WO2014007289A1 - 核酸クロマトグラフィー法、核酸クロマトグラフィー用組成物及びこれを含むキット - Google Patents

核酸クロマトグラフィー法、核酸クロマトグラフィー用組成物及びこれを含むキット Download PDF

Info

Publication number
WO2014007289A1
WO2014007289A1 PCT/JP2013/068251 JP2013068251W WO2014007289A1 WO 2014007289 A1 WO2014007289 A1 WO 2014007289A1 JP 2013068251 W JP2013068251 W JP 2013068251W WO 2014007289 A1 WO2014007289 A1 WO 2014007289A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
chromatography
target nucleic
water
composition
Prior art date
Application number
PCT/JP2013/068251
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
晃暢 織部
孝介 丹羽
廣田　寿一
Original Assignee
日本碍子株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 日本碍子株式会社 filed Critical 日本碍子株式会社
Priority to JP2014523765A priority Critical patent/JP6294821B2/ja
Priority to EP13812618.0A priority patent/EP2871244A4/en
Publication of WO2014007289A1 publication Critical patent/WO2014007289A1/ja
Priority to US14/587,214 priority patent/US20150125859A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/12—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the preparation of the feed
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody

Definitions

  • the nucleic acid chromatography method comprises a detection probe in which a liquid containing a target nucleic acid is developed on a porous solid phase carrier on which the liquid diffuses due to a capillary phenomenon, and is immobilized in advance on a specific region on the solid phase carrier.
  • the hybridized product is formed.
  • the detection of the hybridized product is based on the signal element imparted to the target nucleic acid prior to or at the time of development. That is, a signal element in the specified region or a secondary signal based on the signal element is detected.
  • the nucleic acid chromatography method requires a reaction time of about 10 to 15 minutes after the start of development.
  • the amount of target nucleic acid or the like subjected to chromatography may vary depending on the nucleic acid amplification reaction or the like. When the amount of the target nucleic acid is small, sufficient detection sensitivity may not be obtained.
  • the present specification provides a nucleic acid chromatography method, a composition for nucleic acid chromatography, and a kit capable of obtaining a stable detection state.
  • the present inventors have studied various methods for detecting a target nucleic acid more practically, that is, nucleic acid chromatography capable of detecting a target nucleic acid more stably. As a result, it was found that the detection sensitivity of the target nucleic acid is improved by including a water-soluble polymer not related to the detection of the target nucleic acid such as bovine serum albumin (BSA) in the liquid used for nucleic acid chromatography. .
  • BSA bovine serum albumin
  • a nucleic acid chromatography method comprising: A step of performing chromatography by supplying a chromatography solution containing a target nucleic acid to a solid phase carrier on which a detection probe capable of capturing the target nucleic acid is immobilized; With The chromatographic liquid is one or more water-soluble substances selected from the group consisting of albumin, casein, skim milk, globulin, gelatin, heparin, polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, dextran, polyvinyl alcohol, carboxymethyl cellulose, and polymaleimide. Containing a functional polymer.
  • compositions for nucleic acid chromatography comprising one or more water-soluble polymers selected from the group consisting of albumin, casein, skim milk, globulin, gelatin, heparin, polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, dextran, polyvinyl alcohol, carboxymethyl cellulose and polymaleimide object.
  • the magnesium salt contains magnesium chloride.
  • nucleic acid chromatography Nucleic acid containing one or more water-soluble polymers selected from the group consisting of albumin, casein, skim milk, globulin, gelatin, heparin, polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, dextran, polyvinyl alcohol, carboxymethyl cellulose and polymaleimide Chromatographic composition, A kit comprising: (21) The kit according to (20), wherein the composition for nucleic acid chromatography further comprises a magnesium salt.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of nucleic acid chromatography in Example 1.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of nucleic acid chromatography in Example 2.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of nucleic acid chromatography in Example 3. It is a figure which shows the nucleic acid chromatography result in Example 4.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of nucleic acid chromatography in Example 5. It is a figure which shows the nucleic acid chromatography result in Example 6.
  • the present specification provides a nucleic acid chromatography method, a composition for nucleic acid chromatography, and a kit for nucleic acid chromatography.
  • the nucleic acid chromatography method disclosed in the present specification includes one or more predetermined water-soluble polymers in a nucleic acid chromatography solution containing a target nucleic acid.
  • the composition disclosed in the present specification is a composition for preparing a solution for nucleic acid chromatography, and contains one or more predetermined water-soluble polymers.
  • the kit disclosed in this specification is provided with this composition.
  • the nucleic acid chromatography method, the present composition, and the present kit disclosed in the present specification include one or more predetermined water-soluble polymers in a liquid to be subjected to nucleic acid chromatography, so that the target can be detected with good detection sensitivity.
  • Nucleic acids can be detected. Therefore, for example, the target nucleic acid can be detected stably even if the amount of the target nucleic acid varies. Moreover, since the detection sensitivity is good, the target nucleic acid can be detected quickly. The reason is not necessarily clear, but it is inferred that it is possible to increase the accumulation degree of the target nucleic acid in the probe region.
  • the target nucleic acid is not particularly limited, and is any nucleic acid whose presence and / or amount should be detected.
  • the target nucleic acid may be natural or artificially synthesized.
  • natural target nucleic acids include genetic indicators in organisms such as humans and non-human animals, such as constitution, genetic diseases, onset of specific diseases such as cancer, disease diagnosis, treatment prognosis, selection of drugs and treatments, etc. Or a base sequence.
  • polymorphisms such as SNP and congenital or acquired mutations can be mentioned.
  • base sequences derived from microorganisms such as pathogenic bacteria and viruses can also be mentioned as base sequences possessed by the target nucleic acid.
  • synthetic target nucleic acids include nucleic acids that are artificially synthesized for some kind of identification.
  • the amplification product obtained by performing nucleic acid amplification reaction with respect to a certain kind of natural or artificial nucleic acid is mentioned.
  • the collection source of the target nucleic acid is not particularly limited.
  • the sample that may contain the target nucleic acid include various biological samples (blood, urine, sputum, tissue, cells (cultured animals derived from various animals). Cell, cultured plant cell, cultured microbial cell)), or a DNA extracted sample obtained by extracting DNA from such a biological sample.
  • nucleic acid means a polymer of nucleotides, and the number thereof is not particularly limited. Therefore, the target nucleic acid includes an oligonucleotide in which several tens of nucleotides are linked, and includes a longer polynucleotide.
  • the target nucleic acid includes single-stranded or double-stranded DNA, RNA single-stranded or double-stranded, DNA / RNA hybrid, DNA / RNA chimera and the like.
  • the nucleic acid may include a natural base, a nucleotide, and a nucleoside, and may include a non-natural base, a nucleotide, and a nucleoside in part.
  • a partial double strand structure having a single strand portion at least at any end may be used.
  • the single-stranded portion can be hybridized with a detection probe, so that the heat denaturation step necessary for a complete double strand can be omitted.
  • a partial double-stranded structure for example, one end (5 ′ end or 3 ′ end) of one strand of the double strand has a single strand protruding from the double strand portion, and one end of the other strand ( Similarly, it may be a structure having a single strand at the 3 ′ end or the 5 ′ end.
  • the structure which has a single strand in which both ends (5 'end and 3' end) of one strand of the double strand respectively protrude from the paired strand may be used.
  • Such a partial double-stranded structure includes, in addition to Patent Document 2, an amplification product of a nucleic acid amplification reaction as disclosed in International Publication No. 2006/095550, JP-A-5-252998, and the like.
  • Each of these amplification products has a double-stranded DNA having a partially double-stranded structure having a protruding end made of natural DNA at the 5 ′ end of each strand, and a protruding end made of natural DNA as an aptamer.
  • This type of DNA double strand has a first tag strand corresponding to the single strand portion of the first strand at the 5 ′ end and hybridizes to the target nucleic acid via a linking site that suppresses the DNA polymerase reaction.
  • This nucleic acid chromatography method (hereinafter simply referred to as a chromatography method) is a detection probe capable of capturing a target nucleic acid using a nucleic acid chromatography solution containing a target nucleic acid (hereinafter simply referred to as a chromatography solution). Is supplied to a solid phase carrier on which is immobilized, and chromatography is performed.
  • a solid phase carrier on which is immobilized and chromatography is performed.
  • the chromatography main body and the liquid for chromatography for performing nucleic acid chromatography will be described, and then the chromatography step will be described.
  • the chromatography main body includes a solid phase carrier and one or more detection probes fixed to the solid phase carrier.
  • the solid phase carrier is not particularly limited, and a conventionally known one can be adopted.
  • examples of the solid phase carrier include so-called porous materials mainly composed of polymers such as polyethersulfone, nitrocellulose, nylon, and polyvinylidene fluoride. Cellulose materials such as filter paper can also be preferably used.
  • the form of the main body for chromatography is not particularly limited. Any form such as a sheet form or a thin bar form capable of developing and diffusing the chromatographic liquid by the capillary phenomenon may be used.
  • the detection probe includes a detection sequence that can hybridize with at least a part of the target nucleic acid so that the target nucleic acid can be captured.
  • the detection sequence is preferably complementary to the part in the target nucleic acid.
  • the detection sequence possessed by the detection probe has a base sequence that is complementary to the extent that specific hybridization with at least a part of the target nucleic acid is possible. Preferably it has a completely complementary base sequence.
  • Such a detection sequence can be set complementarily to a sequence characteristic of the target nucleic acid, but can also be set independently of the target sequence.
  • the detection sequence of the detection probe can suppress or avoid non-specific binding between a plurality of detection probes, and is suitable for hybridization at a suitable temperature and time. Can be set in consideration of the hybridization conditions.
  • the same detection probe can always be used regardless of the type of target nucleic acid.
  • the target nucleic acid includes a base sequence capable of hybridizing such a detection probe.
  • a primer for a nucleic acid amplification reaction such as PCR is designed to include such a base sequence.
  • the length of the detection sequence is not particularly limited, but can be, for example, about 20 bases to 50 bases. This is because within this range, hybridization efficiency can generally be secured while ensuring the specificity of each detection sequence.
  • a base length detection sequence includes a 46 base length sequence obtained by combining two base sequences each having a base length of 23 bases each selected from SEQ ID NOs: 1 to 100 and a complementary sequence thereof, and the combined base sequence. Can be obtained by appropriately adding or deleting a base. More preferably, it is 20 bases or more and 25 bases or less.
  • such a base length detection sequence can be obtained by appropriately adding or deleting bases to the 23 base length sequences of SEQ ID NOS: 1 to 100 and their complementary sequences or these base sequences. it can.
  • the tag sequence in the first primer is a base sequence that is paired with the detection sequence
  • the base length of the tag sequence is preferably 20 bases or more and 50 bases or less, like the detection sequence. Preferably, it is 20 bases or more and 25 bases or less.
  • One or more detection probes can be immobilized on a single solid phase carrier.
  • the immobilization form is not particularly limited.
  • a known immobilization method is used. For example, in addition to electrostatic interaction between the probe for detection and the surface of the solid phase alone, functional groups in the material of the solid phase carrier (including functional groups provided for immobilization in addition to pre-existing functional groups) And a covalent bond with a functional group in the detection probe.
  • the region (probe region) on the solid phase carrier on which the detection probe is immobilized is formed in an arbitrary pattern. It may have a dot shape, a streak shape, or any other shape. Typically, a plurality of probe regions are provided at regular intervals along the development direction in a strainer leak shape that is orthogonal to the development direction of the chromatographic solution. Preferably, one probe region corresponds to one type of detection probe.
  • the chromatography main body can be provided with, for example, a known site. You may provide the supply part to which the liquid for chromatography is supplied in the upstream of a probe area
  • a complexing part for complexing the labeling element with the supplied target nucleic acid may be provided upstream of the probe region and the same as or downstream of the supply part.
  • a detection window or a colored marker may be provided to clearly indicate the probe area so that the probe area can be easily viewed.
  • a water absorption part for collecting the liquid after the completion of the expansion may be provided on the downstream side of the probe region.
  • the solid phase carrier can be provided with a marker region or the like for indicating that the chromatographic solution has sufficiently developed, in addition to the probe region in which the detection probe is immobilized.
  • a marker region or the like for indicating that the chromatographic solution has sufficiently developed, in addition to the probe region in which the detection probe is immobilized.
  • Each of these sites like the probe region, is formed of a porous body that can develop chromatographic liquids at the same time, and at the same time, does not prevent continuous development of chromatographic liquids at each site. It is configured. For example, such a plurality of parts are provided on one solid phase carrier. The label element will be described later.
  • the chromatographic liquid is a liquid that diffuses and moves the solid phase carrier of the chromatography main body by a capillary phenomenon, and is a medium for moving the solid phase carrier to the target nucleic acid.
  • the term “liquid for chromatography” has a composition and a state when applied to a chromatography main body.
  • the composition for chromatography mentioned later is a composition for preparing such a liquid for chromatography.
  • the liquid component of the chromatographic liquid disclosed in this specification is an aqueous medium.
  • the aqueous medium is not particularly limited, and examples thereof include water, an organic solvent compatible with water, or a mixture of water and one or more organic solvents.
  • Organic solvents that are compatible with water are well known to those skilled in the art, and examples include lower alcohols having about 1 to 4 carbon atoms, esters such as DMSO, DMF, methyl acetate, and ethyl acetate, and acetone.
  • the chromatographic solution can contain components for keeping the pH of the solution in a certain range. This is to ensure a pH range for ensuring a preferable dissociation state, stability and development environment of the target nucleic acid.
  • the buffer salt is usually in the range of 6.0 to 8.0, depending on the intended pH. More preferably, it is 7.0 or more and 8.0 or less.
  • Components for obtaining such pH are, for example, acetic acid and sodium acetate (acetic acid buffer), citric acid and sodium citrate (citrate buffer), phosphoric acid and sodium phosphate (phosphate buffer), and the like. Furthermore, a phosphate buffered saline (PBS) etc. are mentioned.
  • the chromatography solution contains a water-soluble polymer.
  • the water-soluble polymer means a water-soluble polymer other than the target nucleic acid, which does not inhibit the specific hybridization between the target nucleic acid and the detection probe.
  • a water-soluble polymer is a natural or synthetic water-soluble polymer which has a base sequence unrelated to the target nucleic acid and the detection probe or is heterogeneous.
  • water-soluble polymers examples include albumin, casein, skim milk, globulin, gelatin (mammalian gelatin such as cow and pig, fish gelatin), heparin, polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, dextran, polyvinyl alcohol, carboxymethyl cellulose, and polymaleimide. Can be mentioned. This is because these water-soluble polymers are usually different from the target nucleic acid and the detection probe. These can be used alone or in combination of two or more.
  • albumin casein, and skim milk are preferable as the water-soluble polymer. More preferred is albumin.
  • albumin one or two selected from the group consisting of cow, pig, goat, guinea pig, rabbit, cow, human, dog, rat, cat, mouse, monkey, donkey, hamster, horse, chicken and turkey
  • the above-mentioned animal serum albumin can be used. More preferably, it contains bovine serum albumin. Note that these sera can be used as they are instead of albumin. Any of these types of water-soluble polymers are commercially available.
  • the above-mentioned protein or other than the above-mentioned polymer can be used.
  • DNA and RNA are mentioned.
  • water-soluble polymers include polymers such as DNA and RNA.
  • fish DNA containing herring DNA such as herring sperm DNA and salmon DNA such as salmon sperm DNA can be mentioned.
  • synthetic DNA or RNA having a base sequence unrelated to the target nucleic acid or the detection probe is artificially mentioned.
