JPS61195699A - ポリヌクレオチド配列を検出するための溶液相二重交雑アツセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、試験試料中の特定の核酸配列の存在を決定す
るために試験を実施する新規な方法およびそのために有
用な新規なプローブに関する。

２つのオーバーラツプしないＤＮＡプローブの交雑（ｈ
ｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）へ（７）応用は、ＰＣＴ特
許出願第８３７０１４５９号、欧州特許出願第００７０
６８７号および００７０６８５号［ホモ（Ｈｏｍｏ）］
に開示されている。ＰＣＴ特許出願第８３１０１４５９
号、欧州特許出願第００７０６８７号は、試験試料中の
特定のポリヌクレオチド配列の検出のために２つのオー
バーラツプしない交雑プローブを応用することを開示し
ている。プローブの一方は交雑前に固体の支持体へ固定
される。この方法は交雑前に核酸の電子泳動分離の問題
を排除するが、この方法は不均質相を利用するために遅
い。

欧州特許出願第００７０６８５号は、非放射性転移法を
用いる均質相の２つのプローブを開示している。この方
法は交雑の監視に複雑な装置を必要とする。ブラウン運
動、いくつかの非特異的反応のため、そして溶液中に存
在する非交雑プローブの濃度が交雑プローブに比較して
常に非常に高いので、バックグラウンドを排除すること
ができない。

それらの一方が固定化されている２つのプローブを含む
改良された不均質系は欧州特許出願第８４　１０７　２
４８号およびランキ（Ｒａｎｋｉ）ら、ジーン（Ｇｅｎ
ｅ）冬↓（１９８３）７７−ｎ５に記載されている。プ
ローブはＤＮＡ、ＲＮＡ、混合核酸またはオリゴヌクレ
オチドであることができる。そこには特定の核酸配列、
例えば、組型赤血球貧血を示すものを、例えば、試料と
２つのプローブとの接触によって試験することが開示さ
れている。固定化プローブ、そうでなければ分離プロー
ブと識別されている、支持体、例えば、ニトロセルロー
ス上に固定化される。他方のプローブ、検出プローブと
識別される、は究極のアッセイのための標識を支持する
。両方のプローブは異る核酸断片を含み、それらの断片
は、試験配列が試験試料中に存在する場合、試験配列の
異る部分と相補的である。試料とプローブとを混合し、
交雑条件に暴露しそして、試料が正しい配列を含有する
場合、その核酸は２つのプローブの架橋としてはたらく
であろう。これにより、標識されたプローブの標識は固
体の支持体へ取り付けられるようになる。支持体を取り
出し、次いで標識の存在について「読む」。

プローブは、固体支持体上の標識が検出すべき条件に関
して陽性または陰性の結果を示すようなものであること
ができる。鎌型赤血球貧血に加えて、試験は他の遺伝条
件、例えば、地中海貧血、デーーザックス病などのいず
れであることもできる。同定手順は、また、試験試料中
のバクテリアまたはウィルスの検出に従うことができる
。

このような手順は満足な結果を生産するが、上に示した
均質な２つのプローブのアッセイに付随する欠点をとも
わないで、診断法を加速することが望ましいであろう。

この目的および他の目的および利点は本発明に従い実現
され、本発明によれば均質な交雑法ならびに交雑分離系
が提供される。この手順は交雑を迅速に起こさせ、そし
て雑種を溶液から選択的に分離することによりバックグ
ラウンドの問題を排除する。この方法は、後交雑産生物
（ｐｏｓｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　　ｐｒｏｄｕ
ｃｔＳ）をアッセイするために普通の実験室の装置を必
要とするだけである。

診断のプロセスは、均質に、すなわち、溶液中で起こり
、そして、引続いて、分離プローブが固定化されかつ、
事実交雑が起こった場合、それとともに検出プローブが
固定化される。その上、交雑のプロセスの効率は不均質
系よりも溶液中において高い。

これは、反応相手（ｒｅａｃｔｉｏｎ　　ｐ良ｒｔｎｅ
ｒ）と安定な共有結合または非共有結合を形成できる反
応性部位をまた有する分離プローブを使用することによ
って達成される。好ましくは、分離プローブ中のこのよ
うな反応性部位は結合部位、例えば、ビオチンまたはハ
プテンの部分であり、このような結合部位は結合物質、
例えば、アビジン（ａｖｉｄｉｎ）または反応相手とし
てはたらくアビジンと特異的な非共有結合を形成できる
。反応相手は固定化された形態で、例えば、固体の支持
体へ取り付けられた形態で提供される。したがって、交
雑後、溶液を固定化された反応相手と接触させて分離プ
ローブ中の反応性部位と安定な結合を形成させ、固定化
された反応相手を溶液から分離し、そして得られる分離
された固定化分画または残留する溶液、あるいは両者を
検出プローブの存在についてアッセイする。

分離プローブの反応性部位とその固定化された反応相手
との１つのことに有用な組み合わせは、アビジンまたは
ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）−ビ
オチンの相補体を包含する。こうして、この対の一方を
分離プローブへ取り付け、そして他方を固体の支持体へ
取り付け、これらの両者は既知の方法で、例えば、欧州
特許出願第８４　１０　７６２４号に記載されているよ
うに実施する。

固体の支持体はセファデックス（Ｓｅｐｈｄｅｘ）ゲル
、アガロース、ニトロセルロース、紙、プラスチックな
どであることができる。

好ましくは、分離プローブを検出可能な化学基で標識す
る。このような化学基は、放射性物質、蛍光体、酵素な
どであることができ、そして欧州特許出願第８４　１０
　７６２４号に記載されているもののいずれも適する。

分離プローブおよび検出プローブは希薄な溶液として使
用し、これらの溶液を互いにおよび試験試料と、同時に
あるいは任意の所望の工程の順序で、必要に応じて希釈
して、組み合わせることができる。イオン強度、ｐＨお
よび形質の適当な条件を利用することにより、適当な成
分が存在する場合、交雑は非常の急速に起こるであろう
。次いで、固定化された反応相手を導入しそして、適当
な時間を経過させて反応相手と分離プローブとを相互作
用させた後、欧州特許出願第８４　１０７６２４号に記
載されている既知の方法で、固定化された相または分画
を取り出し、洗浄し、そしてアッセイを実施する。

