JP5341291B2 - ディップスティック検定における改良型結合相互作用 - Google Patents
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Description
試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップ、ならびに
接触端から離れたクロマトグラフィーストリップの捕捉帯に固定された捕捉プローブであって、標的核酸とハイブリダイズし得るか、あるいは標的核酸に結合されたフック捕捉プローブとハイブリダイズし得る捕捉プローブであり、捕捉プローブが捕捉プローブスペーサーに連結され、捕捉プローブスペーサーが捕捉帯に連結され、それにより捕捉帯に捕捉プローブを固定し、そして捕捉帯と捕捉プローブとの間に間隔を置く捕捉プローブ
を含むディップスティックが提供される。
捕捉プローブスペーサーは、捕捉プローブが標的核酸またはフックプローブとハイブリダイズし得るのを防止することなく、捕捉プローブと捕捉帯との間に間隔を置く任意の構成成分を含み得る。好ましくは捕捉プローブスペーサーは、生体高分子を含む。
好ましくはタンパク質は、捕捉プローブに直接吸着される。
慣用的ディップスティックでは、検出プローブまたは捕捉プローブは、共有結合、吸着、熱の使用により、またはUV架橋によりディップスティックに固定される。しかしながら、タンパク質は、捕捉プローブより容易に且つ効率的にディップスティックに固定され得る、ということが判明した。その結果として、捕捉帯へのタンパク質の直接吸着は、慣用的固定よりも、ディップスティックに捕捉プローブを固定するより便利で且つより効率的な手段である。
タンパク質に非タンパク質を連結するためには、非タンパク質と反応し得る一次反応基およびタンパク質と反応し得る二次反応基を含む変性剤を用いることが一般的に必要である。
一旦変性剤が非タンパク質およびタンパク質と反応して、非タンパク質をタンパク質に連結すれば、反応化変性剤は、本明細書中では「リンカー」と呼ばれる。
しかしながら好ましくは、非タンパク質は、捕捉プローブが標的核酸またはフック捕捉プローブとハイブリダイズしていた場合、形成された塩基対と積重ね相互作用を生じ得るヌクレオ塩基を含む。さらに好ましくは、非タンパク質はヌクレオチドを含む。もっとも好ましくは、非タンパク質は1つまたはそれ以上のヌクレオチドのみからなる。
本発明の第一の局面のディップスティックは、試料溶液中の標的核酸の存在に関する試験方法であって、標的核酸とハイブリダイズし得る検出プローブが、標的核酸との検出プローブのハイブリダイゼーションのための条件下で試料溶液とともにインキュベートされる方法に用いられ得る。ディップスティックの接触端は試料溶液と接触され、もう監査用により試料溶液がディップスティックを上昇するのを可能にする。試料溶液中の検出プローブとハイブリダイズされた標的核酸は次に、捕捉帯で捕捉プローブにより捕捉され得る。次に試料溶液中の標的核酸の存在が、捕捉帯での検出プローブの存在により示される。
本発明の第一の局面のディップスティック、および
標的核酸とハイブリダイズし、それにより検出プローブを利用した標的核酸の検出を可能にし得る検出プローブ
を含むキットも提供する。
試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップ、
接触端から遠く離れた捕捉帯に固定された捕捉部分であって、標的核酸と直接または間接的に結合し得る捕捉部分、ならびに
接触端および捕捉帯間に置かれたプローブ帯に放出可能的に固定された検出プローブであって、標的核酸とハイブリダイズし得る、そして標的と結合されて、検出プローブの直接的検出を可能にし、あるいは検出リガンドに結合されて検出プローブの間接的検出を可能にする検出プローブ
を含むディップスティックであって、標識または検出リガンドが検出プローブスペーサーに連結され、そして検出プローブスペーサーが検出プローブに連結されて、それにより標識または検出リガンドを検出プローブに結合し、そして標識または検出リガンドと検出プローブとの間に間隔を置くディップスティックが提供される。
検出プローブスペーサーは、タンパク質を含み得る。「タンパク質」という用語は、1つまたはそれ以上のアミノ酸残基を含む任意の化合物を意味するために本明細書中で用いられる。好ましいタンパク質の例は、天然タンパク質、例えばウシ血清アルブミン(BSA)、チログロブリンまたはその誘導体である。誘導体としては、アミノ酸置換、付加または欠失により、あるいは翻訳後修飾によりBSAまたはチログロブリンとは異なるタンパク質が挙げられる。
適切な変性剤の例は、6−(トリフルオロアセチルアミノ)ヘキシル−(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)−ホスホルアミダイト(C6−TFA)である。その他の適切な変性剤は、当業者に既知である。
標識または検出リガンドは、ビーズのような粒子の一部であり得るか、またはそれに付着される。好ましくはタンパク質は、標識または検出リガンドに直接吸着される。
タンパク質に非タンパク質を連結するためには、非タンパク質と反応し得る一次反応基およびタンパク質と反応し得る二次反応基を含む変性剤を用いることが一般的に必要である。ヘキシル基を含む非タンパク質とともに用いるための適切な変性剤は、6−(トリフルオロアセチルアミノ)ヘキシル−(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)−ホスホルアミダイト(C6−TFA)である。その他の適切な変性剤は、当業者に既知である。
その他の配置では、検出プローブスペーサーは非タンパク質のみを含む。このような配置に関しては、標識または検出リガンドに非タンパク質を連結するためには、非タンパク質を機能的にすることが一般的に必要である。これは、非タンパク質と反応し得る一次反応基および標識または検出リガンドと反応し得る二次反応基を含む変性剤を用いることによりなされ得る。