  • the concentration of the water-soluble polymer in the chromatographic liquid is not particularly limited as long as the detection of the target nucleic acid can be stabilized, but when it exceeds 3.5% by mass, it is 3.5% by mass or less. This is because the stability of the detection sensitivity does not improve so much with respect to the increase in the content of. More preferably, it is 3 mass% or less, More preferably, it is 2.5 mass% or less. Moreover, 2 mass% or less may be sufficient.
  • the lower limit of the water-soluble polymer is preferably 0.1% by mass. This is because if the amount is less than 0.1% by mass, it is difficult to obtain the effect of containing the water-soluble polymer. More preferably, it is 0.3 mass%, More preferably, it is 0.4 mass%, More preferably, it is 0.5 mass%.
  • the chromatography solution can further contain a magnesium salt.
  • a magnesium salt in addition to the water-soluble polymer, it is possible to further increase the degree of target nucleic acid accumulation in the probe region and improve the detection stability, sensitivity, and rapidity of the target nucleic acid.
  • Such an effect is an effect peculiar to a magnesium salt that is hardly obtained with a potassium salt or a sodium salt.
  • Magnesium salt is an ionic compound containing magnesium as a cation.
  • inorganic salts such as magnesium hydroxide, magnesium chloride, magnesium bromide, and magnesium iodide, and organic acid salts such as magnesium acetate, magnesium citrate, and magnesium malate are exemplified.
  • the magnesium salt is not particularly limited and may be used alone or in combination of two or more.
  • magnesium chloride is included.
  • the concentration of the magnesium salt is appropriately determined within a range where the detection stability of the target nucleic acid can be improved.
  • it is 0.5 mM or more and 10.0 mM or less, and if it is less than 0.5 mM, a synergistic effect with the water-soluble polymer is difficult to obtain, and if it exceeds 10.0 mM, nonspecific hybridization occurs. is there. More preferably, it is 1 mM or more, More preferably, it is 2 mM or more, More preferably, it is 3 mM or more. Even at about 8.0 mM, specific hybridization between the target nucleic acid and the detection probe is not inhibited, the detection sensitivity of the target nucleic acid is improved, and rapid detection becomes possible. Moreover, 5 mM or less may be sufficient.
  • the chromatographic solution may contain a metal salt other than the magnesium salt. Although it does not specifically limit, For example, potassium salt and sodium salt may be included.
  • the chromatography liquid can further contain a surfactant.
  • a surfactant By including the surfactant, the interfacial tension can be reduced at the gas / liquid interface and the solid / liquid interface, and the wettability can be improved. By improving the wettability, the development speed of the chromatographic liquid is increased, and rapid detection becomes possible.
  • the surfactant is not particularly limited.
  • Triton X-100 polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether is the main component
  • Tween 20 polyoxyethylene sorbitan monolate is the main component
  • Tweeen80 polyoxyethylene
  • sorbitan monooleate as a main component
  • the concentration of the surfactant is not particularly limited, but is preferably 0.01% by mass to 1.0% by mass. Preferably, it is 0.05 mass% or more and 0.5 mass% or less, More preferably, it is 0.05 mass% or more and 0.35 mass% or less, More preferably, it is 0.2 mass% or less, Preferably, it is 0.1% by mass or less.
  • the chromatographic solution contains the target nucleic acid.
  • the form of the target nucleic acid is not specifically limited as described above. It may be in the form of amplification products by various known nucleic acid amplification reactions including PCR. That is, a nucleic acid amplification step can be provided prior to the chromatography step described later.
  • a heat denaturation step (heating to about 90 ° C. to 95 ° C.) that dissociates the double strand in the chromatographic solution is not necessary. Further, when the target nucleic acid is a partial duplex having a single strand that hybridizes with the detection probe, heat denaturation can be omitted.
  • the target nucleic acid is double-stranded like the amplification product of the nucleic acid amplification reaction, it needs to be single-stranded in order to allow hybridization with the detection probe. That is, prior to the chromatography step, it is necessary to carry out a step of thermally denaturing the double strands by heating the chromatography solution containing the target nucleic acid.
  • a step of preparing a chromatography solution containing a nucleic acid amplification reaction solution containing the amplification product can be provided. That is, the nucleic acid amplification reaction solution can be used as a part of the chromatography solution, and both BSA and magnesium salt can be added to obtain a chromatography solution. By doing so, the DNA can be easily subjected to a chromatography step without separating DNA from the nucleic acid amplification reaction solution.
  • the target nucleic acid can be detected stably even when the nucleic acid amplification reaction solution is used as a part of the chromatographic solution.
  • the amplification step is performed using a first primer and a second primer.
  • the nucleic acid amplification method in the nucleic acid amplification step include various known methods for amplifying DNA using a DNA polymerase reaction such as PCR to obtain a double-stranded DNA fragment.
  • the first primer includes a tag sequence complementary to a detection probe previously associated with the target nucleic acid and a first identification sequence for identifying the first base sequence in the target nucleic acid.
  • the lengths and the like of these base sequences are not particularly limited, and are appropriately determined according to the contents of the target sequence of the target nucleic acid.
  • the first identification sequence is a sequence for amplifying the target nucleic acid by nucleic acid amplification, and can specifically hybridize with the first base sequence constituting a part of the target sequence in the target nucleic acid.
  • the first identification sequence is set complementarily to the extent that it can hybridize with the first base sequence with high selectivity. Preferably, it is set to be completely complementary (specific).
  • the tag sequence is a sequence for allowing the amplified fragment to hybridize with the detection probe, and detects the target nucleic acid. Therefore, each target nucleic acid is set so as to be hybridizable to the detection sequence of the detection probe.
  • the base sequence is complementary to the detection sequence. Therefore, one target nucleic acid is associated with one detection probe.
  • the base length of the tag sequence preferably matches the base length of the detection sequence of the detection probe, preferably 20 bases to 50 bases, more preferably 20 bases to 25 bases. It is as follows.
  • the first base sequence and the second base sequence in the target nucleic acid may have any configuration with respect to the target nucleic acid. For example, when a mutation on DNA is detected, a mutation site of one or more bases may be included in only one of the base sequences. Moreover, you may make it a variation part be included in both.
  • the first primer has such a tag sequence and a first identification sequence, has a natural base constituting such a base sequence or an artificial base homologous thereto, and a base pair with a natural nucleic acid. It has a skeleton that can be combined. Typically an oligonucleotide or a derivative thereof.
  • the ligation site is a site capable of suppressing or stopping the DNA polymerase reaction when included in the template strand.
  • the DNA polymerase reaction it is said that if there is no nucleic acid (or base) as a template, the DNA strand will not be extended any further.
  • the linking site of the present invention has a structure that cannot serve as a template during DNA elongation by DNA polymerase. That is, this linking site does not include a natural base or a derivative of a natural base (such as a natural base) that pairs with a natural base.
  • this linking site may be only a skeleton chain having no natural base or the like. That is, it may be a sugar-phosphate skeleton or a skeleton applied to other known artificial oligonucleotides.
  • the DNA polymerase includes various known DNA polymerases. Typically, DNA polymerase used for nucleic acid amplification methods, such as various PCR, is mentioned.
  • this linking site may be a chain linking group containing a single chain structure having 2 to 40 elements adjacent to the nucleotide via a phosphodiester bond. This is because if the number of elements is 1 or less, the DNA polymerase reaction is likely to be incompletely inhibited or stopped, and if the number of elements exceeds 40, the solubility of nucleotides may be reduced. Considering the effect of suppressing or stopping the DNA polymerase reaction, the chain linking group element is preferably 2 or more and 36 or less, more preferably 3 or more and 16 or less.
  • This linking site contains a single bond to facilitate rotation at the linking site, and the single bond is a carbon-carbon single bond, carbon-oxygen single bond, carbon-nitrogen single bond, SS single bond. Examples include bonding. It is preferable that this connection site is mainly composed of such a single bond. In addition, this linking site may partially contain an aromatic ring or cycloalkane as long as it contains a single bond.
  • the connecting site preferably contains an alkylene chain or a polyoxyalkylene chain which has 2 to 40 elements and may be substituted.
  • Such a chain-like connection structure is structurally simple and can be easily introduced as a connection site.
  • connection part represented by the following formula
  • equation (1) is mentioned, for example.
  • equation (1) (In the formula, 5 ′ represents an oxygen atom of a phosphodiester bond on the 5 ′ side, 3 ′ represents a phosphate atom of a phosphodiester bond on the 3 ′ side, and m represents an integer of 2 to 40. To express.)
  • m is preferably 2 or more and 36 or less, and more preferably 3 or more and 16 or less.
  • substituent of H in formula (1) include an alkyl group, an alkoxy group, and a hydroxyl group.
  • the alkyl group and alkoxy group preferably have 1 to 8 carbon atoms, more preferably 1 to 4 carbon atoms.
  • the substituents may be the same or different.
  • connection part represented by the following formula
  • equation (2) is mentioned.
  • equation (2) (In the formula, 5 ′ represents an oxygen atom of a phosphodiester bond on the 5 ′ side, 3 ′ represents a phosphate atom of a phosphodiester bond on the 3 ′ side, and n represents an integer of 2 or more and 4 or less.
  • l is an integer of 2 or more, and (n + 1) ⁇ l represents an integer of 40 or less.)
  • (n + 1) ⁇ l is preferably 2 or more and 36 or less, and more preferably 3 or more and 16 or less.
  • the same aspect as the substituent in Formula (1) is applied to the substituent of H in Formula (2).
  • linking site examples include the following chain sites.
  • linking site examples include the following chain sites.
  • a nucleic acid sequence having a three-dimensional structure that inhibits the progress of polymerase such as a strong hairpin structure or a pseudoknot structure, a target nucleic acid natural nucleic acid such as an L-type nucleic acid or an artificial nucleic acid, Non-nucleic acid structures such as RNA and fatty chains.
  • the artificial nucleic acid include peptide nucleic acid, cross-linked nucleic acid, azobenzene and the like.
  • the first primer has a first identification sequence and a tag sequence, and has a natural base constituting such a base sequence or an artificial base homologous thereto, and allows base pairing with a natural nucleic acid.
  • a main component Typically an oligonucleotide or a derivative thereof.
  • the first primer preferably has a tag sequence, a linking site, and a first identification sequence in that order from the 5 'side.
  • the 5 'end of the nucleotide base adjacent to the 3 ′ side of the ligation site derived from the first primer in the template strand or the base in the vicinity thereof is the 5 ′ end, and the tag sequence in the first primer An amplified fragment having no complementary strand is obtained (see FIGS. 1A and 1B and FIGS. 2A to 2C).
  • a sequence unrelated to the tag sequence or the first identification sequence can also be included in the vicinity of the linking site, that is, on the 3 'side and 5' side of the linking site.
  • the presence of a ligation site can reduce or avoid the influence of unintended DNA extension reaction progress or termination on the tag sequence or the first identification sequence in the extended strand. Because.
  • the second primer includes a second identification sequence that identifies the second base sequence in the target nucleic acid.
  • the lengths and the like of these base sequences are not particularly limited, and are appropriately determined according to the contents of the target sequence of the target nucleic acid.
  • the second identification sequence is a sequence for amplifying the target nucleic acid together with the first primer by nucleic acid amplification, and specifically with the second base sequence constituting the other part of the target sequence in the target nucleic acid. Can hybridize.
  • the second identification sequence is set complementarily to the extent that it can hybridize with the second base sequence with high selectivity. Preferably, it is set to be completely complementary (specific).
  • the label element binding region can be provided with a label element in advance.
  • the labeling element is for detecting a DNA double-stranded fragment bound to a detection probe on a solid phase.
  • a labeling element a conventionally known element can be appropriately selected and used. It may be various dyes such as a fluorescent substance that emits a fluorescent signal when excited by itself, or may be a substance that emits various signals in combination with the second component by an enzyme reaction or an antigen-antibody reaction.
  • fluorescent labeling elements such as Cy3, Alexa555, Cy5, Alexa647 can be used.
  • the label element binding region is provided with a label element linked to the second base sequence directly or via a suitable linker by a known method.
  • the second primer may be configured such that the labeling element binding region can bind the labeling element. That is, a labeled probe having a predetermined base sequence and having a label element and a base sequence for identifying the label binding sequence may be capable of binding. Such a labeled probe can be supplied to a DNA double-stranded fragment hybridized with a detection probe on a solid phase in the hybridization step or detection step described later, and can be labeled.
  • the second primer may not have a labeling element binding region. That is, in the amplification step, nucleic acid amplification is performed using a nucleoside triphosphate containing a nucleoside derivative triphosphate having a labeling element, whereby the amplified fragment labeled with the labeling element is introduced into the DNA extension site of the amplified fragment. Because it can be obtained.
  • the second primer has a labeling element binding region as necessary, and has a natural base constituting the base sequence of the second identification sequence or an artificial base homologous thereto. In addition, it has a skeleton that allows base pairing with natural nucleic acids. Typically an oligonucleotide or a derivative thereof.
  • the labeling element binding region and the second identification sequence may be directly linked, but preferably have a linking site between them.
  • the labeling element binding region has a base sequence that interacts with and binds to the labeling probe.
  • the linking site is as described in the first primer.
  • the second primer preferably has a labeling element binding region, a linking site, and a second identification sequence in that order from the 5 'side.
  • the base binding to the base of the nucleotide adjacent to or adjacent to the 3 ′ side of the linking site derived from the second primer in the template strand is the 5 ′ end, and the label binding region in the second primer A DNA amplified fragment having no complementary strand of (base sequence) is obtained (see FIGS. 1B and 2B).
  • a sequence unrelated to the labeling element binding region and the second identification sequence can also be included in the vicinity of the linking site, that is, on the 3 'side and 5' side of the linking site.
  • the second primer becomes a template strand, due to the presence of the ligation site, the influence of unintended DNA extension reaction progression or termination on the labeling element binding region or the second identification sequence in the extended strand is reduced or This is because it can be avoided.
  • Such primers can be synthesized according to a normal oligonucleotide synthesis method.
  • the linking site can be synthesized using a phosphoramidite reagent having an alkylene chain.
  • a reagent itself is known and can be obtained from, for example, GlenResearch.
  • the following reagents can be mentioned.
  • DMT represents a typical dimethoxytrityl group as a hydroxyl protecting group, but may be other known hydroxyl protecting groups.
  • PA represents a phosphoramidite group.
  • Nucleic acid amplification is performed using these primers.
  • various known methods can be applied to the nucleic acid amplification method, but typically, various PCRs such as PCR and multiplex PCR are used.
  • a person skilled in the art can appropriately set the solution composition, temperature control, and the like in carrying out the nucleic acid amplification step.
  • the first primer having these in the order of the tag sequence, the linking site and the first identification sequence from the 5 ′ side, and the labeling element binding region, the linking site and the second from the 5 ′ side.
  • PCR is performed on a sample that may contain a target nucleic acid using a second primer having these in the order of the identification sequences, as shown in each of (a) to (c) of FIG. 1B Due to the DNA extension reaction of DNA polymerase, a template strand containing the primer is formed from the first primer and the second primer.
  • the DNA extension reaction is again performed by the DNA polymerase using the second primer and the first primer which are different from the primers from which the template strands are derived.
  • the DNA elongation reaction of the DNA polymerase with respect to the template strand starting from the second primer and containing the first primer is performed by the first primer in the template strand.
  • DNA elongation is suppressed or stopped.
  • the DNA extension reaction of the DNA polymerase to the template strand starting from the first primer and containing the second primer is derived from the second primer in the template strand.
  • the DNA elongation is suppressed or stopped.
  • the resulting amplified fragment comprises a single-stranded tag sequence protruding from the 5 ′ end and a labeling element binding region, respectively.
  • the first identification sequence and the second identification sequence Becomes a double-stranded DNA fragment comprising a double strand. That is, in the heavy chain fragment of this DNA, the tag sequence protrudes into a single strand on the 5 ′ side of one DNA strand, and the labeling element binding region protrudes on the 5 ′ side of the other DNA strand. Yes.
