ES2372477T3 - Interacciones de unión mejorada en ensayos con tiras reactivas. - Google Patents

Interacciones de unión mejorada en ensayos con tiras reactivas. Download PDF

Info

Publication number
ES2372477T3
ES2372477T3 ES01947639T ES01947639T ES2372477T3 ES 2372477 T3 ES2372477 T3 ES 2372477T3 ES 01947639 T ES01947639 T ES 01947639T ES 01947639 T ES01947639 T ES 01947639T ES 2372477 T3 ES2372477 T3 ES 2372477T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
probe
capture
detection
nucleic acid
target nucleic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES01947639T
Other languages
English (en)
Inventor
Helen Lee
Magda Anastassova Dineva
Hsiang Yun Hu
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Diagnostics for the Real World Ltd
Original Assignee
Diagnostics for the Real World Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Diagnostics for the Real World Ltd filed Critical Diagnostics for the Real World Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2372477T3 publication Critical patent/ES2372477T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measurement Of Length, Angles, Or The Like Using Electric Or Magnetic Means (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

Una tira reactiva para analizar la presencia de un acido nucleico objetivo en una disoluci6n de muestra que comprende: una tira cromatografica que tiene un extremo de contacto para su puesta en contacto con la disoluci6n de muestra; y una sonda de captura inmovilizada en una zona de captura de la tira cromatografica alejada del extremo de contacto, y la sonda de captura es capaz de hibridar al acido nucleico objetivo o a una sonda de captura de enganche unida al acido nucleico objetivo, en la que la sonda de captura esta unida a un separador de la sonda de captura y el separador de la sonda de captura esta unido a la zona de captura, por lo que inmoviliza la sonda de captura en la zona de captura y separa la sonda de captura de la zona de captura, caracterizadaºporuue: i) el separador de la sonda de captura esta unido a un extremo de la sonda de captura, y el extremo de la sonda de captura que no esta unido al separador de la sonda de captura esta acoplado a uno o mas nucle6tidos que no hibridan al acido nucleico objetivo cuando la sonda de captura ha hibridado al acido nucleico objetivo o a la sonda de captura de enganche cuando la sonda de captura ha hibridado a la sonda de captura de enganche; ii) el separador de la sonda de captura esta unido a una parte de la sonda de captura entre los extremos de la sonda de captura, y uno o ambos extremos de la sonda de captura estan acoplados a uno o mas nucle6tidos que no hibridan al acido nucleico objetivo cuando la sonda de captura ha hibridado al acido nucleico objetivo o a la sonda de captura de enganche cuando la sonda de captura ha hibridado a la sonda de captura de enganche; iii) el separador de la sonda de captura comprende: un nucle6tido que comprende una nucleobase capaz de formar una interacci6n por apilamiento con un par de bases formado cuando la sonda de captura ha hibridado al acido nucleico objetivo o a la sonda de captura de enganche; fosfato de 3hidroxipropilo; o fosfato de hexaetilen glicol; o iv) el separador de la sonda de captura comprende una proteina adsorbida directamente en la zona de captura, y unida covalentemente a la sonda de captura mediante un ligador

