JP3436538B2 - 改良型の鎖置換アッセイおよびそれに有用な複合体 - Google Patents
改良型の鎖置換アッセイおよびそれに有用な複合体Info
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は臨床分析の分野に関する。より詳細には、本
発明は、公知の鎖置換アッセイ（strand displacement
assay）に改良を加えた分析方法および装置に関する。
さらに、本発明は、鎖置換アッセイ法を用いるNeisseri
a gonorrhoeae（淋菌）の検査ならびに他の核酸プロー
ブアッセイにおいて有用な核酸配列に関する。
発明は、公知の鎖置換アッセイ（strand displacement
assay）に改良を加えた分析方法および装置に関する。
さらに、本発明は、鎖置換アッセイ法を用いるNeisseri
a gonorrhoeae（淋菌）の検査ならびに他の核酸プロー
ブアッセイにおいて有用な核酸配列に関する。
背景および従来技術
臨床化学の分野で広く知られており、また受け入れら
れている診断アッセイの１グループは核酸ハイブリダイ
ゼーションに基づくものである。周知のことだが、拡散
分子（DNAおよびRNA）は核酸の相補鎖同士がハイブリダ
イズして二本鎖分子を形成することができる。
れている診断アッセイの１グループは核酸ハイブリダイ
ゼーションに基づくものである。周知のことだが、拡散
分子（DNAおよびRNA）は核酸の相補鎖同士がハイブリダ
イズして二本鎖分子を形成することができる。
核酸ハイブリダイゼーションの原理はきわめて単純な
２つの規則に基づいている。すべての核酸分子は４種類
のヌクレオチド塩基から成り立っている。DNAは“A"、
“T"、“C"および“G"の塩基を含み、一方RNAは“A"、
“U"、“C"および“G"を含む。上記した２つの単純な規
則は（ｉ）塩基“A"と“T"または“U"が相補的で互いと
ハイブリダイズし、そして“C"と“G"が相補的で互いと
ハイブリダイズする、というものである。さまざまな長
鎖核酸分子は、塩基を互いに結合させることによって形
成することができる。
２つの規則に基づいている。すべての核酸分子は４種類
のヌクレオチド塩基から成り立っている。DNAは“A"、
“T"、“C"および“G"の塩基を含み、一方RNAは“A"、
“U"、“C"および“G"を含む。上記した２つの単純な規
則は（ｉ）塩基“A"と“T"または“U"が相補的で互いと
ハイブリダイズし、そして“C"と“G"が相補的で互いと
ハイブリダイズする、というものである。さまざまな長
鎖核酸分子は、塩基を互いに結合させることによって形
成することができる。
特定の生物、ウイルス、DNA/RNA配列中の突然変異な
どを同定する場合には、同定しようとする物質に固有の
配列が存在することと、上気したハイブリダイゼーショ
ンの原理に依っている。例えば、微生物“X"が固有のDN
A配列： 5'−AAACCGGCC−3' を含むとすると、理論的には、固有のDNA配列を接近し
易くして、これをその相補鎖： 3'−TTTGGCCGG−5' と接触させることにより該微生物を同定することが可能
である。相補鎖が標識、すなわち何らかの“マーカー”
を含む場合は、ハイブリダイゼーションが起こったこと
を確認することができるだろう。すべての核酸測定アッ
セイの基礎となるのがこの原理である。
どを同定する場合には、同定しようとする物質に固有の
配列が存在することと、上気したハイブリダイゼーショ
ンの原理に依っている。例えば、微生物“X"が固有のDN
A配列： 5'−AAACCGGCC−3' を含むとすると、理論的には、固有のDNA配列を接近し
易くして、これをその相補鎖： 3'−TTTGGCCGG−5' と接触させることにより該微生物を同定することが可能
である。相補鎖が標識、すなわち何らかの“マーカー”
を含む場合は、ハイブリダイゼーションが起こったこと
を確認することができるだろう。すべての核酸測定アッ
セイの基礎となるのがこの原理である。
鎖置換アッセイは一連の米国特許に記載されている。
すなわち、米国特許第4,629,689号（Diamondら）、第4,
725,536号（Fritschら）、第4,725,537号（Fritsch
ら）、第4,735,897号（Varyら）、第4,752,566号（Coll
insら）、第4,766,062号（Diamondら）、第4,766,064号
（Williamsら）、第4,767,699号（Varyら）、第4,795,7
01号（Vary）、および第4,818,680号（Collinsら）。本
質的に、それは、目的の核酸配列を含むと予想される検
査試料と、異なる長さの２つの核酸配列のハイブリッド
複合体と、を接触させることを含んでいる。より長い配
列は結合プローブと呼ばれ、目的の核酸配列に相補的で
ある。信号プローブと呼ばれる、短い方の配列は結合プ
ローブの一部とのみハイブリダイズする。信号プローブ
とハイブリダイズしていない結合プローブの部分は初期
結合領域と呼ばれる。例えば、上記の配列： 5'−AAACCGGCC−3' の例を用いると、次のようなハイブリッド複合体を作製
することができる： ここで、“TTGGCCGG"は結合プローブで、“TTGG"は初期
結合領域で、そして“GGCC"は信号プローブである。実
際には、結合プローブが初期結合領域つまり“IBR（ini
tial binding region）”を介して標的配列と結合す
る。結合プローブは標的分子とハイブリダイズし続け
る。なんとなれば、標的分子は信号プローブよりも長
く、より長い分子を含む複合体の方が安定しているから
である。しかし、核酸は安定した三本鎖複合体を形成す
ることはなく、かくして信号プローブが“置換”され
る。信号プローブを標識しておくと、この置換を測定す
ることができる。
すなわち、米国特許第4,629,689号（Diamondら）、第4,
725,536号（Fritschら）、第4,725,537号（Fritsch
ら）、第4,735,897号（Varyら）、第4,752,566号（Coll
insら）、第4,766,062号（Diamondら）、第4,766,064号
（Williamsら）、第4,767,699号（Varyら）、第4,795,7
01号（Vary）、および第4,818,680号（Collinsら）。本
質的に、それは、目的の核酸配列を含むと予想される検
査試料と、異なる長さの２つの核酸配列のハイブリッド
複合体と、を接触させることを含んでいる。より長い配
列は結合プローブと呼ばれ、目的の核酸配列に相補的で
ある。信号プローブと呼ばれる、短い方の配列は結合プ
ローブの一部とのみハイブリダイズする。信号プローブ
とハイブリダイズしていない結合プローブの部分は初期
結合領域と呼ばれる。例えば、上記の配列： 5'−AAACCGGCC−3' の例を用いると、次のようなハイブリッド複合体を作製
することができる： ここで、“TTGGCCGG"は結合プローブで、“TTGG"は初期
結合領域で、そして“GGCC"は信号プローブである。実
際には、結合プローブが初期結合領域つまり“IBR（ini
tial binding region）”を介して標的配列と結合す
る。結合プローブは標的分子とハイブリダイズし続け
る。なんとなれば、標的分子は信号プローブよりも長
く、より長い分子を含む複合体の方が安定しているから
である。しかし、核酸は安定した三本鎖複合体を形成す
ることはなく、かくして信号プローブが“置換”され
る。信号プローブを標識しておくと、この置換を測定す
ることができる。
鎖置換アッセイは有用であるが、問題がないわけでは
ない。感度が少なからず問題となる。病理学的状態、例
えば正常と異常との差異が１個のヌクレオチド塩基の差
異にあるような状態が知られている。鎌型赤血球貧血症
はこのタイプの点突然変異により確認された病理学的状
態の最もよく知られた例である。１個のヌクレオチド塩
基の測定が重要となるアナライトや、種々の微生物間の
差がわずかであるアナライトが他にも存在する。このよ
うな状況下での同定および測定には、鎖置換アッセイに
おいてこれまで得ることができなかったレベルの感度と
特異性が要求される。
ない。感度が少なからず問題となる。病理学的状態、例
えば正常と異常との差異が１個のヌクレオチド塩基の差
異にあるような状態が知られている。鎌型赤血球貧血症
はこのタイプの点突然変異により確認された病理学的状
態の最もよく知られた例である。１個のヌクレオチド塩
基の測定が重要となるアナライトや、種々の微生物間の
差がわずかであるアナライトが他にも存在する。このよ
うな状況下での同定および測定には、鎖置換アッセイに
おいてこれまで得ることができなかったレベルの感度と
特異性が要求される。
核酸アッセイに関連してかなり詳しく研究されてきた
生物の１つにNeisseria gonorrhoeaeがあり、これは性
的感染症の原因菌で、毎年およそ200万件が報告されて
いる。N.gonorrhoeae特異的核酸プローブに関する特許
文献の例として、米国特許第4,900,659号（Loら）、第
5,047,523号および第5,099,011号（両方ともWoodsら）
を挙げることができる。これらの特許はDNA:DNAハイブ
リダイゼーションを扱っており、そして有用であるがあ
まり特異的ではないプローブを開示している。
生物の１つにNeisseria gonorrhoeaeがあり、これは性
的感染症の原因菌で、毎年およそ200万件が報告されて
いる。N.gonorrhoeae特異的核酸プローブに関する特許
文献の例として、米国特許第4,900,659号（Loら）、第
5,047,523号および第5,099,011号（両方ともWoodsら）
を挙げることができる。これらの特許はDNA:DNAハイブ
リダイゼーションを扱っており、そして有用であるがあ
まり特異的ではないプローブを開示している。
さらに、公開された特許出願WO90/14442、EPA337,89
6、EPA272009およびEPA408077は、RNAと相補プローブと
のハイブリダイゼーションを開示している。これらの特
許は、Kohneの特許、つまり米国特許第4,851,330号を発
展させたものであり、生物のrRNA配列が標的であるとい
う点で固有のRNA配列を検出することにより該生物を同
定するものであった。
6、EPA272009およびEPA408077は、RNAと相補プローブと
のハイブリダイゼーションを開示している。これらの特
許は、Kohneの特許、つまり米国特許第4,851,330号を発
展させたものであり、生物のrRNA配列が標的であるとい
う点で固有のRNA配列を検出することにより該生物を同
定するものであった。
これらの特許文献はどれも、鎖置換アッセイを含む各
種診断アッセイにおいて有用な、本明細書で開示するN.
