authority: DE
Inventors: Joseph Eugene Celebuski
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1989-08-01
Filing date: 1989-08-03
Publication date: 1996-05-15
Anticipated expiration: 2009-08-04
Also published as: JPH0383600A; EP0411186B1; ES2080737T3; DE68924591D1; JP2912385B2; EP0411186A1; CA1337639C

Description

DNA-SONDENASSAYS DIE NEUTRAL GELADENE SONDENSTRÄNGE VERWENDEN

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Assays, die markierte Sondenstränge aus DNA verwenden, die zu den DNA-Strängen in einer Probe komplementär sind, um die Anwesenheit der DNA in der Probe zu bestimmen, in dem eine Analyse auf die markierten Sondenstränge durchgeführt wird.
DNA-Sondenassays umfassen typischerweise die Analyse auf eine oder mehrere Kopien eines ersten Oligonucleotidstranges in einer Probe, indem mehrere zweite Oligonucleotidstränge eingebracht werden, die zu dem ersten Strang oder zu den ersten Strängen komplementär sind, so daß sie mit den ersten Strängen hybridisieren, wenn die ersten Stränge in der Probe vorhanden sind. Die zweiten Stränge sind markierte (z. B. mit Phosphor-32, chemilumineszenten Verbindungen, wie Acridinen und Luminolen, mit fluoreszenten Verbindungen wie Fluorescein und Rhodamin, mit Biotin und mit Enzymen, wie alkalischer Phosphatase und saurer Phosphatase und mit Liposomen, die solche Markierungen enthalten) so daß sie in der Probe nachgewiesen werden können.
In der Vergangenheit war bei den DNA-Sondenassays die Abtrennung der hybridisierten Sondenstränge von den unhybridisierten Sondensträngen ein Problem. Ein Abtrennungsverfahren, daß auf den Größenunterschieden zwischen Sonde, Zielmolekül und Sonden-Zielmolekül-Duplex beruht, arbeitet, aber die verwendeten Verfahren sind ermüdend und schwierig zu automatisieren. Beispielsweise ist ein Southern Blot Assay [Southern, Journal Molecular Biology, 98: Seite 503- 517 (1975)] schwierig zu automatisieren. Ein anderes Assay, daß die Abtrennung aufgrund der Größe anwendet, ist das Abbott Laboratories Genostics Assay für den Hepatitis-B-Virus. In dem Genostics Assay wird native HB-DNA an Jod-125-markierte Sonde hybridisiert. Der DNA-Sonden-Hybrid wird dann durch eine Siebchromatographiesäule laufen lassen, wobei genügend Eluentenvolumen zugegeben wird, daß allein der Hybrid in Lösung in einem Kolben aufgefangen wird. Der Kolben wird dann nach Standardverfahren auf das Radioisotop hin untersucht. Obwohl dieses Verfahren gut arbeitet, muß dennoch ein Techniker den Test durchführen. Außerdem kann man das Verfahren nicht automatisieren. Es wurde nur eine geringe Anzahl zufriedenstellender Lösungen für das Auftrennungsproblem in automatisierten Systemen vorgeschlagen.
Als interessierende Hintergrundinformation für die vorliegende Erfindung offenbart das US Patent Nr. 4 469 863 nichtionische R-stereoisomere Nucleinsäurealkyl- und Arylphosphonate und ihre Verwendung bei der Hemmung des Wachstums von Tumorzellen oder bei der Replikation von Viren in infizierten Zellen. Als weiterer technischer Hintergrund offenbart EP-A-0 281 390 polykationische Träger für die Reinigung von Nucleinsäuren, die Trennung und die Hybridisierung.