反応性部位／反応相手の対 適当な親和性または相互作用を示して安定な結合を形成
する本質的に物質の木質的に任意の対をこの機能に使用
することができ、この結合は引続くアッセイの工程、主
として分離工程および検出工程の間に実質的に無傷にと
どまる２つの間の連鎖（ｌ　ｉ　ｎｋｉ　ｎｇ）または
連結（ｃｏａｐｌｉｎｇ）である。形成する結合は゛共
有結合または非共有結合であることができ、後者はこと
に選択性または特異性により特徴づけられるとき好まし
い。このような好ましい結合の形成の場合において、分
離プローブ上の反応性部位を結合部位と呼び、そして反
応相手を結合物質と呼び、反応性部位は結合物質と非共
有の普通に特異的な結合または連鎖を形成する。

このような好ましい実施態様において、結合部位は分離
プローブの一本鎖の交雑部分の中にあるいは一本鎖また
は二本鎖の非交雑部分の中に存在することができ、ある
いはプローブの化学的修飾の結果として存在することが
できる。ヌクレオチド配列中に存在する結合部位の例は
、プローブがプロモーター蛋白質（例えば、バクテリオ
ファージのプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼ）により
結合可能であるプロモーター配列（例えば、１ａＣ−プ
ロモータ、ｔｒｐ−プロモーター）からなるか、あるい
はリプレッサー蛋白質（例えば、ｌａＣリプレッサー）
により結合可能なオペレーター配列（例えば、ｌａｃ　
　オペレーター）からなるか、あるいは特異的抗体によ
り結合可能な稀な抗原性ヌクレオチドまたは配列（例え
ば、５−ブロモまたは５−ヨードデオキシウリジン、Ｚ
−ＤＮＡ）からなる場合である［英国特許明細書２．１
２５，９６４号参照］。分離プローブにおいて構成され
るポリヌクレオチドの化学的修飾により導入される結合
部位は、とくに有用であり、そして通常プローブの核酸
に対する特異的結合対の１つの構成員の連鎖を包含する
。選択すべき有用な結合対は、ビオチン／アビジン（卵
白のアビジンおよびストレトアビジンを包含する）、ハ
プテンおよび抗原／抗体、炭水化物／レクチン、酵素／
阻害剤などを包含する。結合対は蛋白質の構成員および
非蛋白質の構成員から成るとき、非蛋白質の構成員をプ
ローブに結合することが通常好ましい。なぜなら、蛋白
質の構成員はプローブの交雑条件下に不安定であること
があるからである。好ましい系はプローブをビオチンま
たはハプテンと結合させ、そしてそれぞれ固定化された
アビジンまたは抗ハプテン抗体試薬を使用することを包
含する。

抗体試薬は、本発明において、前述のようにハブテンま
たは抗体−修飾分離プローブを固定化する手段として、
あるいは後述するように検出プローブを結合する手段と
して使用することができる。ここで用いるとき、抗体試
薬は抗体結合活性を有する免疫学的に誘導された結合物
質を意味し、そして全抗体またはその断片、または普通
のポリクローナルまたはモノクローナルの変種の凝集体
または複合体であることができる。全抗体の形態である
とき、それは既知の免疫グロブリンの綱または亜綱、例
えば、ＩｇＧ、ＩｇＭなどのいずれかに属すことができ
る。含まれるプローブ上の結合部位に対する特異的な結
合の親和性を保持するこのような抗体の任意の断片、例
えば、普通にＦａｂ　、　Ｆ　（ａｂ　’）そしてＦ（
ａｂｌ）２として知られているＩｇＧの断片を使用する
こともできる。さらに、免疫グロブリンまたはその断片
の凝集体、ポリマー、誘導体および複合体を、適当なら
ば、使用することができる。抗体試薬のための免疫グロ
ブリン源は、任意の利用可能な方法、例えば、普通の抗
血清およびモノクローナル技術において得ることができ
る。抗血清は、動物、例えば、マウス、ウサギ、モルモ
ットまたはヤギの適当な免疫原による免疫化を含むよく
確立された技術により得ることができる。免疫グロブリ
ンは、たま、体細胞の交雑技術により得ることができ、
例えば、モノクローナル抗体と普通に呼ばれるものを生
産し、適当な免疫原の使用を包含する。

例えば、分離プローブは、反応性の −ＮＨ２ −３Ｈ −ＣＯＯＨ Ｏ）（ ■ 一−Ｐ−０−Ｈ −Ｃ− −ＯＨ の残基を有するように修飾することができる。これは既
知の方法において達成することができる。

５−アリルアミノＵＴＰまたは８−へキシルアミノＡＴ
Ｐおよび末端のデオキシヌクレオチジルトランスフェラ
ーゼを使用すると、−ＮＨ２残基を分離プローブの３′
末端に導入することができる。４−チオＵＴＰまたは５
−カルボキシメチルＵＴＰおよびＴｄＴを使用すると、
−ＳＨおよび−ＣＯＯＨ残基を導入することができる。

修飾された塩基は、また、ニック翻訳により導入するこ
とができる。あるいは、配位子をプローブに共有結合さ
せることができる。配位子は反応の部位であることがで
きる。例として、−ＮＨ２をもつオランダヒュの（ｐｓ
ｏｒａｌｅａｎ）アルゲリシンまたはアジドエチジウム
をプローブに写真化学的に共有結合し、次いで配位子中
の反応性部位を介して修飾することができる。制限酵素
で消化した断片は、通常、５′−ホスホリル化末端を生
成する。カルボニル残基は、末端リポース残基の酸化に
より生成することができる（ＴｄＴ反応を介して導入で
きる）。すべてのこれらの１または２以上の部位を分離
プローブにつき１つまたは多数の単位で存在させること
ができる。いったんこれらの残基が利用可能であると、
既知の反応を用いてこれらの残基と固定化媒体との間の
共有結合を形成できる。固定化媒体の例は、次の通りで
ある：　−ＯＨ残基を有する固体の粒状支持体、または
　Ｈ９一固体の支持体　または 一＼Ｊ−固体の支持体　または ＯＧＨ−固体の支持体 Ｎ−Ｃ− ５−Ｓ− ５−Ｃ− ■ Ｎ−Ｃ− Ｃ−０− を形成するため。

すべてのこれらの活性化された固体の支持体は、既知の
反応によりつくることができる。

分離プローブ上の反応性部位と反応相手との間の相互作
用は、また、共有結合を形成することができる。

固定化 分離プローブ上の反応性部位に対する分離プローブを、
本発明のアッセイにおいて、固定化された形態で使用す
る。固定化された形態は、反応相手、および反応相手と
交雑および／または分離プローブとの結合の形成により
関連するようになった反応混合物の任意の成分を、引続
いて、例えば、遠心、濾過、クロマトグラフィーまたは
デカンテーションにより、残留する混合物から単離また
は分離することができるようにするいかなる適当な形態
であることもできる。固定化された反応相手の種々の組
成および立体的配置は、こうして、この分野の研究者ら
にとって明らかでありかつ利用可能である。一般に、こ
のようなものは固体の支持体への取り付け、重合または
、引続いて沈殿または凝集させることのできる水分散性
物質への取り付けを包含する。