  • the labeling element When the second primer to be used has a labeling element binding region to which a labeling element is bound in advance as shown in FIG. 2A, the labeling element is attached to the 5 ′ end of one DNA strand as shown in FIG. 2A. It has a tag sequence protruding on the 5 ′ side of one DNA strand, and in the first and second identification sequences, it becomes a DNA double-stranded fragment comprising a double strand.
  • a labeling element is provided at the DNA chain extension site, a tag sequence is protruded on the 5 ′ side of one of the DNA strands, and the first and second identification sequences are double-stranded.
  • a DNA double-stranded fragment comprising
  • water-soluble polymers such as BSA and magnesium salts may be contained in the nucleic acid amplification reaction solution.
  • a water-soluble polymer such as BSA or a magnesium salt contained in a nucleic acid amplification reagent or a nucleic acid amplification reaction solution may satisfy a part of the water-soluble polymer and magnesium salt in a chromatography solution.
  • the content of the water-soluble polymer and the magnesium salt is prepared to obtain the composition of the liquid for chromatography.
  • the target nucleic acid may be previously labeled with a labeling element described later.
  • the labeling element may be directly incorporated in a nucleic acid amplification reaction or by an enzymatic reaction. Otherwise, a labeling step for forming a hybrid product between a target nucleic acid such as an amplification product and a labeling probe that can hybridize with the target nucleic acid and is labeled with a labeling element may be performed separately.
  • an unlabeled target nucleic acid may be formed in a chromatography solution as described below to form a hybridized product.
  • the chromatography solution can further contain a labeling element for identifying the target nucleic acid.
  • a labeling element By including a labeling element in the chromatography liquid, it is not necessary to label the target nucleic acid in the chromatography body after supplying the chromatography liquid containing the target nucleic acid to the chromatography body. It is not necessary to form a composite part for forming a complex with the element.
  • an operation of adding a labeling element to the amplification product can be omitted.
  • a “labeling element” is a substance that makes it possible to distinguish a substance or molecule to be detected from others.
  • the labeling element is not particularly limited, but typically, fluorescence, radioactivity, enzyme (eg, peroxidase, alkaline phosphatase, etc.), hapten (eg, digoxigenin, DIG, etc.), phosphorescence, chemiluminescence, coloring, etc. are utilized.
  • a labeling element is a substance that makes it possible to distinguish a substance or molecule to be detected from others.
  • the labeling element is not particularly limited, but typically, fluorescence, radioactivity, enzyme (eg, peroxidase, alkaline phosphatase, etc.), hapten (eg, digoxigenin, DIG, etc.), phosphorescence, chemiluminescence, coloring, etc. are utilized.
  • a labeling element is utilized.
  • the labeling elements in this specification also include molecules or substances that can bind them so that they can be finally
  • the labeling element is preferably a luminescent substance or a coloring substance that presents luminescence or coloring that can be detected visually (with the naked eye). That is, it is preferable that the substance itself is a substance that can generate a signal that allows the naked eye to visually recognize the target nucleic acid without requiring other components.
  • Such materials typically include various colorants such as various pigments and dyes.
  • various metals or alloys such as copper, or organic compounds containing the metal (may be complex compounds) may be used.
  • inorganic compounds such as mica, which are similar to the colorant, can be used.
  • Such labeling elements typically include various dyes, various pigments, luminol, isoluminol, acridinium compounds, olefins, enol ethers, enamines, aryl vinyl ethers, dioxene, aryl imidazoles, lucigenin, luciferin and eclion.
  • a chemiluminescent substance is mentioned.
  • particles such as latex particles that are labeled with such labeling elements.
  • colloids or sols including gold colloids or sols or silver colloids or sols can be mentioned.
  • a metal particle, an inorganic particle, etc. are mentioned.
  • the average particle diameter of latex particles or the like constituting a part of the labeling element is not particularly limited, but is, for example, 20 nm to 20 ⁇ m, typically 40 nm to 10 ⁇ m, preferably 0.1 ⁇ m to 10 ⁇ m, particularly
  • the average particle diameter is preferably 0.1 ⁇ m or more and 5 ⁇ m or less, more preferably 0.15 ⁇ m or more and 2 ⁇ m or less.
  • Preferred particles are particles that can be suspended in an aqueous solution and consist of a water-insoluble polymeric material.
  • polyethylene, polystyrene, styrene-styrene sulfonate copolymer, acrylic acid polymer, methacrylic acid polymer, acrylonitrile polymer, acrylonitrile-butadiene-styrene, polyvinyl acetate-acrylate, polyvinylpyrrolidone, or vinyl chloride-acrylate may be mentioned.
  • Such a labeling element is commercially available, and the labeling element production and the method of labeling the label on the particle are also known, and those skilled in the art can appropriately obtain the labeling element using a known technique. Furthermore, the labeling element or the particle labeled with the labeling element and an oligonucleotide such as DNA can be appropriately bound via a functional group such as an amino group, which is well known in the art.
  • the labeling element contained in the chromatography liquid can take, for example, the following forms. It is in the form of a labeling probe that can hybridize with a target nucleic acid and has a labeling element.
  • the labeling probe can include, for example, a labeling sequence that hybridizes with a part of the amplification product (labeling tag sequence) that is a target nucleic acid, and a labeling element.
  • labeling tag sequence a part of the amplification product
  • the labeling sequence has complementarity to such an extent that it can specifically hybridize with the tagging tag sequence, and is preferably completely complementary.
  • the length of the base sequence of the labeling sequence is not particularly limited, and is appropriately determined according to the content of the target sequence of the target nucleic acid, its Tm related to hybridization, and the like.
  • a preferred labeling element possessed by the labeling probe is a labeling element that develops or emits light with the naked eye in the probe region, and more preferably one or two selected from gold colloid particles, silver colloid particles, and colored latex particles. More than a seed.
  • the target nucleic acid can be detected in situ without using a fluorescence measuring device.
  • the present chromatographic solution contains a water-soluble polymer, stable detection sensitivity can be obtained when such particles are used.
  • the embodiment of the nucleic acid chromatography is not particularly limited. It may be intended to be deployed in a substantially horizontal state. In this case, typically, chromatography is carried out by dropping a certain amount of chromatography liquid into a specific chromatography liquid supply section. Further, the form of chromatography may be intended for development in a substantially vertical direction. In this case, typically, the chromatography main body is supported in a substantially vertical direction, and the lower end portion of the main body is immersed in a chromatography solution to perform chromatography.
  • the chromatography liquid By supplying the chromatography liquid to the chromatography main body according to the form of chromatography, the chromatography liquid is diffused through the solid phase carrier and developed into the probe region by the capillary phenomenon.
  • the labeling element is not supplied to the target nucleic acid, the target nucleic acid is combined with the labeling element prepared in advance in the complexing portion upstream of the probe region to form a complex with the labeling element to form the probe region. It is expanded to.
  • the target nucleic acid hybridizes with the detection probe to form a hybridized product. Thereby, it will be in the state which can present the signal which can identify a target nucleic acid according to the kind of labeling element with which a target nucleic acid is equipped.
  • the target nucleic acid can be highly detected in the probe region and the detection of the target nucleic acid can be stabilized. At the same time, high sensitivity can be achieved and rapid detection is possible. For example, by including a water-soluble polymer and a magnesium salt, the target nucleic acid can be detected even in about 5 minutes.
  • the conditions in the chromatography step are not particularly limited. Preferably they are 15 degreeC or more and 35 degrees C or less.
  • a chromatography liquid of about 10 ⁇ l or more and 60 ⁇ l or less is a sheet-like chromatography having a width (2.0 mm or more and 8.0 mm or less) and a length (or height) of 20 mm or more and 100 mm or less. Penetration into a part of the main body (lower end or supply part) and start chromatography. The development time for the chromatographic solution to pass through the probe region is approximately 2 to 50 minutes.
  • the detection step is a step of detecting the final hybridized product based on the labeling element. More specifically, it is a step of confirming the coloring and position of the immobilization region where the detection probe is immobilized. In order to detect the signal by the labeling element, it is appropriately selected according to the type of the labeling element. When a specific binding reaction or a color reaction with an enzyme is required, such an operation is appropriately performed. In this chromatography method, it is preferable to carry out the detection step as it is without washing the solid phase carrier.
  • the labeling element is a labeling element that presents color development or luminescence that can be detected with the naked eye, such as latex particles, colloidal gold particles, or silver colloidal particles, the presence of the target nucleic acid and its amount (color intensity) immediately with the naked eye. Etc.) can be detected. For this reason, further rapid detection is possible.
  • composition and kit for nucleic acid chromatography The composition disclosed herein is one or two selected from the group consisting of albumin, casein, skim milk, globulin, gelatin, heparin, polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, dextran, polyvinyl alcohol, carboxymethyl cellulose and polymaleimide. It is a composition containing at least one kind of water-soluble polymer, for preparing a chromatographic solution for use in nucleic acid chromatography.
  • the chromatographic composition may have a composition corresponding to the final concentration of the chromatographic liquid in advance (first aspect).
  • the chromatography composition is a powder that is soluble at the time of use in a composition that can be prepared by dissolving in a buffer solution that may contain a part of the components of water or chromatography liquid at the time of use. Or it may be a solid (second embodiment).
  • the chromatographic composition may be in the form of a high-concentration liquid (stock solution) that can be diluted with water or a buffer to prepare the chromatographic liquid (third aspect).
  • a kit comprising the present composition and an aqueous medium for dilution of water or a buffer solution can be constituted.
  • the chromatographic composition may be in the form of a stock solution having a composition capable of preparing the chromatographic liquid by mixing with a predetermined amount of the amplification reaction liquid of the PCR amplification reaction (fourth aspect).
  • a kit comprising the present composition, an aqueous medium for dilution such as water or a buffer, and an amplification reaction reagent can be configured.
  • any of the above-described chromatographic compositions may be a kit provided with either or both of the chromatography main body described above and various types of labeling elements.
  • the concentration of the water-soluble polymer in the chromatographic composition of the third aspect can be, for example, 0.2% by mass or more and 6.0% by mass in consideration of the concentration of the water-soluble polymer in the chromatographic solution. .
  • concentration of the magnesium salt in this composition for chromatography shall be 1.0 mM or more and 20.0 mM or less.
  • the concentration of the surfactant in the chromatographic composition is preferably 0.1% by mass or more and 0.5% by mass or less. This is because it is convenient to dilute 1.4 to 2.0 times.
  • the concentration of the water-soluble polymer in the chromatographic composition of the fourth aspect can be 0.1% by mass or more and 5.0% by mass.
  • concentration of the magnesium salt in this composition for chromatography shall be 0.5 mM or more and 16.0 mM or less.
  • concentration of surfactant in this composition for chromatography shall be 0.1 to 0.5 mass%. This is because it is convenient to dilute the nucleic acid amplification reaction solution by 1.4 to 2.0 times.
  • the water-soluble polymer concentration and the magnesium salt concentration are appropriately adjusted according to the concentration of the water-soluble polymer such as BSA of the amplification reagent used and the concentration of the magnesium salt.
  • PCR amplification was performed on human normal tissue genomic DNA using a commercially available PCR amplification reagent using a primer set for obtaining partial double-stranded DNA. Then, it used for the nucleic acid chromatography.
  • the experimental materials and methods were as follows. In addition, according to this primer set, partial double-stranded DNA in which the 5 ′ end of each double-stranded strand is a single strand is obtained. For this reason, this target nucleic acid was subjected to nucleic acid chromatography without performing a heat denaturation step.
  • Probes (probes 1, 2, 10, 14, 36, 77, 89, and 94) having three bases and eight kinds of base sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, 10, 14, 36, 77, 89, and 94 are Spotting was performed using a GENISHOT (registered trademark) spotter, and a total of eight band-shaped probe regions were formed. In addition, poly T probes were spotted further downstream. Probe 1 targets the amplification product obtained in (3).
  • PCR amplification reagents and reaction conditions were as follows.
  • PCR amplification reagent Nippon Genetics_KAPA2G Fast HotStart PCR Kit (Cat.No.KK5502) PCR reaction conditions Reaction conditions: 95 ° C., 3 minutes [95 ° C., 15 seconds, 68 ° C., 2 minutes] ⁇ 40 cycles Composition of PCR reaction solution:
  • the concentration of magnesium salt derived from the PCR amplification product was 0.9 mM. Further, the BSA concentrations of the chromatographic liquids 1 to 4 were 0%, 0.35%, 0.7%, and 2.1%, respectively. The results are shown in FIG.
  • Synthetic oligo DNA (complementary oligo): Synthetic product synthetic oligo DNA information (sequence) Complementary oligo DNA (Probe.No.1): 5 '-(TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTTCTCTGACCAATGAATCTGC) -3' (SEQ ID NO: 103)
  • Chromatographic liquids 1 to 3 were prepared according to the following table.
  • the developing solution 4 is 0.1% Tween 80-3.0% BSA-phosphate buffer, and the salts 1 to 3 are 25 mM sodium chloride (salt 1), 25 mM potassium chloride (salt 2) and 25 mM magnesium chloride (salt 3). did.
  • the final concentration of each salt was 3 mM.
  • the final concentration of the synthetic oligo DNA was 100 nM and the BSA was 2.1%. The results are shown in FIG.
  • the magnesium salt (salt 3) was used, a blue band could be confirmed in the probe region of the probe 1 after 5 minutes.
  • sodium salt (salt 1) and potassium salt (salt 2) were used a blue band could be confirmed only after 20 minutes.
  • salt 3 the color development of the blue band reached a maximum after 20 minutes.
  • the magnesium salt can effectively accumulate the target nucleic acid in the probe region in the presence of a water-soluble polymer such as BSA. It was found that it contributes to confirming.
  • Chromatographic liquids were prepared according to the following table.
  • the developing solution 4 is 0.1% Tween 80-3.0% BSA-phosphate buffer, and the salt is 25 mM magnesium chloride (salt 3), and the final concentration of magnesium chloride is 0 mM, 1 mM, 3 mM, and 4.5 mM. It was prepared as follows. The final concentration of synthetic oligo DNA was 100 nM and BSA was 2.1%. The results are shown in FIG.
  • the magnesium salt concentration derived from the PCR amplification product was 0.6 mM.
  • the magnesium chloride concentrations derived from the developing solution are 3.5 mM, 7.7 mM, and 16.1 mM, and the total magnesium chloride concentration in the chromatography solutions 1 to 4 is 0.6 mM, 4.1 mM, 8 3 mM and 16.7 mM.
  • Each BSA concentration of the chromatography liquids 1 to 4 was 2.1%. The results are shown in FIG.
  • Example 4 As shown in FIG. 9, as in Example 4, as the magnesium salt concentration increased, it became possible to detect with high sensitivity and speed. That is, when the magnesium concentrations were 4.1 mM and 8.3 mM, a clear blue band could be confirmed after 5 minutes from the start of development. At 0.6 mM, a thin blue band was finally confirmed after 20 minutes. On the other hand, when the concentration was 16.7 mM, the intended band also strongly developed blue, but after 30 minutes, cross-hybridization occurred, and even the unintended band developed blue.
  • magnesium chloride is present in the presence of water-soluble polymer such as BSA even if the target nucleic acid that is an amplification product, such as PCR amplification reaction solution, as well as enzymes such as DNA polymerase, primers, and nucleotides remain. It has been found that the inclusion of the compound promotes the accumulation of the target nucleic acid and the detection probe without inhibiting the hybridization to the detection probe. Moreover, when cross hybridization was considered, it turned out that it is preferable that a magnesium salt concentration is lower than 16.7 mM.
  • the magnesium salt concentration derived from the PCR amplification product was 0.9 mM.
  • the magnesium chloride concentrations derived from the developing solution are 3.5 mM, 7.7 mM, and 16.1 mM, and the total magnesium chloride concentration in the chromatographic solutions 1 to 3 is 0.9 mM, 4.4 mM, 8 .6 mM and 17.0 mM.
  • Each BSA concentration of the chromatography liquids 1 to 4 was 2.1%. The results are shown in FIG.
  • magnesium chloride is present in the presence of water-soluble polymer such as BSA even if the target nucleic acid that is an amplification product, such as PCR amplification reaction solution, as well as enzymes such as DNA polymerase, primers, and nucleotides remain. It has been found that the inclusion of the compound promotes the accumulation of the target nucleic acid and the detection probe without inhibiting the hybridization to the detection probe. It was also found that application of a water-soluble polymer such as BSA and magnesium chloride was effective for different PCR amplification reaction solutions.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

