JPH08501689A - 改良型の鎖置換アッセイおよびそれに有用な複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、公知の鎖置換アッセイの改良法および該方法に有用な組成物に関する。改良点は１個のヌクレオチド塩基のオーダーでの診断が可能なことである。

Description

【発明の詳細な説明】 改良型の鎖置換アッセイおよびそれに有用な複合体発明の分野 本発明は臨床分析の分野に関する。より詳細には、本発明は、公知の鎖置換ア ッセイ（strand displacement assay）に改良を加えた分析方法および装置に関 する。さらに、本発明は、鎖置換アッセイ法を用いる Neisseria gonorrhoeae （淋菌）の検査ならびに他の核酸プローブアッセイにおいて有用な核酸配列に関 する。背景および従来技術 臨床化学の分野で広く知られており、また受け入れられている診断アッセイの １グループは核酸ハイブリダイゼーションに基づくものである。周知のことだが 、核酸分子（ＤＮＡおよびＲＮＡ）は核酸の相補鎖同士がハイブリダイズして二 本鎖分子を形成することができる。 核酸ハイブリダイゼーションの原理はきわめて単純な２つの規則に基づいてい る。すべての核酸分子は４種類のヌクレオチド塩基から成り立っている。ＤＮＡ は“Ａ”、“Ｔ”、“Ｃ”および“Ｇ”の塩基を含み、一方ＲＮＡは“Ａ”、“ Ｕ”、“Ｃ”および“Ｇ”を含む。上記した２つの単純な規則は（ｉ）塩基“Ａ ”と“Ｔ”または“Ｕ”が相補的で互いとハイブリダイズし、そして“Ｃ”と“ Ｇ”が相補的で互いとハイブリダイズする、というものである。さまざまな長鎖 核酸分子は、塩基を互いに結合させ ることによって形成することができる。 特定の生物、ウイルス、ＤＮＡ／ＲＮＡ配列中の突然変異などを同定する場合 には、同定しようとする物質に固有の配列が存在することと、上記したハイブリ ダイゼーションの原理に依っている。例えば、微生物“Ｘ”が固有のＤＮＡ配列 ： ５’−ＡＡＡＣＣＧＧＣＣ−３’ を含むとすると、理論的には、固有のＤＮＡ配列を接近し易くして、これをその 相補鎖： ３’−ＴＴＴＧＧＣＣＧＧ−５’ と接触させることにより該微生物を同定することが可能である。相補鎖が標識、 すなわち何らかの“マーカー”を含む場合は、ハイブリダイゼーションが起こっ たことを確認することができるだろう。すべての核酸測定アッセイの基礎となる のがこの原理である。 鎖置換アッセイは一連の米国特許に記載されている。すなわち、米国特許第4, 629,689 号（Diamondら）、第4,725,536 号（Fritschら）、第4,725,537 号（Fr itschら）、第4,735,897 号（Vary ら）、第4,752,566 号（Collinsら）、第4,7 66,062 号（Diamondら）、第4,766,064 号（Williams ら）、第4,767,699 号（V ary ら）、第4,795,701 号（Vary）、および第4,818,680 号（Collinsら）。本 質的に、それは、目的の核酸配列を含むと予想される検査試料と、異なる長さの ２つの核酸配列のハイブリッド複合体と、を接触させることを含んでいる。より 長い配列は結合プローブと呼ばれ、目的の核酸配列に相補的である。信号プロー ブと呼ばれる、短い方の配列は結合プローブの一部とのみハイブリダイズする。 信号 プローブとハイブリダイズしていない結合プローブの部分は初期結合領域と呼ば れる。例えば、上記の配列： ５’−ＡＡＡＣＣＧＧＣＣ−３’ の例を用いると、次のようなハイブリッド複合体を作製することができる： ＴＴＧＧＣＣＧＧ ＧＧＣＣ ここで、“ＴＴＧＧＣＣＧＧ”は結合プローブで、“ＴＴＧＧ”は初期結合領域 で、そして“ＧＧＣＣ”は信号プローブである。実際には、結合プローブが初期 結合領域つまり“ＩＢＲ(initialbinding region)”を介して標的配列と結合す る。結合プローブは標的分子とハイブリダイズし続ける。なんとなれば、標的分 子は信号プローブよりも長く、より長い分子を含む複合体の方が安定しているか らである。しかし、核酸は安定した三本鎖複合体を形成することはなく、かくし て信号プローブが“置換”される。信号プローブを標識しておくと、この置換を 測定することができる。 鎖置換アッセイは有用であるが、問題がないわけではない。感度が少なからず 問題となる。病理学的状態、例えば正常と異常との差異が１個のヌクレオチド塩 基の差異にあるような状態が知られている。鎌型赤血球貧血症はこのタイプの点 突然変異により確認された病理学的状態の最もよく知られた例である。１個のヌ クレオチド塩基の測定が重要となるアナライトや、種々の微生物間の差がわずか であるアナライトが他にも存在する。このような状況下での同定および測定には 、鎖置換アッセイにおいてこれまで 得ることができなかったレベルの感度と特異性が要求される。 核酸アッセイに関連してかなり詳しく研究されてきた生物の１つに Neisseria gonorrhoeaeがあり、これは性的感染症の原因菌で、毎年およそ２００万件が報 告されている。N. gonorrhoeae特異的核酸プローブに関する特許文献の例として 、米国特許第4,900,659 号（Loら）、第5,047,523 号および第5,099,011 号（両 方ともWoods ら）を挙げることができる。これらの特許はＤＮＡ：ＤＮＡハイブ リダイゼーションを扱っており、そして有用であるがあまり特異的ではないプロ ーブを開示している。 さらに、公開された特許出願 W090/14442、EPA 337,896、EPA 272009およびEP A 408077は、ＲＮＡと相補プローブとのハイブリダイゼーションを開示している 。これらの特許は、Kohne の特許、つまり米国特許第4,851,330 号を発展させた ものであり、生物のｒＲＮＡ配列が標的であるという点で固有のＲＮＡ配列を検 出することにより該生物を同定するものであった。 これらの特許文献はどれも、鎖置換アッセイを含む各種診断アッセイにおいて 有用な、本明細書で開示するN. gonorrhoeaeに対して特異的な核酸プローブを教 示していない。