反応相手を共有結合または非共有結合により取り付けま
たは固定する固体の支持体を使用することがとくに好ま
しく、非共有結合は適当に安定な強い取り付けを与える
吸着法を包含する。固体の支持体は、種々の形状および
組成を取ることができ、それらの例は、微小球、ビーズ
、多孔質および不透過性のストリップおよび膜、反応容
器、例えば、試験管の内表面、マイクロタイタープレイ
）（ｍｉｃｒｏｔｉｅｒ　　ｐｌａｔｅ）などである。

所望の反応相手を選択したセ固体の支持体へ取り付ける
手段は、この分野の研究者らにとて日常のものであろう
。

例えば、反応相手が蛋白質物質である場合、例えば、ア
ビジン、抗体試薬または他の結合蛋白質を分離プローブ
上の結合部位のための結合物質として使用する場合、固
体の支持体へこのような物質を固定化する広範な種類の
方法は文献に記載されている［メソッズ・イン・エンジ
モロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ）。

ｖｏｌ、４４　（１９７６）参照］。蛋白質は共有結合
または非共有結合の吸着により普通に固定化される。頻
繁に使用される非共有結合法は、ポリスチレンのビーズ
または微小球およびポリ塩化ビニルの表面への非特異的
吸着である。多くの共有結合法が用いられておりそして
いくつかのものは臭化シアン活性化アガロースおよびデ
キストラン；グルタルアルデヒド活性化ナイロンおよび
ポリアクリルアミド；およびアクリルおよび他の支持体
上のエポキシドを含む。ＩｇＧ部類の抗体は、また、固
定化された形態の蛋白質Ａへの結合により固定化するこ
とができる。

検出系 本発明において、分離固定化分画の中あるいあは残留す
る反応溶液の中の検出プローブの存在について決定して
アッセイを結論づけるとき使用できる多数の方法が存在
する。検出プローブと検出すべき配列との間の交雑の発
生を検出し、かつ固定化された相中の検出プローブの生
ずる存在または反応混合物中のその減少した存在を検出
するための慣用の手段から選択することができる。一般
に、検出工程は標識された形態の検出プローブの使用、
問題の配列と独特に検出可能な雑種を形成する分離プロ
ーブの使用、あるいは交雑が起こるときにのみ実施でき
る二次反応、例えば、プライマーの延長反応に基づくで
あろう。

検出工程へのとくに好ましいアプローチは、標識された
形態の検出プローブの使用を包含する。

標識は、プローブまたは検出可能な物理的、化学的もし
くは電気的性質を有する物質において構成されたポリヌ
クレオチドの自然の特性であろう。

検出可能な標識物質が導入されると、それは直接、例え
ば、プローブへの共有結合により結合することができ、
あるいは、例えば、マイクロカプセルまたはリポソーム
中に究極的に検出可能な物質を組込み、次いでそれを検
出可能なプローブへ結合することにより間接的に結合す
ることができる。

標識物質は免疫アッセイの分野においてよく確立されて
おりそして、一般に、このような方法において有用なほ
とんどの標識を本発明において応用することができる。

とくに有用なものは、次の通りである：酵素的に活性な
群、例えば、酵素［クリニカル・ケミストリー（ＣＩｉ
ｎ、Ｃｈｅｍ、）（１９７６）２２：１２３２、米国再
発行特許第３１，００６号および英国特許２．Ｏ１９，
４０８号参照］、酵素基質［米国特許第４゜４９２．７
５１号参照］、補酵素［米国特許第４．２３０，７９７
号および４．２３８．５６５号参照］および酵素阻害剤
［米国特許第４，１３４．７９２号参照］　；蛍光体［
クリニカル・ケミストリー（ＣＩｉｎ、Ｃｈｅｍ、）（
１９７９）２５　：　３５３参照］　；発色体（ｃｈｒ
ｏｍｏｐｈｏｒｅｓ）；冷光体（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ
ｓ）、例えば、化学ルミネンセンサーおよび生物ルミネ
センサー［米国特許第４．３８０．５８０号参照］　；
特異的に結合性配位子、例えば、ビオチン［欧州特許明
細書６３．８７９号参照］またはハプテン［ＰＣＴ公開
８３’−２２８６号参照］；ラジオアイソトープ、例え
ば、３Ｈ１３５Ｓ、３２ｐ、！２５■および１４Ｃ０こ
のような標識はそれら自体の物理的性質（例えば、蛍光
体、発色体およびラジオアイソトープ）またはそれらの
活性または結合性質（例えば、配位子、酵素、基質、補
酵素および阻害剤）に基づいて検出される。例えば、コ
ファクター標識種は酵素（またはサイクル系を使用する
場合酵素）を添加することにより検出することができ、
その酵素の標識はコファクターおよびその酵素の１種ま
たは２種以上の基質である。ハプテンまたは配位子（例
えば、ビオチン）標識種は抗体をハプテンまたは蛋白質
（例えば、アビジン）に添加することにより検出するこ
とができ、ハプテンまたは蛋白質は配位子と結合し、検
出可能な分子で標識される。このような検出可能な分子
は測定可能な物理的性質（例えば、蛍光または吸収）を
もつ分子または酵素反応に参加する物質（例えば、上の
リストを参照）であることができる。例えば、基質に作
用して測定可能な物理的性質をもつ産生物を発生する酵
素を使用できる。後者の例は、β−ガラクトシダーゼ、
アルカリ性ホスファターゼおよびペルオキシダーゼを包
含するが、これらの限定されない。

本発明の好ましい実施態様において使用する標識検出プ
ローブを調製する方法は、先行技術から容易に入手可能
である。プローブを標識するとき、標識されたプローブ
が交雑に参加することを実質的に妨害しないで核酸を修
飾するために有効な合成アプローチが用いられ、そして
交雑に用いる条件下で十分に安定であって引続くその検
出を可能とする標識が使用される。プローブの一本鎖ま
たは二本鎖の区域を、必要に応じて標識することができ
る。

一例として、次のアプローチをプローブの標識に使用で
きる。放射能標識ヌクレオチドをＤＮＡの中に、例えば
、ニック翻訳および末端デオキシヌクレオチジルトラン
スフェラーゼによる末端標識付けのような方法により組
込むことができる。

