JPH0383600A - Ｄｎａプローブアッセイおよびそれに用いるキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、試料中のＤＮＡのストランドに相補的なりＮ
Ａを有する標識プローブストランドを用い、標識プロー
ブストラン、ドを分析することにより試料中のＤＮＡの
存在を検出するためのアッセイ法に関する。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）一般
にＤＮＡプローブアッセイには、試料中の第一のオリゴ
ヌクレオチドのストランドの１または２以上のコピーを
分析することが含まれるが、このことは、該第一のスト
ランドに相補的なオリゴヌクレオチドの第二のストラン
ドを複数導入して、該第一のストランドが試料中に存在
する場合に該第一のストランドにハイブリダイズさせる
ことによって行なわれる。第二のストランドは標識され
る（たとえばリン−３２、アクリジンやルミノールのよ
うな化学発光化合物、フルオレセインやローダミンのよ
うな蛍光化合物、ピオチン、アルカリホスファターゼや
酸性ホスファターゼのような酵素、およびそのような標
識を含有するリポソームにより）ので、該ストランドは
試料中で検出することができる。

過去におけるＤＮＡプローブアッセイに付随する問題の
一つは、ハイブリダイズしたプローブストランドをハイ
ブリダイズしていないプローブストランドから分離する
点にある。プローブ、目的物およびブローブー目的物二
量体間での大きさ（サイズ）の相異に基づいた分離シス
テムを作動させることもできるが、これに用いる方法は
長時間を要し、自動化が困難である。−例として、サザ
ーンブロッティングアッセイ［サザーン（Ｓ　ｏｕｔｈ
ｅｒｎ）、Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
　Ｂ　ｉｏｌｏｇｙ、　　９８　：５０３〜５１７（１
９７５）］は自動化が困難である。サイズ分離を利用し
た他のアッセイは、Ｂ型肝炎（ＨＢ）ウィルスのための
アボット・ラボラトリーズジエノスチックス（Ｇ　ｅｎ
ｏｓｔ　１ｃｓ）アッセイである。

このジェノスチノクスアッセイでは、天然のＨＢＤＮＡ
をヨウ素−１２５標識プローブとバイブｌダイズさせる
。ＤＮＡ−プローブハイブリッドを、ついで、充分な容
量の溶出液を用いてサイズ排除カラムに通し、収集フラ
スコ中にハイブリッド溶液のみを集める。ついでフラス
コを標準的な方法により放射性同位体についてアッセイ
する。

この方法はよく作動するものであるが、なお専門家が試
験を行う必要かある。この古注はまた、自動化には向か
ない。自動化システムにおける分離の問題には満足のい
く解決性がほとんど提起されていないのが現状である。

（課題を解決するための手段） 本発明は、試料中の第一のオリゴヌクレオチド配列を検
出するためのアッセイ法であって、（ｉ）実質的に中性
に荷電されているために該第一のオリゴヌクレオチド配
列とハイブリダイズすることのできる第二のオリゴヌク
レオチド配列を試料中に導入し、 （ｉｉ）正に荷電した固相に該試料を接触させてハイブ
リダイズしたオリゴヌクレオチドを該固相に保持させる
ことにより、該ハイブリダイズした第二のオリゴヌクレ
オチドからハイブリダイズしていない第二のオリゴヌク
レオチドを分離し、ついで（ｉｉｉ）該固相または該ハ
イブリダイズしていない第二のオリゴヌクレオチド配列
における該第二のオリゴヌクレオチド配列の存在、量を
分析することにより該試料中の該第一のオリゴヌクレオ
チド配列の存在または量を決定する ことを特徴とする方法；および 第一のオリゴヌクレオチド配列の存在について試料を分
析するためのキットであって、 （ａ）正に荷電した固相、および （ｂ）該第一のオリゴヌクレオチド配列とハイブリダイ
ズすることのできる実質的に中性に荷電した第二のオリ
ゴヌクレオチド配列 からなることを特徴とするキットを提供するものである
。

本発明のＤＮＡプローブアッセイに用いるプローブスト
ランドは、ハイブリダイズしたプローブストランドをハ
イブリダイズしていないプローブストランドから容易に
分離することを可能にする。