Zusammenfassung der Erfindung

Das DNA-Sondenassay der vorliegenden Erfindung liefert Sondenstränge, die die einfache Abtrennung der hybridisierten von den nicht hybridisierten Sondensträngen erlauben. Mit einer geeigneten Markierung kann daher das DNA-Sondenassay der vorliegenden Erfindung einfach an die Durchführung unter Verwendung von automatisierten Ausrüstungen angepaßt werden.
Das Assay der vorliegenden Erfindung vermag eine erste Oligonucleotidsequenz in einer Probe nachzuweisen, indem in die Probe eine zweite Sondenoligonucleotidsequenz eingebracht wird, die zu der ersten Oligonucleotidsequenz komplementär ist. Die zweite Oligonucleotidsequenz besteht aus neutral geladenen Nucleotiden, so daß die erste und zweite Sequenz hybridisieren. Alle unhybridisierten Sondenstränge können von den hybridisierten Sondensträngen abgetrennt werden, indem die Probe einfach mit einer positiv geladenen festen Phase in Kontakt gebracht wird, gefolgt von einem Waschschritt. Die erste Oligonucleotidsequenz enthält eine intrinsische negative Ladung aufgrund der P=O Gruppe in jedem der Nucleotide, die der erste Oligonucleotidstrang in der Probe umfaßt. Die negativen Gruppen werden auf der positiv geladenen festen Phase zurückgehalten, wodurch die hybridisierten Sondenstränge an der festen Phase ebenfalls zurückgehalten werden. Die unhybridisierten, neutral geladenen Sondenstränge werden nicht von der festen Phase zurückgehalten. Dem gemäß kann bei einer geeigneten Markierung am Sondenstrang die Menge oder Anwesenheit der ersten Oligonucleotidsequenz in der Probe durch Analyse der festen Phase oder der unhybridisierten Sondenstränge auf die Anwesenheit der Markierung untersucht werden.
Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Sondenstränge durch Synthese des Sondenstranges aus Alkylphosphonatnucleotiden neutral geladen gemacht, wodurch die geladene P=O Gruppe aus dem Sondenstrang ausgeschlossen wird. Vorzugsweise sind die Alkylphosphonatnucleotide enantiomerenrein, um im wesentlichen nur die R-Stereoisomere eines jeden Nukleotides zu verwenden. Es ist festgestellt worden, daß Mischungen der R- und S-Stereoisomere (racemische Mischungen) an die erste Oligonucleotidsquenz in der Probe nicht so gut wie die enantiomerenreinen Sondenstränge hybridisieren.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Die Figur zeigt verschiedene Verbindungen, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung hergestellt worden sind.

EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung umfaßt die Verwendung von neutral geladenen DNA-Sondensträngen in einem DNA-Sondenassay, wo die Sondenstränge an eine Oligonucleotidsequenz hybridisieren, die in einer zu testenden Probe vorhanden ist. Die DNA in Blutproben, in Bakterien oder in anderen Körperflüssigkeiten besteht normalerweise aus Nucleotiden, die eine geladene P=O Gruppe aufweisen, was dem DNA-Strang und der Probe eine übergreifende negative Ladung erteilt. Wenn der ungeladene Sondenstrang mit der geladenen Oligonucleotidsequenz in der Probe hybridisiert, weist der hybridisierte DNA-Strang ebenfalls eine übergreifende negative Ladung auf. Daher können die hybridisierten Stränge von den unhybridisierten Sondensträngen dadurch abgetrennt werden, daß die Probe, die sowohl die hybridisierten als auch die unhybridisierten Sondenstränge enthält, mit einer positiv geladenen festen Phase in Kontakt gebracht wird. Die negativ geladenen hybridisierten Stränge sammeln sich an der positiv geladenen festen Phase an, aber die ungeladenen unhybridisierten Sondenstränge tun dies nicht. Nach dem Stand der Technik ist es eine einfache Aufgabe, die feste Phase, die die hybridisierten Sondenstränge enthält, von der flüssigen Phase, die die unhybridisierten Sondenstränge enthält, abzutrennen, und die Anwesenheit oder Menge der zu bestimmenden Oligonucleotidsequenz in der Probe kann entweder durch Messen der Menge an hybridisiertem Sondenstrang auf der festen Phase oder durch Messung des unhybridisierten Sondenstranges in der flüssigen Phase erfaßt werden. Bei der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Proteinase K zu der Probe hinzugegeben, die die Ziel-DNA enthält, bevor die Sondenstränge eingebracht werden, damit die Proteine, die unter Umständen vorhanden sind, hydrolysiert werden.