ここに開示する配列は固有(unique)であるばかりか、特異的なN. gonorrhoeaeプローブとして機能する。この記述に関して、特異的配列の固有性 （または唯一性：uniqueness）とは、この配列がプローブとして機能することを 必ずしも意味しない、ことを指摘しておかなければならない。プローブの全長、 多くの生物株を同定する能力、微変異性などを含めて、いろいろな事柄が考慮さ れるべきである。 N. gonorrhoeaeプローブとして有用なプローブを同定すること の困難性を考えると、 Neisseria 属の異なる種の匹敵する配列とたった１個の 塩基対で異なっているプローブがN.gonorrhoeaeの同定に使用し得るということ は驚くべきことである。こうしたプローブはここに記載する本発明のもうｌつの 特徴となる。図面の簡単な説明 図１は、N. gonorrhoeae特異的ハイブリッド複合体を用いる初期結合実験を示 す。 図２は、１個の塩基対のミスマッチを同定する実験の結果を示す。 図３は、追加の置換実験を示す。 図４は、更なる置換実験を示す。 図５は、追加の置換実験を示す。 図６は、アッセイの感度を示す。 図７は、抽出したＲＮＡに対するアッセイの特異性を示す。 図８も、抽出したＲＮＡに対する特異性を示す。 図９は、溶菌試料により得られた結果を示す。 図10は、鎌型赤血球貧血症のＤＮＡに関する実験の結果を示す。 図11は、固相に基づいたアッセイのデータを示す。 図12も、ビーズを用いる置換アッセイを示す。 図13は、典型的な試験片フォーマットアッセイの模式図である。 図14は、試験片フォーマットを用いて得られた結果を示す。 図15は、固相反応速度論アッセイで得られた結果を示す。 図16も、固相反応速度論アッセイからの結果を示す。 図17は、粗製ｒＲＮＡ抽出液を用いる固相アッセイの結果を示 す。 図18は、試験片上捕捉アッセイ(on strip capture assay)のモデルを示す。 図19は、試験片上捕捉アッセイを用いて得られた結果を示す。好ましい実施態様の詳細な説明 実施例１ Neisseria gonorrhoeae を同定するのに適した物質を作製する実験に着手した 。N. gonorrhoeaeの特定の株の16S rRNA遺伝子は知られている（Rossauら，Nucl ．Acids Res．16: 6227 (1988)）。ここには記載してない実験で、N.meningitid is とN. lactamicaの特定株の16S rRNAの比較可能なＤＮＡの配列を決定した。 この比較によると、核酸1262-1281が非相同であることがわかった。 別の実験では、１個の塩基対が相違している３つの他の領域が確認された。 これらの配列はそれぞれ N.gonorrhoeae 16S rRNA遺伝子のマイナス鎖の塩基 66 1−687、750−776および 1125−1151に相当する。配列番号：４において塩基 67 4は“C”であるが、他の２つのNeisseria 種では“Ｔ”である。配列番号：５ では塩基 763が 他の２つと比べて“A”であり、配列番号：６では塩基1138が“C”であるのに対 して他の２つの菌株の場合は“T”である。これらに相補的な配列も有用である 。実施例２ 選ばれた配列が有用であるためには、それらはできる限り広くN. gonorrhoeae を同定しなければならず、一方でN. gonorrhoeae以外の物質とハイブリダイズし てはならない。このことを調べるために、これらの配列から５’末端標識化によ りプローブを作製した。配列番号：４、５および６に対応するオリゴヌクレオチ ド（1.0 μｌ、約2.46 pmol）を13.09 μｌの蒸留水、2.0 μｌの緩衝液、3.66 μｌのγ-³²P-ATP、および0.25μｌのＴ₄ ポリヌクレオチドキナーゼと混合した 。この混合物を37℃で30分間インキュベートし、次いで2.5 μｌの0.1M EDTA (p H 8.0)を加えた。必要になるまで混合物を氷上で４℃に保った。 １パネル39のNeisseria 株を集め、３つの対照とともに使用した。標準的な技 法に従ってそれぞれの菌株から染色体ＤＮＡを抽出した。その後、ＤＮＡをナイ ロン膜に固定し、上記した標識ヌクレオチド配列の標的として用いた。ハイブリ ダイゼーションを65℃で一夜行い、その後ドットブロットを洗浄、乾燥し、標準 オートラジオグラフィーを行った。結果を下記の表１に示す。 性能データ─ “674 部位”での選ばれた構造 これらの、結果から、３種配列がすべてN．gonorrhoeaeに対して特異的で、そ れ故、今後の研究の土台となりうることが判明した。実施例３ 配列番号：１によって示される非相同配列に基づいて初期実験を行った。これ らを実施するにあたって、長い結合プローブとして80ヌクレオチド配列を含むハ イブリッド複合体を作製した。この長い配列は配列番号：１に相補的で、配列番 号：１の５’末端から49塩基のところで開始する。信号プローブは３’末端の最 後の25塩基にわたってハイブリダイズした： この25ヌクレオチドプローブを上記の方法で標識した。 置換アッセイは、Diamond らの米国特許第4,766,022 号およびCollins らのEP A 167238に記載される方法で行った。しかし、徹底させるため、プロトコールを 説明する。まず、上記の２成分をハイブリダイズさせるために、1.5 mlの微量遠 心管に次の成分を加え、混合した。 ２×ＳＳＣ（15.5μｌ） 50％ＰＥＧ（5.0μｌ） 結合プローブ（110 fm／μｌ） （2.5μｌ） 標識信号（110 fm／μｌ） （2.0μｌ） 最終容量が25μｌ、最終塩濃度が1.24×ＳＳＣ、そして10％ＰＥＧとなった。こ の混合物を37℃で60分間インキュベートし、その後必要となるまで氷上または４ ℃で保持した。 アナライト（分析物）をアッセイするために、1.0μｌのハイブリッド複合体 を３μｌの蒸留水、4.0μｌの25％ＰＥＧ、1.0μｌの20×ＳＳＣおよび1.0μｌ の試料と混合した。この混合物をどの場合にも50℃で１〜４時間インキュベート した。信号プローブの置換を電気泳動により測定した。混合物を20％未変性ポリ アクリルアミドゲル（30％アクリルアミド溶液：66.6ml、水：21.3ml、３％過硫 酸アンモニウム：2.1ml、10×ＴＢＥ：10.0ml）中で泳動を行い、0.45μmの無菌 フィルター装置により濾過した。