安定した検出状態を得ることができる核酸クロマトグラフィー法、核酸クロマトグラフィー用組成物及びキットを提供する。この目的のため、本開示は、核酸クロマトグラフィー方法において、標的核酸を含有するクロマトグラフィー用液を、前記標的核酸を捕捉可能な検出用プローブが固定化された固相担体に供給してクロマトグラフィーを実施する工程、を備えるようにし、前記クロマトグラフィー用液は、１種又は２種以上の水溶性ポリマーを含有するようにする。

Description

核酸クロマトグラフィー法、核酸クロマトグラフィー用組成物及びこれを含むキット
　本願は、２０１２年７月５日出願の日本国特許出願特願２０１２－１５１７５５に基づく優先権を主張するものであり、その全内容は参照により本明細書に組み込まれるものとする。本明細書は、核酸クロマトグラフィー法、核酸クロマトグラフィー用組成物及びこれを含むキットに関する。
　各種の生体由来の標的核酸を検出するための方法として、いわゆる核酸クロマトグラフィー法がある。核酸クロマトグラフィー法は、標的核酸を含む液体を、その液体がキャピラリー現象により拡散する多孔質性の固相担体上を展開させて、固相担体上の特定の領域に予め固定した検出用プローブとのハイブリダイズ産物を形成させる。ハイブリダイズ産物の検出は、展開に先だってあるいは展開の際に、標的核酸に対して付与したシグナル要素に基づいている。すなわち、特定した領域におけるシグナル要素あるいは当該シグナル要素に基づく二次的シグナルを検出する。
国際公開第2009/034842号パンフレット 国際公開第2012/034842号パンフレット
　核酸クロマトグラフィー法では、展開開始後１０～１５分程度の反応時間が必要である。また、クロマトグラフィーに供される標的核酸等の量は核酸増幅反応等により変動する場合もある。標的核酸等の量が少ない場合には、十分な検出感度が得られない場合もある。
　本明細書は、安定した検出状態を得ることができる核酸クロマトグラフィー法、核酸クロマトグラフィー用組成物及びキットを提供する。
　本発明者らは、より実用的な標的核酸の検出方法、すなわち、より安定して標的核酸を検出できる核酸クロマトグラフィーについて種々検討した。その結果、核酸クロマトグラフィーに供する液体中に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの標的核酸の検出に関わらない水溶性ポリマーが含まれていることで、標的核酸の検出感度が向上することがわかった。本明細書は、こうした知見に基づき以下の手段を提供する。
（１）　核酸クロマトグラフィー方法であって、
　標的核酸を含有するクロマトグラフィー用液を、前記標的核酸を捕捉可能な検出用プローブが固定化された固相担体に供給してクロマトグラフィーを実施する工程、
を備え、
　前記クロマトグラフィー用液は、アルブミン、カゼイン、スキムミルク、グロブリン、ゼラチン、ヘパリン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、デキストラン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース及びポリマレイミドからなる群から選択される１種又は２種以上の水溶性ポリマーを含有する、方法。
（２）　前記水溶性ポリマーは、アルブミンを含む、（１）に記載の方法。
（３）　前記クロマトグラフィー用液における前記水溶性ポリマーの濃度は、３．５質量％以下である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）　前記クロマトグラフィー用液は、さらに、マグネシウム塩を含む、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）　前記マグネシウム塩は、塩化マグネシウムを含む、（４）に記載の方法。
（６）　前記マグネシウム塩の濃度は、０．５ｍＭ以上１０．０ｍＭ以下である、（４）又は（５）に記載の方法。
（７）　前記クロマトグラフィー用液は、さらに、界面活性剤を含む、（１）～（６）のいずれかに記載の方法。
（８）　前記クロマトグラフィー用液は、さらに、前記標的核酸を識別するための標識要素を含む、（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）　前記標識要素は、着色された粒子である、（８）に記載の方法。
（１０）　前記クロマトグラフィー工程に先立って、前記標的核酸を増幅産物として含有する核酸増幅反応液を含む前記クロマトグラフィー用液を調製する工程を備える、（１）～（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）　前記マグネシウム塩の少なくとも一部を、前記核酸増幅反応液中のマグネシウム塩が充足する、（４）～（６）のいずれかに記載の方法。
（１２）　核酸クロマトグラフィー用組成物であって、
　アルブミン、カゼイン、スキムミルク、グロブリン、ゼラチン、ヘパリン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、デキストラン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース及びポリマレイミドからなる群から選択される１種又は２種以上の水溶性ポリマーを含有する、組成物。
（１３）　前記水溶性ポリマーは、アルブミンを含む、（１２）に記載の組成物。
（１４）　前記水溶性ポリマーの終濃度が３．５％以下となるように前記水溶性ポリマーを含有する、（１２）又は（１３）に記載の組成物。
（１５）　さらに、マグネシウム塩を含む、（１２）～（１４）のいずれかに記載の組成物。
（１６）　前記マグネシウム塩は、塩化マグネシウムを含む、（１５）に記載の組成物。
（１７）　前記マグネシウム塩の終濃度が０．５ｍＭ以上１０．０ｍＭ以下となるように、前記マグネシウム塩を含有する、（１２）～（１６）のいずれかに記載の組成物。
（１８）　さらに、界面活性剤を含む、（１２）～（１７）のいずれかに記載の組成物。
（１９）　標的核酸に対応する増幅産物を含む核酸増幅反応液に添加するための、（１２）～（１８）のいずれかに記載の組成物。
（２０）　核酸クロマトグラフィー用キットであって、
　アルブミン、カゼイン、スキムミルク、グロブリン、ゼラチン、ヘパリン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、デキストラン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース及びポリマレイミドからなる群から選択される１種又は２種以上の水溶性ポリマーを含有する、核酸クロマトグラフィー用組成物、
を備える、キット。
（２１）　前記核酸クロマトグラフィー用組成物は、さらに、マグネシウム塩を含む、（２０）に記載のキット。
本発明の検出方法における増幅工程の一例の概要を模式的に示す図である。 本発明の検出方法における増幅工程の他の一例の概要を模式的に示す図である。 本発明の検出方法のフローの一例を示す図である。 本発明の検出方法のフローの他の一例を示す図である。 本発明の検出方法のフローの他の一例を示す図である。 実施例で用いたクロマトグラフィー本体を示す図である。 図３に示すクロマトグラフィー本体を用いた核酸クロマトグラフィーの実施状態を示す図である。 実施例１での核酸クロマトグラフィー結果を示す図である。 実施例２での核酸クロマトグラフィー結果を示す図である。 実施例３での核酸クロマトグラフィー結果を示す図である。 実施例４での核酸クロマトグラフィー結果を示す図である。 実施例５での核酸クロマトグラフィー結果を示す図である。 実施例６での核酸クロマトグラフィー結果を示す図である。
　本明細書は、核酸クロマトグラフィー法、核酸クロマトグラフィー用組成物及び核酸クロマトグラフィー用キットを提供する。本明細書に開示される核酸クロマトグラフィー法は、標的核酸を含む核酸クロマトグラフィー用液中に、所定の水溶性ポリマーを１種又は２種以上含む。本明細書に開示される組成物は、核酸クロマトグラフィー用液を調製するための組成物であり、所定の水溶性ポリマーを１種又は２種以上含む。また、本明細書に開示されるキットは、本組成物を備えている。本明細書に開示される核酸クロマトグラフィー法、本組成物及び本キットは、核酸クロマトグラフィーに供する液体に所定の水溶性ポリマーを１種又は２種以上含むようするため、良好な検出感度で標的核酸を検出することができる。このため、例えば、標的核酸の量が変動しても安定して標的核酸を検出できる。また、検出感度が良好であるため、迅速に標的核酸を検出できる。その理由は必ずしも明らかではないが、プローブ領域における標的核酸の集積度を高めることができるものによると推論される。
　本明細書において、標的核酸は、特に限定されないでその存在及び／又は量を検出するべき任意の核酸である。標的核酸は、天然のあるいは人工的に合成されたものであってもよい。天然の標的核酸としては、例えば、体質、遺伝病、癌などの特定疾患についての発症、疾患診断、治療予後、薬剤や治療の選択などのヒト、非ヒト動物などの生物における遺伝子上の指標となる塩基あるいは塩基配列を含んでいる。典型的には、ＳＮＰなどの多型や先天的又は後天的変異が挙げられる。また、病原菌やウイルスなどの微生物由来の塩基配列も標的核酸が有する塩基配列として挙げられる。また、合成の標的核酸としては、人為的になんらかの識別のために合成された核酸が挙げられる。また、ある種の天然あるいは人工の核酸に対して核酸増幅反応を行って得られる増幅産物が挙げられる。
　本明細書において、標的核酸の採取源は特に限定されないが、標的核酸が含まれうる試料としては、各種の生体由来の試料（血液、尿、痰、組織、細胞（各種の動物由来の培養動物細胞、培養植物細胞、培養微生物細胞を含む））あるいは、こうした生体試料からＤＮＡを抽出したＤＮＡ抽出試料等が挙げられる。
　本明細書において、核酸は、ヌクレオチドの重合体を意味しており、その数は特に限定しない。したがって、標的核酸には、数十程度のヌクレオチドが連結したオリゴヌクレオチドが包含され、さらに長いポリヌクレオチドも包含される。標的核酸は、ＤＮＡ１本鎖若しくは二本鎖のほか、ＲＮＡ一本鎖若しくは二本鎖、さらには、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラなども包含される。また、核酸は、天然の塩基、ヌクレオチド及びヌクレオシドからなるもののほか、非天然の塩基、ヌクレオチド、ヌクレオシドを一部に含むものであってもよい。
　また、各二本鎖の場合には、少なくともいずれかの端部に一本鎖部分を有する部分二本鎖構造であってもよい。部分二本鎖構造であると、当該一本鎖部分において検出用プローブとハイブリダイズ可能であるため、完全な二本鎖に必要な熱変性工程を省略できる。こうした部分二本鎖構造としては、例えば、二本鎖の一方の鎖の片端（５’末端又は３’末端）が二重鎖部分から突出する一本鎖を有し、他方の鎖の片端（３’末端又は５’末端）に同様に一本鎖を有する構造であってもよい。また、二本鎖の一方の鎖の両端（５’末端及び３’末端）がそれぞれ対合鎖より突出する一本鎖を有する構造であってもよい。
　こうした部分二本鎖構造は、特許文献２のほか、国際公開第２００６／０９５５５０号パンフレット、特開平５－２５２９９８号公報等に開示されるような、核酸増幅反応の増幅産物が挙げられる。これらの増幅産物は、それぞれ、天然ＤＮＡからなる突出末端を各鎖の５’末端に有する部分二本鎖構造を有するＤＮＡ二本鎖、アプタマーである天然ＤＮＡからなる突出末端を一方の鎖の５’末端に有する部分二本鎖構造を有するＤＮＡ二本鎖、非天然ＤＮＡからなる突出末端を一方の鎖の５’末端に有する部分二重鎖構造となっている。
　この種のＤＮＡ二本鎖は、第1の鎖の一本鎖部分に対応する第１のタグ鎖を５’末端に有し、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制する連結部位を介して標的核酸にハイブリダイズ可能な第１の識別配列を有する第１のプライマーと、第１の鎖に対合する第２の鎖の一本鎖部分に対応する第２のタグ鎖を５’末端に有し、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位を介して標的核酸にハイブリダイズ可能な第１の識別配列を有する第２のプライマーと、を含むプライマーセットを用いて、標的核酸を含む試料に対して核酸増幅反応を実施することによっても得られる。こうした連結部位を含むプライマーによる核酸増幅については後述する。
　以下では、本明細書の開示の代表的かつ非限定的な具体例について、図面を参照して詳細に説明する。この詳細な説明は、本明細書の開示の好ましい例を実施するための詳細を当業者に示すことを単純に意図しており、本明細書の開示の範囲を限定することを意図したものではない。また、以下に開示される追加的な特徴ならびに開示は、さらに改善された標的核酸の検出方法等を提供するために、他の特徴や発明とは別に、又は共に用いることができる。
　また、以下の詳細な説明で開示される特徴や工程の組み合わせは、最も広い意味において本明細書の開示を実施する際に必須のものではなく、特に本明細書の開示の代表的な具体例を説明するためにのみ記載されるものである。さらに、上記及び下記の代表的な具体例の様々な特徴、ならびに、独立及び従属クレームに記載されるものの様々な特徴は、本明細書の開示の追加的かつ有用な実施形態を提供するにあたって、ここに記載される具体例のとおりに、あるいは列挙された順番のとおりに組合せなければならないものではない。
　本明細書及び／又はクレームに記載された全ての特徴は、実施例及び／又はクレームに記載された特徴の構成とは別に、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、個別に、かつ互いに独立して開示されることを意図するものである。さらに、全ての数値範囲及びグループ又は集団に関する記載は、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、それらの中間の構成を開示する意図を持ってなされている。
　以下、本発明の実施形態について説明する。
（核酸クロマトグラフィー法）
　本核酸クロマトグラフィー法（以下、単にクロマトグラフィー法という。）は、標的核酸を含有する核酸クロマトグラフィー用液(以下、単に、クロマトグラフィー用液という。）を、標的核酸を捕捉可能な検出用プローブが固定化された固相担体に供給してクロマトグラフィーを実施する工程、を備えている。以下、核酸クロマトグラフィーを実施するためのクロマトグラフィー本体及びクロマトグラフィー用液について説明し、その後、クロマトグラフィー工程について説明する。
（クロマトグラフィー本体）
　クロマトグラフィー本体は、固相担体と、固相担体に固定化された１種又は２種以上の検出用プローブとを備えている。固相担体は、特に限定されないで従来公知のものを採用できる。例えば、固相担体としては、例えば、ポリエーテルスルホン、ニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビニリデンなどのポリマーを主体としたいわゆる多孔質性の材料が挙げられる。また、ろ紙などのセルロース系材料も好ましく用いることができる。クロマトグラフィー用本体の形態は特に問わない。シート状や細い棒状など、キャピラリー現象によるクロマトグラフィー用液の展開拡散が可能な形態であればよい。
　検出用プローブは、標的核酸を捕捉可能に標的核酸の少なくとも一部とハイブリダイズ可能な検出用配列を含んでいる。検出用配列は、好ましくは、標的核酸中の前記一部と相補的である。検出用プローブが有する検出用配列は、標的核酸の少なくとも一部と特異的なハイブリダイズが可能な程度に相補的な塩基配列を有している。好ましくは完全に相補的な塩基配列を有している。
　このような検出用配列は、標的核酸に特徴的な配列に相補的に設定することができるが、標的配列とは無関係に設定することもできる。標的配列と無関係に設定することで、検出用プローブの検出用配列を、複数の検出用プローブ間での非特異的結合を抑制又は回避できるように、かつ、ハイブリダイゼーションに好適な温度及び時間等のハイブリダイゼーション条件を考慮して設定することができる。また、標的核酸の種類にかかわらず、いつも同じ検出用プローブを用いることができるようになる。なお、この場合には、標的核酸にこうした検出用プローブがハイブリダイズ可能な塩基配列が含まれるようにする。典型的には、ＰＣＲなどの核酸増幅反応のプライマーが、こうした塩基配列を含むように設計する。
　検出用配列の長さは、特に限定しないが、例えば、２０塩基以上５０塩基以下程度とすることができる。この範囲であると、一般的に各検出用配列の特異性を確保しつつハイブリダイゼーション効率も確保できるからである。例えば、こうした塩基長の検出用配列は、後述する配列番号１～１００及びその相補配列から選択される各２３塩基長の塩基配列を２つ組み合わせた４６塩基長の配列や、当該組み合わせた塩基配列に対して適宜塩基を付加、欠失などすることにより得ることができる。より好ましくは、２０塩基以上２５塩基以下である。例えば、こうした塩基長の検出用配列は、配列番号１～１００の各２３塩基長の塩基配列及びその相補配列又はこれらの塩基配列に対して適宜塩基を付加、欠失などすることにより得ることができる。なお、第１のプライマーにおけるタグ配列は、検出用配列と対合する塩基配列であるため、タグ配列の塩基長は、検出用配列と同様、２０塩基以上５０塩基以下であることが好ましく、より好ましくは、２０塩基以上２５塩基以下である。
　１種又は２種以上の検出用プローブを単一の固相担体に固定化することができる。固定化形態は特に限定されない。公知の固定化方法が用いられる。例えば、検出用プローブと固相単体表面との静電的相互作用のほか、固相担体の材料内の官能基（予め存在する官能基のほか、固定化のために付与した官能基を含む）との検出用プローブ内官能基との共有結合等によりことができる。
　検出用プローブが固定化される固相担体上の領域（プローブ領域）は、任意のパターンで形成される。任意の形態を有する、ドット状であってもよいし、ストリーク状であってもよいし、その他の形態であってもよい。プローブ領域は、典型的には、クロマトグラフィー用液の展開方向と直交するようなストレーナーリーク状の形態で、展開方向に沿って複数個一定間隔で備えられている。好ましくは１つのプローブ領域が１種の検出用プローブに対応されている。