NEUTRAL GELADENE OLIGONUCLEOTIDE

Die neutral geladenen Oligonucleotide, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind vorzugsweise Alkylphosphonatnucleotide, bei denen die normale negativ geladene P=O Gruppe in den Basen durch eine alkylierte Phosphonatgruppe ersetzt ist. Die Alkylphosphonate, die verwendet werden können, umfassen Methylphosphonat, Ethylphosphonat, Methylthiophosphonat und Methoxyphosphonat. Die Nucleotide, an die obige Alkylphosphonate in der 3'-Position angehängt werden können, umfassen Thymidin, Guanidin, Adenosin, Cytidin, 5-Aminoallyluridin.
Bei der Verwendung alkylierter Phosphonatnucleotide, um die Sondenstränge "neutral geladen" zu machen, ist es nicht notwendig, die Sondenstränge zu 100% aus Alkylphosphonatnucleotiden zu synthetisieren. Solange der Sondenstrang aus einem ausreichenden Prozentsatz an "neutral geladenen" Nukleotiden synthetisiert wurde, so daß die unhybridisierten Sondenstränge entweder die positiv geladene feste Phase passieren oder von dieser heruntergewaschen werden können, während die hybridisierten Sondenstränge auf der festen Phase verbleiben, kann der Sondenstrang als "im wesentlichen neutral geladen" im Sinne des Schutzumfanges der vorliegenden Erfindung betrachtet werden. Man nimmt an, daß der Sondenstrang wenigstens ungefähr 75 Prozent an neutralgeladenen Nucleotiden enthalten sollte.
Es ist festgestellt worden, daß bei der Synthese alkylierter Phosphonatnukleotide an jedem Phosphor ein chirales Zentrum erzeugt wird. Es ist vorzuziehen, die R- und S- Stereoisomere der Nucleotide voneinander zu trennen und die Sondenstränge allein aus den R-stereoisomeren Nucleotiden zu synthetisieren. Es ist festgestellt worden, daß die R- Stereisomerenucleotide leichter an die Zieloligonucleotidsequenzen in der Probe hybridisieren, als dies Sondenstränge aus S-Stereoisomeren oder aus Racematen tun. Die Trennung der R- von den S-Stereoisomeren ist im Beispiel 1 unten beschrieben. Andere Verfahren, die angewendet werden können, um neutral geladene Oligonucleotide zu erhalten, umfassen die Herstellung enantiomerenreiner alpha-P-Alkyl- Nucleotidtriphosphate der vier Hauptnucleotidtriphosphate und dann den enzymatischen Einbau dieser Basen in eine Sonde, unter Verwendung von DNA-Polymerasen.

FESTE PHASEN

Die vorliegende Erdindung verwendet Festphasenmaterialien, die positiv geladen sind. Das Festphasenmaterial kann aufgrund seiner intrinsischen Fahigkeit zur Anziehung negativ geladener hybridisierter Sondenstränge ausgewählt werden. Zum Beispiel, weisen methylierte Wolle, Nylons und gewisse Gläser intrinsische positive Ladungen auf. Alternativ kann eine positiv geladene Substanz auf das Festphasenmaterial aufgezogen oder an diese konjugiert werden. Das Festphasenmaterial kann offensichlich alle der porösen Materialien umfassen, die in der Technik bekannt sind, durch welche Flüssigkeiten abfließen, und durch die Flüssigkeiten leicht hindurchfließen können. Zum Beispiel kann das Festphasenmaterial folgende Stoffe umfassen 1) Glasfaser, Zellulose oder Nylonbäusche zur Verwendung in einer Durchflußassayvorrichtung, die ein oder mehrere Schichten aufweist, welche ein oder mehrere Asssayreagenzien enthalten; 2) ein Tauchstäbchen für ein Eintauch- und Ableseassay; oder 3) einen Streifen für chromatographische (z. B. Papier) oder dünnschichtchromatographische (z. B. Nitrozellulose) Verfahren, bei denen eines oder alle Reagenzien in getrennten Bereichen auf einem einzelnen Streifen aus Festphasenmaterial enthalten sind. Das Festphasenmaterial ist jedoch nicht auf poröses Material beschränkt. Das Festphasenmaterial kann Perlen, magnetische Perlen, Latexpartikel, ein Reagenzglas aus Glas oder jegliches andere Material umfassen, das eine intrinsische positive Ladung aufweist, oder das eine positiv geladene Substanz zurückzuhalten vermag.
Natürliche, synthetische oder natürlich vorkommende Materialien, die synthetisch abgewandelt sind, können als Festphasenmaterial verwendet werden. Solche Materialien umfassen Polysaccharide; z. B. Zellulosematerialien, wie Papier und Zellulosederivate einschließlich Zelluloseacetat und Nitrozellulose, Silica, anorganische Materialien wie deaktiviertes Aluminiumoxid, Diatomeenerde, Magnesiumsulfat oder andere anorganische fein verteilte Materialien, die einheitlich in einer porösen Polymermatrix verteilt sind, wobei ein Polymer wie Vinylchlorid, Vinylchlorid-Propylen-Copolymer und Vinylchlorid-Vinylacetat-Copolymer; Stoff, sowohl natürlich vorkommender (z. B. Baumwolle), als auch synthetischer (z. B. Nylon); Gele, wie Silicagel, Agarose, Dextran und Gelatine; Polymerfilme wie Polyacrylamid und dergleichen verwendet werden können.
Bevorzugte Festphasenmaterialien umfassen poröse Glasfasermaterialien wie ein Whatman 934-AH Filterpapier, das eine nominale Dicke von 0,33mm aufweist oder andere Fasermatrix- Vorrichtungen. Die Dicke des Materials ist nicht ausschlaggebend und steht zur Wahl, im wesentlichen beruhend auf den Eigenschaften der Probe oder des Analyten, die/der untersucht wird, wie beispielsweise der Fluidität der Testprobe.
Um die intrinsische Ladung des Festphasenmaterials zu verändern oder zu verstärken, kann eine positiv geladene Substanz direkt auf das Material oder auf Mikropartikel aufgezogen werden, welche von einer festen Phase zurückgehalten werden. Alternativ können Mikropartikel allein als das geladene Festphasenmaterial verwendet werden. Eine mögliche geladene Substanz ist ein polymeres Kation, das von dem Festphasenmaterial zurückgehalten wird, und das die negativ geladenen hybridisierten Sondenstränge über die Anziehung entgegengesetzter Ladungen anzieht und zurückhält. Eine große Anzahl geeigneter Polykationen sind verfügbar, einschließlich quaternärer Ammoniumsalze wie GafQuat , GAF Corporation, Wayne, New Jersey 07470, CelQuat L-200 und CelQuat H-100 (National Starch and Chemical Corporation, Bridgewater, New Jersey 08807).
Die geladene Substanz kann auf die Partikel (z. B. Perlen oder Mikropartikel) aufgezogen werden. Diese Partikel dienen als feste Phase, indem sie in einer Säule zurückgehalten werden, oder in einer Mischung aus löslichen Reagenzien und der Testprobe supendiert werden, oder aber die Partikel selbst können von einem Festphasenmaterial zurückgehalten und immobilisiert werden. Mit "zurückgehalten und immobilisiert" ist gemeint, daß die Partikel, die sich auf dem Festphasenmaterial befinden, zu keiner wesentlichen Bewegung zu anderen Stellen innerhalb des Materials hin befähigt sind. Diese Partikel können vom Fachmann aus jeglicher Form geeigneten Partikelmaterials ausgewählt werden, das aus Polystyrol, Polymethylacrylat, Polypropylen, Latex, Polytetrafluorethylen, Polyacrylnitril, Polycarbonat oder ähnlichen Materialien zusammengesetzt ist. Die Größe der Patikel ist nicht ausschlaggebend, obwohl vorzuziehen ist, daß der mittlere Durchmesser der Partikel geringer als der mittlere Porendurchmesser des Festphasenmaterials ist, das eingesetzt wird.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele zeigen die bevorzugten Durchführungsweisen für DNA-Sondenassays gemäß der vorliegenden Erfindung. Die Beispiele sind jedoch nur für veranschaulichende Zwecke gedacht und können nicht derart ausgelegt werden, daß sie den Schutzumfang der Erfindung einschränken, da der Schutzumfang allein durch die beigefügten Ansprüche bestimmt wird.