Description

Interacciones de uni6n mejorada en ensayos con tiras reactivas.
La presente invenci6n se refiere a la detecci6n mejorada de acidos nucleicos mediante tiras reactivas. Las tiras reactivas de la invenci6n se usan para detectar la presencia de un acido nucleico objetivo en una disoluci6n de mues5 tra, por ejemplo para identificar si un paciente esta infectado con un microorganismo pat6geno, tal como Chlamydia trachomatis.
Algunos ensayos convencionales para la detecci6n de la presencia de un acido nucleico objetivo en una disoluci6n de muestra se basan en la amplificaci6n del acido nucleico objetivo mediante el uso de la reacci6n en cadena de la polimerasa (PCR). Aunque esta reacci6n permite la detecci6n de pequenas cantidades del acido nucleico objetivo,
10 puede implicar varias horas antes de que se obtenga un resultado. Esto puede ser una desventaja significativa, debido a que a menudo se desea obtener el resultado tan rapidamente como sea posible, por ejemplo, para mantener al minimo los tiempos de espera de los pacientes. Otras desventajas adicionales de tales metodos son la necesidad de un equipo especializado costoso para llevar a cabo la reacci6n, y el coste relativamente elevado de los reactivos.
15 En contraste, las tiras reactivas detectan el acido nucleico objetivo sin amplificar sin la necesidad de ningun equipo especializado, y los resultados se pueden obtener mucho mas rapidamente que en los metodos basados en PCR. Los pacientes se pueden tratar asi en la misma visita. Esto es especialmente ventajoso cuando es poco probable que el paciente vuelva en una fecha posterior, o no pueda hacerlo.
En una tira reactiva convencional tipica descrita en el documento US 5.310.650, se inmoviliza una sonda de captura
20 de ADN monocatenario en un filtro de nitrocelulosa en una zona de captura alejada de un extremo del filtro (el extremo de contacto). Parte de la secuencia de la sonda de captura es complementaria a la secuencia de una primera regi6n del acido nucleico objetivo a detectar. Una sonda de detecci6n de ADN monocatenario marcada esta inmovilizada en el filtro de nitrocelulosa en una zona de la sonda localizada entre la zona de captura y el extremo de contacto del filtro. La sonda de detecci6n tiene una secuencia complementaria a la secuencia de una segunda regi6n
25 (distinta de la primera regi6n) del acido nucleico objetivo.
Para detectar el ADN objetivo en una disoluci6n de muestra que se piensa que contiene el ADN objetivo, el extremo de contacto del filtro de nitrocelulosa se pone en contacto con la disoluci6n de muestra. La disoluci6n de muestra impregna el filtro mediante acci6n capilar, y pasa por la zona de la sonda y la zona de captura. A medida que la disoluci6n de muestra pasa por la zona de la sonda, moviliza la sonda de detecci6n y provoca que se eleve con la
30 disoluci6n de muestra hacia la zona de captura. La sonda de detecci6n movilizada puede hibridar despues a la segunda regi6n de cualquier ADN objetivo presente en la disoluci6n de muestra.
Cuando la sonda de detecci6n hibridada y el ADN objetivo llegan a la zona de captura, la primera regi6n del ADN objetivo puede hibridar a la sonda de captura inmovilizada. Se forma, por tanto, un complejo ternario entre el acido nucleico objetivo, la sonda de captura y la sonda de detecci6n marcada. La presencia de un marcador en la zona de
35 captura, por lo tanto, indica que el ADN objetivo esta presente en la disoluci6n de muestra.
Con un segundo tipo de tira reactiva convencional, la sonda de detecci6n de ADN marcada no esta inmovilizada en el filtro de nitrocelulosa. En su lugar, se anade la sonda de detecci6n a la disoluci6n de muestra en condiciones que permiten la hibridaci6n de la sonda de detecci6n a cualquier acido nucleico objetivo en la disoluci6n de muestra. El extremo de contacto del filtro de nitrocelulosa se pone en contacto despues con la disoluci6n de muestra, y a medida
40 que la disoluci6n de muestra impregna la tira reactiva, el acido nucleico objetivo que esta hibridado a la sonda de detecci6n es capturado en la zona de captura por la sonda de captura.
Sin embargo, se ha descubierto que la sensibilidad de la detecci6n de acidos nucleicos mediante tiras reactivas convencionales puede ser baja. Si el acido nucleico objetivo es bicatenario, la sensibilidad de la detecci6n mediante tiras reactivas puede ser especialmente baja. Por lo tanto, a veces puede no detectarse la presencia del acido nu
45 cleico objetivo en una disoluci6n de muestra. Se desea, por lo tanto, mejorar la sensibilidad de la detecci6n de acidos nucleicos objetivo mediante tiras reactivas.
Segun un primer aspecto de la invenci6n, se proporciona una tira reactiva para analizar la presencia de un acido nucleico objetivo en una disoluci6n de muestra que comprende:
una tira cromatografica que tiene un extremo de contacto para su puesta en contacto con la disoluci6n de muestra; y
50 una sonda de captura inmovilizada en una zona de captura de la tira cromatografica alejada del extremo de contacto, y la sonda de captura es capaz de hibridar al acido nucleico objetivo o a una sonda de captura de enganche unida al acido nucleico objetivo, en la que la sonda de captura esta unida a un separador de la sonda de captura y el separador de la sonda de captura esta unido a la zona de captura, por lo que inmoviliza la sonda de captura en la zona de captura y separa la sonda de captura de la zona de captura, caracterizada porque:
E01947639 23-11-2011
i) el separador de la sonda de captura esta unido a un extremo de la sonda de captura, y el extremo de la sonda de captura que no esta unido al separador de la sonda de captura esta acoplado a uno o mas nucle6tidos que no hibridan al acido nucleico objetivo cuando la sonda de captura ha hibridado al acido nucleico objetivo o a la sonda de captura de enganche cuando la sonda de captura ha hibridado a la sonda de captura de enganche;
ii) el separador de la sonda de captura esta unido a una parte de la sonda de captura entre los extremos de la sonda de captura, y uno o ambos extremos de la sonda de captura estan acoplados a uno o mas nucle6tidos que no hibridan al acido nucleico objetivo cuando la sonda de captura ha hibridado al acido nucleico objetivo o a la sonda de captura de enganche cuando la sonda de captura ha hibridado a la sonda de captura de enganche;
iii) el separador de la sonda de captura comprende: un nucle6tido que comprende una nucleobase capaz de formar una interacci6n por apilamiento con un par de bases formado cuando la sonda de captura ha hibridado al acido nucleico objetivo o a la sonda de captura de enganche; fosfato de 3hidroxipropilo; o fosfato de hexaetilen glicol; o
iv) el separador de la sonda de captura comprende una proteina adsorbida directamente en la zona de captura, y unida covalentemente a la sonda de captura mediante un ligador.
La expresi6n "tira cromatografica" se usa en la presente memoria para significar cualquier tira porosa de un material capaz de transportar una disoluci6n por capilaridad.
El separador de la sonda de captura puede comprender cualquier componente que separe la sonda de captura de la zona de captura sin impedir que la sonda de captura pueda hibridar al acido nucleico objetivo o a la sonda de captura de enganche. Preferiblemente, el separador de la sonda de captura comprende un biopolimero.
El separador de la sonda de captura puede comprender una proteina. El termino "proteina" se usa en la presente memoria para significar cualquier compuesto que comprende uno o mas residuos de aminoacidos. Los ejemplos de proteinas preferidas son las proteinas que se dan de manera natural, preferiblemente albumina de suero bovino (BSA), tiroglobulina, o derivados de las mismas. Los derivados incluyen proteinas que difieren de BSA o tiroglobulina por la sustituci6n, adici6n o deleci6n de aminoacidos, o por la modificaci6n posttraduccional.
Para unir la sonda de captura al separador proteico sera necesario en general funcionalizar la sonda de captura. Esto se puede llevar a cabo mediante el uso de un modificador que comprende un primer grupo reactivo capaz de reaccionar con la sonda de captura y un segundo grupo reactivo capaz de reaccionar con la proteina. Un modificador adecuado comprende un grupo fosforamidita y un grupo amino primario (o un grupo amino primario protegido que se desprotege antes del uso). El grupo fosforamidita es capaz de reaccionar con un grupo hidroxilo (normalmente el 5'OH o el 3'OH de la sonda de captura cuando la sonda de captura es un acido nucleico) y el grupo amino primario es capaz de reaccionar con un grupo carboxilo de la proteina. Un ejemplo de un modificador adecuado es 6(Trifluoroacetilamino)hexil(2cianoetil)(N,Ndiisopropil)fosforamidita (C6TFA). Otros modificadores adecuados seran conocidos para las personas de experiencia habitual en la tecnica.
Una vez que el modificador ha reaccionado con la sonda de captura y la proteina para unir la sonda de captura a la proteina, el modificador reaccionado se denomina en la presente memoria "ligador".
Preferiblemente, la proteina se adsorbe directamente en la zona de captura.
En las tiras reactivas convencionales, la sonda de detecci6n o la sonda de captura se inmoviliza en la tira reactiva mediante uni6n covalente, adsorci6n, el uso de calor o mediante entrecruzamiento UV. Sin embargo, se ha descubierto que las proteinas se pueden inmovilizar en la tira reactiva de manera mas facil y eficaz que la sonda de captura. Por lo tanto, la adsorci6n directa de la proteina en la zona de captura es un medio mas conveniente y eficaz de inmovilizar la sonda de captura en la tira reactiva que la inmovilizaci6n convencional.
El separador de la sonda de captura puede comprender una molecula no proteica. En una disposici6n preferida, el separador de la sonda de captura comprende una proteina y una molecula no proteica, y la sonda de captura esta acoplada a la molecula no proteica y la molecula no proteica esta acoplada a la proteina, por lo que separa la sonda de captura de la proteina.
Para unir la molecula no proteica a la proteina sera necesario en general usar un modificador que comprende un primer grupo reactivo capaz de reaccionar con la molecula no proteica y un segundo grupo reactivo capaz de reaccionar con la proteina.
Un modificador adecuado para el uso con moleculas no proteicas que comprenden un grupo hidroxilo es 6(Trifluoroacetilamino) hexil(2cianoetil)(N,Ndiisopropil)fosforamidita (C6TFA). Otros modificadores adecuados seran conocidos para las personas de experiencia habitual en la tecnica.
Una vez que el modificador ha reaccionado con la molecula no proteica y la proteina para unir la molecula no proteica a la proteina, el modificador reaccionado en denomina en la presente memoria "ligador".
Los ejemplos de componentes de separadores no proteicos adecuados incluyen fosfato de 1',2'didesoxirribosa (dS), 3
E01947639 23-11-2011
fosfato de 3hidroxipropilo (SC3), y fosfato de hexaetilenglicol (S). Las estructuras quimicas de estos compuestos se muestran en la Figura 1.
Preferiblemente, sin embargo, la molecula no proteica comprende una nucleobase capaz de formar una interacci6n por apilamiento con un par de bases formado cuando la sonda de captura ha hibridado al acido nucleico objetivo o a la sonda de captura de enganche. Mas preferiblemente, la molecula no proteica comprende un nucle6tido. Lo mas preferiblemente, la molecula no proteica consiste solamente en uno o mas nucle6tidos.
Preferiblemente, la molecula no proteica tiene una longitud de al menos tres mon6meros de nucle6tido. La longitud de un mon6mero de nucle6tido (N) es aproximadamente igual a la longitud de un fosfato de 1',2'didesoxirribosa (dS)
o un fosfato de 3hidroxipropilo (SC3). Tres mon6meros de nucle6tido son aproximadamente iguales a la longitud de un fosfato de hexaetilenglicol (S).
El separador de la sonda de captura se puede unir a cualquier parte de la sonda de captura que no impida que la sonda de captura hibride al acido nucleico objetivo o a la sonda de captura de enganche.
La sonda de captura de enganche puede comprender una primera regi6n capaz de hibridar al acido nucleico objetivo y una segunda regi6n capaz de hibridar a la sonda de captura, por lo que posibilita la uni6n indirecta de la sonda de captura al acido nucleico objetivo. La sonda de captura de enganche puede comprender al menos un acido nucleico
o analogo de acido nucleico.
Las tiras reactivas del primer aspecto de la invenci6n se pueden usar en metodos para analizar la presencia de un acido nucleico objetivo en una disoluci6n de muestra en los que una sonda de detecci6n capaz de hibridar al acido nucleico objetivo se incuba con la disoluci6n de muestra en condiciones para la hibridaci6n de la sonda de detecci6n al acido nucleico objetivo. El extremo de contacto de la tira reactiva se pone en contacto con la disoluci6n de muestra, lo que permite que la disoluci6n de muestra suba por la tira reactiva mediante acci6n capilar. El acido nucleico objetivo hibridado a la sonda de detecci6n en la disoluci6n de muestra puede ser capturado despues por la sonda de captura en la zona de captura. La presencia del acido nucleico objetivo en la disoluci6n de muestra se indica entonces por la presencia de la sonda de detecci6n en la zona de captura.
Por lo tanto, la invenci6n tambien proporciona un equipo para analizar la presencia de un acido nucleico objetivo en una disoluci6n de muestra que comprende:
una tira reactiva del primer aspecto de la invenci6n; y
una sonda de detecci6n capaz de hibridar al acido nucleico objetivo, por lo que permite la detecci6n del acido nucleico objetivo mediante la utilizaci6n de la sonda de detecci6n.
En vez de incubar la sonda de detecci6n con la disoluci6n de muestra, la sonda de detecci6n puede estar inmovilizada de manera liberable en la tira reactiva, por ejemplo en una zona de la sonda entre el extremo de contacto y la zona de captura de la tira cromatografica. Para analizar la presencia del acido nucleico objetivo en una disoluci6n de muestra, el extremo de contacto de la tira reactiva se puede poner en contacto con la disoluci6n de muestra, de manera que la disoluci6n de muestra impregne la tira reactiva mediante acci6n capilar. A medida que la disoluci6n de muestra pasa por la zona de la sonda de la tira reactiva, moviliza la sonda de detecci6n de manera que la sonda de detecci6n puede hibridar al acido nucleico objetivo de la disoluci6n de muestra y moverse con el acido nucleico objetivo hacia la zona de captura. El acido nucleico objetivo hibridado a la sonda de detecci6n es capturado por la sonda de captura a medida que la disoluci6n de muestra pasa por la zona de captura. La presencia del acido nucleico objetivo en la disoluci6n de muestra se indica entonces por la presencia de la sonda de detecci6n en la zona de captura.
La sonda de detecci6n puede estar acoplada a un marcador, por lo que permite la detecci6n directa del acido nucleico objetivo en la zona de captura. De manera alternativa, la sonda de detecci6n puede estar acoplada a un ligando de detecci6n que permite la detecci6n indirecta del acido nucleico objetivo mediante el uso de un resto de uni6n al ligando de detecci6n. El marcador o el ligando de detecci6n puede estar unido a un separador de la sonda de detecci6n que esta unido a la sonda de detecci6n, por lo que acopla el marcador o el ligando de detecci6n a la sonda de detecci6n y separa el marcador o el ligando de detecci6n de la sonda de detecci6n.
Segun un segundo aspecto de la invenci6n, se proporciona una tira reactiva para analizar la presencia de un acido nucleico objetivo en una disoluci6n de muestra que comprende:
una tira cromatografica que tiene un extremo de contacto para su puesta en contacto con la disoluci6n de muestra;
un resto de captura, inmovilizado en una zona de captura alejada del extremo de contacto, y el resto de captura es capaz de unirse directamente o indirectamente al acido nucleico objetivo; y una sonda de detecci6n, inmovilizada de manera liberable en una zona de la sonda localizada entre el extremo de contacto y la zona de captura, y la sonda de detecci6n es capaz de hibridar al acido nucleico objetivo, y la sonda de detecci6n esta acoplada a un marcador que permite la detecci6n directa de la sonda de detecci6n, o la sonda de detecci6n esta acoplada a un ligando de
E01947639 23-11-2011
detecci6n que permite la detecci6n indirecta de la sonda de detecci6n;
en la que el marcador o el ligando de detecci6n esta unido a un separador de la sonda de detecci6n, y el separador de la sonda de detecci6n esta unido a la sonda de detecci6n, por lo que acoplael marcador o el ligando de detecci6n a la sonda de detecci6n y separa el marcador o el ligando de detecci6n de la sonda de detecci6n, y
en la que:
i) el separador de la sonda de detecci6n esta unido a un extremo de la sonda de detecci6n, y el extremo de la sonda de detecci6n que no esta unido al separador de la sonda de detecci6n esta acoplado a uno o mas nucle6tidos que no hibridan al acido nucleico objetivo cuando la sonda de detecci6n ha hibridado al acido nucleico objetivo;
ii) el separador de la sonda de detecci6n esta unido a una parte de la sonda de detecci6n entre los extremos de la sonda de detecci6n, y uno o ambos extremos de la sonda de detecci6n estan acoplados a uno o mas nucle6tidos que no hibridan al acido nucleico objetivo cuando la sonda de detecci6n ha hibridado al acido nucleico objetivo;
iii) el separador de la sonda de detecci6n comprende: un nucle6tido que comprende una nucleobase capaz de formar una interacci6n por apilamiento con un par de bases formado cuando la sonda de detecci6n ha hibridado al acido nucleico objetivo; fosfato de 3hidroxipropilo; o fosfato de hexaetilen glicol; o iv) el separador de la sonda de detecci6n comprende una proteina.