全部で44μｌのTEMED を加え、混合物を放置さ せた。試料を加えた（1500ボルト、２時間、緩衝液１×ＴＢＥ；負荷緩衝液：30 ％グリセロール＋染料ブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノール）。 図１に示した結果から、N. gonorrhoeae（レーン５〜８）が陽性信号を与える のに、N. lactamica(レーン９〜12）は陽性でないことがわかる。しかし、N.men ingitidis （レーン13〜16）も陽性の結果をもたらした。これはN. gonorrhoeae とN.meningitidis 間の大きな相同度（ｒＲＮＡ配列については98.5％程度に高 いことが報告されている）に起因するものである。実施例４ N.meningitidis との結合を考慮して、別の戦略を検討した。これらは結合プ ローブと信号プローブの大きさおよび開始点を変更するものであった。変更を以 下に示してあるが、ここで“SDBP”は結合プローブを指し、そして“SDSP”は信 号プローブを指す。最初の数字は配列の長さを表し、２番目の数字はN. gonorrh oeae 16S rRNA遺伝子の５’末端に対するその開始点を表す。 これらのデータを検討する際に、非相同配列が始まるN. gonorrhoeaeの塩基“ 1262”を、当分野で標準的なE.coli 16S rRNA遺伝子との並列化のために、以後 “1213”と呼ぶことを指摘しておく必要がある。 試験したすべてのハイブリッド複合体のうちで、番号17、すなわちSDBP-32-12 66/SDSP-25-1273 だけが特異性を示した。この複合体の初期結合領域は７塩基長 で、非gonorrhoeae Neisseria に 対して４位と５位にミスマッチをもっていた。これらの実験は、ＩＢＲの長さが 特異性のための重要な基準となることを示した。実施例５ 実施例４に記載した観察、つまりＩＢＲの長さの重要性について以後の実験で 調べた。これらの実験では、１個の点突然変異を組み込んだ合成N. gonorrhoeae アナライトを作製した。上記したプロトコールに従って、SDBP-32-671/SDSP-25- 678 複合体を用いた。図２は、１個の塩基対ミスマッチの解明が可能であること を示す。これは当該技術分野での現在の解明レベルに比べて進歩であり、点突然 変異によって生じる病気（例えば、鎌型赤血球貧血症）の診断、さらにはウイル スを含めて密接に関連した生物の識別の機会を提供するものである。実施例６ 一般に、上記した実施例は完結させるのに約10分を要した。そこで、アッセイ の反応速度を向上させるように努めた。これを行うにあたって、上記したように 、塩基674 で他のNeisseria 生物とは異なっているN. gonorrhoeaeの塩基661-68 7 に対応する配列に基づいて組成物を調製した。多数の複合体を調製し、そして 対照の合成N. gonorrhoeae試薬および合成N. meningitidis 試薬を用いて試験し た。この置換アッセイは50fmolの試料と10fmolのハイブリッド複合体の使用を含 んでいた。物質を37℃または50℃で１時間インキュベートした。置換の結果を図 ３、４および５に示す。しかし、これらの結果は次の表３にまとめることができ る。 性能データ─ “674 部位”での選ばれた構造 最良の結果を与えた２つの複合体はSDBP-32-671/SDSP-25-678とSDBP-24-671/S DSP-17-678 で、両方とも７塩基長のＩＢＲをもっていた。次に、これらの複合 体を反応速度実験に使用したとこ ろ、上記の実施例に記載した条件を用いて45℃でインキュベートすると、５分以 内で置換反応が完了した。実施例７ アッセイの感度を調べる実験を行った。これらの実験では、１attamol （1×1 0^-18mol）の複合体を５〜10倍過剰のアナライトと低ストリンジェント条件下で 混合した。約１attamol の感度が観測された。 ストリンジェント条件についても試験した（0.22×ＳＳＣ、10％ＰＥＧ、375 attamolのハイブリッド、0.005 attamol 〜 53fmolの試料）。これらの条件のも とで、約530 attamol に対する感受性が観測され、これは例えば図６からもわか る。この図面は化学量論量未満から100 倍過剰までの範囲の量を用いて得られた 結果を示している。実施例８ ２つの異なる方法でハイブリッドの安定性を調べた。最初の方法は上記のよう なハイブリッド複合体を前もって形成し、４℃で貯蔵した。次に、アリコートを 定期的に取り出し、ゲル電気泳動でアッセイした。３週間にわたって脱ハイブリ ダイゼーションが全く見られなかった。この変法において、ハイブリッド複合体 を50℃で調べたら、24時間後に10％未満の“脱ハイブリダイゼーション (dehyb ridization)”が観察された。 安定性を調べる２番目の方法はハイブリッドの形成、蒸発乾固および４℃での 貯蔵を含んでいた。５週間にわたって１週に１度、 残留物をハイブリダイゼーション緩衝液に再溶解し、アリコートを取り出し、ゲ ル電気泳動を実施した。５週間後でさえ脱ハイブリダイゼーションが全く見られ なかった。実施例９ これらの実験では、ハイブリッド複合体SDBP-32-671/SDSP-25-678 とSDBP-24- 671/SDSP-17-678 を使ってNeisseria 由来のｒＲＮＡを分析した。両プローブと も³²Ｐで標識した。 まず初めに、各種のNeisseria 菌株からＲＮＡを単離した。これを行うために 、200ml の各試料を中間対数期まで増殖させた。次に“緩衝液Ａ” （200mM Tr is，pH8.0，20mM EDTA，20mM Na₃N，20mM オーリン- トリカルボン酸）20mlを 各培養物に加えた。培養物をペレット化し、ペレットは10mMバナジルリボヌクレ オシド複合体（ＶＲＣ）を含む“STET”緩衝液（８％スクロース，５％トリトン X-100，5mM EDTA，50mM Tris，pH7）2ml中に再懸濁した。懸濁液をフェノール／ クロロホルム（１：１）で抽出した。遠心により相を分離させた。