放射能標識ヌクレオチドは、プロメガ脅バイオチク（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ　　Ｂｉｏｔｅｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ
）から入可能であるリポプローブ（Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ
＠）ＤＮＡ鋳型系を使用して、バクテリオファージＳＰ
６からのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用する生
体外合成の間に、ＲＮＡプローブの中に組込むことがで
きる。ランガー（Ｌａｎｇｅｒ）らの方法［（１９８１
）プロシーディンゲス拳オブ・ナショナル争アカデミ−
・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、ｓｃｉ　、）７８：６６３３］を用いて、ビオチンを
５−（３−アミン）アリルウリドおよびデオキシウリジ
ントリホスフェートに連結することができる。これらの
ビオチニル化ヌクレオチドは、ニック翻訳により二本鎖
ＤＮＡの中に組込むことができ、あるいは末端デオキシ
ヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して３°−末
端に付加することができる。ビオチンは、また、ポリア
ミン［ブロウカー（Ｂｒｏｋｅｒ）。

Ｔ、Ｒ，、（１９７８）核酸の研究（Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、）４：３６３］およびチトクロ
ムＣ架橋［ソジャ（Ｓｏｄｊａ）、Ａ、およびディビド
ソ７（Ｄａｖｉｄｓｏｎ）、Ｎ、（１９７８）核酸の研
究（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、）５：３８５］
を介してＲＮＡの３′−ＯＨ末端へ取り付けることがで
きる。プローブの蛋白質標識の直接の連結は、１２５Ｉ
−ヒストンを変性ＤＮＡへグルタルアルデヒドを使用し
て連結したレンズ（Ｒｅｎｚ）の方法［ＥＭＢＯジャー
ナル、２：８１７］により達成することができる。酵素
、例えば、ペルオキシダーゼおよびアルカリ性ホスファ
ターゼは、同様な化学［レンズ（Ｒｅｎｚ）およびクル
ズ（Ｋｕｒｚ）（１９８４）核酸の研究（Ｎｕｃｌ、Ａ
ｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、）１２：３４３５］によりＤＮＡ
プローブへ結合することができる。末端標識ＤＮＡプロ
ーブについての他の化学は、エシャグポウア（Ｅｓｈａ
ｇｈｐｏｕｒ）ら［（１９７９）核酸の研究（Ｎｕｃｌ
、Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、）７：１４８５］が記載する
ものを包含する。ｌまたは２以上の４−チオウリジン残
基をＤＮＡの３’−ＯＨ末端へ導入することができ、そ
してチオールを種々な親電子低分子量試薬と反応させる
ことができる。この化学を用いて種々のハプテンをＤＮ
Ａプローブへ取り付けることができる。ハプテンＮ−ア
セトキシ−Ｎ−２−アサチルアミノフルオレンを使用す
る標識付けは、チェ７（Ｔｃｈｅｎ）ら［（１９８４）
プロシーディンゲス・オブφナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ
、ｓｃｉ、）８１　：３４６６］に記載されている。Ｄ
ＮＡおよびＲＮＡプローブをＮ−アセトキシ−Ｎ−２−
アサチルアミノフルオレンと反応させて、グアニンの８
−炭素原子に取り付けられたＮ−２−アサチルアミノフ
ルオレン残基を有する付加物を生成することができる。

共有結合により修飾されたＤＮＡは、Ｎ−アセトキシ−
Ｎ−２−アサチルアミノフルオレン残基に対してレイズ
（ｒａｉｓｅ）された抗体を用いて検出することができ
る。フ（Ｈｕ）およびメッレンズ（Ｍｅ　ｓ　ｓ　ｉ　
ｎｇ）の方法［（１９８２）遺伝子（Ｇｅｎｅ）、１７
　：　２７１］を用いて、−末鎖Ｍ１３ベクターにクロ
ーニングされたプローブへ標識を付加することができる
。クローニング部位への領域５゛に対して相補的である
汎用のプライマーは、プローブ配列から下流のＭ１３鎖
に対して相補的なりＮＡの合成を示す。

ＤＮＡポリメラーゼは放射性ヌクレオチドトリホスフェ
ートおよびビオチン５−（３−アミノアリル）デオキシ
ウリジントリホスフェートを新しい鎖の中に組込み、そ
れらの標識をプローブの配列から離れたベクターへ取り
付けることができる。

二木釦部分は、また、８−アジドエチジウムとの反応に
より修飾することができる。

検出工程への他のとくに好ましいアプローチは検出プロ
ーブ系の使用を包含し、ここで問題のポリヌクレオチド
配列と検出プローブとの間で形成した雑種はその個々の
一本鎖から抗原的に区別される。こうして、前述のよう
にこのような雑種の結合に対して選択的である抗体試薬
を添加することにより、交雑して検出プローブを含有す
る固定化分画中の検出プローブの存在を検出することが
できる。好ましい抗体試薬は、−末鎖核酸より二本鎖核
酸の結合に対して選択的であるもの、例えば、（ｉ）Ｄ
ＮＡ　’　ＲＮＡまたはＲＮＡ　’　ＲＮＡの雑種また
は（ｉ　ｉ）挿入複合体（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔ　ｉｏ
ｎ　　ｃｏｍｐｌｅｘ）であろう。第１の場合において
、ＤＮＡ　’　ＲＮＡ雑種の結合について選択的な抗生
試薬は、検出プローブおよび検出すべき配列の一方がＤ
ＮＡでありかつ他方がＲＮＡである場合に有用であり、
そしていずれの場合においても、もちろん、分離プロー
ブはＲＮＡまたはＤＮＡであり、検出すべき１、配列と
同一で、ｌ　ｉｉ：　ｎψ あろう。ＲＮＡ’　ＲＮＡ雑種の発見について選択的で
ある抗体試薬を使用することができ、ここで検出プロー
ブおよび問題の配列の両者はＲＮＡであり、そして分離
プローブはＤＮＡである。挿入複合体の場合において、
検出プローブと問題の配列との間で形成した雑種が挿入
複合体の形態でそれに結合した核酸挿入体からなるであ
ろう。