El separador de la sonda de detecci6n puede comprender cualquier componente que separe la sonda de detecci6n del marcador o del ligando sin impedir que la sonda de detecci6n pueda hibridar al acido nucleico objetivo. Preferiblemente, el separador de la sonda de detecci6n comprende un biopolimero.
El separador de la sonda de detecci6n puede comprender una proteina. El termino "proteina" se usa en la presente memoria para significar cualquier compuesto que comprende uno o mas residuos de aminoacidos. Los ejemplos de proteinas preferidas son las proteinas que se dan de manera natural, tales como albumina de suero bovino (BSA), tiroglobulina, o derivados de las mismas. Los derivados incluyen proteinas que difieren de BSA o tiroglobulina por la sustituci6n, adici6n o deleci6n de aminoacidos, o por la modificaci6n posttraduccional.
Para unir la sonda de detecci6n al separador proteico sera necesario en general funcionalizar la sonda de detecci6n. Esto se puede llevar a cabo mediante el uso de un modificador que comprende un primer grupo reactivo capaz de reaccionar con la sonda de detecci6n y un segundo grupo reactivo capaz de reaccionar con la proteina.
Un ejemplo de un modificador adecuado es 6(Trifluoroacetilamino)hexil(2cianoetil)(N,Ndiisopropil)fosforamidita (C6TFA). Otros modificadores adecuados seran conocidos para las personas de experiencia habitual en la tecnica.
Una vez que el modificador ha reaccionado con la sonda de detecci6n y la proteina para unir la sonda de detecci6n a la proteina, el modificador reaccionado se denomina en la presente memoria "ligador".
El marcador o el ligando de detecci6n pueden ser parte de, o estar unidos a, una particula tal como una microesfera. En tales casos, preferiblemente, la proteina esta adsorbida directamente en el marcador o el ligando de detecci6n.
El separador de la sonda de detecci6n puede comprender una molecula no proteica. En una disposici6n preferida, el separador de la sonda de detecci6n comprende una proteina y una molecula no proteica, y la sonda de detecci6n esta acoplada a la molecula no proteica y la molecula no proteica esta acoplada a la proteina, por lo que separa la sonda de detecci6n de la proteina.
Para unir la molecula no proteica a la proteina sera necesario en general usar un modificador que comprende un primer grupo reactivo capaz de reaccionar con la molecula no proteica y un segundo grupo reactivo capaz de reaccionar con la proteina. Un ejemplo de un modificador adecuado para el uso con moleculas no proteicas que comprenden un grupo hidroxilo es 6(Trifluoroacetilamino) hexil(2cianoetil)(N,Ndiisopropil)fosforamidita (C6TFA). Otros modificadores adecuados seran conocidos para las personas de experiencia habitual en la tecnica.
Una vez que el modificador ha reaccionado con la molecula no proteica y la proteina para unir la molecula no proteica a la proteina, el modificador reaccionado en denomina en la presente memoria "ligador".
En otras disposiciones, el separador de la sonda de detecci6n comprende una molecula no proteica unicamente. Con tales disposiciones, sera necesario en general funcionalizar la molecula no proteica para unir la molecula no proteica al marcador o al ligando de detecci6n. Esto se puede llevar a cabo mediante el uso de un modificador que comprende un primer grupo reactivo capaz de reaccionar con la molecula no proteica y un segundo grupo reactivo capaz de reaccionar con el marcador o el ligando de detecci6n.
Si la molecula no proteica comprende un grupo hidroxilo y el marcador o el ligando de detecci6n comprende un grupo carboxilo, un modificador adecuado comprende un grupo fosforamidita y un grupo amino primario (o un grupo amino primario protegido que se desprotege antes del uso). 6(Trifluoroacetilamino)hexil(2cianoetil)(N,Ndiisopropil)fosforamidita (C6TFA) es un ejemplo adecuado. Otros modificadores adecuados seran conocidos para
E01947639 23-11-2011
las personas de experiencia habitual en la tecnica.
Los ejemplos de componentes separadores de la sonda de detecci6n no proteicos adecuados incluyen fosfato de 1',2'Didesoxirribosa (dS), fosfato de 3Hidroxipropilo (SC3), y fosfato de Hexaetilenglicol (S).
Preferiblemente, sin embargo, la molecula no proteica comprende una base capaz de formar una interacci6n por apilamiento con un par de bases formado cuando la sonda de detecci6n ha hibridado al acido nucleico objetivo. Mas preferiblemente, la molecula no proteica comprende un nucle6tido. Lo mas preferiblemente, la molecula no proteica consiste solamente en uno o mas nucle6tidos.
Preferiblemente, la molecula no proteica tiene una longitud de al menos tres nucle6tidos.
El separador de la sonda de detecci6n se puede unir en cualquier parte de la sonda de detecci6n que no impida que la sonda de detecci6n hibride al acido nucleico objetivo.
El resto de captura puede ser capaz de unirse directamente o indirectamente al acido nucleico objetivo mediante emparejamiento de bases o una interacci6n que no sea por emparejamiento de bases.
Por ejemplo, el resto de captura puede comprender una sonda de captura capaz de hibridar directamente al acido nucleico objetivo. De manera alternativa, el resto de captura puede comprender una sonda de captura capaz de hibridar a una sonda de captura de enganche unida al acido nucleico objetivo.
El resto de captura puede ser capaz de unirse a un ligando de captura acoplado a una sonda de captura unida al acido nucleico objetivo, por lo que permite la uni6n indirecta del resto de captura al acido nucleico objetivo. Por ejemplo, el resto de captura puede ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Si la sonda de captura esta acoplada a un ligando de captura, la sonda de captura puede estar unida a un separador de la sonda de captura que esta unido al ligando de captura para separar el ligando de captura de la sonda de captura.
La sonda de captura de enganche se puede anadir a la disoluci6n de muestra de manera que se pueda unir al acido nucleico objetivo en la disoluci6n de muestra y pueda ser capturada por la sonda de captura a medida que la disoluci6n de muestra impregne la tira reactiva mediante acci6n capilar.
La sonda de captura, la sonda de captura de enganche y la sonda de detecci6n pueden comprender cada una al menos un acido nucleico o analogo de acido nucleico. Cuando una sonda comprende mas de un acido nucleico o analogo de acido nucleico, preferiblemente estan hibridados entre si.
La invenci6n tambien proporciona un equipo para analizar la presencia de un acido nucleico objetivo en una disoluci6n de muestra que comprende:
una tira reactiva segun el segundo aspecto de la invenci6n en la que el resto de captura es capaz de unirse a un ligando de captura acoplado a una sonda de captura unida al acido nucleico objetivo; y
una sonda de captura capaz de hibridar al acido nucleico objetivo o a una sonda de captura de enganche unida al acido nucleico objetivo, en la que la sonda de captura esta acoplada a un ligando de captura que se puede unir al resto de captura.
Los ejemplos de marcadores adecuados incluyen colorantes textiles, una soluci6n coloidal metalica tal como oro coloidal, y particulas coloreadas tales como particulas de latex coloreadas. Tales marcadores se pueden acoplar directamente a la sonda de detecci6n o, si la sonda de detecci6n esta acoplada a un ligando de detecci6n, al resto de uni6n al ligando de detecci6n.
Los ejemplos de ligandos de captura o detecci6n adecuados incluyen biotina (capturada o detectada, por ejemplo, mediante un anticuerpo antibiotina, avidina, estreptavidina o un derivado de los mismos), fluoresceina (capturada o detectada, por ejemplo, mediante un anticuerpo antifluoresceina) y 2,4dinitrofenol (DNP) (capturado o detectado, por ejemplo, mediante un anticuerpo antiDNP).
La sonda de detecci6n puede comprender una sonda de detecci6n universal que es capaz de hibridar a una sonda de detecci6n de enganche unida al acido nucleico objetivo. La sonda de detecci6n universal puede estar unida a un marcador o un ligando de detecci6n, por lo que permite la detecci6n de la sonda de detecci6n.
Se apreciara que los equipos y las tiras reactivas de la invenci6n pueden comprender ademas cualquier reactivo necesario para usar el equipo para detectar un acido nucleico objetivo en una disoluci6n de muestra. Por ejemplo, los equipos de la invenci6n que comprenden una sonda de detecci6n acoplada a un ligando de detecci6n pueden comprender ademas un resto de uni6n al ligando de detecci6n. Este puede estar por separado respecto de la tira reactiva o inmovilizado de manera liberable en la tira reactiva entre el extremo de contacto y la zona de captura.
El resto de uni6n al ligando de detecci6n puede comprender un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, o una molecula que no es un anticuerpo. Por ejemplo, si el ligando de detecci6n comprende biotina, el resto de uni6n al ligando
E01947639 23-11-2011
de detecci6n puede comprender un anticuerpo antibiotina, estreptavidina, avidina o un derivado del mismo que mantiene la actividad de uni6n a biotina. Preferiblemente, el resto de uni6n al ligando de detecci6n esta marcado, por lo que permite la detecci6n indirecta del acido nucleico objetivo mediante la utilizaci6n de la sonda de detecci6n y el resto de uni6n al ligando de detecci6n.
Se entendera que la invenci6n se refiere al uso de sondas de detecci6n y/o sondas de captura unidas a un separador, y que la sonda de detecci6n o la sonda de captura puede estar inmovilizada en la tira reactiva o se puede incubar con la disoluci6n de muestra, dependiendo del metodo de detecci6n del acido nucleico objetivo.
Tambien se proporciona segun la invenci6n un equipo para analizar la presencia de un acido nucleico objetivo en una disoluci6n de muestra que comprende:
i) una tira reactiva que comprende una tira cromatografica que tiene un extremo de contacto para su puesta en contacto con la disoluci6n de muestra y una sonda de captura capaz de hibridar al acido nucleico objetivo, o a una sonda de captura de enganche unida al acido nucleico objetivo, y la sonda de captura esta inmovilizada en una zona de captura de la tira cromatografica alejada del extremo de contacto; y
ii) una sonda de detecci6n capaz de hibridar al acido nucleico objetivo, y la sonda de detecci6n esta acoplada a un marcador que permite la detecci6n directa del acido nucleico objetivo mediante la utilizaci6n de la sonda de detecci6n, o la sonda de detecci6n esta acoplada a un ligando que permite la detecci6n indirecta del acido nucleico objetivo mediante la utilizaci6n de la sonda de detecci6n, en la que el marcador o el ligando de detecci6n esta unido a un separador de la sonda de detecci6n, y el separador de la sonda de detecci6n esta unido a la sonda de detecci6n, por lo que acopla del marcador o el ligando de detecci6n a la sonda de detecci6n y separa el marcador o el ligando de detecci6n de la sonda de detecci6n y en la que:
i) el separador de la sonda de detecci6n esta unido a un extremo de la sonda de detecci6n, y el extremo de la sonda de detecci6n que no esta unido al separador de la sonda de detecci6n esta acoplado a uno o mas nucle6tidos que no hibridan al acido nucleico objetivo cuando la sonda de detecci6n ha hibridado al acido nucleico objetivo;
ii) el separador de la sonda de detecci6n esta unido a una parte de la sonda de detecci6n entre los extremos de la sonda de detecci6n, y uno o ambos extremos de la sonda de detecci6n estan acoplados a uno o mas nucle6tidos que no hibridan al acido nucleico objetivo cuando la sonda de detecci6n ha hibridado al acido nucleico objetivo;
iii) el separador de la sonda de detecci6n comprende: un nucle6tido que comprende una nucleobase capaz de formar una interacci6n por apilamiento con un par de bases formado cuando la sonda de detecci6n ha hibridado al acido nucleico objetivo; fosfato de 3hidroxipropilo; o fosfato de hexaetilen glicol; o iv) el separador de la sonda de detecci6n comprende una proteina.
Tambien se proporciona segun la invenci6n un equipo para analizar la presencia de un acido nucleico objetivo en una disoluci6n de muestra que comprende:
i) una tira reactiva que comprende una tira cromatografica que tiene un extremo de contacto para su puesta en contacto con la disoluci6n de muestra y un resto de captura inmovilizado en una zona de captura de la tira cromatografica alejada del extremo de contacto, y el resto de captura es capaz de unirse directamente o indirectamente al acido nucleico objetivo;
ii) una sonda de captura capaz de hibridar al acido nucleico objetivo, o a una sonda de captura de enganche unida al acido nucleico objetivo, en la que la sonda de captura esta acoplada a un ligando de captura que se puede unir al resto de captura; y
iii) una sonda de detecci6n capaz de hibridar al acido nucleico objetivo, y la sonda de detecci6n esta acoplada a un marcador que permite la detecci6n directa del acido nucleico objetivo mediante la utilizaci6n de la sonda de detecci6n, o la sonda de detecci6n esta acoplada a un ligando de detecci6n que permite la detecci6n indirecta del acido nucleico objetivo mediante la utilizaci6n de la sonda de detecci6n, en la que el marcador o el ligando de detecci6n esta unido a un separador de la sonda de detecci6n, y el separador de la sonda de detecci6n esta unido a la sonda de detecci6n, por lo que acopla el marcador o el ligando de detecci6n a la sonda de detecci6n y separa el marcador o el ligando de detecci6n de la sonda de detecci6n en la que:
i) el separador esta unido a un extremo de la sonda, y el extremo de la sonda que no esta unido al separador esta acoplado a uno o mas nucle6tidos que no hibridan al acido nucleico objetivo cuando la sonda ha hibridado al acido nucleico objetivo o a la sonda de captura de enganche;
ii) el separador esta unido a una parte de la sonda entre los extremos de la sonda, y uno o ambos extremos de la sonda estan acoplados a uno o mas nucle6tidos que no hibridan al acido nucleico objetivo cuando la sonda ha hibridado al acido nucleico objetivo o a la sonda de captura de enganche;
iii) el separador comprende: un nucle6tido que comprende una nucleobase capaz de formar una interacci6n por
E01947639 23-11-2011
apilamiento con un par de bases formado cuando la sonda ha hibridado al acido nucleico objetivo o a la sonda de captura de enganche; fosfato de 3hidroxipropilo; o fosfato de hexaetilen glicol; o iv) el separador comprende una proteina.
Tambien se proporciona segun la invenci6n un equipo para analizar la presencia de un acido nucleico objetivo en una disoluci6n de muestra que comprende:
i) una tira reactiva que comprende una tira cromatografica que tiene un extremo de contacto para poner en contacto la disoluci6n de muestra y un resto de captura inmovilizado en una zona de captura de la tira cromatografica alejada del extremo de contacto;
ii) una sonda de captura capaz de hibridar al acido nucleico objetivo, o a una sonda de captura de enganche unida al acido nucleico objetivo, en la que la sonda de captura esta unida a un separador de la sonda de captura y el separador de la sonda de captura esta unido a un ligando de captura, por lo que acopla el ligando de captura a la sonda de captura y separa el ligando de captura de la sonda de captura; y
iii) una sonda de detecci6n capaz de hibridar al acido nucleico objetivo, y la sonda de detecci6n esta acoplada a un marcador que permite la detecci6n directa del acido nucleico objetivo mediante la utilizaci6n de la sonda de detecci6n, o la sonda de detecci6n esta acoplada a un ligando de detecci6n que permite la detecci6n indirecta del acido nucleico objetivo mediante la utilizaci6n de la sonda de detecci6n,
en el que:
i) el separador esta unido a un extremo de la sonda, y el extremo de la sonda que no esta unido al separador esta acoplado a uno o mas nucle6tidos que no hibridan al acido nucleico objetivo cuando la sonda ha hibridado al acido nucleico objetivo o a la sonda de captura de enganche;
ii) el separador esta unido a una parte de la sonda entre los extremos de la sonda, y uno o ambos extremos de la sonda estan acoplados a uno o mas nucle6tidos que no hibridan al acido nucleico objetivo cuando la sonda ha hibridado al acido nucleico objetivo o a lasonda de captura de enganche;
iii) el separador comprende: un nucle6tido que comprende una nucleobase capaz de formar una interacci6n por apilamiento con un par de bases formado cuando la sonda ha hibridado al acido nucleico objetivo o a la sonda de captura de enganche; fosfato de 3hidroxipropilo; o fosfato de hexaetilen glicol; o
iv) el separador comprende una proteina.
Segun la invenci6n, tambien se proporciona una sonda de ensayo de tira reactiva para la detecci6n o la captura de un acido nucleico objetivo en un ensayo de tira reactiva tal como se define en la presente memoria, y la sonda comprende un acido nucleico o analogo de acido nucleico capaz de hibridar al acido nucleico objetivo, y un marcador que permite la detecci6n directa del acido nucleico objetivo mediante la utilizaci6n de la sonda, o un ligando que permite la captura o la detecci6n indirecta del acido nucleico objetivo mediante la utilizaci6n de la sonda, en la que el marcador o el ligando esta unido a un separador y el separador esta unido al acido nucleico o analogo de acido nucleico, por lo que separa el marcador o el ligando del acido nucleico o analogo de acido nucleico, caracterizada porque:
i) el separador esta unido a un extremo de la sonda, y el extremo de la sonda que no esta unido al separador esta acoplado a uno o mas nucle6tidos que no hibridan al acido nucleico objetivo cuando la sonda ha hibridado al acido nucleico objetivo;
ii) el separador esta unido a una parte de la sonda entre los extremos de la sonda, y uno o ambos extremos de la sonda estan acoplados a uno o mas nucle6tidos que no hibridan al acido nucleico objetivo cuando la sonda ha hibridado al acido nucleico objetivo;