BEISPIEL 1

Enantiomerenreine 3'-Methylphosphonat-substituierte Nucleotide wurden nach dem Verfahren von Lesnikowski, Wolkanin, und Stec, Tetrahedron Letters 28 5535-8 (1987) hergestellt. Das Verfahren zur Synthese von 1 und 2, den Sp-und Rp Enantiomeren von 5'-O-Monomethoxytritylthymidin-3'-O-(O-(4- nitrophenyl)methanphosphonat) ist wie folgt Das 5'-MMT-N-4- Benzoyladenosin, 5'-MMT-N-4-Benzoylcytidin, und das 5'-MMT-N-2- Isobutylguanidinmethylphosphonatderivat werden auf ähnliche Weise hergestellt. Zu einer Lösung von MeP(O)Cl&sub2; (200mg) in Pyridin (6ml) unter Argonatmosphäre in einem flammengetrockneten Kolben wird eine Lösung von Monomethoxytritylthymidin (257,7mg) in Pyridin (3ml) bei Raumtemperatur im Verlauf von 45 Minuten zugesetzt. Die Mischung wurde nach Vervollständigung der Zugabe noch eine Stunde länger gerührt, dann wurde 4-Nitrophenol (627mg) auf einmal zugesetzt. Nach einstündigem Rühren wurde die Reaktion mit 50%ig wässerigem Pyridin (2ml) gelöscht. Nach der Zugabe von gesättigter NaHCO&sub3; (90ml) wurde die Emulsion mit 2 x 100ml CHCl&sub3; extahiert. Die Chloroformextrakte wurden über MgSO&sub4; getrocknet, abfiltriert, eingedampft und vakuumgetrocknet. Der Rückstand wurde in 1%ig MeOH in CHCl&sub3; (6ml) aufgelöst, und die Lösung wurde auf eine Flash-Chromatographiesäule aufgebracht, die mit demselben Lösungsmittel gepackt worden war. Die Verbindungen wurden unter Verwendung eines 1-8%igen Gradienten von MeOH in CHCl&sub3; eluiert. Die UV aktiven Banden, die Rf-Werte zwischen 0,6 und 0,53 in 95:5 CHCL&sub3; : MeOH auf Silicagel aufwiesen, ergaben 85,9mg an Verbindung 1 (in der beigefügten Figur gezeigt), beziehungsweise 91mg an 2 (siehe Figur).