しかしながら好ましくは、非タンパク質は、検出プローブが標的核酸とハイブリダイズしていた場合、形成された塩基対と積重ね相互作用を生じ得る塩基を含む。さらに好ましくは、非タンパク質はヌクレオチドを含む。もっとも好ましくは、非タンパク質は1つまたはそれ以上のヌクレオチドのみからなる。
検出プローブスペーサーは、検出プローブが標的核酸とハイブリダイズするのを妨げない検出プローブの任意の部分に連結され得る。検出プローブスペーサーが検出プローブの末端間の検出プローブの一部分に連結される場合、検出プローブの一端または両端は、検出プローブが標的核酸とハイブリダイズしていた場合には標的核酸とハイブリダイズしない1つまたはそれ以上のヌクレオチド、好ましくは少なくとも3つのヌクレオチドと結合され得る。
例えば捕捉部分は、標的核酸と直接的にハイブリダイズし得る捕捉プローブを含み得る。あるいは捕捉部分は、標的核酸に結合されたフック捕捉プローブとハイブリダイズし得る捕捉プローブを含み得る。
捕捉プローブ、フック捕捉プローブおよび検出プローブは各々、少なくとも1つの核酸または核酸類似体を含み得る。プローブが1つより多い核酸または核酸類似体を含む場合、それらは好ましくは一緒にハイブリダイズされる。
捕捉部分が、標的核酸に結合された捕捉プローブに結合された捕捉リガンドと結合し得る本発明の第二の局面によるディップスティック、ならびに
標的核酸と、または標的核酸に結合されたフック捕捉プローブとハイブリダイズし得る捕捉プローブであって、捕捉部分により結合され得る捕捉リガンドに結合される捕捉プローブ
を含むキットも提供する。
適切な捕捉または検出リガンドの例としては、ビオチン(例えば抗ビオチン抗体、アビジン、ストレプタビジンまたはその誘導体により捕捉または検出される)、フルオロセイン(例えば抗フルオレセイン抗体により捕捉または検出される)、および2,4−ジニトロフェノール(DNP)(例えば抗DNP抗体により捕捉または検出される)が挙げられる。
本発明のキットおよびディップスティックは、試料溶液中の標的核酸を検出するために用いられるキットに必要な任意の試薬をさらに含み得る、と理解される。例えば、検出リガンドに結合された検出プローブを含む本発明のキットは、検出リガンド結合部分をさらに含み得る。これは、ディップスティックに分離されるか、あるいは接触端および捕捉帯間のディップスティックに放出可能的に固定され得る。
試料溶液中の標的核酸の存在に関する試験キットであって、以下の:
i)試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップ、および標的核酸と、または標的核酸に結合されたフック捕捉プローブとハイブリダイズし得る捕捉プローブであって、接触端から遠く離れたクロマトグラフィーストリップの捕捉帯に固定されている捕捉プローブを含むディップスティック、ならびに
ii)標的核酸とハイブリダイズし得る、標識に結合されて検出プローブを利用した標的核酸の直接的検出を可能にする、あるいはリガンドに結合されて検出プローブを利用した標的核酸の標的核酸の間接的検出を可能にする検出プローブ
を含むキットであって、標識または検出リガンドが検出プローブスペーサーに連結され、そして検出プローブスペーサーが検出プローブに連結されて、それにより標識または検出リガンドを検出プローブに結合し、標識または検出リガンドと検出プローブとの間に間隔を置くキットも本発明により提供される。
i)試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップ、および接触端から遠く離れたクロマトグラフィーストリップの捕捉帯に固定された捕捉部分であって、標的核酸と直接または間接的に結合し得る捕捉部分を含むディップスティック、
ii)標的核酸と、または標的核酸に結合されたフック捕捉プローブとハイブリダイズし得る捕捉プローブであって、捕捉部分により結合され得る捕捉リガンドに結合される捕捉プローブ、ならびに
iii)標的核酸とハイブリダイズし得る、標識に結合されて検出プローブを利用した標的核酸の直接検出を可能にし、あるいは検出リガンドに結合されて検出プローブを利用した標的核酸の間接的検出を可能にする検出プローブ
を含むキットであって、標識または検出リガンドが検出プローブスペーサーに連結され、そして検出プローブスペーサーが検出プローブに連結されて、それにより標識または検出リガンドを検出プローブに結合し、そして標識または検出リガンドと検出プローブとの間に間隔を置くキットも本発明により提供される。
i)試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップ、および接触端から遠く離れたクロマトグラフィーストリップの捕捉帯に固定された捕捉部分を含むディップスティック、
ii)標的核酸と、または標的核酸に結合されたフック捕捉プローブとハイブリダイズし得る捕捉プローブであって、捕捉プローブが捕捉プローブスペーサーに連結され、そして捕捉プローブスペーサーが捕捉リガンドに連結されて、それにより捕捉リガンドを捕捉プローブに結合し、捕捉リガンドと捕捉プローブとの間に間隔を置く捕捉プローブ、ならびに
iii)標的核酸とハイブリダイズし得る、標識に結合されて検出プローブを利用した標的核酸の直接検出を可能にし、あるいは検出リガンドに結合されて検出プローブを利用した標的核酸の間接的検出を可能にする検出プローブ
を含むキットも本発明により提供される。
固相にプローブを固定するための本発明の方法は、プローブをタンパク質に結合することをさらに包含し得る。
プローブは、核酸または核酸類似体を包含し得る。