従って、本発明のＤＮＡプローブアッセイは、適当な標
識を用いれば、自動化装置を用いて作動させるよう容易
に適合させることができる。

本発明のアッセイによれば、第一のオリゴヌクレオチド
配列に相捕的な第二のプローブオリゴヌクレオチド配列
を試料中に導入することにより、試料中の該第一のオリ
ゴヌクレオチド配列を検出することができる。第二のオ
リゴヌクレオチド配列は、該第一のオリゴヌクレオチド
配列および該第二のプローブオリゴヌクレオチド配列が
ハイブリダイズすることができるように、中性に荷電し
たヌクレオチドからなる。ハイブリダイズしたプローブ
ストランドからハイブリダイズしていないプローブスト
ランドを分離するには、正に荷電した固相に試料を接触
させ、ついで洗浄するだけでよい。試料中の第一のオリ
ゴヌクレオチドストランドを構成する各ヌクレオチド中
にはＰ−Ｏ残基が存在するため、第一のオリゴヌクレオ
チド配列は固有の負の荷電を含んでいる。この負に荷電
した部分は正に荷電した固相上に保持されるから、ハイ
ブリダイズされたプローブストランドもまた固相上に保
持される。ハイブリダイズしていない中性に荷電したプ
ローブストランドは、固相上に保持されない。それゆえ
、プローブストランドに適当な標識を用いれば、標識の
存在について固相またはハイブリダイズしていないプロ
ーブストランドをアッセイすることにより、試料中の第
一のオリゴヌクレオチド配列の量または存在を分析する
ことができる。

本発明の第一の態様においては、プローブストランドを
アルキルホスホネートヌクレオチドから合成し、そのこ
とにより荷電したＰ＝Ｏ残基をプローブストランドから
除くことによってプローブストランドを中性に荷電する
ようにする。アルキルホスホネートヌクレオチドは、キ
ラルに分割し、各ヌクレオチドのうち実質的にＲ立体異
性体のみを用いるのが好ましい。ＲとＳの立体異性体の
混合物（ラセミ混合物）は、キラルに分割したプローブ
ストランドはどには試料中の第一のオリゴヌクレオチド
配列と充分にハイブリダイズしないことがわかっている
。

以下、本発明をさらに詳しく説明する。

本発明は、プローブストランドと試験すべき試料中のオ
リゴヌクレオチド配列とがハイブリダイズするＤＮＡプ
ローブアッセイにおいて、中性に荷電したＤＮＡプロー
ブストランドを使用することを含む。血液、細菌または
他の体液などの試料中のＤＮＡは、通常、荷電したＰ−
〇残基を有するヌクレオチドからなっており、このため
ＤＮＡストランドおよび試料は全体的に負の荷電を有す
る。荷電していないプローブストランドが試料中の負に
荷電したオリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズする
と、ハイブリダイズしたＤＮＡストランドもまた全体的
にみれば負に荷電している。

それゆえ、ハイブリダイズしたプローブストランドおよ
びハイブリダイズしていないプローブストランドの両方
を含んでいる試料を正に荷電した固相と接触させること
（こよって、ハイブリダイズしたＤＮＡストランドをハ
イブリダイズしていないプローブストランドから分離す
ることができる。

負に荷電したハイブリダイズしたストランドは正に荷電
した固相上に集まるが、荷電していないハイブリダイズ
していないプローブストランドは集まらない。ハイブリ
ダイズしたプローブストランドを含んでいる固相をハイ
ブリダイズしていないプローブストランドを含んでいる
液相から分離するのは当該技術分野で知られた簡単なこ
とであり、また試料中の決定すべきオリゴヌクレオチド
配列の存在または量は、固相上のハイブリダイズしたプ
ローブストランドの量を測定するかまたは液相中のハイ
ブリダイズしていないプローブストランドの量を測定す
ることにより確かめることができる。本発明の好ましい
態様においては、目的ＤＮＡを含む試料中に存在してい
るかもしれないタンパク質を加水分解するために、プロ
ーブストランドを導入する前にタンパク質分解酵素ブロ
テイナーゼＫを試料に加える。

中性に荷電したオリゴヌクレオチド 本発明に用いる中性に荷電したオリゴヌクレオチドは、
アルキルホスホネートであるのが好ましく、これは塩基
中の通常のＰ＝○で示される負に荷電した残基をアルキ
ル化ホスホネート基で置き換えたちのである。使用する
ことのできるアルキルホスホネートの具体例としては、
メチルホスホネート、エチルホスホネート、メチルチオ
ホスホネートおよびメトキシホスホネートが挙げられる
。

上記アルキルホスホネートが３°位において付加するこ
とのできるヌクレオチドの例としては、チミジン、グア
ニジン、アデノシン、シチジンおよび５−アミノアリル
ウリジンが挙げられる。

アルキル化ホスホネートヌクレオチドを用いてプローブ
ストランドに「負の荷電」を付与するに際して、プロー
ブストランドを１００％アルキルホスホネートヌクレオ
チドから合成する必要はない。