ＲＮＡ　’　ＤＮＡ雑種に対して特異的な抗体を刺激す
る免疫原は、ホモポリマーまたはへテロ重合体のポリヌ
クレオチド二重らせんからなることができる。可能なホ
モポリマーの二重らせんのうちで、ポリ（ｒＡ）’ポリ
（ｄＴ）［キタガワ（Ｋｉ　ｔ　ａｇａｗａ）およびス
トシー（Ｓｔｏｌｌａｒ）（１９８２）分子免疫学（Ｍ
ｏ　Ｉ　、Ｉｍｍｕｎｏ、）１９：４１３］はとくに好
ましい。しかしながら、一般にペテロ重合体の二重らせ
んは使用に好ましく、そして、種々の方法で、例えば、
φＸ１７４つ゛ポリオンＤＮＡをＲＮＡポリメラーゼで
転写することのより調製することができる［ナカザト（
Ｎａｋａｚａｔｏ）（１９８０）バイオケミストリー（
Ｂｉｏｃｈｅｍ、）１９：２８３５］。選択されたＲＮ
Ａ　　ＤＮＡ二重らせんはメチル化蛋白質へ吸着される
か、あるいはそうでなければ普通の免疫原担体物質、例
えば、ウシ血清アルブミンへ結合し、そして所望の宿主
動物へ注入する［ストシー（Ｓｔｏｌｌａｒ）（１９８
０）酵素学の方法（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ。

１、）７０ニア０参照］。ＲＮＡ　　ＤＮＡ二重らせん
に対する抗体を、レオウィルスまたはなかでもテンサイ
に感染するフィシ−（Ｆｉｊｉ）病ウィルスのようなウ
ィルスからの二本鎖ＲＮＡに対してレイズさせることが
できる。また、ホモポリマーの二重らせん、なかでも、
例えば、ポリ（ｒＩ）’ポリ（ｒＣ）またはポリ（ｒＡ
）’ポリ（ｒＵ）を上の免疫化に使用することができる
。

挿入複合体に対する抗体は、通常陽イオン性蛋白質また
は蛋白質誘導体（例えば、メチル化ウシ血清アルブミン
）と免疫イオン性挿入体−核酸複合体との間のイオン性
複合体からなるであろう免疫原に対して調製することが
できる。理想的には、挿入体は二本鎖核酸へ共有結合さ
れるであろう。あるいは、挿入体−核酸複合体を相体の
蛋白質へ共有結合することができる。免疫原の核酸部分
は、アッセイの雑種中に見出される特異的な対の配列か
らなることができるか、あるいは任意の他の所望の配列
からなることができる。なぜなら、抗体の特異性は一般
に含まれる特定の塩基配列に依存しないからであろう。

挿入複合体に対して選択的である抗体試薬を検出系に使
用する他の場合において、種々の挿入化合物を含めるこ
とができる。一般に、挿入化合物は好ましくは低分子量
の平らで通常芳香族であると言うことができるが、時に
は通常塩基対間の挿入により二本鎖核酸と結合できる多
環式分子、例えば、ＤＮＡ　’　ＤＮＡ、ＤＮＡ　’　
ＲＮＡまたはＲＮＡ　’　ＲＮＡの二重らせんであるこ
とができる。

主な結合機構は、通常、非共有結合であり、共有結合は
第２工程として起こり、ここで挿入体は反応性または活
性化可能な化学基を有し、挿入された二本鎖の一方また
は双方上に存在する隣接化学基と共有結合を形成するで
あろう。挿入の結果、隣接塩基対はそれらの通常の分離
距離のほぼ２倍に広がり、二重らせの分子長さは増加す
る。さらに、約１２〜３６度の二重らせんの巻戻しは挿
入体を収容するために起こらなくてはならない。全体的
な概観およびそれ以上の情報は、次の文献に記載されて
いるニラ−マン（Ｌｅｒｍａｎ）、分子生物学雑誌（Ｊ
、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）３：１８　（１９６１）、ブル
ームフィールド（Ｂ　ｌ　ｏ　。

ｍｆｉｅｌｄ）ら、［核酸の物理化学（Ｐｈｙｓｉｃａ
ｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ｏｆ　　Ｎｕｃｌｅｉｃ
　　Ａｃ１ｄｓ）Ｊ　、７章、４２９−４７６ページ、
ハーバ−・アンド・ロウウニ（Ｈａｐｅｒ　　ａｎｄ　
　Ｒｏｗｅ）、ＮＹ　（１９７４）；ワーリング（Ｗａ
ｒｉｎｇ）、ネイチ−？−（Ｎａｔｕｒｅ）２１９：１
３２０　（１９８６）；バー）？７　（Ｈａ　ｒ　ｔ　
ｍａ　ｎ）ら、Ａｎｇｅｗ、Ｃｈｅｍｉ、英語版７　：
　６９３　（１９６８）；リッパード（Ｌ　ｉ　ｐ　ｐ
　ａ　ｒ　ｄ）　　、アカウンッ響オブ・ケミカル・リ
サーチ（Ａｃｃｔｓ　　Ｃｈｅｍ、Ｒｅｓ、）１１：２
１１　（１９７８）；ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）、イ
ンター力レイション・ケミストリー（Ｉｎｔｅｒｃａｌ
ａｔｉｏｎ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（１９８２）、４
４５；およびバーマン（Ｂｅｒｍａｎ）ら、アニュアル
・リビュー・イン・バイオフィジックス・バイオエンジ
ニアリング（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｂｉ　
ｏｅｎｇ、）２０：８７　（１９８１）。

挿入体の例は、アクリジン染料、例えば、アクリジンオ
レンジ、ツェナトリジン、例えば、エチジウム、フェナ
ジン、フロクマリン、フェノチアジンおよびキノリンで
ある。

挿入複合体は検出プローブの使用により交雑の間にアッ
セイ媒質中で形成し、前記検出プローブはその相補的−
末鎖区域が修飾されてそれに化学的に結合した挿入体を
有しており、こうして交雑のとき、挿入複合体が形成さ
れる。本質的に任意の便利な方法を使用して、このよう
な結合を達成することができる。通常、結合は反応性の
、好ましくは光反応性挿入体を使用して挿入を実施し、
次いで結合反応させることにより形成される。とくに有
用な方法はアジド挿人体（ａｚｉｄｏｉｎｔｅｒｃａｌ
ａｔｅｒ）を含む。紫外線または可視光線に露出すると
、反応性二トレンは容易に発生する。アリールアジドの
ニトレンはそれらの転位生成物よりも挿入反応を好む［
ホワイ）（Ｗｈｉ　ｔ　ｅ）ら、メンッズ・イン拳エン
ジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ、）４６　：　６４４　（１９７７）参照１゜代表的
アジド挿入体は、３−アジドアクリジン、９−アジドア
クリジン、エチジウムモノアジド、エチジウムジアジド
、エチジウムシマーアジド［ミッチェル（Ｍｆｔｃｈｅ
ｌｌ）ら、ＪＡＣ３１０４：４２６５　（１９８２）］
、４−アジド−７−クロロキノリンおよび２−アジドフ
ルオレンである。多の有用な光反応性挿入体は、ピリミ
ジン残基と［２＋２］シクロ付加物を形成するフルオロ
クマリンである。アルキル化剤、例えば、ビスタロロエ
チルアミンおよびエポキシドまたはアジリジン、例えば
、アフラトキシ、ポリ環式炭化水素のエポキシド、ミド
マイシンおよびノルフィリンＡを使用することもできる
。次いで、挿入体修飾二重らせんを変性して修飾された
一本鎖のプローブを生成する。