　クロマトグラフィー本体は、このほか、例えば、公知の部位を備えることができる。クロマトグラフィー用液が供給される供給部をプローブ領域の上流側に備えていてもよい。また、供給された標的核酸に対して標識要素を複合化させるための複合化部をプローブ領域の上流側であって供給部と同一あるいはそれよりも下流側に備えていてもよい。さらに、プローブ領域を視認しやすいように当該領域を明示する検出窓や着色されたマーカーを備えていてもよい。さらにまた、展開終了後の液体を回収するための吸水部をプローブ領域の下流側に備えていてもよい。
　また、固相担体には、検出用プローブを固定化したプローブ領域の他、クロマトグラフィー用液が十分に展開したことを示すためのマーカー部位等を備えることができる。これらの部位は、いずれも、プローブ領域と同様、それ自体がクロマトグラフィー用液の展開が可能な多孔質体で形成され、同時に、各部位におけるクロマトグラフィー用液の連続的な展開を妨げないように構成されている。例えば、１つの固相担体上にこうした複数の部が備えられる。なお、標識要素については後述する。
（クロマトグラフィー用液）
　クロマトグラフィー用液は、クロマトグラフィー本体の固相担体をキャピラリー現象により拡散移動する液体であり、標的核酸に固相担体を移動させるための媒体である。本明細書においては、クロマトグラフィー用液というとき、クロマトグラフィー本体に適用する際の組成及び状態を有するものである。なお、後述するクロマトグラフィー用組成物は、こうしたクロマトグラフィー用液を調製するための組成物である。
　本明細書に開示されるクロマトグラフィー用液の液体成分は、水性媒体である。水性媒体は、特に限定しないが、例えば、水、水と相溶する有機溶媒、又は水と１種又は２種以上の前記有機溶媒の混液が挙げられる。水と相溶する有機溶媒は、当業者において周知であるが、例えば、炭素数１～４程度の低級アルコール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類、アセトン等が挙げられる。
　クロマトグラフィー用液は、当該用液のｐＨを一定範囲にするための成分を含むことができる。好ましい標的核酸の解離状態、安定性及び展開環境を確保するためのｐＨ範囲を確保するためである。緩衝塩は、意図するｐＨにもよるが通常は、６．０以上８．０以下の範囲である。より好ましくは、７．０以上８．０以下である。こうしたｐＨを得るための成分は、例えば、酢酸と酢酸ナトリウム（酢酸緩衝液）、クエン酸とクエン酸ナトリウム（クエン酸緩衝液）、リン酸とリン酸ナトリウム（リン酸緩衝液）等である。さらに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等が挙げられる。
　クロマトグラフィー用液は、水溶性ポリマーを含有している。ここで水溶性ポリマーとは、標的核酸以外であって、標的核酸と検出用プローブとの特異的ハイブリダイズを阻害しない、水溶性ポリマーを意味している。こうした水溶性ポリマーとしては、標的核酸及び検出用プローブと無関係な塩基配列を有しているか又は異質な天然又は合成の水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーをクロマトグラフィー用液に含有することで、プローブ領域における標的核酸の集積度を高めて標的核酸の検出感度を向上し安定化させることができる。また、検出の迅速化も促進することができる。
　こうした水溶性ポリマーとしては、例えば、アルブミン、カゼイン、スキムミルク、グロブリン、ゼラチン（ウシやブタなど哺乳動物ゼラチン、魚類ゼラチン）、ヘパリン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、デキストラン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース及びポリマレイミドが挙げられる。これらの水溶性ポリマーは、通常、標的核酸及び検出用プローブと異質であるからである。これらはそれぞれ単独でも用いることができるほか、２種類以上を組み合わせてもよい。
　水溶性ポリマーとしては、なかでも、アルブミン、カゼイン、スキムミルクが好ましい。より好ましくはアルブミンである。アルブミンとしては、ウシ、ブタ、ヤギ、モルモット、ウサギ、ウシ、ヒト、イヌ、ラット、ネコ、マウス、サル、ロバ、ハムスター、ウマ、ニワトリ及び、七面鳥からなる群から選択される１種又は２種以上の動物の血清のアルブミンを用いることができる。より好ましくは、ウシ血清アルブミンを含んでいる。なお、こうしアルブミンに替えて、これらの血清をそのまま用いることもできる。この種の水溶性ポリマーは、いずれも、商業的に入手が可能である。
　水溶性ポリマーとしては、上記したタンパク質あるいは上記ポリマー以外も用いることができる。例えば、ＤＮＡやＲＮＡが挙げられる。こうした水溶性ポリマーとしては、例えば、ＤＮＡやＲＮＡなどのポリマーが挙げられる。典型的には、ニシン精子ＤＮＡなどのニシンＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡなどのサケＤＮＡを含む魚類ＤＮＡが挙げられる。あるいは、人工的に、標的核酸や検出用プローブと無関係な塩基配列からなる合成ＤＮＡやＲＮＡが挙げられる。例えば、ポリＡ、ポリＧ、ポリＴ、ポリＣ、ポリｄＡ、ポリｄＧ、ポリｄＴ、ポリｄＣ、ポリｄＵなどのホモポリリボヌクレオチドポリマー、ポリマーポリデオキシリボヌクレオチドのほか、これらをブロックとして有するブロックコポリマー等が挙げられる。
　水溶性ポリマーは、クロマトグラフィー用液における濃度は、標的核酸の検出を安定化できる範囲内で特に限定されないが、３．５質量％以下である、３．５質量％を超えると、水溶性ポリマーの含有量の増加に対して検出感度の安定性がそれほど向上しないからである。より好ましくは、３質量％以下であり、さらに好ましくは２．５質量％以下である。また、２質量％以下であってもよい。なお、水溶性ポリマーの下限は、好ましくは、０．１質量％である。０．１質量％を下回ると、水溶性ポリマーを含有することの効果が得られくいからである。より好ましくは、０．３質量％であり、さらに好ましくは０．４質量％であり、一層好ましくは、０．５質量％である。
　クロマトグラフィー用液は、さらに、マグネシウム塩を含むことができる。水溶性ポリマーに加えてマグネシウム塩を含むことで、一層プローブ領域における標的核酸の集積度を高めて標的核酸の検出安定性や感度及び迅速性を向上させることができる。こうした効果は、カリウム塩やナトリウム塩ではほとんど得られない、マグネシウム塩特有の効果である。
　マグネシウム塩は、マグネシウムを陽イオンとして含むイオン性化合物である。典型的には、水酸化マグネシウム、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、ヨウ化マグネシウムなどの無機塩、酢酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、リンゴ酸マグネシウム等の有機酸塩等が挙げられる。マグネシウム塩としては、特に限定しないで、１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。好ましくは、塩化マグネシウムを含む。
　マグネシウム塩の濃度は、標的核酸の検出安定性を向上させることができる範囲で、適宜決定される。好ましくは、０．５ｍＭ以上１０．０ｍＭ以下である、０．５ｍＭ未満であると、水溶性ポリマーとの相乗効果が得られにくく、１０．０ｍＭを超えると非特異的ハイブリダイズが発生するからである。より好ましくは、１ｍＭ以上であり、さらに好ましくは、２ｍＭ以上であり、より一層このましくは３ｍＭ以上である。８．０ｍＭ程度でも、標的核酸と検出用プローブとの特異的ハイブリダイズを阻害せず、また、標的核酸の検出感度が向上し、迅速な検出が可能となる。また、５ｍＭ以下でもよい。
　なお、クロマトグラフィー用液は、マグネシウム塩以外の金属塩を含んでいてもよい。特に限定しないが、例えば、カリウム塩やナトリウム塩を含んでいてもよい。
　クロマトグラフィー用液は、さらに、界面活性剤を含むことができる。界面活性剤を含むことで、気/液界面、固/液界面において界面張力を低下させ、ぬれ性を向上させることができる。ぬれ性を向上させることで、クロマトグラフィー用液の展開速度を速め、迅速な検出が可能となる。界面活性剤としては、特に限定されないが、例えば、ポリオキシエチレン奥チルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラスレート、ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテルリン酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等が挙げられる。より具体的には、Triton X-100（ポリエチレングリコールモノ－ｐ－イソオクチルフェニルエーテルを主成分とする。）、Tween20（ポリオキシエチレンソルビタンモノラルレートを主成分とする。）、Tweeen80（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートを主成分とする。）等が挙げられる。
　界面活性剤の濃度は特に限定しないが、０．０１質量％以上から１．０質量％以下であることが好ましい。好ましくは、０．０５質量％以上０．５質量％以下であり、より好ましくは、０．０５質量％以上０．３５質量％以下であり、さらに好ましくは０．２質量％以下であり、一層このましくは、０．１質量％以下である。
　クロマトグラフィー用液は、標的核酸を含んでいる。標的核酸の形態は、上記のとおり特異に限定されない。ＰＣＲを含む公知の各種核酸増幅反応による増幅産物の形態であってもよい。すなわち、後述するクロマトグラフィー工程に先立って、核酸増幅工程を備えることもできる。
　標的核酸が一本鎖の形態であるときには、クロマトグラフィー用液において二本鎖を解離する熱変性工程（９０℃以上９５℃以下程度に加熱する。）は必要ではない。また、標的核酸が検出用プローブとハイブリダイズする一本鎖を有する部分二重鎖である場合には、熱変性を省略できる。一方、標的核酸が核酸増幅反応の増幅産物のように二本鎖の場合には、検出用プローブとのハイブリダイズを可能とするために、一本鎖とする必要がある。すなわち、クロマトグラフィー工程に先立って標的核酸を含むクロマトグラフィー用液を加熱して二本鎖を熱変性する工程を実施する必要がある。
　クロマトグラフィー工程に先立って、標的核酸を核酸増幅反応の増幅産物として取得するとき、増幅産物を含有する核酸増幅反応液を含んでクロマトグラフィー用液を調製する工程を備えることができる。すなわち、核酸増幅反応液をクロマトグラフィー用液の一部として用いて、ＢＳＡ及びマグネシウム塩の双方を追加して、クロマトグラフィー用液とすることができる。こうすることで、核酸増幅反応液からＤＮＡを分離することなく簡易にクロマトグラフィー工程に供することができる。本クロマトグラフィー用液では、水溶性ポリマー及びマグネシウム塩が含まれていることで、核酸増幅反応液をクロマトグラフィー用液の一部として用いても、安定して標的核酸を検出できる。
　ここで、既述の部分二本鎖構造の増幅産物を取得する核酸増幅工程の一例について説明する。
（増幅工程）
　図２Ａに示すように、増幅工程は、第１のプライマーと第２のプライマーとを用いて実施する。核酸増幅工程における核酸増幅法は、ＰＣＲを始めとするＤＮＡポリメラーゼ反応を用いてＤＮＡを増幅して二重鎖ＤＮＡ断片を取得する各種の公知の方法が挙げられる。
（第１のプライマー）
　第１のプライマーは、標的核酸に予め関連付けられた検出用プローブに相補的なタグ配列と標的核酸中の第１の塩基配列を識別する第１の識別配列とを含んでいる。これらの塩基配列の長さ等は特に限定されず、標的核酸の標的配列の内容に応じて適宜決定される。
（第１の識別配列）
　第１の識別配列は、核酸増幅により、標的核酸を増幅するための配列であり、標的核酸中の標的配列の一部を構成する第１の塩基配列と特異的にハイブリダイズできる。第１の識別配列は、第１の塩基配列と高い選択性でハイブリダイズ可能な程度に相補的に設定される。好ましくは完全に相補的（特異的）に設定される。
（タグ配列）
　タグ配列は、タグ配列は、増幅断片が検出用プローブとハイブリダイゼーションを可能とするための配列であり、標的核酸を検出するものである。このため、標的核酸毎に検出用プローブの検出用配列にハイブリダイズ可能に設定される。典型的には、検出用配列に相補的な塩基配列となっている。したがって、一つの標的核酸は、一つの検出用プローブに対応付けられることになる。タグ配列の塩基長は、既に説明したように、好ましくは検出用プローブの検出用配列の塩基長に一致し、好ましくは、２０塩基以上５０塩基以下であり、より好ましくは、２０塩基以上２５塩基以下である。
　標的核酸中の第１の塩基配列と第２の塩基配列とは、標的核酸に対してどのような構成となっていてもよい。例えば、ＤＮＡ上の変異を検出する場合、いずれか一方の塩基配列にのみ１又は２以上の塩基の変異部位が含まれるようにしてもよい。また、双方に変異部位が含まれるようにしてもよい。なお、第１のプライマーは、こうしたタグ配列及び第１の識別配列を有しており、こうした塩基配列を構成する天然塩基あるいはこれに相同な人工塩基を有するとともに、天然核酸との間で塩基対合を可能とする骨格を有している。典型的にはオリゴヌクレオチド又はその誘導体である。
（連結部位）
　タグ配列を有するプライマーの一部と第１の識別配列を有するプライマーの他の一部とは直接連結されることはなく、これらの間には連結部位を有している。連結部位は、鋳型鎖に含まれたとき、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な部位である。ＤＮＡポリメラーゼ反応は、鋳型となる核酸（ないし塩基）がないとそれ以上ＤＮＡ鎖を伸長しないとされている。このため、本発明の連結部位は、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長時の鋳型となりえない構造を有している。すなわち、本連結部位は、天然塩基又は天然塩基と対合する天然塩基の誘導体（天然塩基等）を含まない。こうした天然塩基等を含まないことで、前記鋳型となることを回避して、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の伸長を抑制又は回避できる。したがって、本連結部位は、天然塩基等を有しないない単なる骨格鎖だけであってもよい。すなわち、糖－リン酸骨格や、他の公知の人工オリゴヌクレオチドに適用される骨格であってもよい。なお、ＤＮＡポリメラーゼは、各種公知のＤＮＡポリメラーゼが包含される。典型的には、各種ＰＣＲなどの核酸増幅法に用いられるＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
　また、本連結部位は、リン酸ジエステル結合を介してヌクレオチドに隣接される、元素数が２以上４０以下である一重鎖構造を含む鎖状の連結基であってもよい。元素数が１以下では、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止が不完全になりやすく、元素数が４０を超えると、ヌクレオチドの溶解性が低下するおそれがあるからである。ＤＮＡポリメラーゼ反応の抑制又は停止の効果を考慮すると、鎖状の連結基の元素は、２以上３６以下であることが好ましく、より好ましくは３以上１６以下である。
　本連結部位が、一重結合を含むのは、連結部位における回転を容易にするためであり、一重結合は、炭素－炭素一重結合、炭素－酸素一重結合、炭素－窒素一重結合、Ｓ－Ｓ一重結合などが挙げられる。本連結部位は、こうした一重結合を主体とすることが好ましい。また、本連結部位は、一重結合を含む限り一部に芳香環あるいはシクロアルカンを含んでいてもよい。
　本連結部位としては、元素数が２以上４０以下であって置換されていてもよいアルキレン鎖又はポリオキシアルキレン鎖を含むことが好ましい。こうした鎖状の連結構造は、構造的に簡易であるほか、連結部位としての導入も容易である。
　こうした連結部位としては、例えば、以下の式（１）で表される連結部位が挙げられる。
５’－Ｏ－ＣmＨ2m－Ｏ－３’             式（１）
（式中、５’は、５’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、ｍは２以上４０以下の整数を表す。）
　式（１）においてｍは、好ましくは２以上３６以下であり、より好ましくは３以上１６以下である。式（１）中のＨの置換基は、典型的には、アルキル基、アルコキシ基、水酸基等が挙げられる。アルキル基及びアルコキシ基の炭素数は１～８であることが好ましく、より好ましくは１～４である。また、２以上の置換基を有する場合には、置換基は同一であっても異なっていてもよい。さらに、置換基を有していないことも好ましい。
　また、他の連結部位としては、以下の式（２）で表される連結部位が挙げられる。
５’－（ＯＣnＨ2n）l－Ｏ－３’          式（２）
（式中、５’は、５’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、ｎは２以上４以下の整数を表し、ｌは、２以上の整数であって、（ｎ＋１）×ｌは４０以下となる整数を表す。）
　式（２）において（ｎ＋１）×ｌは、好ましくは２以上３６以下であり、より好ましくは３以上１６以下である。式（２）中のＨの置換基は、式（１）中の置換基と同様の態様が適用される。
　本連結部位としては、例えば、以下の鎖状部位が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　さらに、本連結部位としては、例えば、以下の鎖状部位が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　また、本連結部位としては、このほか、強固なヘアピン構造やシュードノット構造のようにポリメラーゼの進行を阻害する立体構造を有する核酸配列、Ｌ型核酸や人工核酸等の標的核酸天然型核酸や、ＲＮＡ及び脂肪鎖のような非核酸構造が挙げられる。人工核酸としては、ペプチド核酸、架橋化核酸、アゾベンゼン等が挙げられる。
　第１のプライマーは、第１の識別配列及びタグ配列を有しており、こうした塩基配列を構成する天然塩基あるいはこれに相同な人工塩基を有するとともに、天然核酸との間で塩基対合を可能とする骨格を主体として有している。典型的にはオリゴヌクレオチド又はその誘導体である。