水相を取り出 し、0.1容量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２容量のエタノールで沈降させた。 沈降物は10,000rpmで15分遠心して濃縮した。次いで、ペレットを10mM ＶＲＣ を含むDEPC処理滅菌水2ml中に再懸濁した。混合物をフェノール／クロロホルム で２回抽出し、沈降させた。 遠心後、得られたペレットを１ｇのＣｓＣｌを含むDEPC処理滅菌水2ml中に再 懸濁した。その後、各混合物を5.7M CsCl/100mMEDTA，pH7 の0.75mlクッション に重層し、次に約１mlのグリセロールを重層した。続いて、40,000rpm で遠心し てｒＲＮＡを一晩 ペレット化させた。グリセロールとＣｓＣｌクッションを取り出し、ＲＮＡペレ ットを400 μｌのDEPC処理滅菌水に再懸濁した。ＲＮＡを酢酸ナトリウムとエタ ノールで沈降させた。 沈降物を遠心により濃縮し、300 μｌのDEPC処理滅菌水に再懸濁した。光学密 度を測定し、ＲＮＡをアリコートに分けて−20℃で凍結させた。11.25 μｌアリ コートを１％ホルムアルデヒド／アガロースゲル上で電気泳動を行い、続いてエ チジウムブロミドで可視化することにより均質性をチェックした。E. coli ｒＲ ＮＡを対照とした。平均収量はN. gonorrhoeaeの場合が2.9mg、N.meningitidis の場合が 2.7mg、そしてN. lactamicaの場合が3.1mgであった。これらの試料は １６Ｓと２３Ｓの両ｒＲＮＡを含み、その比は約１／３：２／３であった。 上記のようなハイブリダイゼーションのプロトコールを実施した。この実施例 に記載したハイブリッド複合体を用いた。図７および８はN. gonorrhoeaeについ ての置換を示すが、N.meningitidis やN. lactamicaについての置換を示さない 。 本発明に従ってNeisseria の急速溶菌試料に対して鎖置換を行うために、Neis seria 株をチョコレート寒天プレートで増殖させ、個々のコロニーを50μｌのＧ ＴＥ （グルコース、Tris、EDTA／リゾチーム溶液）を含む滅菌した1.5ml 微量 遠心管に移した。この混合物を強くボルテックス混合し、氷上で５分間インキュ ベートした。グラム陰性溶菌液（collins，EPA 167238）の50μｌアリコートを 加え、試料を15秒間ボルテックス混合した。その後、この試料を鎖置換アッセイ に供した。 図９に示した結果は、溶菌試料を用いる鎖置換アッセイの有効 性を実証している。実施例10 実施例１〜９から、N. gonorrhoeaeの同定にここで論じた鎖置換アッセイを使 用できることが明らかである。このアッセイは、さらに、鎌型赤血球貧血症に関 連した配列の同定についても試験された。 Bakloriti ら，Blood 74: 1817-1822(1989)に従ってオリゴヌクレオチドを作 製した。すなわち、 信号プローブ （結合プローブ、正常） （結合プローブ、病気） （配列番号：11） （アナライト、正常） （配列番号：12） （アナライト、病気） 正常および病気のアナライトの差異は塩基60に見られ（正常ではＡ、病気では Ｔ）、結合プローブの差異は３’末端から４塩基目に見られる（正常ではＴ、病 気ではＡ）。Neisseria アッセイに記載した条件を用いて反応を行い、37℃で反 応させた。図10のレーン１〜３では病気のアナライトとともに正常な結合プロー ブを使用しており、一方、レーン４〜６では正常または病気のアナライトととも に病気のプローブを使用している。点突然変異の決定的な同定が観察された。さ らに、２つのアナライトを比較しても、交差反応性は全く見られなかった。正常 なヘモグロビンモデル配列は鎌型赤血球細胞のヘモグロビンモデルアナライトと の置換を示さず、その逆も同様であった。実施例11 実施例１〜10は溶液中で起こる鎖置換アッセイを詳述するものである。実際に は、固相に基づくアッセイ系が最も望ましく、診療室や小さい実験室はこうした 系が非常に望ましいことが分かるだろう。 ストレプトアビジンのコーティングを有するラテックスビーズが固相として使 用されたが、この結合剤および関連分子のアビジンの結合の方法論はよく知られ ている。これらをビオチンで標識したハイブリッド複合体と共に使用した。これ らの複合体は先に記載したSDBP-32-671/³²P-SDSP-25-678 とSDBP-32-1266/³²P-S DSP-25-1273 であった。製造業者の説明書（“Applied BiosystemsUser Bulleti n 49”を参照）に従ってＳＤＢＰにアミノ結合を結合させ、生じた物質をビオチ ニル化した。これを行うため、ア ミノ結合オリゴヌクレオチドを乾燥し、75μｌの0.25M Tris-HCl，pH7.6 中に再 調製した。次に、1.0mg のビオチン−ＮＨＳエステル試料を75μｌのＤＭＦに溶 解し、２つの物質を室温で一夜ボルテックス混合した。ＤＭＦを透析により除き 、得られた物質をロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮物を蒸留水に 溶かした。ＨＰＬＣ分析はビオチンの結合が起こったことを示した。 ビオチニル化プローブとストレプトアビジンビーズが得られたら、鎖置換アッ セイを行うにあたって２つの異なる方法論を採用することができる。１つの反応 形式は標的アナライトとハイブリッド複合体との反応を実施することが必要で、 その後ストレプトアビジン標識ビーズを加えて未反応の複合体をすべて回収した 。同様に、複合体をビーズとプレインキュベートし、固相に結合した複合体を試 料に添加し、その後鎖置換を進行させることにより鎖置換を調べた。 最初の方法を選択する場合は、上記のような液相反応を起こさせた後で、スト レプトアビジン標識ビーズを加え、２分間インキュベートした。その後、物質の アリコートを試験のためにゲルに加えた。 ２番目の変法に従う場合は、ビーズをビオチニル化ハイブリッド複合体（SDBP -32-1266/³²P-SDSP-25-1273）と混合し、２分間インキュベートし、その後これ らを試料に加えた。この場合も、反応後に試料のアリコートをゲルに加えた。