プローブストランドが充分な割合の「中性に荷電した」
ヌクレオチドから合成され、ハイブリダイズしていない
プローブストランドは正に荷電した固相を通り抜けてし
まうかまたは洗浄により除くことができるが、ハイブリ
ダイズしたプローブストランドは固相により保持される
限り、そのようなプローブストランドは「実質的に中性
に荷電した」ものとして本発明の範囲に含まれる。本発
明のプローブストランドは、中性に荷電したヌクレオチ
ドを少なくとも７５％含んでいなければならないと思わ
れる。

アルキル化ホスホネートヌクレオチドを合成する際に、
各リン上にキラル中心が生成することがわかっている。

ヌクレオチドのＲ立体異性体およびＳ立体異性体を互い
に分割し、Ｒ立体異性体ヌクレオチドのみからプローブ
ストランドを合成するのが好ましい。Ｒ立体異性体ヌク
レオチドは、Ｓ立体異性体やラセミ体からのプローブス
トランドに比べて試料中の目的オリゴヌク−１オチド配
列と一層容易にハイブリダイズすることがわかっている
。Ｒ立体異性体とＳ立体異性体の分離は、以下の実施例
１に記載しである。負に荷電したオリゴヌクレオチドを
製造するのに用いることのできる他の方性としては、４
種の主要なヌクレオチド三リン酸のためにキラルに分割
したα−Ｐ−アルキルヌクレオチド三リン酸を調製し、
ついでこれらの塩基をＤＮＡポリメラーゼを用いて酵素
的にプローブ中に導入する方性が挙げられる。

固相 本発明では、正に荷電した固相物質を利用する。

本発明の固相物質は、負に荷電したハイブリダイズした
プローブストランドを誘引することのできる内在的な能
力によって選択することができ、たとえば、メチル化羊
毛、ナイロン、およびある種のガラスが固有の正の荷電
を有している。別のやり方として、正に荷電した物質を
固相物雪上にコーティングするかまたは結合させること
ができる。

固相物質には、流体が容易にその中を流れ通り過ぎるこ
とのできる、当該技術分野で知られたあらゆる多孔質物
質が含まれる。たとえば、固相物質には、（１）ｌまた
は２以上のアッセイ試薬を含有する１または２以上の層
を有するフロースルー（ｆｌｏｗ　ｔｈｒｏｕｇｈ）ア
ッセイに用いるためのガラス繊維、セルロース、または
ナイロン、（２）デイツプ・アンド・リード（ｄｉｐ　
ａｎｄ　ｒｅａｄ）アッセイのためのデイツプスティッ
ク、または（３）ｌまたはすべての試薬が固相物質の単
一のストリップの別々の領域に含まれているクロマトグ
ラフィー法のためのストリップ（たとえば、紙）または
薄層（たとえば、ニトロセルロース）が含まれる。しか
しながら、固相物質は多孔質物質に限られるものではな
い。固相物質には、ビーズ、磁気ビーズ、ラテックス粒
子、ガラス試験管、または内在的な正の荷電を有するか
または正に荷電した物質を保持することのできる他のあ
らゆる物質が含まれる。

天然の物質、合成物質、または自戒的に修飾した天然に
存在する物質を固相物質として用いることができる。そ
のような物質の具体例としては、多糖類、たとえば紙や
セルロース誘導体く酢酸セルロース、ニトロセルロース
を含む）のようなセルロース物質；シリカ；不活化アル
ミナ、ケイソウ上、硫酸マグネシウムのような無機物質
、または多孔質ポリマーマトリックス中に均一に分散さ
せた他の微細に粉砕した無機物質（この場合のポリマー
としては、塩化ビニル、塩化ビニル−プロピレンコポリ
マー、塩化ビニル−酢酸ビニルコポリマー、天然に存在
する布くたとえば、綿）および自戒の布（たとえば、ナ
イロン）が挙げられる〉ニジリカゲル、アガロース、デ
キストランおよびゼラチンのようなゲル；ポリアクリル
アミドのようなポリマーフィルムなどが挙げられる。

好ましい固相物質には、ファツトマン（Ｗｈａｔｍａｎ
）９３４−ＡＨ濾紙（名目上の厚さ：０．３３朋）のヨ
ウナ多孔質ガラス繊維物質または他の繊維マトリックス
装置か含まれる。物質の厚さは重要ではなく、試験試料
の流動性などのような、主として試料またはアッセイす
べき分析対象物の性質に依存した単なる選択の問題に過
ぎないであろう。