リンカーは、好ましくはプローブの非ヌクレオ塩基部分に結合される。プローブが核酸を含む場合、リンカーは好ましくはプローブの糖またはホスフェート基に結合される。プローブが核酸類似体PNA(タンパク質核酸)を含む場合、リンカーは好ましくはプローブのアミノ基に結合される。これは、リンカーがヌクレオ塩基の塩基対合を妨害しないようにということである。あるいはリンカーは、プローブおよびその結合相手の塩基対合相互作用をリンカーが妨害しないよう、プローブの結合相手(例えば標的核酸)とハイブリダイズし得るプローブの部分の5‘または3’に結合され得る。
リンカーは好ましくは、リンカーに結合された第一アミノ基とタンパク質のカルボキシル基との反応により、タンパク質に結合される。
プローブに結合されたタンパク質の固相への吸着により固相に固定されたプローブも、本発明により提供される。
試料溶液中の標的核酸の存在に関して試験するためのディップスティック検定における本発明のディップスティック、キットまたはプローブの使用も、本発明により提供される。
1)接触端を有するクロマトグラフィーストリップおよび接触端から遠く離れた捕捉帯で固定された捕捉プローブであって、標的核酸とハイブリダイズし得る捕捉プローブを含むディップスティックが提供される。検出プローブは、検出プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションのための条件下で試料溶液と接触される。試料溶液は、ディップスティックの接触端と接触されて、毛管作用により試料溶液を捕捉帯に移動させ、それにより標的核酸および検出プローブを試料溶液とともに捕捉帯に移動させ、そして標的核酸を捕捉帯で捕捉させる。検出プローブは次に、捕捉帯で検出され得る。捕捉帯での検出プローブの存在は、標的核酸が試料溶液中に存在したことを示す。
実施例は、クラミジア属細菌のトラコーマクラミジアChlamydia trachomatis(CT)の隠れたプラスミドのDNA断片の検出に関する。CTは、性感染病の最も一般的な原因の1つである。CT感染は、不妊症を引き起こし得るし、そして妊娠中には、自然流産を、さらに出産時または出産後子宮内膜炎を生じ得る。新生児において、CT感染は失明および慢性呼吸疾患を引き起こし得る。感染男性の約10%、および感染女性の約70%がCT感染の症状を示さない。したがって、病気の早期治療が開始され得るよう、CT感染の的確な診断が重要である。
標的核酸の検出感度は、捕捉プローブがハイブリダイズする標的核酸の領域と検出プローブがハイブリダイズする領域との間の距離が26ヌクレオチド未満である場合、低減され得る、ということが判明した。したがって、これらの領域間の距離は少なくとも26ヌクレオチド、好ましくは少なくとも200ヌクレオチドである、というのが好ましい。
以下の実施例に用いられるプローブの配列を以下に示す:
配列番号1:5’TGC AAC TCT TGG TGG TAG ACT TTG C
配列番号2:5’GCG CAC AGA CGA TCT ATT TTT TGC A
配列番号3:5’CGG GCG ATT TGC CTT AAC CCC ACC A
配列番号4:5’CCA AGC TTA AGA CTT CAG AGG AGC G
配列番号5:5’CAT GCG TTT CCA ATA GGA TTC TTG G
配列番号6:5’CAC AGT CAG AAA TTG GAG TGC TGG C
配列番号7:5’CTT GCT GCT CGA ACT TGT TTA GTA C
配列番号8:5’AGA AGT CTT GGC AGA GGA AAC TTT T
配列番号9:5’CTA GAA TTA GAT TAT GAT TTA AAA GGG
配列番号10:5’TTC ATA TCC AAG GAC AAT AGA CCA A
配列番号11:5’TGA TCT ACA AGT ATG TTT GTT GAG T
配列番号12:5’TGC ATA ATA ACT TCG AAT AAG GAG AAG
配列番号13:5’TCC CTC GTG ATA TAA CCT ATC CG
配列番号14:5’CAG GTT GTT AAC AGG ATA GCA CGC
配列番号15:5’CTC GTT CCG AAA TAG AAA ATC GCA
配列番号16:5’GGT AAA GCT CTG ATA TTT GAA GAC
配列番号17:5’CTG AGG CAG CTT GCT AAT TAT GAG T
下記の実施例における検出プローブの構造は、図12に模式的に示されている。
実験設定:
捕捉フォーマット:直接プローブ捕捉(cp)(ディップスティック上に固定された配列番号14);
検出プローブ(dp):5‘末端に直接結合されたビオチンを伴う、あるいは3ヌクレオチド(N3)、6ヌクレオチド(N6)、SまたはSSスペーサーによる配列番号13または配列番号15、もしくは3’末端に直接結合されたビオチンを伴う配列番号13。各々の1012コピー。
標的DNA:73または76ヌクレオチド一本鎖DNA断片(5x1011〜1010コピー)。
N6、N3、SSまたはSスペーサーにより5‘末端に結合されたビオチンを伴う検出プローブを用いた標的核酸検出の感度は、5’末端に直接結合されたビオチンを伴う検出プローブを用いた感度より高かった。
ビオチン(またはその他の検出リガンド)は検出プローブの一端に結合される、というのが好ましい。捕捉プローブおよび検出プローブが捕捉帯で標的核酸とハイブリダイズされる場合に形成された複合体においては、ビオチン(またはその他の検出リガンド)は、捕捉プローブとハイブリダイズする標的核酸の領域に近位の検出プローブの末端に(内部的に配向される)、あるいは好ましくは捕捉プローブとハイブリダイズする標的核酸の領域に遠位の検出プローブの末端に(外部的に配向される)存在し得る。検出プローブに検出リガンドを結合するためにスペーサーが用いられない場合には、標的核酸の検出感度は一般に、検出リガンドが外部的に配向される場合は、より高い。したがって検出プローブは通常は、検出リガンドが外部的に配向されるよう、選択される。
実験設定