gonorrhoeaeに対して特異的な核酸プローブを教示して
いない。ここに開示する配列は固有（unique）であるば
かりか、特異的なN.gonorrhoeaeプローブとして機能す
る。この記述に関して、特異的配列の固有性（または唯
一性:uniqueness）とは、この配列がプローブとして機
能することを必ずしも意味しない、ことを指摘しておか
なければならない。プローブの全長、多くの生物株を同
定する能力、微変異性などを含めて、いろいろな事柄が
考慮されるべきである。
種診断アッセイにおいて有用な、本明細書で開示するN.
gonorrhoeaeに対して特異的な核酸プローブを教示して
いない。ここに開示する配列は固有（unique）であるば
かりか、特異的なN.gonorrhoeaeプローブとして機能す
る。この記述に関して、特異的配列の固有性（または唯
一性:uniqueness）とは、この配列がプローブとして機
能することを必ずしも意味しない、ことを指摘しておか
なければならない。プローブの全長、多くの生物株を同
定する能力、微変異性などを含めて、いろいろな事柄が
考慮されるべきである。
N.gonorrhoeaeプローブとして有用なプローブを同定
することの困難性を考えると、Neisseria属の異なる種
の匹敵する配列とたった１個の塩基対で異なっているプ
ローブがN.gonorrhoeaeの同定に使用し得るということ
は驚くべきことである。こうしたプローブはここに記載
する本発明のもう１つの特徴となる。
することの困難性を考えると、Neisseria属の異なる種
の匹敵する配列とたった１個の塩基対で異なっているプ
ローブがN.gonorrhoeaeの同定に使用し得るということ
は驚くべきことである。こうしたプローブはここに記載
する本発明のもう１つの特徴となる。
図面の簡単な説明
図１は、N.gonorrhoeae特異的ハイブリッド複合体を
用いる初期結合実験を示す。
用いる初期結合実験を示す。
図２は、１個の塩基対のミスマッチを同定する実験の
結果を示す。
結果を示す。
図３は、追加の置換実験を示す。
図４は、更なる置換実験を示す。
図５は、追加の置換実験を示す。
図６は、アッセイの感度を示す。
図７は、抽出したRNAに対するアッセイの特異性を示
す。
す。
図８は、抽出したRNAに対する特異性を示す。
図９は、溶菌試料により得られた結果を示す。
図10は、鎌型赤血球貧血症のDNAに関する実験の結果
を示す。
を示す。
図11は、固相に基づいたアッセイのデータを示す。
図12も、ビーズを用いる置換アッセイを示す。
図13は、典型的な試験片フォーマットアッセイの模式
図である。
図である。
図14は、試験片フォーマットを用いて得られた結果を
示す。
示す。
図15は、固相反応速度論アッセイで得られた結果を示
す。
す。
図16も、固相反応速度論アッセイからの結果を示す。
図17は、粗製rRNA抽出液を用いる固相アッセイの結果
を示す。
を示す。
図18は、試験片上捕捉アッセイ（on strip capture a
ssay）のモデルを示す。
ssay）のモデルを示す。
図19は、試験片上捕捉アッセイを用いて得られた結果
を示す。
を示す。
好ましい実施態様の詳細な説明
実施例１
Neisseria gonorrhoeaeを同定するのに適した物質を
作製する実験に着手した。N.gonorrhoeaeの特定の株の1
6S rRNA遺伝子は知られている（Rossauら,Nucl.Acids R
es.16:6227（1988））。ここには記載してない実験で、
N.meningitidisとN.lactamicaの特定株の16S rRNAの比
較可能なDNAの配列を決定した。この比較によると、核
酸1262−1281が非相同であることがわかった。
作製する実験に着手した。N.gonorrhoeaeの特定の株の1
6S rRNA遺伝子は知られている（Rossauら,Nucl.Acids R
es.16:6227（1988））。ここには記載してない実験で、
N.meningitidisとN.lactamicaの特定株の16S rRNAの比
較可能なDNAの配列を決定した。この比較によると、核
酸1262−1281が非相同であることがわかった。
別の実験では、１個の塩基対が相違している３つの他
の領域が確認された。
の領域が確認された。
これらの配列はそれぞれN.gonorrhoeae 16S rRNA遺伝子
のマイナス鎖の塩基661−687、750−776および1125−11
51に相当する。配列番号:4において塩基674は“C"であ
るが、他の２つのNeisseria種では“T"である。配列番
号:5では塩基763が他の２つと比べて“A"であり、配列
番号:6では塩基1138が“C"であるのに対して他の２つの
菌株の場合は“T"である。これらに相補的な配列も有用
である。
のマイナス鎖の塩基661−687、750−776および1125−11
51に相当する。配列番号:4において塩基674は“C"であ
るが、他の２つのNeisseria種では“T"である。配列番
号:5では塩基763が他の２つと比べて“A"であり、配列
番号:6では塩基1138が“C"であるのに対して他の２つの
菌株の場合は“T"である。これらに相補的な配列も有用
である。
実施例２
選ばれた配列が有用であるためには、それらはできる
限り広くN.gonorrhoeaeを同定しなければならず、一方
でN.gonorrhoeae以外の物質とハイブリダイズしてはな
らない。このことを調べるために、これらの配列から5'
末端標識化によりプローブを作製した。配列番号:4、５
および６に対応するオリゴヌクレオチド（1.0μｌ、約
2.46pmol）を13.09μｌの蒸留水、2.0μｌの緩衝液、3.
66μｌのγ−32P−ATP、および0.25μｌのT4ポリヌクレ
オチドキナーゼと混合した。この混合物を37℃で30分間
インキュベートし、次いで2.5μｌの0.1M EDTA（pH 8.
0）を加えた。必要になるまで混合物を氷上で４℃に保
った。
限り広くN.gonorrhoeaeを同定しなければならず、一方
でN.gonorrhoeae以外の物質とハイブリダイズしてはな
らない。このことを調べるために、これらの配列から5'
末端標識化によりプローブを作製した。配列番号:4、５
および６に対応するオリゴヌクレオチド（1.0μｌ、約
2.46pmol）を13.09μｌの蒸留水、2.0μｌの緩衝液、3.
66μｌのγ−32P−ATP、および0.25μｌのT4ポリヌクレ
オチドキナーゼと混合した。この混合物を37℃で30分間
インキュベートし、次いで2.5μｌの0.1M EDTA（pH 8.