固相物質の固有の荷電を変化させ、または太きくするた
めに、正に荷電した物質を固相物質に直接コーティング
するか、または該正に荷電した物質を微細粒子にコーテ
ィングして該微細粒子を固相物質に保持させることがで
きる。別のやり方として、荷電した固相物質として微細
粒子を単独で用いることができる。可能な荷電物質の−
っはポリマー性カチオンであり、該ポリマー性カチオン
は固相物質によって保持され、負に荷電したハイブリダ
イズしたプローブストランドを反対荷電間での引力によ
り引き付は保持するであろう。広範囲の専売ポリカチオ
ンが入手可能であり、これには、ガフコート（Ｇ　ａｆ
Ｑ　ｕａｔ）（Ｇ　Ａ　Ｆコーポレーション、ウニイン
、ニューシャーシー０７４７０）、セルコート（Ｃｅｌ
Ｑｕａｔ）Ｌ　　２００およびセルコートＨ−１００［
ナショナル・スターチ・アンド・ケミカル・コーポレー
ション（Ｎ　ａｔｉｏｎａｌ　Ｓ　ｔａｒｃｈａｎｄ　
Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ブリッ
ジウォーター、ニューシャーシー０８８０７］のような
第四級アンモニウム塩が含まれる。

荷電物質を粒子（たとえばビーズや微細粒子）上にコー
ティングすることができる。これらの粒子は、カラム中
に保持するかまたは可溶性試薬と試験試料との混合物中
に懸濁することにより固相として動＜シ、または粒子自
体を固相物質により保持し固定化することもできる。本
明細書において「保持し固定化する」とは、固相物質上
の粒子が固相物質内のどこの位置へでも実質的に移動し
得ることを意味する。これらの物質は、ポリスチレン、
ポリメチルアクリレート、ポリプロピレン、ラテックス
、ポリテトラフルオロエチレン、ポリアクリロニトリル
、ポリカーボネートまたは同様の物質からなる適当な微
細物質から当業者により選択することができる。粒子の
大きさは重要ではないが、粒子の平均直径は使用した固
相物質の平均孔径よりも小さいのが好ましい。

以下の実施例は本発明のＤＮＡプローブアッセイを行う
ための好ましい態様を示すものである。

しかしながら、本発明はこれらに限られるものではない
。

実施例１ 鏡像体的に純粋な３′−メチルホスホネート置換ヌクレ
オチドヲ、レスニコウスキー（Ｌｅｓｎｉｋｏｗｓｋｉ
）、ウオーカニン（Ｗｏｌｋａｎｉｎ）およびステック
（Ｓｔｅａ）の方ｉ’ｉ［Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌ
ｅｔｔｅｒｓＳ２８．５５３５〜８（１９８７）］によ
り調製した。５゛−Ｏモノメトキシトリチルチミジン−
３−０−（０−（４−ニトロフェニル）メタンホスホネ
ート）のＳｐ鏡像体（下記式上）およびＲｐ鏡像体く下
記式２）の合成性は、以下のとおりである。

５°−ＭＭＴ−Ｎ−４−ベンゾイルアデノシン、５−Ｍ
ＭＴ−Ｎ−４−ベンゾイルシチジン、および５’−ＭＭ
Ｔ−Ｎ−２−インブチルグアニジンメチルホスホネート
誘導体を同様に調製した。

火炎乾燥フラスコ中のアルゴン雰囲気下のピリジン（６
ｚ（り中のＭｅＰ　（ｏ　）ｃ　１２（２００ｍｙ）の
溶液に、ピリジン（３ｆｆＣ）中の５°−０−モノメト
キシトリチルチミジン（２５７，７ｘｙ）の溶液を室温
にて４５分かけて加えた。添加を完了したら混合物をさ
らに１時間撹拌し、ついで４−ニトロフェノール（６２
７ｙｙ）を−度に加えた。１時間撹拌した後、５０％ピ
リジン水溶液（２ｆｆ１２）で反応を停止させた。

飽和ＮａＨＣＯ３（９０ｍＱ）を加えた後、懸濁液をＣ
ＨＣｌ、で抽出した（２　Ｘ　Ｉ　Ｏ０ａｉ２）。クロ
ロホルム抽出物をＭｇ５Ｏ，上で乾燥させ、濾過し、蒸
発させ、真空乾燥した。残渣をＣＨＣｌ　ｓ中の１％Ｍ
ｅＯＨ（６ｉ＆）中に溶解し、この溶液を同じ溶媒を充
填したフラッシュクロマトグラフィーカラムにかけた。

ＣＨＣＬ中のＭｅＯＨの１〜８％勾配を用い、化合物を
溶出した。シリカケル上、ＣＨＣＩ３ＭｅＯＨ＝９５：
５においてＲｆが０．６および０５３であるＵＶ活性ス
ポットから、化合抱土（８５，９ｍｇ）および化合物２
（９１ｍｇ）がそれぞれ得られた。