BEISPIEL 2

Die enantiomerenreine Verbindung 2, die in Beispiel 1 hergestellt worden war, wurde mit 3'-Acetoxythymidin 3 auf dieselbe Weise wie folgt kondensiert, wie dies von Lesnikowski, Wolkanin and Stec. (oben) angegeben ist. Das Oligomere 5'- TT*T*T*T*T-3', in dem der Stern eine enantiomerenreine 3'-bis 5'-Methylphosphonatbindung bedeutet, wurde über ein schrittweises Verfahren hergestellt, das aufeinander abfolgende Kondensationen von 2 an die wachsende Oligonucleotidkette in der 5'-Richtung umfaßt. Die Endkondensation zum Erhalt der normalen Phosphodiesterbindung wurde mit 5'-Acetoxythymidin-3'-Phosphat, DCC und Tetrazol durchgeführt. Zu einer Lösung von 3'- Acetoxythymidin (16,6mg) in THF (7ml) wurde unter Argonatmosphäre bei 0º C 2,0M t-BuMgCl in THF (30ul) über eine Spritze zugesetzt. Innerhalb von 15 Minuten erschien ein weißer Niederschlag. Die Suspension wrude bei 0º C 30 Minuten lang gerührt, dann wurde die Verbindung 2 (32mg), gelöst in THF (3ml), zugesetzt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde lang gerührt, dann wurde DMF (100ul) zugegeben. Die Mischung wurde insgesamt 19 Stunden lang gerührt. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde vakuumgetrocknet. Das Material wurde in 0,8%ig MeOH in CHCl&sub3; aufgenommen. Es wurde eine Flash-Chromatographie des Materials durchgeführt, indem ein schrittweiser Gradient von 250ml an je 0,8%, 2%, 4%, 6%, und 8% MeOH in CHCl&sub3; eingesetzt wurde. Das Produkt 4 eluierte bei 6% MeOH in CHCl&sub3; und wies einen Rf-Wert von 0,32 in 95:5 CHCl&sub3; : MeOH auf. Die Monomethoxytritylgruppe wurde vom 5'-Ende des Addukts unter Verwendung von 2% Toluolsulfonsäure in 7:3 CHCl&sub3;:MeOH entfernt, was 5 ergab. Verbindung 5 wurde dann zur Kettenverlängerung eingesetzt, indem die 5'-OH Position mit t-BuMgCl deprotniert wurde und das resultierende Anion mit einem anderen Äquivalent an 2 umgesetzt wurde.

BEISPIEL 3

Die Vorschrift für die Beschichtung mit kationischem Quat für Glasfaserfilterscheiben, die bei dem Ioneneinfangassay eingesetzt wurde, das in Beispiel 4 beschrieben ist, ist unten eingehend aufgeführt. Zehn feine Whatman Glasfaserfilterscheiben (2,5cm ID) wurden in 10ml einer 25mg/ml Lösung von Celquat L- 200 (National Starch & Chemical Corp., Ansatz 10, Herstellungstag 5-3-82) in Wasser 2½ Stunden lang gesättigt. Dann wurde die Celquat Lösung abgegossen und jede Scheibe wurde mit 10 x 20ml destilliertem Wasser gewaschen. Zur Überprüfung der Wirksamkeit der Anioneneinfangfähigkeit bei Verwendung dieser kationischen Filter wurde das folgende Kontrollexperiment durchgeführt. Eine Probe (0,5pmol) des 16-meren M13 Hybridisierungssondenprimers 5'-dCACAATTCCACACAAC-3' (New England Biolabs Nr. 1202, Ansatz 14-15) wurde einer Kinasebehandlung mit T4 Polynucleotidkinase und γ³²P ATP (2,5pmol) unterzogen. Die radioaktive DNA wurde auf 500ul verdünnt, und sie wurde in dreifachen Anteilen auf sechs 1cm ID Filterscheibchen aufgebracht. Drei Scheibchen waren mit Celquat L-200 quat behandelt worden, während die verbleibenden drei Scheibchen nicht mit Quat behandelt worden waren. Die Scheibchen wurden mit 1ml von 100mM NaCl/10mM TRIS/1mM EDTA pH 8,0 Puffer (STE) gewaschen. Die Filter wurden in einem Szintillationszähler auf Radioaktivität untersucht. Die quat-behandelten Filter hielten 71% der gesamten radioaktiven Impulse zurück, während die Kontrollfilter 7% der radioaktiven Zählimpulse zurückhielten. Daher fangen quatbehandelte kationische Glasfaserfilter Polyanionen wie DNA im Vergleich mit nicht-quatbehandelten Glasfaserfiltern ein und halten diese zurück. Daher kann unter Verwendung dieses ionischen Einfangverfahrens ein Assay auf DNA durchgeführt werden.