0）を加えた。必要になるまで混合物を氷上で４℃に保
った。
１パネル39のNeisseria株を集め、３つの対照ととも
に使用した。標準的な技法に従ってそれぞれの菌株から
染色体DNAを抽出した。その後、DNAをナイロン膜に固定
し、上記した標識ヌクレオチド配列の標識として用い
た。ハイブリダイゼーションを65℃で一夜行い、その後
ドットブロットを洗浄、乾燥し、標準オートラジオグラ
フィーを行った。結果を下記の表１に示す。
に使用した。標準的な技法に従ってそれぞれの菌株から
染色体DNAを抽出した。その後、DNAをナイロン膜に固定
し、上記した標識ヌクレオチド配列の標識として用い
た。ハイブリダイゼーションを65℃で一夜行い、その後
ドットブロットを洗浄、乾燥し、標準オートラジオグラ
フィーを行った。結果を下記の表１に示す。
これらの結果から、３種の配列がすべてN.gonorrhoea
eに対して特異的で、それ故、今後の研究の土台となり
うることが判明した。
eに対して特異的で、それ故、今後の研究の土台となり
うることが判明した。
実施例３
配列番号:1によって示される非相同配列に基づいて初
期実験を行った。これらを実施するにあたって、長い結
合プローブとして80ヌクレオチド配列を含むハイブリッ
ド複合体を作製した。この長い配列は配列番号:1に相補
的で、配列番号:1の5'末端から49塩基のところで開始す
る。信号プローブは3'末端の最後の25塩基にわたってハ
イブリダイズした： この25ヌクレオチドプローブを上記の方法で標識した。
期実験を行った。これらを実施するにあたって、長い結
合プローブとして80ヌクレオチド配列を含むハイブリッ
ド複合体を作製した。この長い配列は配列番号:1に相補
的で、配列番号:1の5'末端から49塩基のところで開始す
る。信号プローブは3'末端の最後の25塩基にわたってハ
イブリダイズした： この25ヌクレオチドプローブを上記の方法で標識した。
置換アッセイは、Diamondらの米国特許第4,766,022号
およびCollinsらのEPA 167238に記載される方法で行っ
た。しかし、徹底させるため、プロトコールを説明す
る。まず、上記の２成分をハイブリダイズさせるため
に、1.5mlの微量遠心管に次の成分を加え、混合した。
およびCollinsらのEPA 167238に記載される方法で行っ
た。しかし、徹底させるため、プロトコールを説明す
る。まず、上記の２成分をハイブリダイズさせるため
に、1.5mlの微量遠心管に次の成分を加え、混合した。
２×SSC（15.5μｌ）
50％PEG（5.0μｌ）
結合プローブ（110fm/μｌ）（2.5μｌ）
標識信号（110fm/μｌ）（2.0μｌ）
最終容量が25μｌ、最終塩濃度が1.24×SSC、そして10
％PEGとなった。この混合物を37℃で60分間インキュベ
ートし、その後必要となるまで氷上または４℃で保持し
た。
％PEGとなった。この混合物を37℃で60分間インキュベ
ートし、その後必要となるまで氷上または４℃で保持し
た。
アナライト（分析物）をアッセイするために、1.0μ
ｌのハイブリッド複合体を３μｌの蒸留水、4.0μｌの2
5％PEG、1.0μｌの20×SSCおよび1.0μｌの試料と混合
した。この混合物をどの場合にも50℃で１〜４時間イン
キュベートした。信号プローブの置換を電気泳動により
測定した。混合物を20％未変性ポリアクリルアミドゲル
（30％アクリルアミド溶液:66.6ml、水:21.3ml、３％過
硫酸アンモニウム:2.1ml、10×TBE:10.0ml）中で泳動を
行い、0.45μｍの無菌フィルター装置により濾過した。
全部で44μｌのTEMEDを加え、混合物を放置させた。試
料を加えた（1500ボルト、２時間、緩衝液１×TBE;負荷
緩衝液:30％グリセロール＋染料ブロモフェノールブル
ーおよびキシレンシアノール）。
ｌのハイブリッド複合体を３μｌの蒸留水、4.0μｌの2
5％PEG、1.0μｌの20×SSCおよび1.0μｌの試料と混合
した。この混合物をどの場合にも50℃で１〜４時間イン
キュベートした。信号プローブの置換を電気泳動により
測定した。混合物を20％未変性ポリアクリルアミドゲル
（30％アクリルアミド溶液:66.6ml、水:21.3ml、３％過
硫酸アンモニウム:2.1ml、10×TBE:10.0ml）中で泳動を
行い、0.45μｍの無菌フィルター装置により濾過した。
全部で44μｌのTEMEDを加え、混合物を放置させた。試
料を加えた（1500ボルト、２時間、緩衝液１×TBE;負荷
緩衝液:30％グリセロール＋染料ブロモフェノールブル
ーおよびキシレンシアノール）。
図１に示した結果から、N.gonorrhoeae（レーン５〜
８）が陽性信号を与えるのに、N.lactamica（レーン９
〜12）は陽性でないことがわかる。しかし、N.meningit
idis（レーン13〜16）も陽性の結果をもたらした。これ
はN.gonorrhoeaeとN.meningitidis間の大きな相同度（r
RNA配列については98.5％程度に高いことが報告されて
いる）に起因するものである。
８）が陽性信号を与えるのに、N.lactamica（レーン９
〜12）は陽性でないことがわかる。しかし、N.meningit
idis（レーン13〜16）も陽性の結果をもたらした。これ
はN.gonorrhoeaeとN.meningitidis間の大きな相同度（r
RNA配列については98.5％程度に高いことが報告されて
いる）に起因するものである。
実施例４
N.meningitidisとの結合を考慮して、別の戦略を検討
した。これらは結合プローブと信号プローブの大きさお
よび開始点を変更するものであった。変更を以下に示し
てあるが、ここで“SDBP"は結合プローブを指し、そし
て“SDSP"は信号プローブを指す。最初の数字は配列の
長さを表し、２番目の数字はN.gonorrhoeae 16S rRNA遺
伝子の5'末端に対するその開始点を表す。
した。これらは結合プローブと信号プローブの大きさお
よび開始点を変更するものであった。変更を以下に示し
てあるが、ここで“SDBP"は結合プローブを指し、そし
て“SDSP"は信号プローブを指す。最初の数字は配列の
長さを表し、２番目の数字はN.gonorrhoeae 16S rRNA遺
伝子の5'末端に対するその開始点を表す。
これらのデータを検討する際に、非相同配列が始まる
N.gonorrhoeaeの塩基“1262"を、当分野で標準的なE.co
li 16S rRNA遺伝子との並列化のために、以後“1213"と
呼ぶことを指摘しておく必要がある。
N.gonorrhoeaeの塩基“1262"を、当分野で標準的なE.co
li 16S rRNA遺伝子との並列化のために、以後“1213"と
呼ぶことを指摘しておく必要がある。
試験したすべてのハイブリッド複合体のうちで、番号
17、すなわちSDBP−32−1266/SDSP−25−1273だけが特
異性を示した。この複合体の初期結合領域は７塩基長
で、非gonorrhoeae Neisseriaに対して４位と５位にミ
スマッチをもっていた。これらの実験は、IBRの長さが
特異性のための重要な基準となることを示した。
17、すなわちSDBP−32−1266/SDSP−25−1273だけが特
異性を示した。この複合体の初期結合領域は７塩基長
で、非gonorrhoeae Neisseriaに対して４位と５位にミ
スマッチをもっていた。これらの実験は、IBRの長さが
特異性のための重要な基準となることを示した。
実施例５
実施例４に記載した観察、つまりIBRの長さの重要性
について以後の実験で調べた。これらの実験では、１個
の点突然変異を組み込んだ合成N.gonorrhoeaeアナライ
トを作製した。上記したプロトコールに従って、SDBP−
32−671/SDSP−25−678複合体を用いた。図２は、１個
の塩基対ミスマッチの解明が可能であることを示す。こ
れは当該技術分野での現在の解明レベルに比べて進歩で
あり、点突然変異によって生じる病気（例えば、鎌型赤
血球貧血症）の診断、さらにはウイルスを含めて密接に
関連した生物の識別の機会を提供するものである。
について以後の実験で調べた。これらの実験では、１個
の点突然変異を組み込んだ合成N.gonorrhoeaeアナライ
トを作製した。上記したプロトコールに従って、SDBP−
32−671/SDSP−25−678複合体を用いた。図２は、１個
の塩基対ミスマッチの解明が可能であることを示す。こ
れは当該技術分野での現在の解明レベルに比べて進歩で
あり、点突然変異によって生じる病気（例えば、鎌型赤
血球貧血症）の診断、さらにはウイルスを含めて密接に
関連した生物の識別の機会を提供するものである。
実施例６
一般に、上記した実施例は完結させるのに約10分を要
した。そこで、アッセイの反応速度を向上させるように
努めた。これを行うにあたって、上記したように、塩基
674で他のNeisseria生物とは異なっているN.gonorrhoea
eの塩基661−687に対応する配列に基づいて組成物を調
製した。多数の複合体を調製し、そして対照の合成N.go
norrhoeae試薬および合成N.meningitidis試薬を用いて
試験した。この置換アッセイは50fmolの試料と10fmolの
ハイブリッド複合体の使用を含んでいた。物質を37℃ま
たは50℃で１時間インキュベートした。置換の結果を図
３、４および５に示す。しかし、これらの結果は次の表
３にまとめることができる。
した。そこで、アッセイの反応速度を向上させるように
努めた。これを行うにあたって、上記したように、塩基
674で他のNeisseria生物とは異なっているN.gonorrhoea
eの塩基661−687に対応する配列に基づいて組成物を調
製した。多数の複合体を調製し、そして対照の合成N.go
norrhoeae試薬および合成N.meningitidis試薬を用いて
試験した。この置換アッセイは50fmolの試料と10fmolの
ハイブリッド複合体の使用を含んでいた。物質を37℃ま
たは50℃で１時間インキュベートした。置換の結果を図
３、４および５に示す。しかし、これらの結果は次の表
３にまとめることができる。
最良の結果を与えた２つの複合体はSDBP−32−671/SD
SP−25−678とSDBP−24−671/SDSP−17−678で、両方と
も７塩基長のIBRをもっていた。次に、これらの複合体
を反応速度実験に使用したところ、上記の実施例に記載
した条件を用いて45℃でインキュベートすると、５分以
内で置換反応が完了した。
SP−25−678とSDBP−24−671/SDSP−17−678で、両方と
も７塩基長のIBRをもっていた。次に、これらの複合体
を反応速度実験に使用したところ、上記の実施例に記載
した条件を用いて45℃でインキュベートすると、５分以
内で置換反応が完了した。
実施例７
アッセイの感度を調べる実験を行った。これらの実験
では、1attamol（１×10-18mol）の複合体を５〜10倍過
剰のアナライトと低ストリンジェント条件下で混合し
た。約1attamolの感度が観測された。
では、1attamol（１×10-18mol）の複合体を５〜10倍過
剰のアナライトと低ストリンジェント条件下で混合し
た。約1attamolの感度が観測された。
ストリンジェント条件についても試験した（0.22×SS
C、10％PEG、375attamolのハイブリッド、0.005attamol
〜53fmolの試料）。これらの条件のもとで、約530attam
olに対する感受性が観測され、これは例えば図６からも
わかる。この図面は化学量論量未満から100倍過剰まで
の範囲の量を用いて得られた結果を示している。
C、10％PEG、375attamolのハイブリッド、0.005attamol
〜53fmolの試料）。これらの条件のもとで、約530attam
olに対する感受性が観測され、これは例えば図６からも