実施例２ 土３己レスニコウスキー、ウオーカニンおよびステック
の方法と同様にして、実施例１で得た光学的に純粋な化
合物２を下記式３； で示される３°−アセトキシチミジンと縮合した。

式：５′−ＴＴ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ−３°（式中、星印は
光学的に純粋な３°→５°メチルホスホネ一ト結合を表
す）で示されるオリゴマーを、５°方向に成長するオリ
ゴヌクレオチド鎖へ化合物２を連続的に縮合することを
含む段階工程により調製した。通常のホスホジエステル
結合が得られる最後の縮合は、５゛−アセトキシチミジ
ン−３°−ホスフェート、ＤＣＣおよびテトラゾールを
用いて行った。アルゴン雰囲気下でＯｏＣのＴＨＦ（７
ｆｆＣ）中の３°−アセトキシチミジン（１６，６１！
９）の溶液に、Ｔ　ＨＦ　（３０ｔ、ｔ（１＞中の２．
ＯＭ　ｔ−ＢｕＭｇＣｌをスポイトで加えた。１５分以
内に白色の沈澱か生成した。懸濁液をＯｏＣにてさらに
３０分間撹拌し、ついでＴＨＦ（３ｍ１２）中に溶解し
た化合物２（３２ｕ９）を加えた。

混合物を室温で１時間撹拌し、ついでＤＭＦ（１００μ
Ｑ）を加えた。混合物を全部で１９時間撹拌した。溶媒
を真空下で除き、残渣を真空乾燥した。

この物質をＣＨＣ１３中の０．８％ＭｅＯＨ中に入れた
。ＣＨＣ１，中の０．８％、２％、４％、６％および８
％ＭｅＯＨ各２５０ｍ１２の段階勾配を用い、この物質
のフラッシュクロマトグラフィーを行った。ＣＨＣ１３
中の６％ＭｅＯＨに生成物ｉ：ｈ ｃＯ が溶出し、ＣＨＣｌ、：ＭｅＯＨ＝９５：５においてＲ
ｆが０．３２であった。ＣＨＣｌ５：ＭｅＯＨ（７：３
）中の２％トルエンスルホン酸を用い、得られた付加物
の５°末端からモノメトキシトリチル基を除いて下記化
合物旦を得た。

丘 ついで、化合物５を、鎖を延長し、ｔ−ＢｕＭｇＣｌで
５°−ＯＨを脱プロトン化し、得られたアニオンを他の
化合物２と反応させるために用いた。

笈星週旦 実施例４に記載するイオン捕捉アッセイに用いるため、
ガラス繊維フィルターディスクのためのカチオン性りオ
ートコーティングプロトコールを以下に詳述する。１０
個のファツトマン（Ｗｈａｔｍａｎ）の細いガラス繊維
フィルターディスク（２，５ｃｍＩＤ）のそれぞれを、
水中のセルコートＬ−２００（ナショナル・スターチ・
アンド・ケミカル・コーポレーション、バッチ＃ｌＯ１
製造年月日５−３−８２）の溶液（２５朽／村；１０酎
）中に２時間３０分浸漬した。ついでセルコート溶液を
デカントし、各ディスクを蒸留水（１０Ｘ２０ｍＣ）で
洗浄した。これらのカチオンフィルターを用いたアニオ
ン捕捉の効率を試験するために、以下のコントロール実
験を行った。１６−ｍ０１Ｍ１３ハイブリダイゼーシヨ
ンプローブブライマー５°−ｄＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣ
ＡＣＡＡＣ−３°にュー・イングランド・バイオラブズ
（Ｎｅｗ　Ｅ　ｎｇｌａｎｄ　Ｂ　１ｏｌａｂｓ）、＃
１２０２、ロット１４〜１５）の試料（０５ピコモル）
を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ−３″Ｐ　
ＡＴＰ（２，５ピコモル）を用いてキナーゼ処理した。

放射性ＤＮＡを５００μＱに希釈し、３アリコートにて
６個の１ｃｌｌＩＩＤフイルターデイスクに加えた。こ
のうち３個のディスクはセルコートＬ−２００で処理を
していたが、他の３個は同処理をしていなかった。ディ
スクを１００ｍＭ　ＮａＣ１／１０ｍＭ　トリス／１ｍ
ＭＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８，０；５ＴＥ）（ｌｌＩＱ）
で洗浄した。

放射活性についてフィルターをシンチレーションカウン
ター中でアッセイした。セルコート処理したフィルター
は全体で７１％の放射活性カウントを保持したが、コン
トロールのフィルターは７％の放射活性カウントを保持
しただけであった。従って、本発明のカチオン性りオー
ト処理したガラス繊維フィルターは、フォート処理して
いないガラス繊維フィルターに比べてＤＮＡのようなポ
リアニオンを取り込み保持することができる。従って、
このイオン性捕捉アッセイ態様を用いてＤＮＡをアッセ
イすることができる。

実施例４ オリゴマー３：５′−ＴＴ＊Ｔ＋Ｔ＊Ｔ＊Ｔ−３°（式
中、Ｔ＊は３′から５°へのＲ立体化学のＭｅＰ（０）
結合を表す）の５′末端を３１ｐで標識するために、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ−３１ＰＡＴＰで
処理した。ついで末端標識したプローブ３を５５℃にて
１時間、ｐｄ（Ａ）ｔ。（ファルマシア、ロット＃００
０８８４７−２）にノ＼イブリダイズした。実施例３で
得たフォート処理フィルターディスクに上記二量体を適
用しＳＴＥ緩衝液（１ｍ）で洗浄したときは、シンチレ
−７ヨンカウンティングにより示されるように放射性カ
ウントのほとんどがフィルターディスク上に残った。こ
のことは、ハイブリダイゼーションが起こったことを示
していた。従って、本質的に標的ＤＮＡを用いて中性プ
ローブをフィルターに結合させることにより、標的中性
プローブを本アッセイ形態において検出することができ
る。コントロール実験においては、オリゴマー基をγ−
３２Ｐ−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで
キナーゼ処理し、放射性プローブをフォート非処理フィ
ルターディスクに適用した。１ｔｎ（ｌのＳＴＥで洗浄
した後に、標的中性プローブから放出される全放射能カ
ウントは１％未満しか検出することができなかった。

犬鬼皿五 本実施例では、ラセミ体メチルホスホネート中性プロー
ブの合成および精製を記載する。Ｍ２Ｓに相補的なｌ　
７−ｍｅｒ　Ｇ　Ｔ＊Ｃ＊Ａ＊Ｔ＊ＡＪＧＩＣ＊Ｔ＊Ｇ
＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊ＧＩ６（式中、＊は結合塩
基間の５′末端および３゛末端間でのラセミＭｅｐ（ｏ
）結合を表す）を、適当なメチルホスホールアミダイト
（ｎｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ）を
用い、アプライドバイオシステムズＤＮＡシンセサイザ
ー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂ　ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｄ　Ｎ
　Ａ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）上で合成した。トリチ
ル基を有する中性オリゴヌクレオチドを逆相ＨＰＬＣに
より精製し、ついで８０％酢酸水溶液（３００μのによ
りトリチル基を除去した。このトリチル除去中性プロー
ブをゲル電気泳動（５０ｍＭヒスチジン、ｐＨ７，６，
３００■）により精製した。ついで”Ｆ　ＡＴＰ（アマ
−ジャム）およびポリヌクレオチドキナーゼ（ファルマ
シア）を用い、プローブ６の５゛末端を３７℃で３０分
間標識した。プローブを５０％ホルムアミド（５００μ
Ｃ）中に入れ、１０μＱアリコートにてセルコート−Ｌ
２００処理フィルター（ＩＣ肩ＩＤ）上に適用した。３
０秒後にフィルターをＳＴＥ緩衝液（１ｘ＆）で洗浄し
た。フィルターのシンチレーションカウンティングは、
全部で０．９７％の放射能がフィルターディスク上に残
っていることを示していた。

裏鬼皿旦 本発明のイオン捕捉形態でＭ２Ｓ　　ＤＮＡをアッセイ
するために、はとんど中性のＤＮＡプローブ旦を用いた
。−本鎖鋳型ＤＮＡ標的（Ｍ１３ｍｐ１８、二ニー・イ
ングランド・バイオラブズ、４０４Ｃ）およびコントロ
ールＤＮＡ（φＸ１７４、ＢＲＬ、５２６４５Ａ）を３
Ｍホスフェ−ｈ　（ｐＨ６。

