JP2017023110A - 核酸の検出方法および当該方法を利用した試薬キット - Google Patents
核酸の検出方法および当該方法を利用した試薬キット Download PDFInfo
- Publication number
- JP2017023110A JP2017023110A JP2015148551A JP2015148551A JP2017023110A JP 2017023110 A JP2017023110 A JP 2017023110A JP 2015148551 A JP2015148551 A JP 2015148551A JP 2015148551 A JP2015148551 A JP 2015148551A JP 2017023110 A JP2017023110 A JP 2017023110A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- virus
- sequence
- specific base
- base sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 115
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 113
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 113
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 27
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 84
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 36
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 24
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 22
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 20
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 28
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 21
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 17
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 13
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 claims description 13
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- OSNIIMCBVLBNGS-UHFFFAOYSA-N 1-(1,3-benzodioxol-5-yl)-2-(dimethylamino)propan-1-one Chemical compound CN(C)C(C)C(=O)C1=CC=C2OCOC2=C1 OSNIIMCBVLBNGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 58
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 42
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000252870 H3N2 subtype Species 0.000 description 8
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 description 8
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 6
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000197306 H1N1 subtype Species 0.000 description 3
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 3
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 3
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 3
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 2
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940083542 sodium Drugs 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- NRHMKIHPTBHXPF-TUJRSCDTSA-M sodium cholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 NRHMKIHPTBHXPF-TUJRSCDTSA-M 0.000 description 2
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 2
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 108010065868 RNA polymerase SP6 Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- LWZFANDGMFTDAV-BURFUSLBSA-N [(2r)-2-[(2r,3r,4s)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-2-hydroxyethyl] dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O LWZFANDGMFTDAV-BURFUSLBSA-N 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007846 asymmetric PCR Methods 0.000 description 1