両 方の反応形式とも、２組のパラメーター（37℃で90分のインキュベーション、ま たは50℃で20分のインキュベーション）を使って試験を行った。図11において、 レーン１〜８はビーズの存在下でアッセイを行った場 合の結果を示し、そしてレーン９〜16は反応後にビーズを加えた場合に得られた 結果を示す。全ての場合に、９ fmolの複合体と50fmolのアナライトを使用した 。N. gonorrhoeaeのモデルアナライトのみが置換を生じ、meningitidisとlactami ca のモデルは何も示さなかった。 別の実験では、置換反応を10fmolのビオチン標識SDBP-32-671/³²P-SDSP-25-67 8 を用いて行い、50℃で30分間インキュベートし、コーティングしたビーズを加 える前に氷上で冷やした。合成アナライトを試験し、同様に粗製ＲＮＡ抽出物も 試験した。図12にこれらの結果を示す。合成N. gonorrhoeaeについては完全な反 応が起こったが、N. meningitidis では部分的な反応が起こったにすぎなかった （それぞれレーン２および４）。また、粗製N. gonorrhoeae抽出物のみが反応を 示し（レーン５）、その他の粗製抽出物（レーン６〜８）は反応を示さなかった 。実施例12 ニトロセルロース膜とともに使用する場合の置換アッセイを試験する実験も行 った。これらの実験では、ニトロセルロース膜（５μｍ，ＭＳＩ）に底から約0. 5cm のところで反応混合物をアプライした。次に、ハイブリダイゼーション緩衝 液を、溶媒の前面が約2.5cm 移動するまで加えた。試験片をカバーし、オートラ ジオグラフィーを行った。 図13は試験片フォーマットアッセイのための典型的なシステムを示す。ここに 記載した実験においては、ビオチン標識ハイブリッド複合体SDBP-32-671/³²P-SD SP-25-678 (10fmol)を種々のNeis seria アナライトと組み合わせた。反応温度は50℃とした。アリコートを２、５ および10分おきに取り出し、ストレプトアビジンをコーティングしたビーズに加 え、氷上で貯蔵した。この混合物を上記の試験片に２通りずつアプライし、オー トラジオグラフィーにかけた。 図14に結果を示す。対照反応では、アナライトが存在せず、ハイブリッド複合 体がアプライ位置に止まった。正しいアナライト（図面では“Ａ”）を加えると 、放射能が徐々に消失することによって示されるように、置換が起こる。N. men ingitidis （図面では“Ｍ”）の場合はこれが起こらない。実施例13 複合体との置換後にビーズを加える場合のシステムについて反応速度を比較し た。すべてのパラメーターは実施例12と同じにした。図15および16に示す結果は 、ビーズを複合体とともに加えるとき、80％の置換が40分後に起こったことを示 す。一方、ビーズをあとで加えると、たったの10分後に80％の置換が起こった。 反応速度の著しい相違を考慮して、以後の実験は速い方の反応システムを採用す ることにする。実施例14 上記の試験片に基づくアッセイにおいて合成アナライトを使用した。ｒＲＮＡ を用いるアッセイの実施可能性について試験した。用いたプローブ複合体は実施 例11〜13で使用したものであり、アナライトは上記した方法で抽出したＲＮＡか 合成アナライトであ った。アッセイのプロトコールは実施例12および13のものであった。図17から明 らかなように、結果は、粗製核酸混合物（N. gonorrhoeae RR21）および純粋な ＲＮＡは置換を示したが、純粋なN. lactamicaＲＮＡと純粋なN. meningitidis ＲＮＡは置換を示さないというものであった。実施例15 反応工程を単純化するため、上で論じた試験片方法の改良法を開発した。この 改良法は直接試験片上捕捉法と呼ばれるもので、図18に示される。本質的には、 ニトロセルロース片の一部に熱−ＢＳＡストレプトアビジンを標準的技法により コーティングする。実施例11〜14のビオチニル化ハイブリッド複合体を用いて標 準液相置換反応を実施した。置換後、プレコーティングした試験片の上に反応ア リコートを点在させた（２ fmolのプローブ、および0.1、0.3、1.0、3、10.0お よび30.0fmolのアナライト）。インキュベーションは50℃で１時間であった。各 アナライトは２回、対照は３回の反復実験を行った。５分後試験片をクロマトグ ラフィーにかけ、図19に示すようにオートラジオグラフィーにかけた。あらゆる 濃度で置換が起こったが、対照も若干の置換を示した。実施例16 配列番号：４、５および６に示したプローブおよびそれらの相補鎖は鎖置換ア ッセイ以外のアッセイにも有用である。それらを広範囲に試験するため、世界中 からNeisseria gonorrhoeae の200 を上回る臨床単離株を選択した。 プローブ実験を行うために、Neisseria 株の２５μｌ培養物を増殖させ、標準 法によりゲノムＤＮＡを抽出した。ＤＮＡを精製し、アガロース上で純度と完全 性をチェックした。これがすんだら、やはり標準法を用いて10μｇの試料をナイ ロン膜にアプライした。次いで、プローブ試料を加え（約３×10⁵カウントの³² Ｐ標識プローブ）、65℃で一夜ハイブリダイゼーションを行った。膜を洗って、 フィルムに露出した。 結果を添付の表４に示す。表中の記号は次の配列番号に対応する。 プローブ 配列番号 １Ａ ４に対する相補鎖 ２Ａ ４ ３ ６に対する相補鎖 ４ ６ ５ ５に対する相補鎖 ６ ５ ｒ１０２ 対照配列 （例えば、ヨーロッパ特許出願 第272,009 号を参照） 表４は、その広範な試験および陽性結果から、このシステムの有効性を示して いる。プローブの総効率は次のとおりである。プローブ 陽性株／総数 効率 １Ａ 194/199 97.5 ２Ａ 196/199 98.5 ３ 196/199 98.5 ４ 196/199 98.5 ５ 196/199 98.5 ６ 197/199 99.0実施例17 ＤＮＡに対する特異性を示す実施例16の結果を考慮して、ＲＮＡ特異性を調べ る試験を行った。25のＲＮＡ株を無作為に選び、ＲＮＡを標準法または上に示し た方法により抽出した。対照株も用いた。抽出したＲＮＡを定量し、１％ホルム アルデヒドーアガ ロースゲル上で電気泳動を行って純度と完全性をチェックし、その後10μｇの試 料をナイロン膜にアプライした。