JP2018088913A - 核酸を定量的にプロファイリングするための方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】上記方法は、一群の標的核酸分子のそれぞれの標的核酸分子を定量化するための複数のハイブリダイゼーション反応を実施して、複数の定量的シグナルを生成するステップと、2つの定量的シグナル間の比を生成するステップと、一群の標的核酸分子の定量的ランドスケープを構築するために、比を併合するステップとを含む。本発明に従う方法により、多数の標的核酸分子をプロファイリングして、多様な適用例のために、高感度で広いダイナミックレンジを有するビッグデータ標準化手段を提供することが可能になる。
【選択図】なし
Description
一群の標的核酸分子のそれぞれの標的核酸分子を定量化するための複数のハイブリダイゼーション反応を実施して、複数の定量的シグナルを生成するステップであって、複数のハイブリダイゼーション反応が、約1fMよりも低い定量化の限界を有する、ステップと、
任意の2つの定量的シグナル間の複数の比を生成するステップと、
一群の標的核酸分子の定量的ランドスケープを構築するために、比を併合するステップと
を含む方法を提供するものである。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する。
(項目1)
一群の標的核酸分子の定量的ランドスケープを確立するための方法であって、
上記一群の標的核酸分子のそれぞれの標的核酸分子を定量化するための複数のハイブリダイゼーション反応を実施して、複数の定量的シグナルを生成するステップであって、上記複数のハイブリダイゼーション反応が、約1fMよりも低い定量化の限界を有する、ステップと、
任意の2つの定量的シグナル間の複数の比を生成するステップと、
上記一群の標的核酸分子の上記定量的ランドスケープを構築するために、上記比を併合するステップと
を含む、方法。
(項目2)
上記一群の標的核酸分子中の上記標的核酸分子の数がnであり、相関させようとする比の数が[n×(n−1)/2](式中、nは整数である)である、項目1に記載の方法。
(項目3)
標識化が行われない、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目4)
酵素による増幅が行われない、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目5)
上記標的核酸分子が、DNA、cfDNA、メチル化DNA、mRNA、miRNA、LncRNAおよびリボソームRNAからなる群より選択される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
上記一群の標的核酸分子が、少なくとも3つの標的核酸分子を含有する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
上記複数のハイブリダイゼーション反応が、同時に実施される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
上記標的核酸分子が、1つのチップまたはマイクロアレイ中に統合される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
上記複数の定量的シグナルが、電気的な変化、重量の変化、吸光度波長の変化、吸光度強度の変化、蛍光および蛍光強度の変化、ならびに屈折率の変化からなる群より選択される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
上記電気的な変化が、電荷の変化、電流の変化、電気抵抗の変化、閾値電圧シフトの変化、電気伝導度の変化、電場の変化、電気容量の変化、電流の変化、電子の変化および電子空孔の変化からなる群より選択される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
上記複数のハイブリダイゼーション反応が、固体表面に付着している認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子、または上記固体表面から所定の距離だけ間隔をあけている上記認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子を用いて実施される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
上記固体表面が、電界効果トランジスタ(FET)の半導体に基づく電気的検知チップ、または表面プラズモン共鳴(SPR)の金属表面である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
上記固体表面の材料が、多結晶ケイ素または単結晶ケイ素である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
上記固体表面が、上記電気的な変化を検出するための電気的な変化を検出する要素とカップリングされている、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
上記電気的な変化を検出する要素が、電界効果トランジスタまたは表面プラズモン共鳴である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
上記認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子が、少なくとも1つの電気的に中性のヌクレオチドおよび少なくとも1つの負に荷電しているヌクレオチドを含む部分的に中性の一本鎖オリゴヌクレオチドである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目17)
上記電気的に中性のヌクレオチドが、C1〜C6アルキル基により置換されているリン酸基を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
上記負に荷電しているヌクレオチドが、非置換のリン酸基を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
上記認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子が、固体表面に付着しており、上記部分的に中性の一本鎖オリゴヌクレオチドが、上記固体表面に付着している第1の部分を含み、上記第1の部分の長さが、上記部分的に中性の一本鎖オリゴヌクレオチドの全長の約50%であり、上記第1の部分が、少なくとも1つの電気的に中性のヌクレオチドおよび少なくとも1つの負に荷電しているヌクレオチドを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
上記定量的シグナルの最も小さなシグナルと最も大きなシグナルとの間の差が、少なくとも2桁の大きさである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
上記項目のいずれか一項に記載の方法を用いて確立される、一群の標的核酸分子の定量的ランドスケープ。
開示の要約
本発明は、一群の標的核酸分子の定量的ランドスケープを確立するための方法に関する。上記方法は、一群の標的核酸分子のそれぞれの標的核酸分子を定量化するための複数のハイブリダイゼーション反応を実施して、複数の定量的シグナルを生成するステップと、2つの定量的シグナル間の比を生成するステップと、一群の標的核酸分子の定量的ランドスケープを構築するために、比を併合するステップとを含む。本発明に従う方法により、多数の標的核酸分子をプロファイリングして、多様な適用例のために、高感度で広いダイナミックレンジを有するビッグデータ標準化手段を提供することが可能になる。
一群の標的核酸分子のそれぞれの標的核酸分子を定量化するための複数のハイブリダイゼーション反応を実施して、複数の定量的シグナルを生成するステップであって、複数のハイブリダイゼーション反応が、約1fMよりも低い定量化の限界を有する、ステップと、
任意の2つの定量的シグナル間の複数の比を生成するステップと、
一群の標的核酸分子の定量的ランドスケープを構築するために、比を併合するステップと
を含む方法を提供するものである。
デオキシシチジン(n−ac)p−メトキシホスホラミダイト、チミジンp−メトキシホスホラミダイト、デオキシグアノシン(n−ibu)p−メトキシホスホラミダイト、およびデオキシアデノシン(n−bz)p−メトキシホスホラミダイト(全て、ChemGenes Corporation、米国から購入した)を使用して、固相ホスホトリエステル合成に基づいてか、またはApplied Biosystems 3900 High Throughput DNA Synthesizer(Genomics(登録商標)Biosci & Tech、またはMission Biotechにより提供された)により、所与の配列に従うオリゴヌクレオチドを合成した。
SiNW表面層(SiO2)の官能基化により、認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子を付着させた。最初に、(3−アミノプロピル)トリエトキシシラン(APTES)を使用して、表面を改変した。APTES分子中のケイ素原子を、ヒドロキシル基の酸素と共有結合させ、表面のシラノール基(SiOH)をアミンに変換した。試料を、2%のAPTES(99%EtOH)中に30分間浸漬し、次いで、120℃で10分間加熱した。このステップの後、アミノ基(NH2)が、表面からの末端の単位となった。
認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子(プローブ)および標的オリゴヌクレオチド分子(標的)の配列を、表1に列挙する。
電気的な変化の比を、表2〜表7に示す。さらに、それぞれのmiRNAの細胞内濃度を、検量線に対して較正することによって定量化することができる。同様に、任意の細胞について、任意の2つのmiRNA間の濃度の比を計算し、したがって、miRNA発現の複合ランドスケープを作り出すことも、容易かつ実用的である。図10〜図15のデータは、2つの腫瘍細胞株、すなわち、PC3細胞およびCWR細胞(両方がヒト前立腺がんに由来する)について、7つのmiRNA標的から得られた少なくとも18セットの比のデータを示し、この場合、定量化の限界はfMを下回り、ダイナミックレンジは4桁であった。0.01アトモルのmiRNAが、このダイナミックレンジ内で検出された。2つのがん細胞株から得られたmiRNAの比の比較により、miRNAのランドスケープの3Dプロットが、同じ疾患についてでさえも同じでないことが示された(図16および図17)。ランドスケープはまた、異なる治療剤の負荷を受ければさらなる変化を経ると専ら想定され得る。
Claims (21)
- 一群の標的核酸分子の定量的ランドスケープを確立するための方法であって、
前記一群の標的核酸分子のそれぞれの標的核酸分子を定量化するための複数のハイブリダイゼーション反応を実施して、複数の定量的シグナルを生成するステップであって、前記複数のハイブリダイゼーション反応が、約1fMよりも低い定量化の限界を有する、ステップと、
任意の2つの定量的シグナル間の複数の比を生成するステップと、
前記一群の標的核酸分子の前記定量的ランドスケープを構築するために、前記比を併合するステップと
を含む、方法。 - 前記一群の標的核酸分子中の前記標的核酸分子の数がnであり、相関させようとする比の数が[n×(n−1)/2](式中、nは整数である)である、請求項1に記載の方法。
- 標識化が行われない、請求項1に記載の方法。
- 酵素による増幅が行われない、請求項1に記載の方法。
- 前記標的核酸分子が、DNA、cfDNA、メチル化DNA、mRNA、miRNA、LncRNAおよびリボソームRNAからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記一群の標的核酸分子が、少なくとも3つの標的核酸分子を含有する、請求項1に記載の方法。
- 前記複数のハイブリダイゼーション反応が、同時に実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記標的核酸分子が、1つのチップまたはマイクロアレイ中に統合される、請求項1に記載の方法。
- 前記複数の定量的シグナルが、電気的な変化、重量の変化、吸光度波長の変化、吸光度強度の変化、蛍光および蛍光強度の変化、ならびに屈折率の変化からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記電気的な変化が、電荷の変化、電流の変化、電気抵抗の変化、閾値電圧シフトの変化、電気伝導度の変化、電場の変化、電気容量の変化、電流の変化、電子の変化および電子空孔の変化からなる群より選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記複数のハイブリダイゼーション反応が、固体表面に付着している認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子、または前記固体表面から所定の距離だけ間隔をあけている前記認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子を用いて実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記固体表面が、電界効果トランジスタ(FET)の半導体に基づく電気的検知チップ、または表面プラズモン共鳴(SPR)の金属表面である、請求項11に記載の方法。
- 前記固体表面の材料が、多結晶ケイ素または単結晶ケイ素である、請求項11に記載の方法。
- 前記固体表面が、前記電気的な変化を検出するための電気的な変化を検出する要素とカップリングされている、請求項11に記載の方法。
- 前記電気的な変化を検出する要素が、電界効果トランジスタまたは表面プラズモン共鳴である、請求項14に記載の方法。
- 前記認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子が、少なくとも1つの電気的に中性のヌクレオチドおよび少なくとも1つの負に荷電しているヌクレオチドを含む部分的に中性の一本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項11に記載の方法。
- 前記電気的に中性のヌクレオチドが、C1〜C6アルキル基により置換されているリン酸基を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記負に荷電しているヌクレオチドが、非置換のリン酸基を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子が、固体表面に付着しており、前記部分的に中性の一本鎖オリゴヌクレオチドが、前記固体表面に付着している第1の部分を含み、前記第1の部分の長さが、前記部分的に中性の一本鎖オリゴヌクレオチドの全長の約50%であり、前記第1の部分が、少なくとも1つの電気的に中性のヌクレオチドおよび少なくとも1つの負に荷電しているヌクレオチドを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記定量的シグナルの最も小さなシグナルと最も大きなシグナルとの間の差が、少なくとも2桁の大きさである、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法を用いて確立される、一群の標的核酸分子の定量的ランドスケープ。
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