わかる。この図面は化学量論量未満から100倍過剰まで
の範囲の量を用いて得られた結果を示している。
実施例８
２つの異なる方法でハイブリッドの安定性を調べた。
最初の方法は上記のようなハイブリッド複合体を前もっ
て形成し、４℃で貯蔵した。次に、アリコートを定期的
に取り出し、ゲル電気泳動でアッセイした。３週間にわ
たって脱ハイブリダイゼーションが全く見られなかっ
た。この変法において、ハイブリッド複合体を50℃で調
べたら、24時間後に10％未満の“脱ハイブリダイゼーシ
ョン（dehybridization）”が観察された。
最初の方法は上記のようなハイブリッド複合体を前もっ
て形成し、４℃で貯蔵した。次に、アリコートを定期的
に取り出し、ゲル電気泳動でアッセイした。３週間にわ
たって脱ハイブリダイゼーションが全く見られなかっ
た。この変法において、ハイブリッド複合体を50℃で調
べたら、24時間後に10％未満の“脱ハイブリダイゼーシ
ョン（dehybridization）”が観察された。
安定性を調べる２番目の方法はハイブリッドの形成、
蒸発乾固および４℃での貯蔵を含んでいた。５週間にわ
たって１週に１度、残留物をハイブリダイゼーション緩
衝液に再溶解し、アリコートを取り出し、ゲル電気泳動
を実施した。５週間後でさえ脱ハイブリダイゼーション
が全く見られなかった。
蒸発乾固および４℃での貯蔵を含んでいた。５週間にわ
たって１週に１度、残留物をハイブリダイゼーション緩
衝液に再溶解し、アリコートを取り出し、ゲル電気泳動
を実施した。５週間後でさえ脱ハイブリダイゼーション
が全く見られなかった。
実施例９
これらの実験では、ハイブリッド複合体SDBP−32−67
1/SDSP−25−678とSDBP−24−671/SDSP−17−678を使っ
てNeisseria由来のrRNAを分析した。両プローブとも32P
で標識した。
1/SDSP−25−678とSDBP−24−671/SDSP−17−678を使っ
てNeisseria由来のrRNAを分析した。両プローブとも32P
で標識した。
まず初めに、各種のNeisseria菌株からRNAを単離し
た。これを行うために、200mlの各試料を中間対数期ま
で増殖させた。次に“緩衝液A"（200mM Tris,pH8.0,20m
M EDTA,20mM Na3N,20mM オーリン−トリカルボン酸）2
0mlを各培養物に加えた。培養物をペレット化し、ペレ
ットは10mMバナジルリボヌクレオシド複合体（VRC）を
含む“STET"緩衝液（８％スクロース,5％トリトンＸ−1
00,5mM EDTA,50mM Tris,pH7）2ml中に再懸濁した。懸濁
液をフェノール／クロロホルム（1:1）で抽出した。遠
心により相を分離させた。水相を取り出し、0.1容量の3
M酢酸ナトリウムと２容量のエタノールで沈降させた。
た。これを行うために、200mlの各試料を中間対数期ま
で増殖させた。次に“緩衝液A"（200mM Tris,pH8.0,20m
M EDTA,20mM Na3N,20mM オーリン−トリカルボン酸）2
0mlを各培養物に加えた。培養物をペレット化し、ペレ
ットは10mMバナジルリボヌクレオシド複合体（VRC）を
含む“STET"緩衝液（８％スクロース,5％トリトンＸ−1
00,5mM EDTA,50mM Tris,pH7）2ml中に再懸濁した。懸濁
液をフェノール／クロロホルム（1:1）で抽出した。遠
心により相を分離させた。水相を取り出し、0.1容量の3
M酢酸ナトリウムと２容量のエタノールで沈降させた。
沈降物は10,000rpmで15分遠心して濃縮した。次い
で、ペレットを10mM VRCを含むDEPC処理滅菌水2ml中に
再懸濁した。混合物をフェノール／クロロホルムで２回
抽出し、沈降させた。
で、ペレットを10mM VRCを含むDEPC処理滅菌水2ml中に
再懸濁した。混合物をフェノール／クロロホルムで２回
抽出し、沈降させた。
遠心後、得られたペレットを1gのCsClを含むDEPC処理
滅菌水2ml中に再懸濁した。その後、各混合物を5.7M Cs
Cl/100mM EDTA,pH7の0.75mlクッションに重層し、次に
約1mlのグリセロールを重層した。続いて、40,000rpmで
遠心してrRNAを一晩ペレット化させた。グリセロールと
CsClクッションを取り出し、RNAペレットを400μｌのDE
PC処理滅菌水に再懸濁した。RNAを酢酸ナトリウムとエ
タノールで沈降させた。
滅菌水2ml中に再懸濁した。その後、各混合物を5.7M Cs
Cl/100mM EDTA,pH7の0.75mlクッションに重層し、次に
約1mlのグリセロールを重層した。続いて、40,000rpmで
遠心してrRNAを一晩ペレット化させた。グリセロールと
CsClクッションを取り出し、RNAペレットを400μｌのDE
PC処理滅菌水に再懸濁した。RNAを酢酸ナトリウムとエ
タノールで沈降させた。
沈降物を遠心により濃縮し、300μｌのDEPC処理滅菌
水に再懸濁した。光学密度を測定し、RNAをアリコート
に分けて−20℃で凍結させた。11.25μｌアリコートを
１％ホルムアルデヒド／アガロースゲル上で電気泳動を
行い、続いてエチジウムブロミドで可視化することによ
り均質性をチェックした。E.coli rRNAを対照とした。
平均収量はN.gonorrhoeaeの場合が2.9mg、N.meningitid
isの場合が2.7mg、そしてN.lactamicaの場合が3.1mgで
あった。これらの試料は16Sと23Sの両rRNAを含み、その
比は約1/3:2/3であった。
水に再懸濁した。光学密度を測定し、RNAをアリコート
に分けて−20℃で凍結させた。11.25μｌアリコートを
１％ホルムアルデヒド／アガロースゲル上で電気泳動を
行い、続いてエチジウムブロミドで可視化することによ
り均質性をチェックした。E.coli rRNAを対照とした。
平均収量はN.gonorrhoeaeの場合が2.9mg、N.meningitid
isの場合が2.7mg、そしてN.lactamicaの場合が3.1mgで
あった。これらの試料は16Sと23Sの両rRNAを含み、その
比は約1/3:2/3であった。
上記のようなハイブリダイゼーションのプロトコール
を実施した。この実施例に記載したハイブリッド複合体
を用いた。図７および８はN.gonorrhoeaeについての置
換を示すが、N.meningitidisやN.lactamicaについての
置換を示さない。
を実施した。この実施例に記載したハイブリッド複合体
を用いた。図７および８はN.gonorrhoeaeについての置
換を示すが、N.meningitidisやN.lactamicaについての
置換を示さない。
本発明に従ってNeisseriaの急速溶菌試料に対して鎖
置換を行うために、Neisseria株をチョコレート寒天プ
レートで増殖させ、個々のコロニーを50μｌのGTE（グ
ルコース、Tris、EDTA/リゾチーム溶液）を含む滅菌し
た1.5ml微量遠心管に移した。この混合物を強くボルテ
ックス混合し、氷上で５分間インキュベートした。グラ
ム陰性溶菌液（collins,EPA 167238）の50μｌアリコー
トを加え、試料を15秒間ボルテックス混合した。その
後、この試料を鎖置換アッセイに供した。
置換を行うために、Neisseria株をチョコレート寒天プ
レートで増殖させ、個々のコロニーを50μｌのGTE（グ
ルコース、Tris、EDTA/リゾチーム溶液）を含む滅菌し
た1.5ml微量遠心管に移した。この混合物を強くボルテ
ックス混合し、氷上で５分間インキュベートした。グラ
ム陰性溶菌液（collins,EPA 167238）の50μｌアリコー
トを加え、試料を15秒間ボルテックス混合した。その
後、この試料を鎖置換アッセイに供した。
図９に示した結果は、溶菌試料を用いる鎖置換アッセ
イの有効性を実証している。
イの有効性を実証している。
実施例10
実施例１〜９から、N.gonorrhoeaeの同定にここで論
じた鎖置換アッセイを使用できることが明らかである。
このアッセイは、さらに、鎌型赤血球貧血症に関連した
配列の同定についても試験された。
じた鎖置換アッセイを使用できることが明らかである。
このアッセイは、さらに、鎌型赤血球貧血症に関連した
配列の同定についても試験された。
Bakloritiら,Blood 74:1817−1822（1989）に従って
オリゴヌクレオチドを作製した。すなわち、 正常および病気のアナライトの差異は塩基60に見られ
（正常ではＡ、病気ではＴ）、結合プローブの差異は3'
末端から４塩基目に見られる（正常ではＴ、病気では
Ａ）。Neisseriaアッセイに記載した条件を用いて反応
を行い、37℃で反応させた。図10のレーン１〜３では病
気のアナライトとともに正常な結合プローブを使用して
おり、一方、レーン４〜６では正常または病気のアナラ
イトとともに病気のプローブを使用している。点突然変
異の決定的な同定が観察された。さらに、２つのアナラ
イトを比較しても、交差反応性は全く見られなかった。
正常なヘモグロビンモデル配列は鎌型赤血球細胞のヘモ
グロビンモデルアナライトとの置換を示さず、その逆も
同様であった。
オリゴヌクレオチドを作製した。すなわち、 正常および病気のアナライトの差異は塩基60に見られ
（正常ではＡ、病気ではＴ）、結合プローブの差異は3'
末端から４塩基目に見られる（正常ではＴ、病気では
Ａ）。Neisseriaアッセイに記載した条件を用いて反応
を行い、37℃で反応させた。図10のレーン１〜３では病
気のアナライトとともに正常な結合プローブを使用して
おり、一方、レーン４〜６では正常または病気のアナラ
イトとともに病気のプローブを使用している。点突然変
異の決定的な同定が観察された。さらに、２つのアナラ
イトを比較しても、交差反応性は全く見られなかった。
正常なヘモグロビンモデル配列は鎌型赤血球細胞のヘモ
グロビンモデルアナライトとの置換を示さず、その逆も
同様であった。
実施例11
実施例１〜10は溶液中で起こる鎖置換アッセイを詳述
するものである。実際には、固相に基づくアッセイ系が
最も望ましく、診療室や小さい実験室はこうした系が非
常に望ましいことが分かるだろう。
するものである。実際には、固相に基づくアッセイ系が
最も望ましく、診療室や小さい実験室はこうした系が非
常に望ましいことが分かるだろう。
ストレプトアビジンのコーティングを有するラテック
スビーズが固相として使用されたが、この結合剤および
関連分子のアビジンの結合の方法論はよく知られてい
る。これらをビオチンで標識したハイブリッド複合体と
共に使用した。これらの複合体は先に記載したSDBP−32
−671/32P−SDSP−25−678とSDBP−32−1266/32P−SDSP
−25−1273であった。製造業者の説明書（“Applied Bi
osystems User Bulletin 49"を参照）に従ってSDBPにア
ミノ結合を結合させ、生じた物質をビオチニル化した。
これを行うため、アミノ結合オリゴヌクレオチドを乾燥
し、75μｌの0.25M Tris−HCl,pH7.6中に再調製した。
次に、1.0mgのビオチン−NHSエステル試料を75μｌのDM
Fに溶解し、２つの物質を室温で一夜ボルテックス混合
した。DMFを透析により除き、得られた物質をロータリ
ーエバポレーターで濃縮した。この濃縮物を蒸留水に溶
かした。HPLC分析はビオチンの結合が起こったことを示
した。
スビーズが固相として使用されたが、この結合剤および
関連分子のアビジンの結合の方法論はよく知られてい
る。これらをビオチンで標識したハイブリッド複合体と
共に使用した。これらの複合体は先に記載したSDBP−32
−671/32P−SDSP−25−678とSDBP−32−1266/32P−SDSP
−25−1273であった。製造業者の説明書（“Applied Bi
osystems User Bulletin 49"を参照）に従ってSDBPにア