　第１のプライマーにおいては、その５’側からタグ配列、連結部位及び第１の識別配列の順でこれらを有していることが好ましい。こうした構成とすることで、こうしたプライマーによって増幅されたＤＮＡ鎖が鋳型鎖となって増幅されるとき、鋳型鎖中の第１のプライマー由来の連結部位よりも５’側、すなわち、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長されるＤＮＡ鎖においてより先の３’側では伸長反応が停止されるか抑制される。この結果、鋳型鎖中の第１のプライマー由来の連結部位の３’側に隣接するヌクレオチドの塩基又はその近傍の塩基に対合する塩基を５’末端とし、第１のプライマー中のタグ配列の相補鎖を有しない増幅断片が得られることとなる（図１Ａ及び図１Ｂ、図２Ａ～図２Ｃ参照）。
　なお、連結部位近傍、すなわち、連結部位の３’側及び５’側には、タグ配列や第１の識別配列とは無関係の配列を含めることもできる。第１のプライマーが鋳型鎖となったとき、連結部位の存在のために、伸長鎖におけるタグ配列や第１の識別配列に対して意図しないＤＮＡ伸長反応の進行や停止の影響を低減又は回避できるからである。
（第２のプライマー）
　図２Ａに示すように、第２のプライマーは、標的核酸中の第２の塩基配列を識別する第２の識別配列を含んでいる。これらの塩基配列の長さ等は特に限定されず、標的核酸の標的配列の内容に応じて適宜決定される。
（第２の識別配列）
　第２の識別配列は、核酸増幅により、第１のプライマーとともに標的核酸を増幅するための配列であり、標的核酸中の標的配列の他の一部を構成する第２の塩基配列と特異的にハイブリダイズできる。第２の識別配列は、第２の塩基配列と高い選択性でハイブリダイズ可能な程度に相補的に設定される。好ましくは完全に相補的（特異的）に設定される。
（標識要素結合領域）
　図２Ａに示すように、標識要素結合領域は、予め標識要素を備えることができる。標識要素は、固相上で検出用プローブに結合したＤＮＡ二重鎖断片を検出するためのものである。標識要素としては従来公知のものを適宜選択して用いることができる。それ自体励起されると蛍光シグナルを発する蛍光物質などの各種色素であってもよいし、さらに酵素反応や抗原抗体反応により第２成分と組み合わせて各種シグナルを発する物質であってもよい。典型的には、Ｃｙ３、Alexa555、Ｃｙ５、Alexa647等の蛍光標識要素を用いることができる。また、ビオチンとストレプトアビジンＨＰＲとを組み合わせのほか、ＤＩＧ等を用いて基質による処理等による発色による検出を用いてもよい。標識要素結合領域は、標識要素を、第２の塩基配列に対して直接あるいは適当なリンカーを介して公知の方法により連結して備えている。
　また、第２のプライマーは、図２Ｂに示すように、標識要素結合領域が、標識要素を結合可能に構成されていてもよい。すなわち、所定の塩基配列を有しており、標識要素を有するとともに標識結合配列を識別する塩基配列を有する標識プローブが結合可能であってもよい。こうした標識プローブは後述するハイブリダイゼーション工程や検出工程において固相体上の検出用プローブとハイブリダイゼーションしたＤＮＡ二重鎖断片に供給されて、これを標識することができる。
　さらに、第２のプライマーは、図２Ｃに示すように、標識要素結合領域を備えていなくてもよい。すなわち、増幅工程において、標識要素を備えるヌクレオシド誘導体三リン酸を含むヌクレオシド三リン酸を用いて核酸増幅を実施することで、増幅断片のＤＮＡ伸長部位に標識要素が導入され標識された増幅断片を得ることができるからである。
　第２のプライマーは、第２の識別配列のほか、必要に応じて標識要素結合領域を有しており、第２の識別配列の塩基配列を構成する天然塩基あるいはこれに相同な人工塩基を有するとともに、天然核酸との間で塩基対合を可能とする骨格を有している。典型的にはオリゴヌクレオチド又はその誘導体である。
（連結部位）
　標識要素結合領域を備えるとき、標識要素結合領域と第２の識別配列とは、直接連結されていてもよいが、これらの間には連結部位を有していることが好ましい。特に、図２Ｂに示すように、標識要素結合領域が標識プローブと相互作用してこれを結合する塩基配列を有しているときにおいて好ましい。連結部位は、既に第１のプライマーにおいて説明したとおりである。
　第２のプライマーにおいては、その５’側から、標識要素結合領域、連結部位及び第２の識別配列の順でこれらを有していることが好ましい。こうした構成とすることで、第２のプライマーによって増幅されたＤＮＡ鎖が鋳型鎖となって、第１のプライマーによって増幅されるとき、鋳型鎖中の第２のプライマーに由来する連結部位よりも５’側、すなわち、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される新たなＤＮＡ鎖においてはより先の３’側では伸長反応が停止されるか抑制される。この結果、鋳型鎖中の第２のプライマー由来の連結部位の３’側に隣接するヌクレオチドの塩基又はその近傍の塩基に対合する塩基を５’末端とし、第２のプライマー中の標識結合領域（の塩基配列）の相補鎖を有しないＤＮＡ増幅断片が得られることとなる（図１Ｂ、図２Ｂ参照）。
　なお、連結部位近傍、すなわち、連結部位の３’側及び５’側には、標識要素結合領域や第２の識別配列とは無関係の配列を含めることもできる。第２のプライマーが鋳型鎖となったとき、連結部位の存在のために、伸長鎖における標識要素結合領域や第２の識別配列に対して意図しないＤＮＡ伸長反応の進行や停止の影響を低減又は回避できるからである。
　こうしたプライマーは、通常のオリゴヌクレオチド合成法にしたがって合成することができる。例えば、連結部位については、アルキレン鎖を有するホフォスホアミダイト試薬を用いて合成することができる。こうした試薬自体は、公知であり、例えば、GlenResearch社等から入手することができる。例えば、以下の試薬が挙げられる。なお、以下の式においてＤＭＴは、水酸基保護基として典型的なジメトキシトリチル基を表すが、他の公知の水酸基保護基であってもよい。また、以下の式においてＰＡは、ホスホアミダイト基を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　核酸増幅は、これらのプライマーを用いて実施する。核酸増幅法は既に説明したように各種公知の方法を適用できるが、典型的にはＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ等の各種ＰＣＲである。核酸増幅工程を実施するにあたっての、溶液組成、温度制御等については、当業者であれば適宜設定することができる。
　すでに説明したように、たとえば、５’側からタグ配列、連結部位及び第１の識別配列の順でこれらを有する第１のプライマーと、５’側から、標識要素結合領域、連結部位及び第２の識別配列の順でこれらを有する第２のプライマーと、を用いて標的核酸を含む可能性のある試料に対してＰＣＲを実施すると、図１Ｂの各（ａ）～（ｃ）に示すように、ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ伸長反応により、第１のプライマー及び第２のプライマーに由来して当該プライマーを含む鋳型鎖が形成される。
　そして、これらの鋳型鎖がそれぞれ由来するプライマーとは異なる第２のプライマー及び第１のプライマーによって再びＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応が実施される。このとき、図１Ｂの各（ｄ）及び（ｅ）に示すように、第２のプライマーから始まり第１のプライマーを含む鋳型鎖に対するＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ伸長反応は、鋳型鎖中の第１のプライマー由来の連結部位より５’側、すなわち、伸長鎖では連結部位よりも３’側ではＤＮＡの伸長が抑制又は停止される。
　また、図１Ｂの（ｄ）及び（ｅ）に示すように、第１のプライマーから始まり第２のプライマーを含む鋳型鎖に対するＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ伸長反応は、鋳型鎖中の第２のプライマー由来の連結部位より５’側、すなわち、伸長鎖では連結部位よりも３’側ではＤＮＡの伸長が抑制又は停止される。なお、
　こうした結果、得られる増幅断片は、図２Ｂに示すように、５’末端にそれぞれ突出する一本鎖のタグ配列と標識要素結合領域とを備え、第１の識別配列と第２の識別配列においては二重鎖を備えるＤＮＡ二重鎖断片となる。すなわち、このＤＮＡに重鎖断片にあっては、一方のＤＮＡ鎖の５’側では、タグ配列が突出して一本鎖となり、他方のＤＮＡ鎖の５’側では、標識要素結合領域が突出している。
　なお、用いる第２のプライマーが図２Ａに示すように、予め標識要素が結合した標識要素結合領域を有する場合には、図２Ａに示すように、標識要素を一方のＤＮＡ鎖の５’末端に有し、一方のＤＮＡ鎖の５’側にタグ配列を突出して有し、第１及び第２の識別配列においては二重鎖を備えるＤＮＡ二重鎖断片となる。
また、図２Ｃに示すように、標識要素をＤＮＡ鎖伸長部位に有し、一方のＤＮＡ鎖の５’側にタグ配列を突出して有し、第１及び第２の識別配列においては二重鎖を備えるＤＮＡ二重鎖断片となる。
　なお、ＢＳＡなどの水溶性ポリマーやマグネシウム塩は、核酸増幅反応液に含まれることがある。このため、核酸増幅試薬ないし核酸増幅反応液に含まれるＢＳＡ等の水溶性ポリマーやマグネシウム塩が、クロマトグラフィー用液の水溶性ポリマー及びマグネシウム塩の一部を充足することがある。この場合には、必要に応じて、水溶性ポリマー及びマグネシウム塩の含有量を調製して、クロマトグラフィー用液の組成とする。
　標的核酸は、予め、後述する標識要素により標識されていてもよい。例えば、核酸増幅反応において、あるいは酵素反応によって直接標識要素を取り込むようにしてもよい。そうでないにしても、増幅産物などの標的核酸と、その標的核酸とハイブリダイズ可能で標識要素により標識された標識用プローブとのハイブリダイズ産物を形成する標識工程を別に実施してもよい。あるいは、以下のように、未標識の標的核酸をクロマトグラフィー用液内においてハイブリダイズ産物を形成させてもよい。
　クロマトグラフィー用液は、さらに、標的核酸を識別するための標識要素を含むことができる。クロマトグラフィー用液に標識要素を含むことで、クロマトグラフィー本体に標的核酸を含むクロマトグラフィー用液を供給後に、クロマトグラフィー本体において、標的核酸を標識する必要がなく、クロマトグラフィー本体に標的核酸と標識要素との複合体を形成するための複合化部を形成しなくてもよい。また、標的核酸を調製するための核酸増幅工程において、増幅産物に対して標識要素を付与する操作を省略できる。
　本明細書において「標識要素」とは、検出しようとする物質あるいは分子を他と識別することを可能とする物質である。標識要素は、特に限定しないが、典型的には、蛍光、放射能、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、ハプテン（例えば、ジゴキシゲニンやＤＩＧなど）、燐光、化学発光、着色などを利用した標識要素が挙げられる。本明細書における標識要素とは、最終的にこれらの標識要素による識別が可能にこれらを結合可能な分子ないし物質も含まれる。
　標識要素は、目視（肉眼で）で検出可能な発光又は発色を提示する発光物質又は発色物質であることが好ましい。すなわち、直接それ自体が、他の成分を必要としないで肉眼で標的核酸を視認可能なシグナルを生成することができる物質であることが好ましい。こうした物質としては、典型的には、各種の顔料や染料などの各種の着色剤が挙げられる。また、これに準ずる、金、銀などの貴金属ほか、銅などの各種金属又は合金、あるいは当該金属を含む有機化合物（錯体化合物であってもよい）が挙げられる。また、着色剤に準ずる、マイカ等の無機化合物が挙げられる。
　この種の標識要素としては、典型的には、各種染料、各種顔料、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム化合物、オレフィン、エノールエーテル、エナミン、アリールビニルエーテル、ジオキセン、アリールイミダゾール、ルシゲニン、ルシフェリン及びエクリオンを包含する化学発光物質が挙げられる。また、こうした標識要素でラベルされているラテックス粒子などの粒子も挙げられる。さらに、金コロイド若しくはゾル又は銀コロイド若しくはゾルを包含するコロイド若しくはゾル等が挙げられる。さらにまた、金属粒子、無機粒子等が挙げられる。
　標識要素の一部を構成するラテックス粒子などの平均粒子径は、特に限定しないが、例えば、２０ｎｍ以上２０μｍ以下であり、典型的には、４０ｎｍ～１０μｍ、好ましくは０．１μｍ以上１０μｍ以下、特に好ましくは０．１μｍ以上５μｍ以下、さらに好ましくは０．１５μｍ以上２μｍ以下の平均粒子径を有している。好ましい粒子は、水溶液に懸濁でき、そして水不溶性ポリマー材料からなる粒子である。例えばポリエチレン、ポリスチレン、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリル酸ポリマー、メタクリル酸ポリマー、アクリロニトリルポリマー、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン、ポリビニルアセテート－アクリレート、ポリビニルピロリドン又は塩化ビニル－アクリレートが挙げられる。それらの表面上に活性基、例えばカルボキシル、アミノ又はアルデヒド基を有するラテックス粒子も挙げられる。
　こうした標識要素は、商業的に入手できるほか、標識要素の製造及び標識を粒子にラベルする方法も公知であり、当業者であれば適宜公知技術を利用して取得することができる。さらに、こうした標識要素又は標識要素でラベル化された粒子とＤＮＡ等のオリゴヌクレオチドとの結合もアミノ基等の官能基を介して適宜可能であり、それ自体は当該分野において周知である。
　クロマトグラフィー用液に含まれる標識要素は、例えば、以下の形態を採ることができる。標的核酸とハイブリダイズ可能であって標識要素を備える標識用プローブの形態である。１つは、標識用プローブは、例えば、標的核酸である増幅産物の一部（標識用タグ配列）とハイブリダイズする標識用配列と、標識要素と、を備えることができる。標識用配列は、標識用タグ配列と特異的にハイブリダイズ可能な程度の相補性を有しており、好ましくは完全に相補的である。標識用配列の塩基配列の長さ等は特に限定されず、標的核酸の標的配列の内容やハイブリダイゼーションに関わるそのＴｍ等に応じて適宜決定される。標識用プローブが有する好ましい標識要素は、プローブ領域において肉眼で検出可能に発色又は発光する標識要素であり、より好ましくは、金コロイド粒子、銀コロイド粒子及び着色ラテックス粒子から選択される１種又は２種以上である。こうした標識用プローブを用いることで、蛍光測定装置を用いることなく、その場において標的核酸を検出可能である。また、本クロマトグラフィー用液が、水溶性ポリマーを含んでいるため、こうした粒子を用いた場合において、安定した検出感度を得ることができる。
　次に、以上で説明したクロマトグラフィー本体とクロマトグラフィー用液を用いてクロマトグラフィーを実施する工程について説明する。
　クロマトグラフィー工程を実施するにあたり、核酸クロマトグラフィーの実施形態は特に限定されない。ほぼ水平状態での展開を意図したものであってもよい。この場合、典型的には、特定のクロマトグラフィー用液供給部に一定量のクロマトグラフィー用液を滴下等してクロマトグラフィーを実施する。また、クロマトグラフィーの形態は、ほぼ鉛直方向での展開を意図したものであってもよい。この場合、典型的には、クロマトグラフィー本体をほぼ鉛直方向に支持して、当該本体の下端部をクロマトグラフィー用液に浸漬してクロマトグラフィーを実施する。
　クロマトグラフィーの形態に応じて、クロマトグラフィー用液をクロマトグラフィー本体に供給することで、キャピラリー現象により、クロマトグラフィー用液は、固相担体を拡散してプローブ領域へと展開される。標的核酸に標識要素が供給されていない場合には、標的核酸はプローブ領域の上流側の複合化部に予め準備された標識要素と結合して、標識要素との複合体を形成してプローブ領域へと展開される。
　プローブ領域において、標的核酸がハイブリダイズすべき検出用プローブが固定されていると、標的核酸は、当該検出用プローブとハイブリダイズして、ハイブリダイズ産物を形成する。これにより、標的核酸が備える標識要素の種類に応じて標的核酸を識別できるシグナルが提示可能な状態となる。
　本クロマトグラフィー法によれば、クロマトグラフィー用液に、水溶性ポリマーを含んでいるために、プローブ領域における標的核酸の集積度を高めて、標的核酸の検出を安定化できる。また、同時に高感度化できるとともに迅速検出が可能となっている。例えば、水溶性ポリマーとマグネシウム塩とを含むことにより、５分程度であっても、標的核酸を検出可能とすることができる。
　プローブ領域が複数存在する場合には、ハイブリダイゼーション用液に存在する他の標的核酸とハイブリダイズすべき検出用プローブが存在すれば、そのプローブ領域において、ハイブリダイズ産物が形成される。
　なお、クロマトグラフィー工程における条件は特に限定されないが、例えば、５℃以上４０℃以下程度の空気雰囲気下で実施できる。好ましくは１５℃以上３５℃以下である。また、例えば、１０μｌ以上６０μｌ以下程度のクロマトグラフィー用液を、クロマトグラフィー本体としては、幅２．０ｍｍ以上８．０ｍｍ以下で長さ（又は高さ）が２０ｍｍ以上１００ｍｍ以下のシート状のクロマトグラフィー本体の一部（下端部又は供給部）に浸透させて、クロマトグラフィーを開始する。クロマトグラフィー用液がプローブ領域の通過を完了する展開時間はおおそよ２分から５０分である。
（検出工程）
　検出工程は、最終的なハイブリダイズ産物を、前記標識要素に基づいて検出する工程である。より具体的には、検出用プローブが固定化された固定化領域の着色及び位置を確認する工程である。標識要素によるシグナルを検出するには、標識要素の種類に応じて適宜選択される。特異的結合反応や酵素による発色反応が必要な場合には、適宜そうした操作が行われる。本クロマトグラフィー法では、固相担体を洗浄することなくそのまま検出工程を実施することが好ましい。
　標識要素が、例えば、ラテックス粒子、金コロイド粒子、銀コロイド粒子など、肉眼で検出可能な発色又は発光を提示する標識要素であるときには、肉眼で直ちに標的核酸の存在やその量（色の濃さ等で）を検出できる。このため、一層の迅速検出が可能となっている。
（核酸クロマトグラフィー用組成物及びキット）
　本明細書に開示される組成物は、アルブミン、カゼイン、スキムミルク、グロブリン、ゼラチン、ヘパリン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、デキストラン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース及びポリマレイミドからなる群から選択される１種又は２種以上の水溶性ポリマーを含有する、組成物であって、核酸クロマトグラフィーに供するクロマトグラフィー用液を調製するための組成物である。