検出プローブと問題の配列との間で形成される抗原的に
異る雑種に結合する抗体試薬の検出は、普通の方法で進
行することができる。例えば、前述の検出可能な化学的
基で標識された抗体試薬を使用することができる。標識
された抗体の調製は、文献に広く記載されている。１２
５■−標識の組込みは、ポルトン（Ｂｏｌｔｏｎ）およ
びハンター（Ｈｕｎｔｅｒ）（１９７２）生物化学雑誌
（Ｂｉｃｈｅｍ、Ｊ、）１３３：５２９の方法により達
成することができる。イシカワ（Ｉｓｈｉｋａｗａ）ら
（１９８２）免疫アッセイの雑誌（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏａ
ｓｓａｙ）４：２０９は、抗体に対して種々の酵素を結
合するいくつかの異る方法を概説している。ヨシタケ（
Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ）ら（１９７９）Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、）ｌｏｔ　：　３９５は、クルコースオキ
シダーゼを抗体へ化合物するためにマレイミドを使用す
る方法を記載している。アルカリ性ホスファターゼをグ
ルタルアルデヒドの使用により抗体へ結合することがで
きる［ボウラー（Ｖｏｉｌｅｒ）ら（１９７６）Ｂｕｌ
ｌ、Ｗｏｒｌｄ　　Ｈｅａｌｔｈ　　Ｏｒｇａｎ、）、
５３：５５］、抗体はフルオレセインでブラケスリー（
Ｂｌａｋｅｓｌｅｅ）およびパイン（Ｂａｉｎｅ）（１
９７６）免疫学の方法の雑誌（Ｊ　、Ｉｍｍｕｎｏ　ｌ
　。

Ｍｅ　ｔ　ｈ、）　１３　：　３０５（７）方法により
標識することができる。化学ルミネセント標識は、シュ
レダー（Ｓ　ｃ　ｈ　ｒ　ｏ　ｅ　ｄ　ｅ　ｒ）ら（１
９８１）臨床の化学（Ｃ１ｉｎ、Ｃｈｅｍ、）２７：１
３７８の方法により導入することができる。あるいは、
抗体試薬は自然の性質、例えば、その抗原性に基づいて
検出することができる。標識抗−（抗体）抗体は一時抗
体試薬へ結合し、ここで第２抗体のための標識は前述の
任意の慣用の標識である。さらに、抗体は、相補的固定
または標識に蛋白質Ａの使用、ならびに抗体の検出分野
において知られた他の技術により検出することができる
。

反応混合物 アッセイすべき試験試料は、問題の任意の媒質であるこ
とができ、そして通常医学的、獣的、環境的、栄養的ま
たは工業的な意味をもつ液状試料であろう。ヒトおよび
動物の試料および体液をとくに本発明の方法によりアッ
セイすることができ、このような試料および体液は尿、
血液（血清または血漿）、牛乳、脳を髄液、たん、糞便
、肺の吸出された物質、喉のスワブ、性器のスワブおよ
び滲出液、直腸のスワブ、および鼻咽頭の吸出された物
質を包含する。患者または試験すべき他の源から得られ
る試験試料が主として二本鎖核酸、例えば、細胞中に含
有されるものを含有する場合、試料を処理して核酸を変
性し、そして必要に応じて、まず細胞から核酸を開放す
る。核酸の変性は好ましくは沸騰水中の加熱またはアル
カリ処理（例えば、０．ＩＮ水酸化ナトリウム）により
達成され、これを必要に応じて、同時に使用して細胞を
溶解することができる。また、核酸の開放は、例えば、
機械的崩壊（凍結／融解、摩耗、超音波処理）、物理／
化学的崩壊（洗浄剤、トリトン、ツイーン、ドデシル硫
酸ナトリウム、アルカリ処理、浸透衝撃または熱）、酵
素溶解（リソチーム、プロイテイナーゼＫ、ペプシン）
により実施することができる。得られる試験媒質は核酸
を一本鎖の形態で含有し、次いでこれを本発明の交雑法
に従ってアッセイすることができる。さらに、試料の核
酸は特異的にあるいは非特異的に断片化して特定の所望
のアッセイを実施することができ、このようなアッセイ
は、例えば、点突然変異を特異的エンドヌクレアーゼ処
理により検出し、次いで二重交雑を実施するアッセイで
ある（例えば、欧州特許出願第８４　１０７　２４８号
参照）。

この分野において知られているように、種々の交雑条件
を用いることができる。典型的には、交雑はわずかに高
い温度、例えば、約３５〜７５°Ｃ１通常６５°Ｃ付近
において、ＰＨ約６〜８および適当なイオン強度の緩衝
液（例えば、５ＸＳＳＣ１ここ−ｔ’１Ｘｓｓ（、＝０
．１５モル（７）塩化ナトリウムおよび０．０１５モル
のクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）および必要に応じ
て蛋白質、例えば、ウシ血清アルブミンおよび変性異質
ＤＮＡ、例えば、コウシ胸腺またはサケ精子からなる溶
液中で進行するであろう。これより低い交雑温度が望ま
しい場合、水素結合試薬、例えば、ジメチルスルホキシ
ドおよびホルムアミドを含めることができる。交雑を起
こすために要求される試料とプローブの鎖との間の相補
性の程度は、条件の厳格さに依存する。厳格さを決定す
る因子はこの分野において知られている。

通常、交雑のために選択される温度の条件は形成した雑
種への抗体試薬の結合および標識応答の検出と不適合性
であろう。したがって、抗体試薬の結合および標識検出
工程は、交雑工程の完結後に進行されるであろう。反応
混合物は通常約り℃〜約４０℃の範囲の温度にし、次い
で結合および検出工程を実施する。塩および／またはホ
ルムアミドの濃度が抗体の結合反応を有意に妨害するた
めに十分に高いとき、抗体試薬添加前の交雑混合物の希
釈は望ましい。標識結合相手または標識された抗体試薬
を使用するして検出プローブの交雑を検出することを含
むアッセイの場合において。