ミノ結合を結合させ、生じた物質をビオチニル化した。
これを行うため、アミノ結合オリゴヌクレオチドを乾燥
し、75μｌの0.25M Tris−HCl,pH7.6中に再調製した。
次に、1.0mgのビオチン−NHSエステル試料を75μｌのDM
Fに溶解し、２つの物質を室温で一夜ボルテックス混合
した。DMFを透析により除き、得られた物質をロータリ
ーエバポレーターで濃縮した。この濃縮物を蒸留水に溶
かした。HPLC分析はビオチンの結合が起こったことを示
した。
ビオチニル化プローブとストレプトアビジンビーズが
得られたら、鎖置換アッセイを行うにあたって２つの異
なる方法論を採用することができる。１つの反応形式は
標的アナライトとハイブリッド複合体との反応を実施す
ることが必要で、その後ストレプトアビジン標識ビーズ
を加えて未反応の複合体をすべて回収した。同様に、複
合体をビーズとプレインキュベートし、固相に結合した
複合体を試料に添加し、その後鎖置換を進行させること
により鎖置換を調べた。
得られたら、鎖置換アッセイを行うにあたって２つの異
なる方法論を採用することができる。１つの反応形式は
標的アナライトとハイブリッド複合体との反応を実施す
ることが必要で、その後ストレプトアビジン標識ビーズ
を加えて未反応の複合体をすべて回収した。同様に、複
合体をビーズとプレインキュベートし、固相に結合した
複合体を試料に添加し、その後鎖置換を進行させること
により鎖置換を調べた。
最初の方法を選択する場合は、上記のような液相反応
を起こさせた後で、ストレプトアビジン標識ビーズを加
え、２分間インキュベートした。その後、物質のアリコ
ートを試験のためにゲルに加えた。
を起こさせた後で、ストレプトアビジン標識ビーズを加
え、２分間インキュベートした。その後、物質のアリコ
ートを試験のためにゲルに加えた。
２番目の変法に従う場合は、ビーズをビオチニル化ハ
イブリッド複合体（SDBP−32−1266/32P−SDSP−25−12
73）と混合し、２分間インキュベートし、その後これら
を試料に加えた。この場合も、反応後に試料のアリコー
トをゲルに加えた。両方の反応形式とも、２組のパラメ
ーター（37℃で90分のインキュベーション、または50℃
で20分のインキュベーション）を使って試験を行った。
図11において、レーン１〜８はビーズの存在下でアッセ
イを行った場合の結果を示し、そしてレーン９〜16は反
応後にビーズを加えた場合に得られた結果を示す。全て
の場合に、9fmolの複合体と50fmolのアナライトを使用
した。N.gonorrhoeaeのモデルアナライトのみが置換を
生じ、meningitidisとlactamicaのモデルは何も示さな
かった。
イブリッド複合体（SDBP−32−1266/32P−SDSP−25−12
73）と混合し、２分間インキュベートし、その後これら
を試料に加えた。この場合も、反応後に試料のアリコー
トをゲルに加えた。両方の反応形式とも、２組のパラメ
ーター（37℃で90分のインキュベーション、または50℃
で20分のインキュベーション）を使って試験を行った。
図11において、レーン１〜８はビーズの存在下でアッセ
イを行った場合の結果を示し、そしてレーン９〜16は反
応後にビーズを加えた場合に得られた結果を示す。全て
の場合に、9fmolの複合体と50fmolのアナライトを使用
した。N.gonorrhoeaeのモデルアナライトのみが置換を
生じ、meningitidisとlactamicaのモデルは何も示さな
かった。
別の実験では、置換反応を10fmolのビオチン標識SDBP
−32−671/32P−SDSP−25−678を用いて行い、50℃で30
分間インキュベートし、コーティングしたビーズを加え
る前に氷上で冷やした。合成アナライトを試験し、同様
に粗製RNA抽出物も試験した。図12にこれらの結果を示
す。合成N.gonorrhoeaeについては完全な反応が起こっ
たが、N.meningitidisでは部分的な反応が起こったにす
ぎなかった（それぞれレーン２および４）。また、粗製
N.gonorrhoeae抽出物のみが反応を示し（レーン５）、
その他の粗製抽出物（レーン６〜８）は反応を示さなか
った。
−32−671/32P−SDSP−25−678を用いて行い、50℃で30
分間インキュベートし、コーティングしたビーズを加え
る前に氷上で冷やした。合成アナライトを試験し、同様
に粗製RNA抽出物も試験した。図12にこれらの結果を示
す。合成N.gonorrhoeaeについては完全な反応が起こっ
たが、N.meningitidisでは部分的な反応が起こったにす
ぎなかった（それぞれレーン２および４）。また、粗製
N.gonorrhoeae抽出物のみが反応を示し（レーン５）、
その他の粗製抽出物（レーン６〜８）は反応を示さなか
った。
実施例12
ニトロセルロース膜とともに使用する場合の置換アッ
セイを試験する実験も行った。これらの実験では、ニト
ロセルロース膜（５μm,MSI）に底から約0.5cmのところ
で反応混合物をアプライした。次に、ハイブリダイゼー
ション緩衝液を、溶媒の前面が約2.5cm移動するまで加
えた。試験片をカバーし、オートラジオグラフィーを行
った。
セイを試験する実験も行った。これらの実験では、ニト
ロセルロース膜（５μm,MSI）に底から約0.5cmのところ
で反応混合物をアプライした。次に、ハイブリダイゼー
ション緩衝液を、溶媒の前面が約2.5cm移動するまで加
えた。試験片をカバーし、オートラジオグラフィーを行
った。
図13は試験片フォーマットアッセイのための典型的な
システムを示す。ここに記載した実験においては、ビオ
チン標識ハイブリッド複合体SDBP−32−671/32P−SDSP
−25−678（10fmol）を種々のNeisseriaアナライトと組
み合わせた。反応温度は50℃とした。アリコートを２、
５および10分おきに取り出し、ストレプトアビジンをコ
ーティングしたビーズに加え、氷上で貯蔵した。この混
合物を上記の試験片に２通りずつアプライし、オートラ
ジオグラフィーにかけた。
システムを示す。ここに記載した実験においては、ビオ
チン標識ハイブリッド複合体SDBP−32−671/32P−SDSP
−25−678（10fmol）を種々のNeisseriaアナライトと組
み合わせた。反応温度は50℃とした。アリコートを２、
５および10分おきに取り出し、ストレプトアビジンをコ
ーティングしたビーズに加え、氷上で貯蔵した。この混
合物を上記の試験片に２通りずつアプライし、オートラ
ジオグラフィーにかけた。
図14に結果を示す。対照反応では、アナライトが存在
せず、ハイブリッド複合体がアプライ位置に止まった。
正しいアナライト（図面では“A"）を加えると、放射能
が徐々に消失することによって示されるように、置換が
起こる。N.meningitidis（図面では“M"）の場合はこれ
が起こらない。
せず、ハイブリッド複合体がアプライ位置に止まった。
正しいアナライト（図面では“A"）を加えると、放射能
が徐々に消失することによって示されるように、置換が
起こる。N.meningitidis（図面では“M"）の場合はこれ
が起こらない。
実施例13
複合体との置換後にビーズを加える場合のシステムに
ついて反応速度を比較した。すべてのパラメーターは実
施例12と同じにした。図15および16に示す結果は、ビー
ズを複合体とともに加えるとき、80％の置換が40分後に
起こったことを示す。一方、ビーズをあとで加えると、
たったの10分後に80％の置換が起こった。反応速度の著
しい相違を考慮して、以後の実験は速い方の反応システ
ムを採用することにする。
ついて反応速度を比較した。すべてのパラメーターは実
施例12と同じにした。図15および16に示す結果は、ビー
ズを複合体とともに加えるとき、80％の置換が40分後に
起こったことを示す。一方、ビーズをあとで加えると、
たったの10分後に80％の置換が起こった。反応速度の著
しい相違を考慮して、以後の実験は速い方の反応システ
ムを採用することにする。
実施例14
上記の試験片に基づくアッセイにおいて合成アナライ
トを使用した。rRNAを用いるアッセイの実施可能性につ
いて試験した。用いたプローブ複合体は実施例11〜13で
使用したものであり、アナライトは上記した方法で抽出
したRNAか合成アナライトであった。アッセイのプロト
コールは実施例12および13のものであった。図17から明
らかなように、結果は、粗製核酸混合物（N.gonorrhoea
e RR21）および純粋なRNAは置換を示したが、純粋なN.l
actamicaRNAと純粋なN.meningitidis RNAは置換を示さ
ないというものであった。
トを使用した。rRNAを用いるアッセイの実施可能性につ
いて試験した。用いたプローブ複合体は実施例11〜13で
使用したものであり、アナライトは上記した方法で抽出
したRNAか合成アナライトであった。アッセイのプロト
コールは実施例12および13のものであった。図17から明
らかなように、結果は、粗製核酸混合物（N.gonorrhoea
e RR21）および純粋なRNAは置換を示したが、純粋なN.l
actamicaRNAと純粋なN.meningitidis RNAは置換を示さ
ないというものであった。
実施例15
反応工程を単純化するため、上で論じた試験片方法の
改良法を開発した。この改良法は直接試験片上捕捉法と
呼ばれるもので、図18に示される。本質的には、ニトロ
セルロース片の一部に熱−BSAストレプトアビジンを標
準的技法によりコーティングする。実施例11〜14のビオ
チニル化ハイブリッド複合体を用いて標準液相置換反応
を実施した。置換後、プレコーティングした試験片の上
に反応アリコートを点在させた（2fmolのプローブ、お
よび0.1、0.3、1.0、３、10.0および30.0fmolのアナラ
イト）。インキュベーションは50℃で１時間であった。
各アナライトは２回、対照は３回の反復実験を行った。
５分後試験片をクロマトグラフィーにかけ、図19に示す
ようにオートラジオグラフィーにかけた。あらゆる濃度
で置換が起こったが、対照も若干の置換を示した。
改良法を開発した。この改良法は直接試験片上捕捉法と
呼ばれるもので、図18に示される。本質的には、ニトロ
セルロース片の一部に熱−BSAストレプトアビジンを標
準的技法によりコーティングする。実施例11〜14のビオ
チニル化ハイブリッド複合体を用いて標準液相置換反応
を実施した。置換後、プレコーティングした試験片の上
に反応アリコートを点在させた（2fmolのプローブ、お
よび0.1、0.3、1.0、３、10.0および30.0fmolのアナラ
イト）。インキュベーションは50℃で１時間であった。
各アナライトは２回、対照は３回の反復実験を行った。
５分後試験片をクロマトグラフィーにかけ、図19に示す
ようにオートラジオグラフィーにかけた。あらゆる濃度
で置換が起こったが、対照も若干の置換を示した。
実施例16
配列番号:4、５および６に示したプローブおよびそれ
らの相補鎖は鎖置換アッセイ以外のアッセイにも有用で
ある。それらを広範囲に試験するため、世界中からNeis
seria gonorrhoeaeの200を上回る臨床単離株を選択し
た。
らの相補鎖は鎖置換アッセイ以外のアッセイにも有用で
ある。それらを広範囲に試験するため、世界中からNeis
seria gonorrhoeaeの200を上回る臨床単離株を選択し
た。
プローブ実験を行うために、Neisseria株の25μｌ培
養物を増殖させ、標準法によりゲノムDNAを抽出した。D
NAを精製し、アガロース上で純度と完全性をチェックし
た。これがすんだら、やはり標準法を用いて10μｇの試
料をナイロン膜にアプライした。次いで、プローブ試料
を加え（約３×105カウントの32P標識プローブ）、65℃
で一夜ハイブリダイゼーションを行った。膜を洗って、
フィルムに露出した。
養物を増殖させ、標準法によりゲノムDNAを抽出した。D