iii) el separador comprende: un nucle6tido que comprende una nucleobase capaz de formar una interacci6n por apilamiento con un par de bases formado cuando la sonda ha hibridado al acido nucleico objetivo; fosfato de 3hidroxipropilo; o fosfato de hexaetilen glicol; o
iv) el separador comprende una proteina.
Segun un aspecto adicional, se proporciona un metodo para la inmovilizaci6n de una sonda en una fase s6lida que comprende proporcionar una sonda acoplada a una proteina y adsorber la proteina en la fase s6lida.
Los metodos para la inmovilizaci6n de una sonda en una fase s6lida pueden comprender ademas el acoplamiento de la sonda a la proteina.
La sonda se acopla preferiblemente a un ligador, y el ligador se acopla a la proteina. La sonda se acopla preferiblemente al ligador antes de acoplar el ligador a la proteina.
E01947639 23-11-2011
La sonda puede comprender un acido nucleico o analogo de acido nucleico.
El ligador se acopla preferiblemente a una parte que no es una nucleobase de la sonda. Cuando la sonda comprende un acido nucleico, el ligador se acopla preferiblemente a un grupo carbohidrato o fosfato de la sonda. Cuando la sonda comprende un analogo de acido nucleico APN (acido peptidonucleico), el ligador se acopla preferiblemente a un grupo amino de la sonda. Esto se da de manera que el ligador no interfiere con el emparejamiento de bases de la nucleobase. De manera alternativa, el ligador se puede acoplar al extremo 5' o 3' de la parte de la sonda que es capaz de hibridar a la molecula de uni6n de la sonda (por ejemplo, el acido nucleico objetivo) para evitar la interferencia del ligador con las interacciones por emparejamiento de bases de la sonda y su molecula de uni6n.
La sonda se acopla preferiblemente al ligador mediante la reacci6n de un grupo fosforamidita unido al ligador con un grupo hidroxilo de la sonda, o mediante la reacci6n de un grupo hidroxilo del ligador con un grupo fosforamidita unido a la sonda.
El ligador se acopla preferiblemente a la proteina mediante la reacci6n de un grupo amino primario unido al ligador con un grupo carboxilo de la proteina.
La fase s6lida puede comprender una membrana, preferiblemente una membrana de nitrocelulosa. De manera alternativa, la fase s6lida puede comprender una particula, tal como una microesfera.
Tambien se proporciona una sonda inmovilizada en una fase s6lida mediante la adsorci6n en la fase s6lida de una proteina acoplada a la sonda.
Tambien se proporciona segun la invenci6n el uso de una tira reactiva, equipo, o sonda de la invenci6n en un ensayo de tira reactiva para analizar la presencia de un acido nucleico objetivo en una disoluci6n de muestra.
Se cree que la sensibilidad de las tiras reactivas de la invenci6n que tienen un separador de la sonda de captura se mejora debido a que la sonda de captura unida al separador de la sonda de captura es mas accesible para la hibridaci6n al acido nucleico objetivo. La sensibilidad de las tiras reactivas o de los equipos de la invenci6n en los que la sonda de captura esta acoplada a un ligando de captura mediante un separador de la sonda de captura puede mejorarse debido a que la sonda de captura, en consecuencia, es mas accesible para la hibridaci6n al acido nucleico objetivo y el ligando de captura es mas accesible para la uni6n al resto de captura.
De forma similar, se cree que la sensibilidad de las tiras reactivas o de los equipos de la invenci6n que tienen un separador de la sonda de detecci6n que acopla la sonda de detecci6n a un marcador se mejora debido a que el separador de la sonda de detecci6n hace que la sonda de detecci6n sea mas accesible para la hibridaci6n al acido nucleico objetivo. Si la sonda de detecci6n se acopla a un ligando de detecci6n mediante un separador de la sonda de detecci6n, se cree que la sonda de detecci6n es mas accesible para la hibridaci6n al acido nucleico objetivo, y el ligando de la sonda de detecci6n tambien puede ser mas accesible para el resto de uni6n al ligando de detecci6n.
Se cree que el uso de separadores que comprenden nucleobases de acuerdo con la invenci6n es especialmente eficaz, debido a que el nucle6tido o la nucleobase es capaz de formar interacciones por apilamientos con los pares de bases formados entre la sonda de captura o la sonda de detecci6n y el acido nucleico objetivo. Se cree que la formaci6n de las interacciones por apilamientos aumenta la hibridaci6n de la sonda de captura o la sonda de detecci6n al acido nucleico objetivo, por lo que se mejora la eficacia de la captura o la detecci6n del acido nucleico objetivo en la zona de captura de la tira reactiva.
Cuando sea adecuado, las tiras reactivas y los equipos de la invenci6n se pueden usar en los siguientes tipos de ensayos de tiras reactivas para analizar la presencia de un acido nucleico objetivo en una disoluci6n de muestra:
1) Se proporciona una tira reactiva que comprende una tira cromatografica que tiene un extremo de contacto y una sonda de captura inmovilizada en una zona de captura alejada del extremo de contacto, y la sonda de captura es capaz de hibridar al acido nucleico objetivo. Se pone en contacto una sonda de detecci6n con la disoluci6n de muestra en condiciones para la hibridaci6n de la sonda de detecci6n al acido nucleico objetivo. La disoluci6n de muestra se pone en contacto con el extremo de contacto de la tira reactiva para provocar que la disoluci6n de muestra se mueva mediante acci6n capilar hacia la zona de captura, por lo que se permite que el acido nucleico objetivo y la sonda de detecci6n se muevan con la disoluci6n de muestra hacia la zona de captura, y que el acido nucleico objetivo sea capturado en la zona de captura. La sonda de detecci6n se puede detectar entonces en la zona de captura. La presencia de la sonda de detecci6n en la zona de captura indica que el acido nucleico objetivo estaba presente en la disoluci6n de muestra.
En una variaci6n de este ensayo, la sonda de detecci6n puede estar inmovilizada de manera liberable en la tira reactiva entre el extremo de contacto y la zona de captura, en vez de estar por separado de la tira reactiva. Cuando el extremo de contacto de la tira reactiva se pone en contacto con la disoluci6n de muestra, lo que provoca que la disoluci6n de muestra se mueva mediante acci6n capilar hacia la zona de captura, la sonda de detecci6n se libera en la disoluci6n de muestra de manera que la sonda de detecci6n liberada puede hibridar al acido nucleico objetivo
E01947639 23-11-2011
en la disoluci6n de muestra a medida que se mueve hacia la zona de captura.
En variaciones adicionales de este ensayo, la sonda de detecci6n puede estar separada de la disoluci6n de muestra y se puede poner en contacto con la zona de captura de la tira reactiva. Esto se realizara normalmente despues de que el extremo de contacto de la tira reactiva se haya puesto en contacto con la disoluci6n de muestra. La sonda de detecci6n se puede poner en contacto directamente con la zona de captura, o la sonda de detecci6n puede estar en una disoluci6n de sonda distinta que se pone en contacto con el extremo de contacto de la tira reactiva para provocar que la disoluci6n de sonda se mueva mediante acci6n capilar hacia la zona de captura.
2) Se proporciona una tira reactiva que comprende una tira cromatografica que tiene un extremo de contacto y un resto de captura inmovilizado en una zona de captura alejada del extremo de contacto, y el resto de captura es capaz de unirse a una sonda de captura hibridada al acido nucleico objetivo. La sonda de captura se pone en contacto con la disoluci6n de muestra en condiciones para la hibridaci6n de la sonda de captura al acido nucleico objetivo. La disoluci6n de muestra se pone en contacto con el extremo de contacto de la tira reactiva para provocar que la disoluci6n de muestra se mueva mediante acci6n capilar hacia la zona de captura, por lo que se permite que el acido nucleico objetivo y la sonda de captura se muevan con la disoluci6n de muestra hacia la zona de captura, y que se capture el acido nucleico objetivo en la zona de captura mediante la uni6n del resto de captura a la sonda de captura. El acido nucleico objetivo se puede detectar entonces en la zona de captura. El acido nucleico objetivo se puede detectar mediante el uso de una sonda de detecci6n como se describi6 para el ensayo (1). La sonda de detecci6n se puede anadir a la disoluci6n de muestra con la sonda de captura o por separado respecto de la sonda de captura (en cualquier orden). De manera alternativa, la sonda de detecci6n puede estar inmovilizada de manera liberable en la tira reactiva entre el extremo de contacto y la zona de captura, o se puede poner en contacto por separado con la zona de captura como se describi6 para el ensayo (1).
En una variaci6n del ensayo (2), en vez de mezclar la sonda de captura con la disoluci6n de muestra, puede estar inmovilizada de manera liberable en la tira reactiva entre el extremo de contacto y la zona de captura. Cuando el extremo de contacto de la tira reactiva se pone en contacto con la disoluci6n de muestra, lo que provoca que la disoluci6n de muestra se mueva mediante acci6n capilar hacia la zona de captura, la sonda de captura se libera en la disoluci6n de muestra de manera que la sonda de captura liberada se libera en la disoluci6n de muestra de forma que la sonda de captura puede hibridar al acido nucleico objetivo en la disoluci6n de muestra a medida que se mueve hacia la zona de captura. El acido nucleico objetivo se puede detectar mediante el uso de una sonda de detecci6n que se puede poner en contacto con la disoluci6n de muestra, inmovilizada de manera liberable en la tira reactiva entre el extremo de contacto y la zona de captura, o se puede poner en contacto por separado con la zona de captura.
En una variaci6n adicional del ensayo (2), la sonda de captura se puede poner en contacto con la zona de captura antes (o, de manera excepcional, al mismo tiempo) que la disoluci6n de muestra alcance la zona de captura mediante acci6n capilar. Esto permitira que la sonda de captura se una al resto de captura en la zona de captura, de manera que el acido nucleico objetivo pueda ser capturado. La sonda de captura puede estar en una disoluci6n de sonda de captura diferente que se pone en contacto por separado con la zona de captura aplicandola directamente en la zona de captura, o poniendo en contacto la disoluci6n de sonda de captura con el extremo de contacto de la tira reactiva para provocar que la sonda de captura se mueva mediante acci6n capilar hacia la zona de captura. El contacto posterior del extremo de contacto de la tira reactiva con la disoluci6n de muestra permitira que el acido nucleico objetivo alcance la zona de captura mediante acci6n capilar para ser capturado alli. De nuevo, el acido nucleico objetivo se puede detectar mediante el uso de una sonda de detecci6n que se puede poner en contacto con la disoluci6n de muestra, inmovilizada de manera liberable en la tira reactiva entre el extremo de contacto y la zona de captura, o se puede poner en contacto por separado con la zona de captura. Como alternativa al uso de una sonda de detecci6n en el ensayo (2), el acido nucleico objetivo se puede marcar directamente en la disoluci6n de muestra, por ejemplo mediante la uni6n covalente de un marcador al acido nucleico objetivo. Esto se puede llevar a cabo mediante el contacto de un marcador precursor con la disoluci6n de muestra e incubaci6n de la disoluci6n de muestra y el marcador precursor en condiciones para la uni6n covalente del marcador al acido nucleico objetivo.
El resto de captura del ensayo (2) puede ser una sonda de captura universal capaz de hibridar a la sonda de captura, o el resto de captura puede ser capaz de unirse mediante una interacci6n que no es por emparejamiento de bases a la sonda de captura. Por ejemplo, cuando la sonda de captura comprende uno o mas ligandos de captura, el resto de captura es un resto de uni6n al ligando de captura.
Cuando el ensayo de tira reactiva usa mas de una sonda capaz de hibridar al acido nucleico objetivo, se prefiere que todas las sondas se anadan a la disoluci6n de muestra y que se lleve a cabo la hibridaci6n en una unica etapa. Esto simplifica el ensayo, y lo hace mas sencillo y rapido de llevar a cabo. Se ha descubierto que la sensibilidad de la detecci6n del acido nucleico objetivo mediante el uso de un ensayo de hibridaci6n de una etapa es aproximadamente igual a la sensibilidad de la detecci6n cuando la hibridaci6n se lleva a cabo en etapas multiples. La hibridaci6n de etapas multiples se puede llevar a cabo mediante la hibridaci6n secuencial de las diferentes sondas al acido nucleico objetivo en la disoluci6n de muestra, o poniendo en contacto la tira reactiva con diferentes disoluciones, cada una de las cuales contiene una sonda diferente. Normalmente, el segundo metodo de hibridaci6n de etapas multiples implicara el lavado de la tira reactiva entre cada contacto con una disoluci6n de sonda diferente. Aunque puede haber
E01947639 23-11-2011
circunstancias en las que se prefiera la hibridaci6n de etapas multiples, se apreciara que normalmente se preferira el formato mas simple y rapido de hibridaci6n de una etapa.
Lo mas preferido es que la disoluci6n de muestra sea de una composici6n adecuada para permitir que tengan lugar las reacciones de hibridaci6n en una unica etapa de hibridaci6n, y tambien para permitir que tengan lugar interacciones que no son por emparejamiento de bases (por ejemplo, entre un ligando de detecci6n y un resto de uni6n al ligando de detecci6n, y entre un ligando de captura y un resto de uni6n al ligando de captura) y para transportar un complejo que comprende el acido nucleico objetivo y una o mas sondas hibridadas y (opcionalmente) restos de uni6n al ligando mediante acci6n capilar por la tira reactiva. Mediante el uso de tal disoluci6n de muestra, se apreciara que las reacciones de hibridaci6n se pueden llevar a cabo en una unica etapa, y puede tener lugar cualquier interacci6n ligandoresto de uni6n al ligando, antes de que la disoluci6n de muestra se ponga en contacto directamente con el extremo de contacto de la tira reactiva (sin necesidad de diluir o alterar primero la disoluci6n de muestra). Las interacciones ligandoresto de uni6n al ligando pueden tener lugar ademas o de manera alternativa en la tira reactiva si se desea, ya que la disoluci6n de muestra se desplaza hacia la zona de captura. Por lo tanto, se facilita una detecci6n mediante tira reactiva simple y rapida del acido nucleico objetivo.
Se ha descubierto que tales resultados se consiguen con disoluciones de muestra que comprenden un tamp6n de hibridaci6n estandar (tal como tamp6n SSPE o tamp6n Tris) con sales, detergente y una proteina bloqueante tal como BSA o leche en polvo. Se ha descubierto que la sensibilidad de la detecci6n del acido nucleico objetivo mediante el uso de tales ensayos es aproximadamente igual o mejor que la de otros ensayos de tiras reactivas.
Las realizaciones de la invenci6n se describen a continuaci6n a modo de ejemplo con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
La Figura 1 muestra la estructura quimica de componentes no proteicos adecuados como componentes del separador de la sonda de captura o del separador de la sonda de detecci6n de la invenci6n;
la Figura 2 muestra la detecci6n del acido nucleico objetivo de Chlamydia trachomatis mediante el uso de una realizaci6n de la invenci6n;
la Figura 3 muestra el sistema experimental para el Ejemplo 1;
la Figura 4 muestra el sistema experimental para el Ejemplo 2;
la Figura 5 muestra el sistema experimental para el Ejemplo 3;
la Figura 6 muestra el sistema experimental para el Ejemplo 4;
la Figura 7 muestra el sistema experimental para el Ejemplo 6;
la Figura 8 muestra el sistema experimental para el Ejemplo 7;
la Figura 9 muestra el sistema experimental para el Ejemplo 9;
la Figura 10 muestra el sistema experimental para el Ejemplo 10;
la Figura 11 muestra el sistema experimental para el Ejemplo 11; y
la Figura 12 muestra esquematicamente las estructuras de diferentes sondas de detecci6n acopladas a un ligando de detecci6n de biotina usado en los ejemplos.
Los ejemplos se refieren a la detecci6n de un fragmento de ADN del plasmido criptico de Chlamydia trachomatis (CT). CT es una de las causas mas habituales de enfermedades de transmisi6n sexual. Las infecciones por CT pueden provocar infertilidad y, durante el embarazo, pueden dar como resultado un aborto espontaneo, muerte fetal
o endometritis posparto. En los neonatos, la infecci6n por CT puede provocar ceguera y enfermedad respiratoria cr6nica. Aproximadamente un 10% de los hombres infectados y hasta un 70% de las mujeres infectadas no muestran sintomas de la infecci6n por CT. Por lo tanto, el diagn6stico preciso de la infecci6n por CT es importante para que se pueda iniciar el tratamiento temprano de la enfermedad.
En los ejemplos, se usa una tira reactiva 10 para tratar de detectar el acido nucleico objetivo 12 de CT monocatenario o bicatenario en una disoluci6n de muestra 14 (vease la Figura 2). La tira reactiva 10 comprende una tira de nitrocelulosa 16 que tiene un extremo de contacto 18 para ponerla en contacto con la disoluci6n de muestra 14, y una sonda de captura 20 inmovilizada en una zona de captura 22 de la tira de nitrocelulosa 16 alejada del extremo de contacto 18. Un conjugado anticuerpo antibiotinacolorante 24 (o un conjugado anticuerpo antifluoresceinacolorante en el ejemplo 5) esta inmovilizado de manera liberable en una zona de conjugado 26 de la tira de nitrocelulosa localizada entre el extremo de contacto 18 y la zona de captura 22. La sonda de captura 20 es capaz de hibridar a una primera regi6n de una cadena (la primera cadena) del acido nucleico objetivo 12.