ＲＮＡは脱イオン化ホルムアミドおよびホルム アルデヒドを加えて変性し、50℃で１時間インキュベートし、氷上で冷やし、そ の後膜にアプライした。ハイブリダイゼーションは、上記したプロトコールに従 って、５’³²Ｐ標識プローブを用いて60℃で一夜行った。 プローブ２Ａ、４および６は一本鎖16S ｒＲＮＡとハイブリダイズしたが、1 6S ｒＲＮＡと同一であるはずのプローブ１Ａ、３および５はハイブリダイズし なかった。３つの事例はすべて感度が100 ％であった。考察 上記の実施例は改良された形の鎖置換アッセイについて記述するものである。 本質的に、この方法は対象となる試料をハイブリッド複合体と接触させることを 含む。複合体は結合プローブと信号プローブを含有する。この複合体の第１のメ ンバーは初期結合領域つまり“ＩＢＲ”と標的結合領域に分けることができる。 標的結合領域と信号プローブが互いにハイブリダイズし、ＩＢＲは複合体から延 在している。結合プローブはその全体がアッセイすべき核酸分子に相補的でなけ ればならない。複合体を試料に加えると、結合プローブが試料の核酸アナライト とハイブリダイズし始める。より長い配列のハイブリッドの方が短いものより安 定しているから、標的と結合プローブとのハイブリダイゼーションが有利となり 、信号プローブの置換をもたらす。いったん置換されたら、信号プローブを測定 または観察することにより標的アナライトの測定が得られる。 ハイブリッド複合体のメンバーに関してはいくつかの要件がある。結合プロー ブについては、ＩＢＲは、非アナライト配列へのハイブリダイゼーションを防止 するため、あまり長すぎてはいけない。これは、例えばＩＢＲが非標的配列に95 ％相同で、５％の差異がＩＢＲの長さに沿って分散されている場合に起こり得る 。このことがたまたま起こると、ＩＢＲはランダムに配置された非相補性の領域 を無視して、とにかくハイブリダイズするであろう。こうした問題を避けるため 、ＩＢＲは非相補的結合を防止するに十分短くなければならない。同様に、全プ ローブ配列は非相補的配列との安定したハイブリッドの形成を防止するに十分な ほど短 くなければならない。これは、たとえＩＢＲが誤ったハイブリダイゼーションに 参加しない場合でも、より長い領域が依然としてハイブリダイズする恐れがある ので、長いプローブを用いるときに起こり得る。好ましくは、全プローブ配列は 長さが20〜40塩基で、25〜35塩基の長さが特に好ましい。これらのプローブ配列 において、ＩＢＲの長さを10塩基またはこれより少なくして、標的結合領域の長 さとして好ましくは10〜30ヌクレオチド塩基、あるいは15〜35ヌクレオチド塩基 を残しておくことが好適である。特に良好な結果は、例えばＩＢＲが７塩基長で 、標的結合領域が25塩基長である場合に得られた。 ここに記載したタイプのハイブリッド複合体はアナライトの測定に有用であり 、１個の塩基対の差異のレベルまで区別することができる。複合体は、それ自体 で、種々のアナライトおよび病理学的状態（点突然変異を含む）の診断アッセイ に有用である。この方法のさまざまな診断的使用のなかで、とりわけ性的感染症 、ウイルス感染症、バクテリア、染色体障害、遺伝的疾患、核酸変異などを挙げ ることができる。 本発明のアッセイを行う際には、先に記述したように、液相アッセイと固相ア ッセイの両方が可能であるが、後者のカテゴリーが特に好ましい。後者のカテゴ リーの変法として、ハイブリッド複合体をビーズ、ニトロセルロース紙またはナ イロン膜といった固体に結合させておき、信号プローブをそこから置換させるア ッセイがある。置換された信号をその後測定することができる。このようなシス テムにおいて、固相への核酸の固定化はやや日常的であるように、当業者に知ら れた多くの方法で結合プローブを固 相に結合させることができる。特に好ましいシステムは、結合プローブを（スト レプト）アビジン−ビオチン結合系により固定するもので、この結合系の要素は 交換し合ってもよい。固相へプローブを結合させるため付加的なリンカー分子を 使用することもできる。 また、上に示したように、置換アッセイを行った後に固相を加えて、アッセイ を実施した溶液から複合体を分離することも可能である。続いて、固相上のまた は溶液中の信号の量を測定する。 信号プローブは、その同定を容易にするために、もちろん標識される。核酸配 列の標識化には多くの信号の任意のものを使用し得るが、³²Ｐ、³⁵Ｓなどの放射 性標識を用いることができる。金ゾルのような金属粒子も使用でき、また、蛍光 体、化学発光体、あるいは着色した微粒子のような“固有の”信号を呈示する他 の物質を使用してもよい。また、検出のために更なる処理が必要であるという点 で固有の信号を発生する物質ではない他の標識も使用し得る。かかる物質にはペ ルオキシダーゼやアルカリホスファターゼのような酵素（この場合は信号発生の ために酵素の基質を添加する）、磁性粒子、抗原またはハプテン分子、抗体など （この場合は信号の存在を示すために更なる反応が必要となる）が含まれる。 本発明はまた、ここに記載したタイプの置換アッセイを行うのに有用な試薬キ ットおよび複合体を包含する。本発明の複合体は上述したものである。試薬キッ トはこの複合体を含み、さらに、例えばアッセイの前または後で複合体を結合さ せるための固相成分、および信号プローブの標識を検出するための信号手段を含 む ことができる。信号手段は標識配列から分離しておくが、固相材料は結合プロー ブに直接結合させてもさせなくともよい。所望により、結合プローブと信号プロ ーブをキットの別の部分に存在させることも可能である。 また、固相への複合体の結合は診断装置の作製を可能にする。その際、ニトロ セルロース紙片のような固体担体の上に複合体を固定化させる。この紙片は、結 合させた複合体の下流の地点に、置換された標識を測定するための信号発生系を 含む。信号発生系は、例えば試薬の容器の形で、紙片の“オフボード（off boar d）”で提供されてもよい。 この出願の最初の２，３の実施例は、特異的なN. gonorrhoeae診断プローブと して有用な、単離された核酸配列を記述している。これらのオリゴマーは偽陽性 をもたらす程度にNeisseria の他の種とはハイブリダイズせず、従ってgonorrho eae の診断において特に有用である。例えば、配列番号：１、４〜６、および７ が前記オリゴマーの例である。これらのプローブは上記した方法のいずれか、あ るいは当分野で知られた他の方法で標識される。上記の鎖置換アッセイとともに 異なるアッセイ形式を採用することができる。アッセイの特に望ましい応用は自 動化されたシステムにある。こうしたシステムでは、ハイブリッド複合体が試験 管または反応キュベットの内壁のような固相上に固定化される。複合体は直接的 に、（ストレプト）アビジン−ビオチン複合体により、あるいは核酸固定化のた めに利用できる他の手段により固定化することができる。その後、試料を複合体 の担体に加えると、試料液体、上清液などへの信号プローブの置換が起こる。そ の後、信 号プローブを含む液体を自動化システムのある個所に移して、そこで信号を測定 する。本発明の他の態様も当業者には明らかであり、ここで繰り返す必要はない だろう。 上記の詳細な記述および実施例は例示的なものであって本発明を限定するもの ではないこと、そして本発明の精神および範囲に含まれる他の実施態様が当業者 には自明であることが理解されるであろう。配列表 配列番号：１ 配列の長さ：18塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：２ 配列の長さ：16塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：３ 配列の長さ：16塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：４ 配列の長さ：27塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：５ 配列の長さ：27塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：６ 配列の長さ：27塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：７ 配列の長さ：25塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：８ 配列の長さ：17塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：９ 配列の長さ：24塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：10 配列の長さ：24塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：11 配列の長さ：80塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：12 配列の長さ：80塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９４年８月１０日 【補正内容】 請求の範囲 １．Neisseria gonorrheaeに特異的なヌクレオチド配列を検出することにより試 料中のNeisseria gonorrheaeの存在を測定する方法であって、 試料を、 (a)配列番号：４、配列番号：４に相補的な配列、配列番号：５、配列 番号：５に相補的な配列、配列番号：６、および配列番号：６に相補的な配列よ りなる群から選ばれるプローブヌクレオチド配列；および (b)複合体の標的結合領域の少なくとも一部分に沿って該プローブヌク レオチドにハイブリダイズされた標識ヌクレオチド配列； の複合体と接触させ、その際、Neisseria gonorrheaeに特異的な該ヌクレオチド 配列は該プローブヌクレオチド配列と結合して、そこから該標識ヌクレオチド配 列を放出させるものであり、そして 該試料中の放出された標識ヌクレオチド配列を該試料におけるNeisseria go norrheaeの存在の指標として測定する、ことからなる方法。 ２．溶液中で行う、請求項１に記載の方法。 ３．固相上で行う、請求項１に記載の方法。 ４．前記の標識ヌクレオチド配列が非放射性標識で標識されている、 請求項１ に記載の方法。 ５．前記の標識ヌクレオチド配列がハプテンで標識されている、請求項１に記載 の方法。 ６．前記のハプテンがビオチン、フルオレセインまたはジゴキシンである、請求 項５に記載の方法。 ７．試料中のNeisseria gonorrheaeを測定するのに有用な核酸分子の複合体であ って、本質的に (a)配列番号：４、配列番号：４に相補的な配列、配列番号：５、配列番号 ：５に相補的な配列、配列番号：６、および配列番号：６に相補的な配列よりな る群から選ばれるプローブ；および (b)該プローブヌクレオチドに標識ヌクレオチドプローブの結合領域の部分 でハイブリダイズされた標識ヌクレオチド配列； からなる複合体。 ８．患者の鎌型赤血球貧血症を診断する方法であって、 (i)患者から得られた試料を、 (a)配列番号：10および配列番号：10の相補鎖よりなる群から選ばれるプ ローブヌクレオチド配列；および (b)該プローブヌクレオチドにそのヌクレオチド配列の少なくとも一部に 沿ってハイブリダイズされた標識ヌクレオチド配列； の複合体と接触させ、その際、該プローブヌクレオチドは鎌型赤血球貧血症に特 異的な配列と結合することによって該標識ヌクレオチド配列を放出させるもので あり、そして (ii)該試料中の放出された標識ヌクレオチド配列を鎌型赤血球 貧血症の診断として測定する、 ことからなる方法。 ９．溶液中で行う、請求項８に記載の方法。 10．固相上で行う、請求項８に記載の方法。 11．前記の標識ヌクレオチド配列が非放射性標識で標識されている、請求項８に 記載の方法。 12．前記の標識ヌクレオチド配列がハプテンで標識されている、請求項８に記載 の方法。 13．前記のハプテンがビオチン、フルオレセインまたはジゴキシンである、請求 項12に記載の方法。 14．前記の標識ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列が配列番号：８からなるも のである、請求項８に記載の方法。 15．