NAを精製し、アガロース上で純度と完全性をチェックし
た。これがすんだら、やはり標準法を用いて10μｇの試
料をナイロン膜にアプライした。次いで、プローブ試料
を加え（約３×105カウントの32P標識プローブ）、65℃
で一夜ハイブリダイゼーションを行った。膜を洗って、
フィルムに露出した。
結果を添付の表４に示す。表中の記号は次の配列番号
に対応する。
に対応する。
表４は、その広範な試験および陽性結果から、このシ
ステムの有効性を示している。プローブの総効率は次の
とおりである。プローブ 陽性株／総数 効率 1A 194/199 97.5 2A 196/199 98.5 3 196/199 98.5 4 196/199 98.5 5 196/199 98.5 6 197/199 99.0 実施例17 DNAに対する特異性を示す実施例16の結果を考慮し
て、RNA特異性を調べる試験を行った。25のRNA株を無作
為に選び、RNAを標準法または上に示した方法により抽
出した。対照株も用いた。抽出したRNAを定量し、１％
ホルムアルデヒド−アガロースゲル上で電気泳動を行っ
て純度と完全性をチェックし、その後10μｇの試料をナ
イロン膜にアプライした。RNAは脱イオン化ホルムアミ
ドおよびホルムアルデヒドを加えて変性し、50℃で１時
間インキュベートし、氷上で冷やし、その後膜にアプラ
イした。ハイブリダイゼーションは、上気したプロトコ
ールに従って、5'32P標識プローブを用いて60℃で一夜
行った。
ステムの有効性を示している。プローブの総効率は次の
とおりである。プローブ 陽性株／総数 効率 1A 194/199 97.5 2A 196/199 98.5 3 196/199 98.5 4 196/199 98.5 5 196/199 98.5 6 197/199 99.0 実施例17 DNAに対する特異性を示す実施例16の結果を考慮し
て、RNA特異性を調べる試験を行った。25のRNA株を無作
為に選び、RNAを標準法または上に示した方法により抽
出した。対照株も用いた。抽出したRNAを定量し、１％
ホルムアルデヒド−アガロースゲル上で電気泳動を行っ
て純度と完全性をチェックし、その後10μｇの試料をナ
イロン膜にアプライした。RNAは脱イオン化ホルムアミ
ドおよびホルムアルデヒドを加えて変性し、50℃で１時
間インキュベートし、氷上で冷やし、その後膜にアプラ
イした。ハイブリダイゼーションは、上気したプロトコ
ールに従って、5'32P標識プローブを用いて60℃で一夜
行った。
プローブ2A、４および６は一本鎖16S rRNAとハイブリ
ダイズしたが、16S rRNAと同一であるはずのプローブ1
A、３および５はハイブリダイズしなかった。３つの事
例はすべて感度が100％であった。
ダイズしたが、16S rRNAと同一であるはずのプローブ1
A、３および５はハイブリダイズしなかった。３つの事
例はすべて感度が100％であった。
考察
上記の実施例は改良された形の鎖置換アッセイについ
て記述するものである。本質的に、この方法は対象とな
る試料をハイブリッド複合体と接触させることを含む。
複合体は結合プローブと信号プローブを含有する。この
複合体の第１のメンバーは初期結合領域つまり“IBR"と
標的結合領域に分けることができる。標的結合領域と信
号プローブが互いにハイブリダイズし、IBRは複合体か
ら延在している。結合プローブはその全体がアッセイす
べき核酸分子に相補的でなければならない。複合体を試
料に加えると、結合プローブが試料の核酸アナライトと
ハイブリダイズし始める。より長い配列のハイブリッド
の方が短いものより安定しているから、標的と結合プロ
ーブとのハイブリダイゼーションが有利となり、信号プ
ローブの置換をもたらす。いったん置換されたら、信号
プローブを測定または観察することにより標的アナライ
トの測定が得られる。
て記述するものである。本質的に、この方法は対象とな
る試料をハイブリッド複合体と接触させることを含む。
複合体は結合プローブと信号プローブを含有する。この
複合体の第１のメンバーは初期結合領域つまり“IBR"と
標的結合領域に分けることができる。標的結合領域と信
号プローブが互いにハイブリダイズし、IBRは複合体か
ら延在している。結合プローブはその全体がアッセイす
べき核酸分子に相補的でなければならない。複合体を試
料に加えると、結合プローブが試料の核酸アナライトと
ハイブリダイズし始める。より長い配列のハイブリッド
の方が短いものより安定しているから、標的と結合プロ
ーブとのハイブリダイゼーションが有利となり、信号プ
ローブの置換をもたらす。いったん置換されたら、信号
プローブを測定または観察することにより標的アナライ
トの測定が得られる。
ハイブリッド複合体のメンバーに関してはいくつかの
要件がある。結合プローブについては、IBRは、非アナ
ライト配列へのハイブリダイゼーションを防止するた
め、あまり長すぎてはいけない。これは、例えばIBRが
非標的配列に95％相同で、５％の差異がIBRの長さに沿
って分散されている場合に起こり得る。このことがたま
たま起こると、IBRはランダムに配置された非相補性の
領域を無視して、とにかくハイブリダイズするであろ
う。こうした問題を避けるため、IBRは非相補的結合を
防止するに十分短くなければならない。同様に、全プロ
ーブ配列は非相補的配列との安定したハイブリッドの形
成を防止するに十分なほど短くなければならない。これ
は、たとえIBRが誤ったハイブリダイゼーションに参加
しない場合でも、より長い領域が依然としてハイブリダ
イズする恐れがあるので、長いプローブを用いるときに
起こり得る。好ましくは、全プローブ配列は長さが20〜
40塩基で、25〜35塩基の長さが特に好ましい。これらの
プローブ配列において、IBRの長さを10塩基またはこれ
より少なくして、標的結合領域の長さとして好ましくは
10〜30ヌクレオチド塩基、あるいは15〜35ヌクレオチド
塩基を残しておくことが好適である。特に良好な結果
は、例えばIBRが７塩基長で、標的結合領域が25塩基長
である場合に得られた。
要件がある。結合プローブについては、IBRは、非アナ
ライト配列へのハイブリダイゼーションを防止するた
め、あまり長すぎてはいけない。これは、例えばIBRが
非標的配列に95％相同で、５％の差異がIBRの長さに沿
って分散されている場合に起こり得る。このことがたま
たま起こると、IBRはランダムに配置された非相補性の
領域を無視して、とにかくハイブリダイズするであろ
う。こうした問題を避けるため、IBRは非相補的結合を
防止するに十分短くなければならない。同様に、全プロ
ーブ配列は非相補的配列との安定したハイブリッドの形
成を防止するに十分なほど短くなければならない。これ
は、たとえIBRが誤ったハイブリダイゼーションに参加
しない場合でも、より長い領域が依然としてハイブリダ
イズする恐れがあるので、長いプローブを用いるときに
起こり得る。好ましくは、全プローブ配列は長さが20〜
40塩基で、25〜35塩基の長さが特に好ましい。これらの
プローブ配列において、IBRの長さを10塩基またはこれ
より少なくして、標的結合領域の長さとして好ましくは
10〜30ヌクレオチド塩基、あるいは15〜35ヌクレオチド
塩基を残しておくことが好適である。特に良好な結果
は、例えばIBRが７塩基長で、標的結合領域が25塩基長
である場合に得られた。
ここに記載したタイプのハイブリッド複合体はアナラ
イトの測定に有用であり、１個の塩基対の差異のレベル
まで区別することができる。複合体は、それ自体で、種
々のアナライトおよび病理学的状態（点突然変異を含
む）の診断アッセイに有用である。この方法のさまざま
な診断的使用のなかで、とりわけ性的感染症、ウイルス
感染症、バクテリア、染色体障害、遺伝的疾患、核酸変
異などを挙げることができる。
イトの測定に有用であり、１個の塩基対の差異のレベル
まで区別することができる。複合体は、それ自体で、種
々のアナライトおよび病理学的状態（点突然変異を含
む）の診断アッセイに有用である。この方法のさまざま
な診断的使用のなかで、とりわけ性的感染症、ウイルス
感染症、バクテリア、染色体障害、遺伝的疾患、核酸変
異などを挙げることができる。
本発明のアッセイを行う際には、先に記述したよう
に、液相アッセイと固相アッセイの両方が可能である
が、後者のカテゴリーが特に好ましい。後者のカテゴリ
ーの変法として、ハイブリッド複合体をビーズ、ニトロ
セルロース紙またはナイロン膜といった固体に結合させ
ておき、信号プローブをそこから置換させるアッセイが
ある。置換された信号をその後測定することができる。
このようなシステムにおいて、固相への核酸の固定化は
やや日常的であるように、当業者に知られた多くの方法
で結合プローブを固相に結合させることができる。特に
好ましいシステムは、結合プローブを（ストレプト）ア
ビジン−ビオチン結合系により固定するもので、この結
合系の要素は交換し合ってもよい。固相ヘプローブを結
合させるため付加的なリンカー分子を使用することもで
きる。
に、液相アッセイと固相アッセイの両方が可能である
が、後者のカテゴリーが特に好ましい。後者のカテゴリ
ーの変法として、ハイブリッド複合体をビーズ、ニトロ
セルロース紙またはナイロン膜といった固体に結合させ
ておき、信号プローブをそこから置換させるアッセイが
ある。置換された信号をその後測定することができる。
このようなシステムにおいて、固相への核酸の固定化は
やや日常的であるように、当業者に知られた多くの方法
で結合プローブを固相に結合させることができる。特に
好ましいシステムは、結合プローブを（ストレプト）ア
ビジン−ビオチン結合系により固定するもので、この結
合系の要素は交換し合ってもよい。固相ヘプローブを結
合させるため付加的なリンカー分子を使用することもで
きる。
また、上に示したように、置換アッセイを行った後に
固相を加えて、アッセイを実施した溶液から複合体を分
離することも可能である。続いて、固相上のまたは溶液
中の信号の量を測定する。
固相を加えて、アッセイを実施した溶液から複合体を分
離することも可能である。続いて、固相上のまたは溶液
中の信号の量を測定する。
信号プローブは、その同定を容易にするために、もち
ろん標識される。核酸配列の標識化には多くの信号の任
意のものを使用し得るが、32P、35Sなどの放射性標識を
用いることができる。金ゾルのような金属粒子も使用で
き、また、蛍光体、化学発光体、あるいは着色した微粒
子のような“固有の”信号を呈示する他の物質を使用し
てもよい。また、検出のために更なる処理が必要である
という点で固有の信号を発生する物質ではない他の標識
も使用し得る。かかる物質にはペルオキシダーゼやアル
カリホスファターゼのような酵素（この場合は信号発生
のために酵素の基質を添加する）、磁性粒子、抗原また
はハプテン分子、抗体など（この場合は信号の存在を示
すために更なる反応が必要となる）が含まれる。
ろん標識される。核酸配列の標識化には多くの信号の任
意のものを使用し得るが、32P、35Sなどの放射性標識を
用いることができる。金ゾルのような金属粒子も使用で
き、また、蛍光体、化学発光体、あるいは着色した微粒
子のような“固有の”信号を呈示する他の物質を使用し
てもよい。また、検出のために更なる処理が必要である
という点で固有の信号を発生する物質ではない他の標識
も使用し得る。かかる物質にはペルオキシダーゼやアル
カリホスファターゼのような酵素（この場合は信号発生
のために酵素の基質を添加する）、磁性粒子、抗原また
はハプテン分子、抗体など（この場合は信号の存在を示
すために更なる反応が必要となる）が含まれる。
本発明はまた、ここに記載したタイプの置換アッセイ
を行うのに有用な試薬キットおよび複合体を包含する。
本発明の複合体は上述したものである。試薬キットはこ
の複合体を含み、さらに、例えばアッセイの前または後
で複合体を結合させるための固相成分、および信号プロ
ーブの標識を検出するための信号手段を含むことができ