　クロマトグラフィー用組成物は、予め、クロマトグラフィー用液の最終濃度に対応する組成を備えていてもよい（第１の態様）。
　また、クロマトグラフィー用組成物は、用時に水やクロマトグラフィー用液の成分の一部を含んでいてもよい緩衝液に溶解してクロマトグラフィー用液を調製可能な組成の用時溶解性の粉末ないし固形物であってもよい（第２の態様）。
　また、クロマトグラフィー用組成物は、水や緩衝液によって希釈されて本クロマトグラフィー用液を調製可能な高濃度液（原液）の形態であってもよい（第３の態様）。この場合、本組成物と、水や緩衝液などの希釈のための水性媒体と、を備えるキットを構成できる。
　さらに、クロマトグラフィー用組成物は、ＰＣＲ増幅反応の増幅反応液の所定量と混合して本クロマトグラフィー用液を調製可能な組成を有する原液の形態であってもよい（第４の態様）。この場合、本組成物と、水や緩衝液などの希釈のための水性媒体と、さらに、増幅反応試薬と、を備えるキットを構成できる。
　以上のクロマトグラフィー用組成物は、いずれも、既に説明したクロマトグラフィー本体と、各種態様の標識要素とのいずれかあるいは双方を備えるキットとしてもよい。
　第３の態様のクロマトグラフィー用組成物における水溶性ポリマーの濃度は、クロマトグラフィー用液における水溶性ポリマーの濃度を考慮して例えば、０．２質量％以上６．０質量％とすることができる。また、本クロマトグラフィー用組成物におけるマグネシウム塩の濃度は、１．０ｍＭ以上２０.０ｍＭ以下とすることが好ましい。用時において、また、クロマトグラフィー用組成物における界面活性剤の濃度は、０．１質量％以上０．５質量％以下とすることが好ましい。１．４～２．０倍に希釈するのが都合がよいからである。
　第４の態様のクロマトグラフィー用組成物における水溶性ポリマーの濃度は、同様に、０．１質量％以上５．０質量％とすることができる。また、本クロマトグラフィー用組成物におけるマグネシウム塩の濃度は、０．５ｍＭ以上１６．０ｍＭ以下とすることが好ましい。また、本クロマトグラフィー用組成物における界面活性剤の濃度は、０．１質量％以上０．５質量％以下とすることが好ましい。核酸増幅反応液に対して１．４～２．０倍に希釈するのが都合がよいからである。また、第４の態様のクロマトグラフィー組成物は、用いる増幅試薬のＢＳＡなどの水溶性ポリマー濃度やマグネシウム塩の濃度に応じて、その水溶性ポリマー濃度やマグネシウム塩濃度が適宜調節される。
　以下、本発明を実施例を挙げて具体的に説明するが、以下の実施例は本発明を説明するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。なお、以下の実施例において、％は、いずれも質量％を意味する。
（増幅産物である標的核酸を含む増幅反応液を含有するクロマトグラフィー用液を用いた核酸クロマトグラフィーにおける標的核酸の検出１）
　ヒト正常組織ゲノムＤＮＡに対して部分二本鎖ＤＮＡを得るためのプライマーセットを用いて市販のＰＣＲ増幅試薬を用いてＰＣＲ増幅した。その後、核酸クロマトグラフィーに供した。実験材料及び方法は、以下の通りであった。なお、このプライマーセットによれば、二本鎖の各鎖の５’末端がそれぞれ一本鎖である部分二本鎖ＤＮＡが得られる。このため、この標的核酸は、熱変性工程を実施しないで、核酸クロマトグラフィーに供した。
（１）実験材料
ゲノムＤＮＡ：コスモバイオ社　ヒト正常組織ゲノムＤＮＡ（Cat.No.D1234148）
ＰＣＲ増幅試薬：QIAGEN社_Multiplex PCR Kit （Cat.No.206143）
プライマー（Forward, Reverse）：日本遺伝子研究所への合成委託品
（２）プライマーセット
プライマー（Forward）：
5'-(TGTTCTCTGACCAATGAATCTGCXACCAAAGAATATGGCTGAATTTAGTAGTGTTTTAAATAATTTTAA)-3'（配列番号１０１）
プライマー（Reverse）：
5'-(TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTXACCTGCTAATGAGATGATCCCTTATTTTGAAAACAACTATTCCTA)-3'（配列番号１０２）
連結部位Ｘ=SpacerC3は以下の構造を有している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
（３）ＰＣＲ反応条件
反応条件：９５℃，１５分、［９５℃，３０秒、８０℃，１秒、６４℃，６分］×４０サイクル
ＰＣＲ反応液の組成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 ＊１：ＭｇＣｌ２（塩化マグネシウム）の終濃度：３ｍＭ
（４）核酸クロマトグラフィー本体の準備
　メルクミリポア製のメンブレンシート（型式：Ｈｉ-Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ ＨＦ１８０）（幅３．５ｍｍ、長さ６０ｍｍ）に対して、図３に示すパターンで、赤色の顔料によるマーカー３箇所と、配列番号１、２、１０，１４、３６、７７、８９及び９４の８種の塩基配列を有するプローブ（プローブ１、２、１０、１４、３６、７７、８９及び９４）を日本ガイシ株式会社ＧＥＮＥＳＨＯＴ（登録商標）スポッターを用いてスポットし、計８個のバンド状のプローブ領域を形成した。さらに、ポリＴプローブをさらに下流にスポットした。（３）で取得した増幅産物を標的とするのは、プローブ１である。
（５）核酸クロマトグラフィー用組成物の準備
　クロマトグラフィー用組成物（展開液）として、界面活性剤、リン酸バッファー（ｐＨ７．４）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む展開液１～４を準備した。また、標識要素としては、着色剤：タグＤＮＡ（ポリＡ）付きカラーラテックス（青色）粒子の２．５％懸濁液を準備した。
展開液１：０．１％Tween80-リン酸バッファー
展開液２：０．１％Tween80-０．５％ＢＳＡ-リン酸バッファー
展開液３：０．１％Tween80-１．０％ＢＳＡ-リン酸バッファー
展開液４：０．１％Tween80-３．０％ＢＳＡ-リン酸バッファー
Tween80：和光純薬工業（株） ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノオレエート   （Cat.No.163-21625）
ＢＳＡ：ロシュ ダイアグノスティックス（株）　アルブミンフラクションV（Cat.No.735086）
リン酸バッファー：リン酸水素二ナトリウム・１２水とリン酸ニ水素カリウムの混合液
（６）核酸クロマトグラフィーの実施
　（３）で得られたＰＣＲ増幅反応液の全量１０μｌを、以下の組成に従いクロマトグラフィー用液１～４を各５０μｌを調製した。クロマトグラフィー用液１～４において、ＰＣＲ増幅産物に由来するマグネシウム塩濃度は０．６ｍＭであった。また、クロマトグラフィー用液１～４の各ＢＳＡ濃度は、それぞれ、０％、０．３５％、０．７％及び２．１％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　図４に示す形態で、各クロマトグラフィー用液５０μｌをマイクロチューブに投入後、クロマトグラフィー本体の下端部をクロマトグラフィー用液に浸漬し、全てのクロマトグラフィー用液が展開させ（約２０分）、その後約１０分そのままの状態で乾燥させた。結果を図５に示す。
　図５に示すように、ＢＳＡを含まないクロマトグラフィー用液１によれば、３０分経過後においても、プローブ１のプローブ領域において着色したバンドをほとんど観察できなかった。これに対して、ＢＳＡを０．３５～２．１質量％含むクロマトグラフィー用液２～４では、２０分経過後には明らかにプローブ１によるプローブ領域において着色バンドが観察された。ＢＳＡが最も高濃度であるクロマトグラフィー用液４において最も明瞭なバンドを観察することができた。
（増幅産物である標的核酸を含む増幅反応液を含有するクロマトグラフィー用液を用いた核酸クロマトグラフィーにおける標的核酸の検出２）
　実施例１とは異なる市販ＰＣＲ増幅試薬及びＰＣＲ反応条件及びＰＣＲ反応液の組成を用いる以外は、実施例１と同様に操作して、核酸クロマトグラフィーに供した。ＰＣＲ増幅試薬及び反応条件等は、以下の通りであった。
ＰＣＲ増幅試薬：日本ジェネティクス社_KAPA2G Fast HotStart PCR Kit （Cat.No.KK5502）
ＰＣＲ反応条件
反応条件：９５℃，３分［９５℃，１５秒、６８℃，２分］×４０サイクル
ＰＣＲ反応液の組成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 　※1：ＭｇＣｌ2（塩化マグネシウム）の終濃度：４．５ｍＭ
　なお、実施例２のクロマトグラフィー用液１～４において、ＰＣＲ増幅産物に由来するマグネシウム塩濃度は０．９ｍＭであった。また、クロマトグラフィー用液１～４の各ＢＳＡ濃度は、それぞれ、０％、０．３５％、０．７％及び２．１％であった。結果を図６に示す。
　図６に示すように、ＢＳＡを含まないクロマトグラフィー用液１によれば、実施例１と同様、３０分経過後においても、プローブ１のプローブ領域において着色したバンドをほとんど観察できなかった。これに対して、ＢＳＡを０．３５～２．１％含むクロマトグラフィー用液２～４では、１５分経過後には明らかにプローブ１によるプローブ領域において着色バンドが観察された。ＢＳＡが最も高濃度であるクロマトグラフィー用液４において最も明瞭なバンドを観察することができた。また、クロマトグラフィー用液２～４では、マグネシウム塩濃度が０．９ｍＭと実施例１より高いため、１０分経過後から青色バンドを検出することができた。
（合成オリゴＤＮＡを用いて核酸クロマトグラフィーによるクロマトグラフィー用液における塩の評価）
　標的核酸として、合成オリゴＤＮＡを用いて、クロマトグラフィー用液における塩の種類と標的核酸の検出程度との関係について評価した。標的核酸として以下の配列の合成オリゴＤＮＡを用いて増幅反応を実施せず、以下の組成に従ってクロマトグラフィー用液１～３を調製した以外は、実施例１と同様に操作して、核酸クロマトグラフィーに供した。合成オリゴＤＮＡの塩基配列及びクロマトグラフィー用液の組成は以下の通りであった。なお、ポリＴ部分はカラーラテックス粒子のＤＮＡタグ（ポリＡ）とのハイブリダイズ部位である。
合成オリゴＤＮＡ（相補オリゴ）：日本遺伝子研究所の合成品
合成オリゴＤＮＡ情報（配列）
相補オリゴＤＮＡ（Probe.No.1）：
5'-( TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTTCTCTGACCAATGAATCTGC)-3'（配列番号１０３）
　クロマトグラフィー用液１～３は、以下の表に従い調製した。なお、展開液４は、0.1％Tween80-3.0％BSA-リン酸バッファーとし、塩１～３は、２５ｍＭ塩化ナトリウム（塩１）、２５ｍＭ塩化カリウム（塩２）及び２５ｍＭ塩化マグネシウム（塩３）とした。各塩の最終濃度は３ｍＭであった。また、合成オリゴＤＮＡの最終濃度は、１００ｎＭであり、ＢＳＡは、２．１％であった。結果を図７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　図７に示すように、マグネシウム塩（塩３）を用いた場合には、５分経過後において、青色のバンドをプローブ１のプローブ領域に確認できた。これに対して、ナトリウム塩（塩１）及びカリウム塩（塩２）を用いた場合には、２０分経過後からしか青色バンドを確認できなかった。塩３の場合には、２０分経過後には、青色バンドの発色は最大程度となった。以上の結果から、マグネシウム塩は、アルカリ塩とは異なり、ＢＳＡ等の水溶性ポリマーの存在下において、標的核酸を効果的にプローブ領域に集積させることができ、結果として高感度かつ迅速に標的核酸を確認するのに寄与することがわかった。
（合成オリゴＤＮＡを用いて核酸クロマトグラフィーによるクロマトグラフィー用液におけるマグネシウム塩濃度評価）
　以下の組成に従ってクロマトグラフィー用液を調製した以外は、実施例３と同様に操作して、核酸クロマトグラフィーに供した。
　クロマトグラフィー用液は、以下の表に従い調製した。なお、展開液４は、0.1％Tween80-3.0％BSA-リン酸バッファーとし、塩は２５ｍＭ塩化マグネシウム（塩３）を用いて塩化マグネシウムの最終濃度が、０ｍＭ、１ｍＭ、３ｍＭ及び４．５ｍＭとなるように調製した。合成オリゴＤＮＡの最終濃度は、１００ｎＭであり、ＢＳＡは、２．１％であった。結果を図８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　図８に示すように、マグネシウム塩が高濃度になるにつれて、高感度にかつ迅速な検出が可能になった。すなわち、マグネシウム濃度が３ｍＭ及び４．５ｍＭでは、展開開始から５分経過時において明らかな青バンドを確認できた。同１ｍＭでも、１０分経過後には、青バンドを確認できた。以上の結果から、マグネシウム濃度が相当高濃度でも、標的核酸と検出用プローブとのハイブリダイズを阻害せず、検出用プローブへの集積が促進されることがわかった。
（増幅産物である標的核酸を含む増幅反応液を含有するクロマトグラフィー用液を用いた核酸クロマトグラフィーにおける標的核酸の検出３）
　実施例１の展開液１～４に替えて展開液４～７を用いて、クロマトグラフィー用液における全塩化マグネシウムの最終濃度が０．６ｍＭ、４．１ｍＭ、８．３ｍＭ、１６．７ｍＭとなるようにクロマトグラフィー用液を調製した以外は、実施例１と同様に操作して、核酸クロマトグラフィーに供した。新たに調製した展開液５、６、７の組成は以下の通りであった。
展開液５：０．１％Tween80-３．０％ＢＳＡ-５．０ｍＭ塩化マグネシウム－リン酸バッファー
展開液６：０．１％Tween80-３．０％ＢＳＡ-１１．０ｍＭ塩化マグネシウム－リン酸バッファー
展開液７：０．１％Tween80-３．０％ＢＳＡ-２３．０ｍＭ塩化マグネシウム－リン酸バッファー
　なお、実施例４のクロマトグラフィー用液１～４において、ＰＣＲ増幅産物に由来するマグネシウム塩濃度は０．６ｍＭであった。また、別に展開液に由来する塩化マグネシウム濃度は、３．５ｍＭ、７．７ｍＭ及び１６．１ｍＭであり、クロマトグラフィー用液１～４における全塩化マグネシウム濃度は、０．６ｍＭ、４．１ｍＭ、８．３ｍＭ及び１６．７ｍＭであった。クロマトグラフィー用液１～４の各ＢＳＡ濃度は、２．１％であった。結果を図９に示す。
　図９に示すように、実施例４と同様に、マグネシウム塩が高濃度になるにつれて、高感度にかつ迅速な検出が可能になった。すなわち、マグネシウム濃度が４．１ｍＭ及び８．３ｍＭでは、展開開始から５分経過時において明らかな青バンドを確認できた。０．６ｍＭでは、２０分経過後には、やっと薄い青バンドを確認できた。一方、１６．７ｍＭであると、意図したバンドも強くいずれかに青色に発色するが、３０分経過後には、クロスハイブリダイゼーションが発生し、意図しないバンドにおいても青色に発色した。以上の結果から、ＰＣＲ増幅反応液のように増幅産物である標的核酸のほか、ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素、プライマー、ヌクレオチドなどが残存していても、ＢＳＡ等の水溶性ポリマーの存在下に塩化マグネシウムを含有させることで、標的核酸と検出用プローブとのハイブリダイズを阻害せず、検出用プローブへの集積が促進されることがわかった。また、クロスハイブリダイゼーションを考慮すると、マグネシウム塩濃度は、１６．７ｍＭより低いことが好ましいことがわかった。
（増幅産物である標的核酸を含む増幅反応液を含有するクロマトグラフィー用液を用いた核酸クロマトグラフィーにおける標的核酸の検出４）
　実施例２の展開液１～４に替えて展開液４～７を用いて、クロマトグラフィー用液における全塩化マグネシウムの最終濃度が０．９ｍＭ、４．４ｍＭ、８．６ｍＭ及び１７．０ｍＭとなるようにクロマトグラフィー用液を調製した以外は、実施例２と同様に操作して、核酸クロマトグラフィーに供した。新たに調製した展開液５、６、７の組成は以下の通りであった。
展開液５：０．１％Tween80-３．０％ＢＳＡ-５．０ｍＭ塩化マグネシウム－リン酸バッファー
展開液６：０．１％Tween80-３．０％ＢＳＡ-１１．０ｍＭ塩化マグネシウム－リン酸バッファー
展開液７：０．１％Tween80-３．０％ＢＳＡ-２３．０ｍＭ塩化マグネシウム－リン酸バッファー
　なお、実施例６のクロマトグラフィー用液１～４において、ＰＣＲ増幅産物に由来するマグネシウム塩濃度は０．９ｍＭであった。また、別に展開液に由来する塩化マグネシウム濃度は、３．５ｍＭ、７．７ｍＭ及び１６．１ｍＭであり、クロマトグラフィー用液１～３における全塩化マグネシウム濃度は、０．９ｍＭ、４．４ｍＭ、８．６ｍＭ及び１７．０ｍＭであった。クロマトグラフィー用液１～４の各ＢＳＡ濃度は、２．１％であった。結果を図１０に示す。
　図１０に示すように、実施例５と同様に、マグネシウム塩が高濃度になるにつれて、高感度にかつ迅速な検出が可能になった。すなわち、マグネシウム濃度が４．４ｍＭ及び８．６ｍＭでは、展開開始から５分経過時において明らかな青バンドを確認できた。特に、８．６ｍＭのときには、５分経過前から青色バンドを確認できた。０．９ｍＭでは、１５分～２０分経過後には、やっと薄い青バンドを確認できた。一方、１７．０ｍＭであると、意図したバンドも強く青色に発色するが、２０分経過後には、クロスハイブリダイゼーションが発生し、意図しないバンドにおいても青色に発色した。また、クロスハイブリダイゼーションを考慮すると、マグネシウム塩濃度は、１７．０ｍＭより低いことが好ましいことがわかった。
　以上の結果から、ＰＣＲ増幅反応液のように増幅産物である標的核酸のほか、ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素、プライマー、ヌクレオチドなどが残存していても、ＢＳＡ等の水溶性ポリマーの存在下に塩化マグネシウムを含有させることで、標的核酸と検出用プローブとのハイブリダイズを阻害せず、検出用プローブへの集積が促進されることがわかった。また、異なるＰＣＲ増幅反応液についてＢＳＡ等の水溶性ポリマー及び塩化マグネシウムの適用が有効であることがわかった。
配列番号１～１００、１０３：プローブ、配列番号１０１～１０２：プライマー