患者の鎌型赤血球貧血症を診断する方法であって、 (i)被験者から得られた試料を、 (a)配列番号：９および配列番号：９の相補鎖よりなる群から選ばれるプ ローブヌクレオチド配列；および (b)該プローブヌクレオチドにそのヌクレオチド配列の少なくとも一部に 沿ってハイブリダイズされた標識ヌクレオチド配列； の複合体と接触させ、その際、該プローブヌクレオチドは正常なヌクレオチド配 列と結合するが、鎌型赤血球貧血症に特異的なヌクレオチド配列とは結合しない ものであり、そして (ii)該試料中の放出された標識ヌクレオチド配列の不存在を鎌型赤血球貧血 症の診断として測定する、 ことからなる方法。 16．溶液中で行う、請求項15に記載の方法。 17．固相上で行う、請求項15に記載の方法。 18．前記の標識ヌクレオチド配列が非放射性標識で標識されている、請求項15に 記載の方法。 19．前記の標識ヌクレオチド配列がハプテンで標識されている、請求項15に記載 の方法。 20．前記のハプテンがビオチン、フルオレセインまたはジゴキシンである、請求 項19に記載の方法。 21．前記の標識ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列が配列番号：８からなるも のである、請求項１５に記載の方法。 22．鎌型赤血球貧血症を診断するのに有用な核酸分子の複合体であって、本質的 に (a)配列番号：９、配列番号：10、配列番号：９の相補鎖、および配列番号 ：10の相補鎖よりなる群から選ばれるプローブ；および (b)該プローブにそのヌクレオチド配列の少なくとも一部に沿ってハイブリ ダイズされた標識ヌクレオチド配列； からなる複合体。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/70 9453−4Ｂ //(Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:36） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:36） Ｃ１２Ｒ 1:36） (72)発明者 バルゴビン，ニール アメリカ合衆国 96250 インディアナ州 インディアナポリス， ヘイグ ロード 9115番地 (72)発明者 バック，ハーヴェイ アメリカ合衆国 46250 インディアナ州 インディアナポリス， ヘイグ ロード 9115番地

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．試料中の標的ヌクレオチド配列の測定方法であって、 試料を、 (a)標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするプローブヌクレオチド 配列であって、(i) 初期結合領域および(ii)標的結合領域からなるもの；および (b)該標的結合領域の少なくとも一部分に沿って該プローブヌクレオチ ドにハイブリダイズしている標識ヌクレオチド配列； の複合体と接触させ、その際、該標的ヌクレオチド配列は該プローブヌクレオチ ド配列と結合して、そこから該標識ヌクレオチド配列を放出させ、そして 放出された標識ヌクレオチド配列を該標的ヌクレオチド配列の指標として測定 することからなり、その際、該初期結合領域はこれへの非相補的ヌクレオチド配 列のハイブリダイゼーションを防止するほど十分に短く、かつ該プローブヌクレ オチドは非相補的配列との安定したハイブリッドの形成を防止するほど十分に短 いものである、上記方法。 ２．前記のプローブヌクレオチド配列が約20〜40ヌクレオチド塩基の長さである 、請求項１に記載の方法。 ３．前記のプローブヌクレオチド配列が約25〜35ヌクレオチド塩基の長さである 、請求項２に記載の方法。 ４．前記の標的結合領域が約10〜30ヌクレオチド塩基の長さである、請求項２に 記載の方法。 ５．前記の標的結合領域が約15〜35ヌクレオチド塩基の長さである、請求項２に 記載の方法。 ６．前記の初期結合領域が10ヌクレオチド塩基より少ない長さである、請求項２ に記載の方法。 ７．前記のプローブヌクレオチド配列が約32ヌクレオチド塩基の長さであり、前 記の標的結合領域が約25ヌクレオチド塩基の長さであり、そして前記の初期結合 領域が約７ヌクレオチド塩基の長さである、請求項２に記載の方法。 ８．前記の標的ヌクレオチド配列が病理学的状態に特有のものである、請求項１ に記載の方法。 ９．前記の病理学的状態が感染である、請求項８に記載の方法。 10．前記の感染がバクテリアの感染である、請求項９に記載の方法。 11．前記の感染がウイルスの感染である、請求項９に記載の方法。 12．前記の病理学的状態が遺伝的疾患である、請求項８に記載の方法。 13．前記の病理学的状態が鎌型赤血球貧血症である、請求項12に記載の方法。 14．前記の標的ヌクレオチド配列が性的感染症に特有のものである、請求項１に 記載の方法。 15．前記の病理学的状態が後天性免疫不全症候群である、請求項８に記載の方法 。 16．前記のバクテリア感染がNeisseria gonorrhoeae 感染である、請求項10に 記載の方法。 17．前記の感染がＨＢＶ、ＨＣＶまたはクラミジアの感染である、請求項９に記 載の方法。 18．前記の標的ヌクレオチド配列が点突然変異を含むものである、請求項１に記 載の方法。 19．標的ヌクレオチド配列を測定するのに有用な複合体であって、 (a)標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするプローブヌクレオチド配列 であって、(i)初期結合領域および(ii)標的結合領域からなるもの；および (b)該標的結合領域の少なくとも一部分に沿って該プローブヌクレオチドに ハイブリダイズしている標識ヌクレオチド配列； からなり、 ここで、該標的ヌクレオチド配列は該プローブヌクレオチド配列と結合して 、そこから該標識ヌクレオチド配列を放出させるものである、上記複合体。 20．前記の標識ヌクレオチド配列が非放射性標識で標識されている、請求項19に 記載の複合体。 21．前記の標識ヌクレオチド配列がハプテンで標識されている、請求項20に記載 の複合体。 22．前記のハプテンがビオチン、フルオレセインまたはジゴキシンである、請求 項21に記載の複合体。