- 108010028263 bacteriophage T3 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- NLEBIOOXCVAHBD-QKMCSOCLSA-N dodecyl beta-D-maltoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OCCCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NLEBIOOXCVAHBD-QKMCSOCLSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- SBWGZAXBCCNRTM-CTHBEMJXSA-N n-methyl-n-[(2s,3r,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl]octanamide Chemical compound CCCCCCCC(=O)N(C)C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO SBWGZAXBCCNRTM-CTHBEMJXSA-N 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 1
- 238000004816 paper chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 159000000001 potassium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 235000011067 sorbitan monolaureate Nutrition 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000002888 zwitterionic surfactant Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
(1)エンベロープを有したウイルスを含む試料と、水溶性有機溶媒を少なくとも含む溶液とを接触させて、前記ウイルス由来の核酸を抽出する工程
(2)前記ウイルス由来の核酸中の特定塩基配列の一部と相同的な配列を有するプライマー、前記特定塩基配列の一部と相補的な配列を有するプライマー、および核酸増幅酵素を含む溶液と、前記(1)の工程で抽出した核酸とを反応させて、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅する工程
(3)前記(2)の工程で増幅した核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な標識物質を結合したオリゴヌクレオチド、および前記増幅した核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な固相に結合されたオリゴヌクレオチドで前記増幅した核酸を捕捉することで、前記ウイルス由来の核酸を検出する工程
また本発明の第二の態様は、(1)の工程でエンベロープを有したウイルスを含む試料と接触させる水溶性有機溶媒を含む溶液が、ジメチルスルホキシドを含む溶液である、前記第一の態様に記載の検出方法である。
(A)ジメチルスルホキシドおよび一種類以上の界面活性剤を少なくとも含む、エンベロープを有したウイルス由来の核酸を抽出する試薬
(B)前記ウイルス由来の核酸における特定塩基配列の一部と相同的な配列を有するプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相補的な配列を有するプライマーと、核酸増幅酵素を少なくとも含む、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅する試薬
(C)前記増幅した核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを結合したメンブレン
(D)前記増幅した核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な標識物質を結合したオリゴヌクレオチド
(E)非イオン界面活性剤を少なくとも含むクロマトグラフィー用展開液
また本発明の第八の態様は、前記(E)が、前記(A)と前記(B)との混合物である、前記第七の態様に記載の試薬キットである。
ジメチルスルホキシドおよび一種類以上の界面活性剤を少なくとも含む、エンベロープを有したウイルス由来の核酸を抽出する試薬と、
前記ウイルス由来の核酸における特定塩基配列の一部と相同的な配列を有するプライマー(第一のプライマー)と、前記特定塩基配列の一部と相補的な配列を有するプライマー(第二のプライマー)と、核酸増幅酵素を少なくとも含む、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅する試薬と、
前記増幅した核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド(第二のプローブ)を結合したメンブレン、
前記増幅した核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な標識物質を結合したオリゴヌクレオチド(第一のプローブ)と、
非イオン界面活性剤を少なくとも含むクロマトグラフィー用展開液と、
を含む検出試薬キットがあげられる。なお前記態様のうち、第一のプローブは前記展開液に添加してもよいし、前記メンブレンに塗布してもよい。また前記抽出試薬と前記核酸増幅試薬との混合液中に非イオン界面活性剤を含んでいれば当該混合液をそのまま展開液として用いてもよく、前記混合液に非イオン界面活性剤を含んでいなければ、核酸増幅反応後クロマトグラフィーを行なう前に前記混合液に非イオン界面活性剤を添加して展開液を調製してもよく、前記混合液をメンブレンの一端にスポットした後、非イオン界面活性剤を含む新たな展開液を用いてクロマトグラフィーを行なってもよい。
標識物質として、直径500nmのラテックス粒子Estapor(メルク製)を使用し、以下に示す方法で、当該標識物質をインフルエンザウイルスRNAまたは内部標準核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイス可能なオリゴヌクレオチド(第一のプローブ)に結合させた。