BEISPIEL 4

Das Oligomere 3, 5'-TT*T*T*T*T-3', in dem T* eine Mep(O) Bindung mit R-Stereochemie in 3'- zu 5'-Richtung anzeigt, wurde mit T4 Polynucleotidkinase und γ-³²P ATP behandelt, um das 5'-Ende des Oligonucleotides mit ³²P zu markieren. Die endständig markierte Sonde 3 wurde dann an pd(A)&sub2;&sub0; (Pharmacia, Ansatz 00088472) bei 55º C eine Stunde lang hybridisiert. Gab man den Duplex auf eine quat-behandelte Filterscheibe nach Beispiel 3 auf, und wusch man mit STE Puffer (1ml), so verblieb das meiste der radioaktiven Impulse auf dem Filterscheibchen, wie mittels Scintillationszählung festgestellt wurde. Dies zeigte an, daß die Hybridisierung stattgefunden hatte. Daher kann eine markierte neutrale Sonde mit dieser Assayanordnung nachgewiesen werden, indem im wesentlichen die Ziel-DNA zur Bindung der neutralen Sonde an das Filter verwendet wird. Beim Kontrollexperiment wurde das oligomere 3 mit γ-³²P ATP und T4 Polynucleotidkinase kinasebehandelt, und die radioaktive Sonde wurde auf quat-behandelte Filterscheibchen aufgegeben. Nach dem Auswaschen mit 1ml STE konnte weniger als 1% der gesamten radioaktiven Impulse, die von der markierten neutralen Sonde ausgingen, auf dem Filterscheibchen festgestellt werden.

Beispiel 5

Ein Synthese und ein Reinigungsschema für eine racemische Methylphosphonat-Neutral-Sonde ist in diesem Beispiel beschrieben. Der komplementäre Strang zu dem M13 17-meren GT*C*A*T*A*G*C*T*G*T*T*T*C*C*T*G* 6, in dem "*" eine racemische MeP(O) Bindung zwischen dem 5'- und dem 3'-Ende aneinander angrenzender Basen anzeigt, wurde auf einem Applied Biosystems DNA Synthesizer unter Verwendung der geeigneten Methylphosphoramidite synthetisiert. Das Trityl-tragende neutrale Oligonucleotid wurde mittels Umkehrphasen-HPLC gereinigt, und dann wurde die Tritylgruppe mittels 80%iger wässeriger Essigsäure (300ul) enfernt. Die Trityl-befreite neutrale Sonde wurde durch Gel-Elektophorese (50mM Histidin, pH 7,6, 300V) gereinigt. Die Sonde 6 wurde dann am 5'-Ende unter Verwendung von ³²P ATP (Amersham) und Polynucleotidkinase (Pharmacia) bei 37º C 30 Minuten lang markiert. Die Probe wurde in 50%igem Formamid (500ul) wieder hergestellt, und wurde in 10ul-Anteilen auf Celquat L-200 behandelte Filter von 1cm ID aufgegeben. Nach 30 Sekunden wurden die Filter mit STE Puffer (1ml) gewaschen. Die Scintillationszählung der Filter zeigte an, daß 0,97% der Gesamtradioaktivität auf den Filterscheibchen verbleibt.

Beispiel 6

Annähernd neutrale DNA-Sonde 6 wurde zur Untersuchung auf M13 DNA mit der Ioneneinfanganordnung dieser Erfindung eingesetzt. Einzelsträngige Ziel-DNA als Schablone (Mßmp18, New England Biolabs 404C) und Kontroll-DNA ( X 174, BRL, 52645A) wurden in 3M Phosphat, pH 6,8, verdünnt, um End-DNA- Konzentrationen von 15pmol in 25ul Lösung zu erhalten. Dann wurden Lösungen der kinase-behandelten Sonde 6 zu den DNA- Anteilen zugesetzt. Die Lösungen wurden dann 5 Minuten gekocht und dann wurden sie auf 47º C gekühlt. Auf eine fünfstündige Inkubation folgte ein abkühlendes Löschen in Eiswasser, bevor die Behandlung der einzelnen Proben einsetzte. Die Hybridisierungslösungen wurden auf 1cm ID Celquat L-200 behandelte Glasfaserscheibchen aufgebracht, und diese wurden mit 1ml STE, pH 7,8, enthaltend 0,02% NaN&sub3; gewaschen. Die Scheibchen wurden dann auf verbleibende Radioaktivität in einem Scintillationszähler untersucht. Es wurde festgestellt, daß die Impulse auf dem Filter mit Sonde 6/M13 um 30% höher waren als jene auf dem Filter mit der Sonde 6 allein. Dieses Ergebnis zeigt an, daß Ziel-DNA jeglicher Sequenz untersucht werden kann, indem die geeignete racemische Methylphosphonatsonde bei einer Ioneneinfanganordnung eingesetzt wird.