Claims (21)

  1. 　核酸クロマトグラフィー方法であって、
    　標的核酸を含有するクロマトグラフィー用液を、前記標的核酸を捕捉可能な検出用プローブが固定化された固相担体に供給してクロマトグラフィーを実施する工程、
    を備え、
    　前記クロマトグラフィー用液は、アルブミン、カゼイン、スキムミルク、グロブリン、ゼラチン、ヘパリン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、デキストラン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース及びポリマレイミドからなる群から選択される１種又は２種以上の水溶性ポリマーを含有する、方法。
  2. 　前記水溶性ポリマーは、アルブミンを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記クロマトグラフィー用液における前記水溶性ポリマーの濃度は、３．５質量％以下である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記クロマトグラフィー用液は、さらに、マグネシウム塩を含む、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 　前記マグネシウム塩は、塩化マグネシウムを含む、請求項４に記載の方法。
  6. 　前記マグネシウム塩の濃度は、０．５ｍＭ以上１０．０ｍＭ以下である、請求項４又は５に記載の方法。
  7. 　前記クロマトグラフィー用液は、さらに、界面活性剤を含む、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  8. 　前記クロマトグラフィー用液は、さらに、前記標的核酸を識別するための標識要素を含む、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  9. 　前記標識要素は、着色された粒子である、請求項８に記載の方法。
  10. 　前記クロマトグラフィー工程に先立って、前記標的核酸を増幅産物として含有する核酸増幅反応液を含む前記クロマトグラフィー用液を調製する工程を備える、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
  11. 　前記マグネシウム塩の少なくとも一部を、前記核酸増幅反応液中のマグネシウム塩が充足する、請求項４～６のいずれかに記載の方法。
  12. 　核酸クロマトグラフィー用組成物であって、
    　アルブミン、カゼイン、スキムミルク、グロブリン、ゼラチン、ヘパリン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、デキストラン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース及びポリマレイミドからなる群から選択される１種又は２種以上の水溶性ポリマーを含有する、組成物。
  13. 　前記水溶性ポリマーは、アルブミンを含む、請求項１２に記載の組成物。
  14. 　前記水溶性ポリマーの終濃度が３．５％以下となるように前記水溶性ポリマーを含有する、請求項１２又は１３に記載の組成物。
  15. 　さらに、マグネシウム塩を含む、請求項１２～１４のいずれかに記載の組成物。
  16. 　前記マグネシウム塩は、塩化マグネシウムを含む、請求項１５に記載の組成物。
  17. 　前記マグネシウム塩の終濃度が０．５ｍＭ以上１０．０ｍＭ以下となるように、前記マグネシウム塩を含有する、請求項１２～１６のいずれかに記載の組成物。
  18. 　さらに、界面活性剤を含む、請求項１２～１７のいずれかに記載の組成物。
  19. 　標的核酸に対応する増幅産物を含む核酸増幅反応液に添加するための、請求項１２～１８のいずれかに記載の組成物。
  20. 核酸クロマトグラフィー用キットであって、
    　アルブミン、カゼイン、スキムミルク、グロブリン、ゼラチン、ヘパリン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、デキストラン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース及びポリマレイミドからなる群から選択される１種又は２種以上の水溶性ポリマーを含有する、核酸クロマトグラフィー用組成物、
    を備える、キット。
  21. 　前記核酸クロマトグラフィー用組成物は、さらに、マグネシウム塩を含む、請求項２０に記載のキット。
PCT/JP2013/068251 2012-07-05 2013-07-03 核酸クロマトグラフィー法、核酸クロマトグラフィー用組成物及びこれを含むキット WO2014007289A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014523765A JP6294821B2 (ja) 2012-07-05 2013-07-03 核酸クロマトグラフィー法、核酸クロマトグラフィー用組成物及びこれを含むキット
EP13812618.0A EP2871244A4 (en) 2012-07-05 2013-07-03 NUCLEIC ACID CHROMATOGRAPHY METHOD, COMPOSITION FOR NUCLEIC ACID CHROMATOGRAPHY AND KIT CONTAINING THE SAME
US14/587,214 US20150125859A1 (en) 2012-07-05 2014-12-31 Nucleic Acid Chromatography Method, Composition for Nucleic Acid Chromatography and Kit Containing Same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012151755 2012-07-05
JP2012-151755 2012-07-05

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US14/587,214 Continuation US20150125859A1 (en) 2012-07-05 2014-12-31 Nucleic Acid Chromatography Method, Composition for Nucleic Acid Chromatography and Kit Containing Same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014007289A1 true WO2014007289A1 (ja) 2014-01-09

Family

ID=49882041

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2013/068251 WO2014007289A1 (ja) 2012-07-05 2013-07-03 核酸クロマトグラフィー法、核酸クロマトグラフィー用組成物及びこれを含むキット

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20150125859A1 (ja)
EP (1) EP2871244A4 (ja)
JP (1) JP6294821B2 (ja)
WO (1) WO2014007289A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016129609A1 (ja) * 2015-02-09 2016-08-18 日本碍子株式会社 標的核酸の検出方法
JP2017023110A (ja) * 2015-07-28 2017-02-02 東ソー株式会社 核酸の検出方法および当該方法を利用した試薬キット
JP2017131166A (ja) * 2016-01-28 2017-08-03 株式会社Ｔｂａ 標的核酸の検出方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05252998A (ja) 1992-03-13 1993-10-05 Internatl Reagents Corp Ｐｃｒ増幅ｄｎａの測定法
JP2003225099A (ja) * 2002-02-04 2003-08-12 Nitto Denko Corp 標的ｄｎａの検出方法
JP2004512499A (ja) * 2000-07-07 2004-04-22 リー，エレン ディップスティック検定における改良型結合相互作用
WO2006095550A1 (ja) 2005-03-04 2006-09-14 Kyoto University Ｐｃｒプライマー、それを利用したｐｃｒ法及びｐｃｒ増幅産物、並びにｐｃｒ増幅産物を利用するデバイス及びｄｎａ-タンパク複合体
JP2008500831A (ja) * 2004-06-01 2008-01-17 エーエスエム サイエンティフィック， インコーポレイテッド リコンビナーゼポリメラーゼ増幅
WO2009034842A1 (ja) 2007-09-11 2009-03-19 Kaneka Corporation 核酸検出方法、および核酸検出キット
JP2009535053A (ja) * 2006-05-04 2009-10-01 エーエスエム サイエンティフィック， インコーポレイテッド レコンビナーゼポリメラーゼ増幅
WO2012034842A1 (de) 2010-09-16 2012-03-22 Siemens Vai Metals Technologies Gmbh Verfahren zum transfer eines metallbundes

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070190537A1 (en) * 2005-07-22 2007-08-16 Postech Foundation Solid phase synthesis
EP2021508B1 (en) * 2006-05-23 2012-04-25 Molecular Detection, Inc. Ambient temperature stable kits for molecular diagnostics
JP4559510B2 (ja) * 2008-07-14 2010-10-06 田中貴金属工業株式会社 イムノクロマトグラフ法のための展開液、及びそれを用いた測定方法
JP4638555B1 (ja) * 2010-09-08 2011-02-23 田中貴金属工業株式会社 核酸又は免疫クロマトグラフィー用試薬組成物、核酸又は免疫クロマトグラフィー測定方法及び核酸又は免疫クロマトグラフィー測定用キット

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05252998A (ja) 1992-03-13 1993-10-05 Internatl Reagents Corp Ｐｃｒ増幅ｄｎａの測定法
JP2004512499A (ja) * 2000-07-07 2004-04-22 リー，エレン ディップスティック検定における改良型結合相互作用
JP2003225099A (ja) * 2002-02-04 2003-08-12 Nitto Denko Corp 標的ｄｎａの検出方法
JP2008500831A (ja) * 2004-06-01 2008-01-17 エーエスエム サイエンティフィック， インコーポレイテッド リコンビナーゼポリメラーゼ増幅
WO2006095550A1 (ja) 2005-03-04 2006-09-14 Kyoto University Ｐｃｒプライマー、それを利用したｐｃｒ法及びｐｃｒ増幅産物、並びにｐｃｒ増幅産物を利用するデバイス及びｄｎａ-タンパク複合体
JP2009535053A (ja) * 2006-05-04 2009-10-01 エーエスエム サイエンティフィック， インコーポレイテッド レコンビナーゼポリメラーゼ増幅
WO2009034842A1 (ja) 2007-09-11 2009-03-19 Kaneka Corporation 核酸検出方法、および核酸検出キット
WO2012034842A1 (de) 2010-09-16 2012-03-22 Siemens Vai Metals Technologies Gmbh Verfahren zum transfer eines metallbundes

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAZUHIKO AOYAGI ET AL.: "Mokuteki Idenshi o Fuyasu Nobasu Tanri suru 3 RT-PCR, Experimental Medicine separate volume", MOKUTEKIBETSU DE ERABERU PCR JIKKEN PROTOCOL, 2011, pages 74 - 85, XP008176080 *
OBERACHER H. ET AL.: "Some Guidelines for the Analysis of Genomic DNA by PCR-LC-ESI-MS", J AM SOC MASS SPECTROM, vol. 17, 2006, pages 124 - 129, XP027973672 *
See also references of EP2871244A4

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016129609A1 (ja) * 2015-02-09 2016-08-18 日本碍子株式会社 標的核酸の検出方法
JPWO2016129609A1 (ja) * 2015-02-09 2017-04-27 日本碍子株式会社 標的核酸の検出方法
JP2017023110A (ja) * 2015-07-28 2017-02-02 東ソー株式会社 核酸の検出方法および当該方法を利用した試薬キット
JP2017131166A (ja) * 2016-01-28 2017-08-03 株式会社Ｔｂａ 標的核酸の検出方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2871244A1 (en) 2015-05-13
JPWO2014007289A1 (ja) 2016-06-02
US20150125859A1 (en) 2015-05-07
EP2871244A4 (en) 2016-03-23
JP6294821B2 (ja) 2018-03-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6076273B2 (ja) 標的核酸の検出方法
JP6182300B2 (ja) 標的核酸の検出方法
JP2020530779A5 (ja)
US20230167496A1 (en) Compositions and methods for isolating nucleic acid molecules
JP6294821B2 (ja) 核酸クロマトグラフィー法、核酸クロマトグラフィー用組成物及びこれを含むキット
JP6691380B2 (ja) 短鎖ｒｎａの検出方法
JP2016527900A (ja) ｃＭＥＴ核酸のマルチモード解析のための組成物および方法
JP6196611B2 (ja) 標的核酸の検出方法
JP6321318B2 (ja) 標的核酸の検出方法
JP5967785B2 (ja) 標的核酸の検出方法
WO2017006859A1 (ja) 標的核酸の検出法
JP6202455B2 (ja) 標的核酸の検出方法
US20230067733A1 (en) Primer set and method for detecting target nucleic acid using same
JP2017158523A (ja) リステリア・モノサイトゲネスを検出するためのプライマーセット、キット及び方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13812618

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2014523765

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2013812618

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2013812618

Country of ref document: EP