アッセイ工程の順序は一般に次のように進行するであろ
う。交雑反応は、まず、前述のように普通に予備処理さ
れている試験試料を用いて達成されるであろう。２つの
プローブを試験試料と必要に応じて同時にあるいは順次
に接触させる。次いで、固定化および標識結合相手また
は抗体試薬の接触を、同時にあるいはいずれかの順序で
実施することができる。最後に、標識を固定化分画また
は残留する反応混合物中で測定する。これらの工程の変
更は当業者にとって明らかであろう。

反応系 本発明は、所望のアッセイ法を実施するために必須の要
素のすべてからなる試薬系、すなわち、試薬の組み合わ
せまたは手段をさらに提供する。

試薬系は、商業的に包装された形態で、組成物または混
合物として提供され、ここで試薬の適合性は、試験装置
の構成において、あるいはより通常試験キットとして、
すなわち、必要な試薬を保持し、そして通常アッセイを
実施するために書かれた取扱説明書を含む１または２以
上の容器、装置などの包装された組み合わせを可能とす
るであろう。本発明の試薬系は、ここに記載する種々の
交雑フォーマットを実施するためのすべての構成および
組成を包含する。

すべての場合において、試薬系は（１）ここに記載した
第１の分離プローブ、（２）ここに記載した第２の検出
プローブ、および（３）固定化された反応相手からなる
であろう。この系の試験キットの形態は、補助化学物質
、例えば、交雑溶液の成分および試験試料中で二本鎖核
酸を一本鎖の形態に共有することのできる変性剤をさら
に含むことができる。

実施例 工程：　１、　反応性分離プローブの調製２、　検出プ
ローブの標識付け ３、　雑種の固定化のための支持体の 調製 ４、　交雑および雑種の分離および アッセイ 患者の血液試料を集め、試験ＤＮＡを単離し、試験試料
診断する方法は、ウィルソン（Ｗｆｌｓ。

ｎ）らへの米国特許第４，３９５，４８６号に詳述され
ている。プローブ　ｂ　　ＢＲ３２２Ｐｓｔ（４，４に
６）の調製のための族プラスミドは、また、その特許に
記載されている。

１、反応性分離プローブの調製 １ｍｇ（７）ｐ　　ＢＲ３２２ｂ　　ＰｓｔをＡｌｕｌ
で消化し、そして７３７塩基対の断片をウィルソン（Ｗ
ｉ　ｌ　ｓ　ｏ　ｎ）らへの米国特許第４，３９５．４
８６号に従いその消化物から単離する。

次いで、７３７塩基対の断片を酵素ＤｄｅＩでさらに消
化し、そして断片２０１および１７５（塩基対の長さ）
を分離しそして４％のポリアクリルアミドゲルから単離
する。２０１塩基対の断片を分離プローブとして使用し
、そして１７５塩基対の断片を検出プローブとして使用
する。前述のように、鎌型赤血球の突然変異は２つの断
片の接合部に存在する（米国特許第４，３９５，４８６
号）。ＤｄｅＩ消化により生産されて大きさ３７６塩基
対のＤＮＡ断片の単一片への両者のプローブの交雑は、
鎌型赤血球の突然変異示すであろう。

本発明を次の例示的実施例において、本発明に従うフロ
ーシートである添付図面を参照しなから説明する。

ｌｏｇＨの２０１塩基対の断片をＯ，１ｍｌのｌＯミリ
モルのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８，６）中に溶解する（分
離プローブ１０）。ｔｐＬｔ（ｔｍ　ｇ　／　ｍ　ｌ　
）の４′−アミノメチル−４，５’−ジメチルアンゲラ
シンの水溶液を添加し、そしてこの混合物を３４６ｎｍ
で１５分間照射する（分離プローブＡ）。次いで、１０
μｌ　（１ｍｇ／ｍ　ｌ　、ジメチルホルムアミド中）
のＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチンをビオチル化
剤１２として添加する。この混合物を室温に１６時間放
置する。反応混合物をｌＯミリモルのトリスＨＣＩおよ
び１ミリモルのＥＤＴＡ　（ｐＨ７，２）緩衝液に対し
て広範に透析する。次いで、試料をエタノールを使用す
る沈殿によりさらに精製する。固体を１００ｐｌのトリ
ス−ＥＤＴＡ緩衝液中に再溶解する。Ｉｇｌのこの溶液
をベセスダ・リサーチ寺ラボラトリ−（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｇ
ａ１ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ　　ＭＤ）から購入したキット
を使用してビオチンについてアッセイする。これはビオ
チル化分離プローブ１４（分離プローブＢ）である。

２、検出プローブの標識材は 検出プローブは１７５塩基対の断片である。１７５塩基
対の断片を標識１８でニック翻訳（ｎｉｃｋ　　ｔｒａ
ｎｓｌａｔｉｏｎ）により標識する（米国特許第４，３
９５，４８６号）。コールドＮＴＰの代わりに３２ｐ標
識デオキシＮＴＰを使用すると、高い３２ｐ特異的活性
をもつ標識された検出プローブ２０が合成される。この
１７５塩基対の断片は、ｂ　グロブリン遺伝子の突然変
異を検出するための２０１塩基対の検出プローブのため
の重ならない特異的断片である。

商業的に入手可能なストレプトアビジン（ＢＲＬ）を既
知の方法によりアガロース２２へ固定化する。　［クア
トレカサス（ＣｕａｔｒｅｃａｓａＳ）およびパリク（
ｐａｒｉｋｈ）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉ　ｓｔ　ｒｙ）↓↓、２２９１　（１９７２）］。固
定化後、それを１ミリモルのトリスｏ、ｉミリモルのＥ
ＤＴＡ　（ｐＨ約７）中のニシンの精子のＤＮＡ溶液の
大過剰量中に浸漬して保持する。

４、血液中の鎌型赤血球ＤＮＡの検出 制限酵素ＤｄｅＩは野生型（正常）および鎌型赤血球Ｄ
ＮＡを異るように消化することが知られている。この多
形態性は本発明の方法により検出することができる。両
者の分離プローブ１４（実施例１）および検出プローブ
２０（実施例２）が交雑する場合、試験ＤＮＡはＤｄｅ
　Ｉにより検出の特異的部位において認識されていない
。これは試験ＤＮＡ２４が鎌型赤血球貧血の配列をもた
ないことを示すであろう。ただ１つの条件下で、両者の
分離プローブおよび検出プローブは並列してＤＮＡの直
線の片に交雑するであろう。

１０ｍ１の血液試料から、既知の方法（米国特許第４，
３９５，４８８号）に従いＤＮＡを単離し、制限酵素（
２単位のＤ　ｄ　ｅ　Ｉ／　ｇｇ）ｎＮＡ）で消化する
。消化されたＤＮＡをフェノール抽出により脱プロトン
化し、次いでｌＯミリモルのトリスｌミリモルのＥＤＴ
Ａ緩衝液に対して透析する。