(1)ラテックス粒子1.4×1010個に対し、3’末端側をアミノ基で修飾した配列番号1から4に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれ150ng添加し、30分室温で静置した。なお配列番号1はA型H1N1亜型インフルエンザウイルスRNAを捕捉可能なオリゴヌクレオチドの配列であり、配列番号2はA型H3N2亜型インフルエンザウイルスRNAを捕捉可能なオリゴヌクレオチドの配列であり、配列番号3はB型インフルエンザウイルスRNAを捕捉可能なオリゴヌクレオチドの配列であり、配列番号4は内部標準核酸を捕捉可能なオリゴヌクレオチドの配列である。
(2)さらに水溶性カルボジイミドを終濃度10mg/mLとなるよう添加し、室温で2時間反応させ、ラテックス粒子を当該オリゴヌクレオチドに結合させた。
(3)遠心により得られた沈殿(標識物質を結合した第一のプローブ)は、Tween 20およびSDSを含む溶液により洗浄し、バッファー(0.5mM EDTA、1M NaCl、および0.05% Tween 20を含む10mM Tris−HCl(pH7.4))中に保存した。
固相として、ニトロセルロースメンブレンHF120(メルク製)を台紙(メルク製)に結合させたものを使用し、以下に示す方法で当該メンブレンにインフルエンザウイルスRNAまたは内部標準核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイス可能なオリゴヌクレオチド(第二のプローブ)を結合させた。
(1)配列番号5から7に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド50μMを塗布機を用いて、メンブレンに塗布した。なお配列番号5はA型(H1N1亜型およびH3N2亜型)インフルエンザウイルスRNAを捕捉可能なオリゴヌクレオチドの配列であり、配列番号6はB型インフルエンザウイルスRNAを捕捉可能なオリゴヌクレオチドの配列であり、配列番号7は内部標準核酸を捕捉可能なオリゴヌクレオチドの配列である。
(2)UVを2分間照射後、37℃で2時間乾燥することで、前記オリゴヌクレオチドをメンブレンに結合させた。
本発明の検出方法を用いて、試料中に含まれるインフルエンザウイルスの検出を試みた。
(1)A型H3N2亜型インフルエンザウイルス(A/Texas/50/2012、ZeptoMetrix製)を、注射用水を用いて5×100TCID50/mL、5×10−1TCID50/mLおよび5×10−2TCID50/mLとなるよう希釈することで、各濃度のA型インフルエンザウイルス試料を調製し、B型インフルエンザウイルス(B/Massachusetts/2/2012、ZeptoMetrix製)を、注射用水を用いて5×101TCID50/mLおよび5×100TCID50/mLとなるよう希釈することで、各濃度のB型インフルエンザウイルス試料を調製した。
(2)FLOQスワブ(シン・コーポレイション製)を用いて咽頭部分を擦過し、これを注射水100μLに懸濁することで咽頭ぬぐい液を調製した。
(3)(1)で調製した各ウイルス試料11μLに、(2)で調製した咽頭ぬぐい液0.75μLおよび以下の組成からなるウイルス抽出液3.25μLを添加し、撹拌した。
21.2mM 塩化マグネシウム
102.7mM 塩化カリウム
1.15% グリセロール
11.5% ジメチルスルホキシド
0.01% ドデシル硫酸ナトリウム
(4)以下の組成からなる反応液10μLを0.5mL容量PCR用チューブ(GeneAmp Thin−Walled Reaction Tubes、ライフテクノロジーズ製)に分注した。なお第一のプライマーおよび第二のプライマーは、それぞれ表1に示す配列からなるオリゴヌクレオチドおよび濃度とし、第一のプライマーの5’末端側にはT7プロモーター配列(配列番号8)を付加した。また表1に示す第一および第二のプライマーのうち、内部標準核酸およびA型H1N1亜型インフルエンザウイルスRNAを増幅するためのプライマーは配列番号9および12に記載の配列からなるプライマーであり、A型H3N2亜型インフルエンザウイルスを増幅するためのプライマーは配列番号10および13に記載の配列からなるプライマーであり、B型インフルエンザウイルスを増幅するためのプライマーは配列番号11および14に記載の配列からなるプライマーである。
60mM Tris−HCl(pH8.6)
各0.25mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP
各2.6mM ATP、CTP、UTP、GTP
3.06mM ITP
90mM トレハロース
6.4U AMV逆転写酵素
142U T7 RNAポリメラーゼ
104コピー 内部標準(配列番号15)
第一のプライマー(濃度および配列は表1参照)
第二のプライマー(濃度および配列は表1参照)
21.2mM 塩化マグネシウム
102.7mM 塩化カリウム
1.2% グリセロール
11.5% ジメチルスルホキシド
0.5% Tween 20
(6)開始液添加時から8分後、実施例1で作製した第一のプローブを含む溶液を添加し、さらに実施例2で作製した第二のプローブを結合した固相をPCRチューブに入れ、クロマトグラフィーを2分間実施した。
Claims (8)
- 以下の(1)から(3)に示す工程を含む、エンベロープを有したウイルスの検出方法。
(1)エンベロープを有したウイルスを含む試料と、水溶性有機溶媒を少なくとも含む溶液とを接触させて、前記ウイルス由来の核酸を抽出する工程
(2)前記ウイルス由来の核酸中の特定塩基配列の一部と相同的な配列を有するプライマー、前記特定塩基配列の一部と相補的な配列を有するプライマー、および核酸増幅酵素を含む溶液と、前記(1)の工程で抽出した核酸とを反応させて、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅する工程
(3)前記(2)の工程で増幅した核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な標識物質を結合したオリゴヌクレオチド、および前記増幅した核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な固相に結合されたオリゴヌクレオチドで前記増幅した核酸を捕捉することで、前記ウイルス由来の核酸を検出する工程 - (1)の工程でエンベロープを有したウイルスを含む試料と接触させる水溶性有機溶媒を含む溶液が、ジメチルスルホキシドを含む溶液である、請求項1に記載の検出方法。
- (1)の工程でエンベロープを有したウイルスを含む試料と接触させる水溶性有機溶媒を含む溶液が、さらに一種類以上の界面活性剤を含む溶液である、請求項2に記載の検出方法。
- (3)の工程における固相がメンブレンであり、(2)の工程で増幅した核酸の捕捉を展開液を用いたクロマトグラフィーにより行なう、請求項1から3のいずれかに記載の検出方法。