La disoluci6n de muestra 14 se prepara agregando bacterias Chlamydia trachomatis a 1 ml de orina, y despues centrifugando la orina a 15.000 rpm durante 30 minutos. Los sedimentos se resuspenden en 100 ml de tamp6n de hibridaci6n estandar (que incluye un agente bloqueante tal como caseina o BSA). Despues se anade una sonda de detecci6n 28 capaz de hibridar al acido nucleico objetivo (junto con una sonda auxiliar capaz de hibridar al acido nucleico objetivo en posici6n adyacente a la regi6n reconocida por la sonda de detecci6n y/o la sonda de captura, si se usa). La sonda de detecci6n 28 esta acoplada a biotina (o a fluoresceina en el ejemplo 5) (mediante el uso de metodos muy conocidos para los expertos en la tecnica). La disoluci6n de muestra 14 se calienta despues a 100 °C durante 7 minutos y se enfria.
El extremo de contacto 18 de la tira reactiva 10 se pone en contacto despues con la disoluci6n de muestra 14. La disoluci6n de muestra 14 y cualquier acido nucleico objetivo 12 hibridado a la sonda de detecci6n 28 sube por la tira reactiva 10 mediante acci6n capilar. A medida que la disoluci6n de muestra 14 pasa por la zona de conjugado 26, moviliza el conjugado anticuerpo antibiotinacolorante 24. El conjugado anticuerpo antibiotinacolorante 24 liberado se puede unir despues a la biotina acoplada a la sonda de detecci6n 28 hibridada al acido nucleico objetivo 12.
El complejo formado entre el conjugado anticuerpo antibiotinacolorante 24, la sonda de detecci6n 28 y el acido nucleico objetivo 12 sube despues por la tira reactiva 10 hasta la zona de captura 22, en la que el acido nucleico objetivo del complejo puede hibridar a la sonda de captura 20 inmovilizada. La sonda de captura 20 esta inmovilizada en la zona de captura 22 de tal manera que no se puede movilizar mediante la disoluci6n de muestra 14 la medida que se mueve por la zona de captura 22. Por lo tanto, el complejo unido a la sonda de captura permanece en la zona de captura y se puede detectar mediante la presencia del colorante del conjugado anticuerpo antibiotinacolorante en la zona de captura.
Si no hay un acido nucleico objetivo de CT en la disoluci6n de muestra, la sonda de detecci6n 28 no puede ser capturada en la zona de captura 22, y asi el colorante no es visible en la zona de captura. Si hay acido nucleico objetivo de CT en la disoluci6n de muestra, pero se puede capturar una cantidad insuficiente del acido nucleico objetivo en la zona de captura, no se detectara la presencia del acido nucleico objetivo en la disoluci6n de muestra.
Se ha descubierto que la sensibilidad de la detecci6n del acido nucleico objetivo se puede reducir si la distancia entre la regi6n del acido nucleico objetivo a la que hibrida la sonda de captura y la regi6n a la que hibrida la sonda de detecci6n es menor de 26 nucle6tidos. Asi, se prefiere que la distancia entre estas regiones sea de al menos 26 nucle6tidos, y preferiblemente al menos 200 nucle6tidos.
La captura del acido nucleico objetivo descrita anteriormente se denomina captura de sonda directa en los ejemplos siguientes. La intensidad de la detecci6n del acido nucleico objetivo en los ejemplos se registra en una escala de 0 a 5, y 5 representa la detecci6n mas intensa, y 0 representa la ausencia de detecci6n.
Las secuencias de las sondas usadas en los ejemplos siguientes son:
SEQ ID N° 1: 5' TGC AAC TCT TGG TGG TAG ACT TTG C
SEQ ID N° 2: 5' GCG CAC AGA CGA TCT ATT TTT TGC A
SEQ ID N° 3: 5' CGG GCG ATT TGC CTT AAC CCC ACC A
SEQ ID N° 4: 5' CCA AGC TTA AGA CTT CAG AGG AGC G
SEQ ID N° 5: 5' CAT GCG TTT CCA ATA GGA TTC TTG G
SEQ ID N° 6: 5' CAC AGT CAG AAA TTG GAG TGC TGG C
SEQ ID N° 7: 5' CTT GCT GCT CGA ACT TGT TTA GTA C
SEQ ID N° 8: 5' AGA AGT CTT GGC AGA GGA AAC TTT T
SEQ ID N° 9: 5' CTA GAA TTA GAT TAT GAT TTA AAA GGG
SEQ ID N° 10: 5' TTC ATA TCC AAG GAC AAT AGA CCA A
SEQ ID N° 11: 5' TGA TCT ACA AGT ATG TTT GTT GAG T
SEQ ID N° 12: 5' TGC ATA ATA ACT TCG AAT AAG GAG AAG
SEQ ID N° 13: 5' TCC CTC GTG ATA TAA CCT ATC CG
SEQ ID N° 14: 5' CAG GTT GTT AAC AGG ATA GCA CGC
SEQ ID N° 15: 5' CTC GTT CCG AAA TAG AAA ATC GCA SEQ ID N° 16: 5' GGT AAA GCT CTG ATA TTT GAA GAC SEQ ID N° 17: 5' CTG AGG CAG CTT GCT AAT TAT GAG T Las estructuras de las sondas de detecci6n en los ejemplos descritos mas adelante se muestran esquematicamente
en la Figura 12.
5 Ejemplo� Sistema Experimental Formato de captura: captura de sonda directa (cp) Seq ID N° 14 inmovilizada en la tira reactiva; Sonda de detecci6n (dp): Seq ID N° 13 o Seq ID N° 15 con biotina acoplada directamente al extremo 5', o mediante
un separador de 3 nucle6tidos (N3), 6 nucle6tidos (N6), S, o SS, o SEQ ID N° 13 con biotina acoplada directamente
10 al extremo 3'. 1012 copias de cada uno. Formato de detecci6n: conjugado anticuerpo antibiotinacolorante; ADN objetivo: Fragmentos de ADN monocatenario de 73 6 76 nucle6tidos a 5x1011 1010 copias.
Resultados
dp Seq ID N° 13
Copias del objetivo: 5x1011 1011 5x1010 1010 Sonda de detecci6n Senal intensidad
dpB5' 3,5 3,0 2,0 1,0
dpN3B5' 4,5 3,5 3,0 1,5
dpN6B5' 5,0 4,0 3,0 2,0
dpSB5' 4,0 3,0 2,0 1,0 dpSSB5' 4,5 3,5 2,5 1,0 3' Bdp 5,0 3,5 3,0 2,0 dp Seq ID N° 15 Copias del objetivo: 5x1011 1011 5x1010 Sonda de detecci6n Senal intensidad
dpB5' 3,5 2,0 1,0
dpN3B5' 4,0 3,0 2,0
dpN6B5' 4,5 3,0 2,0
dpSB5' 4,0 2,5 1,5
dpSSB5' 4,0 2,5 1,5
15 Estos resultados demuestran: La sensibilidad de la detecci6n del acido nucleico objetivo mediante el uso de sondas de detecci6n con biotina
acoplada al extremo 5' mediante un separador N6, N3, SS o S fue superior que la sensibilidad mediante el uso de una sonda de detecci6n con biotina acoplada directamente al extremo 5'.
20 Los separadores N3 y N6 fueron mejores que los separadores S y SS. Se prefiere que la biotina (u otro ligando de detecci6n) este acoplada en un extremo de la sonda de detecci6n. En el complejo formado cuando la sonda de captura y la sonda de detecci6n hibridan al acido nucleico objetivo en la zona
E01947639 23-11-2011
de captura, la biotina (u otro ligando de detecci6n) puede estar en el extremo de la sonda de detecci6n en posici6n proximal respecto de la regi6n del acido nucleico objetivo que hibrida a la sonda de captura (orientada internamente) o, preferiblemente, en el extremo de la sonda de detecci6n en posici6n distal respecto de la regi6n del acido nucleico objetivo que hibrida a la sonda de captura (orientada externamente). Si no se usa espaciador para acoplar el ligando de detecci6n a la sonda de detecci6n, la sensibilidad de la detecci6n del acido nucleico objetivo es generalmente superior si el ligando de detecci6n esta orientado externamente. Por lo tanto, la sonda de detecci6n se elige normalmente de manera que el ligando de detecci6n este orientado externamente.
Sin embargo, en este ejemplo, la sensibilidad de la detecci6n mediante el uso de una sonda de detecci6n con biotina orientada externamente acoplada directamente al extremo 3' de la sonda de detecci6n fue tan buena como la sensibilidad mediante el uso de una sonda de detecci6n con biotina orientada internamente acoplada al extremo 5' de la sonda de detecci6n mediante un separador de seis nucle6tidos. Asi, cuando se usan separadores de acuerdo con la invenci6n, la sonda de detecci6n no se tiene que elegir de manera que el ligando de detecci6n este orientado externamente en el complejo capturado en la zona de captura.
Ejemplo�:�
Sistema Experimental
Formato de captura: captura de sonda directa (cp) Seq ID N° 14 inmovilizada en la membrana de la tira reactiva;
Sonda de detecci6n: sonda de detecci6n (dp) Seq ID N° 13, Seq ID N° 15 y Seq ID N° 16 con biotina acoplada al extremo 5' mediante un separador de 3 nucle6tidos (N3), 6 nucle6tidos (N6), S o SS. 1012 copias de cada uno.
Formato de detecci6n: conjugado anticuerpo antibiotinacolorante; ADN objetivo: Fragmentos de ADN bicatenario de 214 pb a 1011 1010 copias.
Resultados
Copias del objetivo: 1011 5x1010 1010
Sonda de detecci6n Senal Intensidad
dp13B + dp15B + dp16B 1,5 1,0 0,0 dp13N3B + dp15N3B + dp16N3B 3,0 2,0 0,5 dp13N6B + dp15N6B + dp16N6B 4,5 3,0 1,0 dp13SB + dp15SB + dp16SB 3,0 2,0 <0,5 dp13SSB + dp15SSB + dp16SSB 3,5 3,0 0,5 dp13 nonlab + dp15N6B + dp16N6B 2,5 1,5 0,5
Estos resultados demuestran:
La sensibilidad de la detecci6n del acido nucleico objetivo bicatenario mejor6 mas de cinco veces mediante el uso de separadores N3, N6, S o SS.
La sensibilidad de la detecci6n fue superior con los separadores N6 y SS que con los separadores N3 y S, lo que indica que la longitud del separador es importante para una sensibilidad de detecci6n mejorada.
La sensibilidad de la detecci6n fue superior con el separador N6 que con el separador SS, a pesar del hecho de que estos separadores son de longitud equivalente, lo que indica que las propiedades fisicoquimicas del separador son importantes para una sensibilidad de detecci6n mejorada.
La sensibilidad de la detecci6n mediante el uso de solamente dos sondas de detecci6n, cada una acoplada en el extremo 5' a biotina mediante un separador N6 (dp13 nonlab + dp15N6B + dp16N6B), en las que la biotina esta orientada internamente en el complejo capturado por la sonda de captura, fue mayor que la sensibilidad de la detecci6n mediante el uso de tres sondas de detecci6n cada una acoplada en el extremo 5' directamente a biotina (dp13B + dp15B + dp16B) en las que la biotina de una sonda de detecci6n (dpl3B) esta orientada externamente en el complejo capturado por la sonda de captura.
Conclusiones de los ejemplos 1 y 2
E01947639 23-11-2011
La sensibilidad de la detecci6n del acido nucleico objetivo se incrementa mediante el uso de un separador para acoplar el ligando de detecci6n a la sonda de detecci6n.
Los separadores mas largos son mejores que los separadores mas cortos.
Los separadores de longitud equivalente pero con propiedades fisicoquimicas diferentes tuvieron efectos diferentes sobre la sensibilidad de la detecci6n. En particular, los separadores en los que el componente no proteico consiste solamente en nucle6tidos son mejores que los separadores que incluyen componentes no nucleotidicos. Las posibles explicaciones de esto son:
1.
Los separadores de nucle6tidos pueden mejorar la sensibilidad de la detecci6n aumentando la hibridaci6n de la sonda de detecci6n al acido nucleico objetivo. No se espera que los nucle6tidos de estos separadores emparejen sus bases a los nucle6tidos del acido nucleico objetivo cuando la sonda de detecci6n hibrida al acido nucleico objetivo. Las nucleobases de estos nucle6tidos pueden formar interacciones por apilamiento con los pares de bases formados cuando la sonda de detecci6n hibrida al acido nucleico objetivo. Estas interacciones por apilamientos pueden aumentar la estabilidad de los hibridos formados entre el acido nucleico objetivo y la sonda de detecci6n, por lo que aumenta la sensibilidad de la detecci6n del acido nucleico objetivo.
2.
Los separadores de nucle6tidos pueden ser mas rigidos que los separadores S y SS. Se espera que los anillos de ribosa de los separadores de nucle6tidos proporcionen una rigidez mucho mas elevada que los grupos de polietilen glicol de los separadores S y SS. Esta rigidez mayor podria incrementar la disponibilidad del ligando de detecci6n acoplado al separador de nucle6tidos para la interacci6n con el resto de uni6n al ligando de detecci6n.
3.
Las diferencias de polaridad entre los separadores nucleotidicos y los separadores no nucleotidicos puede provocar diferencias en la sensibilidad de la detecci6n.
Ejemplo�
Sistema Experimental
Formato de captura: captura de sonda directa (cp) Seq ID N° 10 inmovilizada en la tira reactiva;
Sonda de detecci6n: sonda de detecci6n (dp) Seq ID N° 13 acoplada a biotina en el extremo 5' directamente o mediante un separador N6, SS, (dS)6, (SC3)6 o SN3SN3S. 1012 copias de cada uno. Formato de detecci6n: conjugado anticuerpo antibiotinacolorante; Sondas auxiliares: SEQ ID N° 5 y SEQ ID N° 6 adyacentes a SEQ ID N° 10; SEQ ID N° 1 y SEQ ID N° 2 adyacentes a SEQ ID N° 13 a 1012 copias;
ADN objetivo: fragmento de ADN bicatenario de 872 pb a 2x1011 5x1010 copias.
Resultados
Copias del objetivo: 2x1011 5x1010
Sonda de detecci6n Senal intensidad
dpB
<1,0 0,0
dp N6B
2,0 0,5
dp SSB
1,0 0,0
dp (dS)6B
1,0 0,0
dp (SC3)6B
1,0 0,0
dp SN3SN3SB
1,5 0,0
Estos resultados demuestran:
Los separadores SS, (dS)6, y (SC3)6 son de longitud equivalente, y tuvieron un efecto similar en el aumento de la sensibilidad de la detecci6n del acido nucleico objetivo a pesar de sus diferencias estructurales y propiedades.
El separador N6 es de una longitud equivalente a los separadores SS, (dS)6, y (SC3)6. Sin embargo, el separador N6 tuvo el mayor efecto en la mejora de la sensibilidad de la detecci6n del acido nucleico objetivo.
Resultados
Copias del objetivo: Sonda de detecci6n dpB5' dpN3B5' dpN4B5' dpN5B5' dpN6B5' dp(dS)6B5' dpSB5' dpSSB5' dpSSSB5' dpSSSSB5' dpS N3 S N3 SB5'
E01947639 23-11-2011
La sensibilidad de la detecci6n del acido nucleico objetivo fue mayor mediante el uso del separador N6 que con el separador SN3SN3S (el separador mas largo ensayado). Una explicaci6n posible para esto podria ser que el mon6mero S reduce o elimina la interacci6n por apilamiento entre las nucleobases de los componentes de N3 del separador y los pares de bases formados entre la sonda de detecci6n y el acido nucleico objetivo. Estos datos apoyan la conclusi6n de que las interacciones por apilamientos entre las nucleobases sin emparejar del separador y la molecula doble formada entre el acido nucleico objetivo y la sonda de detecci6n son importantes para aumentar la sensibilidad de la detecci6n del acido nucleico objetivo.
Ejemplo�
Se estudiaron espaciadores con diferentes propiedades fisicoquimicas y longitudes mediante el ensayo de las tiras reactivas y mediante analisis de transferencia puntual. El analisis mediante transferencia puntual permite analizar la eficacia de la interacci6n del anticuerpo antibiotina con la biotina acoplada a la sonda de detecci6n sin la hibridaci6n de la sonda de detecci6n al acido nucleico objetivo. Se colocaron puntualmente 5x1085x1011 copias de las sondas de detecci6n acopladas a biotina mediante separadores diferentes en lugares diferentes en una membrana de nailon cargada positivamente y se entrecruzaron mediante luz UV a la membrana. La membrana se incub6 despues con un anticuerpo antibiotina acoplado a fosfatasa alcalina (capaz de convertir un sustrato cromogenico de Nitro Azul de Tetrazolio/Fosfato de 5Bromo4Cloro3Indolilo (NBT/BCIP)), se lav6, y se incub6 con el sustrato cromogenico de NBT/BCIP, y la membrana se observ6 para ver si se formaba color en la zona de captura.
Sistema experimental para el ensayo de tiras reactivas
Formato de captura: captura de sonda directa (cp) Seq ID N° 14 inmovilizada en la tira reactiva;
Sonda de detecci6n: sonda de detecci6n (dp) Seq ID N° 13 acoplada a biotina en el extremo 5' directamente o mediante un separador de nucle6tidos o un separador no nucleotidico. 1012 copias de cada uno.
Formato de detecci6n: conjugado anticuerpo antibiotinacolorante; Sondas auxiliares: SEQ ID N° 2 y SEQ ID N° 3 adyacentes a SEQ ID N° 14 a 1012 copias;
ADN objetivo: fragmento de ADN bicatenario de 416 pb a 5x1010 5x109 copias.
5x1010
5x109
Senal
intensidad
3,5
0,5
4,5
1,5
4,5
1,0
4,5
1,0
5,0
1,5
4,0
0,5
3,5
0,0
4,0
0,0
4,5
0,0
4,0
0,0
4,5
0,5
Sistema experimental para el analisis mediante transferencia puntual
Sondas de detecci6n: sonda de detecci6n Seq ID N° 13 acoplada a biotina en el extremo 5', directamente o me diante un separador de nucle6tidos o un separador no nucleotidico. Formato de detecci6n: anticuerpo antibiotina acoplado a fosfatasa alcalina, detecci6n mediante sustrato
E01947639 23-11-2011
cromogenico de NBT/BSIP. Resultados
Separador
Limite de detecci6n
sin separador
5,0 x E11
N3
5,0 x E10
N4
5,0 x E10
N5
5,0 x E10
N6
2,5 x E10
(dS)6
2,5 x E10
SN3SN3S
2,5 x E9
SSSS
2,5 x E9
SSS
5,0 x E9
SS
2,5 x E10
S
5,0 x E11
Los resultados del ensayo de tiras reactivas demuestran:
No existe una diferencia significativa de sensibilidad en la detecci6n del acido nucleico objetivo mediante el uso de sondas de detecci6n con separadores de tres, cuatro o cinco nucle6tidos.
La sensibilidad de la detecci6n con un separador de seis nucle6tidos es ligeramente mejor que la de los separadores de 35 nucle6tidos.
La sensibilidad de la detecci6n con los separadores que consisten solamente en nucle6tidos fue mejor que con los separadores que incluyen moleculas no nucleotidicas. Por ejemplo, el separador N3 fue mejor que el separador mas largo SN3SN3S, equivalente a una longitud de 15 nucle6tidos.
El separador (dS)6 es ligeramente mejor que el separador SS.
Los resultados del ensayo mediante transferencia puntual demuestran:
La sensibilidad de la detecci6n fue mayor con los separadores mas largos (SSSS y SN3SN3S).
La sensibilidad de la detecci6n mediante el uso de separadores de longitudes equivalentes (N6, (dS)6 y SS) con diferentes propiedades fisicoquimicas fue similar.
Conclusiones de los ejemplos 3 y 4
El componente dS tiene una estructura similar a la de un nucle6tido. Ambos tienen un residuo de ribosa, que se espera que proporcione rigidez. Sin embargo, el nucle6tido tiene una nucleobase que no esta presente en el componente dS. El efecto diferente del separador (dS)6 sobre la sensibilidad de la detecci6n del acido nucleico objetivo en comparaci6n con el separador N6 sugiere que el efecto mayor sobre la mejora de la sensibilidad de la detecci6n mediante el uso de un separador de nucle6tidos se explica principalmente por la presencia de las nucleobases que no producen un emparejamiento de bases con el acido nucleico objetivo.
La composici6n del separador parece ser mas importante que su longitud (comparense los resultados para dpN3B5' y dpSN3SN3SB5' en el ensayo de tiras reactivas del ejemplo 4).