捕捉フォーマット:ディップスティック膜上に固定された直接プローブ捕捉(cp)配列番号14;
検出プローブ:3ヌクレオチド(N3)、6ヌクレオチド(N6)、SまたはSSスペーサーにより5‘末端に直接結合されたビオチンを伴うプローブ(dp)配列番号13、配列番号15および配列番号16。各々の1012コピー。
検出フォーマット:抗ビオチン抗体染料接合体;
標的DNA:214 bp二本鎖DNA断片(1011〜1010コピー)。
二本鎖標的核酸の検出感度は、N3、N6、SSまたはSスペーサーを用いて5倍以上改良された。
検出感度は、N3およびSスペーサーを用いた場合よりN6およびSSスペーサーを用いた方が高かったが、これは、スペーサーの長さが検出感度改良のために重要であることを示す。
検出感度は、以下のスペーサーが等価長を有するという事実にもかかわらず、SSスペーサーよりN6スペーサーを用いたほうがより高かったが、これは、スペーサーの物理化学的特性が検出感度改良のために重要であることを示す。
標的核酸検出の感度は、検出プローブに検出リガンドを結合するためにスペーサーを用いることにより増大される。
長いスペーサーのほうが短いスペーサーより良好である。
等価長であるがしかし異なる物理化学的特性を有するスペーサーは、検出感度に異なる作用を及ぼした。特に、非タンパク質構成成分がヌクレオチドのみからなるスペーサーは、非ヌクレオチド構成成分を含むスペーサーより良好である。これに関して考え得る説明をいかに示す:
1.ヌクレオチドスペーサーは、検出プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションを強化することにより、検出感度を改良し得る。これらのスペーサーのヌクレオチドは、検出プローブが標的核酸とハイブリダイズする場合、標的核酸のヌクレオチドと塩基対合すると予測されない。これらのヌクレオチドのヌクレオ塩基は、検出プローブが標的核酸とハイブリダイズする場合に形成される塩基対との積重ね相互作用を生じ得る。これらの積重ね相互作用は、標的核酸と検出プローブとの間に生成されるハイブリッドの安定性を強化し、それにより標的核酸の検出感度を強化し得る。
実験設定
捕捉フォーマット:直接プローブ捕捉(cp)配列番号10(ディップスティック上に固定);
検出プローブ:直接的に、あるいはN6、SS、(dS)6、(SC3)6またはSN3SN3Sスペーサーによりビオチンに結合された検出プローブ(dp)配列番号13。各々の1012コピー;
検出フォーマット:抗ビオチン抗体染料接合体;
ヘルパープローブ:配列番号10に隣接する配列番号5および配列番号6;配列番号13に隣接する配列番号1および配列番号2(1012コピー)。
標的DNA:872 bp二本鎖DNA断片(2x1011〜1010コピー)。
SS、(dS)6および(SC3)6スペーサーは、それらの構造的差異および特性にもかかわらず、等価長を有し、そして標的核酸の検出感度の強化に同様の作用を及ぼした。
標的核酸検出の感度は、SN3SN3Sスペーサー(試験した最長スペーサー)よりN6スペーサーを用いたほうがより高かった。これに関して考え得る説明は、スペーサーのN3構成成分のヌクレオ塩基と検出プローブおよび標的核酸間に形成される塩基対との間の積重ね相互作用をSモノマーが低減または排除する、というものであり得る。このデータは、スペーサーの非対合ヌクレオ塩基と標的核酸および検出プローブ間に形成される二重鎖との間の積重ね相互作用が標的核酸の検出感度の強化に重要である、という結論を支持する。
ディップスティック試験により、ならびにドットブロット分析により、異なる物理化学的特性および長さを有するスペーサーを評価した。ドットブロット分析は、検出プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションの非存在下で分析される検出プローブに結合されたビオチンとの抗ビオチン抗体の相互作用の効率性を可能にする。異なるスペーサーによりビオチンに結合された検出プローブの5x108〜5x1011コピーを、正荷電ナイロン膜上の異なる場所にスポッティングし、そして膜とUV架橋させた。次に膜を、アルカリ性ホスファターゼ(ニトロブルーテトラゾリウム/5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスフェート(NBT/BCIP)色原性基質を転換し得る)に結合された抗ビオチン抗体とともにインキュベートし、洗浄し、NBT/BCIP色原性基質とともにインキュベートし、そして膜を観察して、捕捉帯でいかなる色が生成されたかを見た。
捕捉フォーマット:直接プローブ捕捉(cp)配列番号14(ディップスティック上に固定);
検出プローブ:直接的に、あるいはヌクレオチドまたは非ヌクレオチドスペーサーにより5‘末端でビオチンに結合された検出プローブ(dp)配列番号13。各々の1012コピー;
検出フォーマット:抗ビオチン抗体染料接合体;
ヘルパープローブ:配列番号14に隣接する配列番号2および配列番号3(1012コピー)。
標的DNA:416 bp二本鎖DNA断片(5x1010〜109コピー)。
検出プローブ:直接的に、あるいはヌクレオチドまたは非ヌクレオチドスペーサーにより5‘末端でビオチンに結合された検出プローブ配列番号13;
検出フォーマット:アルカリ性ホスファターゼに結合された抗ビオチン抗体。NBT/BSIP色原性基質による検出;
3、4または5ヌクレオチドスペーサーとともに検出プローブを用いた標的核酸検出の感度に、有意差は認められない。
ヌクレオチドのみからなるスペーサーを用いた検出感度は、非ヌクレオチドを含むスペーサーを用いた場合より良好であった。例えばN3スペーサーは、15ヌクレオチド長と等価である最長スペーサーSN3SN3Sより良好であった。
ドットプロット試験の結果を以下に示す:
検出感度は、最長スペーサー(SSSおよびSN3SN3S)を用いた場合に最高であった。