Beispiel 7

Fast-neutrale Sonde 6 (Beispiel 5) kann zur Analyse auf M13 DNA bei einer Ioneneinfanganordnung dieser Erfindung verwendet werden. Einzelsträngige Ziel-DNA als Schablone (M13mp18, N.E. Biolabs) und Kontroll-DNA ( X174, Bethesda Research Labs.) werden in Puffer (30mM NaCl, 10mM TRIS, 10mM MgCl&sub2;, pH 8,0) verdünnt, um DNA-End-Konzentrationen von 1 bis 100 pmol in 25ul Lösung zu ergeben. Kinasebehandelte Lösungen von 6 werden zu den DNA-Anteilen hinzugegeben, bis ein Endvolumen von 50ul erreicht wird. Die Lösungen werden zwei Minuten gekocht, und dann auf 45º C abgekühlt. Auf die 16-stündige Inkubation folgt eine löschende Abkühlung in Eiswasser. Die Hybridisierungslösungen werden in einzelne Vertiefungen einer 96iger Vertiefungs-Mikrotiterplatte eingebracht, deren Vertiefungen mit 0,1%ig Polylysin (100-mer, Sigma, St. Louis, MO) beschichtet sind. Die Hybridisierungsmischungen werden in den Vertiefungen 30 Minuten lang bei 22º C inkubiert, dann wird die Mikrotiterplatte mit Puffer gewaschen. Die Vertiefungen können aufgetrennt werden und mittels Flüssigscintillationszählung auf Radioaktivität hin untersucht werden, um festzustellen, ob Ziel-DNA eingefangen wurde.

Beispiel 8

Fast-neutrale DNA-Sonde 6 kann verwendet werden, um eine Analyse auf M13 DNA im wesentlichen wie in Beispiel 7 beschrieben durchzuführen. Die Sonde ist nicht Kinase-behandelt, jedoch ist sie unter Anwendung von Standardverfahren an alkalische Phosphatase konjugiert. Die Verdünnungs- und Hybridisierungspuffer enthielten 0,1%ig BSA. Die Sonde- Schablone-Mischung wird vor der Hybridisierung nicht gekocht, sondern sie wird im wesentlichen 16 Stunden bei 45º C inkubiert. Die Lösungen werden in behandelte Mikrotiterplatten eingegeben, inkubiert und gewaschen, wie dies in Beispiel 7 beschrieben ist. Anstatt daß die Vertiefungen aufgetrennt werden und die Radioaktivität ausgezählt wird, wird zu jeder Vertiefung auf der intakten Platte eine Lösung zugesetzt, die Dinitrophenylphosphat enthält. Nach 15-minütiger Inkubation bei 22º C wird ein Äquivalent 1M H&sub2;SO&sub4; zugesetzt, und die Farbe in jeder Vertiefung kann spektrophotometrisch bestimmt werden, um festzustellen ob Ziel-DNA eingefangen wurde.

Beispiel 9

Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung in einer Kitanordnung. Die Serumprobe, die die interessierende DNA enthält, wird zunächst mit Proteinase K lysiert, um die polyanionischen Proteine zu zerstören, die mit der DNA um die Bindungszentren auf dem kationischen Glasfaserfilter konkurieren können. Dann wird die markierte neutrale Sonde zugesetzt. Nachdem die Hybridisierung an die Sonde abgeschlossen ist, wird die Probe durch ein kationisch geladenes Filter laufen lassen. Das Filter wird dann mit STE gewaschen. Nach der Filtration kann unter Verwendung geeigneter Verfahren auf die Anwesenheit markierter DNA-Sonde auf dem Filter getestet werden. Wenn Lösungsphasenassays gewünscht sind, kann man den filterscheibchengebundenen DNA-Sondenduplex mit 2M wässerigem Piperidin behandeln, gefolgt von einem zusätzlichen Waschschritt. Die Piperidinbehandlung spaltet das neutrale Sondengerüst, und der Waschschritt ergibt eine Lösung der Markierung.

Beispiel 10

Dieses Beispiel zeigt die Details der Synthese von Nucleotidtriphosphaten, die eine chirale Methylphosphonatgruppe an dem alpha-Phospha des Triphosphates aufweisen. Die Behandlung der notwendigen vier chiralen P-Methyltriphosphate mit DNA- Polymerase in Anwesenheit einer Schablone lieferte die komplementären Sondenstänge, die ein chirales Methylphosphonatgerüst aufwiesen. Die Synthesen der alpha PS- und PR-Methylthymidintriphosphate wird beschrieben. Die Synthesen von alpha PS- und PR-Methyl-ATP, -CTP, und -GTP wurden auf die gleiche Art und Weise durchgeführt. Zu einer 1M Lösung von 3'-O- Acetylthymidin in Pyridin wurden 3,0 Äquivalente an MeP(O)Cl&sub2; zugesetzt. Nach eineinhalb Stunden des Rührens bei Raumtemperatur wurden 9,0 Äquivalente 4-Nitrophenol zugesetzt. Die R- und S- Enantiomeren wurden mittels HPLC an einer Silicagelsäure unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0,5 bis 10%ig MeOH in CHCl&sub3; aufgetrennt. Die absolute Konfiguration am Phosphor der einzelnen Enantiomeren wurde mittels Entschützen der 3'-Acetoxygruppe mit Base festgestellt, gefolgt von der in situ Cyclisierung unter Erhalt der cyclischen 3',5'-Methanphosphonate (cTMPCH3) deren Konfigurationen bekannt sind. Die aufgetrennten Enantiomere wurden mit Diphosphatanionen behandelt&sub1; um die Triphosphate in Dioxan/THF zu ergeben.
Obige Beispiele veranschaulichen im wesentlichen die bevorzugten Ausführungsweisen der vorliegenden Erfindung, aber weitergehende Aspekte der Erfindung werden durch die nachfolgenden Ansprüche definiert.

Claims

1. Assayverfahren zum Nachweis einer ersten Oligonucleotidsequenz in einer Probe, das folgendes umfaßt:

Einbringen einer zweiten Oligonucleotidsequenz, die mit der ersten Oligonucleotidsequenz zu hybridisieren vermag, in die Probe, wobei das zweite Oligonucleotid im wesentlichen neutral geladen ist, so daß die erste und zweite Sequenz hybridisieren;

Abtrennen jeglichen unhybridisierten zweiten Nucleotids von dem hybridisierten zweiten Nucleotid durch in-Kontakt- Bringen der Probe mit einer positiv geladenen festen Phase, sodaß das hybridisierte Oligonucleotid von der festen Phase zurückgehalten wird; und

Analysieren der festen Phase oder der unhybridisierten zweiten Sequenzen auf die Anwesenheit der zweiten Sequenzen zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge der ersten Sequenz in der Probe.

2. Assayverfahren nach Anspruch 1, wobei die zweite Sequenz analysiert wird, indem sie mit einer nachweisbaren Markierung markiert wird.

3. Assayverfahren nach Anspruch 1, wobei die zweite Oligonucleotidsequenz Alkylphosphonatnucleotide umfaßt.

4. Assayverfahren nach Anspruch 3, wobei die zweite Oligonucleotidsequenz aus enantiomerenreinen Nucleotiden besteht.

5. Assayverfahren nach Anspruch 4, wobei die Nucleotide aus den R-Stereoisomeren gewählt sind.

6. Assayverfahren nach Anspruch 1, wobei die geladene feste Phase ein poröses Material ist.

7. Assayverfahren nach Anspruch 6, wobei das poröse Material mit einem positiv geladenen Material beschichtet ist.

8. Assayverfahren nach Anspruch 7, wobei das positiv geladene Material ein quaternäres Ammoniumsalz umfaßt.

9. Assayverfahren nach Anspruch 1, das die Einführung einer Proteinase in die Probe zum Aufschluß jedweden vorhandenen Proteins umfaßt.

10. Kit für die Analyse einer Probe auf die Anwesenheit einer ersten Oligonucleotidsequenz, das folgendes unfaßt:

a.) eine positiv geladene feste Phase; und

b.) eine im wesentlichen neutral geladene zweite Oligonucleotidsequenz, die mit der ersten Oligonucleotidsequenz zu hybridisieren vermag.

11. Kit nach Anspruch 10, wobei die zweite Oligonucleotidsequenz Alkylphosphonatnucleotide umfaßt.

12. Kit nach Anspruch 11, wobei die Alkylphosphonatnucleotide enantiomerenrein sind.

13. Kit nach Anspruch 12, wobei die Nucleotide aus R- Stereoisimeren gewählt sind.

14. Kit nach Anspruch 10, wobei die zweite Oligonucleotidsequenz eine Markierung umfaßt.

15. Kit nach Anspruch 10, wobei die feste Phase porös ist.

16. Kit nach Anspruch 10, wobei die feste Phase porös und mit einem positiv geladenen Material beschichtet ist.

17. Kit nach Anspruch 16, wobei das positiv geladene Material ein quaternäres Ammoniumsalz umfaßt.

18. Kit nach Anspruch 10, das desweiteren eine Proteinase für den Aufschluß jedweden Proteins in der Probe umfaßt.