第１アミンをもつ分離プローブＡの使用４゛−アミノメ
チル−４，５′−ジメチルアンゲリシン との光化学反応後のプローブは第一−ＮＨ２残基を含有
するであろうので、それらは 残基を含有する固体の支持体へ直接結合することができ
る［クアトレカサス（Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ）および
パリク（Ｐａｒｉｋｈ）、バイオケミストリー（Ｂｉ　
ｏｃｈｅｍｉ　ｓｔ　ｒｙ）去↓。

２２９１　（１９７２）］。

２終ｇのビオチル化分離プローブ、０．２＃１．ｇの３
２ｐ標識検出プローブおよび血液からのＤＮＡ抽出物を
、１０ミリモルのトリス１ミリモルのＥＤＴＡ緩衝液と
混合する、最終の合計容積２ｍｌ、この溶液を９５℃に
加熱し、次いで６５°Ｃで１５分間インキュベーション
する。次いで、それを水中で冷却し、そして２０ｍ１の
水を添加してイオン強度を減少させる。この方法を実施
してＴｍを減少し、こうして非特異的雑種が３０°Ｃで
溶融するようにする。ストレプトアビジンに対するビオ
チンの結合定数は高いので、この水準への希釈は配位子
−蛋白質の相互作用の問題をなんら生じない。希釈後、
溶液を３０℃において１５分間インキュベーションし、
次いで膨潤した状態の１　ｍ　ｌのアガロース−ストレ
プトアビジン２２（実施例３）を添加し、攪拌し、そし
て遠心する。次いで、固体を室温において１ミリモルの
トリス０．１ミリモルのＥＤＴＡで５回洗浄する。

次いで、固体をバイアル中に取り、そしてシンチレーシ
ョンカウンターで３２ｐについて計数する。この固体は
通常の方法でオートラジオグラフの検出に使用すること
ができる。

前述したように、ビーズ上のバックグラウンドの水準よ
り上の放射能が存在する場合、ＤＮＡ標本の特異的状態
は鎌型赤血球の患者または担体から由来する。放射能が
存在しない場合、ＤＮＡは正常の血液試料からのもので
ある。

交雑の音素および塩の濃度および緩衝液を変化させるこ
とができる。交雑の特定の条件は核酸の型、長さ、配列
、プローブの大きさなどに依存する。ストレプトアビジ
ンの代わりに、ビオチンに対する抗体を分離のために使
用できる。他のハプテンを標識するビオチンの代わりに
、配位子または酸化可能な残基を固体の支持体への結合
剤として使用できる。検出プローブ上の標識は、例えば
、既知の方法でアッセイすることのできる配位子、蛍光
体または酵素であることができる。ストレプトアビジン
を使用する代わりに、Ｎ−ヒドロ夫シスクシンイミド活
性化アガロースの結合支持体を使用すると、雑種は分離
プローブを介して共有アミド結合を形成するであろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に従う方法のフローシートである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試験試料を第１の分離核酸プローブおよび第２の検
   出核酸プローブと接触させ、前記プローブの各々は検出
   すべき配列の互いに相容れない部分と交雑可能な少なく
   とも１つの一本鎖塩基配列からなり、分離プローブは反
   応相手と安定な結合を形成できる反応性部位をさらに含
   み、試験試料とプローブとの間のこのような接触は溶液
   中で交雑条件下に実施し、得られる溶液を固定化された
   形態の反応相手と接触させ、前記安定な結合を分離プロ
   ーブ中の反応性部位と形成し、得られる固定化された分
   画を残留する溶液から分離し、そして分離された固定化
   された分画または残留する溶液の中の検出プローブの存
   在を決定する工程からなることを特徴とする試験試料中
   の特定のポリヌクレオチド配列の存在の検出方法。 ２、分離プローブ中の反応性部位のための固定化された
   形態の反応相手が反応相手を取り付ける固体の支持体か
   らなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、分離プローブ中の反応性部位が、反応相手の役目を
   する結合物質と特異的な非共有結合をすることのできる
   結合部位である特許請求の範囲第１または２項記載の方
   法。 ４、分離プローブ中の結合部位がビオチンまたはハプテ
   ンであり、そしてその結合物質がそれぞれアビジンまた
   は抗ハプテン抗体試薬である特許請求の範囲第１〜３項
   のいずれかに記載の方法。 ５、検出プローブが検出可能な標識からなり、そして分
   離された固定化された分画または残留溶液の中の検出プ
   ローブの存在をその中のこのような標識を測定すること
   により決定する特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに
   記載の方法。 ６、検出可能な標識が、酵素的に活性な基、蛍光体、発
   色体、冷光体、ラジオアイソトープまたは標識されたそ
   の結合相手と結合することにより検出することのできる
   特異的に結合可能な配位子である特許請求の範囲第１〜
   ５項のいずれかに記載の方法。 ７、結合相手を検出可能な化学基で標識し、標識された
   結合相手を交雑工程から得られる溶液あるいは分離固定
   化分画と接触させ、そして得られる固定化された標識を
   測定する特許請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載の
   方法。 ８、問題のポリヌクレオチド配列と検出プローブとの間
   で形成された雑種がその個々の鎖と抗原的に異なり、そ
   して前記雑種との結合について選択的である抗体試薬と
   の結合およびこのような分離された固定化分画に結合す
   るようになる抗体試薬の測定により、分離された固定化
   分画中の検出プローブの存在を決定する特許請求の範囲
   第１〜７項のいずれかに記載の方法。 ９、（１）第１の分離プローブ、（２）第２の検出プロ
   ーブ、前記プローブの各々は検出すべき配列の互いに相
   容れない部分と交雑可能である少なくとも１つの一本鎖
   塩基配列からなり、前記分離プローブは反応相手のため
   の反応性部位をさらに含む、および（３）固定化された
   形態の前記反応相手からなることを特徴とする、試験試
   料中の特定のポリヌクレオチド配列の存在を検出するた
   めの試薬の組み合わせ。 １０、（１）第１の分離プローブ、（２）第２の検出プ
   ローブ、前記プローブの各々は検出すべき配列の互いに
   相容れない部分と交雑可能である少なくとも１つの一本
   鎖塩基配列からなり、前記分離プローブは反応相手のた
   めの反応性部位をさらに含む、および（３）固定化され
   た形態の前記反応相手からなることを特徴とする、試験
   試料中の特定のポリヌクレオチド配列の存在を検出する
   ための試薬の組み合わせの交雑アッセイにおける使用。