異なる物理化学的特性を有する等価長スペーサー(N6、(dS)6およびSS)を用いた検出感度は、同様であった。
dS構成成分は、ヌクレオチドと同様の構造を有する。ともに、剛性を提供すると予測されるリボース残基を有する。しかしながらヌクレオチドは、dS構成成分中には存在しないヌクレオ塩基を有する。N6スペーサーと比較した場合の標的核酸検出の感度に及ぼす(dS)6スペーサーの異なる作用は、ヌクレオチドスペーサーを用いた検出の感度の改良に及ぼすより大きい作用が、標的核酸と塩基対合しないヌクレオ延期の存在により主に説明される、ということを示唆する。
(dS)6スペーサーを用いた検出感度は、SSスペーサーを用いた場合より高い。これらのスペーサーは、等価長を着する。これは、スペーサーの物理化学的特性、例えば剛性または極性もスペーサーによる検出感度の改良に影響を及ぼし得る、ということを示唆する。
実験設定
捕捉フォーマット:ディップスティックに固定されたBSAに結合された直接プローブ捕捉(cp)配列番号14。捕捉プローブは、直接的にまたは6ヌクレオチドスペーサーにより、BSAに結合される;
検出プローブ:フルオレセインに結合された検出プローブ(dp)配列番号13;
検出フォーマット:抗フルオレセイン抗体−染料接合体;
標的DNA:73 ntまたは76 nt一本鎖DNA断片(1011コピー)。
実験設定
捕捉フォーマット:ディップスティックに固定されたBSAに5‘末端で結合された直接プローブ捕捉(cp)配列番号14。捕捉プローブは、N6またはSN3SN3Sスペーサーにより、BSAに結合される;
検出プローブ:ビオチンに結合された検出プローブ(dp)配列番号7、8、9、10、11、12、13、15、16および17;
検出フォーマット:抗ビオチン抗体−染料接合体;
標的DNA:872 bp二本鎖DNA断片(1011〜2.5x109コピー)。
実験設定
捕捉フォーマット:ディップスティックに固定されたBSAに結合された直接プローブ捕捉(cp)配列番号15。捕捉プローブは、N6スペーサーにより、BSAに結合される;
ヘルパープローブ:配列番号15に隣接する配列番号3および配列番号4;
検出プローブ:本実施例では、検出プローブはフックプローブおよび普遍プローブを含む。フックプローブは、配列番号17(標的核酸とハイブリダイズし得る)に対応する配列および普遍プローブの配列と相補的な配列を有する。普遍プローブは、N6またはSN3SN3Sスペーサーによりテキスタイル染料に結合される。フックプローブの1012コピーが存在する;
標的:872 bp二本鎖DNA断片(1011および1010コピー)。
固定タンパク質に捕捉プローブを結合するためのディップスティックに固定されたタンパク質、および非タンパク質を含むスペーサーの使用(実施例5および6)、あるいは検出プローブに標識を結合するための非タンパク質スペーサーの使用(実施例7)は、標的核酸の検出感度を改良する。
タンパク質担体によりまたは受動的吸着によりディップスティック膜に固定された捕捉プローブを用いた標的核酸検出の感度を、本実施例で比較する。
捕捉フォーマット:ディップスティックに直接固定された配列番号14による、またはBSAタンパク質スペーサーによる直接プローブ捕捉。捕捉プローブおよび捕捉プローブ−BSAをディップスティックに適用し、80℃で1時間ディップスティックを処理することにより固定した;
検出プローブ:ビオチン標識化検出プローブ(dp)配列番号13(1012コピー);
検出フォーマット:抗ビオチン抗体−染料接合体;
標的DNA:73ヌクレオチド一本鎖DNA断片(1x1011コピー)。
捕捉プローブ: シグナル
捕捉プローブ−BSA 4.0
捕捉プローブ 0.0
ディップスティックに直接固定された捕捉プローブを用いて、標的核酸を検出できなかった。しかしながら、捕捉プローブをBSAに結合し、そしてBSAをディップスティックに固定した場合には、強い検出シグナルを得た。
10 mMNaCl、1 mMEDTA、pH7.5を含有する10 mMリン酸塩緩衝液434 μl中で洗浄染料(A575=900)を希釈する。プローブ−BSA(2 mg/ml)5 μlを付加し、十分に混合して、室温で1時間回転させる;
20%アルカリ処理カゼイン50 μlを付加する。十分に混合し、室温で1時間回転させる;
室温で1時間、ミクロ遠心機で4000 rpmで遠心分離する;
上清を除去し、5%スクロース、2%アルカリ処理カゼイン、0.02%Naアジドを含有する接合緩衝液500 μl中にペレットを再懸濁する。
実験設定
捕捉フォーマット:捕捉プローブ配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16および配列番号17に結合された抗ビオチン抗体/ビオチン(1012コピー/試験);
代替的に、直接プローブ捕捉フォーマット(配列番号14または配列番号15)を比較のために用いた;
BSAにより染料粒子に結合された直接検出プローブ配列番号10;
ヘルパープローブ:配列番号10に隣接する配列番号5および配列番号6; 標的:872 bp二本鎖DNA断片(1011〜108コピー)。
実験設定
捕捉フォーマット:ディップスティックに固定されたBSAに結合された直接プローブ捕捉(cp)配列番号15;
ヘルパープローブ:配列番号15に隣接する配列番号3および配列番号4;
検出プローブ領域配列番号17。この領域に置ける標的DNAと、ならびに普遍プローブ配列と相補的な配列を有する「フックプローブ」を、1012コピー/試験で用いた;
検出フォーマット:BSAにより普遍プローブに結合されたテキスタイル染料;
標的:872 bpdsDNA断片(1011および1010コピー)。
標的のコピー 1011 1010
シグナル 2.0 0.0
実験設定
捕捉フォーマット:ディップスティックに固定されたBSAに結合された直接プローブ捕捉配列番号15;
ヘルパープローブ:配列番号15に隣接する配列番号3および配列番号4;
検出プローブ領域配列番号17。この領域に置ける標的DNAと、ならびに普遍プローブ配列2と相補的な配列を有する「フック」検出プローブ1を、1012コピー/試験で用いた;
検出フォーマット:フック検出プローブは、標的核酸の配列と、ならびに一次普遍検出プローブの配列と相補的な配列を含む。一次普遍検出プローブはBSAに結合され、BSAは一次着色粒子に吸着されて、それにより一次普遍検出プローブを一次着色粒子に結合する。いくつかの二次普遍検出プローブも、一次着色粒子に吸着されたBSAに各々結合される。二次普遍検出プローブは、三次普遍検出プローブの配列と相補的な配列を含む。三次普遍検出プローブは、二次着色粒子に吸着されたBSAに結合される。標的核酸がフック検出プローブ、一次、二次および三次普遍検出プローブならびに一次および二次着色粒子を用いて検出される場合、図11におけるように、単一一次着色粒子は標的核酸上に一次層を形成し、そしていくつかの二次着色粒子は標的核酸上に二次層を形成する。いくつかの着色粒子はこの方法で各標的核酸に付着され得るため、標的核酸の検出感度は、フック検出プローブおよび着色粒子に結合された単一普遍検出プローブの使用と比較して改良される、と考えられる。
結果:
標的のコピー 1011 1010
シグナル 2.0 0.5
1598 bpdsDNA標的を用いて、同様の結果を得た。
実験設定:
試薬:
捕捉フォーマット:BSA担体によりディップスティック膜上に固定されたオリゴヌクレオチドプローブ捕捉;
検出フォーマット:多ビオチン標識化検出体プローブ;抗ビオチン抗体−コロイド金接合体;
試料調製:PBS緩衝液中の106コピー/μl〜103コピー/μlの濃度で、トラコーマクラミジアChlamydia trachomatus(Ct)基本小体(EB)細胞を調製し、100℃で20分間加熱した。
検出プローブ、ヘルパープローブおよび5x106〜5x103コピーのEBをハイブリダイゼーション緩衝液中に希釈して80μlとし、100℃で7分間加熱した。次に混合物を手短に遠心分離して、すべての液体を収集し、20μlの抗ビオチンAbコロイド金と混合した。全100μlの混合物をディップスティック上に吸い上げてさせて、シグナルを発現させた。
表および図13に提示した結果は、試料調製段階を含めて1時間未満で、一段階核酸ディップスティック検定を用いてCtEBの約104コピーが検出され得たことを示した。
そのように提示されたディップスティック検出検定は他のサンドイッチハイブリダイゼーション検定とほぼ等しい検出感度を有するが、しかしそれは、速度および簡便性という大きい利点を有する。
一本鎖標的核酸は、分子内塩基対合相互作用により二次構造を形成することが既知である。このような二次構造は、標的核酸との捕捉プローブおよび検出プローブの結合を阻害し得る。したがって、検出プローブおよび捕捉プローブが結合する標的核酸の領域は、しばしば二次構造を実質的に有さないと予測される領域として選択される。
Claims (24)
- 試料溶液中の標的核酸の存在に関して試験するためのディップスティックであって、以下の:
試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップ、
接触端から離れたクロマトグラフィーストリップの捕捉帯に固定された捕捉プローブであって、標的核酸とハイブリダイズし得るか、あるいは標的核酸に結合されたフック(鈎針)捕捉プローブとハイブリダイズし得る捕捉プローブであり、捕捉プローブが捕捉プローブスペーサーに連結され、捕捉プローブスペーサーが捕捉帯に連結され、それにより捕捉帯に捕捉プローブを固定し、そして捕捉帯と捕捉プローブとの間に間隔を置く捕捉プローブを含み、
i) 前記捕捉プローブスペーサーが捕捉プローブの一端に連結され、かつ前記捕捉プローブスペーサーに連結されない捕捉プローブの末端が、捕捉プローブが標的核酸とハイブリダイズしていた場合に標的核酸とハイブリダイズせず、あるいは捕捉プローブがフック捕捉プローブとハイブリダイズしていた場合にフック捕捉プローブとハイブリダイズしない1つまたはそれ以上のヌクレオチドと結合され;
ii) 前記捕捉プローブスペーサーが捕捉プローブの末端間で捕捉プローブの一部に連結され、かつ前記捕捉プローブの一端または両端が、捕捉プローブが標的核酸とハイブリダイズしていた場合に標的核酸とハイブリダイズせず、あるいは捕捉プローブがフック捕捉プローブとハイブリダイズしていた場合にフック捕捉プローブとハイブリダイズしない1つまたはそれ以上のヌクレオチドと結合され;
iii) 前記捕捉プローブスペーサーが、標的核酸またはフック捕捉プローブとハイブリダイズしていた場合、生成された塩基対との積重ね相互作用を生じ得るヌクレオ塩基を含むヌクレオチド、3−ヒドロキシプロピルホスフェート又はヘキサエチレングリコールホスフェートを含む;又は
iv) 前記捕捉プローブスペーサーが捕捉帯に直接吸着され、リンカーにより当該捕捉プローブに共有結合したBSAを含んでなる、
ことを特徴とするディップスティック。
- 前記捕捉プローブスペーサーがBSAをさらに含んで成り、ここで当該捕捉プローブは前記ヌクレオチドに結合され、当該ヌクレオチドは前記BSAに結合され、それにより捕捉プローブとBSAとの間に間隔を置く、請求項1記載のディップスティック。
- ヌクレオチドがリンカーによりBSAに結合される請求項2記載のディップスティック。
- 接触端およびクロマトグラフィーストリップの捕捉帯間に置かれたプローブ帯に放出可能的に固定された検出プローブであって、標的核酸とハイブリダイズして、標的核酸の検出を可能にし得る検出プローブをさらに含む請求項1〜3のいずれかに記載のディップスティック。
- 検出プローブが標的核酸とハイブリダイズしていた場合に標的核酸の直接検出を可能にする標識と検出プローブが結合される請求項4記載のディップスティック。
- 検出プローブが標的核酸とハイブリダイズしていた場合に標的核酸の直接検出を可能にするために検出リガンド結合部分により結合され得る検出リガンドと検出プローブが結合される請求項4記載のディップスティック。
- 標識または検出リガンドが検出プローブスペーサーに連結され、そして検出プローブスペーサーが検出プローブに連結されて、それにより標識または検出リガンドを検出プローブに結合させて、検出プローブと標識または検出リガンドとの間に間隔を置く請求項5または6記載のディップスティック。
- 試料溶液中の標的核酸の存在に関して試験するためのディップスティックであって、以下の:
試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップ、
接触端から遠く離れた捕捉帯に固定された捕捉部分であって、標的核酸と直接または間接的に結合し得る捕捉部分、ならびに
接触端および捕捉帯間に置かれたプローブ帯に放出可能的に固定された検出プローブであって、標的核酸とハイブリダイズし得る、そして標識と結合されて、検出プローブを利用した標的核酸の直接的検出を可能にし、あるいは検出リガンドに結合されて検出プローブを利用した標的核酸の間接的検出を可能にする検出プローブ
を含み、標識または検出リガンドが検出プローブスペーサーに連結され、そして検出プローブスペーサーが検出プローブに連結されて、それにより標識または検出リガンドを検出プローブに結合し、そして標識または検出リガンドと検出プローブとの間に間隔を置き、
i) 前記検出プローブスペーサーが検出プローブの一端に連結され、かつ前記検出プローブスペーサーに連結されない検出プローブの末端が、検出プローブが標的核酸とハイブリダイズしていた場合に標的核酸とハイブリダイズしない1つまたはそれ以上のヌクレオチドと結合され;
ii) 前記検出プローブスペーサーが検出プローブの末端間で検出プローブの一部に連結され、かつ前記検出プローブの一端または両端が、検出プローブが標的核酸とハイブリダイズしていた場合に標的核酸とハイブリダイズしない1つまたはそれ以上のヌクレオチドと結合され;
iii) 前記検出プローブスペーサーが、標的核酸とハイブリダイズしていた場合、生成された塩基対との積重ね相互作用を生じ得るヌクレオ塩基を含むヌクレオチド、3−ヒドロキシプロピルホスフェート又はヘキサエチレングリコールホスフェートを含む;又は
iv) 前記検出プローブスペーサーがBSAを含んでなる、
ことを特徴とするディップスティック。
- 標識または検出リガンドがビーズまたはビーズの一部に付着され、そしてBSAがビーズに直接吸着される請求項8記載のディップスティック。
- BSAがリンカーにより検出プローブに連結される請求項8または9記載のディップスティック。
- 検出プローブスペーサーがヌクレオチドを含む請求項8〜10のいずれかに記載のディップスティック。
- 検出プローブがヌクレオチドに結合され、そしてヌクレオチドがBSAに結合されて、それにより検出プローブとBSAとの間に間隔を置く請求項11記載のディップスティック。
- ヌクレオチドがリンカーによりBSAに結合される請求項12記載のディップスティック。
- 捕捉部分が、標的核酸と、あるいは標的核酸に結合されたフック捕捉プローブとハイブリダイズし得る捕捉プローブを含む請求項8〜13のいずれかに記載のディップスティック。
- 捕捉部分が、標的核酸に結合された捕捉プローブに結合された捕捉リガンドと結合し得る請求項8〜13のいずれかに記載のディップスティック。
- 試料溶液中の標的核酸の存在に関する試験キットであって、以下の:
請求項1〜3のいずれかに記載のディップスティック、ならびに
標的核酸とハイブリダイズし、それにより検出プローブを利用した標的核酸の検出を可能にし得る検出プローブ
を含むキット。
- 検出プローブが、標的核酸とハイブリダイズされた標的検出プローブの直接的検出を可能にする標識と、あるいは検出リガンド結合部分により標的核酸とハイブリダイズされた検出プローブの間接的検出を可能にする検出リガンドと結合される請求項16記載のキットであって、標識または検出リガンドが検出プローブスペーサーに連結され、そして検出プローブスペーサーが検出プローブに連結されて、それにより標識または検出リガンドを検出プローブに結合し、そして標識または検出リガンドと検出プローブとの間に間隔を置くキット。
- 試料溶液中の標的核酸の存在に関する試験キットであって、以下の:
請求項15記載のディップスティック、ならびに
標的核酸と、または標的核酸に結合されたフック捕捉プローブとハイブリダイズし得る捕捉プローブであって、捕捉部分により結合され得る捕捉リガンドに結合される捕捉プローブ
を含むキット。
- 捕捉リガンドが捕捉プローブに連結され、そして捕捉プローブスペーサーが捕捉プローブに連結されて、それにより捕捉リガンドを捕捉プローブと結合し、そして捕捉リガンドと捕捉プローブの間に間隔を置く請求項18記載のキット。
- 試料溶液中の標的核酸の存在に関する試験キットであって、以下の:
試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップ、および標的核酸と、または標的核酸に結合されたフック捕捉プローブとハイブリダイズし得る捕捉プローブであって、接触端から遠く離れたクロマトグラフィーストリップの捕捉帯に固定されている捕捉プローブを含むディップスティック、ならびに
標的核酸とハイブリダイズし得る、標識に結合されて検出プローブを利用した標的核酸の直接検出を可能にし、あるいはリガンドに結合されて検出プローブを利用した標的核酸の間接的検出を可能にする検出プローブ
を含み、標識または検出リガンドが検出プローブスペーサーに連結され、そして検出プローブスペーサーが検出プローブに連結されて、それにより標識または検出リガンドを検出プローブに結合して、標識または検出リガンドと検出プローブとの間に間隔を置き、
i) 前記検出プローブスペーサーが検出プローブの一端に連結され、かつ前記検出プローブスペーサーに連結されない検出プローブの末端が、検出プローブが標的核酸とハイブリダイズしていた場合に標的核酸とハイブリダイズしない1つまたはそれ以上のヌクレオチドと結合され;
ii) 前記検出プローブスペーサーが検出プローブの末端間で検出プローブの一部に連結され、かつ前記検出プローブの一端または両端が、検出プローブが標的核酸とハイブリダイズしていた場合に標的核酸とハイブリダイズしない1つまたはそれ以上のヌクレオチドと結合され;
iii) 前記検出プローブスペーサーが、標的核酸とハイブリダイズしていた場合、生成された塩基対との積重ね相互作用を生じ得るヌクレオ塩基を含むヌクレオチド、3−ヒドロキシプロピルホスフェート又はヘキサエチレングリコールホスフェートを含む;又は
iv) 前記検出プローブスペーサーがBSAを含んでなる、
ことを特徴とするキット。
- 試料溶液中の標的核酸の存在に関する試験キットであって、以下の:
試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップ、および接触端から遠く離れたクロマトグラフィーストリップの捕捉帯に固定された捕捉部分であって、標的核酸と直接または間接的に結合し得る捕捉部分を含むディップスティック、
標的核酸と、または標的核酸に結合されたフック捕捉プローブとハイブリダイズし得る捕捉プローブであって、捕捉部分により結合され得る捕捉リガンドと結合される捕捉プローブ、ならびに
標的核酸とハイブリダイズし得る、標識に結合されて検出プローブを利用した標的核酸の直接検出を可能にし、あるいは検出リガンドに結合されて検出プローブを利用した標的核酸の間接的検出を可能にする検出プローブ
を含み、標識または検出リガンドが検出プローブスペーサーに連結され、そして検出プローブスペーサーが検出プローブに連結されて、それにより標識または検出リガンドを検出プローブに結合し、そして標識または検出リガンドと検出プローブとの間に間隔を置き、または捕捉プローブが捕捉プローブスペーサーに連結され、そして捕捉プローブスペーサーが捕捉リガンドに連結されて、それにより捕捉リガンドを捕捉プローブに結合し、捕捉リガンドと捕捉プローブとの間に間隔を置き、そして
i) 前記スペーサーがプローブの一端に連結され、かつ前記スペーサーに連結されないプローブの末端が、プローブが標的核酸又はフック捕捉プローブとハイブリダイズしていた場合に標的核酸とハイブリダイズしない1つまたはそれ以上のヌクレオチドと結合され;
ii) 前記スペーサーがプローブの末端間でプローブの一部に連結され、かつ前記プローブの一端または両端が、プローブが標的核酸又はフック捕捉プローブとハイブリダイズしていた場合に標的核酸とハイブリダイズしない1つまたはそれ以上のヌクレオチドと結合され;
iii) 前記スペーサーが、標的核酸はフック捕捉プローブとハイブリダイズしていた場合、生成された塩基対との積重ね相互作用を生じ得るヌクレオ塩基を含むヌクレオチド、3−ヒドロキシプロピルホスフェート又はヘキサエチレングリコールホスフェートを含む;又は
iv) 前記スペーサーがBSAを含んでなる、
ことを特徴とするキット。
- ディップスティックアッセイにおいて標的核酸を検出するためのディップスティックアッセイプローブであって、当該プローブは標的核酸にハイブリダイズすることができる核酸又は核酸類似体と、当該プローブを使用して標的核酸の直接的な検出を可能にするラベル又は当該プローブを使用して標的核酸の間接的な検出を可能にするリガンドを含み、ここで当該ラベル又はリガンドはスペーサーに結合され、そしてこのスペーサーは核酸又は核酸類似体に結合され、これにより当該ラベル又はリガンドは当該核酸又は核酸類似体とは間隔を置き、そして
i)前記スペーサーがプローブの一端に連結され、かつ前記スペーサーに連結されないプローブの末端が、プローブが標的核酸とハイブリダイズしていた場合に標的核酸とハイブリダイズしない1つまたはそれ以上のヌクレオチドと結合され;
ii) 前記スペーサーが、3−ヒドロキシプロピルホスフェート又はヘキサエチレングリコールホスフェートを含む;又は
iii) 前記スペーサーがBSAを含んでなる、
ことを特徴とする、ディップスティックアッセイプローブ。
- ディップスティックアッセイにおいて標的核酸を捕捉するためのディップスティックアッセイプローブであって、当該プローブは標的核酸にハイブリダイズすることができる核酸又は核酸類似体と、当該プローブを使用して標的核酸の捕捉を可能にするリガンドを含み、ここで当該リガンドはスペーサーに結合され、そしてこのスペーサーは核酸又は核酸類似体に結合され、これにより当該リガンドは当該核酸又は核酸類似体とは間隔を置き、そして
i) 前記スペーサーがプローブの一端に連結され、かつ前記スペーサーに連結されないプローブの末端が、プローブが標的核酸とハイブリダイズしていた場合に標的核酸又はフック捕捉プローブとハイブリダイズしない1つまたはそれ以上のヌクレオチドと結合され;
ii) 前記スペーサーがプローブの末端間でプローブの一部に連結され、かつ前記プローブの一端または両端が、プローブが標的核酸とハイブリダイズしていた場合に標的核酸又はフック捕捉プローブとハイブリダイズしない1つまたはそれ以上のヌクレオチドと結合され;
iii) 前記スペーサーが、当該スペーサーが標的核酸にハイブリダイズしていた場合に生成される塩基対との積重ね相互作用を生じ得るヌクレオ塩基を含むヌクレオチド;3−ヒドロキシプロピルホスフェート;又はヘキサエチレングリコールホスフェートを含む;又は
iv) 前記スペーサーがBSAを含んでなる、
ことを特徴とする、ディップスティックアッセイプローブ。
- 請求項1〜15のいずれかに記載のディップスティック、又は請求項16〜21のいずれかに記載のキット又は請求項22又は23記載のプローブを使用することを含んで成る、試料液中の標的核酸の存在を試験するための方法。
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