La sensibilidad de la detecci6n mediante el uso de un separador (dS)6 fue mayor que con un separador SS. Estos separadores tienen una longitud equivalente. Esto sugiere que las propiedades fisicoquimicas del separador, tales como la rigidez o la polaridad, tambien pueden tener efecto sobre la mejora de la sensibilidad de la detecci6n por el separador.
E01947639 23-11-2011
El analisis mediante transferencia puntual del ejemplo 4 demuestra que la longitud del separador es importante para la disponibilidad de la biotina para el anticuerpo antibiotina. La sensibilidad de reconocimiento de la biotina por parte del anticuerpo antibiotina fue similar al estar acoplada la biotina a la sonda inmovilizada mediante un espaciador N6, (dS)6 o SS. Sin embargo, el efecto de estos separadores sobre la sensibilidad de la detecci6n en el ensayo de tiras reactivas del ejemplo 4 fue diferente. Esto sugiere que la composici6n del separador es mas importante en la hibridaci6n de la sonda de detecci6n al acido nucleico objetivo que en el reconocimiento de la biotina mediante el anticuerpo antibiotina. La longitud del separador parece ser mas importante que la composici6n del separador para el reconocimiento de la biotina (u otro ligando de detecci6n) mediante el anticuerpo antibiotina (u otro resto de uni6n al ligando de detecci6n).
Ejemplo�
Sistema Experimental
Formato de captura: captura de sonda directa (cp) Seq ID N° 14 acoplada a BSA inmovilizada en la tira reactiva. La sonda de captura esta acoplada a BSA directamente o mediante un separador de seis nucle6tidos;
Sonda de detecci6n: sonda de detecci6n (dp) Seq ID N° 13 acoplada a fluoresceina. 1012 copias.
Formato de detecci6n: conjugado anticuerpo antifluoresceinacolorante; ADN objetivo: fragmentos de ADN monocatenarios de 73 nt o 76 nt a 1011 copias.
Resultado:
Copias del objetivo: 1011
Sonda de captura intensidad de la senal
cpBSAtira reactiva cpN6BSAtira reactiva
4,0 5,0
Ejemplo� Sistema Experimental
Formato de captura: captura de sonda directa (cp) Seq ID N° 14 acoplada en el extremo 5' a BSA inmovilizada en la tira reactiva. La sonda de captura esta acoplada a BSA mediante un separador N6 o SN3SN3S;
Sondas de detecci6n: sondas de detecci6n (dp) Seq ID N° 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 y 17 acopladas a biotina. 1012 copias de cada una;
Formato de detecci6n: conjugado anticuerpo antibiotinacolorante; Objetivo: ADN bicatenario de 872 pb a 1011 2,5x109 copias.
Resultado
Copias del objetivo: 1011 2,5x1010 1010 5x109 2,5x109 Sonda de captura Senal intensidad
cpSN3SN3SBSAtira reactiva
4,0 3,5 2,5 1,0 0,0
cpN6BSAtira reactiva
4,5 4,0 3,0 1,5 0,0
Ejemplo�
Sistema Experimental
Formato de captura: captura de sonda directa (cp) Seq ID N° 15 acoplada a BSA inmovilizada en la tira reactiva. La sonda de captura esta acoplada a BSA mediante un separador N6;
E01947639 23-11-2011
Sondas auxiliares: SEQ ID N° 3 y SEQ ID N° 4 adyacentes a SEQ ID N° 15;
Sonda de detecci6n: En este ejemplo, la sonda de detecci6n comprende una sonda de enganche y una sonda universal. La sonda de enganche tiene una secuencia que corresponde a Seq ID N° 17 (capaz de hibridar al acido nucleico objetivo) y una secuencia complementaria a la secuencia de una sonda universal. La sonda universal esta acoplada a un colorante textil mediante un separador N6 o SN3SN6. Hay 1012 copias de la sonda de enganche.
Objetivo: ADN bicatenario de 872 pb a 1011 y 1010 copias.
Resultado
Copias del objetivo: 1011 1010 Sonda de captura Senal intensidad
Sonda universalSN3SN6Colorante
2,0 0,0
Sonda universalN6 Colorante
2,0 0,5
Conclusiones de los ejemplos 5, 6, y 7
El uso de separadores que comprenden una proteina inmovilizada en la tira reactiva y una molecula no proteica para acoplar la sonda de captura a la proteina inmovilizada (ejemplos 5 y 6), o el uso de separadores de moleculas no proteicas para acoplar el marcador a la sonda de detecci6n (ejemplo 7) mejora la sensibilidad de la detecci6n del acido nucleico objetivo.
La sensibilidad de la detecci6n del acido nucleico fue mayor cuando el componente no proteico del separador consisti6 completamente en nucle6tidos.
Ejemplo�
En este ejemplo se compara la sensibilidad de la detecci6n del acido nucleico objetivo mediante el uso de una sonda de captura inmovilizada en la membrana de la tira reactiva mediante un vehiculo proteico o mediante adsorci6n pasiva.
Se mezclaron 10 nmoles de sonda de captura funcionalizada en el extremo 5' o 3' con un grupo amino primario con 1 1l de BSA del 10% y 25 1l de tamp6n MES 50 mM (pH 6,1) y se llev6 hasta 49 1l con agua en un tubo de microcentrifuga de 500 1l. Despues se anadi6 1 1l de reactivo de acoplamiento (1Etil3(3dimetilaminopropil) carbodiimida 300 mM recien preparada (EDAC) en agua) y se mezcl6 bien. La mezcla se dej6 a temperatura ambiente durante la noche para acoplar BSA a la sonda de captura, y despues se almacen6 a 28 °C. La BSAsonda de captura se aplic6 despues a la zona de captura de la tira reactiva, y la tira reactiva se calent6 a 80 °C durante 1 hora.
Se optimiz6 la proporci6n molar de la sonda de captura respecto de BSA y la concentraci6n del reactivo de acoplamiento EDAC. Se estudiaron las proporciones de sonda de captura:BSA de 2,7:1, 3,2:1, 4,1:1, 5,2:1, 6,6:1, 10,9:1. Se estudiaron las concentraciones de EDAC de 1, 1,5, 2, 4, 5 y 20 mM. Las concentraciones mayores de 5 mM provocaron que la BSAsonda de captura precipitara de la disoluci6n.
Sistema Experimental
Formato de captura: captura de sonda directa mediante Seq ID N° 14 inmovilizada directamente en la membrana de la tira reactiva o mediante un espaciador proteico de BSA. La sonda de captura y la sonda de capturaBSA se aplicaron a la tira reactiva y se inmovilizaron tratando la tira reactiva durante 1 h a 80 °C.
Sonda de detecci6n: sonda de detecci6n marcada con biotina (dp) Seq ID N° 13 a 1012 copias.
Formato de detecci6n: conjugado anticuerpo antibiotinacolorante; ADN objetivo: fragmentos de ADN monocatenarios de 73 nucle6tidos a 1x1011 copias.
Resultados
Senal
E01947639 23-11-2011
0,0
Conclusi6n
El acido nucleico objetivo no se detect6 mediante el uso de una sonda de captura directamente inmovilizada a la tira reactiva. Sin embargo, se obtuvo una senal de detecci6n intensa si la sonda de captura estaba acoplada a BSA y la BSA estaba inmovilizada en la tira reactiva.
Los ejemplos siguientes se refieren a la detecci6n del acido nucleico objetivo mediante el uso de una sonda acoplada a una particula coloreada mediante un separador proteico. Las particulas de colorante se revistieron con la sonda acoplada a BSA. La proteina se adsorbe en las particulas de colorante, por lo que acoplan la sonda a las particulas de colorante. El procedimiento usado fue el siguiente:
Diluir 11 1l de colorante lavado (A575 =900) en 434 1l de tamp6n fosfato 10 mM que contenia NaCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5.
Anadir 5 1l de sondaBSA (2 mg/ml), mezclar bien y rotar a temperatura ambiente durante 1 hora;
Anadir 50 1l de caseina del 20% con tratamiento alcalino. Mezclar bien y rotar a temperatura ambiente durante 1 hora;
Centrifugar a 4000 rpm en una microcentrifuga a temperatura ambiente durante 15 min;
Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 500 1l de tamp6n de conjugaci6n que contiene un 5% de sacarosa y un 2% de caseina con tratamiento alcalino, y un 0,02% de azida Na.
Ejemplo�:�
Sistema Experimental
Formato de captura: Anticuerpo antibiotina/biotina acoplada a las sondas de captura Seq ID N° 13, N° 14, N° 15, N° 16 y N° 17 a 1012 copias por ensayo. De manera alternativa, se us6 el formato de captura de sonda directa (Seq ID N° 14 o Seq ID N° 15) como compara
ci6n; Sonda de detecci6n directa Seq ID N° 10 acoplada a particula de colorante mediante BSA; Sondas auxiliares: SEQ ID N° 5 y SEQ ID N° 6 adyacentes a SEQ ID N° 10; Objetivo: ADN ds de 872 pb a 1011 a 108 copias. Resultado
Amplificaci6n de la Senal Mediante el Uso de Sondas Multiples
Sonda(s) de captura Intensidad de la senal 1011 copias del objetivo
Seq ID N° 13 1 Seq ID N° 14 0 Seq ID N° 15 1 Seq ID N° 16 1 Seq ID N° 17 1 Las 5 5
Analisis de Sensiiilidad
Copias
del objetivo 1x1011 1x1010 5x109 1x109 5x108 1x108
20
E01947639 23-11-2011
Captura de Anticuerpo
5 4,5 4 2,5 2 0,5
(5 sondas)
Captura de Sonda Directa (Seq ID N° 15)
4,5 3 2,5 1,5 0 0
Captura de Sonda Directa (Seq ID N° 14)
3 2 0,5 0 0 0
Estos resultados demuestran que el conjugado sonda de detecci6n directa colorante funciona tanto con el formato de captura de anticuerpo como con el formato de captura de sonda directa.
Ejemplo�0�
Sistema Experimental Formato de captura: captura de sonda directa (cp) Seq ID N° 15 acoplada a BSA inmovilizada en la tira reactiva. Sondas auxiliares: SEQ ID N° 3 y SEQ ID N° 4 adyacentes a SEQ ID N° 15; Regi6n de la sonda de detecci6n Seq ID N° 17. Se us6 una &quot;sonda de enganche&quot; con una secuencia complementa
ria al ADN objetivo en esta regi6n y a la secuencia de sonda universal a 1012 copias por ensayo; Formato de detecci6n: Colorante textil acoplado a la sonda universal mediante BSA; Objetivo: ADN ds de 872 pb a 1011 y 1010 copias. Resultado:
Copias del objetivo 1011 1010
senal 2,0 0,0 La ventaja de este formato en comparaci6n con el formato de conjugado sonda de detecci6n directacolorante es que permite la aplicaci6n de un reactivo universal para la detecci6n visual del acido nucleico cuando una sonda de una secuencia de nucle6tidos universal se conjuga a las particulas coloreadas. Ejemplo�0�
Sistema Experimental
Formato de captura: captura de sonda directa Seq ID N° 15 acoplada a BSA inmovilizada en la tira reactiva.
Sondas auxiliares: SEQ ID N° 3 y SEQ ID N° 4 adyacentes a SEQ ID N° 15;
Regi6n de la sonda de detecci6n Seq ID N° 17. Se us6 una sonda de detecci6n &quot;de enganche&quot; 1, con una secuencia complementaria al ADN objetivo en esta regi6n y a la secuencia de la sonda universal 2, a 1012 copias por ensayo;
Formato de detecci6n: una sonda de detecci6n de enganche comprende una secuencia complementaria a la secuencia del acido nucleico objetivo y a la secuencia de una primera sonda de detecci6n universal. La primera sonda de detecci6n universal esta acoplada a BSA, y la BSA esta adsorbida en una primera particula coloreada, por lo que acopla la primera sonda de detecci6n universal a la primera particula coloreada. Tambien hay varias segundas sondas de detecci6n universales acopladas cada una a BSA adsorbida en la primera particula coloreada. Las segundas sondas de detecci6n universales comprenden secuencias complementarias a la secuencia de una tercera sonda de detecci6n universal. La tercera sonda de detecci6n universal esta acoplada a BSA adsorbida en una segunda particula coloreada. Cuando el acido nucleico objetivo se detecta mediante el uso de la sonda de detecci6n de enganche, la primera, segunda y tercera sondas de detecci6n universales y la primera y segunda particulas coloreadas, una unica primera particula coloreada forma una primera capa en el acido nucleico objetivo, y varias segundas particulas coloreadas forman una segunda capa en el acido nucleico objetivo como se muestra en la Figura 11. Debido a que se pueden unir varias particulas coloreadas a cada acido nucleico objetivo de esta manera, se cree que la sensibilidad de la detecci6n del acido nucleico objetivo mejora en comparaci6n con el uso de una sonda de detecci6n de enganche y una unica sonda de detecci6n universal acoplada a una particula coloreada.
Objetivo: ADN ds de 872 pb a 1011 y 1010 copias.
Resultados:
E01947639 23-11-2011
Copias del objetivo 1011 1010 senal 2,0 0,5
Se obtuvieron resultados similares con un ADN objetivo ds de 1598 pb.
Ejemplo 0:� Detecci6n Mediante Ensayo de Tiras Reactivas de Acidos Nucleicos de una Etapa de Chlamydia trachomatis
Sistema Experimental:
Reactivos:
Formato de captura: captura mediante sonda oligonucleotidica inmovilizada en la membrana de una tira reactiva por medio de un vehiculo de BSA;
Formato de detecci6n: sonda de detecci6n marcada con biotina multiple; conjugado anticuerpo antibiotina oro coloidal;
Preparaci6n de la muestra: Se prepararon celulas de cuerpos elementales (CE) de Chlamydia trachomatis (Ct) a concentraciones de 106 copias/1l a 103 copias/1l en tamp6n PBS y se calentaron a 100 °C durante 20 minutos;
Tamp6n de hibridaci6n/funcionamiento de tiras reactivas: Tamp6n de hibridaci6n estandar que comprende sales, detergente y una proteina bloqueante tal como BSA o leche en polvo.
Metodo:
La sonda de detecci6n, la sonda auxiliar y 5x106 5x103 copias de CE diluidos en tamp6n de hibridaci6n se llevaron hasta 80 1l y se calentaron a 100 °C durante 7 minutos. La mezcla se centrifug6 despues brevemente para recoger todo el liquido y se mezcl6 con 20 1l de Ab antibiotina y oro coloidal. Los 100 1l de mezcla se impregnaron en la tira reactiva y se dej6 desarrollar una senal.
Resultados y Discusi6n
Los resultados presentados en la Tabla y en la Figura 13 demostraron que se podrian detectar alrededor de 104 copias de CE de Ct con el ensayo de tira reactiva de acido nucleico de una etapa en menos de una hora, lo que incluye la etapa de preparaci6n de la muestra.
Aunque el ensayo de detecci6n de tira reactiva asi presentado tiene una sensibilidad de detecci6n aproximadamente igual a otros ensayos de hibridaci6n de tipo sandwich, tiene ventajas importantes en cuanto a su velocidad y simplicidad.
Un ensayo de hibridaci6n de tipo sandwich para la detecci6n de Ct descrito en el documento PCT WO 93/1322, por ejemplo, es un ensayo complejo con un formato en placa de microtitulaci6n multicomponente, que no se podria llevar a cabo en menos de 5 horas. Este ensayo es un ensayo de multiples etapas, que requiere la adici6n gradual de sus componentes en un orden definido con incubaciones y etapas de lavado tras la adici6n de cada componente nuevo.
El ensayo de tira reactiva de acido nucleico propio de esta invenci6n se podria llevar a cabo en una etapa sin la necesidad de diferentes etapas para la adici6n de los componentes y los lavados. Este ensayo de hibridaci6n de tipo sandwich no requiere mas de una condici6n de disoluci6n para hacer que sea ventajoso para la hibridaci6n y otras formaciones de emparejamientos por afinidad. Las mismas condiciones de disoluci6n podrian proporcionar una migraci6n libre de los componentes a traves de la membrana de la tira reactiva.
Se ha descubierto que la sensibilidad de la detecci6n de un acido nucleico objetivo monocatenario y bicatenario mediante las tiras reactivas se mejora significativamente mediante el uso de separadores de acuerdo con la invenci6n. La sensibilidad de la detecci6n del acido nucleico objetivo circular bicatenario tambien se puede incrementar mediante el uso de espaciadores de acuerdo con la invenci6n.
Se sabe que el acido nucleico objetivo monocatenario forma una estructura secundaria por medio de las interacciones de emparejamiento de bases intramoleculares. Tal estructura secundaria puede inhibir la uni6n de la sonda de captura y la sonda de detecci6n al acido nucleico objetivo. Por lo tanto, la regi6n del acido nucleico objetivo a la que se une la sonda de detecci6n y la sonda de captura se elige a menudo como una regi6n que se ha predicho que estara sustancialmente exenta de estructura secundaria.
La sensibilidad de la detecci6n mejorada del acido nucleico objetivo bicatenario alcanzada mediante el uso de separadores de acuerdo con la invenci6n significa que tambien se mejorara la sensibilidad de la detecci6n del acido nucleico objetivo monocatenario mediante el uso de una sonda de captura y/o una sonda de detecci6n que reconoce una regi6n del acido nucleico objetivo implicada en la estructura secundaria. Una ventaja de esto es que la sonda de captura y/o la sonda de detecci6n no se tienen que elegir basandose en las previsiones de la estructura secundaria formada por el acido nucleico objetivo, simplificando asi la elecci6n de la sonda de captura y de detecci6n.
Se considera que los metodos convencionales de detecci6n mediante tiras reactivas tienen una calidad muy baja en la detecci6n del acido nucleico objetivo bicatenario circular. Por lo tanto, tal acido nucleico objetivo se trata normalmente con una enzima que linealiza el objetivo bicatenario antes de detectarlo. La detecci6n mejorada del acido nucleico objetivo bicatenario circular mediante el uso de separadores de acuerdo con la invenci6n significa que la linealizaci6n del acido nucleico objetivo puede no ser necesaria, simplificando asi los metodos de detecci6n.
Leyendas de las Figuras
Figura 1 Diseno del Separador B=biotina acoplada a un ligador Figura 3 310 cp 320 dp 330 objetivo Figura 4 450 dp Seq ID N° 13 460 cp Seq ID N° 14 470 dp Seq ID N° 15 480 dp Seq ID N° 16 Figura 5 510 cp 520 dp 540 sondas auxiliares dp Figura 6 610 cp 620 dp 640 hp Figura 7 710 cpN6BSA o cpSN3SN3SBSA Figura 8 810 cp 821 enganche de detecci6n 822 Sonda universalN6Colorante o Sonda universalSN3SN6Colorante 840 sondas auxiliares Figura 9 910 sonda de captura acoplada a ligando 920 sonda de detecci6n acoplada a particula de colorante mediante BSA
930 Objetivo de ADN ds de 872 pb 940 sondas auxiliares 950 anticuerpo antibiotina unido a membrana Figura 10
5 1010 cp 1021 enganche de detecci6n 1022 Sonda universalColorante 1040 sondas auxiliares Figura 11
10 1110 captura de sonda directa 1121 sonda de enganche 1122 conjugado de colorante de primera capa 1123 conjugado de colorante de segunda capa 1130 objetivo de ADN ds de 872 pb
15 1140 sondas auxiliares Figura 12 representa el acido nucleico de la sonda de detecci6n B representa biotina acoplada a un ligador x representa el numero de nucle6tidos
20 y representa el numero de mon6meros de fosfato de hexaetilenglicol Figura 13 Detecci6n mediante ensayo de tira reactiva de acidos nucleicos de una etapa de Chlamydia trachomatis Los numeros indican el numero de cuerpos elementales de Chlamydia trachomatis.
�CN: Control Negativo
25 Figura 14 Tabla: detecci6n mediante ensayo de tira reactiva de acidos nucleicos de una etapa de Chlamydia trachomatis

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
  2. 0. Una tira reactiva para analizar la presencia de un acido nucleico objetivo en una disoluci6n de muestra que comprende:
    una tira cromatografica que tiene un extremo de contacto para su puesta en contacto con la disoluci6n de muestra; y
    5 una sonda de captura inmovilizada en una zona de captura de la tira cromatografica alejada del extremo de contacto, y la sonda de captura es capaz de hibridar al acido nucleico objetivo o a una sonda de captura de enganche unida al acido nucleico objetivo, en la que la sonda de captura esta unida a un separador de la sonda de captura y el separador de la sonda de captura esta unido a la zona de captura, por lo que inmoviliza la sonda de captura en la zona de captura y separa la sonda de captura de la zona de captura, caracterizada�poruue:
    10 i) el separador de la sonda de captura esta unido a un extremo de la sonda de captura, y el extremo de la sonda de captura que no esta unido al separador de la sonda de captura esta acoplado a uno o mas nucle6tidos que no hibridan al acido nucleico objetivo cuando la sonda de captura ha hibridado al acido nucleico objetivo o a la sonda de captura de enganche cuando la sonda de captura ha hibridado a la sonda de captura de enganche;
    15 ii) el separador de la sonda de captura esta unido a una parte de la sonda de captura entre los extremos de la sonda de captura, y uno o ambos extremos de la sonda de captura estan acoplados a uno o mas nucle6tidos que no hibridan al acido nucleico objetivo cuando la sonda de captura ha hibridado al acido nucleico objetivo o a la sonda de captura de enganche cuando la sonda de captura ha hibridado a la sonda de captura de enganche;
    20 iii) el separador de la sonda de captura comprende: un nucle6tido que comprende una nucleobase capaz de formar una interacci6n por apilamiento con un par de bases formado cuando la sonda de captura ha hibridado al acido nucleico objetivo o a la sonda de captura de enganche; fosfato de 3hidroxipropilo; o fosfato de hexaetilen glicol; o
    iv) el separador de la sonda de captura comprende una proteina adsorbida directamente en la zona de 25 captura, y unida covalentemente a la sonda de captura mediante un ligador.
    :. Una tira reactiva segun la reivindicaci6n 1(iii) en la que el separador de la sonda de captura comprende ademas una proteina, y la sonda de captura esta acoplada al nucle6tido y el nucle6tido esta acoplado a la proteina, por lo que separa la sonda de captura de la proteina.
  3. 3. Una tira reactiva segun la reivindicaci6n 2 en la que el nucle6tido esta acoplado a la proteina mediante un 30 ligador.
  4. 4.
    Una tira reactiva segun cualquier reivindicaci6n precedente en la que la proteina es BSA, tiroglobulina, o un derivado de las mismas.
  5. 5.
    Una tira reactiva segun cualquier reivindicaci6n precedente que comprende ademas una sonda de detecci6n, inmovilizada de manera liberable en una zona de la sonda localizada entre el extremo de contacto y la zona de cap
    35 tura de la tira cromatografica, y la sonda de detecci6n es capaz de hibridar al acido nucleico objetivo para permitir la detecci6n del acido nucleico objetivo.
  6. 6. Una tira reactiva segun la reivindicaci6n 5 en la que la sonda de detecci6n esta acoplada a un marcador que permite la detecci6n directa del acido nucleico objetivo cuando la sonda de detecci6n ha hibridado al acido nucleico objetivo.
    40 7. Una tira reactiva segun la reivindicaci6n 5 en la que la sonda de detecci6n esta acoplada a un ligando de detecci6n que se puede unir a un resto de uni6n al ligando de detecci6n para permitir la detecci6n indirecta del acido nucleico objetivo cuando la sonda de detecci6n ha hibridado al acido nucleico objetivo.
  7. 8. Una tira reactiva segun la reivindicaci6n 6 6 7 en la que el marcador o el ligando de detecci6n esta unido a un separador de la sonda de detecci6n y el separador de la sonda de detecci6n esta unido a la sonda de detecci6n, por
    45 lo que acopla el marcador o el ligando de detecci6n a la sonda de detecci6n y separa el marcador o el ligando de detecci6n de la sonda de detecci6n.
    :. Una tira reactiva para analizar la presencia de un acido nucleico objetivo en una disoluci6n de muestra que comprende:
    una tira cromatografica que tiene un extremo de contacto para su puesta en contacto con la disoluci6n de muestra;
    50 un resto de captura, inmovilizado en una zona de captura alejada del extremo de contacto, y el resto de captura es capaz de unirse directamente o indirectamente al acido nucleico objetivo; y
    una sonda de detecci6n, inmovilizada de manera liberable en una zona de la sonda localizada entre el extremo de contacto y la zona de captura, y la sonda de detecci6n es capaz de hibridar al acido nucleico objetivo y la sonda de detecci6n esta acoplada a un marcador que permite la detecci6n directa del acido nucleico objetivo mediante la utilizaci6n de la sonda de detecci6n, o la sonda de detecci6n esta acoplada a un ligando de detecci6n que permite la detecci6n indirecta del acido nucleico objetivo mediante la utilizaci6n de la sonda de detecci6n,
    en la que el marcador o el ligando de detecci6n esta unido a un separador de la sonda de detecci6n, y el separador de la sonda de detecci6n esta unido a la sonda de detecci6n, por lo que acopla el marcador o el ligando de detecci6n a la sonda de detecci6n y separa el marcador o el ligando de detecci6n de la sonda de detecci6n, y
    en la que:
    i) el separador de la sonda de detecci6n esta unido a un extremo de la sonda de detecci6n, y el extremo de la sonda de detecci6n que no esta unido al separador de la sonda de detecci6n esta acoplado a uno o mas nucle6tidos que no hibridan al acido nucleico objetivo cuando la sonda de detecci6n ha hibridado al acido nucleico objetivo;
    ii) el separador de la sonda de detecci6n esta unido a una parte de la sonda de detecci6n entre los extremos de la sonda de detecci6n, y uno o ambos extremos de la sonda de detecci6n estan acoplados a uno o mas nucle6tidos que no hibridan al acido nucleico objetivo cuando la sonda de detecci6n ha hibridado al acido nucleico objetivo;
    iii) el separador de la sonda de detecci6n comprende: un nucle6tido que comprende una nucleobase capaz de formar una interacci6n por apilamiento con un par de bases formado cuando la sonda de detecci6n ha hibridado al acido nucleico objetivo; fosfato de 3hidroxipropilo; o fosfato de hexaetilen glicol; o
    iv) el separador de la sonda de detecci6n comprende una proteina.
    0�. Una tira reactiva segun la reivindicaci6n 9(iv) en la que la proteina es BSA, tiroglobulina, o un derivado de las mismas.
  8. 00. Una tira reactiva segun la reivindicaci6n 9(iv) o 10 en la que el marcador o el ligando de detecci6n esta unido a,
    o forma parte de, una microesfera, y la proteina esta adsorbida directamente en la microesfera.
    0:. Una tira reactiva segun cualquiera de las reivindicaciones 9(iv), 10, o 11 en la que la proteina esta unida a la sonda de detecci6n mediante un ligador.
  9. 03.
    Una tira reactiva segun cualquiera de las reivindicaciones 9(iv), o 10 a 12 en la que el separador de la sonda de detecci6n comprende ademas una molecula no proteica.
  10. 04.
    Una tira reactiva segun la reivindicaci6n 13 en la que la sonda de detecci6n esta acoplada a la molecula no proteica y la molecula no proteica esta acoplada a la proteina, por lo que separa la sonda de detecci6n de la proteina.
  11. 05.
    Una tira reactiva segun la reivindicaci6n 14 en la que la molecula no proteica esta acoplada a la proteina mediante un ligador.
  12. 06.
    Una tira reactiva segun cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 en la que la molecula no proteica tiene una longitud de al menos tres nucle6tidos.
  13. 07.
    Una tira reactiva segun cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 en la que la molecula no proteica comprende un nucle6tido.
  14. 08.
    Una tira reactiva segun la reivindicaci6n 17 en la que la molecula no proteica consiste solamente en uno o mas nucle6tidos.
    0:. Una tira reactiva segun cualquiera de las reivindicaciones 9 a 18 en la que el resto de captura comprende una sonda de captura capaz de hibridar al acido nucleico objetivo o a una sonda de captura de enganche unida al acido nucleico objetivo.
    :�. Una tira reactiva segun cualquiera de las reivindicaciones 9 a 18 en la que el resto de captura es capaz de unirse a un ligando de captura acoplado a una sonda de captura unida al acido nucleico objetivo.
    :0. Un equipo para analizar la presencia de un acido nucleico objetivo en una disoluci6n de muestra que comprende:
    una tira reactiva segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; y
    una sonda de detecci6n capaz de hibridar al acido nucleico objetivo, por lo que permite la detecci6n del acido nucleico objetivo mediante la utilizaci6n de la sonda de detecci6n.
    E01947639 23-11-2011
    ::. Un equipo segun la reivindicaci6n 21 en el que la sonda de detecci6n esta acoplada a un marcador que permite la detecci6n directa de la sonda de detecci6n hibridada al acido nucleico objetivo, o un ligando de detecci6n que permite la detecci6n indirecta de la sonda de detecci6n hibridada al acido nucleico objetivo mediante un resto de uni6n al ligando de detecci6n, en el que el marcador o el ligando de detecci6n esta unido a un separador de la sonda de detecci6n, y el separador de la sonda de detecci6n esta unido a la sonda de detecci6n, por lo que acopla el marcador o el ligando de detecci6n a la sonda de detecci6n y separa el marcador o el ligando de detecci6n de la sonda de detecci6n.
    :3. Un equipo para analizar la presencia de un acido nucleico objetivo en una disoluci6n de muestra que comprende:
    una tira reactiva segun la reivindicaci6n 20; y
    una sonda de captura capaz de hibridar al acido nucleico objetivo, o a una sonda de captura de enganche unida al acido nucleico objetivo, en la que la sonda de captura esta acoplada a un ligando de captura que se puede unir al resto de captura.
    :4. Un equipo segun la reivindicaci6n 23 en el que el ligando de captura esta unido a un separador de la sonda de captura y el separador de la sonda de captura esta unido a la sonda de captura, por lo que acopla el ligando de captura a la sonda de captura y separa el ligando de captura de la sonda de captura.
    :5. Un equipo para analizar la presencia de un acido nucleico objetivo en una disoluci6n de muestra que comprende:
    una tira reactiva que comprende una tira cromatografica que tiene un extremo de contacto para su puesta en contacto con la disoluci6n de muestra y una sonda de captura capaz de hibridar al acido nucleico objetivo, o a una sonda de captura de enganche unida al acido nucleico objetivo, y la sonda de captura esta inmovilizada en una zona de captura de la tira cromatografica alejada del extremo de contacto; y
    una sonda de detecci6n capaz de hibridar al acido nucleico objetivo, y la sonda de detecci6n esta acoplada a un marcador que permite la detecci6n directa del acido nucleico objetivo mediante la utilizaci6n de la sonda de detecci6n, o la sonda de detecci6n esta acoplada a un ligando que permite la detecci6n indirecta del acido nucleico objetivo mediante la utilizaci6n de la sonda de detecci6n, en la que el marcador o el ligando de detecci6n esta unido a un separador de la sonda de detecci6n, y el separador de la sonda de detecci6n esta unido a la sonda de detecci6n, por lo que acopla del marcador o el ligando de detecci6n a la sonda de detecci6n y separa el marcador o el ligando de detecci6n de la sonda de detecci6n, y en la que:
    i) el separador de la sonda de detecci6n esta unido a un extremo de la sonda de detecci6n, y el extremo de la sonda de detecci6n que no esta unido al separador de la sonda de detecci6n esta acoplado a uno o mas nucle6tidos que no hibridan al acido nucleico objetivo cuando la sonda de detecci6n ha hibridado al acido nucleico objetivo;
    ii) el separador de la sonda de detecci6n esta unido a una parte de la sonda de detecci6n entre los extremos de la sonda de detecci6n, y uno o ambos extremos de la sonda de detecci6n estan acoplados a uno o mas nucle6tidos que no hibridan al acido nucleico objetivo cuando la sonda de detecci6n ha hibridado al acido nucleico objetivo;
    iii) el separador de la sonda de detecci6n comprende: un nucle6tido que comprende una nucleobase capaz de formar una interacci6n por apilamiento con un par de bases formado cuando la sonda de detecci6n ha hibridado al acido nucleico objetivo; fosfato de 3hidroxipropilo; o fosfato de hexaetilen glicol; o
    iv) el separador de la sonda de detecci6n comprende una proteina.
    :6. Un equipo para analizar la presencia de un acido nucleico objetivo en una disoluci6n de muestra que comprende:
    una tira reactiva que comprende una tira cromatografica que tiene un extremo de contacto para su puesta en contacto con la disoluci6n de muestra y un resto de captura inmovilizado en una zona de captura de la tira cromatografica alejada del extremo de contacto, y el resto de captura es capaz de unirse directamente o indirectamente al acido nucleico objetivo;
    una sonda de captura capaz de hibridar al acido nucleico objetivo, o a una sonda de captura de enganche unida al acido nucleico objetivo, en la que la sonda de captura esta acoplada a un ligando de captura que se puede unir al resto de captura; y
    una sonda de detecci6n capaz de hibridar al acido nucleico objetivo, y la sonda de detecci6n esta acoplada a un marcador que permite la detecci6n directa del acido nucleico objetivo mediante la utilizaci6n de la sonda de detecci6n, o la sonda de detecci6n esta acoplada a un ligando de detecci6n que permite la detecci6n indirecta del acido nucleico objetivo mediante la utilizaci6n de la sonda de detecci6n;
    en el que la sonda de captura esta unida a un separador de la sonda de captura y el separador de la sonda de captura esta unido al ligando de captura, por lo que acopla el ligando de captura a la sonda de captura y separa el ligando de captura de la sonda de captura, o el marcador o el ligando de detecci6n esta unido a un separador de la
    5 sonda de detecci6n, y el separador de la sonda de detecci6n esta unido a la sonda de detecci6n, por lo que acopla el marcador o el ligando de detecci6n a la sonda de detecci6n y separa el marcador o el ligando de detecci6n de la sonda de detecci6n; y en el que:
    i) el separador esta unido a un extremo de la sonda, y el extremo de la sonda que no esta unido al separador esta acoplado a uno o mas nucle6tidos que no hibridan al acido nucleico objetivo cuando la
    10 sonda ha hibridado al acido nucleico objetivo o a la sonda de captura de enganche;
    ii) el separador esta unido a una parte de la sonda entre los extremos de la sonda, y uno o ambos extremos de la sonda estan acoplados a uno o mas nucle6tidos que no hibridan al acido nucleico objetivo cuando la sonda ha hibridado al acido nucleico objetivo o a la sonda de captura de enganche;
    iii) el separador comprende: un nucle6tido que comprende una nucleobase capaz de formar una interacci6n
    15 por apilamiento con un par de bases formado cuando la sonda ha hibridado al acido nucleico objetivo o a la sonda de captura de enganche; fosfato de 3hidroxipropilo; o fosfato de hexaetilen glicol; o
    iv) el separador comprende una proteina.
    :7. Una sonda de ensayo de tira reactiva para la detecci6n o la captura de un acido nucleico objetivo en un ensayo de tira reactiva como se define en la presente memoria, y la sonda comprende un acido nucleico o analogo de acido
    20 nucleico capaz de hibridar al acido nucleico objetivo, y un marcador que permite la detecci6n directa del acido nucleico objetivo mediante la utilizaci6n de la sonda, o un ligando que permite la captura o la detecci6n indirecta del acido nucleico objetivo mediante la utilizaci6n de la sonda, en la que el marcador o el ligando esta unido a un separador y el separador esta unido al acido nucleico o analogo de acido nucleico, por lo que separa el marcador o el ligando del acido nucleico o analogo de acido nucleico, caracterizada�poruue�
    25 i) el separador esta unido a un extremo de la sonda, y el extremo de la sonda que no esta unido al separador esta acoplado a uno o mas nucle6tidos que no hibridan al acido nucleico objetivo cuando la sonda ha hibridado al acido nucleico objetivo;
    ii) el separador esta unido a una parte de la sonda entre los extremos de la sonda, y uno o ambos extremos de la sonda estan acoplados a uno o mas nucle6tidos que no hibridan al acido nucleico objetivo cuando la
    30 sonda ha hibridado al acido nucleico objetivo;
    iii) el separador comprende: un nucle6tido que comprende una nucleobase capaz de formar una interacci6n por apilamiento con un par de bases formado cuando la sonda ha hibridado al acido nucleico objetivo; fosfato de 3hidroxipropilo; o fosfato de hexaetilen glicol; o
    iv) el separador comprende una proteina.
    35 :8. El uso de una tira reactiva segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, un equipo segun cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26, o una sonda segun la reivindicaci6n 27, para analizar la presencia de un acido nucleico objetivo en una disoluci6n de muestra.
    Figura 12
ES01947639T 2000-07-07 2001-07-06 Interacciones de unión mejorada en ensayos con tiras reactivas. Expired - Lifetime ES2372477T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0016836 2000-07-07
GBGB0016836.9A GB0016836D0 (en) 2000-07-07 2000-07-07 Improved dipstick assays (1)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2372477T3 true ES2372477T3 (es) 2012-01-20

Family

ID=9895306

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES01947639T Expired - Lifetime ES2372477T3 (es) 2000-07-07 2001-07-06 Interacciones de unión mejorada en ensayos con tiras reactivas.

Country Status (9)

Country Link
US (2) US8431336B2 (es)
EP (1) EP1325151B1 (es)
JP (2) JP5341291B2 (es)
CN (2) CN101230393A (es)
AT (1) ATE521714T1 (es)
AU (2) AU2001269285B2 (es)
ES (1) ES2372477T3 (es)
GB (1) GB0016836D0 (es)
WO (1) WO2002004671A2 (es)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0016836D0 (en) 2000-07-07 2000-08-30 Lee Helen Improved dipstick assays (1)
GB0016813D0 (en) * 2000-07-07 2000-08-30 Lee Helen Improved dipstick assays (4)
GB0025245D0 (en) 2000-10-14 2000-11-29 Lee Helen Multiple target detection
DE10154291B4 (de) * 2001-11-05 2005-05-19 Hain Lifescience Gmbh Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren in Form eines Trockenschnelltestes
US8669052B2 (en) * 2008-06-10 2014-03-11 Rapid Pathogen Screening, Inc. Lateral flow nucleic acid detector
GB0701253D0 (en) 2007-01-23 2007-02-28 Diagnostics For The Real World Nucleic acid amplification and testing
US20110086359A1 (en) 2008-06-10 2011-04-14 Rapid Pathogen Screening, Inc. Lateral flow assays
WO2010009203A2 (en) * 2008-07-15 2010-01-21 Rapid Pathogen Screening, Inc. Lateral flow nucleic acid detector
EP2438184B1 (en) * 2009-06-02 2014-06-04 Monoquant PTY LTD A method of nucleic acid amplification
CN103228785B (zh) 2010-11-24 2016-09-07 株式会社钟化 扩增核酸的检测方法和检测装置
JP2013198482A (ja) * 2012-02-22 2013-10-03 Nippon Meat Packers Inc 核酸の検出方法
EP2871244A4 (en) * 2012-07-05 2016-03-23 Ngk Insulators Ltd NUCLEIC ACID CHROMATOGRAPHY METHOD, COMPOSITION FOR NUCLEIC ACID CHROMATOGRAPHY AND KIT CONTAINING THE SAME
US10107780B2 (en) 2014-03-11 2018-10-23 Bio-Rad Laboratories, Inc. Dip-stick western blot
JP6734011B2 (ja) * 2014-06-06 2020-08-05 古河電気工業株式会社 生体分子検出用試験キット、及びこれを用いた生体分子の検出方法、並びにこれらに用いられる生体分子検出用試験片及び生体分子検出用標識試薬
WO2016203267A2 (en) 2015-06-19 2016-12-22 Cambridge Enterprise Limited Diagnosis and treatment of infectious disease
WO2018180987A1 (ja) * 2017-03-29 2018-10-04 東洋紡株式会社 核酸の検出方法
WO2020259678A1 (zh) * 2019-06-26 2020-12-30 南京金斯瑞生物科技有限公司 一种含有阻断物的寡核苷酸
MX2020006374A (es) * 2020-07-13 2022-01-14 Univ Mexico Nac Autonoma Metodo de hibridacion para la deteccion de acidos nucleicos empleando particulas magneticas funcionalizadas.

Family Cites Families (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1223222A (en) * 1984-02-22 1987-06-23 Nanibhushan Dattagupta Immobilized nucleic acid-containing probes
CA1253777A (en) * 1984-06-01 1989-05-09 Robert J. Carrico Nucleic acid hybridization assay employing immobilized rna probes
EP0187332B1 (en) * 1985-01-10 1989-02-01 Molecular Diagnostics, Inc. Photochemical method of labelling nucleic acids for detection in hybridization assays
GB8509367D0 (en) * 1985-04-12 1985-05-15 Amersham Int Plc Nucleic acid hybridisation
US4751177A (en) * 1985-06-13 1988-06-14 Amgen Methods and kits for performing nucleic acid hybridization assays
US4868105A (en) * 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
US4822731A (en) * 1986-01-09 1989-04-18 Cetus Corporation Process for labeling single-stranded nucleic acids and hybridizaiton probes
US5317098A (en) * 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
US5310650A (en) * 1986-09-29 1994-05-10 Abbott Laboratoires Method and device for improved reaction kinetics in nucleic acid hybridizations
US5283174A (en) * 1987-09-21 1994-02-01 Gen-Probe, Incorporated Homogenous protection assay
AU2714988A (en) 1987-10-23 1989-06-01 Siska Diagnostics, Inc. Lanthanide chelate-tagged nucleic acid probes
WO1990001564A1 (en) * 1988-08-09 1990-02-22 Microprobe Corporation Methods for multiple target analyses through nucleic acid hybridization
GB8822228D0 (en) * 1988-09-21 1988-10-26 Southern E M Support-bound oligonucleotides
DE3842700A1 (de) * 1988-12-19 1990-06-21 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur proteinimmobilisierung an einer festphase, so hergestellte protein tragende festphase sowie deren verwendung
DE69031318D1 (de) 1989-03-17 1997-10-02 Abbott Lab Verfahren und Vorrichtung zur Hybridisierung von Nukleinsäure mit verbesserter Reaktionskinetik
DE69032847T2 (de) * 1989-06-30 1999-05-12 Chiron Corp Hydrophobe Nukleinsäure-Sonde
US5232829A (en) 1989-09-29 1993-08-03 Hoffmann-La Roche Inc. Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes
EP0504321B1 (en) 1989-12-04 1997-05-07 Microprobe Corporation Enhanced capture of target nucleic acid by the use of oligonucleotides covalently attached to polymers
CA2031659A1 (en) * 1990-01-26 1991-07-27 John B. Findlay Water-insoluble reagent, nucleic acid probe, test kit and diagnostic and purification methods
US5695926A (en) * 1990-06-11 1997-12-09 Bio Merieux Sandwich hybridization assays using very short capture probes noncovalently bound to a hydrophobic support
FR2663040B1 (fr) * 1990-06-11 1995-09-15 Bio Merieux Procede de detection d'une sequence nucleotidique selon la technique d'hybridation sandwich.
US5210015A (en) * 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US5663318A (en) * 1991-03-01 1997-09-02 Pegg; Randall Kevin Assay preparation containing capture and detection polynucleotides covalently bound to substrates with a heterobifunctional crosslinking agent
US5976789A (en) * 1991-07-17 1999-11-02 Bio Merieux System of probes enabling HLA-DR typing to be performed, and typing method using said probes
FR2679255B1 (fr) * 1991-07-17 1993-10-22 Bio Merieux Procede d'immobilisation d'un fragment nucleique par fixation passive sur un support solide, support solide ainsi obtenu et son utilisation.
FR2679252B1 (fr) 1991-07-17 1993-12-10 Bio Merieux Systeme de sondes permettant d'effectuer le typage hla dr, et procede de typage utilisant lesdites sondes.
US5747244A (en) * 1991-12-23 1998-05-05 Chiron Corporation Nucleic acid probes immobilized on polystyrene surfaces
AU4544193A (en) 1992-06-25 1994-01-24 Microprobe Corporation Solid supports for nucleic acid hybridization assays
WO1994002634A1 (en) * 1992-07-24 1994-02-03 University Of South Australia Amplification and detection process
US5438131A (en) 1992-09-16 1995-08-01 Bergstrom; Donald E. 3-nitropyrrole nucleoside
WO1994006940A1 (en) 1992-09-18 1994-03-31 Abbott Laboratories Multiple assay test strip devices
ES2133529T3 (es) * 1992-11-27 1999-09-16 Innogenetics Nv Procedimiento para tipificar aislamientos de hcv.
WO1994023299A1 (en) 1993-03-31 1994-10-13 Quidel Corporation Multiple assay device
US5496934A (en) * 1993-04-14 1996-03-05 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Nucleic acids encoding a cellulose binding domain
WO1994029696A1 (en) 1993-06-09 1994-12-22 Quidel Corporation Antigen-specific one-step assays
US5635602A (en) * 1993-08-13 1997-06-03 The Regents Of The University Of California Design and synthesis of bispecific DNA-antibody conjugates
WO1995005391A1 (en) 1993-08-18 1995-02-23 Chromagen, Inc. Applications of fluorescent n-nucleosides and fluorescent structural analogs of n-nucleosides
US5789167A (en) * 1993-09-10 1998-08-04 Genevue, Inc. Optical detection of position of oligonucleotides on large DNA molecules
US5925517A (en) * 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US5681697A (en) 1993-12-08 1997-10-28 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assays having reduced background noise and kits therefor
DE4406524A1 (de) * 1994-02-28 1995-08-31 Boehringer Mannheim Gmbh 3'-RNA-Markierung mit Terminaler Transferase
WO1995027081A1 (en) * 1994-03-31 1995-10-12 E.I. Du Pont De Nemours And Company A method for detection of nucleic acid fragments
US5747248A (en) * 1994-12-05 1998-05-05 Chiron Corporation Discontinuous probe design using hybritope mapping
AU724320B2 (en) 1995-05-09 2000-09-14 Kreatech Biotechnology B.V. Methods for the production of platinum-based linkers between labels and bio-organic molecules, for labelling bio-organic molecules, for detecting biological substances of interest and diagnostic test kits
DE19537952A1 (de) * 1995-10-12 1997-04-17 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum Nachweis eines Analyten
US5874216A (en) * 1996-02-23 1999-02-23 Ensys Environmental Products, Inc. Indirect label assay device for detecting small molecules and method of use thereof
JP4981197B2 (ja) 1996-10-08 2012-07-18 クレアテク バイオテクノロジー ベー．ファー． ヌクレオチドを標識付けする方法、標識ヌクレオチド及び有用な中間体
CA2323638A1 (en) * 1998-04-03 1999-10-14 Phylos, Inc. Addressable protein arrays
US20020012913A1 (en) * 1998-09-15 2002-01-31 Kevin L. Gunderson Nucleic acid analysis using complete n-mer arrays
EP1138762A1 (en) * 1998-12-10 2001-10-04 Takara Shuzo Co, Ltd. Method for immobilizing oligonucleotide on a carrier
DE19901761A1 (de) * 1999-01-18 1999-07-01 Gerhard Dr Hartwich Verfahren zur elektrochemischen Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen
DE19910761A1 (de) * 1999-03-11 2000-09-14 Tellmann Wilfried Magnetmotor
EP1183387A2 (en) 1999-04-09 2002-03-06 Arcturus Engineering, Inc. GENERIC cDNA OR PROTEIN ARRAY FOR CUSTOMIZED ASSAYS
GB0016833D0 (en) 2000-07-07 2000-08-30 Lee Helen Improved dipstick assays (2)
GB0016836D0 (en) 2000-07-07 2000-08-30 Lee Helen Improved dipstick assays (1)
GB0016814D0 (en) 2000-07-07 2000-08-30 Lee Helen Improved dipstick assays (3)
GB0025245D0 (en) 2000-10-14 2000-11-29 Lee Helen Multiple target detection
GB0029154D0 (en) 2000-11-30 2001-01-17 Lee Helen Signal enhancement with multiple labelled-antibodies
GB0130947D0 (en) 2001-12-24 2002-02-13 Lee Helen Improved sample preparation for the detection of infectious agents
GB0217390D0 (en) 2002-07-26 2002-09-04 Lee Helen Liquid sampler and method

Also Published As

Publication number Publication date
CN101230393A (zh) 2008-07-30
ATE521714T1 (de) 2011-09-15
GB0016836D0 (en) 2000-08-30
WO2002004671A2 (en) 2002-01-17
JP5341291B2 (ja) 2013-11-13
CN100355905C (zh) 2007-12-19
AU2001269285B2 (en) 2007-08-16
WO2002004671A3 (en) 2003-05-01
AU6928501A (en) 2002-01-21
US8431336B2 (en) 2013-04-30
US20140106347A1 (en) 2014-04-17
JP2004512499A (ja) 2004-04-22
EP1325151B1 (en) 2011-08-24
CN1452664A (zh) 2003-10-29
JP2012019797A (ja) 2012-02-02
EP1325151A2 (en) 2003-07-09
US20040072176A1 (en) 2004-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2372477T3 (es) Interacciones de unión mejorada en ensayos con tiras reactivas.
ES2275292T3 (es) Sondas y equipos para la deteccion de chlamidia trachomatis.
JP2797047B2 (ja) 受身固定により核酸フラグメントを固体支持体上に不動化する方法、そのようにして得られた固体支持体およびその使用
US20060234261A1 (en) Colorimetric readout of hybridization chain reaction
EP0405913B1 (en) Hydrophobic nucleic acid probe
US20080318340A1 (en) Method of Detecting Target Substances
US20150099265A1 (en) Detection signal and capture in dipstick assays
US20080160516A1 (en) Capture and detection format versatility for dipstick assays
JP2000514307A (ja) 増加した標的特異的ｔ▲下ｍ▼を持つ修飾オリゴヌクレオチドを用いた核酸配列の検出および増幅のための方法
JPH11504517A (ja) オリゴヌクレオチドの化学結合による核酸検出及び増幅
JPS61195699A (ja) ポリヌクレオチド配列を検出するための溶液相二重交雑アツセイ
JPH08501689A (ja) 改良型の鎖置換アッセイおよびそれに有用な複合体
AU2001269285A1 (en) Improved binding interactions in dipstick assays
EP0146039A2 (en) Hybridization assay with immobilization of hybrids by antihybrid binding
JP2613203B2 (ja) ポリヌクレオチド配列の検出のための溶液相単一交雑アツセイ
PT1436420E (pt) Sistema de ensaio de tira de teste e método para a detecção de sequências de ácido nucleico específicas.
WO2018003550A1 (ja) ２以上の標的核酸を検出するためのプライマーセット、キット及び方法
WO2007032748A1 (en) Method for detecting dna methylation
TWI286159B (en) Improved stability of hybridisation interactions in dipstick assays
JP3008690B2 (ja) リガンドまたはレセプターの測定法
JPWO2009054320A1 (ja) 核酸プローブ及びプローブポリマーの形成方法
WO1999004042A1 (en) Synthetic oligonucleotide-peptide conjugates and methods of use
JP2004533257A (ja) 増幅可能なプローブ