８）中に希釈し、溶液２５μＱ中にＤＮＡの最終濃度１
５ピコモルとした。ついで、キナーゼ処理プローブ旦溶
液をＤＮＡアリコートに加えた。ついで溶液を５分間沸
騰させ、ついで４７℃に冷却した。５時間インキュベー
トした後、個々の試料の加工（ｐｒｏｃｅｓｓ　ｉｎｇ
）が始まるまで氷水中に冷却停止させた。ハイブリダイ
ゼーション溶液をセルコートＬ２００処理ガラス繊維デ
ィスク（ｌｃ、ｗｌＤ円形）に適用し、０．０２％Ｎ　
ａ　Ｎ　３を含むＳ　Ｔ　Ｅ　（ｐＨ７，８，１ｍ！２
）で洗浄した。ついで、残留する放射能についてディス
クをシンチレーションカウンター中でアッセイした。プ
ローブ６／Ｍ１３フィルター上のカウントは、プローブ
６のみを有するフィルター上のカウントよりも３０％高
いことが観察された。この結果は、本発明のイオン捕捉
アッセイ形態において適当なラセミ体メチルホスホネー
トプローブを用いることにより、あらゆる配列の標的Ｄ
ＮＡをアッセイすることができることを示している。

実施例７ 本発明のイオン捕捉形態でＭ２Ｓ　　ＤＮＡをアッセイ
するために、はとんど中性のＤＮＡプローブ６（実施例
５）を用いることができる。−本鎖鋳型ＤＮＡ標的（Ｍ
１３ｍｐ１８、二ニー・イングランド・バイオラプズ）
およびコントロールＤＮＡ（φＸ１７４、ベセスダ・リ
サーチ・ラボラトリーズ）を緩衝ｉｌ＆（３０ｍＭ　Ｎ
　ａＣＩＳｌ　０　ｍＭ　トリス、１０ｍＭ　ＭｇＣＬ
、ｐＨ８，０）中に希釈し、２５μＱの溶液中でのＤＮ
Ａの最終濃度を１−１００ピコモルとする。キナーゼ処
理プローブ６溶液をＤＮＡのアリコートに加え、最終容
量を５０μｇとする。

この溶液を２分間沸騰させ、ついで４５°Ｃに冷却する
。１６時間インキュベートした後、氷水中で冷却停止さ
せる。ハイブリダイゼーション溶液を９６ウエルマイク
ロタイタープレートの個々のウェルに加えるが、このと
き各ウェルは０．１％ポリリシン（ｌ　ＯＯ−ｍａｒ、
シグマ、セントルイス、ＭＯ）でコーティングしである
。ハイブリダイゼーション混合物をウェル中、２２°Ｃ
で３０分間インキュベートし、ついでマイクロタイター
プレートを緩衝液で洗浄する。ウェルは分離することが
でき、液体シンチレーションカウンティングにより放射
能をカウントして標的ＤＮＡが捕捉されたかどうかを確
立することができる。

実施例８ 本質的に実施例７に記載したようにして、Ｍ２Ｓ　　Ｄ
ＮＡをアッセイするためにほとんど中性のプローブ６を
用いることができる。プローブをキナーゼ処理しないが
、標準的な方法を用いてアルカリホスファターゼに結合
させる。希釈およびハイブリダイゼーション緩衝液は、
０．１％ＢＳＡを含んでいた。ハイブリダイズする前に
ブローブー鋳型混合物を沸騰させることはせず、４５°
Ｃで１６時間インキュベートさせるだけである。実施例
７に記載のようにして、溶液を処理マイクロタイタープ
レートに加え、インキュベートし、洗浄する。ウェルを
分離して放射能をカウントする代わりに、そのままのプ
レートの各ウェルにジニトロフェニルホスホネートを含
有する溶液を加える。

２２℃で１５分間インキュベートした後、ＩＭＨ，Ｓｏ
、のアリコートを加え、分光測光法により各ウェル中の
色を決定し、標的ＤＮＡが捕捉されたかどうかを確立す
る。

実施例９ 本実施例では、本発明の方法をキットに使用することを
記載する。目的のＤＮＡを含有している血清試料をまず
プロテイナーゼにで溶解し、カチオン性ガラス繊維フィ
ルター上の部位について競合するポリアニオン性のタン
パク質を破壊する。

ついで標識中性プローブを加える。プローブと標的上の
ハイブリダイゼーションが完了した後、カチオン荷電フ
ィルターに試料を通す。ついでフィルターをＳＴＥで洗
浄する。濾過した後、適当な方法を用いて標識ＤＮＡプ
ローブをフィルター上でアッセイすることができる。溶
液相アッセイを所望とするときは、フィルターディスク
に結合したＤＮＡ−プローブニ量体を２Ｍピペリジン水
溶液で処理し、ついで他の洗浄工程を行うことができる
。ピペリジン処理により中性プローブ骨格が開裂し、洗
浄工程により標識溶液が得られる。

実施例１Ｏ 本実施例では、三リン酸のαリン上にキラルなメチルホ
スホネート基を有するヌクレオチド三リン酸の合成を記
載する。必要な４つのキラルなＰ−メチル三リン酸を鋳
型の存在下でＤＮＡポリメラーゼで処理することにより
、キラルなメチルホスホネート骨格を有する相補的なプ
ローブストランドが得られる。αＰｓ−およびＰＲ−メ
チルチミジン三リン酸の合成を記載する。αＰｓ−およ
びＰＲ−メチルＡＴＰ、ＣＴＰおよびＧＴ、Ｐも同様に
して合成した。ピリジン中の３　−０−アセチルチミジ
ンの１Ｍ溶液をＭｅＰ　（０）Ｃｌｔの３，０当量に加
えた。室温で１．５時間撹拌した後、９．０当量の４−
ニトロツユノールを加えた。ＣＨＣＩｓ中の０．５〜１
０％ＭｅＯＨ直線勾配を用い、ＲおよびＳ鏡像体をシリ
カゲルカラム上のＨＰＬＣにより分離した。個々の鏡像
体のリンにおける絶対配置の確立は、塩基により３“−
アセトキシ基を脱保護し、ついでその場で環状化して環
状３°、５−メタンホスホネート（ｃＴ　Ｍ　Ｐ　ＣＨ
ａＸ立体配置は知られている）を得ることにより行った
。分割した鏡像体をニリン酸アニオンで処理し、ジオキ
サン／ＴＨＦ中の三リン酸を得た。

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. （１）試料中の第一のオリゴヌクレオチド配列を検出す
   るためのアッセイ法であって、 （ｉ）実質的に中性に荷電されているために該第一のオ
   リゴヌクレオチド配列とハイブリダイズすることのでき
   る第二のオリゴヌクレオチド配列を試料中に導入し、 （ｉｉ）正に荷電した固相に該試料を接触させてハイブ
   リダイズしたオリゴヌクレオチドを該固相に保持させる
   ことにより、該ハイブリダイズした第二のオリゴヌクレ
   オチドからハイブリダイズしていない第二のオリゴヌク
   レオチドを分離し、ついで（ｉｉｉ）該固相または該ハ
   イブリダイズしていない第二のオリゴヌクレオチド配列
   における該第二のオリゴヌクレオチド配列の存在、量を
   分析することにより該試料中の該第一のオリゴヌクレオ
   チド配列の存在または量を決定する ことを特徴とする方法。
2. （２）第二のオリゴヌクレオチド配列の分析を、該配列
   を検出可能な標識で標識することにより行う請求項（１
   ）記載のアッセイ法。
3. （３）中性に荷電したオリゴヌクレオチド配列がアルキ
   ルホスホネートヌクレオチドを含む請求項（１）記載の
   アッセイ法。
4. （４）第二のオリゴヌクレオチド配列がキラルに分割し
   たヌクレオチドから選ばれたものである請求項（３）記
   載のアッセイ法。
5. （５）正に荷電した固相が多孔質物質からなるものであ
   る請求項（１）記載のアッセイ法。
6. （６）多孔質物質が正に荷電した物質でコーティングさ
   れている請求項（５）記載のアッセイ法。
7. （７）正に荷電した物質が、第四級アンモニウム塩、ガ
   フコート、セルコートＬ−２００およびセルコートＨ−
   １００よりなる群から選ばれたものである請求項（６）
   記載のアッセイ法。
8. （８）第一のオリゴヌクレオチド配列の存在について試
   料を分析するためのキットであって、 （ａ）正に荷電した固相、および （ｂ）該第一のオリゴヌクレオチド配列とハイブリダイ
   ズすることのできる実質的に中性に荷電した第二のオリ
   ゴヌクレオチド配列 からなることを特徴とするキット。
9. （９）第二のオリゴヌクレオチド配列がアルキルホスホ
   ネートヌクレオチドを含む請求項（８）記載のキット。
10. （１０）アルキルホスホネートヌクレオチドがキラルに
    分割したものである請求項（９）記載のキット。
11. （１１）アルキルホスホネートヌクレオチドがＲ立体異
    性体である請求項（１０）記載のキット。
12. （１２）第二のオリゴヌクレオチド配列が標識を含む請
    求項（８）記載のキット。
13. （１３）固相が多孔質である請求項（８）記載のキット
    。
14. （１４）固相が多孔質であり、正に荷電した物質でコー
    ティングされている請求項（８）記載のキット。
15. （１５）正に荷電した物質が、第四級アンモニウム塩、
    ガフコート、セルコートＬ−２００およびセルコートＨ
    −１００よりなる群から選ばれたものである請求項（１
    ４）記載のキット。
16. （１６）試料中のタンパク質を消化するためにタンパク
    質分解酵素をさらに含む請求項（８）記載のキット。
17. （１７）複数のＲ立体異性体アルキルホスホネートを含
    むＤＮＡ配列。