- 展開液が非イオン界面活性剤を少なくとも含む、請求項4に記載の検出方法。
- エンベロープを有したウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項1から5のいずれかに記載の検出方法。
- 以下の(A)から(E)に示す試薬を含む、エンベロープを有したウイルスの検出試薬キット。
(A)ジメチルスルホキシドおよび一種類以上の界面活性剤を少なくとも含む、エンベロープを有したウイルス由来の核酸を抽出する試薬
(B)前記ウイルス由来の核酸における特定塩基配列の一部と相同的な配列を有するプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相補的な配列を有するプライマーと、核酸増幅酵素を少なくとも含む、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅する試薬
(C)前記増幅した核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを結合したメンブレン
(D)前記増幅した核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な標識物質を結合したオリゴヌクレオチド
(E)非イオン界面活性剤を少なくとも含むクロマトグラフィー用展開液 - 前記(E)が、前記(A)と前記(B)との混合物である、請求項7に記載の試薬キット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015148551A JP6679852B2 (ja) | 2015-07-28 | 2015-07-28 | 核酸の検出方法および当該方法を利用した試薬キット |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015148551A JP6679852B2 (ja) | 2015-07-28 | 2015-07-28 | 核酸の検出方法および当該方法を利用した試薬キット |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017023110A true JP2017023110A (ja) | 2017-02-02 |
JP6679852B2 JP6679852B2 (ja) | 2020-04-15 |
Family
ID=57944674
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015148551A Active JP6679852B2 (ja) | 2015-07-28 | 2015-07-28 | 核酸の検出方法および当該方法を利用した試薬キット |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6679852B2 (ja) |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001157598A (ja) * | 1999-12-01 | 2001-06-12 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 遺伝子検出方法およびその方法を利用した装置 |
KR20040037342A (ko) * | 2002-10-28 | 2004-05-07 | 주식회사 바이오세움 | 바이러스 핵산 추출용 조성물 |
JP2006158283A (ja) * | 2004-12-07 | 2006-06-22 | Sysmex Corp | 生体試料処理液、生体試料処理液を用いた核酸増幅反応用試料調製方法及び標的核酸検出方法。 |
JP2006201062A (ja) * | 2005-01-21 | 2006-08-03 | Kainosu:Kk | 核酸の検出あるいは定量方法 |
WO2012032794A1 (ja) * | 2010-09-08 | 2012-03-15 | 田中貴金属工業株式会社 | 核酸又は免疫クロマトグラフィー用試薬組成物、核酸又は免疫クロマトグラフィー測定方法及び核酸又は免疫クロマトグラフィー測定用キット |
JP2012523851A (ja) * | 2009-04-20 | 2012-10-11 | ロングホーン・バクシーンズ・アンド・ダイアグノステイツクス・エル・エル・シー | 生物試料回収/輸送組成物および方法 |
WO2013002354A1 (ja) * | 2011-06-29 | 2013-01-03 | 株式会社ダナフォーム | 生体試料の前処理方法、rnaの検出方法及び前処理キット |
JP2013247968A (ja) * | 2010-11-24 | 2013-12-12 | Kaneka Corp | 増幅核酸検出方法及び検出デバイス |
WO2014007289A1 (ja) * | 2012-07-05 | 2014-01-09 | 日本碍子株式会社 | 核酸クロマトグラフィー法、核酸クロマトグラフィー用組成物及びこれを含むキット |
-
2015
- 2015-07-28 JP JP2015148551A patent/JP6679852B2/ja active Active
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001157598A (ja) * | 1999-12-01 | 2001-06-12 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 遺伝子検出方法およびその方法を利用した装置 |
KR20040037342A (ko) * | 2002-10-28 | 2004-05-07 | 주식회사 바이오세움 | 바이러스 핵산 추출용 조성물 |
JP2006158283A (ja) * | 2004-12-07 | 2006-06-22 | Sysmex Corp | 生体試料処理液、生体試料処理液を用いた核酸増幅反応用試料調製方法及び標的核酸検出方法。 |
JP2006201062A (ja) * | 2005-01-21 | 2006-08-03 | Kainosu:Kk | 核酸の検出あるいは定量方法 |
JP2012523851A (ja) * | 2009-04-20 | 2012-10-11 | ロングホーン・バクシーンズ・アンド・ダイアグノステイツクス・エル・エル・シー | 生物試料回収/輸送組成物および方法 |