る。信号手段は標識配列から分離しておくが、固相材料
は結合プローブに直接結合させてもさせなくともよい。
所望により、結合プローブと信号プローブをキットの別
の部分に存在させることも可能である。
を行うのに有用な試薬キットおよび複合体を包含する。
本発明の複合体は上述したものである。試薬キットはこ
の複合体を含み、さらに、例えばアッセイの前または後
で複合体を結合させるための固相成分、および信号プロ
ーブの標識を検出するための信号手段を含むことができ
る。信号手段は標識配列から分離しておくが、固相材料
は結合プローブに直接結合させてもさせなくともよい。
所望により、結合プローブと信号プローブをキットの別
の部分に存在させることも可能である。
また、固相への複合体の結合は診断装置の作製を可能
にする。その際、ニトロセルロース紙片のような固体担
体の上に複合体を固定化させる。この紙片は、結合させ
た複合体の下流の地点に、置換された標識を測定するた
めの信号発生系を含む。信号発生系は、例えば試薬の容
器の形で、紙片の“オフボード（off board）”で提供
されてもよい。
にする。その際、ニトロセルロース紙片のような固体担
体の上に複合体を固定化させる。この紙片は、結合させ
た複合体の下流の地点に、置換された標識を測定するた
めの信号発生系を含む。信号発生系は、例えば試薬の容
器の形で、紙片の“オフボード（off board）”で提供
されてもよい。
この出願の最初の2,3の実施例は、特異的なN.gonorrh
oeae診断プローブとして有用な、単離された核酸配列を
記述している。これらのオリゴマーは偽陽性をもたらす
程度にNeisseriaの他の種とはハイブリダイズせず、従
ってgonorrhoeaeの診断において特に有用である。例え
ば、配列番号:1、４〜６、および７が前記オリゴマーの
例である。これらのプローブは上記した方法のいずれ
か、あるいは当分野で知られた他の方法で標識される。
上記の鎖置換アッセイとともに異なるアッセイ形式を採
用することができる。アッセイの特に望ましい応用は自
動化されたシステムにある。こうしたシステムでは、ハ
イブリッド複合体が試験管または反応キュベットの内壁
のような固相上に固定化される。複合体は直接的に、
（ストレプト）アビジン−ビオチン複合体により、ある
いは核酸固定化のために利用できる他の手段により固定
化することができる。その後、試料を複合体の担体に加
えると、試料液体、上清液などへの信号プローブの置換
が起こる。その後、信号プローブを含む液体を自動化シ
ステムのある個所に移して、そこで信号を測定する。本
発明の他の態様も当業者には明らかであり、ここで繰り
返す必要はないだろう。
oeae診断プローブとして有用な、単離された核酸配列を
記述している。これらのオリゴマーは偽陽性をもたらす
程度にNeisseriaの他の種とはハイブリダイズせず、従
ってgonorrhoeaeの診断において特に有用である。例え
ば、配列番号:1、４〜６、および７が前記オリゴマーの
例である。これらのプローブは上記した方法のいずれ
か、あるいは当分野で知られた他の方法で標識される。
上記の鎖置換アッセイとともに異なるアッセイ形式を採
用することができる。アッセイの特に望ましい応用は自
動化されたシステムにある。こうしたシステムでは、ハ
イブリッド複合体が試験管または反応キュベットの内壁
のような固相上に固定化される。複合体は直接的に、
（ストレプト）アビジン−ビオチン複合体により、ある
いは核酸固定化のために利用できる他の手段により固定
化することができる。その後、試料を複合体の担体に加
えると、試料液体、上清液などへの信号プローブの置換
が起こる。その後、信号プローブを含む液体を自動化シ
ステムのある個所に移して、そこで信号を測定する。本
発明の他の態様も当業者には明らかであり、ここで繰り
返す必要はないだろう。
上記の詳細な記述および実施例は例示的なものであっ
て本発明を限定するものではないこと、そして本発明の
精神および範囲に含まれる他の実施態様が当業者には自
明であることが理解されるであろう。
て本発明を限定するものではないこと、そして本発明の
精神および範囲に含まれる他の実施態様が当業者には自
明であることが理解されるであろう。
配列表
配列番号:1
配列の長さ:18塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号:2
配列の長さ:16塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号:3
配列の長さ:16塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号:4
配列の長さ:27塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号:5
配列の長さ:27塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号:6
配列の長さ:27塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号:7
配列の長さ:25塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号:8
配列の長さ:17塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号:9
配列の長さ:24塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号:10
配列の長さ:24塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号:11
配列の長さ:80塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号:12
配列の長さ:80塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 バルゴビン，ニール
アメリカ合衆国 96250 インディアナ
州 インディアナポリス， ヘイグ ロ
ード 9115番地
(72)発明者 バック，ハーヴェイ
アメリカ合衆国 46250 インディアナ
州 インディアナポリス， ヘイグ ロ
ード 9115番地
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12Q 1/68
C12N 15/09
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (7)
- 【請求項１】Neisseria gonorrheaに特異的なヌクレオ
チド配列を検出することにより試料中のNeisseria gono
rrheaの存在を測定する方法であって、 試料を、 （ａ）配列番号:4、配列番号:4に相補的な配列、配列番
号:5、配列番号:5に相補的な配列、配列番号:6、および
配列番号:6に相補的な配列よりなる群から選ばれ、標的
結合領域を含む、プローブヌクレオチド配列；および （ｂ）該標的結合領域の少なくとも一部分に沿って該プ
ローブヌクレオチド配列にハイブリダイズされた標識ヌ
クレオチド配列； の複合体と接触させ、その際、Neisseria gonorrheaに
特異的な該ヌクレオチド配列は該プローブヌクレオチド
配列と結合して、そこから該標識ヌクレオチド配列を放
出させるものであり、そして 該試料中の放出された該標識ヌクレオチド配列を該試料
におけるNeisseria gonorrheaの存在の指標として測定
する、ことからなる方法。 - 【請求項２】溶液中で行う、請求項１に記載の方法。
- 【請求項３】固相上で行う、請求項１に記載の方法。
- 【請求項４】前記の標識ヌクレオチド配列が非放射性標
識で標識されている、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】前記の標識ヌクレオチド配列がハプテンで
標識されている、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】前記のハプテンがビオチン、フルオレセイ
ンまたはジゴキシンである、請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】試料中のNeisseria gonorrheaを測定する
のに有用な核酸分子の複合体であって、本質的に、 （ａ）配列番号:4、配列番号:4に相補的な配列、配列番
号:5、配列番号:5に相補的な配列、配列番号:6、および
配列番号:6に相補的な配列よりなる群から選ばれるプロ
ーブ；および （ｂ）該プローブにそのヌクレオチド配列の一部分に沿
ってハイブリダイズされた標識ヌクレオチド配列； からなる複合体。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/945,156 US5445933A (en) | 1992-09-15 | 1992-09-15 | Strand displacement assay and complex useful therefor |
| US07/945,156 | 1992-09-15 | ||
| PCT/US1993/008707 WO1994006937A1 (en) | 1992-09-15 | 1993-09-15 | Improved strand displacement assay and complex useful therefor |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08501689A JPH08501689A (ja) | 1996-02-27 |
| JP3436538B2 true JP3436538B2 (ja) | 2003-08-11 |
Family
ID=25482719
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50827894A Expired - Lifetime JP3436538B2 (ja) | 1992-09-15 | 1993-09-15 | 改良型の鎖置換アッセイおよびそれに有用な複合体 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5445933A (ja) |
| EP (1) | EP0672186B1 (ja) |
| JP (1) | JP3436538B2 (ja) |
| DE (1) | DE69328118T2 (ja) |
| ES (1) | ES2145062T3 (ja) |
| WO (1) | WO1994006937A1 (ja) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2751000B1 (fr) * | 1996-07-12 | 1998-10-30 | Inst Nat Sante Rech Med | Adn specifiques des bacteries de l'espece neisseria meningitidis, leurs procedes d'obtention et leurs applications biologiques |
| CA2260749A1 (en) * | 1996-07-16 | 1998-01-22 | Gen-Probe Incorporated | Methods for detecting rna analytes using modified probes |
| US7070925B1 (en) | 1996-07-16 | 2006-07-04 | Gen-Probe Incorporated | Method for determining the presence of an RNA analyte in a sample using a modified oligonucleotide probe |
| US5994068A (en) | 1997-03-11 | 1999-11-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Nucleic acid indexing |
| WO1999024612A2 (en) * | 1997-11-06 | 1999-05-20 | Mosaic Technologies | Multiple sequential polynucleotide displacement reactions for signal amplification and processing |
| US6322968B1 (en) * | 1997-11-21 | 2001-11-27 | Orchid Biosciences, Inc. | De novo or “universal” sequencing array |
| US6365346B1 (en) | 1998-02-18 | 2002-04-02 | Dade Behring Inc. | Quantitative determination of nucleic acid amplification products |
| US7090975B2 (en) * | 1998-03-13 | 2006-08-15 | Promega Corporation | Pyrophosphorolysis and incorporation of nucleotide method for nucleic acid detection |
| US6270973B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-08-07 | Promega Corporation | Multiplex method for nucleic acid detection |
| US6277578B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-08-21 | Promega Corporation | Deploymerization method for nucleic acid detection of an amplified nucleic acid target |
| US6703211B1 (en) | 1998-03-13 | 2004-03-09 | Promega Corporation | Cellular detection by providing high energy phosphate donor other than ADP to produce ATP |
| US6391551B1 (en) | 1998-03-13 | 2002-05-21 | Promega Corporation | Detection of nucleic acid hybrids |
| US6235480B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-05-22 | Promega Corporation | Detection of nucleic acid hybrids |
| US6312902B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-11-06 | Promega Corporation | Nucleic acid detection |
| US6270974B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-08-07 | Promega Corporation | Exogenous nucleic acid detection |
| US6268146B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-07-31 | Promega Corporation | Analytical methods and materials for nucleic acid detection |
| US6361945B1 (en) * | 1998-07-02 | 2002-03-26 | Gen-Probe Incorporated | Molecular torches |
| AU6412799A (en) | 1998-10-05 | 2000-04-26 | Mosaic Technologies | Reverse displacement assay for detection of nucleic acid sequences |
| JP2003508015A (ja) * | 1999-04-02 | 2003-03-04 | モザイク テクノロジーズ インコーポレーテッド | アダプター分子を用いる標的分子の電気泳動分析 |
| US7005265B1 (en) | 2002-06-20 | 2006-02-28 | Wenhong Fan | Nonenzymatic catalytic signal amplification for nucleic acid hybridization assays |
| AU2005262357B2 (en) | 2004-07-01 | 2009-10-29 | Gen-Probe Incorporated | Methods and compositions to detect nucleic acids in a biological sample |
| CA2723726C (en) | 2008-05-13 | 2017-09-12 | Michael M. Becker | Inactivatable target capture oligomers for use in the selective hybridization and capture of target nucleic acid sequences |
| US8399222B2 (en) | 2008-11-25 | 2013-03-19 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and methods for detecting small RNAs, and uses thereof |
| US20130071839A1 (en) * | 2011-09-02 | 2013-03-21 | Georg Seelig | Systems and methods for detecting biomarkers of interest |
| US9851330B2 (en) * | 2015-03-20 | 2017-12-26 | Konica Minolta Laboratory U.S.A., Inc. | Rapid, highly-sensitive, and highly-specific nucleic acid detection |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4766064A (en) * | 1984-05-07 | 1988-08-23 | Allied Corporation | Displacement polynucleotide assay employing polyether and diagnostic kit |
| US4766062A (en) * | 1984-05-07 | 1988-08-23 | Allied Corporation | Displacement polynucleotide assay method and polynucleotide complex reagent therefor |
| US4767699A (en) * | 1985-05-02 | 1988-08-30 | Allied Corporation | Diagnostic reagent, kit and method employing polynucleotide displacement, separation, enzymatic cleavage and adenosine phosphate detection |
| US4735897A (en) * | 1985-05-02 | 1988-04-05 | Allied Corporation | Method and kit for detecting polyriboadenosine segments and messenger RNA |
| US4795701A (en) * | 1985-07-17 | 1989-01-03 | Allied Corporation | Homogeneous polynucleotide displacement assay method kit and reagent complex |
| US4725537A (en) * | 1985-09-19 | 1988-02-16 | Allied Corporation | Assay, reagent and kit employing nucleic acid strand displacement and restriction endonuclease cleavage |
| US4725536A (en) * | 1985-09-19 | 1988-02-16 | Genetics Institute, Inc. | Reagent polynucleotide complex with multiple target binding regions, and kit and methods |
| EP0219842A1 (en) * | 1985-10-23 | 1987-04-29 | Allied Corporation | Nucleic acid assay employing pair segment inhibition or competition |
| EP0286642A4 (en) * | 1985-12-17 | 1990-06-27 | Genetics Inst | TEST PROCEDURE BY MEANS OF POLYNUCLEOTIDE DISPLACEMENT AND REAGENT COMPLEX. |
| US4752566A (en) * | 1985-12-17 | 1988-06-21 | Genetics Institute, Inc. | Displacement polynucleotide method and reagent complex employing labeled probe polynucleotide |
| US4818680A (en) * | 1985-12-18 | 1989-04-04 | Mary Collins | Method and kit involving displacement and rehybridization of labeled polynucleotide |
| EP1507000B1 (en) * | 1990-05-03 | 2010-03-03 | Cornell Research Foundation, Inc. | A thermostable ligase mediated DNA amplification system for the detection of genetic diseases |
-
1992
- 1992-09-15 US US07/945,156 patent/US5445933A/en not_active Expired - Lifetime
-
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