WO2012032794A1 (ja) * | 2010-09-08 | 2012-03-15 | 田中貴金属工業株式会社 | 核酸又は免疫クロマトグラフィー用試薬組成物、核酸又は免疫クロマトグラフィー測定方法及び核酸又は免疫クロマトグラフィー測定用キット |
JP2013247968A (ja) * | 2010-11-24 | 2013-12-12 | Kaneka Corp | 増幅核酸検出方法及び検出デバイス |
WO2013002354A1 (ja) * | 2011-06-29 | 2013-01-03 | 株式会社ダナフォーム | 生体試料の前処理方法、rnaの検出方法及び前処理キット |
WO2014007289A1 (ja) * | 2012-07-05 | 2014-01-09 | 日本碍子株式会社 | 核酸クロマトグラフィー法、核酸クロマトグラフィー用組成物及びこれを含むキット |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP6679852B2 (ja) | 2020-04-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20240068015A1 (en) | Nucleic Acid Detection System And Method For Detecting Influenza | |
JP6760983B2 (ja) | ウイルスおよび細菌病原体の直接増幅および検出 | |
Ali et al. | Simultaneous detection of multiple viruses based on chemiluminescence and magnetic separation | |
JP6329370B2 (ja) | 呼吸器系ウイルスによる疾患の同時診断キット | |
WO2017212904A1 (ja) | 複数のプライマーセットを組み合わせたlamp法を用いたアフリカ豚コレラウイルスの迅速検出法 | |
WO2005121367A1 (en) | Diagnostic primers and method for detecting avian influenza virus subtype h5 and h5n1 | |
JP2004509648A (ja) | 非病原性又は病原性インフルエンザaサブタイプh5ウイルス検出キット | |
US20050202414A1 (en) | Apparatus and methods for detecting a microbe in a sample | |
JP6387606B2 (ja) | 核酸の検出方法 | |
JP2016182112A (ja) | ウイルスからの核酸抽出試薬 | |
Park et al. | Membrane Rigidity‐Tunable Fusogenic Nanosensor for High Throughput Detection of Fusion‐Competent Influenza A Virus | |
KR20200056831A (ko) | 인플루엔자 바이러스 검출용 프라이머 세트, 이를 포함하는 검출용 키트 및 이를 이용한 검출 방법 | |
JP6507791B2 (ja) | 核酸の検出方法 | |
US20210340635A1 (en) | Materials and methods for detecting coronavirus | |
WO2006132601A1 (en) | Diagnostic primers and method for detecting avian influenza virus subtype h5 and h5n1 | |
JP6679852B2 (ja) | 核酸の検出方法および当該方法を利用した試薬キット | |
JP2018000124A (ja) | ウイルスからの核酸抽出増幅キット及びそれを用いた抽出増幅方法 | |
JP2021528089A (ja) | 試料調製法およびシステム | |
WO2019133727A1 (en) | Universal influenza virus probe set for enrichment of any influenza virus nucleic acid | |
Rodrigo et al. | Electrochemical microarray for identification pathogens: a review | |
CN101333559B (zh) | 乙肝e抗原免疫逃避检测基因芯片及其试剂盒 | |
EP3933052A1 (en) | Rapid detection kit for human pathogenic coronaviruses : betacoronavirus group b/c and sars-cov-2 | |
RU2538168C2 (ru) | Наборы олигонуклеотидов-праймеров и зондов, биологический микрочип и тест-система для идентификации и типирования вируса гриппа а и в с их использованием | |
JP2011072222A (ja) | 標的核酸の検出方法 | |
WO2008000023A1 (en) | Detection of influenza virus |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180612 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190903 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191003 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20191112 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191206 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200218 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200302 |
|
R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 6679852 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |